Lisboa, 2009
Orientador: Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista
Co-orientador: Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar
Tiago Monteiro Lomba Viana
CARACTERIZAÇÃO BIOENERGÉTICA DE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE EM FERMENTAÇÃO VINÁRIA
Júri:
Doutor Virgílio Borges Loureiro, Professor Associado do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa.
Doutor José Martínez Peinado, Professor Catedrático da Facultad de Ciencias Biologicas da Universidad Complutense de Madrid, Espanha.
Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias, Professora Catedrática Convidada do Instituto Superior de Agronomia da Univesidade Técnica de Lisboa.
Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista, Investigadora Auxilar do Instituto Superior de Agronomia da Universiadade Técnica de Lisboa.
Presidente:
Vogais:
i
AGRADECIMENTOS
Terminada esta etapa da minha formação académica, gostaria de expressar o meu
reconhecimento e referir as pessoas e instituição que contribuíram para este trabalho, sem
as quais muito dificilmente teria sido levado a cabo.
As minhas primeiras palavras de agradecimento são dirigidas à Professora Doutora Maria
da Conceição Loureiro Dias, a quem devo grande parte do meu interesse no mundo da
Microbiologia, guiando os meus primeiros passos neste ramo da Ciência, mostrando-me o
seu encanto e incentivando o meu entusiasmo. Foi um enorme privilégio ter iniciado a minha
vida de investigação científica na sua equipa e poder contar com a sua sapiência. O seu
contributo não foi apenas importante no progresso deste trabalho, mas foi igualmente
essencial na minha formação científica/pessoal durante este tempo.
Gostaria de expressar à Doutora Catarina Prista o meu sincero agradecimento por tudo a
que este ano inesquecível diz respeito. Começo por lhe agradecer a sua amizade e o facto
de me ter recebido tão bem no laboratório, proporcionando-me todas as condições que se
podem desejar quando se desenvolve um trabalho desta natureza. A orientação de
excelência com que conduziu este trabalho, o acompanhamento incondicional das diferentes
etapas e a sua disponibilidade inolvidável em ajudar, discutir e iluminar todas as minhas
dúvidas e dificuldades foram inexcedíveis… Muito obrigado!
Um agradecimento especial também aos colegas de laboratório (Vanessa Salvador, Luís
Leitão, Ana Madeira e Maria José) e à equipa da Cooking Lab (Susana Dias e Joana
Moura), com quem aprendi muito e de tudo um pouco. Todos foram responsáveis por terem
tornado este local de trabalho único, repleto de companheirismo, boa-disposição e óptimo
espírito. No entanto, gostava de agradecer em especial à Vanessa e ao Luís, pela ajuda
concedida e pelos conhecimentos partilhados que permitiram, em determinados momentos
deste trabalho, formar teorias verdadeiramente hilariantes e revolucionárias. Não podia
deixar de agradecer às equipas dos laboratórios de Microbiologia e de Fisiologia, pela
cooperação e amizade concedidas. Em particular, ao André Barata por ter esclarecido as
minhas dúvidas relativas à ecologia de leveduras.
Ao Instituto Superior de Agronomia agradeço as facilidades concedidas para a realização
deste trabalho, bem como a oportunidade de, ao longo do curso, me ter cruzado com
diversos professores e colegas que, de uma forma directa ou indirecta, me marcaram e
contribuíram na minha formação académica/pessoal.
Finalmente os últimos e mais especiais agradecimentos à minha família e à Joana, por
tudo o que fizeram por mim, pertencendo-lhes também este meu caminho e trabalho. Ao
longo de todo este tempo, tem sido vital o apoio incondicional e a compreensão inexcedível
ii
dos meus pais e avó. São eles os verdadeiros responsáveis pelo trabalho diário nos
bastidores. Aos meus irmãos e famílias respectivas agradeço todo o apoio que me têm dado
ao longo do tempo. À Joaninha, minha fonte de inspiração, queria agradecer-lhe
profundamente o estar comigo nos momentos mais importantes da minha vida, desafiando-
me e apoiando-me constantemente. Obrigado por seres quem és e como és!
Muito obrigado a todos,
_____________________________________________
iii
RESUMO
Caracterização Bioenergética de Saccharomyces cerevisiae em Fermentação Vinária.
A fermentação vinária constitui um processo complexo ao longo do qual as leveduras são
sujeitas a vários tipos de stresse (pressão osmótica, etanol, pH baixo, esgotamento de
nutrientes, temperatura). O trabalho realizado avaliou o comportamento da estirpe industrial
de Saccharomyces cerevisiae ISA1000 durante fermentações em mosto de uva branca, a
15ºC e a 30ºC, simulando condições reais em adega. Determinou-se o pH intracelular (pHin),
e o efluxo e influxo de protões, em células cultivadas às duas temperaturas, como
indicadores de actividade catabólica e de permeabilidade a H+ da membrana plasmática. As
células foram recolhidas em diferentes fases da fermentação. Avaliou-se também o efeito do
etanol no efluxo e influxo de H+, às duas temperaturas.
Os resultados mais relevantes foram observados a 15ºC, em fase estacionária. Nestas
condições, S. cerevisiae ISA1000 evidenciou pHin baixo (pHin≈5), incapacidade de expulsar
H+ e muito baixa permeabilidade da membrana plasmática aos mesmos. A 30ºC, na mesma
fase, a mesma estirpe revelou-se pouco permeável a H+ e com baixa capacidade de os
expulsar, mantendo, no entanto, um valor de pHin mais elevado (pHin≈6). Para ambas as
temperaturas, observou-se um menor efeito do etanol na permeabilidade de membrana para
células em fase estacionária.
Palavras-chave: Fermentação vinária, etanol, temperatura, membrana plasmática,
permeabilidade, pH intracelular.
*Orientador: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Universidade Técnica de Lisboa
iv
ABSTRACT
Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.
Wine fermentation is a complex process, during which yeast cells are submitted to a
number of adverse stress conditions (osmotic pressure, low pH, ethanol, nutrient limitation
and starvation, temperature). In this work, the performance of the industrial strain
Saccharomyces cerevisiae ISA1000 was evaluated during white grape must fermentations,
at 15ºC and 30ºC, in experiments simulating real winery conditions. Intracellular pH (pHi),
proton influx and proton extrusion through the plasma membrane were measured, at both
temperatures, as indicators of cell catabolic activity and plasma membrane permeability.
Cells were harvested at different stages throughout fermentation. The effect of ethanol on
proton extrusion and proton influx was evaluated at the same temperatures.
The most relevant results were obtained at 15ºC, in stationary phase. Under these
conditions, S. cerevisiae ISA1000 exhibited low pHi (pHi≈5), inability to extrude H+ and very
low H+ permeability. At 30ºC, at the same fermentation stage, the cells presented low H+
permeability and low H+ extrusion capacity, although they had a higher pHi (pHi≈6) than at
15ºC. For both temperatures, the effect of ethanol on H+ permeability was less evident in
stationary phase cells.
Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability,
intracellular pH.
*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon
v
ABSTRACT
Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.
Wine fermentation is a complex ecological and biochemical process. Though grape must
is relatively complete in nutrients content, it can support the growth of only a limited number
of microbial species due to its adverse conditions such as low pH, high sugar content,
pesticide residues and presence of SO2. The selectivity of fermenting must is further
strengthened by oxygen limitation, depletion of certain nutrients and increasing ethanol
concentrations.
This work was part of a project with the broad objective of improving the production/quality
of wine, as far as it depends on yeast fermentation. Specifically, the present work aimed to
characterize yeast proton homeostasis during must fermentation under experimental
conditions simulating real winery conditions for white wine and red wine production.
To accomplish this goal, an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae (ISA1000),
isolated from a commercial starter (FERMIVIN) was used. This strain was grown in white
grape must, under experimental conditions simulating a real winery, at 15 and 30ºC,
temperatures commonly used for white wine and red wine production, respectively.
Six different growth situations were selected for 15ºC: the beginning, the middle and the
final of exponential growth phase, the beginning and the middle stationary growth phase and
the end of fermentation (when no sugar was detected by standard methods). For 30ºC, the
same situations were chosen, except the first sample point. Results were compared with the
same strain grown at the same temperatures in mineral medium, 2% glucose (usual lab
conditions). To evaluate the efficiency of proton homeostasis, intracellular pH, proton
extrusion and proton influx through the plasma membrane were measured at both
temperatures. The effect of ethanol on proton extrusion and proton influx was also evaluated
at the same temperatures for the same cells.
Intracellular pH was assessed through the relative distribution of the non-metabolizable
substrate [7-14C] benzoic acid. Up to the end of the exponential phase, pHi was very similar
for both temperatures (between 6.1 and 6.4). Nevertheless, during the stationary phase,
mainly at 15ºC, a pronounced drop occurred in pHi, reaching pH 5.0 at the end of
fermentation. At 30ºC only a minor drop occurred (pHi 5.8 at the end of fermentation).
Proton influx and proton extrusion were measured in unbuffered cell suspensions, with a
standard pH meter connected to a recorder. H+ extrusion was calculated as the rate of
increase of the concentration of extracellular protons. The acidification curve is the result of
the H+ movements in both directions across the plasma membrane. Considering that H+
vi
extrusion is mainly due to the ATPase activity, results showed that, in general, H+ efflux rate
was higher at 30ºC than at 15ºC (for all the fermentation stages). At both temperatures, a
stronger inhibition of H+ efflux by ethanol was also noticed in exponential phase cells than in
stationary phase cells.
The rate of proton influx was calculated as the rate of the decrease of the concentration of
extracellular protons. All experiments were performed in the presence of 2-deoxy-D-glucose
and antimycin to minimize H+ movements created by the plasma membrane ATPase activity.
Comparing the slope of the curves at each temperature, differences were observed. At 15ºC,
in early fermentation stages (up to the end of the exponential phase), the H+ permeability was
high (≈0.4 mmol.g-1.h-1) and quite sensitive to the presence of ethanol (16-18% ethanol).
