BIOGEOGRAFIA DE BACTÉRIAS CULTURÁVEIS ASSOCIADAS À
FRUTEIRAS TROPICAIS
SAMUEL TAVARES DOS SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
DEZEMBRO 2008
i
BIOGEOGRAFIA DE BACTÉRIAS CULTURÁVEIS ASSOCIADAS À
FRUTEIRAS TROPICAIS
SAMUEL TAVARES DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia, da universidade Estadual do
Norte Fluminense, como parte das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
DEZEMBRO 2008
ii
BIOGEOGRAFIA DE BACTÉRIAS CULTURÁVEIS ASSOCIADAS À
FRUTEIRAS TROPICAIS
SAMUEL TAVARES DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em dia mês ano
Comissão Examinadora:
___________________________________________________________________
Prof. Nome (Titulo, área de especialização) – Sigla da Instituição.
___________________________________________________________________
Prof. Nome (Titulo, área de especialização) – Sigla da Instituição.
___________________________________________________________________
Prof. Nome (Titulo, área de especialização) – Sigla da Instituição.
___________________________________________________________________
Prof. Fábio Lopes Olivares (Doutor, Microbiologia) – UENF.
(Orientador)
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus Pais (Manoel dos Santos (in memória) e Maria de Lourdes), aos
meus irmãos (Francisco, Humberto, Raquel e Regina) e aos meus sobrinhos (Kaline,
Wesley, Gabriel, Guilherme e Gustavo), pelo carinho e motivação.
iv
AGRADECIMENTOS Ao Dr. Fabio Lopes Olivares (meu orientador), e demais Pesquisadores e
Professores: Dr. José Ivo Baldani, Dra. Vera Lúcia Divan Baldani, Dra. Verônica
Massena Reis, Dr. Gonçalo, Dr. Martelleto. Aos Amigos Juarez, Valéria, Vanessa,
Késsia, Rarume, Marlon. À UENF e à Embrapa – Agrobiologia.
v
Sumário DEDICATÓRIA............................................................................................................iv
AGRADECIMENTOS...................................................................................................v
SUMÁRIO....................................................................................................................vi
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................viii
ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................................x
RESUMO....................................................................................................................xii
ABSTRACT................................................................................................................xiv
1. Introdução.................................................................................................................1
2. Revisão de Literatura...............................................................................................3
2.1 Panorama da Fruticultura............................................................................3
2.2 Biogeografia de Microrganismos.................................................................5
2.3 Biogeografia de bactérias Associadas a Vegetais......................................6
2.3.1 sítios de colonização de bactérias em vegetais............................7
- A rizosfera.............................................................................................7
- O ambiente epifítico..............................................................................8
- O ambiente endofítico.........................................................................10
2.3.2 formas de disposição: solitária (ou planktônica) x biofilme (ou
agregados):.........................................................................................11
2.4 Biogeografia de Bactérias Diazotróficas...................................................12
2.5 Potencial biotecnológico de bactérias associadas a vegetais...................17
3. Material e Métodos.................................................................................................20
3.1. Isolamento de bactérias diazotróficas associadas a fruteiras..................20
3.2. Isolamento de bactérias não-diazotróficas...............................................23
3.3. Caracterização parcial e estocagem dos isolados...................................24
3.4. Análise dos resultados do número mais provável (NMP) de bactérias
diazotróficas..............................................................................................26
4. Objetivo..................................................................................................................28
4.1. Objetivos Gerais.......................................................................................28
4.2. Objetivos específicos................................................................................28
5. Resultados.............................................................................................................30
5.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número
mais provável (NMP).............................................................................30
5.1.1. o caso do abacaxizeiro...............................................................30
vi
5.1.1.1. maiores valores observados de NMP:.........................30
5.1.1.2. freqüência de detecção...............................................33
5.1.1.3. Diversidade, riqueza e abundância.............................35
5.1.2. o caso da goiabeira..................................................................37
5.1.2.1. maiores valores observados de NMP.........................37
5.1.2.2. frequência de detecção...............................................39
5.1.2.3. Diversidade, riqueza e abundância............................41
5.1.3. o caso do mamoeiro.................................................................43
5.1.3.1. maiores valores observados de NMP.........................43
5.1.3.2. freqüência de detecção..............................................44
5.1.3.3. Diversidade, riqueza e abundância............................47
5.1.4. O caso do maracujazeiro..........................................................49
5.1.4.1. maiores valores de NMP observados.........................49
5.1.4.2. freqüência de detecção...............................................51
5.1.4.3. Diversidade, riqueza e abundância.............................53
5.2. Isolamento de bactérias diazotróficas....................................................55
5.3 Agrupamento dos isolados bacterianos diazotróficas.............................60
5.4 Isolamento de bactérias não diazotróficas..............................................62
5.5 Agrupamento dos isolados bacterianos não diazotróficos baseados
em características morfológicas da colônia.............................................63
6. Discussão............................................................................................................73
6.1 Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número
mais provável (NMP):...........................................................................73
6.2 Isolamento de bactérias diazotróficas.......................................................75
6.7 Considerações quanto aos resultados de isolamento...............................76
7.Referências Bibliográficas.......................................................................................77
Anexos........................................................................................................................85
Anexo I: fotografias das áreas onde se encontram as fruteiras utilizadas no
estudo..............................................................................................................85
Anexo II: Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos...86
Anexo III: Valores de redução de acetileno produzido pelos isolados
bacterianos oriundos das diferentes fruteiras..................................87
Anexo IV: composição dos meios de cultura...................................................89
Anexo V: fotos das colônias de alguns isolados bacterianos diazotróficos.....92
vii
ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro em diferentes
épocas do ano...........................................................................................32
Tabela 2. Freqüência de detecção de possíveis bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do abacaxizeiro durante três colheitas por épocas do ano
...................................................................................................................34
Tabela 3. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro........................................36
Tabela 4. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios
do abacaxizeiro..........................................................................................36
Tabela 5. Abundância (NMP x g-1 de tecido fresco) de possíveis bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro....................36
Tabela 6. Maiores valores observados do número mais provável de possíveis
bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira em
diferentes épocas do ano..........................................................................38
Tabela 7. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios da goiabeira durante três colheitas por épocas do ano...................40
Tabela 8. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios da goiabeira...............................................42
Tabela 9. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios
da goiabeira...............................................................................................42
Tabela 10. Homogeneidade de possíveis bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios da goiabeira...................................................................42
Tabela 11. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do mamoeiro em diferentes
épocas do ano.........................................................................................44
Tabela 12. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do mamoeiro durante três colheitas por época do ano.46
Tabela 13. Diversidade (Índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do mamoeiro............................................48
Tabela 14. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do mamoeiro...................................................................................48
viii
Tabela 15. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do mamoeiro..................................................................................48
Tabela 16. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do maracujazeiro em
diferentes épocas do ano.........................................................................50
Tabela 17. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do maracujazeiro durante três colheitas por época do
ano...........................................................................................................52
Tabela 18. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do maracujazeiro.....................................54
Tabela 19. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do maracujazeiro............................................................................54
Tabela 20. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do maracujazeiro............................................................................54
Tabela 21. Relação das Bactérias isoladas na Embrapa Agrobiologia oriundas da Fazendinha Agroecológica da Embrapa/UFRRJ/Pesagro (Abacaxi,
Mamão, maracujá) e do Sitio Mazomba (goiaba) durante o Inverno de
2005 e Verão de 2005/2006....................................................................58
Tabela 22. Relação dos Isolados e suas respectíveas plantas e sítios de origem,
meio de cultura onde foram isolados e resultado do agrupamento de
acordo com o perfil protéico e do sequenciamento parcial da região 16S
do DNAr...................................................................................................59
Tabela 23. Relação da distribuição numérica dos isolados bacterianos diazotróficos oriundos dos diferentes sítios de isolamento a partir dos diferentes meios de culturas semi-sólidos..............................................................60 Tabela 24. Número de isolados bacterianos e seus respectivos sítios de origem
obtidos até o momento a partir das diferentes fruteiras a partir de meios
ricos (NB e DYGS)...................................................................................72
Tabela 25. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos
oriundos do abacaxizeiro.........................................................................87
Tabela 26. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos
oriundos da goiabeira..............................................................................87
Tabela 27. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos
oriundos da goiabeira..............................................................................88
Tabela 28. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos
oriundos do maracujazeiro.......................................................................88
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias diazotróficas..22 Figura 2. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias em meio rico..25
Figura 3. Código para identificação dos isolados (em meio de enriquecimento de
bactérias diazotróficas)..............................................................................27
Figura 4. Código para identificação dos isolados bacterianos obtidos a partir de meio
rico (NB e DYGS)........................................................................................28 Figura 5. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias diazotróficas isoladas a partir da cultura do abacaxi,
goiaba, mamão e maracujá.........................................................................61
Figura 6. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do
maracujá.....................................................................................................64
Figura 7. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do
Maracujá.....................................................................................................66
Figura 8. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do abacaxi
Pérola..........................................................................................................67
Figura 9. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do abacaxi
Smoth cayenne............................................................................................69
Figura 10. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do abacaxi
Smoth cayenne............................................................................................71
Figura 14. Fotografia da entrada da Fazendinha Agroecológica
(Embrapa/UFRRJ/Pesagro).....................................................................85
Figura 15. Fotografia da plantação da cultura do mamão onde foi retirada amostras
de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas..........................85
Figura 16. Esquema da plantação da cultura de abacaxi onde foram retiradas
amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.........85
Figura 17. Esquema da plantação da cultura do Maracujá onde foram retiradas
plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas..............................85
x
Figura 18. Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos (Perin,
2003)........................................................................................................86
xi
Resumo
No presente trabalho foi feito um estudo da biogeografia de bactérias
diazotróficas e não-diazotróficas culturáveis. No caso do estudo de biogeografia de
bactérias diazotróficas, as regiões alvo do estudo foram rizosfera, rizoplano,
histoplano-raiz (interior da raiz), filoplano (sob a forma solitária e formando
biofilmes), histoplano-caule (interior do caule) e histoplano-folha (interior da folha) de
quatro fruteiras tropicais, a saber: abacaxi, goiaba, mamão e maracujá. Isso foi feito
através do uso de duas estratégias básica: (1) estudo do padrão de distribuição de
bactérias diazotróficas culturáveis obtidas em cinco meios semi-sólidos sem
nitrogênio (JMV, JNFb, LGI, LGI-P e NFb), através da técnica de número mais
provável (NMP) e (2) agrupamento e caracterização parcial dos isolados bacterianos
obtidos nos meios semi-sólidos citados acima, através da morfologia da colônia.
Quanto ao estudo de biogeografia de bactérias não diazotróficas, tal estudo foi
baseado no isolamento de bactérias rizosféricas, epifítica (rizoplano, cauliplano e
filoplano) e endofítica (histoplano raiz, histoplano caule e histoplano folha) utilizando-
se dois meios complexos, NB (Nutrient Broth) e DYGS, seguido de agrupamento
baseado em características morfológicas. No caso da biogeografia de bactérias
diazotróficas foram obtidos um total de 44 isolados bacterianos (maracujá, 15 (34%);
abacaxi, 14 (32%); mamão, 10 (23%); e goiaba, 5 (11%) isolados). Quanto ao sítio
de origem, de uma forma geral a rizosfera foi de onde foi obtido o maior número de
isolados, 16 (36%), seguidos do histoplano-raiz, 14 (32%), rizoplano 9 (20%),
histoplano – pseudocaule, 3 (7%), e histoplano – folha, 2 (4%). Quanto à análise dos
dados baseados em NMP (maiores valores de densidades de bactérias
diazotróficas; freqüência de detecção, índice de diversidade, a riqueza e a
abundância), foi observado um padrão aleatório de distribuição bacteriana em
relação ao nicho vegetal ou ao meio de cultura ou mesmo à estação do ano. A
exceção foi o fato de na maioria das vezes os maiores valores de NMP estarem
presentes nos sítios associados às regiões da raiz (rizosfera, superfície da raiz, e
histoplano raiz), e o fato dos maiores valores de NMP serem observados para os
meios JNFb e NFb, meios semi-específicos para bactérias do gênero Azospirillum,
que é sabidamente encontrada em uma grande variedade de culturas. Quanto ao
estudo com não diazotróficos, foi obtido um total de 237 isolados bacterianos, dos
quais 40 (17%) foram isoladas de abacaxi smoth cayenne em meio NB; 25 (10%) de
xii
abacaxi smoth cayenne em meio DYGS; 25 (10%) de abacaxi pérola em meio DYGS
e 65 (27%) isolados oriundos de maracujá amarelo em meio DYGS. No geral, o sítio
a apresentar a fornecer o maior número de isolados foi a rizoplano (52 isolados
(22%)), seguido do filoplano (47 isolados (20%)) e do histoplano raiz (42 isolados
(18%)). O agrupamento preliminar dos isolados, baseada em algumas
características morfológicas das colônias não mostrou nenhuma tendência de
colocar num mesmo grupo microrganismos que pertencentes a um determinado
nicho do vegetal. Contudo, estudos futuro poderão nós dizer quais dos 237 isolados
bacterianos têm potencial biotecnológico.
xiii
Abstract In the present work it was performed a biogeographic study of cultivable
diazotrophic and non-diazotrophic bacteria. For the studies involving biogeography of
diazotrophic bacteria, the micro-environments sampled were rhizosphere, rhizoplane,
histoplane-rhizosphere (inner tissue of root), phylloplane (at solitary and biofilm form)
and histoplane-leaf (inner tissue of leaf) of four tropical fruit plants: pineapple, guava,
papaya and passion fruit. Two strategies were used: (1) study of the distributions
patterns of cultivable diazotrophic bacteria obtained using five N-free semi-solid
medium (JMV, JNFb, LGI, LGI-P and NFb) by the use of most-probable number
(MPN) technique (2) grouping and partial identification of bacteria isolates obtained
on N-free semi-solid medium by colony morphology. In relation to the non-
diazotrophic group, the isolation from bacteria associated to pineapple and passion
fruit was performed based on rhizosphere, epiphytic (rhizoplane, cauliplane and
phylloplane) and endophytic (histoplane-root, histoplane-steam and histoplane-leaf)
using two rich medium, NB and DYGS. In the study with diazotrophic bacteria it were
obtained a total of 44 isolates (passion fruit, 15 isolates (34%), pineapple, 14 isolates
(32%), papaya, 10 isolates (23%), and guava, 5 isolates (11%)). In relation to origin
site, in a general form the rhizosphere was the site that resulted in the majority of
isolates, 16 (36%), followed by histoplano-root, 14 (32%), rhizoplane, 9 (20%),
histoplane-pseudocaule, 3 (7%), and histoplano – leaf, 2 (4%). In relation to NMP
dates, (biggest values of densities of diazotrophic bacteria, detection frequency,
diversity indices, an richness and ABUNDÂNCA), it was observed a random pattern
of distribution of diazotrophic bacteria in relation to the niche vegetal or to the culture
medium or to the yea period. The exception was the fact of the most of the time the
biggest values of NMP were present in the site associated to the root regions
(rhizosphere, root surface, and histoplane-root) and to the fact that the biggest values
of MPN it were observed to JNFb and NFb medium. This medium is semi-specific to
bacteria genera Azospirillum, that is know found in a large variety of crops. In relation
to no diazotrophic study, It was obtained a total of 237 isolated, namely: 40 (17
isolated from pineapple smooth cayenne in NB medium; 25 (10%) from pineapple
smooth cayenne in DYGS medium; 25 (10%) from pineapple pérola in DYGS
medium, and 65 (27) from passion fruit in DYGS medium. At all, the site that showed
the bigger number of isolates was the rhizoplane (52 isolates (22%)), followed by
xiv
xv
phylloplane (47 isolates (20%)) and from histoplane root (42 isolates (22%)). The
preliminary clustering of the isolated based in morphological characteristic of the
colony don’t showed any association with the plant niche that they were isolated.
However futures studies can tell us with this 237 isolates have biotechnological
potential.
1. Introdução
Atualmente o Brasil se apresenta como um dos maiores produtores de frutas
tropicais do mundo, fazendo justiça as suas potencialidades naturais (Simão, 1998).
Produção essa bastante diversificada e distribuída por todas as regiões do país
(Agrianual, 2002), conferindo assim um caráter econômico importante. No caso
específico das culturas do abacaxi, goiaba, mamão e maracujá, tais culturas são
cultivadas em praticamente todo o território, sendo o Brasil um dos grandes
produtores mundiais (Simão, 1998; Amaral, 2000; Souza e Souza, 2000; Aguiar e
Santos, 2001). Apesar disso, a produção brasileira ainda pode crescer muito, uma
vez que sua participação na comercialização no mercado internacional é muito
pequena, pois o que é produzido atualmente no Brasil é utilizado basicamente para
atender a demanda interna (Amaral, 2000; Souza e Souza, 2000; Rossi, 1998;
Aguiar e Santos, 2001).
Associada a potencialidade dessas culturas na geração de divisas para o
país, existe claramente na agricultura mundial, uma demanda por tecnologias
alternativas de produção, que passam necessariamente pela intensificação de
processos biológicos na propriedade agrícola, que possam gerar ganhos
econômicos e ecológicos. Neste sentido, crescem em importância as pesquisas
sobre a população de microrganismos benéficos que colonizam essas culturas.
Microrganismos esses com potencial biotecnológico, como por exemplo, através da
promoção de crescimento. Esses microrganismos interagem com o seu hospedeiro
de diferentes maneiras/intensidades dependendo da região por eles colonizada.
Dessa forma, é possível se verificar diferentes graus de interação planta-bactéria.
Um exemplo seria através da colonização da rizosfera (solo que envolve as raízes e
que sofre constante influência da planta hospedeira através da excreção pelo
vegetal de uma grande diversidade de substâncias que contribuem para a criação de
um micro-ambiente diferenciado do ponto de vista físico-químico e biológico). Tal
micro-ambiente tem sido considerado de transição entre a raiz e o solo (Siqueira e
Franco, 1988), possuindo uma diversidade microbiana bastante diferenciada tanto
das demais regiões do solo, como das regiões da planta hospedeira (Moreira e
Siqueira, 2001; Cardoso e Freitas, 1992).
Outro grupo que interage com os vegetais é o dos microrganismos epífitos
“microrganismos de vida livre que habitam a superfície do vegetal” (Andrews e
1
Harris, 2000). Esses microrganismos estão sujeitos a condições ambientais e
nutricionais completamente diferentes das encontradas na rizosfera e, portanto,
evoluíram sob uma pressão de seleção diferente, resultando numa população
diferenciada com relação às características de superfície do eixo vegetativo da
planta. Embora menos estudados que os microrganismos rizosféricos, no que diz
respeito ao seu potencial agronômico, segundo Andrews e Harris (2000), esses
microrganismos são capazes de desempenhar vários papeis, como por exemplo, a
fixação do nitrogênio e o controle de doenças, o que os torna potenciais alvo de
pesquisa.
E por último, com um grau maior de associação com o seu hospedeiro, do
que os descritos anteriormente estão os microrganismos endofíticos, “bactérias e
fungos que podem ser isolados de tecidos vegetais ou de dentro de plantas cuja
superfície tenha sido previamente desinfestadas, que não apresentem nenhum
efeito danoso à planta” (Hallmann et al., 1997). Embora esse grupo tenha
permanecido esquecido por muito tempo, no final do século XX eles voltaram a ser
alvo de intensos estudos com a descoberta de seu enorme potencial biotecnológico,
principalmente ligado à agricultura (Azevedo, 1997). O fator mais importante no
potencial de utilização desses microrganismos deve-se a sua íntima interação com o
tecido vegetal, uma vez que podem ser encontrados colonizando o interior do
vegetal de forma intercelular ou intracelular (Hallmann et al., 1997), encontrando
assim um meio ‘tamponado’ de modo a lhe proteger das adversidades ambientais,
como estresse hídrico, vento, raios solares e menor competição.
