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Trabalho de Laboratório I

Titulação e verificação da capacidade tampão de aminoácidos e da saliva

Introdução teórica

O conhecimento das propriedades ácido-base dos aminoácidos é muito importante para a análise e compreensão das propriedades das proteínas.

Todos os aminoácidos são anfólitos, ou seja, têm um grupo funcional ácido (α-carboxilo), e um grupo funcional básico (α-amino). Além destes, alguns aminoácidos podem ter ainda outros grupos ionizáveis.

O grau de protonação dos grupos ionizáveis e a carga que irão apresentar é função do pH do meio envolvente, o que torna o pH tão importante em sistemas biológicos.

Os grupos ionizáveis actuam como ácidos ou bases fracas cedendo ou ligando protões quando o pH é alterado.

O resultado do seguimento da variação de pH em todos os equilíbrios ácido-base pode ser previsto através da equação de Henderson-Hasselbalch (permite relacionar o valor de Ka de um ácido fraco com o pH da solução que contém o ácido e a sua base conjugada).

pH=pKa+log10[ formanão protonada]

[ forma protonada]

Esta equação é usada para prever as propriedades das soluções tampão utilizadas para controlar o pH de misturas reaccionais.

Ka é a constante de ionização. Quando a [forma não protonada] = [forma protonada], o pKa = pH. (pKa é uma medida numérica da força de um ácido)

A alanina tem dois grupos ionizáveis, o grupo carboxilo com pKa = 2,3 e o grupo amina com pKa = 9,7.

Em pH muito baixo (<1), a alanina existe na forma totalmente protonada, ou seja com o grupo carboxilo totalmente protonado (COOH) e o grupo amina protonado (NH3

+), isto significa que pode doar dois protões durante a sua titulação.

Meio ácido

Meio básicoA+ Forma isoeléctrica A-

pKa1 – Região de tamponamento devida ao grupo COOH.pKa2 – Região de tamponamento devida ao grupo NH2.

pKa1(a-carboxilo) = 2,3pKa2(a-amina) = 9,7

C COOH

H

CH

3

NH

3+

pKa

1

C COO-

H

CH

3

NH3+ pK

a2

C COO-

R

CH3

NH2

Cada grupo teve de titular uma solução de alanina que inicialmente se encontrava na forma protonada.

Ponto isoeléctrico Valor de pH ao qual o somatório de todas as cargas dos grupos ionizáveis existentes na molécula é zero. Nos aminoácidos é igual a metade da soma dos dois valores de pK que constituem a fronteira da forma neutra (switeriónica).

Capacidade tampão de fluidos biológicos:

Fluidos biológicos São sistemas tampão. Não ocorrem variações superiores a 0,2. No sangue, com m pH de 7.4, o sistema tampão baseia-se na protólise do ácido carbónico.

Solução tampão Mistura de um ácido ou base fracos, com os seus conjugados e têm a propriedade de resistir à variação de pH, quando lhe é adicionada uma quantidade moderada de um ácido ou uma base fortes. Está presente num sistema tampão.

Água Influencia todas as interacções de sistemas biológicos; é uma molecular polar, cm uma distribuição assimétrica de carga; possui moléculas com grande afinidade umas pelas outras.

Grau de dissociação Depende da afinidade do anião pelo protão. Se as forças dipolares da água, ao interactuarem com o anião ou com o catião, forem mais fortes que a interacção electrostática entre o anião e o catião, haverá um grau de dissociação elevado.

Interacções entre biomoléculas:

Ligações fortes Ligações covalentes

Ligações fracas Ligações de Van der Waals; Interacções iónicas; Ligações de Hidrogénio

O conjunto de todas as ligações dá origem à estrutura da biomolécula.

pKa é o ponto em que [H+] e [OH-] são iguais e onde o valor de pKa é numericamente igual ao valor de pH é onde há um equilíbrio ácido-base.

Alteração de pH a nível celular:

Acidose – Sistema nervoso – Coma em casos extremos (diabéticos) Alcalose – Diminuição da [] de protões – Sistema nervoso instável – Convulsões e

violência

Dentes – Tecidos minerais e a saliva evita a desmineralização e mineralização dos dentes.

Capacidade tampão da saliva

A cavidade oral está sujeita a vários estímulos exteriores que possuem a capacidade de alterar o pH para além do pH crítico (pH abaixo do qual há risco de desmineralização dentária).

A saliva com os seus constituintes possui diversas funções, entre as quais encontra-se a capacidade tampão.

o Sistemas tampão da saliva

Sistemas tampão

Sistema bicarbonato

É o mais importante do organismo humano. Sistema aquoso que contém:

o Ácido fraco: H2CO3

o Sal – Bicarbonato – NaHCO3

O sistema bicarbonato é o mais importante porque é o que está no sangue. É o mais eficaz no caso de acidose.

