VALTER T. MOTTA BIOQUMICA BSICA

Introduo bioqumica

Captulo

1

1

Introduo Bioqumica

Objetivos

1 Relacionar a importncia da gua a suas propriedades fsicas e qumicas.

2 Definir pH, pK, tampo e seu significado biolgico.

3 Descrever as propriedades biologicamente importantes do carbono.

4 Descrever a estrutura tridimensional das molculas biolgicas.

5 Descrever as macromolculas como polmeros de pequenas molculas.

6 Descrever as molculas hbridas como conjugados de diferentes classes de molculas biolgicas.

7 Diferenciar as clulas procariticas das clulas eucariticas

A bioqumica estuda as estruturas moleculares, os mecanismos e os processos qumicos responsveis pela vida. Os organismos vivos continuamente efetuam atividades que permitem a sua sobrevivncia, crescimento e reproduo. Para realizar as suas funes, os seres vivos dependem da capacidade de obter, transformar, armazenar e utilizar energia. Sem energia ocorre a perda da vitalidade e a morte celular. A maioria dos constituintes moleculares apresenta formas tridimensionais que executam inmeras reaes qumicas entre si para manter e perpetuar a vida. Em bioqumica, a estrutura, a organizao e as atividades potenciais dessas molculas so examinadas na tentativa de elucidar que aspectos promovem as indispensveis contribuies manuteno da vida.

Os organismos vivos so estruturalmente complexos e diversificados. Todavia, muitas caractersticas so comuns a todos eles. Todos fazem uso das mesmas espcies de molculas e extraem a energia do meio ambiente para as suas funes. Quando as molculas que compem os seres vivos so isoladas, esto sujeitas a todas as leis da qumica e da fsica que regem o universo no vivo.

Apesar da grande diversidade dos processos bioqumicos que envolvem a integrao funcional de milhes de molculas para manter e perpetuar a vida, a ordem biolgica conservada por vrios processos: (1) sntese de biomolculas, (2) transporte de ons e molculas atravs das membranas biolgicas, (3) produo de energia e movimento e (4) remoo de produtos metablicos de excreo e substncias txicas.

2 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. A quase totalidade das reaes qumicas que ocorre nos seres

vivos so catalisadas por enzimas protenas com funes catalticas. As reaes celulares, conhecidas coletivamente como metabolismo, resultam de atividades altamente coordenadas. Os tipos mais comuns de reaes encontradas nos processos bioqumicos so: (1) substituio nuclefila, (2) eliminao, (3) adio, (4) isomerizao e (5) oxidao e reduo.

Os seres vivos so formados por uma grande variedade de molculas, tais como: carboidratos, lipdeos, protenas, cidos nuclicos e compostos relacionados. Alm dessas, outras substncias esto presentes em pequenas quantidades: vitaminas, sais minerais, hormnios, etc. Muitos desses compostos se caracterizam por um ou mais grupos cidos ou bsicos em suas molculas e ocorrem em soluo aquosa como espcies ionizadas. A ionizao tem lugar em gua, sendo este um pr-requisito para muitas reaes bioqumicas. O grau de dissociao ou a extenso da ionizao de um grupo qumico em particular e, portanto, a reatividade bioqumica da molcula, amplamente influenciada pela concentrao do on hidrognio da soluo. Isto aplicvel tanto para as vias metablicas, como tambm para os catalisadores biolgicos (enzimas), que controlam as reaes celulares.

1.2 gua: o meio da vida

A gua compe a maior parte da massa corporal do ser humano. o solvente biolgico ideal. A capacidade solvente inclui ons (ex.: Na+, K+ e Cl), acares e muitos aminocidos. Sua incapacidade para dissolver algumas substncias como lipdeos e alguns aminocidos, permite a formao de estruturas supramoleculares (ex.: membranas) e numerosos processos bioqumicos (ex.: dobramento protico). Nela esto dissolvidas ou suspensas as molculas e partculas necessrias para o bom funcionamento celular. Reagentes e produtos de reaes metablicas, nutrientes, assim como produtos de excreo, dependem da gua para o transporte no interior das clulas e entre as clulas.

As interaes fracas so os meios pelos quais as molculas interagem entre si enzimas com seus substratos, hormnios com seus receptores, anticorpos com seus antgenos. A fora e a especificidade das interaes fracas so grandemente dependentes do meio onde ocorrem, sendo que a maioria das interaes biolgicas tem lugar na gua. Duas propriedades da gua so especialmente importantes para a existncia dos seres vivos:

A gua uma molcula polar. A molcula de gua no-linear com distribuio da carga de forma assimtrica.

A gua altamente coesiva. As molculas de gua interagem entre si por meio de pontes de hidrognio. A natureza altamente coesiva da gua afeta as interaes entre as molculas em soluo aquosa.

A. Estrutura da gua A gua uma molcula dipolar formada por dois tomos de

hidrognio ligados a um tomo de oxignio. Cada tomo de

1 Introduo Bioqumica 3

hidrognio possui uma carga eltrica parcial positiva (+) e o tomo de oxignio, carga eltrica parcial negativa (). Assim, o compartilhamento dos eltrons entre H e O desigual, o que acarreta o surgimento de dois diplos eltricos na molcula de gua; um para cada ligao HO. O ngulo de ligao entre os hidrognios e o oxignio (HOH) 104,3, tornando a molcula eletricamente assimtrica e produzindo diplos eltricos (Figura 1.1). Ao se aproximarem, as molculas de gua interagem, pois a carga eltrica parcial positiva do hidrognio de uma molcula atrai a carga eltrica parcial negativa do oxignio de outra molcula de gua adjacente, resultando em uma atrao eletrosttica denominada ponte de hidrognio. Quatro molculas de gua podem interagir produzindo uma estrutura quase tetradrica estabilizada por pontes de hidrognio (Figura 1.1).

O

H

H

+

104.3

O

H

H

OH H

H

H

HO

H HO

+

B. Interaes no-covalentes

As interaes no-covalentes so geralmente eletrostticas; elas ocorrem entre o ncleo positivo de um tomo e a nuvem eletrnica de outro tomo adjacente. De modo diferente das ligaes covalentes, as interaes no-covalentes so individualmente fracas e facilmente rompidas (Tabela 1.1). No entanto, coletivamente elas influenciam de modo significativo as propriedades qumicas e fsicas da gua e as estruturas, propriedades e funes das biomolculas (protenas, polissacardeos, cidos nuclicos e lipdeos) pelo efeito cumulativo de muitas interaes. O grande nmero de interaes nocovalentes estabiliza macromolculas e estruturas supramoleculares, de tal modo que essas ligaes sejam rapidamente formadas ou rompidas permitindo a flexibilidade necessria para manter os processos dinmicos da vida. Nos organismos vivos, as interaes no-

Figura 1.1 Estrutura da molcula de gua. O ngulo de ligao H-O-H 104,30 e tanto os hidrognios como o oxignio possuem cargas eltricas parciais criando um dipolo eltrico. A parte inferior da figura mostra quatro molculas de gua interagindo para formar uma estrutura estabilizada por pontes de hidrognio.

4 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. covalentes mais importantes so: pontes de hidrognio, interaes inicas, interaes hidrofbicas e interaes de van der Waals.

Tabela 1.1 Energia de dissociao de ligao (energia necessria para romper a ligao) de ligaes encontradas nos seres vivos

Tipo de ligao Energia de dissociao de ligao (kJmol1)

Ligaes covalentes >210

Ligaes nocovalentes Interaes eletrostticas (ligaes inicas) 480 Pontes de hidrognio 1230 Interaes hidrofbicas 312 Foras de Van der Waals 0,39

C. Propriedades solventes da gua A natureza polar e a capacidade de formar pontes de hidrognio,

torna a gua uma molcula com grande poder de interao. A gua solvata facilmente as molculas polares ou inicas pelo enfraquecimento das interaes eletrostticas e das pontes de hidrognio entre as molculas competindo com elas por suas atraes (efeito hidroflico, do grego que gosta de gua).

OH

H

H

H

+

O+

H

H

H

H

H

H H

H

H

H

+

++

+

++

O

OO

O O

Figura 1.2 Solvatao de ons. A carga do on orienta os dipolos das molculas da gua.

A gua dissolve sais como o NaCl por hidratao e estabilizao dos ons Na+ e Cl, enfraquecendo as interaes eletrostticas, e assim impedindo a associao para formar uma rede cristalina.

1 Introduo Bioqumica 5

Figura 1.3 Dissoluo de sais cristalinos. A gua dissolve o NaCl (e outros sais cristalinos) por meio da hidratao dos ons Na+ e Cl. medida que as molculas de gua se agrupam ao redor dos ons Cl e Na+ a atrao eletrosttica necessria para a formao da rede cristalina de NaCl rompida.

A gua dissolve biomolculas com grupos ionizveis e muitas

com grupos funcionais polares, porm nocarregadas, por formar pontes de hidrognio com os solutos. Essas associaes so formadas entre a gua e os grupos carbonila, aldedico, cetnico e hidroxila dos lcoois.

As biomolculas ou grupamentos no-polares so insolveis em gua, pois as interaes entre as molculas de gua so mais fortes que as interaes da gua com compostos nopolares. Os compostos nopolares tendem a se aglomerar em gua (efeito hidrofbico, do grego que teme a gua). As interaes hidrofbicas so as principais foras propulsoras no enovelamento de macromolculas (exemplo, protenas).

D. Molculas anfiflicas

Um grande nmero de biomolculas, denominadas anfiflicas (ou anfipticas), contm tanto grupos polares como grupos no-polares. Essa propriedade afeta significativamente o meio aquoso. Por exemplo, os cidos graxos ionizados so molculas anfipticas porque contm grupos carboxilatos hidroflicos e grupos hidrocarbonetos hidrofbicos. Quando misturados com a gua, as molculas anfiflicas se agregam formando estruturas estveis chamadas micelas. Nas micelas, as regies carregadas (grupos carboxilatos), denominadas cabeas polares, so orientadas para a gua com a qual interage. A cauda hidrocarboneto no-polar tende a evitar o contato com a gua e orienta-se para o interior hidrofbico. A tendncia das biomolculas anfipticas espontaneamente se rearranjar em gua e uma caracterstica importante de numerosos componentes celulares. Por exemplo, a formao de bicamadas por molculas de fosfolipdeos a estrutura bsica das membranas biolgicas (Figura 1.4).

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Na Na

NaNa

Na

Na

Na

Na

Na

Na

Na+

Na

Na

6 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda.

Figura 1.4 Bicamada lipdica. Formada na gua por molculas anfiflicas (fosfolipdeos) com cabeas polares e caudas sinuosas.

E. Presso osmtica Osmose o processo espontneo no qual as molculas solventes

atravessam uma membrana semipermevel de uma soluo de menor concentrao de soluto para uma soluo de maior concentrao de soluto. Poros na membrana so suficientemente amplos para permitir que as molculas solventes atravessem nas duas direes mas muito estreitos para a passagem de grandes molculas de soluto ou ons. A presso osmtica a presso necessria para interromper o fluxo lquido de gua por meio da membrana. A presso osmtica depende da concentrao do soluto.

Figura 1.5 Presso osmtica. A gua difunde do lado A (mais diludo) para o lado B (mais concentrado). O equilbrio entre as solues nos dois lados da membrana semipermevel atingido quando no houver mais movimento de molculas de gua do lado A para o lado B. A presso osmtica interrompe o fluxo de gua por meio da membrana.