Algumas das importâncias no estudo dos microrganismos diazotróficos está
não só na possibilidade de seu uso como promotores de crescimento, através da
disponibilização para a planta de nitrogênio sob uma forma assimilável, mas
também, como tem sido observado recentemente, nos estudos de controle biológico
e no seu uso como vetores de genes, nesse caso mais especificamente através do
uso dos microrganismos endofíticos (Hallmann et al., 1997, Baldani et al., 2002).
No presente trabalho foi objetivado realizar uma analise biogeográfica da
comunidade microbiana diazotrófica e não diazotróficas associado naturalmente ao
longo do eixo vegetativo de quatro fruteiras tropicais (abacaxi, goiaba, mamão e
maracujá). No caso do estudo com bactérias diazotróficas foi utilizada duas
abordagens: 1) estudo do padrão de distribuição das bactérias diazotróficas através
2
da técnica de número mais provável (NMP), e, 2) isolamento em diferentes meios de
cultura, e sua identificação parcial através de características morfológicas.
2. Revisão de Literatura
2.1 Panorama da Fruticultura O Brasil é um dos maiores produtor mundiais de frutas (Marino et al., 2001).
Sua produção é bastante diversificada (apesar do setor citrícola responder por uma
parcela considerável da produção nacional), incluindo além das espécies de clima
tropical, também algumas frutas de clima temperado (como o caso da uva e da
maçã) (Garcia et al., 1999).
Além disso, esse é um setor onde a produção está distribuída por todas as
regiões do Brasil (Agrianual, 2002), como também dependendo da cultura, pode
representar: 1) rentabilidade acima de 180% (Mendes et al., 2002), 2) grande
absorção de mão de obra (Souza e Souza, 2000) e 3) grande adaptabilidade às
condições de trabalho do pequeno e médio produtor (Ide et al, 2001), o que confere
a fruticultura um importante papel sócio-econômico para o país.
Contudo, apesar do bom posicionamento do Brasil no ranking dos países
produtores de frutas, essa é uma área agronômica ainda com grande potencialidade
de expansão. Isso ocorre não só pela ainda baixa participação do Brasil no mercado
externo (menos de 1%) (Silva e Tranquilini, 1999), como também devido à previsão
de aumento da demanda por frutas devido a uma crescente conscientização da
população das qualidades nutricionais das frutas em geral (Aguiar e Santos, 2001).
Assim, embora o agronegócio seja o principal setor da econômica nacional, tendo
sido responsável no ano de 2006, por cerca de 36% da receita obtida pelas
exportação nacionais (49,4 bilhões de dólares), a receita obtida com as exportações
do setor frutícola em específico foi bastante reduzido (471,8 milhões de dólares)
(Brasil, 2007).
No caso específico do estado do Rio de Janeiro, são muitas as características
que favorecem o desenvolvimento da fruticultura no estado. Algumas dessas
características, inicialmente enumeradas por Gardelha et al. (1996) para a cultura do
abacaxi, podem também serem aplicadas para a fruticultura em geral: grande
população consumidora; proximidade a diversos centros consumidores como São
Paulo e Minas Gerais; boa disponibilidade de infra-estrutura de transportes marítimo
3
e aéreo, possibilitando o comercio no mercado internacional. Segundo revisado por
Golynski (2005), outra característica favorável ao desenvolvimento da fruticultura no
estado do Rio de Janeiro seria a elevada renda média per capita da população do
estado.
Segundo levantamento contido no Anuário Estatístico do Estado do Rio de
Janeiro 2001, entre os anos de 1996 e 2000, ocorreram fortes oscilações na área
colhida dessas culturas. Contudo, com a implementação de projetos de fruticultura
irrigada no norte do estado, aliado ao desenvolvimento de pesquisas, que vão desde
o desenvolvimento de sementes melhoradas, melhoria da condição da lavoura, até a
implementação de uma biofábrica de cultura de tecidos, que visa à produção de
milhares de mudas anualmente, essa região pode se tornar mais uma forte
candidata a se transformar num pólo de fruticultura a exemplo do que ocorre no vale
do São Francisco.
As culturas do abacaxi, goiaba, mamão e maracujá, objeto da presente tese,
têm em comum o fato de serem culturas de clima tropical, cultivadas em todas as
regiões do país, e na maioria dos estados (Agrianual, 2002; Aguiar e Santos, 2001).
Além disso, como ocorre para a maioria das demais fruteiras, essas culturas têm sua
produção destinada quase que exclusivamente ao mercado interno (Souza et al.,
2000; Marino et al., 2001), além de terem o Brasil como um dos maiores produtores
(Souza, 2007).
No caso do abacaxi, segundo o revisado por Amaral (2000), três países,
Tailândia, Brasil e Filipinas, são os responsáveis por 40% da produção mundial.
Segundo Souza e Souza (2000), foi na década de 90 que a cultura do abacaxi teve
sua área e volume aumentados, até mesmo na região Norte do país, onde
anteriormente não se apresentava uma grande produção. A principal região
produtora é o Sudeste (sendo o estado de Minas Gerais o principal produtor),
seguido pela região Nordeste, tendo o estado da Paraíba como principal produtor.
A cultura da goiaba tem como seus maiores produtores o Brasil, Índia,
Paquistão, México, Egito e Venezuela (Ide et al., 2001). Para Gonzaga Neto (2001),
será com a divulgação de seus valores nutricionais que se espera que no futuro
ocorra uma elevação de sua venda e do consumo. O destino da goiaba produzida é
bastante variável. Segundo Ide et al., 2001, no caso do estado do Rio de Janeiro,
43,7% da produção vai para os intermediários, 27,5% para cooperativas; 15,4% vai
para a indústria de doces e sorvetes; 8,3% é vendida diretamente pelo produtor e
4
5,1% é utilizado pelos próprios produtores para a fabricação de doces caseiros,
geléias, sorvetes e outros.
Quanto à cultura do Mamão, além do Brasil, que responde por
aproximadamente 45% da produção mundial (Souza, 2007), a Nigéria, o México, a
Índia e a Indonésia são os maiores produtores dessa fruta (Souza, 2001). Em nível
nacional, segundo o levantamento feito por Souza (2007), a Região Nordeste tem se
apresentado como o principal produtor da cultura, seguido pelas regiões Sudeste,
Norte, Centro Oeste e Sul. Os principais estados produtores são Bahia, Espírito
Santo, Ceará e Rio Grande do Norte.
A cultura do Maracujá tem sofrido aumento na sua produção nas últimas
décadas, devido ao aumento de sua produtividade (Gonçalves e Souza, 2006;
Aguiar e Santos, 2001). Sua produção tem sido destinada tanto para o consumo in
natura como para a produção de suco (sendo essa última a principal forma de
comercialização no mercado exterior) (Aguiar e Santos, 2001). Segundo o revisado
por Gonçalves e Souza (2006), a nível nacional os principais estados produtores
são: Bahia; Espírito Santo; São Paulo; Rio de Janeiro e Ceará.
2.2 Biogeografia de Microrganismos: São várias as definições do termo ‘biogeografia’, umas mais e outras menos
abrangentes, de forma que o conhecimento das diferentes definições relatadas em
diversos estudos pode dar uma idéia geral do que trata esse ramo da biologia.
Martiny et al., (2006) define biogeografia como “o estudo da distribuição da
biodiversidade no espaço e no tempo” para descobrir onde os organismos vivem,
qual sua quantidade e porque (encontram-se em dado sítio). Para Andrews e Harris
(2000), o termo biogeografia está relacionado ao estudo da distribuição dos
organismos no espaço e dos fatores responsáveis pelo padrão de distribuição
observado. Já Ramette e Tiedje (2006), definem biogeografia (de procarioto) de
duas formas, uma mais específica e outra mais abrangente. Na primeira esses
autores chamam biogeografia de ‘a ciência que documenta a distribuição espacial de
procariotos no ambiente numa escala local, regional, e continental’. No nível mais
abrangente esses autores definem biogeografia como ‘uma disciplina que examina a
variação de característica dos microrganismos (ex: genética, fenotípica e fisiológica)
em diferentes escalas espaciais’. Embora Posadas et al., (2006) definam de forma
bastante simples biogeografia como ‘o estudo da distribuição geográfica dos
5
organismos’, esses autores separam a biogeografia em dois tipos: biogeografia
descritiva (‘estudo do padrão de distribuição’) e interpretativa (‘estudo das causas do
padrão de distribuição observado’). Esses autores ainda diferenciam biogeografia
interpretativa em ecológica e histórica, que segundo revisado por eles apresentam
como diferença a escala de tempo de estudo, sendo a primeira de escala mais curta,
e a segunda de uma escala de tempo de milhões de anos.
Segundo o revisado por Ramette e Tiedje (2007), a formação de perfil
biogeográfico em microrganismos se deve geralmente a combinação de três
processos:
(1) Especiação: que poderia se dar principalmente pela mutação, recombinação,
transferência lateral de genes e rearranjo genômico, em um ambiente
protegido por barreiras;
(2) Dispersão: Tal processo dependeria da combinação de condições climáticas
favoráveis (ex., ventos e tempestades), vetor de disseminação (ex., correntes
oceânicas, poeira, sementes de plantas) e de existência de estágios no ciclo
de vida bacteriano, que o tornaria mais resistente ao transporte de longas
distancias.
(3) Extinção: para esses autores, esse é o processo mais questionável dos três.
Contudo, segundo os referidos autores, tal processo ocorreria numa condição
onde os microrganismos estariam em uma condição de serem lavados de
seus nichos de origem ou pelo esgotamento de fontes nutricionais.
2.3 Biogeografia de bactérias associadas a vegetais Há décadas, as diferentes formas de interação entre microrganismos e
vegetais, bem como os efeitos daqueles em relação a estes, têm sido alvo de
intensa pesquisa da comunidade científica, de modo que hoje é vasta a quantidade
de informações desde o nível fisiológico até o molecular dessa interação.
Sob o aspecto biogeográfico, o que se sabe hoje é que todo o corpo vegetal, seja a
sua superfície ou seu tecido interior, pode ser colonizado por microrganismos. Essa
colonização pode se dar na raiz, caule, folhas, frutos e flores (Hallmann et al., 1997;
Andrews e Harris, 2000).
Contudo, diferentes espécies de microrganismos têm diferentes graus e
formas de interação com diferentes espécies de plantas. O que pode se dar tanto
através de uma interação indireta, através da colonização da região do solo
6
rizosférico, ou através de um contato direto, com a colonização dos tecidos internos
(microrganismos endofíticos), ou da região superficial do vegetal (microrganismos
epifíticos), como a superfície da raiz (rizoplano); superfície do caule (cauliplano); e
superfície da folha (filoplano). Cada um dos três sítios apresentados acima,
apresenta particularidades quanto à concentração de O2, CO2, pH, disponibilidade
de nutrientes, susceptibilidade a diferentes adversidades ambientais e
conseqüentemente a presença e predominância de deferentes grupos microbianos,
como também níveis de diversidade microbiana e sua afinidade com o hospedeiro
(Andrews e Harris, 2000). Wieland et al. (2001) observaram que o perfil da
comunidade microbiana na rizosfera e no rizoplano é alterado devido tanto a
variações da espécie vegetal como da fase de desenvolvimento da planta. Seldin et
al. (1998) observaram diferença significativa a nível intra-especifico da bactéria da
espécie Paenibacillus azotofixans associadas à cultura do milho, entre os isolados
do rizoplano, rizosfera e de solo não rizosférico, demonstrando assim pressões de
seleção diferenciadas de acordo com o sítio em contato com o vegetal.
Apesar dos microrganismos relacionados às plantas já serem alvo de estudo
há anos, estudos recentes através do uso de meios de cultura, têm revelado a
existência de microrganismos até então não descritos. Muitos destes, pertencentes a
grupos de microrganismos que já se pensava serem bem estudado (Bagwell et al.,
1998, Caballero-Mellado et al., 2007). Isso tem dando respaldo aos estudos de
bactérias presentes no ambiente através de seu isolamento em meio de cultura,
apesar de suas conhecida e já bem relatadas limitações, retratada pela frase ‘a
anormalidade da contagem em placa’ revisada por Amann et al. (1995).
2.3.1 sítios de colonização de bactérias em vegetais: -A rizosfera:
A rizosfera é a região do solo que envolve as raízes e que sofre constante
influência da planta hospedeira através da excreção pelo vegetal de uma grande
diversidade de substâncias, tais como exsudados e lisados radiculares, mucigel,
resíduos de parede celular e células vegetais intactas, que contribuem para a
criação de um micro-ambiente diferenciado do ponto de vista físico-químico e
biológico (Cardoso e Freitas, 1992). Esse fato contribui para o desenvolvimento de
um micro-ambiente diferenciado (e mais estabilizado), tanto em relação ao solo em
volta dela, como com relação às demais regiões do vegetal, no que diz respeito a
7
características química, físicas e biológicas (Moreira e Siqueira, 2002), oferecendo
um ambiente relativamente estabilizado contra as adversidades do meio (efeito
rizosférico). Um exemplo disso é o demonstrado pelos estudos de Lovell et al.
(2001), que avaliando o efeito da aplicação de diferentes tipos de nutrientes na
microbiota da rizosfera de Spatina alterniflora, observaram uma grande estabilidade
na microbiota da rizosfera dessa cultura. Além disso, as substâncias excretadas
presentes nesse sítio estão também intimamente relacionadas às diferentes formas
de sinalização entre as diversas formas de vida presente nesse sitio (Bais et al.,
2006), que podem proporcionar tanto resultados positivos, do ponto de vista vegetal,
como negativo.
A espessura da rizosfera varia entre 0,4 a 5 mm em torno da raiz, o que irá
depender do tipo de solo e da morfo-fisiologia da raiz (Cardoso e Freitas, 1992,
Moreira e Siqueira, 2002). Essa aparente tênue região que separa e, ao mesmo
tempo, faz a união entre o solo e o vegetal, abriga uma diversidade tal de
microrganismos responsável pela realização de inúmeras reações, muitas delas
imprescindível para o bom desenvolvimento do vegetal, tais como decomposição,
mineralização da matéria orgânica, fixação biológica de nitrogênio, nitrificação,
amonificação, agregação e estabilização de agregados do solo, etc (Cardoso e
Freitas, 1992, Moreira e Siqueira, 2002). Dessa forma, nesse sítio é possível ser
encontrada uma grande diversidade de microrganismos, que podem contribuir para
o bom desenvolvimento do vegetal, tanto através da promoção de crescimento,
como através do combate a possíveis patógenos. Segundo Siqueira & Franco
(1988), ‘os microrganismos antagonistas na rizosfera constituem a defesa mais
externa das plantas contra o ataque de patógenos’ resultado da antibiose,
competição, parasitismo e predação. Além disso, segundo os mesmos autores, de
0,1 a 1% da população microbiana da rizosfera é capaz de fixar nitrogênio, alguns
deles na ordem de 100 Kg ha-1ano-1.
-O ambiente Epifítico:
Esse ambiente é a extensão da superficial do vegetal que se estende desde a
coifa até o meristema apical caulinar. Os microrganismos epifíticos têm sido
definidos por Andrews e Harris (2000), como aqueles “microrganismos de vida livre
que habitam a superfície do vegetal excluído os patogênicos”, colonizando a
superfície da raiz (rizoplano); superfície do caule (cauliplano); e superfície da folha
8
(filoplano). Segundo Moreira e Siqueira, 4 a 10% da superfície do sistema radicular
estão colonizadas por microrganismos, sendo que os micro-sítios mais favoráveis à
colonização são as regiões da raiz, onde é abundante a disponibilidade de
exsudados e de matéria orgânica, como por exemplo, as junções das células
epidérmicas ou em aberturas causadas por injúrias. De acordo com Andrews e
Harris (2000), eles são capazes de efetuar uma grande diversidade de reações,
como as envolvidas na fixação biológica de nitrogênio, o que confere a esse habitat
uma grande importância ecológica e conseqüentemente o torna alvo de estudos
para o seu melhor conhecimento, como também para a obtenção de microrganismos
com diferentes características e potenciais agronômicos. Dentre as diferentes partes
da planta, é a sua superfície a parte que se encontra mais susceptível aos mais
variados tipos de adversidades (Andrews e Harris, 2000). Segundo o revisado por
estes autores, o vegetal apresenta diferentes regiões onde ocorre uma grande
variação não só de quantidade de nutriente e água, como também, variação na
exposição a diferentes tipos de adversidade ambientais, tais como
disponibilidade/exposição de ar, sol, vento e chuva, o que deverá influenciar na
população microbiana existente em cada um dessas regiões. Leben e Daft (1966)
avaliaram a variação das populações de bactérias epifíticas de espécies vegetais e
observaram que a população de microrganismos epifíticos era altamente variável
entre as diferentes espécies vegetais, e altamente dependente da precipitação da
região e principalmente do período de tempo em que se tinha água disponível na
superfície do vegetal. Wilson et al. (1999), estudando o comportamento de
microrganismos patogênicos e não patogênicos na superfície de folhas de feijão,
observaram que sob condições de estresse, como por exemplo, com tratamento
com peróxido de hidrogênio, radiação UV ou condições limitantes de umidade, as
bactérias tendiam a se proteger, abrigando-se em sítios estratégicos na superfície
da folha. A superfície de folhas de mangueiras foi estudada por Jager et al. (2001),
que observam que a diversidade e o número das bactérias foram bastante
dependentes não só do estádio de desenvolvimento da folha, como também da
posição da folha na planta, mostrando assim a influencia da incidência dos raios
solares.
9
-O ambiente endofítico: Embora já se conheçam os microrganismos endofíticos desde o início do
século XIX, conforme revisado por Azevedo (1997), até recentemente existia certa
confusão quanto à definição do que (e quem) seria um endófito (Azevedo, 1997;
Hallmann et al., 1997; Saikkomen et al., 1998). Apesar de ainda há pouco tempo
esse termo ter sido aplicado quase que exclusivamente para fungos, como
mencionado por Sturz e Nowak (2000), ele se refere a fungos e bactérias (Chanway,
1996). Hallmann et al. (1997) em sua revisão sobre bactérias endofíticas, encontrou
várias definições para o termo endófito, sendo cada uma mais ou menos
abrangente, como por exemplo: 1) “bactérias que residem dentro do tecido da
planta, sem produzir substâncias danosas ou ter outro benefício que não o sítio de
colonização”; 2) “bactérias que estabelecem simbiose com a planta, pela qual a
planta recebe benefícios da presença desse simbionte, como aumento da tolerância
ao estresse ou promoção do crescimento da planta” e; 3) “bactérias que podem ser
isoladas de superfícies de tecidos vegetais desinfestados ou extraídas de dentro da
planta, que não são visivelmente nocivas à planta e, aquelas bactérias que durante
sua fase epífita, se alternam entre a colonização endófita e epífita". Talvez a
possível causa dessa confusão na definição dos microrganismos endófitos se deva
ao fato de que esses microrganismos só foram realmente alvo de pesquisa a partir
do final dos anos 70, devido à descoberta de que esse grupo de microrganismos
possuía importantes propriedades biotecnológicas a serem exploradas (Azevedo,
1997) e não são apenas simples patógenos latentes ou muito menos uma
contaminação de uma esterilização mal sucedida (Thomas e Graham, 1952,
revisados por Sessitch, 2002). Os microrganismos endofíticos existem em
praticamente todas as plantas terrestres e penetram no tecido vegetal através de
aberturas naturais da planta (como estômatos, lenticelas, hidatódios) ou feridas
(provocadas pela emergência das raízes secundárias; pelo atrito do crescimento das
raízes com o solo; provocadas por insetos ou fungos), tendo como fonte a semente,
o solo rizosférico, o material de propagação vegetal e o filoplano (Hallmann et al.,
1997). Esses microrganismos podem se localizar na semente, tubérculo, raiz, caule,
folha e frutos, tanto no espaço intercelular quanto no intracelular (aqui mais
raramente) ou nos vasos condutores (Hallmann et al., 1997).