Nevertheless, during the stationary phase, cells presented very low H+ permeability, not
affected by ethanol present in the assay (up to 20%). At 30ºC, in general, the H+ permeability
was higher than at 15ºC, mainly at early stages, and once again ethanol increased the rate of
H+ influx.
Summarizing the most relevant results:
• The end of exponential phase represents a threshold, and the cells became much
less permeable to protons;
• This effect was more pronounced at 15ºC;
• This impermeability occurred even when ethanol was present in the assay (0-20%
ethanol);
• At 15ºC during the stationary phase the intracellular content was more acidic,
reaching pH 5.0 by the end of fermentation;
• Fermentation proceeded under these conditions up to sugar exhaustion.
These results open new gates for research on yeast performance during late stages of
wine fermentations.
Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability,
intracellular pH.
*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon
vii
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................ i
RESUMO ............................................................................................................................................... iii
ABSTRACT ............................................................................................................................................ iv
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. x
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ xi
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................. xiii
1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................................... 1
1.1. Apresentação e enquadramento do tema ........................................................................ 1
1.2. Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................. 2
1.2.1. Classificação taxonómica ............................................................................................ 2
1.2.2. Estrutura da célula ........................................................................................................ 4
1.2.2.1. Membrana plasmática .............................................................................................. 4
1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática ............................................................. 5
1.2.2.1.2. Fluidez de membrana .......................................................................................... 5
1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar ........................................................................................ 6
1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae ................................................. 9
1.3.1. Bioquímica do processo .............................................................................................. 9
1.3.2. Produtos secundários ................................................................................................ 10
1.4. Fermentação vinária........................................................................................................... 11
1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária ..... 12
1.4.1.1. Etanol ........................................................................................................................ 12
1.4.1.2. Temperatura ............................................................................................................ 17
1.4.1.3. Disponibilidade de oxigénio .................................................................................. 21
1.4.2. Respostas ao stresse ................................................................................................. 22
1.4.3. Biodiversidade de leveduras ..................................................................................... 24
1.5. Objectivos da dissertação ................................................................................................. 27
2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 28
2.1. Microrganismo ..................................................................................................................... 28
2.2. Meios de cultura .................................................................................................................. 28
2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras ....................................................... 29
2.3.1. Manutenção das culturas .......................................................................................... 29
2.3.2. Quantificação de biomassa ....................................................................................... 29
viii
2.3.2.1. Acompanhamento das culturas ............................................................................ 29
2.3.2.2. Peso seco ................................................................................................................ 29
2.3.3. Preparação do pré-inóculo ........................................................................................ 30
2.3.4. Ensaios em meio mineral .......................................................................................... 30
2.3.5. Ensaios em mosto estéril .......................................................................................... 30
2.3.6. Pontos de amostragem .............................................................................................. 30
2.4. Ensaios preliminares de crescimento .............................................................................. 31
2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral ................................................................... 31
2.4.2. Ensaios preliminares em mosto ............................................................................... 31
2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos .................................................. 31
2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento ................................................. 32
2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto ................................................. 32
2.5.1. Base do método .......................................................................................................... 32
2.5.2. Procedimento experimental ...................................................................................... 32
2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto .................................................... 33
2.6.1. Base do método .......................................................................................................... 33
2.6.2. Procedimento experimental ...................................................................................... 34
2.7. Determinação do pH intracelular ...................................................................................... 35
2.7.1. Base do método .......................................................................................................... 35
2.7.2. Características das soluções utilizadas .................................................................. 36
2.7.3. Procedimento experimental ...................................................................................... 37
2.7.3.1. Ensaios em meio mineral ...................................................................................... 37
2.7.3.2. Ensaios em mosto .................................................................................................. 38
2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da membrana a H+ .............. 40
2.8.1. Base do método .......................................................................................................... 40
2.8.2. Procedimento experimental ...................................................................................... 40
2.8.2.1. Preparação das suspensões de células ............................................................. 41
2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada ................... 41
2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares............ 42
2.9. Avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de H+ através da membrana plasmática 42
2.9.1. Base do método .......................................................................................................... 42
2.9.2. Procedimento experimental ...................................................................................... 42
2.9.2.1. Preparação de suspensões de células ............................................................... 42
ix
2.9.2.2. Ensaio experimental a diferentes temperaturas ................................................ 42
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 44
3.1. Ensaios preliminares .......................................................................................................... 44
3.1.1. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC ................... 45
3.1.1.1. Avaliação dos parâmetros de crescimento da estirpe ...................................... 45
3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos do mosto ........................................ 47
3.1.2. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC ................... 51
3.1.2.1. Avaliação de parâmetros de crescimento ........................................................... 51
3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos ......................................................... 52
3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos .............................................................................. 55
3.2.1. pH intracelular ............................................................................................................. 56
3.2.1.1. Em meio K ............................................................................................................... 56
3.2.1.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 60
3.2.2. Efluxo de H+ através da membrana plasmática ..................................................... 62
3.2.2.1. Em meio K ............................................................................................................... 63
3.2.2.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 64
3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões ........................................... 68
3.2.3.1. Em meio K ............................................................................................................... 68
3.2.3.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 69
3.2.3.2.1. Células suspensas e incubadas em água desmineralizada ........................ 69
3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões ................................................ 71
3.3. Discussão Geral .................................................................................................................. 72
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................. 79
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 81
ANEXO I .............................................................................................................................................. 99
ANEXO II ........................................................................................................................................... 100
ANEXO IV .......................................................................................................................................... 103
ANEXO V ........................................................................................................................................... 104
ANEXO VI .......................................................................................................................................... 106
ANEXO VII ......................................................................................................................................... 108
ANEXO VIII ........................................................................................................................................ 110
x
LISTA DE TABELAS
Nº Legenda Pág. 1 Classificação taxonómica de Saccharomyces cerevisiae. 2
2 Metabolitos presentes durante a fermentação alcoólica. 10
3 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 33
4 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 34
5 Dados utilizados nos ensaios de pHin. 39
6 Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações conduzidas a 15ºC.
46
7 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 15ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.
50
8 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.
54
9 Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.
61
10 Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para vinificação FERMIVIN®.
99
11 Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) 100
12 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC. 103
13 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC. 103
14 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 15ºC.
104
15 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 30ºC.
105
16 pHin de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral e em mosto estéril. 106
17 pHin de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 30ºC em meio mineral e em mosto estéril. 107
18 pHin de S. cerevisiae W-303, cultivada a 15ºC e a 30ºC em meio mineral. 107
19 Velocidades de efluxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC.
108
20 Velocidades de efluxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC.
109
21 Velocidades de influxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC.
110
22 Velocidades de influxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC.
111
xi
LISTA DE FIGURAS
Nº Legenda Pág. 1 (a) Saccharomyces sp. observada através de microscopia de contraste de fase,
ampliação de 1000x (b) Constituição de uma célula de levedura. 4
2 Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H+-ATPase membranar.
6
3 Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol.
10
4 Representação das etapas de consumo de O2 na biossíntese de ergosterol.
21
5 Representação da transmissão de sinais ambientais através duma rede interligada de vias de transdução de sinais numa célula de levedura.
24
6 Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de composto radioactivo presente no meio intracelular.
38
7 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4.
40
8 Representação do equipamento utilizado na medição da velocidade do movimento de H+ através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000.
40
9 Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade a H+ da membrana plasmática.
41
10 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.
42
11 Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico.
43
12 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC.
45
13 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC.
47
14 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 15ºC.
50
15 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC
51
16 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.
53
17 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 30ºC.
55
18 Valores medidos para pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, cultivada em meio K, utilizando [1-14C] ácido propiónico.
57
19 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 15ºC, utilizando [1 - 14C] ácido propiónico ou [7-14C] ácido benzóico.
58
20 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 30ºC, utilizando [1-14C] ácido propiónico ou [7-14C] ácido benzóico.
58
21 pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K, a 15ºC e a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.
59
22 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.
60
23 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.
61
24 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K, a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
63
xii
25 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
64
26 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
66
27 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
68
28 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
69
29 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
70
30 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 15ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.
71
31 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 30ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.
72
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABREVIATURAS DESIGNAÇÕES COMPLETAS
∆ψ gradiente electroquímico
∆pH gradiente protónico
ºC graus Celsius
ADP adenosina-5’-difosfato
AMP adenosina-5’-monofosfato
ATP adenosina-5’-trifosfato
Cf concentração final
CPM contagens por minuto
D.O.640nm densidade óptica medida a λ=640nm
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
Final exp. final da fase exponencial /
início da fase de desaceleração
Final ferm. fase final de fermentação
GBq gigabecquerel
Iníc. est. início da fase estacionária
Iníc. exp. início da fase exponencial
MBq megabecquerel
mCi microcurie
Meio est. meio da fase estacionária
Meio exp. meio da fase exponencial
rL/L reagente rLuciferase/Luciferina
pHin pH intracelular
Pi fosfato inorgânico
p.s. peso seco
p/v peso por volume
RLU unidades relativas de luminometria
r.p.m. rotações por minuto
TCA ácido tricloro-acético
Tmaxf temperatura máxima final de crescimento
Tmaxi temperatura máxima inicial de crescimento
Top temperatura óptima de crescimento
Tris 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol
UFC unidades formadoras de colónias
UV ultravioleta
v.q.p.r.d. vinhos de qualidade produzidos em
regiões determinadas
YPD yeast extract peptone dextrose
INTRODUÇÃO GERAL
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Apresentação e enquadramento do tema
Durante a fermentação vinária as leveduras são expostas simultanea e sequencialmente
a uma gama muito variada de situações de stresse [Querol et al., 2003; Zuzuarregui & Olmo,
2004], que podem induzir múltiplas alterações no estado fisiológico das células, afectando o
crescimento, a capacidade fermentativa, a capacidade metabólica e a viabilidade celular
[Pérez-Torrado et al., 2005]. O mosto de uva representa a primeira situação de stresse,
devido ao seu elevado teor de açúcar (stresse osmótico), baixo pH, frequente carência de
nutrientes (e.g. azoto assimilável, vitaminas) e presença de agentes antimicrobianos (e.g.
resíduos de pesticidas, cobre e enxofre) [Carrasco et al., 2001; Querol et al., 2003;
Zuzuarregui & del Olmo, 2004]. Além disso, é-lhe frequentemente adicionado dióxido de
enxofre (SO2), como antioxidante e antisséptico, contribuindo para a criação de um ambiente
ainda mais adverso para as leveduras. Durante a fermentação vinária, as células estão
sujeitas à diminuição do teor de açúcar, ao abaixamento do pH extracelular e ao aumento do
teor de álcool e de CO2 e ao aumento da temperatura, que intensificam os efeitos das outras
formas de stresse referidas. Por estas razões, o estado fisiológico das leveduras altera-se
profundamente durante o processo. Inicialmente ocorre crescimento, em regra durante 7-8
duplicações. Com o decorrer da fermentação, a taxa de crescimento baixa, a cultura entra
em fase estacionária, decorrendo a maior parte do processo fermentativo com células nesta
fase (resting cells).