A presso osmtica cria alguns problemas crticos para os organismos vivos. As clulas contm altas concentraes de alguns solutos, que so pequenas molculas orgnicas e sais inicos, tambm como, macromolculas em baixas concentraes. Conseqentemente, as clulas podem ganhar ou perder gua devido a concentrao de

guaSoluto

Membranapermevel

seletiva

Membranapermevel

seletiva

Membranapermevel

seletiva

Hidrofbico

Hidroflico

Hidroflico

Aquoso

Aquoso

1 Introduo Bioqumica 7 soluto em relao ao seu meio. Se as clulas esto em soluo isotnica (a concentrao de soluto e gua a mesma nos dois lados da membrana plasmtica seletivamente permevel) e a clula nem ganha nem perde gua. Por exemplo, os eritrcitos so isotnicos em soluo de NaCl a 0,9%. Quando as clulas so colocadas em uma soluo com concentrao baixa de soluto (soluo hipotnica) a gua se move para o interior das clulas. Os eritrcitos, por exemplo, se distendem e se rompem em processo chamado hemlise quando eles so imersos em gua pura. Nas solues hipertnicas, aquelas com maior concentraes de soluto, as clulas murcham medida que a gua flui para a soluo. Por exemplo, em soluo hipertnica de NaCl a 3%, os eritrcitos murcham e tornem-se crenados.

Um aumento da osmolaridade no plasma, desencadeia rapidamente a sede, exigindo a ingesto de gua para diluir o Na+ e reajustar a osmolaridade para baixo.

F. Ionizao da gua Pequena proporo de molculas de gua se dissociam para

formar ons hidrognio (H+) e hidroxila (OH):

H2O ' H+ + OH Para cada mol de H+ , um mol de OH produzido. Devido a

elevada reatividade do on hidrognio (ou prton) e o momento dipolar da molcula de gua, o H+ no existe como tal em soluo aquosa, mas reage com uma segunda molcula de H2O para formar o on hidrnio (H3O+). O grau de ionizao descrito quantitativamente pela constante de dissociao (K):

[ ][ ][ ]OH

OHH

2

+=K

O valor da K para a gua 1,8 x 1016 a 25C. A concentrao da gua no dissociada pode ser considerada como uma constante (1000 g/18 g/mol = 55,5 M; ou seja, o nmero de gramas de gua em 1000 mL dividido pela molcula-grama da gua). Portanto, a quantidade ionizada de gua insignificante em relao a no ionizada. Substituindo os valores na equao anterior, tem-se:

[ ][ ] 16+ 108,155,5

OHHK

==

Desse modo, uma nova constante para a dissociao da gua pode ser definida, Kw, a constante do produto inico da gua:

Kw = Keq 55,5 = [H+][OH] Kw = (1,8 1016)(55,5) = 1,0 1014

Assim, a 25 C o valor de Kw dado por:

Kw = [H+][OH] = (107)(107) = 1014 Portanto, o valor numrico do produto [H+][OH] em solues

aquosas a 25C sempre 1,0 x 1014. Em gua pura [H+] = [OH]

8 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda.

tem o valor 1,0 x 107 M. Sempre existe equilbrio entre H2O, H+ e OH- em solues diludas, independentemente da presena de substncias dissolvidas. Ao adicionar qualquer substncia, como ocorre na adio de um cido ou uma base, alteraes concomitantes devem ocorrer nas concentraes do H+ ou OH, para satisfazer relao de equilbrio. Conhecendo-se a concentrao de um deles, facilmente calculado o teor do outro.

G. Escala de pH Para evitar o uso de exponenciais para expressar as concentraes

dos ons hidrognio em solues emprega-se a escala de pH, um modo conveniente para expressar a concentrao real de ons hidrognio de uma soluo. O pH de uma soluo definido como o logaritmo negativo base 10 da concentrao de ons hidrognio:

pH = log[H+]

Em uma soluo aquosa neutra a 25C, a concentrao do on hidrognio (como tambm a [OH]) 1,0 x 107 M ou pH = 7,0:

[H+] = 0,000.000.1 M = 1,0 x 107 M log [H+] = 7

pH = log[H+] = 7

Solues com pH menor do que 7 so cidas, enquanto aquelas com pH>7 so bsicas. A Tabela 1.2 mostra a relao entre a [H+], [OH], pH e pOH.

1 Introduo Bioqumica 9

Tabela 1.2 Relao entre [H+], [OH-], pH e pOH.

[H+] (M) pH [OH] (M) pOH 1,0 0 1 x 1014 14

0,1(1 x 101) 1 1 x 1013 13

1 x 102 2 1 x 1012 12

1 x 103 3 1 x 1011 11

1 x 104 4 1 x 1010 10

1 x 105 5 1 x 109 9

1 x 106 6 1 x 108 8

1 x 107 7 1 x 107 7

1 x 108 8 1 x 106 6

1 x 109 9 1 x 105 5

1 x 1010 10 1 x 104 4

1 x 1011 11 1 x 103 3

1 x 1012 12 1 x 102 2

1 x 1013 13 0,1(1 x 101) 1

1 x 1014 14 1,0 0

importante frisar que o pH varia na razo inversa da concentrao de H+. Desse modo, o aumento de [H+] reduz o pH enquanto a diminuio, o eleva. Notar tambm, que o pH uma funo logartmica, portanto, quando o pH de uma soluo aumenta de 3 para 4, a concentrao de H+ diminui 10 vezes de 103 M a 104 M.

Exerccio 1.1

Como a gua pura tem [H+] = 107 M, calcular o pH das seguintes solues: 1. HCl 104 M 2. NaOH 105 M

A auto-ionizao da gua apresenta uma contribuio negligencivel para as concentraes de ons hidrnio e ons hidrxido.

Soluo:

1. Para o HCl 104: [H3O+] = 104 M; portanto pH = 4. 2. Para o NaOH 105: [OH] = 105 M. Como [OH][H3O+] = 1 x 1014,

ento, [H3O+] = 109 M; assim, pH = 9

Os pH de diferentes lquidos biolgicos so mostrados na Tabela 1.3. Em pH 7 o on H+ est na concentrao 0,000.000.1 M (1 x 107), enquanto a concentrao de outros catons esto entre 0,001 e 0,10 M. Um aumento no teor de on H+ de somente 0,000.001 (1 x 106) tem um grande efeito deletrio sobre as atividades celulares.

10 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda.

Tabela 1.3 Valores de pH de alguns lquidos biolgicos.

Lquido pH

Plasma sangneo 7,4 Lquido intersticial 7,4 Lquido intracelular (citosol heptico) 6,9 Suco gstrico 1,53,0 Suco pancretico 7,88,0 Leite humano 7,4 Saliva 6,47,0 Urina 4,58,0

1.3 cidos e bases

A concentrao do on hidrognio, [H+], afeta a maioria dos processos nos sistemas biolgicos. As definies de cidos e bases propostas por Bronsted e Lowry so as mais convenientes no estudo das reaes dos seres vivos:

cidos so substncias que podem doar prtons. Bases so substncias que podem aceitar prtons.

Por exemplo, a adio de cido clordrico (HCl) a uma amostra de gua aumenta a concentrao de on hidrognio ([H+] ou [H3O+]) pois o HCl doa um prton para a gua:

HCl + H2O H3O+ + Cl A H2O atua como uma base que aceita um prton do cido

adicionado. Do mesmo modo, a adio da base hidrxido de sdio (NaOH)

aumenta o pH (reduo da [H+]) pela introduo de ons hidrxido que combinam com os ons hidrognios existentes:

NaOH + H3O+ Na+ + 2H2O

Na reao, o H3O+ o cido que doa um prton para a base adicionada. O pH final da soluo depende o quanto de H+ (por exemplo, do HCl) foi adicionado ou quanto de H+ foi removido da soluo por sua reao com uma base (por exemplo, on OH- do NaOH).

1 Introduo Bioqumica 11

Quadro 1.1 Fora de cidos

A fora de um cido ou base refere-se a eficincia com que o cido doa prtons ou a base aceita prtons. Com respeito a fora, existem duas classes de cidos e bases: fortes e fracos. cidos e bases fortes so aqueles que se dissociam quase completamente em meio aquoso diludo (Ex.: HCl ou NaOH). cidos e bases fracos so os que dissociam parcialmente em solues aquosas diludas (Ex.: CH3-COOH ou NH3).

A tendncia de um cido fraco no-dissociado (HA) para perder um prton e formar a sua base conjugada (A) dada pela equao:

HA ' H+ + A Esta reao no ocorre at o final, mas, atinge

um ponto de equilbrio entre 0 e 100% da reao.

No equilbrio, a velocidade lquida zero pois as velocidades absolutas em ambas as direes so exatamente iguais. Tal posio descrita pela equao:

[ ]HAAH

=+

K

em que K a constante de equilbrio da reao reversvel e tem um valor fixo para cada temperatura. As K para as reaes de ionizao so denominadas constantes de dissociao ou de ionizao.

Para os cidos usada a designao Ka. Os cidos fortes tem valor de Ka elevado, pois apresentam maior nmero de prtons liberados por mol de cido em soluo.

A. Pares cido-base conjugados Quando um cido fraco, como o cido actico, dissolvido em

gua, obtm-se uma dissociao parcial, estabelecendo um equilbrio entre o cido, o acetato e o on hidrognio (prton):

CH3COOH + H2O ' CH3COO + H3O+ cido Base Base cido conjugado conjugada conjugada conjugado

O cido actico um cido conjugado (doador de prtons). A forma ionizada do cido actico, o on acetato (CH3COO) denominada base conjugada (aceptora de prtons) ou sal. Em reaes deste tipo, tpicas de todos os equilbrios cido-base, o cido fraco (CH3COOH) e a base formada na sua dissociao (CH3COO) constituem um par cido-base conjugado.

Tabela 1.4 Alguns pares cido-base conjugados de importncia nos sistemas biolgicos.

Doador de prtons Aceptor de prtons

CH3CHOHCOOH ' H+ + CH3CHOHCOO CH3COCOOH ' H+ + CH3COCOO HOOCCH2CH2COOH ' 2H+ + -OOCCH2CH2COO +NH3CH2COOH ' H+ + +NH3CH2COO

A constante de equilbrio para a dissociao do cido actico :

[ ] [ ][ ] [ ]OHCOOHCH

OHCOOCH

23

33

=

+K

12 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. Como a concentrao da gua (55,5 M) pouco alterada pela

constante de dissociao cida, Ka: [ ] [ ][ ]COOHCH

HCOOCH

3

3

=

+aK

O valor de Ka para o cido actico 1,74 x 105. A tendncia de um cido conjugado em dissociar especificada

pelo valor de Ka; em valores baixos, a tendncia em liberar prtons pequena (menos cido se dissocia), em valores elevados maior a tendncia em liberar prtons (mais cido se dissocia). As constantes de dissociao so mais facilmente expressas em termos de pKa, que definido como:

pKa = log Ka

ou seja, o pKa de um cido o logaritmo negativo da constante de dissociao do mesmo. Para o cido actico,

pKa = log (1,74 x 105) = 4,76 A relao entre pKa e Ka inversa; o menor valor de Ka fornece o

maior pKa. Os valores de Ka e pKa de alguns cidos so mostrados na Tabela 1.4. A gua considerada um cido muito fraco com pKa = 14 a 25C.