Na relação microrganismo endófito – planta, o primeiro recebe alimento e
abrigo da planta, onde fica protegido das adversidades ambientais e da competição
10
com uma grande diversidade de microrganismos existentes em ambientes como o
solo. Essa proteção tem sido apontada como uma de suas principais vantagens para
seu uso, tanto como inoculante (Sturz e Nowak, 2000) como vetores de genes
(Hallmann et al., 1997, Baldani et al., 2002). Em troca dessas vantagens os
microrganismos endófitos têm o potencial de promover uma série de benefícios ao
seu hospedeiro.
2.3.2 formas de disposição: solitária (ou planctônica) x biofilme (ou agregados): Os microrganismos apresentam-se colonizando o ambiente em geral sob um
gradiente de disposição que pode variar desde uma única célula, disposição solitária
ou planctônica, até formar uma estrutura bastante complexa e organizada,
denominada de agregado ou biofilme. Tais estruturas organizadas são formadas
principalmente por exopolissacarídeos, proteínas e DNA (Davey e O`Toole, 2000,
Ramey et al., 2000). Segundo um definição bastante simples de O`Toole et al.,
2000, biofimes são “...comunidades de microrganismos que são aderidos a um
superfície” e que “podem ser formados por apenas uma espécie de microrganismos,
ou por múltiplas espécies de microrganismos, e podem se formar numa em
superfícies bióticas ou abióticas”. Ainda segundo esses mesmos autores, tal forma
de organização seria um ‘ponto estável do seu ciclo biológico, que seria formado
pelas etapas de iniciação, maturação, manutenção e dissolução’. Segundo Revisado
por Davey e O`Toole et al. (2000), alguns microrganismos prefeririam a disposição
em biofilme ao invés de uma disposição solitária para se proteger contra as
adversidades do ambiente, para otimizar a disponibilidade de nutrientes, como
também para contribuir com a remoção de metabólicos tóxicos, e para favorecer a
transferências horizontais de genes.
Um exemplo de proteção por biofilme associado à planta foi demonstrado por
Jacques et al., (2005). Nesse estudo, os autores demonstraram que os
microrganismos que formavam biofilmes na superfície da folha eram mais
resistentes as condição de estresse (baixa umidade relativa). Além disso, a
população das bactérias sob essa forma de disposição foram mais estáveis durante
o desenvolvimento do vegetal. Os biofilmes podem estar presentes em várias partes
do vegetal (Davey e O`Toole 2000, Ramey et al., 2004). No caso da superfície da
folha, essa forma de disposição pode responder por até 70% da população
11
bacteriana total (Monier e Lindow, 2004). Nesse caso, sua disposição não parece
ser aleatória, tendo em vista os estudos realizados por Monier e Lindow (Monier e
Lindow, 2004), que objetivaram quantificar a freqüência e o tamanho de agregados
microbianos na região da folha. Segundo o revisado por Ramey et al., 2004, os
biofilmes podem ser formados em diversos sítios da planta, por diversos
microrganismos de conhecida importância agronômica, tais como: rizosfera
(Pseudomonas putida, Azospirillum brasilense, bactérias do grupo dos rizóbios e
Agrobacterium tumefaciens), sementes (Pseudomonas putida), tecidos internos
(Xylella fastidiosa, Ralstonia solanacearum), filoplano (Pseudomonas syringae)
(Ramey et al., 2004).
O escasso número de trabalhos avaliando o potencial agronômico desses
microrganismos (principalmente do cauliplano e filoplano), provavelmente se deva
ao descuido em estudá-lo em separado durante o processo de isolamento, através
da homogeneização do tecido vegetal como um todo (Weber et al., 1999), ou
mesmo do desinteresse da comunidade científica agronômica, caracterizada pela a
eliminação das bactérias que colonizam a superfície do tecido, através de sua
esterilizarão superficial, com o intuído de isolamento exclusivo das bactérias
endofíticas. Contudo, nos parece oportuno, em se tratando de estudo inicial da
diversidade de bactérias associadas às espécies frutíferas em questão, um estudo
mais holístico das bactérias que colonizam as diferentes partes dessas fruteiras,
através da caracterização bacteriológica rizosférica, endofítica e epifítica. No caso
da cultura do abacaxi, relatos da bio-prospecção das bactérias diazotróficas, embora
não tão detalhado quanto o objetivado no presente projeto, servem para mostrar a
potencialidade dessas culturas de figurarem como hospedeiros desse importante
grupo de bactérias (Weber et al., 1999; Cruz et al., 2001).
2.4 Biogeografia de Bactérias Diazotróficas: Algumas revisões recentes que tratam da colonização de plantas não
leguminosas por bactérias fixadoras de nitrogênio, têm revelado um enorme avanço
nas últimas décadas nos estudos voltados para a análise dos diferentes aspectos da
interação planta-microrganismo (James e Olivares, 1997; Baldani et al., 1997;
Muthukumarasamy et al., 2002; Reis et al., 2000; Baldani e Baldani, 2005). Para
isso, a exemplo do que tem ocorrido nos diferentes ramos da microbiologia, a
comunidade científica tem se utilizado de um arsenal de diferentes ferramentas
12
metodológica, como as baseadas no isolamento em meio de cultura, microscopia,
uso de anticorpos e abordagem independentes de cultivo (James e Olivares, 1997;
Reis et al., 2000; Baldani e Baldani, 2005).
A história do estudo dos microrganismos diazotróficos, quanto aos sítios
objeto de estudo, foi divida por Baldani et al., (1998), em três fases:
Fase 1 - essa fase se concentrou na análise da comunidade microbiana que se
encontravam na região do solo e da rizosfera.
Fase 2 e 3 – nessas fases foram analisados os microrganismo endofítico. A
diferença entre elas, é que a primeira se dedicou aos microrganismos endofíticos
facultativos (fase 2), e a segunda foi marcada pelo estudo dos microrganismos
endofíticos então considerados de obrigatório (fase 3).
Quanto ao aspecto ecológico da interação, embora tenham ocorrido estudos
baseados em técnicas independentes de cultivo, a grande maioria das informações
obtidas nessa área tem sido o resultado de estudos que têm como objetivo principal
a bioprospecção e a caracterização de novas espécies bacteriana. Dessa forma, tais
estudos têm proporcionado além da identificação de novas espécies, também o
avanço nos estudos de biogeografia descritiva e interpretativa, e assim tem
contribuído no entendimento do padrão de distribuição microbiano relacionados aos
vegetais no que diz respeito no binômio ‘tempo-espaço’.
Exemplo disso foi o estudo realizado na Índia por Suman et al. (2001), que
tinha como o objetivo principal o isolamento de bactérias diazotróficas capazes de
colonizar naturalmente o interior do tecido da raiz de diferentes genótipos da cultura
da cana-de-açúcar. Os pesquisadores observaram que dependendo do genótipo da
planta em questão, a incidência de bactéria diazotrófica capaz de crescer em meio
LGI-P chegou até 3.86% da população total de bactéria endofítica, alcançando uma
densidade de 105 bactérias por grama de tecido. A analise de diversidade genética
mostrou que alguns dos isolados bacterianos apresentaram grande similaridade com
conhecidas espécies de bactérias diazotróficas como Gluconacetobacter
diazotrophicus, e as pertencente ao grupo dos Azospirillum.
Já Mirza et al., 2001, conseguiram detectar uma população entre 106 e 107
bactéria diazotróficas por grama de tecido do caule e da raiz, respectivamente.
Esses autores conseguiram isolar um total de quatro bactérias diazotróficas,
pertencentes ao grupo das Entobacter sp. Esses isolados também foram capazes de
produzir ácido indolacético. Além disso, estudos de promoção de crescimento
13
mostraram que alguns desses isolados quando inoculados com a cultura da cana-
de-açúcar, foram capazes de proporcionar um aumento significativo em diferentes
parâmetros agronômicos dessas culturas.
Em outro estudo, misto de biogeografia descritiva e interpretativa, realizado
por Brasil et al. (2005), esses autores além de ter tido sucesso no isolamento de
diferentes espécies de bactéria diazotróficas a partir de raiz, parte aérea e solo, de
diferentes espécie de pastagens cultivadas na época de cheia e da seca na região
do pantanal mato-grossense, também observaram o efeito negativo do excesso de
água no solo sobre a população de bactérias associada à raiz.
Perin et al, (2006), em um estudo de biogeografia descritiva, realizaram o
isolamento de 111 isolados bacterianos capazes de fixarem nitrogênio pertencentes
ao gênero Burkholderia a partir das culturas de milho e cana-de-açúcar cultivadas no
Brasil (B. unamae; Burkholderia sp.) e no México (B. tropica; B. unamae e
Burkholderia sp.). Essas bactérias foram isoladas a partir da rizosfera (33), rizoplano
(1), histoplano-raiz (31), histoplano-folha (5) e da porção sem prévia separação entre
as rizosfera e o rizoplano (33 isolados).
Também trabalhando com a cultura do milho, no entanto em um trabalho que
apresentou ambos os enfoques, de biogeografia descritiva e interpretativa, Roesch
et al. (2006) observaram que o número de bactérias diazotróficas apresentou tanto
variação espacial (em função da parte da planta) como variação temporal (em
função do desenvolvimento ontogênico da planta). No primeiro caso, os autores
observaram que o tamanho da população diazotrófica foi menor nos tecidos do caule
e na região da rizosfera e maior na raiz (nesse caso, rizoplano e histoplano-raiz).
Quanto ao efeito do desenvolvimento ontogênico da planta, foi observado que esse
parâmetro só influenciou o número de bactérias diazotróficas da raiz (rizoplano e
histoplano-raíz). Tal efeito deveu-se ao fato de ser na região da raiz onde ocorrem
as maiores oscilações de nitrogênio durante o desenvolvimento do vegetal, o que
não ocorre com o interior do caule, devido à pronta disponibilidade de nutrientes
desse sítio, resultando assim numa menor sensibilidade da sua população às
variações ontogênicas.
Já o trabalho de biogeografia interpretativa (biogeografia histórica ou
biogeografia filogenética) realizado por Caballero-Mellado et al., 1995, teve como
objetivo o estudo da diversidade de representante dessa espécie bacteriana isoladas
de diferentes partes da planta de cana-de-açúcar oriunda de diferentes países
14
(México, Brasil, Uruguai, e Austrália). Nesse estudo, devido ao baixo grau de
similaridade encontrado, os pesquisadores concluíram que essa espécie bacteriana
tem recente origem evolutiva.
Assim, após anos de pesquisas voltadas para a bioprospecção e identificação
de bactérias diazotróficas, a microbiologia ambiental tem presenciado (e se
beneficiado com) o descobrimento de uma comunidade microbiana bastante diversa,
pertencente a diferentes gêneros (Beijerinchia spp., Azospirillum spp.,
Gluconacetobacter spp., Herbaspirillum spp., Burkholderia spp.), e também mais
cosmopolita do que se pensava anteriormente, apresentado-se com capacidade de
colonização de diferentes espécie vegetais (Reis et al., 2000; Muthukumarasamy et
al., 2002; Baldani e Baldani, 2005).
Dessa forma, como se pode constatar acima, os estudos biogeográficos de
bactérias diazotróficas associadas a gramíneas não só são bastante numerosos,
como também se encontram num estágio bastante avançado. Por outro lado, os
estudos voltados para a associação entre esse grupo de bactérias e plantas
frutíferas (ou outras espécies vegetais não leguminosas e não gramíneas) só
recentemente começaram a ser realizados.
Os trabalhos de isolamento e identificação de bactérias diazotróficas a partir
da cultura do café são alguns dos estudos pioneiros (Jimenez-Salgado et al., 1997;
Fuentes-Ramirez et al., 2001). No primeiro deles, que tratou de um estudo de
biogeografia descritiva, onde se objetivou detectar a bactéria Gluconacetobacter
diazotrophicus em associação a diferentes sítios da cultura do café, foram obtidos
isolados bacterianos a partir tanto da rizosfera, como do interior da raiz e do caule
pertencente ao gênero Acetobacter, alguns identificados como Acetobacter
diazotróficas, e outros com características fenotípicas diferentes o suficiente para,
apesar de serem agrupadas no gênero acetobacter, não serem classificados como
aquela espécie. Contudo, anos depois, algumas destas bactérias, juntas com outros
isolados obtidos a partir da rizosfera e do rizoplano da cultura do café, foram
classificado como uma nova espécie, G. johannae e G. azotocaptans (Fuentes-
Ramirez et al., 2001).
Dentre as fruteiras, o abacaxizeiro tem sido uma das mais estudadas. Num
desses trabalhos (Tapia-Hernandez et al., 2000), que teve um aspecto de
biogeografia descritiva, foram obtidos bactérias da espécie G. diazotrophicus a partir
15
das raízes, caules e folhas. Além disso, na análise da freqüência de isolamento
observaram um percentual de isolamento de até oitenta por cento.
Um dos trabalhos pioneiro teve como plantas alvo o abacaxizeiro e a
bananeira realizados por Cruz et al. (1999). Nesse trabalho de isolamento e de
biogeografia descritiva de bactéria diazotróficas, embora os autores não tenham tido
a preocupação de acessar separadamente a comunidade microbiana epifítica e
endofítica, o fato de terem procurado isolar bactérias que colonizam naturalmente
diferentes partes da planta (raiz, caule, folha e fruto), confere uma grande
importância ecológica. A análise da diversidade genética de trinta e oito isolados
bacterianos revelou a presença de bactéria da espécie Herbaspirillum seropedicae,
H. rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis e B. tropicans.
Em um trabalho recente de biogeografia descritiva (Caballero-Mellado et al.,
2007), 54 bactérias fixadoras de nitrogênio pertencentes ao gênero Burkholderia
foram isoladas a partir do rizoplano e da rizosfera de tomate. Dentre esses isolados
foi possível identificar a presença das espécies B. unamae, B. xenovorans, B. tropica
e também de duas outras espécies de bactérias ainda não identificadas.
A espécie de bactéria diazotrófica G. diazotrophicus foi alvo de um estudo de
biogeografia descritiva (Madhaiyan et al., 2004), que embora tenha objetivado isola-
la a partir do interior do tecido de uma vasta diversidade de espécies vegetais (que
variou desde os clássicos cereais (como milho, sorgo), plantas fruteiras (ex: goiaba,
e mamão) plantas ornamentais (ex: hibiscus) e culturas comerciais de grande porte
(ex: coco e café)), só obtive sucesso no isolamento a partir das cultura da cenoura,
rabanete, beterraba e café. Em outro trabalho, onde a bactéria diazotrófica
Gluconacetobacter diazotrophicus era o alvo de estudo (Pinôn et al., 2002), foi
observado que essa bactéria tem capacidade de lisar a parede celular do patógeno
Xanthomonas albilineans.
Pedraza et al., (2007) confirmaram a associação natural da espécie de
bactéria diazotrófica Azospirillum diazotrophicus tanto na superfície, como no interior
da raiz e do estolão, nas seguintes quantidades (4,5x104, 2,5x104 e 2X102) da
cultura do morango. Esses autores também observaram que esses isolados
bacterianos também eram capazes de produzir fitormônios e sideróforos.
Junto a esses estudos que tem contribuído para elucidar o aspecto
biogeográfico da interação planta bactéria diazotrófica, uma bateria de experimento
tem sido realizado, seja no mesmo artigo que aborda biogeografia ou em artigos
16
subseqüentes (Oliveira et al., 2002., Weber et al., 2000, Weber et al., 2003), com o
objetivo de selecionar aqueles isolados bacterianos com potencial biotecnológico.
2.5 Potencial biotecnológico de bactérias associadas a vegetais No campo da promoção do crescimento, a fixação biológica de nitrogênio foi
um tema bastante abordado por Dobereiner et al. (1995ª). Conforme revisado por
Döbereiner et al. (1995a), algumas bactérias diazotróficas (Gluconacetobacter
diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae e H. rubrisubalbicans) têm sido
encontras colonizando endofiticamente o interior de raízes, caule e folhas de cana
de açúcar, o que pode ser o fator responsável pela alta contribuição da fixação
biológica de nitrogênio em cana de açúcar. Olivares et al. (1996), observaram que a
bactéria H. seropedicae é um endófito presente em raízes, caule e folhas de um
grande número de espécies de gramíneas. Também no campo da FBN, Sevilla et al.
(2001) confirmaram pesquisas anteriores sobre os benefícios promovidos pela
bactéria endofítica G. diazotrophicus sobre a cultura da cana de açúcar. Nesse
experimento foi observado que quando plantas de cana de açúcar, cultivadas sob
condição de deficiência de nitrogênio, eram inoculadas com aquela bactéria, tinham
um maior teor de N total ao 60 dias após o cultivo do que as plantas inoculadas com
a mesma espécie de bactéria mutante para o gene Nif (gene estrutural da enzima
nitrogenase) ou do que plantas não inoculadas. Indicando assim que a transferência
do N fixado pela bactéria para a planta de cana de açúcar pode ser o mecanismo
envolvido na promoção de crescimento realizado pela bactéria G. diazotrophicus.
Frommel et al. (1993), observaram que a inoculação de Pseudomonas sp. na cultura
da batata estimulou a emergência da planta e o crescimento das raízes na fase
inicial de seu desenvolvimento, como também antecipou a formação de estolões,
tubérculos e a produção de tubérculos de tamanho comercial. Como esses
estímulos ocorreram concomitantemente com a diminuição da densidade
populacional das bactérias que naturalmente habitam a superfície radicular, esses
autores acreditam que aquele estímulo ao crescimento se deu de forma indireta,
com a possível diminuição de fitopatógenos que ocorrem no solo naturalmente.
Já no campo do controle biológico, Barka et al. (2002) observaram a
ocorrência de inibição do crescimento do fungo patogênico (Botrytis cinerea) na
cultura da uva, quando este era inoculado dois dias depois da inoculação da planta
com a bactéria endófita Pseudomonas sp. estirpe PsJN. Segundo esses autores, a
17
bactéria agiu danificando a parede celular do fungo, e promovendo a sua morte. Em
um estudo feito com o objetivo de observar se as bactérias isoladas do tubérculo de
batata são fonte de controle do patógeno Erwinia carotovora var. atroseptica, Sturz e
Matheson (1996) observaram que essa espécie possui endófitos naturais inibidores
daquele patógeno, e que o genótipo da planta é um fator determinante da
diversidade desses endófitos, de modo que a percentagem de endófitos isolados
variou consideravelmente com as variedades estudadas. Um estudo semelhante ao
anterior foi o desenvolvido por Benchimol et al. (2000). Nesse experimento, os
autores buscaram avaliar o potencial de endófitos naturais isolados da cultura de
pimenta do reino como possível agente de controle biológico contra o patógeno
Fusarium solani f. sp. piperis, através do seu isolamento seguido de sua inoculação
em plantas de pimenta do reino a serem cultivadas em solo na presença do
patógeno. Os resultados mostraram que um dos isolados (Methylobacter
radiobacter) não só foi capaz de controlar a ação do patógeno, reduzindo
significativamente o número de plantas mortas, como também funcionou como
promotor de crescimento na ausência do patógeno. Zehnder et al. (2001), relataram
experimentos realizados com a cultura do pepino onde foi observado que a
aplicação de PGPR (“Plant Growth-Promoting Rhizobacteria”) em plântulas dessa
cultura induziu resistência sistêmica contra a murcha bacteriana, tanto devido à
inibição de um composto naturalmente produzido pela planta, que provavelmente a
tornaria mais palatável para o inseto vetor do patógeno relacionado com a doença,
como pela promoção da síntese de compostos (como por exemplo, fitoalexinas e
outros compostos envolvidos na indução de resistência sistêmica) que atuariam
contra o patógeno após ele ter sido introduzido na planta. Reiter et al. (2002)
observaram que a inoculação do patógeno Erwinia carotovora subsp. atroseptica
promoveu um aumento da diversidade de microrganismos endófitos, pertencentes a
uma grande diversidade de grupos bacterianos, estando muito deles envolvidos na
defesa da planta da ação daquele patógeno. Sharma et al. (1998), observaram que
a bacterização in vitro de plantas de tomates com bactérias Pseudomonas sp.