Embora tenham sido bem estudadas a fisiologia e a genética de estirpes laboratoriais de
Saccharomyces cerevisiae, a maior parte deste conhecimento tem sido obtido em condições
laboratoriais e com leveduras em fase exponencial de crescimento, nem sempre sendo
possível extrapolar tal informação para explicar o desempenho da levedura na vinificação.
Estudos prévios realizados no laboratório de Bioenergética Microbiana permitiram avaliar o
desempenho de uma estirpe industrial de S. cerevisiae durante fermentações a 25ºC, em
mosto real, confirmando a ideia de que o estado fisiológico das células em fase estacionária
é muito diferente do das células em fase exponencial. Particularmente interessantes foram
os resultados obtidos para o pH intracelular (pHin) e para os fluxos de protões para e do
interior das células que apontaram para um papel relevante de homeostase protónica na
tolerância ao etanol das células nas últimas fases de fermentação. Os ensaios foram
realizados paralelamente em meio mineral, de forma a permitir a comparação mais fiável
entre os dados obtidos e os dados da literatura [C. Prista, comunicação pessoal].
O presente trabalho surge enquadrado no projecto atrás mencionado procurando-se,
neste caso, dar um novo passo no sentido de aproximar as condições experimentais em
INTRODUÇÃO GERAL
2
laboratório e as condições reais em adega. Para tal, realizaram-se fermentações a
temperaturas normalmente utilizadas para a obtenção de vinho branco (15ºC) e de vinho
tinto (30ºC). Propusemo-nos estudar o comportamento fermentativo da mesma estirpe de S.
cerevisiae às temperaturas referidas, analisando diversos parâmetros fisiológicos (pHin,
efluxo de protões através da membrana plasmática e permeabilidade da mesma aos
protões) que poderão influenciar a capacidade da estirpe para manter a sua viabilidade e a
regulação da sua homeostase protónica.
1.2. Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae é uma espécie de levedura utilizada há milhares de anos na
panificação e na fermentação de bebidas alcoólicas, sendo a levedura fermentativa por
excelência, tendo sido utilizada igualmente nos últimos anos para produção de bioetanol. É
também muito importante como organismo modelo [Ostergaard et al., 2000], quer em
estudos fisiológicos (efeitos de diversos tipos de stresse - osmótico, oxidativo, etanol e
ácidos fracos), quer na área de Biologia Celular e Molecular, sendo o microrganismo
eucariótico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser sequenciado [Williams,
1996].
1.2.1. Classificação taxonómica
A classificação taxonómica da espécie Saccharomyces cerevisiae foi proposta em 1883
por Meyen ex E.C. Hansen, e encontra-se descrita na Tabela 1.
Tabela 1: Classificação Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae
Super Reino Eukaryota
Reino Fungi
Filo Ascomycota
Classe Saccharomycetes
Ordem Saccharomycetales
Família Saccharomycetaceae
Género Saccharomyces
Espécie Saccharomyces cerevisiae
Esta classificação baseia-se num conjunto de características definidas por vários autores
[Kreger-van Rig, 1984; Barnett et al., 1990; Ratledge & Hull, 1991], tais como: morfologia,
capacidade de fermentar diferentes substratos, capacidade de utilizar diferentes substratos,
temperatura de crescimento, entre outros.
INTRODUÇÃO GERAL
3
� Morfologia
As colónias apresentam uma coloração que varia entre o branco (predominantemente) e
o creme (ocasionalmente), são convexas e lisas. Este microrganismo pode formar pseudo-
hifas, que consistem em cadeias simples de células esféricas, elipsoidais ou cilíndricas.
Reproduzem-se na maioria das vezes por gemulação multilateral, onde a nova gémula é
formada na porção lateral da célula-mãe. A conjugação de células individuais conduz à
formação do asco, cuja composição pode variar entre um a doze ascósporos lisos, de forma
oval ou redonda, em cada célula.
� Fermentação
� Assimilação / Crescimento
As respostas aos testes estão indicadas pelos símbolos +, -, D, os quais significam
respectivamente respostas positivas, negativas e demorada.
� Características adicionais
Esta levedura não produz amido, não hidrolisa a ureia e a reacção com o composto azul
de diazónio B é negativa.
D-Glucose +
D-Galactose +, -
Maltose +, -
Me α-D-glucósido +, -
Sacarose +, -
α,α- Trealose +, -
Melibiose +
Lactose -
Celobiose -
Melezitose +, -
Rafinose +, -
Inulina -
Amido +, -
D-Galactose +, -
L-Sorbose -
D-Glucosamina -
D-Ribose –
D-Xilose –
L-Arabinose –
L-Ramnose –
Sacarose +, -
Maltose +, -
α,α-Trealose +, -
Me α-D-Glucosido +, -
Celobiose –
Salicina –
Arbutina –
Melibiose +, -
Lactose –
Rafinose +, -
Melezitose +, -
Inulina -
Amido +, -
Glicerol +, -
Eritritol –
Ribitol –
Xilitol –
L-Arabinitol –
D-Glucitol -, D
D-Manitol -, D
Galactitol –
myo-Inositol –
D-Glucano-1,5-lactona -, D
2-Ceto-D-Gluconato –
5-Ceto-D-Gluconato –
D-Gluconato -
D-Glucuronato –
DL-Lactato +, -
Succinato -, D
Citrato –
Metanol –
Etanol +, -
Nitrato –
Nitrito –
Etilamina –
L-Lisina –
Cadaverina –
Creatina –
Creatinina –
sem Vitaminas +, -
sem myo-Inositol +, -
sem Pantotenato +, -
sem Biotina +, -
sem Tiamina +, -
sem Biotina e Tiamina +, -
sem Piridoxina +, -
sem Niacina +
sem Ácido fólico +
sem PABA +, -
a 25ºC +
a 30ºC +
a 35ºC +, -
a 37ºC +, -
a 42ºC +, -
0,01% Cicloheximida –
0,1% Cicloheximida –
50% D-Glucose +, -
60% D-Glucose -
1.2.2. Estrutura da célula
Relativamente à estrutura da célula, esta possui um citoplasma com vários organelos e
um núcleo revestido por uma
como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a p
celular e a membrana. Na F
levedura.
1.2.2.1. Membrana plasmática
A composição e manutenção da integridade da membrana plasmática são essenciais
para o funcionamento das células e sua adaptação às constantes alterações do ambiente
extracelular [Konings, 2006]. Esta estrutura celular desempenha múltipl
Por um lado, funciona como barreira de separação entre o citoplasma e o ambiente exterior,
permitindo à célula manter uma composição relativamente constante e reter os constituintes
que lhe são próprios, o que é essencial para a manut
necessário à realização de uma variedade de processos de transporte activo secundário
[Konings & Velkamp, 1983; Konings
proteínas com múltiplas funções entre as quais transport
da célula, biossíntese de parede celular, constituição do citosqueleto e transdução de sinal
[Konings, 2006]. A membrana plasmática tem ainda que permitir a passagem de nutrientes
presentes no exterior e de produtos res
é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve
Figura 1: (a) Saccharomyces spobservada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x (em Fugelsang & Edwards, 2007) (b) Constituição de uma célula de levedura (Gaillardin & Helslot, 1987)
Estrutura da célula
Relativamente à estrutura da célula, esta possui um citoplasma com vários organelos e
um núcleo revestido por uma membrana que assegura a protecção dos cromossomas. Tal
como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a p
celular e a membrana. Na Figura 1 está exemplificado a constituição de uma célula de
Membrana plasmática
A composição e manutenção da integridade da membrana plasmática são essenciais
para o funcionamento das células e sua adaptação às constantes alterações do ambiente
extracelular [Konings, 2006]. Esta estrutura celular desempenha múltiplas funções na célula.
Por um lado, funciona como barreira de separação entre o citoplasma e o ambiente exterior,
permitindo à célula manter uma composição relativamente constante e reter os constituintes
que lhe são próprios, o que é essencial para a manutenção do potencial de membrana
necessário à realização de uma variedade de processos de transporte activo secundário
[Konings & Velkamp, 1983; Konings et al., 1995]. Por outro lado, a membrana possuí
proteínas com múltiplas funções entre as quais transporte de substratos de e para o interior
da célula, biossíntese de parede celular, constituição do citosqueleto e transdução de sinal
[Konings, 2006]. A membrana plasmática tem ainda que permitir a passagem de nutrientes
presentes no exterior e de produtos residuais do metabolismo que têm de ser libertados, isto
é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve
Saccharomyces sp. observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x (em Fugelsang & Edwards,
Constituição de uma llardin &
Vacúolo
Membrana plasmática
Complexo de Golgi
Grânulos lipídicos
DNA mitocondrial
Ribossomas “livres”
Gémulas Polimetafosfato
Espaço periplásmico
Parede celular
INTRODUÇÃO GERAL
4
Relativamente à estrutura da célula, esta possui um citoplasma com vários organelos e
membrana que assegura a protecção dos cromossomas. Tal
como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a parede
está exemplificado a constituição de uma célula de
A composição e manutenção da integridade da membrana plasmática são essenciais
para o funcionamento das células e sua adaptação às constantes alterações do ambiente
as funções na célula.