Proteína mais abundante no organismo Colagénio

Proteína mais abundante no sangue Albumina

Sistema aquoso contendo:

Ácido fraco (ácido carbónico): H2CO3

Sal da base conjugada (bicarbonato): NaHCO3

1º Componente

Anidrase

Carbónica

CO2 + H2O H2CO3

Reacção

lenta na

ausência

desta enzim

a O CO2 produzido nos tecidos difunde-se através das membranas celulares e dissolve-se no plasma sanguíneo.

Abundante nos alvéolos pulmonares e nas células epiteliais dos túbulos renais

2º Componente

H2CO3 H+ + HCO3-

NaHCO3 Na+ + HCO3-

Ocorre predominantemente sobre a forma de Bicarbonato de Sódio

Sistema Completo

CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-

+ Na+

Desequilíbrio do sistema na presença de um ácido

Implicações de um:

Desequilíbrio do sistema na presença de uma base

CO2 + H2O H2CO3 H+ + ↑ HCO3-

+ Na++OH-

CO2 + H2O H2CO3 ↑ H+ + HCO3-

CO2/HCO3- pK=6,1

Sistema Fosfato:

Na2HPO4 ❑→ 2 Na+ + HPO4

2-

H2PO4- ❑→ 2 H+ + PO4

3-

Implicações de:

Desequilíbrio do sistema na presença de um ácido de pKa baixo ácido forte. Desequilíbrio do sistema na presença de um ácido de pKa alto ácido fraco.

pKa baixo (ácido forte, base fraca)

HCl + Na2HPO4 ❑→ NaH2PO4 + NaCl

Base fraca

pKa alto (ácido fraco, base forte)

NaOH + NaH2PO4❑→ Na2HPO4 + H2O (SENTIDO DIRECTO)

O sistema fosfato permite conservar as [] de proteína, evitando a degenerescência ao nível celular.

É muito importante para a regulação intracelular.

Sistema Proteico:

É importante quer a nível intra, quer a nível extracelular. E organismos, é dos mais importantes. Assegura a existência de um pKa aproximadamente de 7.4 (a maioria dos P.I. das

proteínas salivares é 7.0)

Diabético Período prolongado de muito açúcar Hemoglobina glicolisada

Hb + Glicose HbA (alteração da estrutura e função das mesmas … ao fim de 120 dias desaparecerem)

O H+ está presente em todos os sistemas tampão.

Protocolo e conclusões

Titulação da alanina

o No ponto isoeléctrico, a [alanina] = [NaOH].o Este aminoácido pode ser utilizado eficazmente como tampão numa gama de

pH de aproximadamente 2,63 a 4,63 e 8,74 a 10,74 (diferença de 2 valores).o Nas zonas de tampão, a variação de pH é menos evidente com a adição da

base NaOH.

Equivalente base teórico é aos 5ml

pKa 1 = 2,3

pKa 2 = 9,7

Verificação da capacidade tampão da saliva

Titulado – AlaninaTitulante - NaOH

pH

V[NaOH] (ml)

Espécie Protonada

Espécie Semi-protonada

Espécie Desprotonada

o Os valores de pH na saliva não variam muito, pois temos vários sistemas tampão a actuar.

Trabalho de Laboratório II

Quantificação Proteica por espectrofotometria utilizando uma curva de calibração

Introdução teórica

A espectrofotometria é útil na identificação de compostos biológicos que absorvem luz UV ou visível.

Um espectro de absorção de luz de um dado composto pode ser obtido, medindo a absorvância de uma solução pura desse composto, numa gama de comprimentos de onda diferentes.

A quantificação por espectrofotometria é baseada na técnica de Lambert-Beer que relaciona a absorção da luz com a concentração do composto que absorve.

o Só é válida para zonas em que as concentrações sejam lineares.o Zonas com concentrações muito elevadas têm tendência a ficar curvas, a lei

não se aplica nessas zonas. As proteínas ou péptidos com mais de duas ligações peptídicas, reagem com o sulfato

de cobre II em meio alcalino formando um complexo de cor azul violeta (absorve nos 550nm) cuja intensidade está relacionada com o número de ligações peptídicas presentes na amostra.

A absorvância da amostra é proporcional à concentração de proteína presente, o que possibilita a utilização da reacção para quantificação de proteínas.

O método é identificado como o teste do biureto (composto com analogia estrutural com uma dupla ligação peptídica) pois esta reacção é análoga à da complexação do cobre pelo biureto.