Estirpe PsJN, não só promoveu um maior crescimento da planta de tomate, mas
também promoveu um aumento da resistência da planta contra o fungo verticillium
wild. Sutra et al. (2000), buscando isolar bactérias do grupo das pseudomona
fluorescente da rizosfera da raiz com potencial antagonista a uma doença fungica,
18
obtiveram 58 isolados, dos quais 6 apresentaram capacidade de antagonismo contra
o fungo Cylindrocladium, um patógeno da cultura da bananeira.
Em um estudo feito com o objetivo de avaliar o efeito da inoculação do fungo
endófito Acremonium coenophialum em plantas forrageiras (Arachevaleta et al.,
1989) com respeito a diferentes tipos de estresse ambientais (excesso de água,
diferentes teores de nitrogênio, déficit hídrico), foi constatado que esse fungo foi
capaz não só de estimular o crescimento vegetal, como também induziu resistência
contra uma condição de estresse hídrico. Por outro lado as plantas não infectadas
morreram. Em um outro estudo, Zaurov et al. (2001) avaliaram o efeito da
inoculação de fungos endófitos na indução de resistência da planta contra o estresse
promovido devido altos teores de alumínio. Os resultados mostram que embora o
fungo sozinho não seja o responsável pela indução de resistência a altos teores de
alumínio, em certas combinações planta-fungo, a infecção do endófito pode
contribuir para melhorar sua tolerância.
19
3. Material e Métodos:
3.1. Isolamento de bactérias diazotróficas associadas a fruteiras: As Plantas utilizadas foram obtidas na Fazenda Agroecológica da Embrapa
Agrobiologia, localizado no município de Seropédica (Abacaxi, Mamão e Maracujá) e
numa área de agricultura familiar no sítio Mazomba (Goiaba), localizado no
município de Itaguaí (anexo I). As partes das plantas foram colhidas, empacotadas
em saco plástico e levadas para o laboratório para serem processadas no mesmo
dia de acordo com o descrito a seguir (Figura 1): a coloteta e separação do solo da
rizosfera e do rizoplano foram realizadas através de uma adaptação do protocolo de
Bramwell (Bramwell et al., 1995), onde 10 gramas do solo aderido à raiz foram
retirados manualmente e adicionadas a um recipiente de 250 ml, contendo 90ml de
solução salina (solo da rizosfera) e agitadas por 1h. Paralelamente, para a obtenção
do solo do rizoplano. 10 gramas de raiz, com suas extremidades vedadas com
parafina, foram adicionadas no mesmo tipo de meio e recipiente citado acima,
acrescido de 10 gramas de areia peneira e autoclavada, seguido de agitação como
acima. No caso da população bacteriana do filoplano, essa região foi fracionada em
duas partes, epífitas solitários e epífitas que constituem biofilme. Tal análise foi feita
através de uma modificação do protocolo de Morris et al. (1998), como descrito a
seguir: 10 gramas de folhas, com suas extremidades vedadas com parafina, foram
imersas em recipiente contendo 90 ml de solução salina e agitadas a 120 rpm por 3
minutos. Em seguida a solução foi fracionada em duas alíquotas de 45ml, sendo
cada uma filtrada em filtros de 5 micrômetros. A solução salina filtrada foi juntada
novamente em um único recipiente (fração de bactérias epífitas solitárias). Quanto
aos filtros, estes foram expostos a uma nova etapa de lavagem utilizando-se solução
salina fresca, sendo os filtros reunidos num mesmo recipiente contendo 90 ml de
solução salina e exposto a 2 minutos (1 desligado e dois ligado) de sonicação, num
sonicador tipo banho-maria (fração epifítica que constituem biofilme). Posteriormente
ao fracionamento das bactérias epifíticas, os tecidos sofreram um processo de
desinfestação superficial (Dobereiner et al., 1995), através da sua imersão por 5
minutos em cloramina T (1%), seguido de enxágüe através de imersão em água por
aproximadamente 3 minutos e posterior imersão em tampão fosfato 0,05 M (pH 7.0)
por três minutos e em seguidas lavadas novamente com água destilada. Após a
esterilização, o tecido vegetal foi acrescentado a 90 ml de solução salina (diluição
20
10-1) e triturada utilizando liquidificador, seguido de sua diluição seriada até 10-7. A
partir dessa suspensão de microrganismo, objetivou-se isolar bactérias diazotróficas
predominantes (aquelas presentes em maior numero), salvo nas condições onde o
número total de isolados foi muito baixo, quando foram isoladas todas as bactérias
de colônia contrastante, como também todas as bactérias cultiváveis crescidas em
meio rico. O isolamento das bactérias diazotróficas foi feito de acordo com
Dobereiner et al. (1995), onde alíquotas de 100 µl das diferentes diluições foram
inoculadas em recipientes de 10 ml em triplicata, contendo 5 ml de meio semi-sólido
JMV, JNFb, LGI, LGI-P e NFb (anexo IV) e incubadas a 30ºC por 7 dias. Após a
verificação do crescimento, através da formação de uma película aerotáxica, as
bactérias crescidas em três frascos de maior diluição foram repicadas para novo
meio semi-sólido correspondente, onde cresceram por 5 dias, seguido de
plaqueamento em meio sólido correspondente. Colônias individuais exibindo
diferentes características morfológicas foram repicadas para meio rico (meio Batata)
para verificação da pureza dos isolados. A constatação do caráter diazotrófico foi
confirmado através da técnica de Redução de Acetileno (Anexo III). Para o
isolamento de todas as bactérias cultiváveis (aqui a bactérias do filoplano não foram
diferenciadas em solitária ou em biofilmes), alíquotas de 100µl da primeira diluição
(10-2) foram plaqueadas em dois meios ricos, NB e DYGS, e crescidas a 32º C por 6
dias, com posterior plaqueamento das colônias em meio de cultura correspondente.
As bactérias diazotróficas foram estocadas de três diferentes maneiras: em água,
liofilizadas e em meio batata inclinado imerso em óleo mineral. Quanto às bactérias
isoladas em meio rico, estas foram estocadas em água.
21
Fruteira
Figura 1. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias diazotróficas.
10g de Raiz 10g de
Pseudocaule10g de Folha
Leves imersões em tampão
fosfato PORÇÃO
RIZOSFÉRICA
Leves agitos imersos em
tampão fosfato
PORÇÃO RIZOPLANO
Leves agitos imersos em
tampão fosfato + areia
Material que passa pela membrana
Maceração em tampão fosfato
= PORÇÃO SOLITÁRIA Filtragem do tampão em
membrana de 5μm Material retido na membrana
de 5μm
Homogeneização das células pro utrassonicação
Desinfestação da superfície do tecido
vegetal
PORÇÃO BIOFILME Desinfestação da superfície do tecido
vegetal
Maceração em tampão fosfato
Maceração em tampão fosfato
PORÇÃO ENDOFÍTICA PORÇÃO ENDOFÍTICA PORÇÃO ENDOFÍTICA = HISTOPLANO RAIZ = HISTOPLANO PSEUDOCAULE = HISTOPLANO FOLHA
22
3.2. Isolamento de bactérias não-diazotróficas: Plântulas crescidas por aproximadamente 2 meses formam retiradas
manualmente do substrato, tendo de 1 a 3 g do solo aderido às raízes adicionados a
um tudo tipo Falcon™ contendo solução salina do meio de cultura NFB numa
quantidade equivalente a dez vezes o peso do solo obtido (fração rizosférica). Para
a obtenção das bactérias epífitas de 1 a 3 gramas do tecido vegetal foi acrescentado
no mesmo tipo de meio e recipiente citados acima, com a posterior adição de areia
peneirada e autoclavada. Em seguida todos os frascos contendo as diferentes
partes da planta mais areia autoclavada (e também o recipiente contendo
unicamente amostras de solo rizosférico) foram submetidos a agitação por 1 h, para
a liberação das bactérias epífitas. Após esse período o tecido vegetal foi retirado do
recipiente e sofreu um processo de desinfestação superficial, através da sua
imersão por 30 minutos em álcool etílico (90%), seguido de sua lavagem em água
destilada autoclavada, e por uma nova etapa de desinfestação através de sua
incubação por 15 minutos em cloramina T 1% e de uma lavagem em tampão fosfato
50mM pH 5,8. Sendo em seguida triturado em solução salina estéril (diluição 10-1),
utilizando almofariz e pistilo, seguido de diluição seriada até 10-7. A partir dessa
suspensão de microrganismo, objetivou-se isolar bactérias diazotróficas
predominantes (aquelas presentes em maior número), salvo nas condições onde o
número total de isolados foi muito baixo, quando foram isoladas todas as bactérias
de colônia contrastante, como também todas as bactérias cultiváveis crescidas em
meio rico. Para o isolamento das bactérias diazotróficas, alíquotas (100 µl) das
diferentes diluições foram inoculadas em recipientes de 10 ml em triplicata, contendo
5 ml de meio NFb semi-sólido (anexo I) padrão e NFB semi-sólido modificado
contendo diferentes fontes de carbono na concentração de 5 g.l-1 (glicose, manitol e
sacarose, adicionadas através de filtração), e incubadas a 300C por 7 dias. Após a
verificação do crescimento, através da formação de uma película aerotáxica, as
bactérias crescidas em três frascos de maior diluição foram repicadas para novo
meio semi-sólido contendo a mesma fonte de carbono, onde cresceram por 5 dias,
seguido de plaqueamento em meio NFB sólido contendo a fonte de carbono
correspondente. Colônias individuais exibindo diferentes características morfológicas
foram repicadas para meio rico (meio NB) para verificação da pureza dos isolados.
Para o isolamento de todas as bactérias cultiváveis, alíquotas de 100 µl da primeira
diluição (10-2) foram plaqueadas em dois meios ricos, NB e Dygs, e crescidas a 32º
23
C por 6 dias, com posterior plaqueamento das colônias em meio de cultura
correspondente e estocagem.
3.3.Caracterização parcial e estocagem dos isolados Uma vez purificados, os isolados foram parcialmente caracterizados quanto à
morfologia da célula e da colônia (anexo I) aos 3 dias de crescimento, recebendo
uma designação do tipo UENF (anexo II), seguida de um número que informativo
quanto a origem da do isolado. As mesmas serão guardadas em triplicata em água
estéril, até a aquisição de um liofilizador.Pretende-se nesta etapa do trabalho, iniciar
a criação de uma bacterioteca para trabalhos futuros em programas de inoculação
de fruteiras tropicais.
24
Figura 2. Organograma das etapas envolvidas no processo de isolamento de bactérias em meio rico.
Planta Frutífera
10g de Caule 10g de Raiz 10g de Folha
Leves imersons em tampão
fosfato
Agito imerso em tampão
fosfato + areia
PORÇÃO RIZOSFERA
Agito imerso em tampão
fosfato + areia
Agito imerso em tampão
fosfato + areia
PORÇÃO RIZOPLANO
PORÇÃO CAULIPLANO
PORÇÃO FILOPLANIO
Desinfestação do tecido
superficial
Desinfestação do tecido
superficial
Desinfestação do tecido
superficial
Masseração Masseração Masseração
PORÇÃO HISTOPLANO RAIZ
PORÇÃO PORÇÃO HISTOPLANO CAULE HISTOPLANO FOLHA
25
3.4. Análise dos resultados do número mais provável (NMP) de bactérias diazotróficas
Devido à grande variação entre as diferentes repetições nos valores de NMP
de bactérias diazotróficas observado para a grande maioria dos tratamentos
estudados (fruteira, época do ano, sítio e meio de cultura), ao invés de uma análise
estatística, a comparação entre os diferentes sítios ao longo do eixo vegetativo das
diferentes culturas quanto à distribuição de bactérias diazotróficas se baseou em
três abordagens:
A - maiores valores de NMP para cada tratamento ao longo de três repetições de
cada estação;
B - observação da freqüência de observações detectadas (número de vezes que é
detectada a presença da bactéria por tratamento);
C - análise da diversidade (Índice de Shannon, riqueza e abundância).
26
CULTIVAR CULTIVA TECIDO VEGETAL MEIO DE CULTURA
DILUIÇÃO ORDEM Z**** W Y N V
Abacaxi -1 Cultivar - 1 -2 Rizosfera -1 X 1, 2, 3, ... Goiaba - 2 Cultivar - 2 JMV - 1 -3 Raiz Mamão - 3 Cultivar - 3 Epífitos -2 JNFb - 2 -4 Maracujá - 4 Cultivar - 4 Agregado -3** LGI -3 -5
Endófitos -4** LGI-P -4 -6 NFb -5 -7 Caule***
Epífitos (lavados com areia)----------a
JMVL -6 NB -8
Endofítico -b DYGS -9 Folha Epífitos -5 Agregados -6 Endófitos -7 Epifítico (lavado com areia)------c*** Pseudocaule-8 (só p/ abacaxi)
UENF VWYXZN
Figura 3. Código para identificação dos isolados (Em meio de enriquecimento de
bactérias diazotróficas)
27
Figura 4. Código para identificação dos isolados bacterianos obtidos a partir de meio rico (NB & DYGS).
CULTURA* V Abacaxi - 1 Goiaba - 2 Mamão - 3 Maracujá - 4
TECIDO VEGETAL
Y Rizosfera -1 Raiz Epífitos -2 Endófitos -3 Caule Epífitos -4 Endófitos -5 Folha Epífitos -6 Endófitos -7 Semente desinfestada -8
CULTIVAR** MEIO DE CULTURA*** W
Cultivar - 1 Cultivar - 2 Cultivar - 3 Cultivar - 4
X NB - 8 DYGS - 9
DILUIÇÃO ORDEM Z N
UENF VWYXYZ
28
4. Objetivo
4.1. Objetivos gerais No presente trabalho, pretendemos realizar tanto um estudo da biogeografia
da comunidade microbiana diazotrófica e não diazotrófica associada ao longo do
eixo vegetativo de diferentes fruteiras por meio de isolamento em diferentes meios
de cultura, como obter um banco de bactérias para uso futuro em programas de
promoção de crescimento.
4.2. Objetivos específicos
- Isolamento de bactérias diazotróficas rizosféricas, epífitas e endofíticas associadas
às raízes e folha de abacaxi (Ananas comosus L.), Goiaba, (Psidium guajava),
mamão (Carica papaya) e maracujá (Passiflora edulis f. edulis; Passiflora edulis f.
flavicarpa; Passiflora alata);
- Isolamento de bactérias em meio NB e Dygs epífitas e endofíticas associadas às
raízes, caule e folha de abacaxi (Ananas comosus L.) e maracujá (Passiflora edulis f.
edulis; Passiflora edulis f. flavicarpa; Passiflora alata);
-Caracterização morfológica dos isolados;
-Caracterização morfológica dos isolados;Agrupamento baseado nas características
morfológicas;
-Geração de uma bacterioteca para uso em futuros programas de inoculação;
Análise biogeográfica da colonização das bactérias diazotróficas ao longo do eixo
vegetativo das fruteiras, bem como a comparação dos padrões biogeográficos entre
os diferentes sítios das diferentes fruteiras em estudo, através da técnica de número
mais provável.
29
5. Resultados: 5.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número mais provável (NMP): 5.1.1. O caso do abacaxizeiro: 5.1.1.1.maiores valores observados de NMP: Apenas no caso da cultura do abacaxi, foi observada uma visível diferença
entre as duas épocas do ano (inverno e verão) no que diz respeito ao padrão de
distribuição dos maiores valores de densidade de bactérias diazotróficas ao longo do
eixo vegetativo (Tabela 1). Tais dados mostram que durante o inverno, os maiores
valores de densidade para um único grupo bacteriano presente no histoplano -
pseudocaule (104 células por grama de tecido fresco) (JMV-, JNFb- e NFb-
dependentes) eram semelhantes àqueles encontrados em alguns sítios associados
à raiz [rizosfera (NFb-dependentes) e histoplano raiz (NFb-dependentes)] ou até
mesmo superior (no caso da rizoplano). Além disso, durante essa estação a
densidade de bactéria no histoplano - folha (103 células por grama de tecido fresco)
(JNFb-, LGI-P- e NFb- dependentes) mostrou-se num mesmo patamar do rizoplano
(LGI-dependentes). Durante o verão, os maiores valores de densidade de bactérias
diazotróficas para um único grupo bacteriano foi observado nos sítios associados à
raiz [rizosfera = 103 (JNFb- e NFb-dependentes); rizoplano = 104 (NFb-
dependentes); histoplano-raiz = 104 (NFb-, LGI-dependentes] do que nos sítios
associados a parte aérea do vegetal (histoplano – folha e histoplano – pseudocaule
= até 102).
Quando é observado o resultado da soma (num universo de três colheitas)
das densidades dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas obtidas numa única
colheita, durante o inverno, a rizosfera, o histoplano-raiz e o histoplano pseudocaule
se apresentam como os sítios a apresentarem as maiores densidades bacterianos
(104), seguidos do rizoplano e do histoplano folha (103). Durante o verão, são o
rizoplano e o histoplano-raiz os sítios a apresentarem a maior densidade (104),
seguido da rizosfera (103) e do histoplano folha e do histoplano pseudocaule (102).
Assim, a semelhança na distribuição das bactérias nos diferentes sítios entre
as duas estações está apenas no fato de que em ambas as estações, algum dos
sítios endofíticos se apresentaram como os de maior densidade: histoplano –
pseudocaule no inverno e histoplano – raiz no verão.
Da mesma forma que aconteceu para a maioria das quatro fruteiras a serem
30
apresentadas abaixo, na cultura do abacaxi também não foi detectada nenhuma
bactéria diazotrófica associada à superfície da folha, seja solitária ou formando
biofilme, independe do sítio, da estação e do meio de cultura.
Quanto aos grupos de bactérias estudadas (determinada de acordo com o
meio em que foi detectada), durante o inverno as maiores densidades observadas
foram as de JMV- (Histoplano – Pseudocaule), NFb – (Histoplano – Raiz e
Histoplano – Pseudocaule), e JNFb – (Histoplano – Pseudocaule), dependentes (104
célula por grama de tecido fresco), seguidas das bactérias LGI-P - e LGI -
dependente (103). Durante o verão, as maiores densidades foram observada para as
bactérias JNFb – (Histoplano-Raiz), NFb – (rizoplano) e LGI – (histoplano-raiz)
dependentes (até 104 células por grama de tecido fresco), seguidas dos demais
grupos: JMV- e LGI-P – dependentes (103 células por grama de tecido fresco).
O ordenamento das maiores densidades dos diferentes grupos microbianos,
resultado da soma (num universo de três colheitas) das densidades de um
determinado grupo microbiano, obtidas a partir dos diferentes sítios numa única
colheita, mostra que durante o inverno as bactérias JMV-, JNFb – e NFb -, foram as
mais numerosas (104), seguida de ambos os grupos de bactérias glicose –
dependente (LGI e LGI-P) (103). Durante o verão essa comparação mostra serem as
bactérias JNFb –, NFb - e LGI – dependentes as que se apresentavam em maiores
densidades (104), seguidas das bactérias JMV – e LGI-P – dependentes (103).
31
Tabela 1. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro em diferentes épocas do
ano.
NMP (x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotrófica nos meios:
Total** JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb*
INVERNO Rizosfera 4,5x102 3,0x102 2,5x102 0,4x102 1,4x104 1,4x104 Rizoplano 2,5x102 7,5x102 1,5x103 Nd 4,5x102 1,9x103
Histoplano-Raiz 4,5x103 2,5x103 0,7x102 2,0x102 1,4x104 2,1X104 Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Histoplano folha 9,5x102 4,5x103 2,0x102 1,1x103 2,5x103 9,3X103
Hist. Pseudocaule 1,1x104 1,4x104 2,0x103 2,5x102 1,1x104 3,8X104 Total*** 1,6X104 2,1X104 3.8X103 1,6X103 4,2X104 VERÃO
Rizosfera 4,5x102 1,4x103 2,5x102 2,5x102 4,5x103 4,6X103 Rizoplano 4,5x103 2,5x103 4,5x102 Nd 4,5x104 5,1X104
Histoplano-Raiz 4,5x103 4,5x104 4,5x104 2,5x103 2,5x103 9,9X104 Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Histoplano Folha 0,9x102 2,5x102 Nd 0,4x102 2,5x102 6,3X102 Hist. Pseudocaule 0,4x102 Nd Nd Nd 0,4x102 0,8X102
Total*** 9,5X103 4,7X104 4,6X104 2,8X103 5,0X104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;
**maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
cinco grupos de bactérias diazotróficas obtidos para um único sítio/forma de disposição.
***maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
sítios da planta obtidos para um único grupo de bactéria diazotrófica.
32
5.1.1.2. freqüência de detecção: Durante o inverno a freqüência de detecção de possíveis grupos unitários
(microrganismos detectados em um determinado meio de cultura) de bactérias
diazotróficas por cada sitio analisado só alcançou 100% (3 detecções em 3
colheitas) para os grupos de bactérias JMV– (histoplano –raiz), JNFb- (rizosfera,
rizoplano e histoplano-raiz), NFb- (rizosfera, rizoplano e histoplano-raiz) (Tabela 2).
A percentagem de detecção dos demais grupos foi de 67; 33% ou não foram
detectadas. Durante o verão, os grupos unitários de bactérias diazotrófica por sitio
analisado a se apresentarem com 100 % foram detectados nos mesmos sítios da
estação anterior.
Quanto a análise da freqüência de detecção sem distinguir o sítio de
isolamento (três tentativas/grupo de bactérias x sete sítios), durante o inverno, o
grupo dos microrganismos a apresentarem o maior percentual de detecção foram os
NFb – dependentes (62%), seguido pelos JNFb – dependentes (57%), JMV –
dependente (48%), LGI - dependentes (38%) e pelas LGI-P – dependentes (29%).
Durante o verão, a percentagem de detecção de cada grupo bacteriano sem
distinguir os sítios, mostrou que os maiores percentuais foram alcançados para o
grupo das bactérias NFb – dependentes (57%), seguidas pelas JNFb - dependentes
(52%), JMV – dependentes (48%), LGI – dependentes (24%) e finalmente pela LGI-
P – dependentes (19%).
Quanto ao sítio como um todo, sem distriguir o grupo da bactérias, durante o
inverno a maior percentagem de detecção de possíveis bactérias diazotrófica foi
obtida no histoplano raiz (87%), seguida pela rizosfera (73%), histoplano – folha
(60%) e rizoplano e histoplano folha (ambos com 53% de detecção, cada). Não
foram detectadas bactérias diazotróficas na superfície das folhas, em nenhuma das
estações estudadas. Durante o verão, os maiores percentuais de detecção foram
observados no histoplano – raiz (87%), seguidos pela rizosfera (73%), rizoplano
(60%), histoplano-folha (47%) e pelos histoplano-pseudocaule (13%).
33
Tabela 2. Freqüência de detecção de possíveis bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do abacaxizeiro durante três colheitas por épocas do ano.
Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:
Meios de Cultura* Total** JMV JNFb LGI LGI-P NFb
INVERNO Rizosfera 67 100 67 33 100 73% Rizoplano 33 100 33 Nd 100 53%
Histoplano-Raiz 100 100 67 67 100 87% Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano folha 67 67 33 33 67 53%
Histoplano Pseudocaule 67 33 67 67 67 60% Total*** 48% 57% 38% 29% 62% VERÃO
Rizosfera 67 100 67 33 100 73% Rizoplano 67 100 33 Nd 100 60%
Histoplano-Raiz 100 100 67 67 100 87% Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 67 67 Nd 33 67 47%
Histoplano Pseudocaule 33 Nd Nd Nd 33 13% Total*** 48% 52% 24% 19% 57%
*Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)
34
5.1.1.3. Diversidade, Riqueza e Abundância:
Durante o inverno, ao longo de três colheitas, os maiores índices de
diversidade (índice de Shannon) foram observados no histoplano folha (0,555241),
seguido pelo histoplano-pseudocaule (0,552358), (ambos na terceira coleta),
rizosfera (0,481521) (na primeira coleta), histoplano raiz (0,397789) (na terceira
coleta) e o rizoplano (0,380529) (na primeira coleta) (Tabela 3). Já durante o verão
tal ordenamento muda, aparecendo o histoplano – raiz como o sítio a apresentar o
maior índice de diversidade (0,516091) (segunda coleta), seguido do histoplano –
folha (5153318) (primeira coleta), rizosfera (0,49319) (primeira coleta), rizoplano
(0,354336) (segunda coleta) e do histoplano-pseudocaule (0,30103) (segunda
coleta).
Quanto a riqueza de bactérias diazotróficas (Tabela 4) (número de grupos
bacterianos detectados), durante o inverno, foi possível se observar que ao menos
em uma colheita, quatro dos sete sítios estudados (rizosfera, histoplano raiz,
histoplano folha e histoplano – pseudocaule) apresentaram a presença de todos os
grupos de bactérias estudados. Durante o verão, apenas nos sítios rizosfera e
histoplano todos os grupos de bactérias diazotróficas estavam presentes numa única
colheita.
Quanto à abundância de possíveis bactérias diazotróficas (somatório dos
diferentes grupos de bactérias diazotróficas) (Tabela 5), durante o inverno, a maior
densidade de bactérias diazotróficas foi observada no histoplano-pseudocaule e no
histoplano-raiz e na rizosfera (104 células por grama de tecido fresco) (ambos na
terceira coleta). Durante o verão a maior densidade de bactérias diazotrófica foi
observada no histoplano – raiz (104 célula por grama de tecido fresco).
35
Tabela 3. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro. Índice de Shannon
Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 0,481521 0,421262 0,049982 0,49319 0,277726 0,041913
Rizoplano 0,380529 0,283054 0,27264 0,190867 0,354336 0,255591
Histoplano-Raiz 0,344498 0,381415 0,397789 0,452916 0,516091 0,276405
Filoplano solitário Nd Nd Nd Nd nd Nd
Filoplano biofilme Nd Nd Nd Nd nd Nd
Histoplano-folha 0 0,174235 0,555241 0,515318 nd 0,440595
Histoplano-Pseudocaule 0,463431 0 0,552358 Nd 0,30103 Nd
Tabela 4. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios
do abacaxizeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 5 3 3 5 4 2
Rizoplano 3 2 3 4 3 2
Histoplano-Raiz 5 3 5 5 5 3
Filoplano solitário 0 0 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 1 2 5 4 0 3
Histoplano-Pseudocaule 3 1 5 0 2 0
Tabela 5. Abundância (NMP x g-1 de tecido fresco) de possíveis bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 8,60x102 4,30x102 1,43x104 3,90x103 1,70x103 4,59x103
Rizoplano 1,15x103 7,00x102 1,99x103 5,09x104 4,10x103 3,45x103
Histoplano-Raiz 6,75x103 3,90x103 2,13x104 9,95x104 1,19x104 3,15x103
Filoplano solitário 0 0 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 0,40x102 2,90x102 9,30x103 6,30x102 0 5,90x102
Histoplano-Pseudocaule 3,30x102 0,40x102 3,82x104 0 0,80x102 0
36
5.1.2. O caso da goiabeira: 5.1.2.1. Maiores valores observados de NMP: Entre todas as fruteiras essa foi a
que se mostrou com os mais baixos valores de densidade de bactérias diazotróficas
nos sítios da parte superior da planta (Tabela 6). Sendo detectadas tais bactérias, e
em baixa densidade, apenas no histoplano – folha, e apenas nas coletas de verão.
Dessa forma, para ambas as estações, foi essa a cultura a apresentar a mais clara
distinção entre as densidades de bactérias presentes nos sítios superiores e
inferiores da planta. Assim, durante o inverno, o sitio que se apresentou abrigando
os maiores valores de densidade de bactérias diazotróficas foram a rizosfera (104
células por grama de tecido fresco para as duas estações) (JNFb-dependentes),
rizoplano (103 células por grama de tecido fresco) (LGI-, NFb-dependentes) e
histoplano raiz (102 células por grama de tecido fresco). Durante o verão tal
ordenação sofreu uma pequena modificação. Nessa estação as maiores densidade
são encontradas na rizosfera (JNFb-, NFb-dependentes) e no rizoplano (JNFb-. NFb-
dependentes)(104), seguida do histoplano-raiz (JMV-, JNFb-, LGI- e LGI-P-
dependentes) (103) e do histoplano - folha (102 células por grama de tecido fresco).
A análise das maiores densidades de bactérias nos diferentes sítios,
resultados da soma das densidades dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas
obtidas numa única colheita, se mostra com o mesmo ordenamento que o resultado
da análise dos maiores valores observados para um determinado grupo de bactéria,
no caso do inverno e levemente diferente no caso do verão. Nessa última estação,
os maiores valores de soma dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas obtidas
numa única estação, mostram que todos os sítios associados à raiz possuem uma
densidade de bactérias diazotrófica muito próxima (104 células por grama de tecido
fresco) seguido pelo histoplano folha (102).
A diferença na densidade de bactérias diazotróficas entre as duas estações
está na quantidade de nichos onde foram detectadas essas bactérias, cujo maiores
valores de NMP alcançaram até 104 células por grama de tecido fresco. Assim,
embora em ambas as estações o maior número de bactérias diazotróficas obtida
tenha sido de 104 células por grama de tecido fresco, foi o verão a estação onde tal
densidade de células foi obtida em maior número de sítios.
Quanto à densidade dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas,
independente do nicho estudado, no inverno as bactérias JNFb – dependentes
foram obtidas em maior número (104 células por grama de tecido fresco) (rizosfera),
37
seguidas pelas JMV- (rizosfera), LGI- (rizosfera e rizoplano) e NFb- (rizosfera e
rizoplano) dependentes (até 103 células por grama de tecido fresco). Não foi
detectada bactérias LGI-P- dependentes em nenhum sítio durante o inverno. No
verão as maiores densidades de bactérias diazotróficas foram as pertencentes aos
dois grupos de bactérias malato – dependentes [JNFb-dependentes (rizosfera,
rizoplano) e NFb- dependentes (rizosfera, rizoplano)] (104 células por grama de
tecido fresco), seguidos pelas JMV – (histoplano-raiz) e pelos dois grupo de
bactérias glicose – dependentes (LGI- LGI-P-dependentes) (até 103 células por
grama de tecido fresco). Esse ordenamento, tanto para o inverno como para o
verão, permanece o mesmo quando são comparadas as densidades dos diferentes
grupos de bactérias, resultado da soma das densidades de bactérias diazotróficas
obtidas a partir dos diferentes sítios numa única colheita. Tabela 6. Maiores valores observados do número mais provável de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira em diferentes épocas do ano.
Goiaba NMP (x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:
JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 2,0x103 1,4x104 2,5x103 Nd 2,5x103 1,6X104 Rizoplano 0,4x102 4,5x102 2,5x103 Nd 1,5x103 2,5X103
Histoplano-Raiz Nd Nd 2,5x102 Nd 0,3x102 2,5X102 Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha Nd Nd Nd Nd Nd 0
Total *** 2,0X103 1,4X104 2,8X103 0 3,0X103 VERÃO
Rizosfera 0,9x102 1,4x104 2,5x103 2,5x102 1,5x104 3,2X104 Rizoplano 9,5x102 1,4x104 4,5x102 Nd 4,5x104 6,0X104
Histoplano-Raiz 2,5x103 2,5x103 4,5x103 4,5x103 7,5x102 1,3X104 Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha 0,4x102 0,4x102 Nd Nd 0,9x102 1,7X102
Total*** 3,5X103 2,8X104 5,2X103 4,5X103 6,0X104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;
**maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
cinco grupos de bactérias diazotróficas obtidos para um único sítio/forma de disposição.
***maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
sítios da planta obtidos para um único grupo de bactéria diazotrófica.
38
5.1.2.2. freqüência de detecção: Os resultados de freqüência de detecção de bactérias diazotróficas (Tabela 7)
mostram uma grande diferença entre as duas estações estudadas: no inverno,
apenas os dois grupos de bactérias malato – dependentes (JNFb-, NFb-
dependentes) (rizosfera), e o grupo das bactérias LGI – dependentes (rizoplano)
apresentaram 100% de detecção em alguns dos sítios estudados, seguidas pelo
grupo de bactéria JMV – dependente, que alcançou um percentual máximo de
detecção de 67% na rizosfera. Durante o verão, os grupos de bactérias JMV –
dependentes (rizoplano), JNFb – dependentes (rizosfera, rizoplano e histoplano
raiz), LGI – dependente (histoplano raiz) e NFb – dependentes(rizoplano) atingiram
100% de detecção. O grupo de bactéria diazotrófica LGI-P – dependentes, atingiram
apenas 33% de detecção (rizosfera e histoplano raiz).
Quando é comparada a freqüência de detecção de bactéria diazotrófica em
cada sítio, sem se distinguir o meio de cultura usado, durante o inverno os sítios que
apresentaram as maiores freqüências foram a rizosfera (67%), seguida do rizoplano
(53%) e do histoplano – raiz (13%). Durante o verão esse ordenamento muda
bastante, sendo o histoplano – raiz o sitio a apresentar a maior freqüência (80%),
seguido pelo rizoplano (73%), rizosfera (60%) e histoplano folha (20%).
A comparação da freqüência dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas
sem distingui os sítios de isolamento, mostra que no inverno as bactérias LGI – e
NFb – dependentes foram detectadas com maior freqüência (33%), seguida das
JNFb – dependentes (28%) e das JMV-dependentes (17%). Durante o verão essa
ordem se altera, sendo o grupo das bactérias JNFb – dependentes (55%) a serem
detectadas com maior freqüência, seguidas do grupo das bactérias JMV – e NFb –
dependentes (44%), LGI – dependentes (39%) e das LGI-P - dependentes (11%).
39
Tabela 7. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios da goiabeira durante três colheitas por épocas do ano.
Goiaba Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:
Meio de cultura* Total** JMV JNFb LGI LGI-P NFb
INVERNO Rizosfera 67 100 67 Nd 100 67% Rizoplano 33 67 100 Nd 67 53%
Histoplano-Raiz Nd Nd 33 Nd 33 13% Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha Nd Nd Nd Nd Nd 0
Total 17% 28% 33% 0 33% VERÃO
Rizosfera 33 100 67 33 67 60% Rizoplano 100 100 67 Nd 100 73%
Histoplano-Raiz 100 100 100 33 67 80% Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 33 33 Nd Nd 33 20%
Total 44% 55% 39% 11% 44% *Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)
40
5.1.2.3. Diversidade, Riqueza e Abundância: A goiabeira foi não só a cultura a apresentar as menores freqüências de
detecção de possíveis bactérias diazotróficas, como também a apresentar os
menores índices de diversidade. Assim, durante o inverno, enquanto o rizoplano e a
rizosfera compartilham um índice de Shannon bastante semelhante (0,455806 e
0,455154) (Tabela 8), para o histoplano raiz tal índice foi zero. Durante o verão esse
ordenamento se altera bastante, sendo o histoplano raiz o sítio a apresentar o maio
índice de Shannon (0,578701), seguido pelo rizoplano (0,511296), histoplano - folha
(0,441939) e rizosfera (0,421397).
A análise da riqueza dos diferentes grupos de bactérias (Tabela 9) mostra que
durante o inverno, os sítios a apresentarem o maior número de grupos de bactérias
diazotróficas detectadas em uma única colheita foi a rizosfera e o rizoplano (4).
Durante o verão, apenas nos sítios rizosfera e histoplano-raiz foi detectada a
presença de todos os grupos de bactérias diazotróficas.
Quanto à abundância de bactérias diazotróficas total, durante o inverno a
maior densidade de bactérias foi observada na rizosfera (104), seguido pelo
rizoplano (103) e pelo histoplano-raiz (102). Durante o verão os sítios rizosfera,
rizoplano e histoplano-raiz apresentaram a maior densidade de bactérias
diazotróficas (104 células por grama de tecido fresco), pelo histoplano-folha (102).
41
Tabela 8. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios da goiabeira. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 0,455154 0,234608 0,228866 0,421397 0 0,209679
Rizoplano 0,455806 0,36171 0 0,283475 0,323918 0,511296
Histoplano-Raiz 0 0 0 0,266096 0,367572 0,578701
Filoplano solitário Nd 0 Nd Nd Nd Nd
Filoplano biofilme Nd 0 Nd Nd Nd Nd
Histoplano-folha Nd 0 Nd Nd Nd 0,441939
Tabela 9. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira.
Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 4 2 4 5 1 3
Rizoplano 4 3 1 4 3 4
Histoplano-Raiz 1 0 1 4 3 5
Filoplano solitário 0 0 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 0 0 0 0 0 3
Tabela 10. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira.
Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 6,0 x 103 1,9 x103 1,6 x 104 3,2 x 104 2,0 x 102 5,2 x 103
Rizoplano 8,1 x 102 2,2 x 103 2,5 x 103 6,0 x 104 1,2 x 103 1,2 x 103
Histoplano-Raiz 2,5 x 102 0 0,3 x 102 3,0 x 103 4,2 x 103 1,3 x 104
Filoplano solitário 0 0 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 0 0 0 0 0 1,7 x 102
42
5.1.3. O caso do mamoeiro: 5.1.3.1. Maiores valores observados de NMP: Da mesma forma que o ocorrido com as culturas anteriores, também do caso
do mamoeiro, em ambas as épocas as maiores densidades de bactérias
diazotróficas foram registradas mais nos sítios associados à raiz do que naqueles
associados à parte aérea da cultura (Tabela 11). Esse mesmo padrão geral se
repetiu quando foram analisadas as maiores densidades de bactérias diazotróficas,
sem se distinguir cada grupo particular (Tabela 11). Assim, durante o inverno a
ordem dos sítios em relação às maiores densidades de um determinado grupo
microbiano foi: rizosfera (104 células por grama de tecido fresco) (NFb-
dependentes), seguido pelo rizoplano, histoplano – raiz e histoplano folha e filoplano
sob a forma solitária (102). Esse último sítio foi representado apenas pela
comunidade LGI - dependente. A comparação dos sítios quanto aos maiores valores
de densidade resultado da soma dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas
numa única colheita, mostrou uma pequena variação nesse ordenamento: rizosfera
(104), rizoplano e histoplano folha (103), histoplano raiz e filoplano solitária (102).
Durante o verão, a maior densidade de um determinado grupo de bactérias
diazotróficas foi observada na rizosfera (104) (JNFb-, NFb-dependentes), seguida
pelo rizoplano (JNFb-, LGI-, e NFb-dependentes), e histoplano raiz (JMV-, e JNFb-
dependentes) (103 células por grama de tecido fresco), pelo histoplano folha e
filoplano sob a forma solitária (102 células por grama de tecido fresco). Essa última
representada apenas por bactérias manitol - dependente. Da mesma forma que o
ocorrido para as duas culturas anteriores, também não foi detectada a presença de
bactérias diazotróficas no filoplano organizada sob a forma de biofilme, em nenhuma
das estações. A comparação dos sítios quanto aos maiores valores resultado da
soma das densidades dos diferentes grupos de bactérias detectadas em uma única
colheita mostra que os maiores valores de densidade total de bactérias diazotróficas
é encontrado na rizosfera (104), seguido pelo rizoplano, histoplano raiz e histoplano
folha (103) e pelo filoplano – solitária (102).
Quanto aos diferentes grupos de bactérias detectadas, durante o inverno foi
observado que o grupo das bactérias NFb – dependentes (rizosfera) foi a que se
mostrou em maior número (até 104 células por grama de tecido fresco), seguida das
bactérias JNFb –dependentes (rizosfera) (até 103 células por grama de tecido
fresco) e finalmente pelas LGI-, LGI-P- e JMV - dependentes (102 células por grama
43
de tecido fresco). Durante o verão ambos os grupos de bactérias malato –
dependentes [JNFb- (rizosfera) e NFb- dependentes, (rizosfera)] se apresentaram
em maior número (104), seguido das JMV- (histoplano-raiz), e LGI – dependentes
(rizoplano) (103) e pelas LGI-P – dependente (102).