Tabela 1.5 Constantes de dissociao e pKa de alguns cidos fracos importantes em bioqumica (a 25C). cido Ka, M pKa

cido actico (CH3COOH) 1,74 x 105 4,76 cido lctico (CH3CHOHCOOH) 1,38 x 104 3,86 cido pirvico (CH3COCOOH) 3,16 x 103 2,50 Glicose6PO3H 7,76 x 107 6,11 cido fosfrico (H3PO4) 1,1 x 102 2,0 on diidrogenofosfato ( )H PO2 4- 2,0 x 107 6,8 on hidrogenofosfato ( )HPO42- 3,4 x 1013 12,5 cido carbnico ( )H CO2 3 1,70 x 104 3,77 on amnio ( )NH4+ 5,62 x 1010 9,25

B. Equao de Henderson-Hasselbalch O pH de uma soluo contendo uma mistura de cido fraco com

sua base conjugada pode ser calculado pela equao de Henderson-Hasselbach. Para a dissociao do cido fraco (HA ' H+ + A) a equao pode ser derivada tomando-se o logaritmo negativo dos dois lados da equao Ka:

[ ][ ][ ]HA

AHa

+=K

1 Introduo Bioqumica 13 Por rearranjo

[ ] [ ][ ]+ = HHAH aK Pode-se expressar [H+] como log[H+] e Ka como log Ka e obter-se

[ ] [ ][ ]HAAloglogHlog a + += K e empregando as definies de pH e pKa

[ ][ ]HAAlogppH a

+= K

ou escrita de forma genrica:

[ ][ ]conjugado cidoconjugada BaselogKppH 10'a += Esta equao apresenta um modo conveniente para o estudo do

inter-relacionamento do pH de uma soluo, o pKa do cido fraco e as quantidades relativas de cido conjugado e base conjugada presentes. Nos casos onde a concentrao molar de cido conjugado igual a da base conjugada ([HA] = [A]), a relao [A]/[HA] igual 1. Como o logaritmo de 1 zero o pH da soluo igual ao valor do pKa do cido fraco.

Exerccio 1.2 Calcular a quantidade relativa de cido actico e de on acetato presente quando 1 mol de cido actico titulado com 0,3 mol de hidrxido de sdio. Calcular tambm o valor do pH da soluo final.

Soluo: Ao adicionar 0,3 mol de NaOH, 0,3 mol de cido actico reage para formar 0,3 mol de on acetato, deixando 0,7 mol de cido actico. A composio 70% de cido actico e 30% de on acetato.

[ ][ ]actico cidoAcetatologpKpH a +=

4,390,70,3log4,75pH =+=

1.4 Tampes e tamponamento

A regulao do pH nos lquidos biolgicos atividade essencial dos organismos vivos. Mesmo pequenas mudanas na concentrao do on hidrognio podem afetar grandemente as estruturas e as funes das biomolculas. A concentrao do H+ mantida relativamente constante por meio de solues-tampes que resistem a

14 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. alteraes bruscas de pH quando adicionadas quantidades relativamente pequenas de cido (H+) ou base (OH). So formados por cidos fracos e suas bases conjugadas.

Quando um cido forte como o HCl adicionado a gua pura, todo o cido adicionado contribui diretamente para a reduo do pH. No entanto, quando o HCl adicionado a uma soluo contendo um cido fraco em equilbrio com sua base conjugada (A), o pH no altera to dramaticamente, pois parte dos prtons adicionados combinam com a base conjugada para amenizar o aumento da [H+] (Figura 1.6).

HCl H+ + Cl grande aumento da [H+]

HCl + A HA + Cl pequeno aumento da [H+]

Quando uma base forte (como o NaOH) adicionada a gua pura ocorre grande reduo da [H+]. Se a base for adicionada a uma cido fraco em equilbrio com sua base conjugada (A), parte dos ons hidrxidos aceitam prtons do cido para formar H2O e, portanto, no contribuem para a reduo do [H+].

NaOH Na+ + OH grande reduo da [H+]

NaOH + HA Na+ + A + H2O pequena reduo da [H+]

O sistema cido fraco/base conjugada (HA/A) atua como tampo para evitar mudanas bruscas do pH quando so adicionados cidos ou bases a soluo.

Figura 1.6 Capacidade tamponante do par cido fraco (HA) e sua base conjugada (A). O sistema capaz de absorver tanto H+ como OH por meio da reversibilidade da dissociao do cido. O doador de prtons (cido fraco), contm uma reserva de H+ ligado que pode ser liberada para neutralizar a adio de OH ao sistema resultando na formao de gua. De forma semelhante, a base conjugada (A-), pode reagir com os ons H+ adicionados ao sistema. Assim, o par cidobase conjugado resiste s variaes de pH quando quantidades relativamente pequenas de cido ou base so adicionadas soluo.

A resistncia a mudanas no pH de um tampo depende de dois fatores: (a) a concentrao molar do cido fraco e sua base conjugada e (b) a relao entre suas concentraes.

pH

Equivalentes de OH

9

8

7

6

5

4

3

2

4

4

4

4

4

4

4

pH = pK

Ao tampo

HA

A

[HA] = [A ]

HA A

H+

OH H O2

1 Introduo Bioqumica 15

Exerccio 1.3 Calcular o valor do pH obtido quando 1,0 mL de HCl 0,1 M adicionado a 99 mL de gua pura. Calcular tambm o pH aps a adio de 1,0 mL de NaOH 0,1 M a 99 mL de gua pura. (Levar em conta a diluio tanto do cido como da base ao volume final de 100 mL)

Soluo:

Sobre a diluio, tem-se 100 mL de HCl 0,001 M e 100 mL de NaOH 0,001 M.

cido adicionado, [H3O+] = 10-3, portanto, pH = 3.

Base adicionada,

[0H-] = 10-3 M.

Como [OH-][H3O+] = 1 x 10-14, [H3O+] = 10-11 M; portanto, pH = 11

A capacidade tamponante mxima de um cido quando o pH = pKa do cido fraco, ou seja, quando a as concentraes molares do cido fraco (HA) e sua base conjugada (H) so iguais. Na realidade, a capacidade tamponante considervel mesmo dentro de uma faixa de 1,0 unidade de pH do valor de seu pKa. Fora destes limites a ao tamponante mnima. Esse fato est representado na curva de titulao do cido actico (Figura 1.7). Para o par cido actico/acetato (pKa = 4,76) o tamponamento efetivo situa-se entre pH 3,76 e 5,76.

Figura 1.7

Curva de titulao do cido actico por uma base (OH). No ponto inicial (antes da adio da base), o cido est presente na forma CH3COOH. A adio de base dissocia prtons at atingir o ponto mdio da titulao onde o pH = pK, as concentraes do cido (CH3COOH) e de sua base conjugada (CH3-COO

) so iguais. A adio de mais base dissocia mais prtons at que todo o cido atinja a forma CH3COO

- (ponto final). Na regio de tamponamento efetivo (PK 1), adies de cidos ou bases no alteram grandemente o pH da soluo.

A. cidos fracos com mais de um grupo ionizvel Algumas molculas contm mais de um grupo ionizvel. O cido

fosfrico (H3PO4) um cido fraco poliprtico pode doar trs ons

pH

Equivalentes de OH

9

8

7

6

5

4

3

2

-

pH = 4,76 = p K

pH = p + 1K

pH = p - 1K

16 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. hidrognio. Durante a titulao com NaOH as ionizaes ocorrem em etapas com a liberao de um prton por vez:

+=+=+= + + + 3338,12pK2482,6pK4215,2pK43 POHHPOHPOHHPOH 321

Os valores de pK1, pK2 e pK3 representam os pKa de cada grupo ionizado (Figura 1.8).

Figura 1.8 Curva de titulao do cido fosfrico (poliprtico). O cido fosfrico possui pK mltiplos, um para cada etapa da titulao.

B. Tampes fisiolgicos Os trs tampes mais importantes no corpo humano so: tampo

bicarbonato, o tampo fosfato e o tampo protico. Cada um est adaptado para solucionar problemas fisiolgicos especficos do organismo.

1. Tampo bicarbonato. Um caso especial de sistema tampo de grande importncia nos mamferos o bicarbonato/cido carbnico. O dixido de carbono reage com a gua para formar cido carbnico:

CO2 + H2O ' H2CO3 O cido carbnico rapidamente se dissocia para formar ons H+ e

HCO+:

H2CO3 ' H+ + HCO3 Como a concentrao do H2CO3 muito baixa no sangue, as

equaes acima podem ser simplificadas a:

CO2 + H2O ' H+ + HCO3

pH

Quantidade de base (equivalentes)

14

13121110

987654

3

2

1

5

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

pH = 2,15 = p K1

pH = 6,82 = p K2

pH = 12,38 = p K3

H PO

PO

3

3

4

H PO2 4-

HPO42-

3-

1 Introduo Bioqumica 17 O H2CO3 um cido relativamente fraco (pKa = 6,37) e,

consequentemente, um tampo ineficaz no sangue. A relao do HCO3/CO2 necessria para manter o pH = 7,4 (normal no sangue) aproximadamente 11 para 1. Em outras palavras, o tampo bicarbonato atua no sangue quase no limite de seu poder tamponante. Alm disso, as concentraes de CO2 e HCO3 no so excepcionalmente altas. Apesar dessas dificuldades, o sistema tamponante do bicarbonato importante, pois os dois compontes podem ser regulados. O dixido de carbono ajustado por alteraes na velocidade da respirao. Enquanto, o teor de bicarbonato regulado pelos rins.

O dixido de carbono fisicamente dissolvido est em constante equilbrio com o cido carbnico e tambm com o CO2 alveolar. Alteraes em qualquer dos componentes na fase aquosa, provocam modificaes no equilbrio; por exemplo, o aumento do CO2 eleva o H2CO3, que desvia o equilbrio da reao de dissociao aumentando

o H+. Assim, o CO2 considerado parte do cido conjugado e participa do componente cido da equao:

[ ][ ][ ][ ]232

3a COCOH

HCOH +=K

Com a incluso do CO2 o valor de pKa 6,1. A quantidade de H2CO3 no-dissociado menor que 1/700 do contedo de CO2 e, normalmente, desprezada. uma prtica comum referir-se ao CO2 dissolvido como o cido conjugado. Existe uma relao direta entre o pH do sangue e a presso do gs dixido de carbono nos pulmes.

Embora o pKa para o sistema HCO3/CO2 seja 1,3 unidades de pH

menor do que o pH extracelular normal de 7,40, este sistema tampona extremamente bem, porque o CO2 pode ser regulado por alteraes da ventilao alveolar.

2. Tampo fosfato. Consiste de um cido fraco/base conjugada H2PO4/HPO42 (diidrogeno fosfato/hidrogeno fosfato):

H2PO4 ' H+ + HPO42 Com pKa 7,2, poderia parecer que o tampo fosfato uma escolha

excelente para o tamponamento sangneo. No entanto, as concentraes do H2PO4 e HPO42 no sangue so muito baixas para exercer atividade significante. Por outro lado, o sistema fosfato fundamental para o tamponamento dos lquidos intracelulares onde suas concentraes so de, aproximadamente, 75 mEq/L. Os nveis de fosfato nos lquidos extracelulares como o sangue est ao redor de 4 mEq/L. Como o pH normal dos lquidos extracelulares cerca de 7,2 (o intervalo de 6,9 a 7,4) uma mistura equimolecular de H2PO4 e HPO42 est presente. Apesar das clulas conterem outros cidos, eles so de pouca importncia pois seus valores de pKa so baixos para o pH intracelular. Por exemplo, o cido lctico tem um pKa de 3,86.