Protocolo e conclusões

Prepararam-se 6 soluções de [] conhecida de BSA (albumina de soro bovino), a partir de uma solução-mãe, a 10mg/ml

pH

V[HCl] (ml)

Sabia-se a concentração que se pretendia em cada uma das amostras, por isso foi necessário calcular o volume de solução de BSA de [] conhecida a colocar e o volume de água destilada para perfazer os 10ml.

Retirou-se então 0,8ml de cada solução padrão e adicionou-se 3,2 ml do reagente de Biureto e deixou-se reagir 30min.

Colocou-se em couvettes descartáveis e leram-se as absorvâncias no espectrofotómetro contra um comprimento de onda de 550nm.

Traçou-se depois uma recta de calibração, sendo determinada a equação da recta e, a partir daí, sabendo o valor da absorvância da solução desconhecida, obtém-se o valor de concentração por substituição das variáveis.

o Recta obtida – y=0,0546x – 0,0026o A absorvância registada foi de 0,385, logo y=0,385. Por substituição tem-se

que x = 7,099mg/ml (por conversão 1,044 x 10-4 mol/L (sabendo o M(albumina) = 68000g/mol, podemos calcular o n = 1,044 x 10-7 mol)

o Assim, na fórmula A=ε.b.c, sabemos que o A = 0,385, o b = 1cm, c = 1,044 x 10-4

mol/L.o O ε calculado é 2992 M-1cm-1.

A recta de calibração tem as absorvâncias no eixo yy e a concentração no eixo xx.

Trabalho de Laboratório III

Digestão oral dos glúcidos: a hidrólise do glicogénio

Introdução teórica

Glúcidos consumidoso Há glúcidos, na dieta, que não são digeríveis.o As ligações β-1,4 destas moléculas tornam-nas resistentes à acção das enzimas

glicolíticas do tubo digestivo.o As bactérias existentes no cólon conseguem quebrar algumas destas ligações,

originando ácidos gordos de cadeia curta, que são rapidamente absorvidos. Glúcidos Digestão oral

o A digestão de glúcidos inicia-se na cavidade oral.o α-amilase

Peso Molecular de 52500 dalton, pH óptimo próximo de 7. Inactivada pelo ambiente ácido do estômago (pH=2) Persiste alguma actividade dentro do bolo alimentar. Cliva as ligações α-1,4 do amido e do glicogénio.

o Produtos da digestão bucal Oligossacáridos lineares de cadeia curta (maltose e maltotriose)

Ramificadas – incapacidade de hidrólise das ligações α-1,6 de amilopectina, por parte da amilase.

Os organismos vivos armazenam hidratos de carbono que actuam como material de reserva.

o Armazenados na forma de polissacáridos (glicogénio em animais e amido e inulina em plantas).

Glicogénioo Tem propriedades físicas e químicas que diferem dos hidratos de carbono mais

simples.o Tem uma estrutura ramificada com cadeias lineares de resíduos de glucose,

ligadas por ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6, nos pontos de ramificação.o Tem uma estrutura com um açúcar terminal redutor e uma série de açúcares

terminais não redutores, muito importante para a rápida mobilização desta reserva.

α-amilase salivaro Enzima muito eficienteo Catalisa a hidrólise das ligações α-1,4 glicosídicas internas, em polímeros de

glucose.o É produzida nas glândulas salivares e actua na boca.o Tem um pH óptimo próximo de 7o É inactivada quando chega ao estômago.

Cinética – Pode ser química ou enzimática

Cinética química

Velocidade da reacção Relacionada com a energia necessária para que reagentes e produtos sejam interconvertíveis.

Factores que influenciam a velocidade das reacções químicas:

Temperatura – Quanto mais alta a temperatura, mais rápida a reacção. Concentração – Quanto mais partículas existirem, maior a reacção. Enzimas – Substâncias que diminuem a energia de activação Tamanho das partículas – As partículas mais pequenas movem-se mais rapidamente

que as partículas maiores.

Catalisador Baixa a barreira de energia para a reacção, permitindo que uma fracção maior de moléculas tenha energia suficiente para atingir o estado de transição e, consequentemente, aumenta a velocidade da reacção, em ambos os sentidos.

Enzimas:

São biocatalisadores. Apresentam uma estrutura maioritariamente proteica.

Podem ser isoenzimas – Enzimas fisicamente distintas, mas com funções catalíticas idênticas.

Localizadas em estruturas sub-celulares, relacionadas com a função que exercem.

Catálise enzimática

A reacção inicia-se com a ligação da enzima ao substrato, formando o complexo enzima-substrato.

o Especificidade – O centro activo tem uma tolerância muito pequena Caso aceite um dos isómeros do substrato – Estereoespecificidade.