A comparação da densidade dos diferentes grupos de bactérias, sem
considerar o sítio de origem, durante o inverno as maiores densidades de bactérias
encontradas foram as de NFb-dependentes (104), seguido dos grupos de bactérias
JNFb- e LGI – dependentes (103), e pelas JMV-, e LGI-P dependentes (102). Durante
o verão, ambos os grupos de bactérias malato-dependentes (JNFb- e NFb-
dependente) (104) foram as que se apresentaram em maior número, seguidas pelas
JMV- e LGI-dependentes (103) e pela LGI-P – dependentes (102).
Tabela 11. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do mamoeiro em diferentes épocas do
ano.
Mamão Densidade (MPN x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:
JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 0,6x102 2,5x103 9,5x102 Nd 1,4x104 1,5X104 Rizoplano 0,4x102 9,5x102 4,5x102 Nd 9,5x102 2,4X103
Histoplano Raiz 0,3x102 4,0x102 4,0x102 Nd 0,9x102 8,0X102 Solitário Filoplano Nd Nd Nd 4,0x102 Nd 4,0X102 Biofilme Filopano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 2,5x102 0,9x102 0,3x102 9,5x102 1,5X103
Total*** 2,5x102 3,3x103 1,7x103 4,0x102 1,5x104 VERÃO
Rizosfera 0,9x102 1,1x104 4,0x102 Nd 4,5x104 5,6x104 Rizoplano Nd 2,0x103 4,5x103 Nd 2,5x103 7,2x103
Histoplano Raiz 4,5x103 2,5x103 2,5x102 0,9x102 9,5x102 7,9x103 Solitário Filoplano 0,4x102 Nd Nd Nd Nd 0,4x102 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 4,5x102 2,5x102 Nd 4,5x102 1,4x103
Total*** 4,8x103 1,1x104 4,9x103 0,9x102 4,8x104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;
**maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
cinco grupos de bactérias diazotróficas obtidos para um único sítio/forma de disposição.
***maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
sítios da planta obtidos para um único grupo de bactéria diazotrófica.
44
5.1.3.2. Freqüência de detecção: Os únicos grupos de microrganismos a apresentarem 100% de detecção
durante o inverno, foram os pertencentes ao grupo dos microrganismos LGI –
dependentes e JNFb – dependentes (ambos para os sítios rizosfera e rizoplano)
(Tabela 12). Durante o verão foram os dois grupos de microrganismos malato –
dependentes (rizosfera, rizoplano e histoplano raiz, para os dois grupos de
microrganismos), e manitol dependentes no caso do histoplano folha.
Quanto aos diferentes sítios da planta e sem distinguir os grupos de bactérias
diazotróficas, durante o inverno foram a rizosfera e o rizoplano os sítios a
apresentarem os maiores percentuais de detecção (60%), seguidos pelo histoplano
folha (53%), histoplano raiz (27%) e do filoplano solitário (13%). Durante o verão
esse ranquiamento muda consideravelmente, com o histoplano raiz como o sítio a
apresentar o maior percentual de detecção (73%), seguido do histoplano folha
(67%), rizosfera (60%), rizoplano (47%) e do filoplano solitário (7%).
Quanto aos diferentes grupos de bactérias diazotróficas na planta como um
todo (sem distinguir os diferentes sítios de isolamento), durante o inverno o grupo de
bactéria a ser detectado com maior freqüência foram as LGI - e as JNFb –
dependentes (50%), seguidas pela JNFb – dependentes (33%), JMV – dependentes
(28%) e pelas LGI-P – dependentes (17%). Durante o verão essa ordenação é
liderada pelos dois grupo das bactérias malato – dependentes (JNFb- e NFb-
dependentes) (61%), seguido das bactérias LGI – dependentes (44%), JMV –
dependentes (39%) e pelas LGI-P – dependentes (5%).
45
Tabela 12. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do mamoeiro durante três colheitas por época do ano.
Mamão Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:
JMV JNFb LGI LGI-P NFb Total INVERNO Rizosfera 33 67 100 Nd 100 60% Rizoplano 33 67 100 Nd 100 60%
Histoplano Raiz 33 33 33 Nd 33 27% Solitário Filoplano Nd Nd Nd 67 Nd 13% Biofilme Filopano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 67 33 67 33 67 53%
Total 28% 33% 50% 17% 50% VERÃO Total
Rizosfera 33 100 67 Nd 100 60% Rizoplano Nd 100 33 Nd 100 47%
Histoplano Raiz 67 100 67 33 100 73% Solitário Filoplano 33 Nd Nd Nd Nd 7% Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 100 67 100 Nd 67 67%
Total 39% 61% 44% 5% 61% *Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)
46
5.1.3.3. Diversidade, riqueza e abundância: Ao logo das três colheitas do inverno o maior índice de diversidade (Tabela
13) foi observado na rizosfera (0,510903), seguido pelo rizoplano (0,484798),
histoplano-folha (0,457852) e pelo histoplano-raiz (0,30103). Durante o verão foi o
histoplano-raíz o sítio a apresentar o maior índice de diversidade (0,597582), vindo
em seguida o histoplano-folha (0,584084), rizoplano (0,338436) e a rizosfera
(0,307264).
Quanto à riqueza (Tabela 14), durante o inverno nenhum dos sítios
mo333straram a presença de todos os grupos de bactérias diazotróficas em uma
única colheita. Nessa estação, os sítios a apresentar o maior número de grupos de
bactérias diazotrófica foram a rizosfera, o rizoplano e o histoplano-folha (quatro
grupos). Durante o verão apenas no sítio histoplano-raiz foi detectada em uma única
colheita todos os grupos de bactérias diazotróficas.
Quanto à abundância de bactérias diazotrófica (Tabela 15), tanto no inverno
como no verão, a maior densidade do conjunto de bactérias diazotróficas observada
em uma única colheita foi detectada na rizosfera.
47
Tabela 13. Diversidade (Índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do mamoeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 0,421262 0,510903 0,10276 0,222191 0,112571 0,307264
Rizoplano 0,441939 0,484798 0,195676 0,338436 0,298344 0,272712
Histoplano-Raiz 0,30103 0 0 0,370707 0,597582 0,408148
Filoplano solitário 0 0 Nd Nd 0 Nd
Filoplano biofilme Nd Nd Nd Nd nd Nd
Histoplano-folha Nd 0,41196 0,457852 0,539985 0,174235 0,584084
Tabela 14. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do mamoeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 3 4 2 3 2 4
Rizoplano 3 4 2 3 2 2
Histoplano-Raiz 2 1 1 3 5 3
Filoplano solitário 1 1 0 0 1 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 0 4 4 4 2 4
Tabela 15. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do mamoeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 4,3 x103 2,9 x103 1,5 x 104 5,6 x 104 4,8 x 103 5,7 x 103
Rizoplano 1,7 x 103 2,4 x 103 5,4 x 102 7,2 x 103 4,5 x 103 1,4 x 103
Histoplano-Raiz 8,0 x 102 0,3 x 102 0,9 x 102 3,8 x 102 5,8 x 102 7,9 x 103
Filoplano solitário 4,0 x 102 0,4 x 102 0 0 0,4 x 102 0
Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0
Histoplano-folha 0 3,6 x 102 1,5 x 103 7,9 x 102 2,9 x 102 1,4 x 103
48
5.1.4.O caso do maracujazeiro: 5.1.4.1. maiores valores de NMP observados: Dentre todas as culturas, o maracujazeiro foi aquela que resultou nas
menores densidades de bactérias diazotróficas (103 células por grama de tecido
fresco) (Tabela 16). Apesar disso, ela foi não só a única cultura a apresentar
bactérias diazotróficas no filoplano associadas sob a forma de biofilme (102 células
por grama de tecido fresco), como também a apresentar a maior densidade de
bactérias diazotróficas nesse sitio sob a forma solitária (até 103). Assim,
praticamente não foi observado um gradiente de densidade de bactérias
diazotróficas ao longo do eixo vegetativo da planta. Tal gradiente foi observado
apenas de uma maneira bastante tênue durante o verão.
Assim, durante o inverno praticamente não foi observada variação na
densidade máxima de bactérias diazotróficas entre os diferentes sítios, tendo em
vista que foi constatado na grande maioria dos sítios um valor máximo de densidade
igual a 103 células por grama de tecido fresco. A exceção foi o caso das bactérias do
filoplano, na porção de microrganismos que formam biofilme. Nesse caso a
densidade máxima observada foi de 102 células por grama de tecido fresco (JNFb-,
NFb-dependente). Esse ordenamento permanece igual, quando são observadas as
maiores densidades de bactérias diazotróficas totais, sem distinguir a que grupo
pertence (maiores valores de densidade resultado da soma dos diferentes grupos de
bactérias numa única colheita). Durante o verão, os sítios associados à raiz
[rizosfera (NFb-dependente), rizoplano (LGI-, NFb-dependente) e histoplano raiz
(JNFb-, NFb-dependente)] apresentaram uma densidade máxima de 103 células por
grama de tecido fresco, seguido pelo histoplano folha, que alcançou em cada um
dos sítios até 102 células por tecido fresco. Contudo, a comparação dos maiores
valores de densidade de bactérias diazotróficas totais (maiores valores de densidade
resultado da soma dos diferentes grupos de bactérias numa única colheita), faz do
rizoplano o sítio a apresentar a maior densidade de bactérias diazotróficas (104),
seguido da rizosfera, histoplano raiz, e histoplano folha (103). Não foram detectadas
bactérias (sob a forma solitária ou em biofilme) colonizando a superfície da folha
nessa época do ano.
Quanto aos grupos de bactérias estudadas, durante o inverno foi observado
os maiores valores de densidade para os grupos de bactérias JNFb-dependente
(rizosfera, histoplano-raiz, filoplano-solitária), LGI-P-dependente (histoplano-folha),
49
NFb-dependente (rizosfera, rizoplano, histoplano-raiz) (103 células por grama de
tecido fresco), seguido pelas bactérias JMV – dependentes (rizosfera, histoplano
folha) (102 células por grama tecido fresco) e pela LGI-dependente (rizosfera,
rizoplano, histoplano-raiz, histoplano folha). Durante o verão, com exceção das
bactérias LGI-P – dependentes (102), todos os grupos de bactérias apresentaram os
mesmos valores máximos de densidade máxima em pelo menos um dos sítios de
análise (103).
A comparação da densidade dos diferentes grupos de bactérias obtidos em
uma única colheita, sem considerar os sítios de isolamento, durante o inverno, com
exceção das bactérias JMV-dependente (102), todos os grupos bacterianos alcanção
até 103 células por grama de tecido fresco. Durante o verão, esse ordenamento se
altera profundamente, com o grupo das bactérias NFb – dependentes se
apresentando com a maior densidade total (104), seguida das JMV-, JNFb-, LGI-
dependentes (103), e do LGI-P dependente (102).
Tabela 16. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias
diazotróficas associadas a diferentes sítios do maracujazeiro em diferentes épocas
do ano.
Maracujá Densidade (NMP x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:
JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 0,4x102 2,0x103 4,0x102 Nd 1,1x103 3,5x103 Rizoplano Nd 4,5x102 9,0x102 Nd 4,5x103 4,8x103
Histoplano Raiz Nd 1,5x103 9,0x102 2,5x102 2,5x103 3,8x103 Filoplano Solitária Nd 2,5x103 Nd 0,4x102 4,0x102 2,9x103 Filoplano Biofilme Nd 9,5x102 Nd Nd 2,5x102 9,5x102 Histoplano Folha 2,5x102 9,0x102 2,5x102 2,5x103 4,5x102 3,7x103
Total** 2,9x102 5,8x103 2,2x103 2,8x103 6,4x103 VERÃO
Rizosfera 0,4x102 9,5x102 9,5x102 Nd 7,5x103 7,7x103 Rizoplano 1,1x102 4,5x102 2,0x103 Nd 6,5x103 1,1x104
Histoplano Raiz 4,5x103 2,5x103 9,5x102 Nd 4,5x103 7,2x103 Filoplano Solitária Nd Nd Nd Nd Nd 0 Filoplano Biofilme Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 2,5x102 2,5x102 4,5x102 2,5x102 1,4x103
Total 4,6x103 6,6x103 4,1x103 4,5x102 1,7x104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;
**maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
cinco grupos de bactérias diazotróficas obtidos para um único sítio/forma de disposição.
***maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes
sítios da planta obtidos para um único grupo de bactéria diazotrófica.
50
5.1.4.2. freqüência de detecção: Quanto à freqüência de detecção, enquanto no inverno apenas os dois grupos
de bactérias malato – dependentes apresentaram – se com 100% de detecção para
pelo menos um dos sítios [JNFb-dependentes (rizosfera); NFb-dependente (rizosfera
e rizoplano)], no verão todos os grupos de bactérias diazotróficas (com exceção das
LGI-P – dependentes) apresentaram com 100% de detecção em pelo menos um dos
sítios estudados (Tabela 17).
Quanto à comparação dos diferentes sítios, sem distinguir os diferentes
grupos de bactérias, durante o inverno é a rizosfera o sítio a apresentar o maior
percentual de detecção (60%), seguida do rizoplano, histoplano folha (47%), do
histoplano raiz (40%), filoplano solitária (33%) e do filoplano biofilme (20%). No
verão o maior percentual de detecção é encontrado no rizoplano, histoplano raiz
(67%), rizosfera (53%) e histoplano folha (47%).
Quanto à comparação dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas na
planta como um todo, sem distinguir o sítio de análise, durante o inverno os maiores
percentuais de detecção são observado para as bactérias malato pH 5,8 –
dependente (72%), seguidas das bactérias malato pH 6,5 – dependentes (67%),
glicose pH 6,3 – dependentes (33%) e das manitol – dependentes, glicose pH 5,5 –
dependentes (17%). No verão, os dois grupos de bactérias malato – dependentes
foram as mais detectadas (61%), seguida das manitol – dependentes, glicose pH 6,2
– dependentes (33%) e das glicose pH 5,5 dependentes (5%).
51
Tabela 17. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a
diferentes sítios do maracujazeiro durante três colheitas por época do ano.
Maracujá Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:
JMV JNFb LGI LGI-P NFb Total INVERNO Rizosfera 33 100 67 Nd 100 60% Rizoplano Nd 67 67 Nd 100 47%
Histoplano Raiz Nd 67 33 33 67 40% Filoplano Solitária Nd 67 Nd 33 67 33% Filoplano Biofilme Nd 67 Nd Nd 33 20% Histoplano Folha 67 67 33 33 33 47%
Total 17% 72% 33% 17% 67% VERÃO
Rizosfera 33 100 33 Nd 100 53% Rizoplano 33 100 100 Nd 100 67%
Histoplano Raiz 100 100 33 Nd 100 67% Filoplano Solitária Nd Nd Nd Nd Nd 0 Filoplano Biofilme Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 33 67 33 33 67 47%
Total 33% 61% 33% 5% 61% *Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)
52
5.1.4.3. Diversidade, riqueza e abundância: Diferente do que ocorreu nos casos anteriores, nas duas estações estudadas
o maior índice de diversidade de bactérias diazotróficas foi observado no histoplano
– folha (Tabela 18). Assim, durante o inverno os maiores valores (num universo de
três amostragens) do índice de Shannon foi o seguinte: histoplano-folha (0,463539),
rizosfera (0,428511), histoplano raiz (0,370707). Durante o inverno, ocorre uma
pequena modificação, passando o ordenamento dos maiores índices de diversidade
a figurar da seguinte forma: histoplano-folha (0,684205), histoplano-raiz (0,523276)
e rizosfera (0,502215).
Quanto à riqueza de bactérias diazotróficas (Tabela 19), tanto no inverno
como no verão, apenas no histoplano-folha foi detectada a presença de todos os
grupos de bactérias diazotróficas em uma única colheita.
Quanto à abundância de bactérias diazotróficas (Tabela 20), durante o
inverno a maior densidade de bactérias diazotróficas foi de 103 células por grama de
tecido fresco. Com exceção do filoplano biofilme, tal densidade foi detectada em
todos os sítios estudados. No verão, o sitio a apresentar a maior densidade de
bactérias diazotróficas foi o rizoplano (104 células por grama de tecido fresco).
53
Tabela 18. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas
associadas a diferentes sítios do maracujazeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 0,404521 0,222246 0,428511 0,502215 0,283054 0,052313
Rizoplano 0,268065 0,121201 0,283054 0,399626 0,335866 0,082697
Histoplano-Raiz 0,370707 0 0,108261 0,523276 0,10819 0,338436
Filoplano solitário 0,174235 0,393408 Nd Nd nd Nd
Filoplano biofilme nd 0,30103 0 Nd nd Nd
Histoplano-folha 0 0,463539 0 0,684205 nd 0,30103
Tabela 19. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do maracujazeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 3 2 4 4 2 2
Rizoplano 2 3 2 3 4 3
Histoplano-Raiz 3 1 2 4 3 3
Filoplano solitário 2 3 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 2 1 0 0 0
Histoplano-folha 1 5 1 5 0 2
Tabela 20. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes
sítios do maracujazeiro. Inverno Verão
1c 2c 3c 1c 2c 3c
Rizosfera 3,5 x 103 1,2 x 103 7,8 x 102 2,9 x 103 7,0 x 102 7,7 x 103
Rizoplano 1,3 x 103 4,8 x 103 7,0 x102 7,4 x 103 1,1 x 104 4,7 x 103
Histoplano-Raiz 3,8 x 103 2,5 x 102 1,6 x 103 2,4 x 103 4,8 x 103 7,2 x 103
Filoplano solitário 2,9 x 103 5,4 x 102 0 0 0 0
Filoplano biofilme 0 5,0 x 102 9,5 x 102 0 0 0
Histoplano-folha 9,0 x 102 3,7 x 103 2,5 x 102 1,4 x 103 0 5,0 x 102
54
5.2. Isolamento de bactérias diazotróficas Ao final do processo de isolamento e confirmação da capacidade de fixar
biologicamente o nitrogênio, um total de 44 isolados bacterianos diazotróficos foi
obtido após 24 colheitas (Tabelas 21, 22 e 23). A cultura do maracujá foi a
responsável pela maioria dos isolados obtidos, 15, seguido da cultura do abacaxi,
14, mamão, 10 e finalmente goiaba, com 5 isolados. Quanto aos nichos em estudo,
a quase totalidade dos isolados são originários dos sítios intrinsecamente
relacionados às raízes (rizosfera, rizoplano ou interior do tecido da raiz), com
exceção da cultura do abacaxi, de onde foram obtidos 2 isolados endofítico de folha
e 3 endofíticos do pseudocaule. Ainda no caso do abacaxi, 2 isolados foram obtidos
da rizosfera, 1 do rizoplano e 6 do interior do raiz.
Quanto a cultura da goiaba, apenas foram isoladas bactérias da rizosfera, 4
representantes, e do rizoplano, 1.
No caso do mamão, a maioria dos isolados bacterianos forama obtidos da
rizosfera, 5, seguidos pelo rizoplano, 4, e do histoplo-raiz, 1 isolado.
No caso da cultura do maracujá, a maior parte dos isolados formam obtidos
do histoplano-raiz, 7, seguido da rizosfera, 5, e do rizoplano, cada um com 3
isolados.
Quanto a origem dos isolados no que diz respeito aos meios de cultura
utilizados, a maioria absoluta foram JNFb- e JMV- dependentes (sendo obtidos 18 e
14 isolados, respectivamente). Quanto aos demais isolados, foram obtidos 11 NFb -
dependente, e 1 isolado JMVL- dependente (meios JMV original acrescidos de
20mg/l de extrato de levedura, que entraria na composição do meio apenas com um
fator ‘start’ para o isolamento de bactérias dos gênero das Burkholderia (Reis,
comunicação pessoal)).