Por um lado, funciona como barreira de separação entre o citoplasma e o ambiente exterior,
permitindo à célula manter uma composição relativamente constante e reter os constituintes
enção do potencial de membrana
necessário à realização de uma variedade de processos de transporte activo secundário
. Por outro lado, a membrana possuí
e de substratos de e para o interior
da célula, biossíntese de parede celular, constituição do citosqueleto e transdução de sinal
[Konings, 2006]. A membrana plasmática tem ainda que permitir a passagem de nutrientes
iduais do metabolismo que têm de ser libertados, isto
é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve-
Polimetafosfato
Retículo endoplasmático
rugoso
Plasmídio
Espaço periplásmico
Cromossoma
Mitocôndria
INTRODUÇÃO GERAL
5
se à sua composição lipídica e, em parte, aos seus sistemas de transporte que permitem à
célula controlar as suas trocas com o meio. O funcionamento destes transportadores é, por
sua vez, igualmente influenciado pela composição lipídica da membrana, da qual depende
também a fluidez desta [Henschke & Rose, 1991; Ribéreau-Gayon et al., 2006].
1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática
Sendo a membrana constituída por lípidos e proteínas, a sua composição determina as
suas características e condiciona vários processos metabólicos.
Os três principais fosfolípidos de membrana plasmática são fosfatidiletanolamina (PE),
fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilinositol (PI), representando 70-85% do total, existindo
fosfatidilserina (PS) e difosfatidilglicerol (PG) em menor quantidade. Os ácidos gordos das
membranas fosfolipídicas contêm maioritariamente entre 14 a 24 átomos de carbono. Os
mais abundantes são os ácidos em C16 e os ácidos em C18, que podem ser saturados,
como o ácido palmítico (C16) e o esteárico (C18), ou insaturados, como o oleico (C18, com
dupla ligação na posição 9), linoleico (C18, com duas duplas ligações nas posições 9 e 12) e
linolénico (C18, com 3 duplas ligações nas posições 9, 12 e 15) [Ribéreau-Gayon et al.,
2006].
A membrana plasmática é ainda constituída por ergosterol, considerado por vários
autores como o principal esterol da membrana plasmática de leveduras [Parks & Casey,
1995; Snoek & Steensma, 2007; Guan et al., 2009]. As enzimas responsáveis pela sua
biossíntese foram localizadas na mitocôndria [Altmann & Westermann, 2005]. Relativamente
às proteínas membranares, destacam-se os múltiplos transportadores e os receptores
celulares específicos, responsáveis pela reacção da célula de levedura a vários estímulos
do meio externo, tais como hormonas sexuais ou alteração da concentração externa de
nutrientes [Ribéreau-Gayon et al., 2006].
1.2.2.1.2. Fluidez de membrana
A composição da membrana em ácidos gordos e a sua proporção em esteróis controlam
a sua fluidez. As cadeias de hidratos de carbono dos ácidos gordos da bicamada
fosfolipídica membranar podem estar num estado rígido e ordenado [Ribéreau-Gayon et al.,
2006], onde algumas ou todas as ligações de carbono dos ácidos gordos são do tipo trans.
No estado fluido, algumas dessas ligações tornam-se cis. A transição de um estado rígido
para um estado fluido acontece quando a temperatura atinge valores superiores aos da
temperatura de fusão, dependendo esta do comprimento das cadeias de ácidos gordos e do
seu grau de insaturação. As cadeias rectilíneas dos ácidos gordos saturados interagem
fortemente entre si [Ribéreau-Gayon et al., 2006], intensificando-se as interacções com o
aumento do comprimento da cadeia. A temperatura de transição, por consequência, sobe à
INTRODUÇÃO GERAL
6
medida que as cadeias de ácidos gordos se tornam mais longas. As duplas ligações de
ácidos gordos insaturados são geralmente cis, conferindo uma “curvatura” à cadeia. Esta
“curvatura” compromete a organização das cadeias de ácidos gordos, diminuindo a
temperatura de transição. O ergosterol, por sua vez, está perpendicularmente inserido na
bicamada lipídica. Os seus grupos hidroxilo associam-se através de pontes de hidrogénio
com a cabeça polar dos fosfolípidos e a sua terminação está inserida na região hidrofóbica
da bicamada lipídica. O ergosterol encontra-se, desta forma, intercalado com os fosfolípidos
da membrana, inibindo a cristalização das cadeias de ácidos gordos a baixas temperaturas.
Por outro lado, à medida que a temperatura vai aumentando, o ergosterol regula o excesso
de fluidez da membrana, reduzindo o movimento das cadeias de ácidos gordos [Zinser et
al., 1991; Alexandre et al., 1994].
1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar
A H+-ATPase membranar constitui 5 a 10% do total de proteína da membrana plasmática
de leveduras [Bowman et al., 1981]. Tem um tamanho aproximado de 100 kDa e pertence
ao grupo de ATPases de tipo P2 transportadoras de catiões, no qual estão incluídas a
Na+/K+-ATPase e a Ca2+-ATPase de membranas plasmáticas de mamíferos [Kühlbrand,
2004]. A H+-ATPase apresenta como propriedades principais uma elevada afinidade para o
ATP (Km entre 0,8 e 4,8 mM), um pH óptimo entre 5,0 e 6,7 para a hidrólise do ATP,
sensibilidade ao vanadato, dietilstilbestrol e diciclohexilcarbodimida e insensibilidade à
oligomicina, à azida e ao nitrato [Sigler & Hofer, 1991].
Através da análise do perfil de hidrofobicidade da H+-ATPase membranar foi proposto um
modelo de organização estrutural da enzima [Hager et al., 1986; Serrano et al., 1986],
representado na Figura 2, com 10 regiões transmembranares (10 hélices α hidrofóbicas) e
extremidades N e C-terminal voltadas para o citosol.
Figura 2: Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H+-ATPase membranar. A posição marcada com um P é o local de fosforilação (Adaptado de Bowman & Bowman, 1986).
As 3 maiores porções de polipéptidos no citosol são: a cauda terminal azotada de cerca
de 115 aminoácidos e dois grandes ganchos de cerca de 130 e 300 aminoácidos [Bowman
& Bowman, 1986]. O maior gancho contém o local onde a enzima é fosforilada durante o
ciclo reaccional, julgando-se também que esteja envolvido na ligação e hidrólise de ATP. Os
dois ganchos citosólicos são as partes mais conservadas da proteína [Bowman & Bowman,
Exterior
Interior
Membrana
INTRODUÇÃO GERAL
7
1986; DeWitt et al., 1998].
A principal H+-ATPase membranar é codificada pelo gene essencial PMA1 [Serrano et al.,
1986]. O gene PMA1 é fortemente expresso e é homólogo ao gene PMA2 que codifica, por
sua vez, para uma H+-ATPase membranar que apresenta 89% de identidade com a proteína
codificada por PMA1, para além de lhe ser funcionalmente semelhante [Schlesser et al.,
1988]. Sob condições normais de crescimento o gene PMA2 é muito menos expresso do
que o gene PMA1 e não é considerado essencial [Schlesser et al., 1988; Supply et al.,
1993a,b]. Em condições de stresse de crescimento que estimulem a activação da H+-
ATPase membranar de Saccharomyces cerevisiae verificou-se, através de ensaios de
quantificação imunológica, que as células apresentaram uma menor quantidade de H+-
ATPase, sendo este facto consistente com a menor expressão do gene PMA1 nessas
mesmas condições de stresse [Monteiro et al., 1994; Viegas et al., 1994, 1995; Fernandes et
al., 1997].
A H+-ATPase presente na membrana plasmática de S. cerevisiae é conhecida por ser
essencial a diversas funções celulares, entre as quais a absorção de nutrientes [Kotyk,
1994], a regulação do pH intracelular [Goffeau & Slayman, 1981] e do potencial de
membrana [Carmelo et al., 1997], o crescimento celular [Portillo & Serrano, 1989] e a
osmorregulação [Martínez de Marãnón et al., 2001]. A actividade da enzima associa a
hidrólise de ATP à expulsão de protões, resultando no estabelecimento de um gradiente
protónico electroquímico transmembranar que conduz o transporte secundário [Serrano,
1984; van Uden, 1985; Cartwright et al., 1987; Serrano, 1988]. Quando a H+-ATPase não
está funcional, muitos simportes de H+ não podem prosseguir, mesmo que a diferença de pH
medida entre os meios intra e extracelular seja suficiente para conduzir os simportes [Kotyk,
1983]. Para além disso, o gradiente electroquímico é igualmente utilizado na regulação da
actividade de algumas enzimas intracelulares sensíveis ao pH [Serrano, 1984].
Johannson e colaboradores (1981) constataram que os ácidos gordos de cadeia longa
aumentam a actividade da H+-ATPase membranar. A razão esterol/fosfolípido parece
influenciar a actividade da H+-ATPase membranar [Johannson et al., 1981]. Arami e
colaboradores (1997) relataram um decréscimo da actividade da H+-ATPase membranar
provocado por uma modificação estrutural da membrana, resultante da decomposição
fotoquímica do ergosterol [Arami et al., 1997].
Martínez de Marãnón e colaboradores (2001) estudaram de que forma a redução do
volume celular provocado pelo aumento da pressão osmótica extracelular afectou a taxa de
expulsão de H+ in vivo. Após terem constatado que uma redução de 50% do volume celular
provocou uma inibição total do processo de expulsão de H+, estes autores postularam que a
inibição da acidificação extracelular poderia ser uma consequência da inibição da H+-
INTRODUÇÃO GERAL
8
ATPase induzida por modificações conformacionais da enzima, como resultado de
deformações na membrana plasmática [Martínez de Marãnón et al., 2001].