Factores que afectam a velocidade de reacção catalisada por enzimas:o Temperaturao pHo Concentração de substrato e de enzima

E + S ES E + P

Equação de Michaelis-Menten

v=V máx[S ]Km+[ S]

Protocolo e conclusões

Demostrar a natureza polissacárida do glicogénio. Demonstrar a diferença da acção catalítica ácida e enzimática, pelo aparecimento de

glucose (açúcar redutor), durante a reacção de hidrólise, bem como a sua especificidade.

A hidrólise pode ser seguida medindo o aumento da [] dos açúcares redutores, através de uma reacção colorimétrica, usando para isso a redução do reagente 3,5-dinitrosalicilato. Este aparecimento de cor pode ser seguido a 540nm.

Amarelo claro (redução) Alaranjado

Hidrólise ácida

Dissolveram-se 24mg de glicogénio em 3ml de água. (c=8mg/ml) Distribuiu-se 0,4ml de solução por todos os tubos, excepto no 1º onde se pôs água. Começou-se a reacção com 0,6ml de HCl (2N) a cada tubo. Registou-se o tempo e, adicionou-se de imediato 1ml de NaOH ao tubo 1 e 2 para

parar a reacção e colocou-se os tubos 3 a 8 no banho a 95ºC. Em intervalos de 5 minutos retirou-se 1 a 1 cada um dos tubos e parou-se a reacção

com a mesma quantidade de NaOH. Depois da reacção ter terminado em todos os tubos, juntou-se 1ml de reagente de 3,5-

dinitrosalicilato a cada tubo e colocou-se no banho por mais 5 minutos, a 95ºC. Arrefeceu-se os tubos por imersão em água fria. Adicionou-se 17ml de água destilada a cada tubo vórtex couvette Leu-se a absorvância a 540nm, usando o tubo 1 como branco.

Hidrólise enzimática

Dissolveu-se 24mg de glicogénio em 3ml de solução a pH2 e a pH7. Distribuiu-se 0,4ml em cada tubo, excepto no 1º que contém a solução tampão. Recolheu-se saliva e fez-se a diluição da mesma, adicionando 0,5ml de saliva a 19,5ml

de solução-tampão. Para começar a reacção adicionou-se 0,5ml de saliva diluída a cada um dos tubos e

registou-se o tempo. Adicionou-se de imediato, 1ml de reagente 3,5-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2, para

parar a reacção e colocou-se os outros tubos (3-8) num banho a 37ºC. Em intervalos de 2 minutos retirou-se cada tubo e parou-se a reacção. No final, colocou-se, durante 5 minutos, os tubos num banho a 95ºC e depois foram

arrefecidos por imersão em água fria. Adicionou-se 18,1ml de água a cada tubo vórtex couvette Leu-se a absorvância a 540nm usando o tubo 1 como branco.

Hidrólise do glicogénio Aumento da [] dos açúcares redutores.

O valor de máximo de absorvância lido na experiência corresponde à concentração máxima de glucose verificada. Assim, corresponde também aos 100% de glicogénio hidrolisado. Com isto, podemos calcular a percentagem de glicogénio hidrolisado nos outros tubos.

Há maior % de glicogénio hidrolisado num menor espaço de tempo com enzima α-amilase num meio com pH=7.

Ao nível da α-amilase em pH=2, verifica-se muito pouco a ocorrência de hidrólise, embora a temperatura de acção fosse óptima (alteração da conformação [reversível ou irreversível]).

Com o HCl, a hidrólise ocorre na totalidade (em relação ao tempo de hidrólise considerado). No entanto, a reacção é mais demorada do que a reacção num meio a pH=7 com a α-amilase salivar.

O HCl quebra todas as ligações, enquanto que a enzima é específica para as ligações α-1,4, daí quebrar menos que o ácido.

No entanto, o corante não permite demonstrar isso, já que detecta unidades isoladas que são mais rapidamente obtidas com a enzima que quebra uma ligação específica.

Hidrólise com HCl banho de 95ºC Aumento da energia cinética Fácil “quebra” de ligações.

Enzimas:

Diminuem a energia de activação necessária Catalisadores biológicos Especificidade (centro activo) São mais eficientes que os catalisadores inorgânicos. Têm condições óptimas de acção (T e pH).

Trabalho de Laboratório IV

Diálise

Introdução teórica

A diálise é uma técnica clássica para separar macromoléculas de outros componentes de baixo peso molecular presentes numa solução.