De uma forma geral, como era de se esperar, os sítios relacionados ao
sistema radicular foram aqueles de onde foram obtidas as maiores quantidade de
isolados bacterianos. Assim, o sítio de onde foi obtido o maior número de isolados
bacterianos foi da rizosfera, 16 isolados; seguido do histoplano – raiz, 14 isolados;
rizoplano, 9 isolados; histoplano - pseudocaule, 3 isolados; e histoplano folha, 2
isolados.
Contudo, como será mostrado abaixo através de vários exemplos, embora os
resultados de contagem pela técnica de NMP tenham revelado à presença de
possíveis bactérias diazotróficas na maioria dos sítios das fruteiras em estudo
55
(crescida na maioria dos sítios) através da detecção de uma película aerotáxica, tal
resultado não se traduziu em isolados bacterianos. No caso do abacaxi isso ocorreu
com as bactérias crescidas em meio LGI-dependentes da rizosfera e JNFb-
dependentes do rizoplano, que embora não tenham nenhum representante entre o
grupo dos 44 isolados, tiveram percentual de detecção de 67 e 100% (nas duas
época do ano) e alcançaram um número de 2,5x102 e 2,5x103 células por grama de
tecido fresco/solo, respectivamente. No caso da goiaba, as bactérias NFb -
dependentes do rizoplano tiveram percentual de detecção de 67% no inverno e
100% no verão e os resultados de contagem mostraram que sua população
alcançou até 4,5X104 células por grama de tecido fresco. Bactérias JMV -
dependentes da rizosfera tiveram 67% de detecção no inverno e 33% no verão e
alcançaram uma população de até 2,6x103 célula por grama de tecido fresco.
Quanto ao mamoeiro, as bactérias LGI-dependente do rizoplano tiveram percentual
de detecção de 100% no inverno e 33% no verão, com uma população alcançando
4,5x103 células por grama de tecido fresco. Outro exemplo é o caso das bactérias
JMV- dependentes do histoplano – folha, que alcançaram uma população de até
2,5x102 células por grama de tecido fresco, com uma freqüência de detecção de
67% no inverno e 100% no verão. No caso do maracujazeiro, bactérias LGI-P –
dependentes do histoplano-folha tiveram freqüência de detecção de 33% em ambas
as estações, com a população alcançando até 2,5x103 células por grama de tecido
fresco. Ou o caso das bactérias LGI-dependentes, detectadas no histoplano raiz
com uma freqüência de detecção de 33% em ambas as estações, alcançando uma
população de até 9,5x102 células por grama de tecido fresco.
Se à primeira vista esses resultados parecem ser um tanto quanto
controverso, é importante observamos que na fase da contagem, os resultados de
detecção que nós consideramos positivos podem de fato representar a presença de
bactérias diazotróficas, contudo, na etapa de isolamento e plaqueamento seguinte,
pode ocorrer uma competição diferenciada entre as diferentes espécies bacterianas
que estavam presentes na fase de contagem, atuando assim eliminando alguma
espécie de bactéria que estava presente no meio semi-sólido. Além disso, na etapa
de plaqueamento, a pO2 é bastante diferente daquela em que as diferentes
comunidades estavam presente. Dessa forma, é possível que nessa etapa de
plaqueamento, estejamos perdendo uma grande diversidade de bactérias
diazotróficas ainda não caracterizadas. Uma outra possibilidade seria o fato desses
56
meios estarem constituídas por bactérias saprófitas, que requerem baixo teor de N
(que seria o N advindo do extrato da planta nas primeiras diluições) ou mesmo
devido a aquisição de plasmídeos
57
Tabela 21. Relação das Bactérias isoladas na Embrapa Agrobiologia oriundas da Fazendinha Agroecológica da Embrapa/UFRRJ/Pesagro (Abacaxi, Mamão, maracujá) e do Sitio Mazomba (goiaba) durante o Inverno de 2005 e Verão de 2005/2006.
Nº de ordem
Código Nº de Ordem
Código Nº de Ordem
Código Nº de Ordem
Código
7 UENF 111222 46 UENF 312221 72 UENF 112531 97 UENF 41423215 UENF 117221 47 UENF 312501 73 UENF 114511 98 UENF 41452117 UENF 118101 49 UENF 312522 75 UENF 211531 99 UENF 11111120 UENF 118104 51 UENF 411201 76 UENF 311522 101 UENF 11411129 UENF 118611 52 UENF 411202 77 UENF 311531 102 UENF 11411230 UENF 211231 53 UENF 411203 82 UENF 411524 103 UENF 11711131 UENF 211211 54 UENF 411204 84 UENF 105 UENF 31122332 UENF 211511 55 UENF 411211 88 UENF 311212 106 UENF 31422134 UENF 212211 67 UENF 114121 91 UENF 412221 107 UENF 41411642 UENF 311211 69 UENF 114131 92 UENF 414111 108 UENF 41411745 UENF 312201 70 UENF 114132 96 UENF 414115 109 UENF 414118
AZUL=ABACAXI PRETO=GOIABA VERDE= MAMÃO VERMELHO= MARACUJÁ
58
Tabela 22. Relação dos Isolados e suas respectíveas plantas e sítios de origem,
meio de cultura onde foram isolados e resultado do agrupamento de acordo com o
perfil protéico e do sequenciamento parcial da região 16S do DNAr. Código do Isolado Hospedeiro Meio de
origem Grupo protéica
Grupo de 16S
7 UENF 111222 Abacaxi, rizosfera JNFb 15 UENF 117221 Abacaxi, histoplano-folha JNFb 17 UENF 118101 Abacaxi, pseudocaule JMV 20 UENF 118104 Abacaxi, pseudocaule JMV 29 UENF 118611 Abacaxi, pseudocaule JMVL 30 UENF 211231 Goiaba, rizosfera JNFb 31 UENF 211211 Goiaba, rizosfera JNFb 32 UENF 211511 Goiaba, rizosfera NFb 34 UENF 212211 Goiaba, rizoplano JNFb 42 UENF 311211 Mamão, rizosfera JNFb 45 UENF 312201 Mamão, rizoplano JNFb 46 UENF 312221 Mamão, rizoplano JNFb 47 UENF 312501 Mamão, rizoplano NFb 49 UENF 312522 Mamão, rizoplano NFb 51 UENF 411201 Maracujá, rizosfera JNFb 52 UENF 411202 Maracujá, rizosfera JNFb 53 UENF 411203 Maracujá, rizosfera JNFb 54 UENF 411204 Maracujá, rizoplano JNFb 55 UENF 411211 Maracujá, rizosfera JNFb 67 UENF 114121 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 69 UENF 114131 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 70 UENF 114132 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 72 UENF 112531 Abacaxi, rhizoplano NFb 73 UENF 114511 Abacaxi, histoplano-raiz NFb 75 UENF 211531 Goiaba, rizosfera NFb 76 UENF 311522 Mamão, rizosfera NFb 77 UENF 311531 Mamão, rizosfera NFb 82 UENF 411524 Maracujá, rizosfera NFb 84 UENF 412522 Maracujá, rizoplano NFb 88 UENF 311212 Mamão, rizosfera JNFb 91 UENF 412221 Maracujá, rizoplano JNFb 92 UENF 414111 Maracujá, histoplano-raiz JMV 96 UENF 414115 Maracujá, histoplano-raiz JMV 97 UENF 414232 Maracujá, histoplano-raiz JNFb 98 UENF 414521 Maracujá, histoplano-raiz NFb 99 UENF 111111 Abacaxi, rizosfera JMV 101 UENF 114111 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 102 UENF 114112 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 103 UENF 117111 Abacaxi, histoplano-folha JMV 105 UENF 311223 Mamão, rizosfera JNFb 106 UENF 314221 Mamão, histoplano-raiz JNFb 107 UENF 414116 Maracujá, histoplano-raiz JMV 108 UENF 414117 Maracujá, histoplano-raiz JMV 109 UENF 414118 Maracujá, histoplano-raiz JMV
59
Tabela 23. Relação da distribuição numérica dos isolados bacterianos diazotróficos oriundos dos diferentes sítios de isolamento a partir dos diferentes meios de culturas semi-sólidos. Cultura Sítio Meio de cultura Total
JMV JNFb LGI LGI-P NFB JMVL** Abacaxi
Rizosfera 1 1 2. Rizoplano 1 1. Hist. Raiz 5 1 6. Filoplano Agr. Folha Hist. Folha 1 1 2. Hist. P-Caule 2 1 3 SUB TOTAL 9 2 2 1 14
Goiaba
Rizosfera 2 2 4. Rizoplano 1 1. Hist. Raiz Filoplano Agr. Folha Hist. Folha SUB TOTAL 3 2 5
Mamão
Rizosfera 3 2 5. Rizoplano 2 2 4. Hist. Raíz 1 1. Filoplano Agr. Folha Hist. Folha SUB TOTAL 6 4 10
Maracujá
Rizosfera 4 1 5. Rizoplano 2 1 3. Hist. Raiz 5 1 1 7. Filoplano Agr. Folha Hist. folha SUB TOTAL 5 7 3 15
*TOTAL 14 18 0 11 1 44 * a essa relação ainda serão acrescentados entorno de 15 isolados que e estão na fase final de isolamento. ** o meio JMVL semi-sólido foi confeccionado, adicionando-se 10 mg de extrato de levedura por litro de meio de cultura JMV semi-sólido (No caso do meio JMV Sólido, foram adicionados 100 mg de extrato de levedura por litro de meio JMV). O meio JMVL semi-sólido não foi utilizado na fase de colheita, mas apenas nas fases de isolamento.
60
5.3 Agrupamento dos Isolados bacterianos diazotróficos A análise de agrupamento dos 44 isolados bacterianos obtidos a partir das quatro fruteiras em estudo resultou na formação de 7 grupos com diferentes números de representante quando avaliada a um grau de similaridade de aproximadamente 90%. Apenas um isolado não se localizou em nenhum grupo (ISOLADO 55) (ver código dos isolados na tabela 1). No grupo ‘a’ foram se posicionaram dois isolados (7 e 31); O grupo ‘b’ foi formado por seis isolados (51, 75, 76, 77, 105 e 106); O grupo ‘c’ foi formado por 4 isolados (52, 54, 72 e 84); O grupo ‘d’ foi formado também por quatro isolados (30, 73, 82 e 91); No grupo ‘e’ se agruparam 5 isolados (15, 34, 42, 46 e 49); O grupo ‘f’ foi maior de todos com 15 isolados (17, 20, 29, 108, 109, 103, 102, 96, 101, 99, 107, 92, 70, 69 e 67), e o grupo ‘g’ o menor de todos com dois isolados (32 e 53).
Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00
101
7
31
51
75
106
105
77
76
52
72
54
84
30
82
73
91
15
42
34
46
49
17
20
29
108
109
103
102
96
101
99
107
92
70
69
67
32
53
55
Figura 5. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias diazotróficas isoladas a partir da cultura do abacaxi, goiaba,
mamão e maracujá.
a
b
c
d
e
f
g
61
5.4 Isolamento de bactérias não diazotróficas Além das bactérias fixadoras de nitrogênio, conforme apresentado no primeiro
capítulo da presente tese, também foram isoladas bactérias que não são
necessariamente fixadoras de nitrogênio, através do uso dos meios ricos NB e
DYGS. Nesse etapa foram obtidos 237 isolados bacterianos (Tabela 24).
Conforme observado na tabela 24, das bactérias isoladas em meio rico, 40
foram isoladas a partir de abacaxi smoth cayenne em meio NB. Quanto a origem dos
isolados (sítios na planta), 15 dos isolados são epífitos de raiz, 3 isolados são
endófitos de raiz, 10 são epífitos de folha e 8 são endófitos de folha;
Ainda a partir da cultura de abacaxi smooth cayenne, usando o meio de
cultura Dygs, foram obtidos 25 isolados. Quanto à origem dos isolados, 5 isolados
são rizosféricos, 9 isolados são epífitos de raiz, 5 isolados são endófitos de raiz, 4
isolados são epífitos de folha e 2 isolados são endófitos de folha.
Foram obtidos 25 isolados a partir da cultura de abacaxi pérola em meio
DYGS. Dentre esses 25, 6 isolados são rizosférico, 7 isolados são epífitos de raiz, 5
isolados são endófitos de raiz, 2 isolados são epífitos de folha e 5 isolados são
endófitos de folha.
Da cultura de maracujá amarelo, usando o meio de cultura NB, foram obtidos
79 isolados, dos quais 7 isolados são epífitos de raiz, 14 isolados são endófitos de
raiz, 11 isolados são epífitos de caule, 15 isolados são endófito de caule, 20 isolados
são epífito de folha, e 12 isolados são endófitos de folha.
Foram obtidos 65 isolados oriundos de maracujá amarelo usando o meio de
cultura DYGS. Quanto a origem desses isolados, 14 isolados são epifíticos de raiz,
15 isolados são endófitos de raiz, 11 isolados são epífitos de caule, 6 isolados são
endófito de caule, 11 isolados são epifíticos de folha e 8 são endófitos de folha.
62
5.5 Agrupamento dos isolados bacterianos não diazotróficos baseados em características morfológicas da colônia.
A Partir do universo de 237 isolados, foram construídos cinco dendogramas
de similaridade baseado em características morfológicas das colônias (anexo II), um
para cada grupo de bactérias oriundas de cada espécie de fruteira (figuras 6, 7, 8, 9
e 10). Uma característica comum de todos os dendogramas foi o alto índice de
similaridades, tendo em vista que a formação de grupos se deu a 90% de
similaridade.
O primeiro dendograma diz respeito aos 65 isolados oriundos da cultura do
Maracujá amarelo, obtidos a partir de meio de cultura DYGS (Figura 6). Esses
isolados foram agrupados em 8 grupos. Grupo ‘a’ comportou 32 isolados (UENF
412921; UENF 412922; UENF 412929; UENF 414925; UENF 413927; UENF
4139212; UENF 412924; UENF 4149210; UENF 412928; UENF 413929; UENF
415923; UENF 417922; UENF 415926; UENF 4169211; UENF 413926; UENF
417926; UENF 417926; UENF 417923; UENF 415921; UENF 416924; UENF
4149210; UENF 414928; UENF 4160210; UENF 413925; UENF 4139211; UENF
417927; UENF 414923; UENF 412923; UENF 417925; UENF 412926; UENF
4139213; UENF 414927; UENF 416923); O grupo ‘b’ comportou somente dois
isolados (UENF 415922; UENF 416921); O grupo ‘c’ comportou 11 isolados (UENF
412925; UENF 413923; UENF 413924; UENF 414921; UENF 4129211; UENF
416929; UENF 415924; UENF 413921; UENF 416925; UENF 414922; UENF
413922); O grupo ‘d’ foi formado apenas por 3 isolados (UENF 412927; UENF
413928; UENF 4139210); O grupo ‘e’ foi formado também apenas por 2 isolados
(UENF 4139215 e UENF 416926); O grupo ‘f’ foi formado por 3 isolados (UENF
4129212; UENF 417924; UENF 417921); O grupo ‘g’ foi formado por 2 isolados,
todos obtidos a partir do cauliplano (UENF 414929; UENF 4149211) e finalmente o
grupo ‘h’ também foi formado por 2 isolados, sendo todos isolados a partir do
rizoplano (UENF 4129213; UENF 4129214). Sete isolados não foram agrupados
(UENF 414924; UENF 416927; UENF 416928; UENF 415925; UENF 417928; UENF
4169212; UENF 4139214; UENF 414926).
63
Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
4129210
412921 412922 412929 414925 413927 4139212 412924 4129210 412928 413929 415923 417922 415926 4169211 413926 417926 417923 415921 416924 4149210 414928 4169210 413925 4139211 417927 414923 412923 417925 412926 4139213 414927 416923 415922 416921 412925 413923 413924 414921 4129211 416929 415924 413921 416925 414922 413922 412927 413928 4139210 414924 416927 416928 4139215 416926 415925 417928 4169212 416922 4129212 417924 417921 4139214 414926 414929 4149211 4129213 4129214
Figura 6. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da colônia de bactérias isoladas em meio DYG`S a partir da cultura do Maracujá.
a
b
c
d
e
f
gh
64
O dendograma para análise do grau de diversidade das 79 bactérias isoladas
a partir da cultura do maracujá amarelo, usando-se meio de cultura rico NB (Figura
7), agrupou tais isolados em 4 grupos. No grupo ‘a’, formado por 56 isolados (UENF
412821; UENF 412824; UENF 412825; UENF 412829; UENF 413821; UENF
417829; UENF 417826; UENF 417827; UENF 413822; UENF 4168223; UENF
417821; UENF 4168220; UENF 4168218; UENF 4178212; UENF4168213; UENF
4168212; UENF 4168210; UENF 4178210; UENF 416827; UENF 4168219; UENF
416821; UENF 4158215; UENF 4158213; UENF 4168217; UENF 415829; UENF
415826; UENF 415825; UENF 416722; UENF 4148211; UENF 4158212; UENF
414828; UENF 414827; UENF 414824; UENF 413824; UENF 4138213; UENF
4138212; UENF 4138211; UENF 4138210; UENF 413829; UENF 413828; UENF
413827; UENF 416829; UENF 413825; UENF 412822; UENF 4168216; UENF
4168222; UENF 414823; UENF 4168215; UENF 416825; UENF 4158211; UENF
415828; UENF 4168214; UENF 415827; UENF 414829; UENF 415814; UENF
414826). O grupo ‘b’ comportou 12 isolados (UENF 412826; UENF 4178213; UENF
413823; UENF 417828; UENF 4168211; UENF 416828; UENF 416826; UENF
4138214; UENF 4148210; UENF 415823; UENF 4168221; UENF 412822). O grupo
‘c’ comportou apenas 3 isolados (UENF 414821; UENF 414825; UENF 414822) e o
grupo ‘d’ comportou 10 isolados (UENF 412823; UENF 413826; UENF 4178211;
UENF 415824; UENF 4158210; UENF 417823; UENF 417824; UENF 416823; UENF
416824; UENF 417825). Dois isolados não se agruparam em nenhum grupo (UENF
415822; UENF 415821).
65
Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00
4138210
412821 412824 412825 412829 413821 417829 417826 417827 413822 4168223 417821 4168220 4168218 4178212 4168213 4168212 4168210 4178210 416827 4168219 416821 4158215 4158213 4168217 415829 415826 415825 416822 4148211 4158212 414828 414827 414824 413824 4138213 4138212 4138211 4138210 413829 413828 413827 416829 418325 412822 4168216 4168222 414823 4168215 416825 4158211 415828 4168214 415827 414829 415814 414826 412826 4178213 413823 417828 4168211 416828 416826 4138214 4148210 415823 4168221 412822 414821 414825 414822 412823 413826 4178211 415824 4158210 417823 417824 416823 416824 417825 415822 415821
a
Figura 7. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do Maracujá.
d
b
c
66
Na Figura 8 está o dendograma de similaridade dos 25 isolados bacterianos a
partir da cultura do abacaxi pérola em meio DYGS. Tais isolados foram agrupados
em cinco grupos bacterianos. No grupo ‘a’ foram agrupados 5 isolados (UENF
121921; UENF 122924; UENF 121922; UENF 121924; UENF 122921). No grupo ‘b’
foram agrupados também 5 isolados ( UENF 123923; UENF 127922; UENF 127924;
UENF 127925). O grupo ‘c’ foi composto por 7 isolados (UENF 121925; UENF
123925; UENF 127923; UENF 121926; UENF 122923; UENF 123922; UENF
123934). O Grupo ‘d’ foi formado por 5 isolados (UENF 121923; UENF 126921;
UENF 126922; UENF 127926; UENF 122925). O grupo ‘e’ foi formado por 2 isolados
(UENF 123921; UENF 127921). Dois isolados não se agruparam em nenhum grupo
(UENF 122922; UENF 123926).
Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
121921
121921
122924
121922
121924
122921
123923
127922
127924
127925
122922
121925
123925
127923
121926
122923
123922
123924
121923
126921
196922
127926
122925
123926
123921
127921
a
b
c
d
e
Figura 8. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio DYG´S a partir da cultura do abacaxi Pérola.