3. Tampo de protenas. As protenas apresentam uma grande capacidade tamponante. Composta de aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas, as protenas contm vrios grupos ionizveis nas cadeias laterais que podem doar ou aceitar prtons. Como as molculas de protenas esto presentes em significantes

18 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. concentraes nos organismos vivos, elas so tampes poderosos. Por exemplo, a hemoglobina a mais abundante biomolcula nas clulas sangneas e exerce um importante papel na manuteno do pH no sangue. Tambm presentes em altas concentraes e auxiliares na manuteno do pH so a albumina e outras protenas sricas.

1.5 Biomolculas

Os organismos vivos so compostos por milhares de molculas inorgnicas e orgnicas diferentes. Contm cerca de 27 elementos qumicos. O nmero real depende do tipo de clula e a espcie de organismo. Acima de 99% da massa da maioria das clulas, so compostas por oito elementos denominados elementos principais. Os outros constituintes so elementos secundrios (Quadro 1.1). A grande maioria dos constituintes moleculares dos sistemas vivos contm carbonos ligados covalentemente a outros carbonos e a tomos de hidrognio, oxignio e nitrognio.

A. Carbono O carbono (nmero atmico 6, peso atmico 12) um tomo

pequeno que tem quatro eltrons em seu orbital eletrnico externo que permite participar no compartilhamento com outros quatro tomos. Os eltrons externos do carbono esto arranjados ao redor do ncleo como um tetraedro, uma pirmide com faces triangulares.

Uma das mais importantes propriedades do tomo de carbono sua capacidade para formar ligaes covalentes com outros tomos de carbono e com tomos de hidrognio, oxignio, nitrognio e enxofre para formar cadeias ou anis das macromolculas. As propriedades de ligao do carbono permitem a produo de inmeras molculas. As ligaes necessitam energia, exemplo: a ligao C-H requer 414 kJmol1; a ligao C-C 343 kJmol1; a ligao C-O 351 kJmol1; a ligao C=C 615 kJmol1 e a ligao C=O 686 kJmol1.

As ligaes simples carbono-carbono podem girar livremente a menos que estejam restritos por grupos muito grandes ou cargas eltricas. A rotao permite a uma molcula orgnica assumir diferentes formas chamadas conformaes. As ligaes duplas carbono-carbono:

So mais curtas que as ligaes simples. Apresentam rotao limitada. So mais rgidas, (propriedade importante em grandes

molculas).

Variam o ngulo entre dois eltrons, afetando a conformao da molcula. Isto tem um grande impacto sobre a atividade biolgica da molcula, que muitas vezes envolve uma interao que depende da conformao de outras molculas.

As cadeias e anis podem apresentar diferentes arranjos em suas ligaes que se alternam dando origem a um sistema de ligao conjugada. Os eltrons da ligao movem-se no interior da molcula aumentando a estabilidade da estrutura. Esse fenmeno chamado estabilizao por ressonncia.

1 Introduo Bioqumica 19

Quadro 1.2 Talidomida

Durante o perodo entre 1957 e 1961, aproximadamente 10.000 pessoas em todo o mundo nasceram com membros deformados ou inexistentes aps as mes terem ingerido a droga talidomida, um sedativo para tratar enjos e nuseas durante a gravidez.

A talidomida pode existir em duas formas enanciomricas. Animais tratados com a R(+)talidomida produziam neonatos normais enquanto aquelas que recebiam o enancimero S() produziam nascituros deformados.

A talidomida prescrita para humanos era formada por uma mistura racmica (mistura que contm quantidades iguais de cada enancimero).

Somente em 1995 foi comprovada que em humanos h uma rpida interconverso entre os dois enancimeros. O equilbrio estabelecido entre as duas formas no sangue, independente de qual enancimero foi empregado inicialmente. Isso sugere que, mesmo utilizando a forma pura r(+)talidomida, os defeitos de nascimento em seres humanos seriam os mesmos.

De modo simplificado, consideram-se as molculas biolgicas

como esqueletos de tomos de carbono ligados covalentemente entre si para formar cadeias longas, lineares ou ramificadas ou, ainda, estruturas cclicas. Os tomos de hidrognio que esto ligados aos tomos de carbono podem ser substitudos por N, O e S para formar uma grande variedade de grupos funcionais, tais como: aminas, aldedos, lcoois e sulfidrilas. Isso confere uma grande variedade de propriedades qumicas especficas encontradas nas molculas e que determinam as suas funes biolgicas especficas. As molculas biolgicas muitas vezes contm mais que um grupo funcional e so denominadas polifuncionais. Por exemplo, os aminocidos contm grupos aminos e grupos carboxlicos.

Tabela 1.6 Elementos encontrados nas clulas

Elementos principais Oligoelementos

Elemento Smbolo Elemento Smbolo

Carbono C Arsnico As Hidrognio H Boro B Nitrognio N Cloro Cl Oxignio O Cromo Cr Fsforo P Fluor F Enxofre S Iodo I Clcio Ca Ferro Fe Potssio K Magnsio Mg

Mangans Mn Molibdnio Mo Nquel Ni Selnio Se Silicnio Si Sdio Na Estanho Sn Vandio V Zinco Zn

20 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. B. Estrutura tridimensional

Os compostos de carbono cujas composies so idnticas, mas as relaes espaciais entre os tomos so diferentes, so denominados estereoismeros. O tomo de carbono ligado a quatro substituintes diferentes chamado assimtrico. Carbonos assimtricos so centros quirais indicando que os estereoismeros podem ocorrer em formas orientadas direita ou esquerda. Os estereoismeros so imagens especulares um do outro e nosuperponveis e so chamados molculas quirais. Alguns estereoismeros so enancimeros e apresentam atividade ptica, ou seja, giram a luz plano-polarizada para a direita (dextrgiro) ou para a esquerda (levgiro). Uma mistura equimolar de dois enancimeros opticamente inativa (mistura racmica).

As posies dos tomos ou grupos ao redor de um tomo de carbono quiral no esto relacionados com a direo do desvio da luz plano-polarizada de uma maneira simples. Emil Fisher em 1891, arbitrria e corretamente, designou uma das estruturas do gliceraldedo e chamou de D-gliceraldedo. O ismero levorrotatrio foi chamado L-gliceraldedo. Atualmente, o gliceraldedo permanece como base da configurao estereoqumica das molculas biolgicas. Estereoismeros de todas as molculas quirais tem configuraes estruturais relacionadas com um dos gliceraldedos e so designadas D ou L independente de sua atividade ptica. A atividade ptica indicada por (+) para dextrorrotatrio e () para levrrotatrio.

Os centros quirais so de grande importncia biolgica pois muitas molculas so seletivas quanto a quiralidade, por exemplo, virtualmente todas as protenas e polissacardios dos organismos superiores so compostos por Laminocidos e Dmonossacardeos, respectivamente. Essa seletividade promove estabilidade adicional s molculas polimricas.

C. Macromolculas As macromolculas so construdas pela unio qumica de

precursores relativamente simples (subunidades monomricas) para formar polmeros de unidades repetidas. Todos os organismos vivos tm os mesmos tipos de subunidades monomricas que alm da formao de macromolculas exercem, tambm, vrias funes biolgicas. As ligaes especficas para cada tipo de macromolcula, so formadas por reaes de condensao com perda de gua, em processos que requerem o fornecimento de energia.

1 Introduo Bioqumica 21

Figura 1.9 As macromolculas so formadas a partir unidades monomricas. As macromolculas intracelulares so polmeros de elevada massa molecular formadas com precursores relativamente simples.

O tamanho de uma molcula dado em termos de massa molecular. A unidade de massa empregada o dalton (D) (1000 D = 1 kilodalton = kD) onde 1 D definido como 1/12 da massa do tomo de 12C.

As quatro principais classes de molculas biolgicas so:

1. Protenas ou polipeptdeos. So longos polmeros formados por vinte diferentes aminocidos. Apresentam elevada massa molecular que variam de centenas a milhes de daltons. Atuam como elementos estruturais, catalisadores (enzimas), anticorpos, transportadores, hormnios, reguladores gnicos, toxinas, etc.

2. Carboidratos. So polmeros de acares simples, como a glicose, com elevadas massas moleculares. Liberam e armazenam energia e tambm so elementos estruturais extracelulares.

3. Lipdeos. So formados por molculas relativamente pequenas (ao redor de 300-1.500 D) que podem se associar para constituir grandes molculas que servem, principalmente, como componentes estruturais das membranas, como forma de armazenamento de energia e outras funes (hormnios esterides, vitaminas, proteo, material isolante).

Unidades monomricas

Reao decondensao -( -1)H On

Onde = nmero deunidades monomricas

n

Ligaes covalentesPolmero

2

22 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda.

Quadro 1.3 Sistema RS

O sistema RS de nomenclatura para a configurao estereoqumica foi desenvolvido em 1956 para superar o principal problema associado com a nomenclatura DL, que pode ser ambiga para compostos com mltiplos centros quirais. O sistema RS compara os quatro tomos ou grupos ligados ao tomo de carbono tetradrico (centro quiral). Cada grupo ligado ao centro quiral tem uma prioridade. As prioridades so: SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > CH3 > H. A configurao do centro quiral visualizada com o grupo de menor prioridade orientado para longe do observador, exemplo, o H no gliceraldedo.

Se a ordem dos outros trs grupos diminui na direo horria, a configurao ser considerada R (do latim, rectus, direita). Se a ordem for no sentido anti-horrio, a configurao ser considerada S (do latim, sinistrus, esquerda). Desse modo, o Rgliceraldedo sinnimo de Dgliceraldedo. O sistema RS descreve sem ambigidades a configurao estereoqumica de compostos contendo vrios centros quirais, exemplo, (2S, 3R) treonina.

4. cidos nuclicos (DNA e RNA). So polmeros formados por nucleotdeos. Armazenam, transmitem e transcrevem a informao gentica. So componentes das organelas celulares.

Na Quadro 1.2 esto destacadas algumas caractersticas da construo das macromolculas. Como exemplo, os carboidratos polimricos so constitudos por monossacardeos unidos por ligaes glicosdicas para formar oligossacardeos (2 a 10 unidades) ou polissacardeos (mais de 10 unidades). Os oligossacardeos so descritos como dissacardeos, trissacardeos ou tetrassacardeos e assim por diante, de acordo com o nmero de unidades monomricas. Nomenclatura similar empregada para as protenas e cidos nuclicos. A maioria das macromolculas contm uma ou poucas unidades monomricas diferentes, por exemplo, o glicognio formado por uma nica unidade monomrica, denominada glicose; o cido desoxirribonuclico (DNA) contm somente quatro diferentes nucleotdios.