Uma mistura de proteínas e pequenos solutos pode ser separada por diálise através de uma membrana semipermeável. As pequenas moléculas passam através da membrana enquanto que as pequenas ficam retidas.

Na prática, uma mistura de moléculas grandes (ex. proteínas) e pequenas é colocada num saco de diálise sendo posteriormente imerso num grande volume de solvente aquoso (solução de EDTA, NaCl ou mesmo água destilada).

A membrana de diálise contém poros que permitem a passagem de moléculas de água e de pequenos solutos até que o equilíbrio seja atingido, mas não permite a passagem de grandes moléculas.

A separação é realizada pela dimensão dos poros da membrana de diálise. A maioria das membranas de diálise não permite a passagem de moléculas com um peso molecular superior a 5kD.

A eficiência da técnica depende do poro da membrana, da temperatura, da pressão e da natureza do solvente.

Existem membranas com limites de permeabilidade bem definidos e de um modo geral a taxa de diálise é maior em água destilada. No entanto, por vezes é necessária uma solução aquosa com pH e força iónica definidos para estabilizar as moléculas em estudo.

Protocolo e conclusões

Mistura de proteína (albumina) e cloreto de sódio submetida a diálise. O cloreto de sódio atravessa facilmente a membrana, o mesmo não acontecendo com

a proteína.

Teste de detecção da albumina Teste do Biureto (detecta as ligações peptídicas. O sulfato de cobre alcalino reage com compostos das ligações peptídicas originando um complexo violeta)

Teste de detecção do Cloreto de Sódio Teste do Nitrato de Prata (Observa-se a formação de um precipitado branco, cloreto de prata).

O saco de diálise foi previamente preparado fervendo-se previamente durante 15 minutos numa solução de EDTA 2mM.

A experiência consiste em:

Saco A – 10ml de Albumina a 1% com 2,5ml de cloreto de sódio 5M.

Saco B – 10ml de Albumina a 1% e 2,5ml de água destilada.

Submergir os dois sacos de diálise em água destilada. Tirar amostras da água exterior aos 15 minutos (1A, 2A, 1B, 2B) e aos 30 minutos (3A, 4A, 3B, 4B) e no final tirar amostra de dentro dos sacos de diálise (5A, 6A, 5B, 6B).

Tubo Teste do Biureto Teste AgNO3

H20 Azul-claro (ausência)

Transparente (ausência)

A albumina não sai do saco de diálise porque tem dimensões superiores aos poros da membrana.

As substâncias saem de dentro do saco por gradientes de concentração que se estabelecem entre o meio interior e exterior.

Quando a concentração é igual dentro e fora da membrana, a reacção atinge o equilíbrio.

Nesta altura, para continuar a purificar o conteúdo que se pretende, muda-se a água que envolve a membrana, de forma a aumentar o gradiente.

A velocidade da reacção é tanto maior, quanto maior for o gradiente.

Trabalho de Laboratório V

Caracterização cinética da enzima fosfatase ácida

Introdução teórica

Enzima fosfatase ácida (ortofosforico-monoéster fosfohidrolase ácida) é uma enzima pouco específica.

Catalisa a hidrólise de uma grande variedade de monoésteres de fosfato, em condições ácidas, fosfato inorgânico.

O pH óptimo é à volta de 5. Está normalmente presente, em pequenas quantidades, no sangue e em vários tecidos

como o fígado, baço, medula óssea, rins e, principalmente, na próstata. Clinicamente, a isoenzima prostática é a de maior interesse, pois tem sido usada como

marcador tumoral no diagnóstico do cancro da próstata. Neste estudo da actividade desta enzima, utiliza-se um substrato artificial, o p-

nitrofenilfosfato, que é convertido pela enzima em p-nitrofeno e fosfato inorgânico. Em meio básico, o p-nitrofenol origina o ião p-nitrofenolato, que apresenta uma cor

amarela (405nm), permitindo assim a quantificação do produto formado por espectrofotometria e, consequentemente, o estudo da actividade da enzima.

Para determinar as velocidades da reacção, é mais vantajoso utilizar um ensaio em contínuo, isto é, determinar a formação de produto ao longo do tempo, pois isso permite verificar a linearidade da resposta obtida.

Para maior simplicidade, é muito frequente serem usados ensaios com uma medida única a um tempo de reacção fixo.

Neste tipo de estudo, as variáveis analisadas são:

[] de substrato [] da enzima [] de cofactores pH Temperatura [] de inibidores

Objectivos:

Verificar a variação de velocidade da reacção em função da [] de substrato, quer na presença, quer na ausência de inibidor.

Classificar quanto ao tipo de inibição e estabelecer uma comparação entre os inibidores NaF e Na2AsO4.