De acordo com alguns autores, a hipótese mais provável para a activação da H+-ATPase
resulta da modificação pós-tradução da enzima PMA1 [Monteiro et al., 1994; Viegas et al.,
1994, 1995], nos casos de esgotamento de fonte de glucose e de azoto [Portillo et al., 1989;
Benito et al., 1992; Eraso & Portillo, 1994; García-Arranz et al., 1994]. Para além disso, é
possível que a activação da H+-ATPase esteja também, pelo menos parcialmente,
relacionada com a alteração dos lípidos constituintes da membrana plasmática de células
cultivadas sobre condições inibitórias, tal como foi proposto para a activação induzida por
ácido decanóico [Alexandre et al., 1996].
A glucose foi identificada como um factor que estimula a expulsão de protões em S.
cerevisiae uma vez que rapidamente activa a H+-ATPase membranar da levedura [Sigler &
Hofer, 1991; Brandão et al., 1994]. Serrano (1983) demonstrou a necessidade de se
proceder a uma pré-incubação com glucose para que se dê a activação da H+-ATPase
membranar e se observem taxas significativas de transporte activo em leveduras [Borst-
Pauwels, 1981; Serrano, 1983].
Para além disso têm sido descritos vários factores ambientais de stresse que estimulam a
actividade desta enzima in vivo, tais como o etanol [Rosa & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá-
Correia, 1992; Monteiro et al., 1994], o ácido octanóico [Viegas & Sá-Correia, 1991; Viegas
et al., 1994], o pH extracelular ácido [Eraso & Gancedo, 1987], o cobre [Fernandes et al.,
1997; Fernandes & Sá-Correia, 1999] e temperaturas supra-óptimas (inferiores a 40ºC)
[Viegas et al., 1995], constituindo a activação da H+-ATPase uma resposta de defesa da
célula face à dissipação da força protomotriz através da membrana e/ou ao decréscimo do
pH interno [Cartwright et al., 1986; Eraso et al., 1987; Sá-Correia et al., 1989; Rosa & Sá-
Correia, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá-Correia, 1992; Monteiro et al., 1994;
Viegas et al., 1994; Viegas et al., 1995].
Relativamente ao efeito do etanol, muito embora seja considerado por vários autores
como um factor que estimule a actividade da H+-ATPase [Rosa & Sá-Correia, 1992;
Monteiro et al., 1994; Monteiro & Sá-Correia, 1998], existem paralelamente evidências de
outros autores [Cartwright et al., 1986; Cartwright et al., 1987; Pascual et al., 1988] de
redução da actividade da H+-ATPase membranar para a gama de concentrações que
reduzem significativamente a taxa de fermentação em ensaios em vesículas. Este efeito
poderá resultar do efeito conjugado da inibição da actividade da H+-ATPase membranar e
do estímulo do influxo passivo de protões, devido a um aumento não especifico da
permeabilidade da membrana descrito por vários autores [Leão & van Uden, 1984a; van
Uden, 1985; Salgueiro et al., 1988].
INTRODUÇÃO GERAL
9
Estudos realizados por Malparida e Serrano (1981) demonstram que a H+-ATPase
membranar mantém o pH intracelular de S. cerevisiae entre 6,0 e 7,0, mesmo quando
ocorrem grandes variações no pH externo [Malpartida & Serrano, 1981]. O crescimento de
leveduras em meios ácidos demonstrou provocar um aumento na actividade da H+-ATPase
[Eraso & Gancedo, 1987], comprovando-se paralelamente a existência de uma correlação
muito forte entre o aumento da actividade da enzima e o aumento da actividade catalítica
[Eraso et al., 1987]. A regulação dos pH’s intra e extracelular foi igualmente confirmada em
mutantes com baixos níveis de H+-ATPase que apresentaram baixo pH intracelular,
demonstrando uma maior sensibilidade à presença de ácidos fracos [McCusker et al., 1987]
e ao baixo valor do pH do meio extracelular. A H+-ATPase demonstrou ser essencial para o
crescimento celular e para a expulsão de protões in vivo, facto comprovado através da
letalidade das mutações null [Serrano et al., 1986]. Para além disto, estudos com mutantes
pma1 demonstraram que esta proteína é também essencial para a resistência a baixas
temperaturas, ao pH ácido e a algumas drogas inibitórias, tais como vanadato metilamina e
TPP+ [McCusker et al., 1987; Ulaszewski et al., 1987a,b; Vallejo & Serrano, 1989].
1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae
1.3.1. Bioquímica do processo
Quando uma hexose é transportada para o interior de uma célula de S. cerevisiae é
degrada através da via glicolítica em duas moléculas de piruvato. Durante a glicólise há
produção de 2 molécula de ATP e de duas moléculas de NADH, por molécula de hexose.
As enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase convertem o piruvato em
etanol e em dióxido de carbono e re-oxidam 2 moléculas de NADH que são produzidas na
glicólise [Barnett, 2003], sendo este o processo conhecido como fermentação alcoólica. Do
ponto de vista energético, a glicólise (Figura 3) seguida de fermentação alcoólica fornece à
levedura 2 moléculas de ATP por molécula de glucose degradada, ou, 14,6 Kcal
(biologicamente utilizável) / mole de glucose fermentada. Do ponto de vista termodinâmico,
a alteração de energia livre durante a degradação de uma mole de glucose e a consequente
formação de etanol e CO2 é de -40Kcal. A diferença (25,4 Kcal) é dissipada sob a forma de
calor [Ribéreau-Gayon, 2006], traduzindo-se frequentemente no aumento de temperatura ao
longo do processo fermentativo.
A capacidade de S. cerevisiae
crescimento em condições anaeróbias [Snoek
grupo de leveduras Crabtree positivas (súbita resposta fermentativa sob condições de
aerobiose e de adição de excesso de açúcar)
de NADH produzido pelo aumento do fluxo de hexoses para o interior da célula. Outro factor
que contribui para que a fermentação se realize em condições de anaerobiose é o efeito de
Pasteur, que é definido como a
fermentação não consegue competir eficientemente com a respiração, em termos de
rendimento em ATP, conduzindo a uma diminuição da taxa de fermentação sob condições
aeróbias [Lagunas, 1986]. Em
aeróbias com limitação de açúcar e em suspensões de células em fase estacionária (devido
às baixas taxas de consumo de açú
1.3.2. Produtos secundários
Durante a fermentação alcoólica,
etanol, produzindo igualmente um elevado número de compostos voláteis responsáveis pelo
aroma do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela
et al., 2008].
Tabela 2: Metabolitos presentes
Metabolitos primários
Ácidos orgânicos superiores
Glucose Citrato Frutose Malato Glicerol Acetato IsoamilaEtanol 2
Figura 3: Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. (Adaptado de RibéreauGayon, 2006)
S. cerevisiae fermentar açúcares é absolutamente vital para o seu
crescimento em condições anaeróbias [Snoek & Steensma, 2007]. Esta espécie pertence ao
grupo de leveduras Crabtree positivas (súbita resposta fermentativa sob condições de
aerobiose e de adição de excesso de açúcar), que produzem etanol para remover o excesso
de NADH produzido pelo aumento do fluxo de hexoses para o interior da célula. Outro factor
que contribui para que a fermentação se realize em condições de anaerobiose é o efeito de
Pasteur, que é definido como a inibição do consumo de açúcares em aerobiose. A
fermentação não consegue competir eficientemente com a respiração, em termos de
rendimento em ATP, conduzindo a uma diminuição da taxa de fermentação sob condições
aeróbias [Lagunas, 1986]. Em S. cerevisiae o efeito de Pasteur ocorre em culturas
aeróbias com limitação de açúcar e em suspensões de células em fase estacionária (devido
s baixas taxas de consumo de açúcares) [Weusthuis, 1994].
Produtos secundários
Durante a fermentação alcoólica, S. cerevisiae converte os açúcares fermentescíveis em
etanol, produzindo igualmente um elevado número de compostos voláteis responsáveis pelo
do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela
durante a fermentação alcoólica, adaptado de [Rossouw
Álcoois superiores Ésteres Ácidos
Metanol Acetato de etilo Ácido valéricoPropanol Acetato de hexilo Ácido propiónico
Isoamilalcool Acetato de isoamilo Ácido isovalérico2-feniletanol 2-etilfenilacetato Ácido isobutíricoIsobutanol Ácido butírico
Butanol
INTRODUÇÃO GERAL
10
Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. (Adaptado de Ribéreau-
çúcares é absolutamente vital para o seu
Steensma, 2007]. Esta espécie pertence ao
grupo de leveduras Crabtree positivas (súbita resposta fermentativa sob condições de
, que produzem etanol para remover o excesso
de NADH produzido pelo aumento do fluxo de hexoses para o interior da célula. Outro factor
que contribui para que a fermentação se realize em condições de anaerobiose é o efeito de
inibição do consumo de açúcares em aerobiose. A
fermentação não consegue competir eficientemente com a respiração, em termos de
rendimento em ATP, conduzindo a uma diminuição da taxa de fermentação sob condições
o efeito de Pasteur ocorre em culturas contínuas
aeróbias com limitação de açúcar e em suspensões de células em fase estacionária (devido
converte os açúcares fermentescíveis em
etanol, produzindo igualmente um elevado número de compostos voláteis responsáveis pelo
do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela 2) [Rossouw
[Rossouw et al., 2008]
Ácidos gordos
Ácido valérico Ácido octanóico Ácido propiónico Ácido decanóico
valérico Caprilato de etilo butírico Lactato de etilo
butírico Caprato de etilo
INTRODUÇÃO GERAL
11
O estudo de Rossouw e colaboradores (2008) permitiu constatar que apesar de se ter
observado um aumento constante na concentração dos compostos aromáticos (referidos na
Tabela 2) durante a fermentação em mosto sintético, o período em que ocorreu a maior
acumulação de compostos aromáticos foi o início de fermentação [Rossouw et al., 2008].