A forma precisa de uma estrutura polimrica conferida pela natureza das ligaes covalentes e das ligaes no-covalentes. As trs ligaes no-covalentes fundamentais so: pontes de hidrognio, interaes eletrostticas e foras de van der Waals. Elas diferem quanto geometria, fora e especificidade. Alm disso, essas ligaes so grandemente afetadas pela presena da gua. As ligaes no-covalentes podem ocorrer entre tomos ou grupos funcionais na mesma cadeia ou entre cadeias adjacentes. A estrutura polimrica pode ser degradada em suas unidades monomricas por hidrlise pela adio de gua aos grupos que esto envolvidos nas ligaes covalentes. Nos sistemas biolgicos isto conseguido pela ao catalisadora de enzimas.

As classes de macromolculas biolgicas no so mutuamente exclusivas e podem interagir para produzir molculas hbridas ou conjugadas. Por exemplo, as protenas e os carboidratos formam proteoglicanos ou glicoprotenas. Os proteoglicanos so fundamentalmente constitudos por polissacardios (95% da massa da macromolcula) unidos entre si por ligaes covalentes e no-covalentes s protenas. As glicoprotenas contm pequenas quantidades de carboidratos ligados s cadeias polipeptdicas por ligaes covalentes.

Molculas hbridas como os glicolipdeos, lipoprotenas e nucleoprotenas tambm esto presentes nos organismos vivos.

1 Introduo Bioqumica 23

Quadro 1.2 Comparao das classes de macromolculas

Caractersticas Carboidratos Protenas cidos nuclicos

Unidades monomricas Monossacardeos Aminocidos Nucleotdeos

Ligao covalente formada por reao de condensao Glicosdica Peptdica Fosfodister

Nomenclatura de unidades mltiplas:

2-10 unidades Oligossacardeos Olipeptdeos Oligonucleotdeos

>10 unidades Polissacardeos Polipetdeos Polinucleotdeos

Ocorrncia de pontes de hidrognio Intra e intermolecular Intra e intermolecular Intra e intermolecular

Enzima hidroltica Glicosidases Peptidases Nucleases

Finalmente, deve-se notar que a atividade biolgica no est

confinada a unidades monomricas, ou grandes cadeias polimricas ou ainda, a molculas conjugadas. Existem muitos exemplos de oligmeros biologicamente ativos, como por exemplo, o glutationa (um tripeptdeo) que atua na manuteno da integridade das membranas.

1.1 Clulas: a unidade bsica da vida

As clulas so as unidades estruturais e funcionais de todos os organismos vivos. Elas diferem amplamente em suas estruturas e funes, mas todas so circundadas por uma membrana que controla a troca de substncias para o interior e para o exterior da clula.

As clulas so classificadas de acordo com seu tamanho e complexidade em uma das duas categorias:

Procariticas (do grego pro, antes), nas quais, o material gentico no est delimitado em um envelope nuclear. No possuem ncleo ou estruturas internas delimitadas por membrana. A sua estrutura mantida pela parede celular. So organismos unicelulares que podem existir em associao, formando colnias de clulas independentes.

Eucariticas (do grego eu, verdadeiro, e karyon, ncleo), contm o material gentico organizado em cromossomos dentro de um envelope nuclear. So organismos complexos e podem ser unicelulares ou multicelulares. As clulas eucariticas possuem vrias organelas limitadas por membranas no seu citoplasma, tais como, lisossomos, peroxissomos, mitocndrias, retculo endoplasmtico e aparelho de Golgi (Quadro 1.1).

24 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda.

Quadro 1.4 Clula

A palavra clula foi introduzida na biologia em 1665 por Robert Hooke em sua coleo de desenhos microscpicos, chamados Micrographia, que inclui uma fina fatia de cortia. Ele registrou a estrutura de favos vazios da cortia e denominou os compartimentos de clulas em analogia a cela de uma priso ou mosteiro. O termo, atualmente, no empregado para descrever o compartimento vazio mas o contedo vivo existente entre estas paredes celulares. Hoje, a clula pode ser definida como a mais simples unidade integrada nos sistemas vivos capazes de sobreviver independentemente.

No incio do sculo 19, as clulas foram reconhecidas como formas vivas e como pertencentes a organismos multicelulares mais complexos. Em 1839, Theodor Schwann, um zoologista, publicou o Mikroskopische Untersuchungen, que contm figuras desenhadas por Mathias Schleiden, um botnico, que registrou semelhanas entre as clulas vegetais e animais. Vinte anos aps, Rudolf Virchow anunciou omnis cellula et cellula, i.e. todas as clulas so provenientes de outras clulas.

O metabolismo celular compartimentalizado para organizar as diferentes vias metablicas como a sntese e degradao, em diversos compartimentos, para que operem independentemente. Algumas funes em diferentes organelas so mostradas no Quadro 1.3.

Quadro 1.3 Resumo das funes das organelas

Organela Funo

Ncleo Envolvido com uma membrana nuclear. Localizao do DNA e protenas (histonas); stio da sntese da maior parte do DNA e do RNA.

Mitocndria Corpos separados constitudos por membranas altamente convolutas. Stio de reaes de oxidao produtoras de energia; possui o seu prprio DNA. Parte do sistema sinttico: biossntese e metabolismo energtico.

Retculo endoplasmtico Membrana citoplasmtica contnua com as membranas nuclear e plasmtica; parte rugosa apresenta com ribossomos ligados

Complexo de Golgi Srie de membranas achatadas; envolvido na secreo de protenas pela clula e em reaes que ligam acares e outros componentes celulares.

Lisossomos Vesculas envolvidas por membranas contendo vrios tipos de enzimas hidrolticas. Parte do sistema sinttico (digestivo); hidrlise do material estranho, lise de clulas mortas.

Peroxissomos Vesculas que contm enzimas envolvidas no metabolismo do perxido de hidrognio.

Ribossomos Compostos de partculas nucleoproticas (RNA e protenas). Stios da sntese protica.

Membrana plasmtica uma camada semipermevel contnua ao redor do citoplasma que separa o seu contedo da circunvizinhana. Contm transportadores e receptores. Regula a troca com o meio.

1 Introduo Bioqumica 25 Com base na comparao de molculas de RNA, Carl Woese

agrupou todos os organismos em trs grupos fundamentais chamados domnios: Eukarya (eucariontes), Bacteria (anteriormente Eubacteria) e Archaea (anteriormente Archaebacteria). A Eukaria compreende todos os organismos macroscpicos, incluindo os seres humanos tambm como muitos organismos microscpicos unicelulares como os fungos. Os dois domnios, Bacteria e Archaea, consistem de procariontes.

Figura 1.10 rvore filogentica de classificao dos trs domnios. O domnio Eukaria consiste de eucariotos. Os dois domnios, Bacteria e Eukarya, consistem de procariotos. Na evoluo, os trs domnios possuem um ancestral comum.

Resumo 1. A bioqumica o estudo das estruturas moleculares, dos mecanismos e

dos processos qumicos responsveis pela vida. Os organismos vivos so mantidos por sua capacidade de obter, transformar, armazenar e utilizar energia.

2. A gua contribui com 5090% do peso de uma clula. As molculas de gua so constitudas por dois tomos de hidrognio e um de oxignio. Cada tomo de hidrognio est ligado ao tomo de hidrognio por uma ligao covalente simples. As ligaes oxignio-hidrognio so polares e as molculas de gua so dipolos. As molculas de gua podem formar pontes de hidrognio entre o oxignio de uma molcula e o hidrognio de outra molcula.

3. As ligaes no-covalentes so relativamente fracas e facilmente rompidas. Exercem papel fundamental na determinao das propriedades fsicas e qumicas da gua e de biomolculas. Interaes inicas ocorrem entre tomos e grupos carregados. O grande nmero de pontes de hidrognio exerce considervel efeito nas molculas envolvidas.

4. Os pontos de ebulio e fuso da gua so excepcionalmente elevados quando comparados com compostos de estrutura e peso molecular semelhante. As pontes de hidrognio so responsveis por esse comportamento anmalo.

Esch

eric

hia

Salm

onel

la

Baci

llus

Hom

o

Sacc

haro

myc

es

Zea

Met

hano

cucc

us

Arc

haeo

glob

us

Hal

obac

teriu

m

Bacteria Eukarya Archaea

Ancestralcomum

26 Motta Bioqumica Laboratrio Autolab Ltda. 5. A estrutura dipolar da gua e sua capacidade de formar pontes de

hidrognio permite a dissoluo de muitas substncias inicas e polares.

6. As molculas de gua lquida apresentam capacidade limitada de ionizar-se para formar H+ e OH. Quando uma soluo contm quantidades iguais

dos ons H+ e OH, considerada neutra. Solues com excesso de H+ so cidas, enquanto aquelas com grande nmero de OH so bsicas. Como os cidos orgnicos no se dissociam completamente em gua, so chamados de cidos fracos. A constante de dissociao de um cido, Ka, expressa a fora de um cido fraco. Em geral, o Ka expresso como pKa

(log Ka).

7. A concentrao do on hidrognio expressa na forma de pH definido como o logaritmo negativo da concentrao do on hidrognio (log [H+]).

8. Os cidos so definidos como doadores de prtons, a as bases como aceptores de prtons. A tendncia de um cido HA doar prtons

expressa pela sua constante de dissociao (Ka =[H+][A]/[HA]). 9. A regulao do pH essencial para a atividade dos seres vivos. A

concentrao do on hidrognio mantida dentro de estreitos limites. As solues tamponadas (par cidobase conjugado) resistem a mudanas de pH. A capacidade mxima de tamponamento est situada uma unidade de pH acima ou abaixo do seu pKa.

10. Vrias propriedades fsicas da gua modificam as molculas de soluto dissolvidas. Uma importante modificao a presso osmtica, a presso que evita o fluxo de gua atravs das membranas celulares.

11. Todos os seres vivos so constitudos de clulas procariticas ou clulas eucariticas. As procariticas o material gentico no est delimitado em um envelope nuclear. As eucariticas apresentam o material gentico dentro de um envelope nuclear. Essas clulas contm ncleo e estruturas complexas que no so observadas nas procariticas.

Referncias

BLACKSTOCK, J. C, Biochemistry. Oxford: Butterworth, 1998. p. 1-19. CAMPBELL, M. K. Bioquimica. 3 ed. Porto Alegre: ArtMed, 2000. p. 64-87. NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger: Princpios de bioqumica. 3 ed. So Paulo: Sarvier, 2002. p. 3-85.

VALTER T. MOTTA BIOQUMICA BSICA

Aminocidos e protenas

Captulo

2

29

2

Aminocidos e Protenas

Objetivos

1. Descrever as propriedades dos aminocidos encontrados nas protenas. 2. Identificar os seguintes grupamentos qumicos nas cadeias laterais dos

aminocidos: hidrofbicos, alcolicos, tilicos, cidos, bsicos e amidas. 3. Descrever a dissociao dos aminocidos em funo da variao do pH. 4. Interpretar a curva de dissociao de um aminocido neutro, de um

aminocido cido e de um aminocido bsico. 5. Calcular o pI de um aminocido, dados os seus pKs 6. Representar uma ligao peptdica entre dois aminocidos. 7. Identificar numa cadeia polipeptdica: o aminoterminal, o carbxiterminal,

os resduos de aminocidos, os radicais e a ligao peptdica. 8. Caracterizar os diferentes nveis estruturais das protenas e descrever as

foras responsveis pelos mesmos. 9. Caracterizar a desnaturao protica como uma modificao das propriedades

fsicas, qumicas e biolgicas das protenas. 10. Descrever a estrutura, as propriedades e as funes das protenas globulares

e fibrosas.