67
Os 25 isolados da cultura do abacaxi Smoth cayenne, obtidos em meio de
cultura DYGS, se agruparam em 8 grupos distintos (Fugura 9). No grupo ‘a’ foram
agrupados 3 isolados bacterianos (UENF 111925; UENF 113922; UENF 113925).
No grupo ‘b’ foram agrupados 4 isolados (UENF 112922; UENF 116922; UENF
116923; UENF 116924). O grupo ‘c’ foi composto por 5 isolados (UENF 113921;
UENF 113923; UENF 117921; UENF 116921; UENF 117922). O grupo ‘d’ foi
composto por 4 isolados (UENF 111923; UENF 112927; UENF 112921; UENF
112929). O grupo ‘e’ foi composto por 2 isolados (UENF 111924; UENF 112926). O
grupo ‘f’ também foi composto por 2 isolados (UENF 112923; UENF 112924). O
grupo ‘g’ foi composto por 3 isolados (UENF 112928; UENF 1129210; UENF
1129211). Quatro isolados bacterianos não se agruparam em nenhum grupo (UENF
111921; UENF 111922; UENF 112925; UENF 113924).
68
Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
1129210
111921
111922
112925
111925
113922
113925
112922
116922
116923
116924
113921
113923
117921
116921
117922
111923
112927
112921
112929
111924
112926
112923
112924
113924
112928
1129210
1129211
a
b
c
d
e
f
g
Tabela 9. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio DYG`S a partir da cultura do abacaxi Smoth
cayenne.
69
O dendograma de similaridade dos 40 isolados bacterianos oriundos da
cultura do abacaxi Smoth cayenne, isolados em meio de cultura NB resultou em 7
grupos. No grupo ‘a’ estavam presente 12 isolados (UENF 112821; UENF 113826;
UENF 116824; UENF 117822; UENF 116827; UENF 116826; UENF 113827; UENF
112822; UENF 112823; UENF 112824; UENF 112827; UENF 113824); No grupo ‘b’
foram agrupadas 2 representantes (UENF 113825; UENF 117821); O grupo ‘c’ foi
formados por 4 representantes (UENF 112828; UENF 116823; UENF 117828; UENF
1178212); O grupo ‘d’ foi formado por 3 representantes (UENF 112825; UENF
116821; UENF 116825); O grupo ‘e’ foi formado por 10 isolados (UENF 112826;
UENF117824; UENF 1168210; UENF 116828; UENF 116822; UENF 112829; UENF
113821; UENF 113823; UENF 117823; UENF 113822); O grupo ‘f’ foi composto por
6 isolados (UENF 1128210; UENF 117827; UENF 116829; UENF 117825; UENF
1128211; UENF 1128214); O grupo ‘g’ foi composto por apenas 3 isolados (UENF
1128213; UENF 1128215; UENF 117826).
70
Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00
1128210
112821
113826
116824
117822
116827
116826
113827
112822
112823
112824
112827
113824
113825
117821
112828
116823
117828
1128212
112825
116821
116825
112826
117824
1168210
116828
116822
112829
113821
113823
117823
113822
1128210
117827
116829
117825
1128211
1128214
1128213
1128215
117826
a
Figura 10. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da
colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do abacaxi Smoth
cayenne.
b
c
d
e
f
g
71
Tabela 24. Número de isolados bacterianos e seus respectivos sítios de origem
obtidos até o momento a partir das diferentes fruteiras a partir de meio ricos (NB e
DYGS)
Espécie vegetal Meio de
cultura
Riz
osfe
ra
Riz
opla
no
End.
Rai
z
Cau
lipla
no
End.
Cau
le
Filo
plan
o
End.
Fol
ha
Rai
z nã
o
dese
nf.
P.A
. Não
dese
n.
End´
. P.A
TOTA
L
Abacaxi smoth cayenne
NB 15 3 10 8 40
DYGS 5 9 5 4 2 25
Abacaxi pérola NB
DYGS 6 7 5 2 5 25
Maracujá Amarelo NB 7 14 11 15 20 15 79
DYGS 14 15 11 6 11 8 65
72
6. Discussão A biogeografia de microrganismos é um tema recente que tem gerado uma
grande discussão (Mantiny et al., 2006). Apesar de toda essa discussão a respeito
de tal tema, uma grande parte da comunidade microbiologista concorda com o fato
de que diferentes condições ambientais, tais como pO2, exposição a UV, umidade,
temperatura e disponibilidade de nutrientes ao longo do corpo vegetal (Halmann et
al., 1997; Andrews e Harris, 2000; Ramey et al., 2004) são apropriados para o
desenvolvimento de uma distribuição microbiana não randômica ao longo do eixo
vegetal. Assim, devido ao fato de que a maioria de trabalhos ecológicos com
bactérias diazotróficas não nodulantes (rizosfera, associativa e endofítica) realizados
até agora, têm esquecido de abordar o parâmetro tempo-espaço, e que as perquisar
a cerca da interação bactéria diazotrófica-planta frutífera estão ainda em sua fase
inicial, o presente trabalho objetivou estudar a distribuição de bactérias diazotróficas
cultiváveis ao longo do eixo vegetativo de fruteiras desse estudo, durante duas
estações, inverno e verão.
6.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número mais provável (NMP): Embora a técnica de NMP tenha revelado a presença de bactérias
diazotróficas em todas as fruteiras, épocas do ano e na maioria dos sítios estudados
(tabela 1, 2, 3 e 4), na maioria dos tratamentos a presença de tais bactérias não foi
detectada em todas as três colheitas de uma mesma estação. Existindo muitos
casos, em que não foram detectadas bactérias em nenhuma das colheitas. Tal fato
ocorreu com grande freqüência no caso da superfície da folha. Assim, se por um
lado os resultados de NMP corroboram até certo ponto com os resultados do
número de bactéria isoladas, uma vez que as maiores populações foram daquelas
JNFb - e NFB - dependente, por outro, os resultados de contagem de bactérias nos
diferentes nichos, como também do crescimento nos demais meios semi-sólidos não
refletem o que foi isolado. Como exemplos que melhor refletem essa contradição
podemos observar a detecção de bactérias diazotróficas nos meios JMV, LGI e LGI-
P originários da maioria das culturas ou dos sítios que não estão representados na
população de isolados até aqui.
De uma forma geral o que se pode observar dos resultados das análises da
contagem das bactérias diazotróficas baseado na técnica de NMP, é a inexistência
73
de um padrão lógicos dos diferentes parâmetros analisados: maiores valores de
densidades de bactérias diazotróficas; freqüência de detecção, índice de
diversidade, a riqueza e a abundância. Ou seja esses índices nos diferentes sítios
variaram em ralação a todos os parâmetros estudados: fruteira, sítio, época do ano e
meio de cultura utilizado. Assim, se por um lado não foi observado um padrão
racional de distribuição microbiana entre os diferentes sítios ao longo do eixo
vegetativo da planta, por outro na maioria das vezes (com exceção da cultura do
abacaxi analisada no inverno) os sítios que resultaram nos maiores valores de NMP
são os sitos relacionados à região da raiz (rizosfera, rizoplano e histoplane – raiz),
fato que embora corrabore com o que a literatura tem publicado a respeito da
distribuição microbiana em geral, por outro, não é o que tem se observado nos
pouco trabalhos que objetivaram estudar o padrão de distribuição das bactérias
diazotróficas em ambas as regiões, abaixo (raiz) e acima do solo (parte aérea) ().
Os resultados da densidade máxima de bactérias diazotróficas (104) aqui
apresentados pela técnica de número mais provável, se mostram um pouco
menores do que os encontrados em estudos para outras culturas
(Muthukumarasamy et al., 2007; Roesch et al., 2006) e até mesmo alguns sítios das
mesmas espécie fruteiras estudadas aqui (Weber et al., 1999). Entretanto, a
principal lição que se pode tirar do presente estudo para a maioria das fruteiras
estudadas, foi a clara divisão da planta quanto ao aspecto ecológico nas regiões
abaixo e acima do solo, como ilustrado por Andrews e Harris, 2000. Entretanto,
apesar de acreditarmos na existência de um grande gradiente de densidade
microbiana entre as duas regiões, que seria governado por bióticos e abióticos
(ambientais), a completa ausência de bactérias diazotróficas nos sítios associados a
parte superior do vegetal nos parece amplamente improvável. Isso porque,
recentemente microbiologistas têm sugerido que bactérias diazotróficas poderiam
possuir uma ‘airborne phase’ (Bashan e Holguin, 1997), que poderiam atuar como
um mecanismo passivo de deposição: ‘win and rain splash in the phyllosphere, and
water flow in the rhizosphere’ (Bashan e Holguin, 1997). Além disso, a comunidade
microbiana geral, poderia vencer diferentes condições inóspitas encontradas até
mesmo na superfície de folha, através do uso de diversas estratégias de ação
(Lindow e Brandl, 2003).
No caso de bactérias diazotróficas em específico, a disposição microbiana
sob a forma de biofilme tem sido sugerido na introdução de apresentação do
74
periódico ‘biofilme’ como um disposição microbiana apropriada para abrigar
bactérias diazotróficas, devido à baixa pressão de pO2 no seu interior (Costerton e
Wilson, 2004). Além disso, de acordo com Ramey et al., 2004, Azospirillum
brasilense, uma bactéria diazotrófica ‘ coloniza a região de elongação da raiz e pelos
radiculares, formando densos biofilme’. Assim, o insucesso na adaptação do
protocolo de Morris na obtenção de biofilmes que poderiam colonizar a rizosfera,
pode ter sido a razão de não termos recuperado bactérias diazotróficas sob essa
forma de organização.
6.2. Isolamento de bactérias diazotróficas Embora o número de isolados bacterianos obtidos no presente estudo não
tenha sido alto e não tenham sido obtidos de todos os sítios estudados, dois fatores
contribuem para conferir um importante papel a esse estudo: o primeiro desses
fatores seria a própria escolha das culturas, onde três das quatro fruteiras em estudo
(goiaba, mamão e maracujá) não tinha sido alvo de nenhum estudo de
bioprospecção de bactérias diazotróficas, embora sejam de importante papel
econômica para a fruticultura brasileira; o segundo desses fatores é o fato de terem
sido isolados um grande número de bactérias endofítica (histoplano-raiz, histoplano-
pseudocaule e histoplano-folha) grupo ecológico bacteriano de grande potencial
biotecnológico, e por muito tempo deixado de fora do objetivo principal da grande
maioria dos estudo tanto ecológico como de bioprospecção.
O sucesso no isolamento de bactérias diazotróficas endofíticas associadas a
abacaxi, mamão e maracujá, nos faz concordar com uma das conclusões finais de
Jimenez-Salgado (Jimenez-Salgado, et al., 1997), que procurando por bactérias
diazotróficas associadas a plantas não-gramíneas (café) concluiu: ‘bactérias
diazotróficas endofíticas são mais prevalent do que se pensava previamente’.
Talvez futuros estudos baseados no uso de uma abordagem polifásica,
através do uso de técnicas dependentes e independentes de cultivo, poderiam
contribuir para refinar os aspectos biogeográficos de estudos semelhantes a esse.
Entretanto, o presente trabalho, onde foi realizado uma refinada procura por
bactérias diazotrófica sob o aspecto tempo-espaço através de técnicas clássicas de
contagem e isolamento, em plantas pouco ou ainda não estudadas, representa um
passo inicial muito importante no entendimento da relação planta – bactéria e a
importância desse grupo de bactéria para as plantas frutíferas estudadas aqui.
75
Apesar disso, futuros estudos de reinoculação desses isolados, inicialmente em
casa de vegetação e posteriormente no campo, certamente representarão uma
etapa crucial não só para desvendarmos a interação entre esses isolados e seu
respectivos hospedeiros, como também no potencial biotecnológico desses isolados.
6.7 Considerações quanto aos resultados de isolamento: Vale lembrar que os resultados quantitativos de isolamento tanto dos
microrganismos diazotróficos como daqueles isolados nos meios ricos, não objetiva
comparar a diversidade entre as diferentes fruteiras, nem tão pouco entre os seus
diferentes compartimentos, uma vez que, conforme o revisado por Amann et al.,
1995, apenas uma pequena fração das espécies de bactéria dos mais diferentes
ambientes é capaz de crescer em meio de cultura. Contudo os resultados
apresentados possuem o objetivo prático e aplicado de relatarmos o quantitativo, e
suas respectivas origens natural, dos isolados purificados e caracterizados que
temos em nossa bacterioteca em construção, que serão fruto de futuros estudos no
âmbito da seleção das bactérias com potencial biotecnológico.
76
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84
Anexos
Anexo I: fotografias das áreas onde se encontram as fruteiras utilizadas no estudo:
Figura 14. Fotografia da entrada da Fazendinha Agroecológica (Embrapa/UFRRJ/Pesagro)
Figura 15. Fotografia da plantação de Mamão onde foi retirada amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.
Figura 16. Esquema da plantação de Abacaxi onde foram retiradas amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas
Figura 17. Esquema da plantação da cultura do Maracujá onde foram retiradas plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.
85
Anexo II – Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos
(baseado em Perin 2002)
Tamanho: menor que 1 mm, puntiforme e maior que 1 mm, anotar dimensão
Forma: circular ou irregular
Elevação:
Plana lente convexa
Pulvinada umbonada umbilicada
Bordo:
ondulada lobada denteada filamentosa inteira
Superfície:
lisa rugosa papilada
Figura 18. Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos
(Perin, 2003).
86
Anexo III: Valores de redução de acetileno produzido pelos isolados bacterianos oriundos das diferentes fruteiras: Tabela 25. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do abacaxizeiro.
Código Ordem Tratamento Repetição ARA (ml)ARA (frasco) Média
UENF 111222 7 10 1 20,12 201,2 7 10 2 22,68 226,8 214 UENF 117221 15 11 1 6,6 66 15 11 2 7,5 75 70,5 UENF 118101 17 13 1 13,09 130,9 17 13 2 13,31 133,1 132 UENF 118104 20 15 1 6,43 64,3 20 15 2 23,62 236,2 150,25 UENF 118611 29 16 1 12,42 124,2 29 16 2 7,69 76,9 100,55 UENF114121 67 18 1 8,98 89,8 67 18 2 8,71 87,1 88,45 UENF 114131 69 20 1 2,23 22,3 69 20 2 6,29 62,9 42,6 UENF 114132 70 21 1 10,33 103,3 70 21 2 11,58 115,8 109,55 UENF 112531 72 26 1 4,05 40,5 72 26 2 4,3 43 41,75 UENF 114511 73 27 1 2,12 21,2 73 27 1 2,12 21,2 21,2 UENF 111111 99 22 1 10,94 109,4 99 22 2 12,34 123,4 116,4 UENF 114111 101 23 1 9,72 97,2 101 23 2 8,95 89,5 93,35 UENF 114112 102 24 1 8,75 87,5 102 24 2 10,47 104,7 96,1 UENF 117111 103 25 1 9,22 92,2 103 25 2 10,07 100,7 96,45 Tabela 26. valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo da goiabeira.
Código Ordem Tratamento RepetiçãoARA (ml)
ARA (frasco) Média
UENF 211231 30 4 1 35,62 356,2 30 4 2 24,72 247,2 301,7 UENF 211211 31 5 1 26,86 268,6 31 5 2 32,44 324,4 296,5 UENF 212211 34 6 1 28,25 282,5 34 6 2 33,31 333,1 307,8 UENF 214301 36 3 1 28,35 283,5 36 3 2 26,29 262,9 273,2
87
Tabela 27, valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do mamoeiro.
Código Ordem Tratamento RepetiçãoARA (ml)
ARA (frasco) Média
UENF 311211 42 2 1 39,9 399 42 2 2 43,24 432,4 415,7 UENF 312201 45 4 1 33,9 339 45 4 2 38,58 385,8 362,4 UENF 312221 46 11 1 8,98 89,8 46 11 2 9,31 93,1 91,45 UENF 312522 49 15 1 6,42 64,2 49 15 2 5,17 51,7 57,95 UENF 311522 76 5 1 4,2 42 76 5 2 5,09 50,9 46,45 UENF 311531 77 6 1 1,65 16,5 77 6 2 1,53 15,3 15,9 UENF 311223 105 13 1 4,2 42 105 13 2 7,59 75,9 58,95 Tabela 28, valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do maracujazeiro.
Código Ordem Tratamento Repetição ARA (ml)ARA (frasco) Média
UENF 411201 51 9 1 9,88 98,8 51 9 2 10,14 101,4 100,1 UENF 411202 52 10 1 18,22 182,2 52 10 2 15,68 156,8 169,5 UENF 411203 53 11 1 3,84 38,4 53 11 2 2,17 21,7 30,05 UENF 411211 55 12 1 11,22 112,2 55 12 2 17,32 173,2 142,7 UENF 412221 91 8 1 18,67 186,7 91 8 2 22,75 227,5 207,1 UENF 414111 92 1 1 5,05 50,5 92 1 2 5,56 55,6 53,05 UENF 414232 97 14 1 2,03 20,3 97 14 2 3,6 36 28,15 UENF 414116 107 2 1 4,6 46 107 2 2 10,62 106,2 76,1 UENF 414117 108 3 1 6,69 66,9 108 3 2 6,93 69,3 68,1 UENF 414118 109 4 1 17,57 175,7 109 4 2 13,13 131,3 153,5
88
Anexo IV: composição dos meios de cultura: Solução Salina Para Diluição: K2HPO4 (sol. 10%).....................................................1,0ml MgSO4 (sol. 10%)....................................................0,5ml NaCl (sol. 10%)..........................................................0,2ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..................................................0,5ml FeEDTA (sol. 1,64%)................................................1,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura............0,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,5 (ajustado com sol. de ácido sulfúrico 5%) Meio JMV: Manitol.....................................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%)................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)..............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,0 Agar: 25g/l (para meio sólido) (para meio sólido adicionar 100mg/l de extrato de levedura) 1,6g/l(para meio semi-sólido) Meio JMVL: Manitol.....................................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%)................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)..............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Extrato de levedura.................................................20mg Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,0-5,4 Agar: 25g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido)
89
Meio JNFb: Ácido Málico...........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)...............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..4,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura..........2,0ml Vitamina para meio de cultura.................................1,0ml KOH.........................................................................4,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,8 Agar: 17g/l (para meio sólido) (para meio sólido adicionar 20g de extrato de levedura) 1,7g/l(para meio semi-sólido) Meio LGI: Açúcar cristal..........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................2,0ml KH2PO4 (sol. 10%).................................................6,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Na2MoO4.2H20 (sol. 0,1%).....................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..5,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,0-6,2 Agar: 15g/l (para meio sólido) 1,4g/l(para meio semi-sólido) Meio LGI-P: Açúcar cristal......................................................100,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................2,0ml KH2PO4 (sol. 10%).................................................6,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeCl3 (sol. 1%)........................................................1,0ml Na2MoO4.2H20 (sol. 0,1%).....................................2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..5,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH..5,5 (ajustados com ácido acético sol. 10%) Agar: 25g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido)
90
Meio NFb: Ácido Málico...........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................5,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%).......................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml KOH.........................................................................4,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,5 Agar: 15g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido) Meio Batata: Batata……………………………………….................200g Ácido málico………………………………..................2,5g Açúcar cristal………………………………..................2,5g Solução de Micronutriente para Meio de Cultura...........2,0ml Solução de Vitamina para meio de Cultura....................1ml Sólido: 15g/l de ágar Meio Dygs (Modificado): Glicose………………………………………………….2,0g Ácido málico …………………………………….……..2,0g Peptona bacteriológica…………………………….……1,5g Extrato de Levedura.........................................................2.0g K2HPO4............................................................................0,5g MgSO4.7H2O....................................................................0,5g Ácido glutâmico...............................................................1,5g Completar com água destilada para 1000 ml pH 6,4 Sólido: 15g/l
Fonte: Döbereiner et al., 1995.
91
92
Anexo V. Fotos das colônias de alguns isolados bacterianos diazotrófico (ver código
dos diferentes isolados na tabela 1).
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