Protocolo e conclusões

Variação da velocidade em função da [] de substrato

1º - Prepararam-se 8 soluções com PNPP a 9mM, excepto a 1ª para ser usado como branco, com solução tampão e água destilada.

2º - Iniciaram-se as reacções, em intervalos de 1 minuto, adicionando 0,5ml da solução de fosfatase ácida a cada tubo – vórtex – banho a 37ºC.

3º - Após 15 minutos de ter adicionado a enzima ao tubo 1, retirou-se do banho e parou-se a reacção adicionando 5ml de NaOH 0,1M – vortex e fez-se o mesmo para todos os tubos de forma a estarem 15 minutos no banho couvettes absorvância a 405nm usando 1 como branco.

Inibição competitiva e não competitiva

1º - Prepararam-se 8 tubos com PNPP a 9mM, excepto o primeiro, com solução tampão e inibidor (NaF ou Na2AsO4) e água destilada.

2º - Iniciou-se a reacção em intervalos de tempo de 1 minuto, adicionando 0,5ml da solução de fosfatase ácida a cada tubo (= ao de cima)

Resultados:

Converte-se os valores de absorvância das duas 2 experiências em [] molares de PNPP, usando a lei de Lambert-Beer, com ε=1,88 x 10-4mol-1cm-1.

Calcula-se a velocidade da reacção para cada valor de [] de substrato PNPP. Representa-se graficamente as curvas da velocidade da reacção, em função da [] de

substrato, na ausência e na presença de inibidor. Determinou-se o valor de Km e Vmáx, na ausência e na presença de inibidor. Inferir sobre os dois tipos de inibidores.

Cinética das reacções catalisadas por enzimas (modelo de Michaelis-Menten)

E+S K 1→K−1←

ES K 2→E+P

São consideradas apenas velocidades iniciais (praticamente não varia [S]). [ES] está em estado estacionário E reagiu com S e S ainda é mais do que E e K2 < K-1. Em condições de saturação (excesso de substrato), toda a enzima se encontra na

forma de ES e, nestas condições, a velocidade de formação de produtos é máxima. Vmax= K2[ES]

Formação de ES V=K1.[E].[S]

Quebra de ES em E e S V = K-1.[ES]

Quebra de ES em E e P V = K2.[ES]

Equação de Michaelis-Menten

V=Vmax .[S ]Km+[S ]

(Equação de uma hipérbole)

Km:

É constante e, quando < o Km, a enzima precisa de mais substrato para atingir a velocidade máxima.

Define a afinidade da enzima para o substrato (Km pequeno grande afinidade). É característico de uma reacção entre 1 dada enzima e 1 dado substrato.

Vmax:

Depende da concentração de enzima.

Km e Vmax podem ser influenciados por parâmetros como o pH e a temperatura.

Para obter a linearização da lei, basta fazer o inverso da hipérbole, que é uma recta, e obtemos a linearização de Lineweaver-Burk, em que y (1/v) = m(Km/Vmax) . x (1/[S]) + b (1/Vmax)

Inibição reversível:

Competitivao Análogos estruturais do substrato que competem com este para a ligação ao

centro activo.o É possível superar esta inibição adicionando mais substrato.o Não afecta a Vmáx.

Não competitivao Inibidores que se ligam à enzima em locais distintos diferentes de onde se liga

o substrato, logo não competem com este.o Não atinge a mesma velocidade máxima, mesmo que se aumente s [S].o O Km vai ser igual, porque o inibidor não vai impedir a ligação do substrato à

enzima, mas a velocidade máxima vai ser muito pequena.

No trabalho prático era pedido para determinar os valores de absorvância e depois calcular as concentrações molares de PPNP.

A=ε.b.c se a absorvância lida fosse 0,219, substituía-se o A, depois o b por 1, o ε por 1,88x104M-1cm-1 e obtém-se a concentração (neste caso c = 1,16 x 10-5M = 11,6µM)

Depois fazia-se igual para todas as absorvâncias com e sem inibidor.

Depois, procedia-se ao cálculo da velocidade, para cada valor de concentração.

v= c∆ t

Sendo que o tempo são 15 minutos ou 900 segundos.

Para aplicar a equação de Michaelis-Menten foi necessário calcular a concentração de substrato PNPP em mol.

Exemplo tubo 2 CaVa=CbVb 9mM . 0,025ml (usado p/ fazer a solução) = Cf . 4,005ml

Cf=0,056mM

Fez-se o mesmo para os restantes tubos e ficou-se assim com a [S].