As protenas so as biomolculas mais abundantes nos seres vivos e exercem funes fundamentais em todos os processos biolgicos. So polmeros formados por unidades monomricas chamadas -aminocidos, unidos entre si por ligaes peptdicas. As protenas so constitudas de 20 aminocidos-padro diferentes reunidos em combinaes praticamente infinitas, possibilitando a formao de milhes de estruturas diversas.

2.1 Aminocidos

Os -aminocidos possuem um tomo de carbono central () onde esto ligados covalentemente um grupo amino primrio (NH2), um grupo carboxlico (COOH), um tomo de hidrognio e uma cadeia lateral (R) diferente para cada aminocido (Figura 2.1). Existem duas excees, a prolina e hidroxiprolina, que so -iminocidos.

30 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda. Os aminocidos com um nico grupo amino e um nico grupo

carboxila, ocorrem em pH neutro na forma de ons dipolares (zwitterions) eletricamente neutros. O grupo amino est protonado (on amnio, + 3NH ) e o grupo carboxlico est dissociado (on carboxilato, COO).

Os aminocidos apresentam as seguintes propriedades gerais:

Com exceo da glicina, todos os aminocidos so opticamente ativos desviam o plano da luz polarizada pois o tomo de carbono de tais molculas um centro quiral. So tomos de carbono ligados a quatro substituintes diferentes arranjados numa configurao tetradrica e assimtrica. Os aminocidos com tomos quirais podem existir como estereoismeros molculas que diferem somente no arranjo espacial dos tomos.

Os aminocidos que constituem as protenas tm a configurao estereoqumica L. Por conveno, na forma L, o grupo + 3NH est projetado para a esquerda, enquanto na forma D, est direcionado para a direita. Os D-aminocidos so encontrados em alguns antibiticos: valinomicina e actinomicina D; e em paredes de algumas bactrias: peptidoglicano. A designao L ou D de um aminocido no indica a sua capacidade para desviar o plano da luz polarizada.

A cadeia lateral (R) determina as propriedades de cada aminocido.

Os -aminocidos so classificados em classes, com base na natureza das cadeias laterais (grupo R). Os 20 tipos de cadeias laterais dos aminocidos variam em tamanho, forma, carga, capacidade de formao de pontes de hidrognio, caractersticas hidrofbicas e reatividade qumica. Os 20 aminocidos-padro so classificados pelos seus grupos R (cadeias laterais):

Aminocidos com cadeias laterais no-polares e alifticas

H3N C COO

H

H

Glicina

H3N C COO

CH3

H

Alanina

H3N C COO

CH CH3CH3

H

Valina

H3N C COO

CH2CH CH3CH3

H

Leucina

H3N C COO

CH CH3CH2CH3

H

Isoleucina

H2N

COO

+

Prolina

H3N C COO

R

H

Figura 2.1 Estrutura de um -aminocido na forma de on dipolar (zwitterions).

2 Aminocidos e protenas 31 Aminocidos com cadeias laterais aromticas

H3N CH COO

CH2

Fenilalanina

H3N CH COO

CH2

OHTirosina

H3N CH COO

CH2

HN

Triptofano

Aminocidos com cadeias laterais polares no-carregadas

H3N CH COO

CH2OH

Serina

H3N CH COO

CH OH

CH3

Treonina

H3N CH COO

CH2SH

Cistena

H3N CH COO

CH2CH2S

CH3

Metionina

H3N CH COO

CH2C

OH

O

Asparagina

H3N CH COO

CH2CH2C

OH

O

Glutamina

Aminocidos com cadeias laterais carregadas negativamente (cidos)

H3N CH COO

CH2COO

Aspartato

H3N CH COO

CH2CH2COO

Glutamato

32 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda. Aminocidos com cadeias laterais carregadas positivamente (bsicos)

H3N CH COO

CH2CH2CH2NH

C

NH2

NH2

Arginina

H3N CH COO

CH2CH2CH2CH2NH3

Lisina

H3N CH COO

CH2

N

NH

Histidina

A. Aminocidos incomuns em protenas Vrias protenas contm aminocidos incomuns formados por

modificao de resduos de aminocidos existentes na cadeia polipeptdica aps a sua sntese. Entre eles est o cido carboxiglutmico, um aminocido ligado ao clcio e encontrado na protrombina, uma protena da cascata de coagulao sangnea. A hidroxiprolina e a hidroxilisina produtos de hidroxilao da prolina e lisina, respectivamente, so importantes componentes estruturais do colgeno (ver adiante). A fosforilao dos aminocidos contendo grupos hidroxila, tais como a serina, a treonina e a tirosina empregada para regular a atividade das protenas.

NH2

CH2CHOH

CH2CH2CHNH2COOH

Hidroxilisina

HC

H2C NCH

CH2

OH

COOH

H

Hidroxiprolina

B. Aminocidos biologicamente ativos Alm da funo primria como componentes das protenas, os

aminocidos tm vrios outros papis biolgicos.

Vrios -aminocidos ou seus derivados atuam como mensageiros qumicos entre as clulas. Por exemplo, glicina, cido aminobutrico (GABA, um derivado do glutamato), serotonina e melatonina (derivados do triptofano) so neurotransmissores, substncias liberadas de uma clula nervosa e que influenciam outras clulas vizinhas (nervosas ou musculares). A tiroxina (um derivado da tirosina produzida pela glndula tireide) e cido indolactico (um derivado do triptofano e encontrado nas plantas) so exemplos de hormnios.

2 Aminocidos e protenas 33 Os aminocidos so precursores de vrias molculas complexas

contendo nitrognio. Exemplos incluem as bases nitrogenadas componentes dos nucleotdeos e cidos nuclicos, o heme (grupo orgnico contendo ferro) e clorofila (pigmento de importncia crtica na fotossntese).

Vrios aminocidos-padro e aminocidosnopadro atuam como intermedirios metablicos. Por exemplo, arginina, citrulina e ornitina so aminocidosnopadro componentes do ciclo da uria (Captulo 10). A sntese da uria uma molcula formada no fgado o principal mecanismo de excreo do excesso de nitrognio proveniente do catabolismo dos aminocidos.

C. Titulao dos aminocidos

Como os -aminocidos possuem grupos ionizveis na molcula, a forma inica predominante dessas molculas em soluo depende do pH. A titulao dos aminocidos ilustra o efeito do pH sobre sua estrutura. A titulao tambm til para determinar a reatividade das cadeias laterais dos aminocidos.

As cadeias laterais R diferenciam um aminocido de outro. O significado funcional da cadeia lateral enfatizado nas protenas onde o grupo carboxlico e o grupo amino formam ligaes peptdicas e, portanto, no exercem suas propriedades cidobsicas. Quando o grupo R neutro, a sua composio tem pequeno efeito sobre as propriedades de dissociao dos grupos carboxlicos e grupos aminos do carbono . Os aminocidos com cadeias laterais ionizveis apresentam trs grupos cidobsicos. Na Tabela 2.1 esto relacionados os valores de pK e pI dos grupos amino, carboxlico alm de grupos ionizveis das cadeias laterais dos aminocidos.

34 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda. Tabela 2.1 Valores de pK e pI para os aminocidos.

Abreviaes pK

Aminocido Comum Letra COOH NH3 Outro (R) pI Alanina Ala A 2,34 9,69 - 6,02 Arginina Arg R 2,17 9,04 12,48 (guanidino) 10,76 cido asprtico Asp D 2,09 9,82 3,86 (carboxil) 2,97 Asparagina Asn N 2,02 8,80 - 5,41 cido glutmico Glu E 2,19 9,67 4,25 (carboxil) 3,22 Glutamina Gln Q 2,17 9,13 - 5,65 Cistena Cys C 1,96 10,28 8,18 (sulfidril) 5,07

Cistina - - 1,65; 2,26 7,85; 9,85 - 5,06

Fenilalanina Phe F 1,83 9,13 - 5,48 Glicina Gly G 2,34 9,60 - 5,97 Histidina His H 1,82 9,17 6,0 (imidazol) 7,59 Hidroxilisina Hyl - 2,13 8,62 9,67 (-amino) 9,15 Hidroxiprolina Hyp - 1,92 9,73 - 5,83 Isoleucina Ile I 2,36 9,68 - 6,02 Leucina Leu L 2,36 9,60 - 5,98 Lisina Lys K 2,18 8,95 10,53 (-amino) 9,74 Metionina Met M 2,28 9,21 - 5,75 Prolina Pro P 1,99 10,.60 - 6,30 Serina Ser S 2,21 9,15 - 5,68 Tirosina Tyr Y 2,20 9,11 10,07 (fenol) 5,66 Treonina Thr T 2,63 10,43 - 6,53 Triptofano Trp W 2,38 9,39 - 5,66 Valina Val V 2,32 9,62 - 5,.97

Ao considerar a alanina em soluo fortemente cida (pH 0), tem-

se os grupos cido e bsico da molcula totalmente protonados. Com a adio de uma base forte tal como NaOH, ocorre inicialmente a perda de prton do grupo COOH e, posteriormente, a perda do prton do grupo + 3NH .

CH3

CH

COOH

NH3+

CH3

CH

COO-NH3

+

CH3

CH

COO-NH2

A curva de titulao da alanina mostrada na Figura 2.2.

2 Aminocidos e protenas 35

Figura 2.2 Curva de titulao da alanina

O valor de pH no qual o aminocido fica eletricamente neutro (igual nmero de cargas positivas e negativas) corresponde ao ponto isoeltrico (pI). O valor do pI uma constante de um composto em particular em condies especficas de fora inica e temperatura. Para o aminocido monoamino e monocarboxlico, o ponto isoeltrico calculado:

2pKpK

p 21+=I

em que K so as constantes de dissociao dos grupos cido e bsico. Para a alanina tem-se:

0262

699342p ,,,I =+=

Um exemplo mais complexo da relao entre a carga eltrica da molcula e o pH, a titulao dos aminocidos monoamino e dicarboxlicos cujos representantes so o cido glutmico e o cido asprtico. Os dois aminocidos possuem em suas cadeias laterais um segundo grupo carboxlico. Para o cido asprtico tem-se:

COOH

CH2CHNH3

+

COOH

COOH

CH2CHNH3

+

COO-

COO-

CH2CHNH3

+

COO-

COO-

CH2CHNH2COO-

A curva de titulao do cido asprtico mostrada na Figura 2.3.

pH

Quantidade de base (equivalentes)

1110

987654

3

2

1

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4 pH = 2,34 = p K1

pI = 6

pH = 9,69 = p K2

36 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda.

Figura 2.3 Curva de titulao do cido asprtico

Para o cido asprtico o pK do COOH 2,09, o pK do grupo COOH 3,86 e o pK do + 3NH 9,82. O ponto isoeltrico (pI) calculado pela frmula:

9722

863092p ,,,I =+=

A lisina um exemplo de aminocido com dois grupos bsicos na molcula. O grupo NH2 da molcula confere basicidade.