Os ácidos produzidos por S. cerevisiae durante a fermentação alcoólica pertencem ao
grupo dos ácidos orgânicos fracos, que são compostos lipofílicos pertencentes a uma
importante classe de aditivos alimentares antimicrobianos [Freese et al., 1973; Warth, 1977;
Cole & Keenan, 1987]. O mecanismo de actuação dos ácidos fracos é dependente do pH
extracelular, na medida em que são tanto menos eficazes, quanto mais alcalino for o meio
extracelular [Viegas et al., 1989]. As moléculas não dissociadas atravessam a membrana
plasmática por difusão simples até se atingir o equilíbrio, de acordo com o gradiente de pH
que se estabelece entre o lado interno e o lado externo da membrana [Booth & Kroll, 1989;
Pampulha & Loureiro-Dias, 1989; Viegas et al., 1989]. A acumulação de aniões [Eklund,
1983; Eklund, 1985] e a diminuição do pH extracelular [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989;
Warth, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1995] estão entre as causas possíveis de redução da
taxa específica de crescimento [Pampulha & Loureiro-Dias, 2000], redução do rendimento
em biomassa [Verduyn et al., 1992] e perda de viabilidade [Prudêncio et al., 1998] de células
expostas a ácidos fracos.
O glicerol é o terceiro composto, a seguir ao etanol e ao CO2, produzido em maiores
quantidades, durante a fermentação alcoólica [Pizarro et al., 2007]. Quando se associa a
influência do glicerol no vinho, depreende-se que não está relacionada com o seu aroma,
uma vez que o glicerol não é volátil, mas participa em vários atributos sensoriais
importantes, tais como doçura (devido à natureza viscosa do glicerol), suavidade e corpo do
vinho [Prior & Hohmann, 1997; Scanes et al., 1998].
1.4. Fermentação vinária
O vinho é uma bebida alcoólica que resulta de fermentação do mosto de uva. A sua
história tem mais de 8000 anos, considerando-se o seu processo de produção como um dos
mais antigos processos biotecnológicos no mundo [Pretorius, 2000; This et al., 2006]. Do
ponto de vista bioquímico, o vinho pode ser definido como uma solução multi-componente
líquida, constituída principalmente por água, etanol, glicerol e ácidos orgânicos. Como
compostos minoritários (mas igualmente importantes) tem-se os componentes responsáveis
pelo flavour [Rossouw et al., 2008; Swiegers et al., 2009]. Alguns destes compostos podem
estar originalmente presentes nas uvas, ou podem ser sintetizados durante o processo de
vinificação [Pizarro et al., 2007].
INTRODUÇÃO GERAL
12
Saccharomyces assume um papel fundamental na transformação anaeróbica do mosto
de uva em vinho. O processo fermentativo pode ser conduzido por estirpes de leveduras
comerciais seleccionadas ou pode deixar-se o mosto fermentar com a flora nativa presente
na adega e nas uvas. Em ambos os casos, S. cerevisiae e S. bayanus são as espécies de
leveduras que conduzem a fermentação [Bisson, 2004] e as espécies predominantes ao
longo da maior parte do processo [Querol et al., 1994; Lopandic et al., 2008]
1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária
A fermentação vinária é um processo bioquímico e ecológico complexo que envolve uma
multiplicidade de factores de stresse que, de uma forma sinérgica, promovem o
desenvolvimento sequencial de diferentes espécies de leveduras [Fleet & Heard, 1993;
Bisson, 1999; Bauer & Pretorius, 2000; Fleet, 2003; Zott et al., 2008]. No início de
fermentação, o mosto constitui a primeira situação de stresse quer pela elevada
concentração de açúcares presentes (elevada pressão osmótica), quer pela presença de
compostos antimicrobianos (SO2 e resíduos de pesticidas) e presença de microrganismos
competidores (presença de factores killer e de moléculas quorum-sensing e influência da
densidade espacial) [Yap et al., 2000; Fleet, 2003; Nissen et al., 2003; Hogan, 2006; Perez-
Nevado et al., 2006]. À medida que a fermentação decorre, aumenta a concentração de
etanol e de CO2, sobe a temperatura (nos casos em que não é controlada), ocorre o
esgotamento de nutrientes e de O2.
1.4.1.1. Etanol
Nas décadas de 70/80, vários grupos de investigadores estudaram os efeitos negativos
que o aumento da concentração de etanol provocava na população de Saccharomyces
cerevisiae, durante o processo de fermentação alcoólica. Diversos mecanismos subjacentes
aos efeitos adversos deste composto foram igualmente descritos, nomeadamente a inibição
hiperbólica não-competitiva de enzimas glicoliticas [Nagodawithana et al., 1977], inibição do
crescimento [Jones et al., 1981; Ingram & Buttke, 1984; van Uden, 1985; Casey & Ingledew,
1986], diminuição da temperatura óptima e máxima de crescimento [van Uden & Duarte,
1981; Loureiro & van Uden, 1982], o estímulo de morte a baixa, média e alta temperatura
[van Uden, 1985; Sá-Correia & van Uden, 1986], inibição do sistema de transporte de
nutrientes, tais como glucose [Leão & van Uden, 1982a], frutose [Sá-Correia & van Uden,
1983], maltose [Loureiro-Dias & Peinado, 1982], amónia [Leão & van Uden, 1984b] e
aminoácidos [Leão & van Uden, 1984b], ocorrência de mutações do tipo petite [Cabeça-
Silva et al., 1982] e estímulo da difusão de espécies químicas não polares [Leão & van
Uden, 1984a].
INTRODUÇÃO GERAL
13
A membrana plasmática foi identificada como um dos principais alvos para a inibição
provocada pelo etanol no transporte de nutrientes. O etanol interage com as membranas
através da sua inserção no interior hidrofóbico, provocando um aumento da polaridade desta
região, enfraquecendo as interacções hidrofóbicas, a barreira hidrofóbica da membrana às
trocas livres de moléculas polares e afecta o posicionamento das proteínas na membrana
[Ingram & Buttke, 1984]. Para além disso, observa-se um aumento de fluidez, com
consequente aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos [Ingram
& Buttke, 1984; Quintas et al., 2000]. Como tal, a composição em ácidos gordos da
membrana lipídica demonstrou ser importante na tolerância ao etanol [Thomas & Rose,
1979; Mishra & Prasad, 1989], sendo este composto responsável por um aumento da
síntese de fosfolípidos membranares, nomeadamente da sua percentagem em ácidos
gordos insaturados (ácido oleico, na maioria). A perda da integridade membranar diminui a
capacidade da célula em manter um gradiente de concentração através da membrana
plasmática, afectando uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão & van Uden,
1984a,b]. Por outro lado, foi demonstrado que, a partir de determinadas concentrações, o
etanol é capaz de promover a formação de um agregado fosfolipídico pouco usual,
designado por fase interdigitada, em suspensões de L-α-dipalmitoilfofastidilcolina [McIntosh
et al., 1983; Simon & McIntosh, 1984]. Na fase interdigitada as cadeias carbonadas dos
lípidos de monocamadas opostas interpenetram-se completamente, ficando expostos os
terminais metílicos. Resultados obtidos por Rowe (1987) em misturas de fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina demonstraram que é possível coexistirem lípidos interdigitados e
lípidos não interdigitados numa membrana. Zonas onde os lípidos se encontrem
interdigitados podem contribuir para a ligação dos dois lados da bicamada e constituir zonas
mais permeáveis de forma a facilitar o acesso ou a libertação de moléculas, podendo
ocorrer naturalmente ou como resultado do efeito tóxico de qualquer tipo de substância
[Rowe, 1987]. Recentemente, Gurtovenko e Anwar (2009) demonstraram pela primeira vez
a formação de monocamadas lipídicas a partir de bicamadas fosfolipídicas, por exposição
das membranas a soluções aquosas de concentrações elevada de etanol (>12 mol%),
apresentando as estruturas em monocamada formadas semelhanças com micelas invertidas
ao possuírem forma irregular, pequena dimensão e carácter persistente [Gurtovenko &
Anwar, 2009]. Estes autores atribuíram igualmente um significado biológico a estas
estruturas em monocamada, postulando que o etanol promove a hemifusão das camadas
lipídicas adjacentes, através de rupturas provocadas nas mesmas, conduzindo
subsequentemente à formação de zonas permeáveis que podem actuar como sistemas de
libertação de moléculas polares, incluindo iões [Gurtovenko & Anwar, 2009].
O fluxo transmembranar de protões demonstrou ser sensível à presença de etanol,
conduzindo à diminuição da taxa de fermentação [Cartwright et al., 1986; Cartwright et al.,
INTRODUÇÃO GERAL
14
1987; Pascual et al., 1988]. A dissipação do gradiente de protões induzida pelo etanol
parece estar envolvida na inibição da actividade da H+-ATPase membranar [Cartwright et al.,
1987], no estímulo do influxo passivo de protões (devido ao aumento não especifico da
permeabilidade da membrana plasmática) [Leão & van Uden 1984a; van Uden, 1985;
Salgueiro et al., 1988], ou numa combinação de ambos [Rosa e Sá-Correia, 1991].
A discussão sobre o efeito do etanol no pH intracelular é controversa. Dombek e Ingram
(1987) detectaram apenas um ligeiro decréscimo nos valores de pH intracelular, durante as
fases finais de fermentação com elevada concentração de etanol [Dombek & Ingram, 1987].
Por outro lado, Cartwright e colaboradores (1986), através da medição do pH intracelular na
presença de etanol, detectaram uma acidificação significativa, mais pronunciada na
ausência de glucose. Os mesmos autores referiram que o gradiente de pH (∆pH) através da
membrana plasmática e o potencial de membrana (∆ψ) foram igualmente afectados,
interpretando os seus resultados como uma consequência do aumento do influxo passivo de
H+ e inibição da H+-ATPase membranar [Cartwright et al., 1986]. Os resultados obtidos por
Loureiro-Dias e Santos (1990) confirmaram o estudo efectuado por Cartwright e
colaboradores (1986), tendo descrito que, na ausência de etanol, se observa apenas uma
ligeira acidificação do citoplasma, sendo esta fortemente acelerada quando se adicionava
etanol ao processo fermentativo. Estes autores observaram igualmente o desaparecimento
rápido do ∆pH através da membrana do tonoplasto para elevadas concentrações de etanol
[Loureiro-Dias & Santos, 1990].