Traçou-se então o gráfico de Michaelis-Menten e pode-se verificar que:

Deu-se um aumento brusco da velocidade no início que depois suaviza. A curva sem inibidor é a que apresenta 1 aumento mais acentuado. A velocidade de reacção com inibidor NaF é superior à velocidade da reacção com

inibidor Na2AsO4.

o A relação de Michaelis-Menten pode ser, algebricamente, transformada numa expressão linear, o que facilita a análise e interpretação de gráficos. Basta substituir ambos os lados da equação pelo seu inverso e tem-se a linearização de Lineweaver-Burk.

Para se traçar o gráfico de Lineweaver-Burk.

Calculou-se o inverso de [S] e o inverso da velocidade, para todos os tubos. Assim, podemos calcular o valor de Km e de Vmáx. Y(1/v)=m(Km/Vmax) . x(1/[S]) + b(1/Vmáx). Os valores de Km das soluções sem inibidor e com inibidor NaF são iguais. Com o aumento de [S], a velocidade da reacção catalisada também aumeta, até ao

momento em que os centros activos ficam todos preenchidos. A utilização de inibidores vai afectar a reacção, inibindo a velocidade da mesma. Inibidor NaF é não competitivo, pois possui um Km semelhante ao da solução sem

inibidor e uma Vmax inferior à do sem inibidor. (liga-se ao centro alostérico, diminui a velocidade porque altera a conformação da proteína)

Inibidor Na2AsO4 é um inibidor competitivo, pois o seu Km é superior ao da solução sem inibidor e as velocidades máximas são iguais. Este inibidor compete com o substrato pelo mesmo centro activo. A velocidade máxima normal pode ser atingida aumentando a concentração de substrato.

Seminário I

Métodos de Estudo de Proteínas

Introdução teórica

Uma determina proteína num fluido biológico precisa de ser purificada antes de ser estudada ou utilizada.

Estudar e trabalhar com proteínas o Separaro Purificaro Quantificaro Caracterizar

Peso Molecular Composição em aminoácidos Sequência Estrutura Função

Purificação de proteínaso Uma proteína tem de ser isolada e purificada para que possa ser caracterizada

quanto à sua composição em aminoácidos e outros: sequência, estrutura tridimensional e função.

Tecido com células em suspensão

Ultra-sons(Extrusão)

Detergente(Homogeneizador

Potter)

Proteínas isoladas

o Cada passo da purificação deve remover a maior parte das proteínas presentes e reter a maior quantidade possível de proteína de interesse.

o As proteínas podem ser isoladas de um tecido animal ou de células microbiais.

Abordagem geral quanto ao isolamento de proteínas

Homogeneização do tecido e disrupção da membrana celular Libertação das proteínas, organitos e agregados na solução [EXTRACTO CELULAR].

Separação de organitos e/ou agregados moleculares para isolamento da fracção contendo a proteína de interesse – centrifugação diferencial

Aplicação clínica Os laboratórios clínicos utilizam a separação de proteínas dos fluidos biológicos no seu dia-a-dia de forma a diagnosticarem os pacientes, assim as proteínas do plasma sanguíneo são analisadas rotineiramente por electroforese de fase gel.

Processos de separação

Com base na concentração salinaa) “Salting Out” – Adição de uma determinada concentração de sais bivalentes (ex.

sulfato de amónio) a uma solução de uma mistura de proteínas, que induz a precipitação de algumas proteínas ficando em solução as proteínas solúveis para a concentração de sal adicionado. É normalmente o primeiro passo de purificação de proteínas. Uma fracção de proteínas que precipitam entre as duas concentrações de sal diferentes, podem ser utilizadas para posteriores purificações.

b) “salting in” – algumas proteínas requerem iões inorgânicos para serem solúveis em água. Uma diálise extensiva contra uma solução com baixa concentração salina pode induzir a precipitação de determinadas proteínas numa mistura original.

Com base na dimensão moleculara) Diálise – Uma mistura de proteínas e pequenos solutos pode ser separada por diálise

através de uma membrana semipermeável. As pequenas moléculas passam enquanto que as grandes ficam retidas.

a. A solução de proteína é introduzida num saco de celofane sendo posteriormente mergulhada numa solução (EDTA, NaCl, água destilada…). A membrana de diálise contém poros que não permitem a passagem de moléculas com um peso molecular superior a 5kD.

b) Ultracentrifugação – A centrifugação a grandes velocidades permite separar uma solução de proteínas em múltiplos componentes.

a. Processo – A velocidade a que uma proteína sedimenta numa ultracentrifuga depende do seu tamanho e forma. Para proteínas com uma forma semelhante, quanto maior o peso molecular mais rápida a sedimentação.