NH3+

(CH2)4CHNH3

+

COOH

NH3+

(CH2)4CHNH3

+

COO-

NH3+

(CH2)4CHNH2COO-

NH2(CH2)4CHNH2COO-

No caso da lisina o pK do COOH 2,18 o pK da + 3NH e o

pK do + 3NH 10,53. O ponto isoeltrico calculado:

7492

5310958p ,,,I =+=

A curva de titulao da lisina mostrada na Figura 2.4.

pH

Quantidade de base (equivalentes)

1110

987654

3

2

1

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4 pH = 2,09 = p K1pI = 2,97

pH = 3,86 = p K2

pH = 9,82 = p K3

2 Aminocidos e protenas 37

Figura 2.4 Curva de titulao da lisina

Tabela 2.2. Grupos ionizveis de aminocidos

Onde o grupo encontrado Forma cida Forma bsica

Resduo NH2-terminal NH3+R

R NH2 + H+ Amnio Amina

Resduo COOH-terminal R COOH R COO- + H+

cido carboxlico Carboxilato

Arginina C NH2

+

NH2

NHR

C NH

NH2

NHR + H+

Guanidnio Guanidino

Cistena SHR S-R + H2

Tiol Tiolato

Histidina

CHC

N

NH+

CH

R

H

CH

C

N

N

CH

R

H

+ H+

Imidazlio Imidazol

Tirosina CHCH

CC

CHCH

R OH

CHCH

CC

CHCH

R O-

Fenol Fenolato

pH

Quantidade de base (equivalentes)

1110

987654

3

2

1

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4 pH = 2,18 = p K1

pI =9,74pH = 8,95 = p K2

pH = 10,53 = p K3

38 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda.

2.3 Reaes dos aminocidos

Os aminocidos com seus grupos carboxlicos, grupos amino primrios e os grupos presentes nas cadeias laterais podem sofrer diferentes reaes qumicas. Duas reaes ligao peptdica e a oxidao da cistena (formao de pontes dissulfeto) so de especial interesse por afetar a estrutura das protenas.

1. Formao de ligao peptdica. Os polipeptdeos so polmeros lineares compostos de aminocidos ligados covalentemente entre si por ligaes amida do grupo COOH de um aminocido com o grupo NH2 de outro, com a remoo da gua (reao de condensao) para formar ligaes peptdicas.

C C

O

OH

R1

H

NH2 + C CO

OH

R2

H

NH2 C C

O

N

R1

H

C

H

C

R2

O

OH

H

NH2

Aps incorporao a peptdeos, os aminocidos individuais so denominados resduos de aminocidos.

A estrutura que contm dois resduos de aminocidos chamada dipeptdeo; com trs aminocidos tripeptdeo, etc. Quando um grande nmero de aminocidos esto unidos dessa forma, o produto denominado polipeptdeo. As protenas podem conter centenas ou milhares de resduos de aminocidos.

Os polipeptdeos so geralmente representados com o grupo amino livre chamado aminoterminal ou Nterminal esquerda e o grupo carboxlico livre denominado carbxiterminal ou Cterminal direita.

H N CH C N CH C N CH C N CH C O3

1

N-terminal

R O R O R O R O C-terminal

2 3 4

H H HResiduo 1 Residuo 2 Residuo 3 Residuo 4

+

A nomenclatura dos peptdeos pequenos dada pela seqncia dos nomes de resduos de aminocidos que os formam e inicia a partir da esquerda com o resduo que possui o grupo aminoterminal livre, substituindose o sufixo ina pelo sufixo il. Assim, so relacionados todos os aminocidos que formam o polipeptdeo, com exceo do que contm o grupo carboxila livre que permanece com o nome original. Exemplo:

C C N

O H

CHCOOH

CHOH

CH3

N

H

C

O

C

CH2C

H

NH2

CH

CHCH

CH

CH

CH

H

CH3

CH3

Tirosilvaliltreonina

As principais caractersticas das ligaes peptdicas so:

2 Aminocidos e protenas 39 Os seis tomos que formam a ligao CCONHC, esto no

mesmo plano (C o carbono alfa de aminocidos adjacentes). O C=O e NH da ligao so trans um em relao ao outro. A ligao CN apresenta algumas caractersticas de dupla ligao

parcial no podendo girar livremente.

A livre rotao possvel para as ligaes carbonocarbono e nitrogniocarbono (nocarbonila), permitindo variaes na conformao.

2. Oxidao da cistena. O grupo sulfidrlico da cistena reversivelmente oxidado. A oxidao de duas molculas de cistena produz a cistina uma molcula que contm uma ponte dissulfeto. A sntese da cistina realizada aps a incorporao da cistena s protenas e exerce importante papel na estabilizao da conformao protica. A ligao covalente pode ocorrer entre cistenas de uma nica cadeia polipeptdica formando um anel ou entre cadeias separadas para formar pontes intermoleculares.

SH

CH2CHNH2COOH

S

CH2CHNH2COOH

S

CH2CHNH2COOH

2

Cistena Cistina

2.4 Peptdeos

Apesar de apresentarem estruturas menos complexas que as molculas de protenas, os peptdeos exercem atividades biolgicas significantes.

O tripeptdeo glutationa (GSH, Lglutamil-Lcisteinilglicina) contm uma ligao incomum amida ( o grupo carboxlico e no o grupo carboxlico do cido glutmico que participa da ligao peptdica). Encontrada em quase todos os organismos, a glutationa est envolvida em diferentes processos, tais como, sntese de protenas e DNA, transporte de aminocidos e metabolismo de frmacos e substncias txicas. A glutationa tambm atua como agente redutor e protege as clulas dos efeitos destrutivos da oxidao por reao com substncias como o perxido (ROOR), que so metablitos reativos do O2. Nos eritrcitos, o perxido de hidrognio (H2O2) oxida o ferro da hemoglobina para a forma frrica (Fe3+). A metaemoglobina, o produto da reao, incapaz de ligar o O2. A glutationa protege contra a formao de metaemoglobina pela reduo do H2O2 em reao catalisada pela enzima glutationaperoxidase. No produto oxidado GSSG duas molculas de GSH esto unidas por uma ponte dissulfeto entre seus grupos sulfidrla.

2 GSH + H2O2 GSSG + H2O A enzima glutamil-transpeptidase participa do metabolismo da

glutationa e empregada como marcador para algumas hepatopatias, como carcinoma hepatocelular e hepatopatias por alcoolismo.

40 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda.

Quadro 2.1 Cromatografia de troca inica

A cromatografia de troca inica utiliza colunas cromatogrficas que separam as molculas com base na sua carga lquida. So usados compostos com grupamentos funcionais positiva ou negativamente carregados, tais como, dietilaminoetil ou carboximetila, covalentemente ligados a uma matriz slida porosa (ex.: resinas base de acrlico, agarose, slica ou estireno divinilbenzeno) para formar trocadores de ctions ou nions.

Quando uma soluo contendo protenas com cargas positivas e negativas aplicada coluna contendo um trocador de cargas de sinal contrrio, as molculas carregadas ligam-se por meio de interaes inicas a trocadores de ctions e nions. Molculas neutras ou carregadas com as mesmas cargas, movem-se atravs da coluna sem serem captadas. A separao das molculas carregadas usualmente realizada em soluo-tampo com concentraes de ons salinos e pH apropriados (determinam os estados de ionizao da molcula) que progressivamente, vo enfraquecendo as ligaes inicas.

Alguns peptdeos atuam como molculas de sinalizao usadas

para coordenar o imenso nmero de processos bioqumicos em organismos multicelulares. Os exemplos incluem o apetite, presso sangnea e a percepo da dor. O papel de alguns desses peptdeos so descritos brevemente.

Os estudos de regulao da ingesto de alimentos e do peso corporal tem revelado vrias molculas de sinalizao no crebro. Entre elas, esto os peptdeos estimulantes do apetite como o neuropeptdeo Y (NPY) e a galanina, e peptdeos inibidores do apetite como colecistocinina e hormnio estimulador melancito (MSH). Evidncias recentes sugerem que a leptina, um polipeptdeo produzido primariamente pelos adipcitos, exerce seus efeitos sobre o peso corporal e atua sobre o neuropeptdeo Y, a galanina e vrias outras molculas sinalizadoras para reduzir a ingesto de alimentos e aumentar o gasto calrico.

A presso sangnea a fora exercida pelo sangue contra as paredes dos vasos influenciada pelo volume sangneo e pela viscosidade. Dois peptdeos afetam o volume sangneo: a vasopressina e o fator natriurtico atrial. A vasopressina, tambm chamada hormnio antidiurtico (ADH), sintetizada no hipotlamo e contm nove resduos de aminocidos. O ADH estimula os rins a reter gua. A estrutura do ADH bastante similar a outro peptdeo produzido pelo hipotlamo chamado oxitocina, uma molcula de sinalizao que estimula a liberao do leite pelas glndulas mamrias e influencia o comportamento sexual, maternal e social. A oxitocina produzida no tero estimula a contrao uterina durante o parto. O fator natriurtico atrial (FNA) um peptdeo produzido por clulas atriais cardacas em resposta a distenso estimula a formao de urina diluda, um efeito oposto ao da vasopressina. O FNA exerce seus efeitos, em parte, pelo aumento da excreo de Na+ pela urina, um processo que causa o aumento da excreo da gua e a inibio da secreo de renina pelo rim.

2 Aminocidos e protenas 41

8-Arginina vasopressina (Hormnio antidiurtico)

A metencefalina e a leuencefalina pertencem a um grupo de peptdeos chamados peptdeosopiceos, encontrados predominantemente nas clulas do tecido nervoso. Os peptdeos opiceos so molculas que atenuam a dor e produzem sensaes agradveis. Os pentapeptdeos leuencefalina e metencefalina diferem entre si somente pelos resduos de aminocidos dos Cterminais. A substncia P e a bradiquinina estimulam a percepo de dor e apresentam efeitos opostos aos peptdeos opiceos.

Um importante dipeptdeo comercial sinttico o adoante artificial aspartame (ster metlico de LaspartilLfenilalanina).

2.5 Protenas

As protenas so componentes essenciais matria viva. Atuam como catalizadores (enzimas), transportadores (oxignio, vitaminas, frmacos, lipdeos, ferro, cobre, etc.), armazenamento (casena do leite), proteo imune (anticorpos), reguladores (insulina, glucagon), movimento (actina e miosina), estruturais (colgeno), transmisso dos impulsos nervosos (neurotransmissores) e o controle do crescimento e diferenciao celular (fatores de crescimento)

Alm das resumidas acima, citam-se algumas funes de grande importncia fisiolgica das protenas: manuteno da distribuio de gua entre o compartimento intersticial e o sistema vascular do organismo; participao da homeostase e coagulao sangnea; nutrio de tecidos; formao de tampes para a manuteno do pH, etc.

Baseado na sua composio, as protenas so divididas em simples, que consistem somente de cadeias polipeptdicas, e conjugadas que, alm das cadeias polipeptdicas tambm possuem componentes orgnicos e inorgnicos. A poro no-peptdica das protenas conjugadas denominada grupo prosttico. As mais importantes protenas conjugadas so: nucleoprotenas, lipoprotenas, fosfoprotenas, metaloprotenas, glicoprotenas, hemoprotenas e flavoprotenas.