Outra explicação para a inibição da fermentação provocada pelo etanol diz respeito à sua
possível actuação sinérgica com o ácido acético nas fases finais de fermentação. Este ácido
encontra-se nas formas não ionizadas durante as fermentações vinárias onde, normalmente,
o pH externo é baixo. Como consequência, a forma dissociada do ácido acético é
acumulada no interior da célula [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989]. Os resultados obtidos por
Loureiro-Dias & Santos (1990) revelaram um outro mecanismo de inibição provocado pelo
etanol que afecta a fase inicial de fermentação (fosforilação de açúcar). De acordo com
alguns autores, este mecanismo surge como consequência da acumulação de etanol no
interior da célula [Dombek & Ingram, 1988; Alterthum et al., 1989]. Segundo estes autores, a
inibição da fosforilação do açúcar deve-se à competição gerada entre o AMP e o ATP para o
local activo da enzima. De acordo com os mesmos autores, o aumento da concentração de
AMP intracelular resulta de um aumento do consumo de ATP devido à activação de H+-
ATPase membranar que ocorre como tentativa da célula combater a acidificação intracelular
em consequência do aumento da permeabilidade ao H+ na presença de etanol. Na mesma
linha de pensamento, os resultados de Loureiro-Dias e Santos (1990) indicaram que a
inibição da fosforilação por acumulação de AMP no interior da célula é estimulada pela
INTRODUÇÃO GERAL
15
produção e acumulação de ácido acético no citoplasma da célula de levedura [Loureiro-Dias
& Santos, 1990].
O efeito conjugado do etanol e da temperatura numa população de leveduras foi
inicialmente estudado por van Uden e Duarte que observaram o efeito directo do etanol na
modificação das temperaturas cardiais de crescimento de Saccharomyces cerevisiae
durante fermentações alcoólicas, uma vez que estas podiam terminar prematuramente
devido ao efeito conjugado do etanol e da temperatura (principalmente na produção de
vinhos tintos onde as temperaturas de fermentação são altas) [van Uden & Duarte, 1981;
van Uden, 1984]. Nesse sentido, os mesmos autores constataram que à medida que a
concentração de etanol aumentava, as três temperaturas cardiais (Top, Tmaxf e Tmaxi)
diminuíam e que, a partir de uma dada concentração crítica de etanol (dependente da
estirpe e da temperatura de fermentação), o valor de Top se aproximava do valor de Tmaxi, de
tal forma que qualquer aumento posterior da concentração de etanol, resultante da
continuidade do processo fermentativo, poderia conduzir a população a um segundo período
exponencial na gama das temperaturas supra-óptimas (Top < T < Tmaxf), durante o qual a
morte exponencial competia com o crescimento exponencial, mas com taxa específica de
crescimento superior à taxa específica de morte [van Uden & Duarte, 1981]. Tendo em conta
esta variação, com o aumento da concentração de etanol atingir-se-á uma situação em que
Tmaxf diminui para temperaturas inferiores à temperatura de fermentação. A partir do
momento em que se atingia esta concentração de etanol, a taxa de morte será superior à
taxa de crescimento, conduzindo à extinção da população viável [van Uden, 1984]. A
sequência de eventos descrita depende da tolerância da estirpe ao álcool, da concentração
final de etanol e da temperatura do processo [van Uden, 1984]. Investigadores do mesmo
grupo estudaram o efeito conjugado do etanol e outros álcoois e da temperatura numa
população de leveduras, tendo verificado que os alcanóis favoreciam a morte térmica [Leão
& van Uden, 1982b]. Estes mesmos autores postularam que os denominados alvos de morte
térmica de S. cerevisiae, cuja taxa de inactivação governa a cinética de morte térmica, estão
localizados na membrana plasmática e que a forma de acção do etanol no estímulo da
morte térmica não resulta de uma acção directa sobre alvos específicos, mas antes de um
efeito não-específico sobre os lípidos de membrana que se tornam os alvos mais sensíveis
à temperatura, sendo o mecanismo molecular de morte celular similar ou idêntico ao de
morte térmica. Esta hipótese baseou-se, por um lado, por se ter observado que o etanol
estimulou a morte térmica e diminuiu a temperatura máxima de crescimento de S.
cerevisiae, sem ter destruído o seu perfil associativo de temperatura e, por outro, pelo facto
dos álcoois testados não terem afectado a entalpia de activação de morte térmica (isto é, o
coeficiente de morte térmica foi o mesmo na presença ou na ausência de álcoois) [Leão &
van Uden, 1982b]. Com base nos resultados referidos, foi possível construir um modelo que
INTRODUÇÃO GERAL
16
relaciona a temperatura máxima de crescimento de S. cerevisiae em presença de etanol
com os parâmetros de morte térmica e os efeitos do etanol sobre estes parâmetros. Este
modelo foi testado com sucesso na previsão da temperatura máxima à qual é possível
prosseguir a fermentação em estirpes vínicas [Loureiro & van Uden, 1982].
A variação de tolerância ao etanol observada nas células em fase exponencial de
crescimento pode ser explicada através de vários factores, tais como: composição lipídica
da membrana plasmática [Jimenez & Benitez, 1987; Lloyd et al., 1993; Sajbidor, 1997; Chi &
Arneborg, 2000; You et al., 2003; Takagi et al., 2005], acumulação de trealose [Mansure et
al., 1994; Sharma, 1997; Lucero et al., 2000] ou da proteína de choque térmico Hsp104
[Sanchez et al., 1992; Piper, 1995], actividade da H+-ATPase membranar [Rosa & Sá-
Correia, 1991; Supply et al., 1995; Aguilera et al., 2006] e estabilidade mitocondrial [Aguilera
& Benitez, 1985; Ibeas & Jimenez, 1997]. O etanol é ainda referido na literatura como um
forte indutor de mutantes respiratórios de S. cerevisiae [Norton et al., 1995; Ibeas &
Jimenez, 1997].
Os ensaios electroquímicos de Wang e colaboradores (2007) demonstraram que o limite
máximo de tolerância ao etanol de S. cerevisiae é de 25% (v/v) etanol, coerente com os
resultados obtidos pelos mesmos autores através das medições convencionais da
capacidade fermentativa [Wang et al., 2007].
A capacidade de adaptação de estirpes de S. cerevisiae a ambientes enológicos está
dependente dos seus perfis específicos de expressão do genoma [Pérez-Ortín et al., 2002].
Estudos realizados no sentido de esclarecer quais os agentes/mecanismos intervenientes
na tolerância de estirpes de S. cerevisiae ao etanol revelaram que a superóxido dismutase
mitocondrial (MnSOD) codificada por SOD2 [Costa et al., 1993], a H+-ATPase membranar
[Aguilera et al., 2006; Lei et al., 2007], a biossíntese de ergosterol [Lei et al., 2007] e a
biossíntese de fosfolípidos [Chi et al., 1999] são essenciais para a aquisição de tolerância ao
etanol. No entanto, muito embora tenham sido realizados vários estudos de resposta a
estímulos extracelulares de estirpes laboratoriais é importante realçar que existem
diferenças substanciais na resposta ao stresse de estirpes industriais, uma vez que estas
crescem normalmente em ambientes mais complexos, para além de terem sido previamente
seleccionadas de acordo com uma resposta melhor e mais rápida a várias condições de
stresse, de forma a terem um melhor desempenho fermentativo [Pizarro et al., 2008]. Os
ensaios de DNA microarrays inicialmente realizados a estirpes de leveduras vínicas
revelaram níveis elevados de expressão de genes envolvidos na biossíntese de
aminoácidos e na biossíntese de porinas [Yang et al., 1994; Cavalieri et al., 2000; Backus et
al., 2001], muito embora a abordagem inicial dos DNA microarrays contemplasse apenas a
resposta das células perante situações de curta duração de stresse ao etanol [Alexandre et
al., 2001]. Recentemente, a análise de expressão global de genes e as análises proteómicas
INTRODUÇÃO GERAL
17
foram realizadas sob condições semelhantes às de fermentação vinária [Rossignol et al.,
2003; Varela et al., 2005; Wu et al., 2006; Marks et al., 2008; Pham & Wright, 2008],
considerando as dinâmicas de expressão génica e de biossíntese de proteínas na resposta
ao stresse. Varela e colaboradores (2005) analisaram o transcriptoma de uma estirpe vínica
de S. cerevisiae em 3 fases de crescimento definidas (meio da fase exponencial, início e
final da fase estacionária), tendo observado para todas as fases estudadas uma maior
expressão de genes relacionados com a produção de energia e com a resposta ao stresse
[Varela et al., 2005]. Estes autores postularam que mecanismos pós-transcricionais
poderiam ser os responsáveis pela regulação de proteínas correspondentes a genes
expressos numa determinada fase de crescimento, destacando a fase estacionária como a
fase onde as células sofrem as maiores alterações fisiológicas, que provavelmente são
provocadas pela elevada concentração de etanol existente no meio [Varela et al., 2005].
