CaCa2+2+-ATPase e Produção de -ATPase e Produção de CalorCalor
Daniel M B Lima
IntroduçãoIntrodução Retículo Sarcoplasmático (RS): Principal reservatório
intracelular de Ca2+ em músculo esquelético; SERCA: bombeia Ca2+ para o interior do RS, as custas
de ATP.
IntroduçãoIntrodução Duas regiões distintas, morfologicamente e
funcionalmente:◦ Túbulos longitudinais
Fração leve (LSR); Enriquecida em Ca2+-ATPase;
◦ Cisternas terminais Fração Pesada (HSR); Contato Direto com os Túbulos T.
IntroduçãoIntrodução
IntroduçãoIntrodução SERCAs: Conversão de energia química liberada na
quebra do ATP em energia osmótica (transporte de Ca2+) e produção de calor (termogênese);
SERCA 1◦ Produz mais calor durante a hidrólise do ATP do que
qualquer outra SERCA;◦ Encontrada, predominantemente, em musculatura
esquelética branca e tecido adiposo marrom.
IntroduçãoIntrodução SERCA 1: Ciclo catalítico, 2 vias:
◦ Acoplada: Transporte de Ca2+ + Liberação de Calor◦ Desacoplada: Liberação de Calor
◦ A via desacoplada é muito importante na produção de calor, tanto em grandes mamíferos quanto humanos adultos;
◦ Em hipotireoidismo e exposição ao frio, duas condições que afetam a termogênese, a expressão de SERCA 1 está aumentada.
IntroduçãoIntrodução Evidências têm mostrado que o K+ afeta passos
intermediários do ciclo catalítico da SERCA 1; O presente artigo explora os efeitos do K+ na
atividade termogênica da SERCA 1.
MetodologiaMetodologia◦ Foram utilizadas vesículas leves e pesadas de retículo
sarcoplasmático isoladas de músculo branco de membro posterior de coelhos.
◦ Antes do uso as vesículas foram diluídas em tampão adequado, para dar 4µM de Ca2+ livre
Captação de Ca2+
◦ Traços de 45Ca foram incluídos no meio◦ O meio foi filtrado e a radiação remanescente nos filtros
foi avaliada por cintilação liquida.◦ Para os experimentos de efluxo, as vesículas foram pré-
carregadas com cálcio, e com o equilíbrio alcançado, KCl foi adicionado ao meio.
MetodologiaMetodologia Atividade ATPásica
◦ Medição da liberação de 32Pi de [γ-32P]ATP.◦ A reação foi interrompida com TCA e o [γ-32P]ATP não
hidrolisado foi retirado com carvão ativado◦ Duas diferentes ATPases
Dependente de Mg2+, medida na presença de EGTA Dependente de Ca2+, descontando a atividade da anterior
Calor da Reação◦ Calorímetro◦ A Entalpia calorimétrica (ΔHcal ) foi calculada dividindo-se a
quantidade de calor liberado pela quantidade de ATP hidrolisado Valores negativos: reação exotérmica Valores positivos: reação endotérmica
MetodologiaMetodologia Procedimento Experimental
◦ Todos os experimentos foram realizados a 35ºC◦ Durante um experimento típico, o meio utilizado nos
ensaios é dividido em 3 amostras que são utilizadas simultaneamente para avaliação da captação de Ca2+, hidrólise de ATP e liberação de calor
◦ Inibidor de ATP sintase foi utilizado a fim de se evitar possível interferência devido a contaminação.
ResultadosResultados Efeito do KCl na captação de Ca2+ pela SERCA 1
ResultadosResultados
ResultadosResultados O efeito observado está relacionado ao cátion (K+) ou
ao ânion (Cl-)?
ResultadosResultados Efeito do KCl no efluxo de Ca2+
Resultados KCl provoca diminuição da concentração de equilíbrio
de Ca2+
◦ Inibição da atividade de Ca2+-ATPase? Não
ResultadosResultados Correlação entre as taxas de hidrólise de ATP e
produção de calor◦ Estudos anteriores demonstraram que:◦ (i) Em leaky LSRs, que não conseguem acumular Ca2+
durante a hidrólise de ATP, a quantidade de calor liberado por mol de ATP clivado é 50% menor que em vesículas intactas que acumulam Ca2+.
◦ (ii) Ao contrário, a ΔHcal da hidrólise de ATP não é modificada pelo acúmulo de Ca2+ em HSRs
◦ Esses ensaios, realizados em meio contendo KCl, foram confirmados.
ResultadosResultados Utilizando meio sem KCl
O calor liberado por molécula de ATP clivada é maior.
ResultadosResultados Efeitos da Valinomicina na captação de Ca2+ e na
produção de calor
ResultadosResultados
DiscussãoDiscussão Receptores de rianodina interagem com receptores de
diidropiridina e essa interação física parece ser necessária para o acoplamento excitação-contração que ocorre em células musculares de mamíferos;
Enquanto o potencial de ação se propaga pelo Túbulo T também ocorre uma mudança nas concentrações de Na+ e K+ nas junções comunicantes entre esses túbulos e o RS;
Variações nas concentrações destes íons nessa região podem ser importantes para aumentar o efluxo de Ca2+ na cisterna terminal;
Alguns estudos já demonstraram que Na+ e K+ interagem com o receptor de rianodina, aumentando sua permeabilidade ao Ca2+.
DiscussãoDiscussão Devido a localização desse receptor predominantemente em
HSR, o efeito do K+ na liberação de Ca2+ poderia ser atribuido à ligação do K+ no receptor de rianodina;
Entretanto, isso não explica a diferença na atividade termogênica encontrada entre vesículas LSR e HSR;
Alguns estudos já sugeriram que o K+ se liga a Ca2+ ATPase e altera passos do seu ciclo. De fato, o presente trabalho mostrou alterações na atividade ATPásica, tanto em HSR quanto LSR
Outras proteínas associadas, no HSR. O aumento de K poderia interferir nestas proteínas, que por sua vez atuariam concomitantemente na Receptor de Rianodina e na SERCA
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