As protenas variam amplamente em suas massas moleculares. Algumas atingem valores acima de um milho de daltons. O limite mnimo mais difcil de definir mas, em geral, considera-se que uma protena quando existir pelo menos 40 resduos de aminocidos. Isso representa o ponto de demarcao no tamanho entre um polipeptdeo e uma protena, entretanto deve-se enfatizar que essa uma definio de convenincia, pois no existem diferenas marcantes nas propriedades dos polipeptdeos grandes e protenas pequenas.

As propriedades fundamentais das protenas permitem que elas participem de ampla variedade de funes:

As protenas so polmeros constitudos por unidades monomricas chamadas aminocidos.

+H N Cys Tyr Phe Glu Asp Cys Pro Arg Gly C3O

NH2

S S

1 2 3 4 5 6 7 8 9

42 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda.

Quadro 2.2 Cromatografia de filtrao em gel

A cromatografia de filtrao em gel separa as molculas de acordo com seu tamanho e forma. Utiliza esferas porosas de um polmero insolvel mas muito hidratado, como a agarose, dextrana ou poliacrilamida. As esferas so contm poros de diferentes tamanhos. A separao acontece quando as molculas de diferentes tamanhos so passadas atravs da coluna contendo as esferas porosas. As molculas pequenas se distribuem dentro dos poros, enquanto as molculas grandes no entram nos poros e passam rapidamente atravs da coluna.

Assim, molculas de diferentes massas moleculares podem ser separadas quando passam pela coluna (peneira molecular). A resoluo depende do tamanho da partcula, tamanho do poro, velocidade do fluxo, comprimento e dimetro da coluna e o volume da amostra.

A tcnica aplicada no fracionamento de protenas e polissacardeos, determinao da massa molecular de protenas e a purificao de cidos nuclicos.

As protenas contm vrios grupos funcionais. As protenas podem interagir entre si ou com outras

macromolculas para formar associaes complexas.

Algumas protenas so bastante rgidas, enquanto outras apresentam flexibilidade limitada.

2.6 Estrutura das protenas

A estrutura das protenas extraordinariamente complexa e seu estudo requer o conhecimento dos vrios nveis de organizao. A distino dos nveis de organizao realizada em termos de natureza das interaes necessrias para a sua manuteno. Destingem-se quatro nveis de organizao existentes nas protenas. Os conceitos a seguir destinam-se fundamentalmente a melhor compreenso das estruturas proticas, pois existem casos de sobreposio entre os diferentes nveis de organizao. As quatro estruturas so:

1. Primria: nmero, espcie e a seqncia dos aminocidos unidos por ligaes peptdicas e pontes dissulfeto. especificada por informao gentica.

2. Secundria: arranjos regulares e recorrentes da cadeia polipeptdica (hlice e folha pregueada).

3. Terciria: pregueamento no peridico da cadeia polipeptdica, formando uma estrutura tridimensional estvel.

4. Quaternria: arranjo espacial de duas ou mais cadeias polipeptdicas (ou subunidades proticas) com a formao de complexos tridimensionais.

A. Estrutura primria Cada cadeia polipeptdica tem uma seqncia especfica de

aminocidos determinada por informao gentica. A estrutura primria descreve o nmero de aminocidos, a espcie, a seqncia (ordem) e a localizao das pontes dissulfeto (cistina) de uma cadeia polipeptdica. A estrutura estabilizada pelas ligaes peptdicas e pontes dissulfeto. Polipeptdeos com funes e seqncias de aminocidos similares so denominados homlogos.

2 Aminocidos e protenas 43 O conhecimento das seqncias de aminocidos em protenas

importante por vrias razes:

Compreender como as protenas realizam suas aes moleculares. Compreender os efeitos das mutaes resultantes da substituio

ou delees de um ou mais aminocidos nas protenas.

Verificar como protenas similares em diferentes organismos podem contribuir com informaes acerca das vias evolutivas.

Comparar seqncias especficas de protenas com funes similares em espcies diferentes.

Identificar a presena de repeties de seqncias em diferentes protenas para agrup-las em famlias.

Estudar da constituio de protenas desconhecidas. Atualmente so conhecidas as estruturas primrias de numerosas

protenas. A primeira a ser determinada foi a insulina (Sanger, 1953) que possui duas cadeias polipeptdicas: cadeia A (21 aminocidos) e B (30 aminocidos) que esto unidas entre si por duas pontes dissulfeto (CysSSCys):

B. Estrutura secundria As protenas apresentam arranjos tridimensionais com

dobramentos regulares denominados estruturas secundrias das protenas. Esta estrutura estabilizada por pontes de hidrognio entre o oxignio carbonil de uma ligao peptdica e o hidrognio amida de uma outra ligao peptdica prxima (NHO=C). A presena de numerosas pontes de hidrognio entre as ligaes peptdicas tem grande significado na estabilizao da estrutura secundria. Existem dois tipos de estruturas secundrias: hlice e folha pregueada.

Hlice Na estrutura -hlice, a molcula polipeptdica se apresenta

como uma hlice orientada para a direita como se estivesse em torno de um cilindro, mantida por pontes de hidrognio arranjadas entre os grupos C=O e o HN das ligaes peptdicas. Cada volta da hlice corresponde a 3,6 resduos de aminocidos (Figura 2.5). A distncia que a hlice aumenta ao longo do eixo por volta de 54 nm. As cadeias laterais R dos aminocidos projetam-se para fora da hlice.

Gly

Phe

Cys Cys Cys Cys Asn

Cys Cys Ala

S

S

S S

A

B

S

S

44 MOTTA Bioqumica Laboratorio Autolab Ltda.

Quadro 2.3 Resina trocadora de ons

Diferentes trocadores de ons esto disponveis para suprir necessidades especficas. A seleo do trocador de on apropriado depende das propriedades das molculas de interesse. Com molculas anfotricas, a estratgia de separao est baseada no pI e na estabilidade da molcula em diferentes valores de pH. Em pHs maiores que o pI, a molcula estar negativamente carregada; em pHs abaixo do pI estar positivamente carregada.

Assim, se a molcula estvel acima de seu valor de pI, um trocador de nion usado ou, ao contrrio, se estvel abaixo do seu valor de pI, um trocador de ction empregado.

A cromatografia de troca inica usada em vrias separaes e purificaes de molculas biolgicas, ex.: protenas, peptdeos, aminocidos, nucleotdeos e isoenzimas. tambm utilizada na deionizao da gua ou em solues de substncias no-inicas e na ultra-purificao de tampes, reagentes inicos etc.

A presena dos aminocidos prolina e hidroxiprolina, cujas

estruturas cclicas relativamente rgidas no se encaixam hlice, foram a cadeia a dobrar-se rompendo a estrutura secundria regular. Esses dois aminocidos, tambm como a glicina, favorecem a formao de conformao folha pregueada (ver adiante). Seqncias polipeptdicas com grande nmero de aminocidos com carga (ex.: cido asprtico, cido glutmico) e grupos R volumosos (ex.: triptofano) so incompatveis com a estrutura helicoidal pelos efeitos provocados por suas cadeias laterais.

Figura 2.6 Estrutura helicoidal de um segmento polipeptdeo mostrando os locais das pontes de hidrognio intracadeia (C=O---HN).

CN

C

N

N

C

CN

CC

C CNCC

C

CC

N

C

CN

C

C

N

C

CC

N

N

C

N

0,54 nm de passo(3,6 resduos)

0,15 nm

2 Aminocidos e protenas 45

Quadro 2.4 Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade envolve a propriedade de algumas protenas de se ligarem por interaes no-covalentes. Um ligante se liga covalentemente a uma matriz inerte, exemplo, agarose (uma matriz de resina slida) que colocada em uma coluna. Uma mistura de biomolculas passada atravs da coluna.

As substncias sem afinidade pelo ligante passam pela coluna e so lavadas por um tampo. A protena desejada liga-se ao ligante de forma especfica de modo no-covalente. A protena ligada pode ser eluda por soluo de ligantes livres ou aplicando solventes orgnicos ou, ainda, por solues de pH ou fora inica diferente.

Folha pregueada A estrutura de folha pregueada resulta da formao de pontes

de hidrognio entre duas ou mais cadeias polipeptdicas adjacentes. As pontes de hidrognio ocorrem entre os grupos C=O e NH de ligaes peptdicas pertencentes a cadeias polipeptdicas vizinhas em vez de no interior da cadeia (Figura 2.7). Cada segmento polipeptdico individual denominado folha . Diferentemente da hlice compacta, as cadeias polipeptdicas da folha esto quase inteiramente estendidas.

Os segmentos polipeptdicos na folha pregueada so alinhados no sentido paralelo ou antiparalelo em relao s cadeias vizinhas:

Estrutura folhas paralelas formada por cadeias polipeptdicas com os Nterminais alinhados na mesma direo.

Estrutura folhas antiparalelas, os Nterminais de cada cadeia polipeptdica esto alinhados em direes opostas.

Ocasionalmente, misturas de cadeias paralelas e antiparalelas so observadas.

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NC

CO

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

H

O

H

O

H

O

H

O

H

NC

CO

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

H

O

H

O

H

O

H

O

H

NC

CO

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

H

O

H

O

H

O

H

O

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Paralela

NC

CO

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

H

O

H

O

H

O

H

O

H

CC

N

C

C

N

C

CN

CC

N

C

CN

CC

N

O

O

O

H

H

NC

CO

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

N

CC

H

O

H

O

H

O

H

O

H

H

H

H

O

O

Anti-paralela

Figura 2.7 Estrutura de folha pregueada entre cadeias polipeptdicas.

A representao esquemtica das ligaes intermoleculares e das cadeias paralelas dispostas em estrutura de folha pregueada so mostradas na Figura 2.7. Nessas estruturas as cadeias laterais (R) so projetadas para cima e para baixo aos planos formados pelas pontes de hidrognio entre as cadeias polipeptdicas.

Estrutura secundria irregular

As hlices e as folhas pregueadas so classificadas como estruturas secundrias regulares, pois seus componentes exibem conformaes estruturais peridicas. Dependendo da natureza das cadeias laterais dos aminocidos presentes, as hlices e as folhas pregueadas podem se apresentar levemente distorcidas em sua conformao especfica.

Muitas protenas apresentam combinaes de estruturas hlice e de estruturas folha pregueada em propores variadas. As combinaes produzem vrios arranjos denominados de estruturas supersecundrias ou motivos cujas variaes so:

Motivo , em que duas folhas pregueadas paralelas esto conectadas a uma hlice.

Motivo meandro, onde duas folhas pregueadas antiparalelas esto conectadas por aminocidos polares e glicina que efetuam uma mudana brusca de direo da cadeia polipeptdica.

Motivo , onde duas hlices antiparalelas consecutivas esto separadas por uma ala ou segmento no-helicoidal.

Barris , so formados quando vrias folhas pregueadas enrolam-se sobre si mesmas.

2 Aminocidos e protenas 47

Figura 2.8 Algumas estruturas supersecundrias (motivos-protena). As setas indicam as direes das cadeias polipeptdicas. (a) Motivo , (b) motivo grampo, (c) motivo meandro, (d) motivo chave grega e (e) sanduche.

As estruturas secundrias e supersecundrias de grandes protenas, geralmente, so organizadas como domnios regies compactas semiindependentes ligadas entre si por uma cadeia polipeptdica.

C. Estrutura terciria A estrutura terciria descreve a conformao especfica da cadeia

polipeptdica secundria que resulta numa estrutura mais compacta onde os tomos ocupam posies especficas. O dobramento pr