b. As unidades em que se expressam os valores obtidos nos estudos de sedimentação são os Syedburg (S) que é igual à constante de sedimentação (s) vezes 1013.

c) Filtração em fase de gel (Cromatografia de exclusão molecular)a. Processo – A filtração em gel utiliza colunas de polímeros de hidratos de

carbono insolúveis mas extremamente hidratados na forma de esferas porosas. As pequenas moléculas entram nos poros no entanto as grandes moléculas não entram nos poros. Desta forma, o volume de solvente disponível (Vd) para as pequenas moléculas é superior ao volume disponível para as grandes moléculas, pelo que as pequenas passam pela coluna mais lentamente.

b. A velocidade com que a molécula passa através de uma coluna é dependente do seu tamanho e forma.

c. Utilização. A filtração em gel é utilizada na determinação do peso molecular de uma proteína bem como na separação de proteínas (o tipo de polímeros utilizados nas colunas variam conforme o tamanho das moléculas que queremos separar).

Com base na carga molecular

a) Cromatografia de troca iónicaa. Descrição – As proteínas vão ligar-se à resina de troca iónica da coluna. A força

de ligação de uma proteína à resina depende da quantidade de resíduos disponíveis da proteína para interactuarem com a resina de troca iónica.

b. Processo – Utiliza-se uma coluna de material de troca iónica insolúvel contendo grupos polianiónicos ou policatiónicos. A um pH apropriado os grupos poliónicos agrupam-se a grupos com carga oposta às proteínas por interacções iónicas.

i. A eluição das proteínas da resina é geralmente realizada por lavagem com soluções salinas que quebram as interacções electrostáticas das proteínas com a resina de troca iónica.

ii. Se for aplicado um aumento gradual da concentração de sal à coluna, as proteínas ligadas mais fracamente à resina de troca iónica são eluidas primeiro que as proteínas fortemente ligadas à coluna.

b) HPLC – High Performance Liquid Chromatographya. Descrição – HPLC é similar à cromatografia de troca iónica e a outros métodos

cromatográficos nos quais as soluções de proteínas atravessam uma coluna de resinas especiais com resíduos laterais, os quais interactuam ionicamente ou hidrofobicamente com as proteínas.

b. Processo – O HPLC difere das cromatografias convencionais pelo facto de ser realizada a pressões muito elevadas. Este tipo de cromatografia a alta pressão é um processo mais rápido e com melhor resolução que as cromatografias a baixas pressões.

c) Electroforesea. Descrição – Os métodos que utilizam um campo eléctrico de forma a induzir

um movimento de qualquer molécula com carga são chamados de electroforese.

b. Processoi. Num campo eléctrico, as proteínas migram numa direcção

determinada pela sua carga líquida da molécula. A carga líquida da proteína é determinada pela natureza dos grupos ionizáveis e pelo pH da solução.

ii. Para cada proteína, existe um valor de pH, chamado o ponto isoeléctrico, no qual as proteínas não têm carga líquida pelo que não se movem no campo eléctrico.

iii. Para valores de pH abaixo do ponto isoeléctrico, a proteína adquire carga positiva movendo-se para o pólo negativo (cátodo). Para valores de pH acima do ponto isoeléctrico o comportamento das proteínas é oposto.

iv. A migração das proteínas num campo eléctrico está relacionada com a sua razão carga/massa.

c. Procedimentos electroforéticosi. Electroforese em gel

1. Este tipo é vulgarmente utilizado em laboratórios de análise para separar as proteínas do plasma com a finalidade de diagnosticar pacientes. A separação é realizada aplicando um campo eléctrico à amostra a um determinado pH, de forma que as proteínas são separadas de acordo com a sua relação carga/massa e forma.

ii. Refocagem isoeléctrica1. Na refocagem isoeléctrica, ácidos poliaminopolicarboxilicos

com valores de pI conhecido são utilizadas para criar um gradiente de pH no campo eléctrico. Uma proteína migra para a parte do gradiente que tem o mesmo pI que a proteína. Esta técnica é muito utilizada para separar proteínas com pI muito próximo.

iii. Electroforese de SDS gel de poliacrilamida1. Procedimento realizado num gel de poliacrilamida na presença

do detergente SDS e de um agente redutor. Separar com base no peso molecular das proteínas. O SDS desnatura as proteínas enquanto que o agente redutor quebra as pontes dissulfito.

2. Devido ao facto de o SDS formar micelas carregadas negativamente, o efeito de carga das proteínas perde-se enquanto que devido à desnaturação as proteínas ficam todas com a forma de bastão. Assim, as micelas de SDS-proteínas são separadas de acordo com o seu peso molecular.