Rossignol e colaboradores (2009) revelaram a existência de alterações substanciais na
quantidade de proteína ao longo da fermentação alcoólica, sem estarem directamente
associadas a alterações nos níveis de transcrito, sugerindo que o mRNA é selectivamente
processado e/ou traduzido durante a fase estacionária [Rossignol et al., 2009]. Para além
dos mecanismos de defesa celular conhecidos em situações de stresse pelo etanol, tais
com a acumulação de proteínas de choque térmico [Varela et al., 2005; Pham et al., 2006;
Wu et al., 2006; Zuzuarregui et al., 2006], a acumulação de trealose [Varela et al., 2005; Wu
et al., 2006; Pham & Wright, 2008] e o rearranjo de esteróis membranares [Varela et al.,
2005; Wu et al., 2006], estudos paralelos revelaram a importância da função vacuolar [Marks
et al., 2008] e de proteínas envolvidas no transporte de electrões [Wu et al., 2006]. De um
modo geral, estes estudos moleculares demonstram a complexidade da resposta ao stresse
de células de leveduras, destacando a importância do seu estado fisiológico e do seu
background genético para uma eficiente resposta a factores de stresse, nomeadamente ao
etanol.
1.4.1.2. Temperatura
A temperatura é um dos parâmetros ambientais mais importantes para o desempenho
das leveduras durante o processo fermentativo [Fleet & Heard, 1993], influenciando o
crescimento de diferentes espécies [Torija et al., 2003b], a duração de fermentação [Torija et
al., 2001] e o metabolismo das leveduras, nomeadamente a formação de metabolitos
secundários (e.g. glicerol, ácido acético e ácido succínico) [Lafon-Lafourcade, 1983].
As fermentações vinárias realizadas a baixas temperaturas têm vindo a tornar-se uma
prática frequente em vinificação, uma vez que são responsáveis pela produção de vinhos
com um perfil aromático rico [Killian & Ough, 1979; Kunkee, 1984] e promovem uma maior
estabilidade do vinho, ao condicionarem fortemente o crescimento de bactérias lácticas e
INTRODUÇÃO GERAL
18
acéticas. No entanto, ao se baixar a temperatura de fermentação aumenta-se o risco de
ocorrer uma paragem prematura e amuo de fermentação [Torija et al., 2003b]. O estudo
realizado por Santos e colaboradores (2008) revelou como factores potencialmente
causadores de fermentações incompletas a limitação de nutrientes, as temperaturas de
fermentação excessivamente altas ou baixas, as más práticas enológicas, a ocorrência de
microrganismos contaminantes e a presença de compostos tóxicos, como os fungicidas e o
etanol [Santos et al., 2008].
Diversos estudos [Sherman, 1959; Chang & Matson, 1972] referem que S. cerevisiae,
uma levedura tipicamente mesófila, é capaz de crescer, sob determinadas condições, a
40ºC. Para além disso, esta espécie apresenta um perfil associativo de temperatura e é
caracterizada por uma elevada aptidão para fermentar a glucose e por um baixo grau de
insaturação de ácidos gordos na gama das temperaturas superiores à óptima de
crescimento [Sinigaglia et al., 1993].
As células em fase exponencial são muito mais termosensíveis do que em fase
estacionária [Rosenberg & Wood, 1957; Sherman, 1956, 1959], sendo a formação da
gémula o período mais sensível aos efeitos nefastos da temperatura elevada, uma vez que
corresponde ao momento em que se realiza a síntese de DNA nuclear [Williamson, 1965].
Parry e colaboradores (1976) confirmaram que as células em fase exponencial de
crescimento apresentaram uma resistência mínima ao choque térmico (52ºC, durante 30
minutos) comparativamente com as células em fase estacionária, confirmando a maior
termossensibilidade que já havia sido descrita pelos outros autores [Parry et al., 1976]. Para
além disso, trabalhos posteriores têm vindo também a confirmar este tipo de comportamento
[Piper, 1993; Werner-Washburne et al., 1993; Steels et al., 1994; Hallberg & Hallberg, 1996].
Vários autores referem as consequências ao nível celular da exposição de células de S.
cerevisiae em fase exponencial a temperaturas superiores à temperatura óptima de
crescimento: perda rápida de viabilidade [Schenberg-Fascino & Moustacchi, 1972; Sanchez
& Lindquist, 1990], indução de síntese de proteínas de choque térmico e transposição
gradual de células para a fase G1 do ciclo celular [Johnston & Singer, 1980], tornando-as
termotolerantes [Lindquist & Craig, 1988]. Células termotolerantes em fase estacionária
apresentam elevados níveis de proteínas de choque térmico [Boucherie, 1985; Petko &
Lindquist, 1986; Piper, 1993; Werner-Washburne et al., 1993; Steels et al., 1994; Hallberg &
Hallberg, 1996].
Hunter e Rose (1972) estudaram a composição lipídica de S. cerevisiae cultivada a 15ºC
e a 30ºC, tendo observado que a diminuição da temperatura de crescimento da cultura era
acompanhada por um aumento na composição total de lípidos, de ácidos gordos,
triacilgliceróis e de fosfolípidos (maioritariamente fosfatidilcolina), não alterando a
composição de diacilgliceróis, ácidos gordos livres, esteróis e ésteres de esteróis [Hunter &
INTRODUÇÃO GERAL
19
Rose, 1972]. Walton e Pringle (1980) postularam que as lesões na membrana plasmática
são os eventos letais primários provocados por altas temperaturas [Walton & Pringle, 1980].
O estudo realizado por Torija e colaboradores (2003) demonstrou que o grau de insaturação
dos lípidos da membrana plasmática de S. cerevisiae foi afectado pela temperatura de
crescimento [Torija et al., 2003a]. Para além disso, alguns autores verificaram que quanto
menor é a temperatura de crescimento, mais insaturados são os ácidos gordos da
membrana plasmática [Kates & Baxter, 1962; Arthur & Watson, 1976; Watson et al., 1976;
Watson & Rose, 1980; Watson, 1984]. S. cerevisiae, por exemplo, encurtou o comprimento
das cadeias de ácidos gordos, através do aumento da quantidade de ácido palmitoleico
comparativamente à quantidade de ácido oleico, ao se baixar a temperatura de crescimento
de 35ºC para 10ºC [Suutari et al., 1996]. Hilge-Rotmann e Rehm (1991) observaram que um
elevado grau de saturação dos ácidos gordos conferiu uma protecção elevada para a célula,
dada a correlação positiva entre a percentagem de saturação de ácidos gordos totais e taxa
de fermentação de células imobilizadas de S. cerevisiae [Hilge-Rotmann & Rehm, 1991].
Estudos realizados por Gorenstein e Warner (1976, 1977) demonstraram que a
exposição de células mutantes (sensíveis à temperatura) de S. cerevisiae a temperaturas
não toleradas (33 e 36ºC) provocou uma diminuição exponencial da síntese de mais de 40
proteínas ribossomais, para ≈ 10 - 20% dos níveis basais em células crescidas a 23ºC
[Gorenstein & Warner, 1976; Warner & Gorenstein, 1977]. A diminuição da síntese proteica
ribossomal observada no mutante resultou de uma redução dos níveis de transcrição
[Watson, 1987]. Miller (1970, 1982) e McAlister (1979), juntamente com os seus
colaboradores, observaram indução e repressão da síntese de numerosos polipéptidos após
um aumento da temperatura de 22-23ºC para 36-37ºC, levando à alteração gradual dos
padrões de síntese proteica com o aumento de temperatura [Miller et al., 1970; McAlister et
al., 1979; Miller et al., 1982].
A resposta ao choque térmico é um sistema protector das células que envolve várias vias
de regulação. Sob stresse térmico subletal, é induzida uma resposta altamente conservada
que provoca alterações marcadas na expressão génica, resultando na indução da síntese
de proteínas de choque térmico (HSPs) e na repressão da maioria das outras proteínas
produzidas previamente ao choque [Bond, 2006]. Paralelamente, nestas situações as
células acumulam uma grande quantidade de trealose que actua principalmente na
protecção da membrana e, em algumas situações específicas, pode servir como hidrato de
carbono de reserva [Van Laere, 1989; Wiemken, 1990]. O choque térmico provoca
igualmente um aumento do teor de glucose intracelular, com inibição parcial da glicólise
[Neves & Francois, 1992]. Como tal, a conversão da glucose em trealose pode ser ainda
uma das vias de protecção face aos níveis potenciais de toxicidade resultantes da
incompleta fosforilação da glucose em glucose-6-fosfato, que se realiza imediatamente após
INTRODUÇÃO GERAL
20
a entrada de glucose na célula. Outros autores referem ainda que nestas situações de
stresse térmico subletal se observa igualmente o estímulo da actividade da H+-ATPase
membranar e da via RAS-adenilato ciclase [Piper, 1993].
Relativamente ao efeito da temperatura sobre a dinâmica de populações de S. cerevisiae
ao longo de fermentação vinária, Torija e colaboradores (2003) observaram curvas de
crescimento com a sequência normal de fases (latência, exponencial, estacionária e
declínio) em fermentações conduzidas a 25 e 30ºC, enquanto a 35ºC observaram uma
elevada taxa de mortalidade de leveduras [Torija et al., 2003b]. Este fenómeno pode estar
na origem de uma fase estacionária mais curta e do amuo de fermentação num período em
que a concentração de açúcares residuais era ainda elevada. Estes resultados estão de
acordo com estudos feitos anteriormente que revelaram que a viabilidade das leveduras
diminuiu à medida que a temperatura de crescimento aumenta [Ough, 1966; Nagodawithana
et al., 1974; Casey et al., 1984], o que pode ser explicado com base na alteração da
estrutura da membrana plasmática [Lucero et al., 2000] e nos efeitos de uma elevada
acumulação de etanol no meio intracelular a elevadas temperaturas, produzindo toxicidade
celular [Nagodawithana et al., 1974]. A hipótese postulada por Nagodawithana e
colaboradores (1974) de uma possível acumulação de etanol no meio intracelular foi
refutada por estudos da década seguinte, na medida em que Loureiro e Ferreira (1983)
observaram uma elevada permeabilidade da membrana plasmática ao 14C-etanol adicionado
ao meio extracelular, indiciando uma baixa probabilidade deste composto se ligar a algum
componente da célula de forma a ficar retido [Loureiro & Ferreira, 1983]. Guijarro e Lagunas
(1984) afirmaram que o etanol atravessa a membrana plasmática por difusão simples,
suportando esta hipótese após terem verificado que, por um lado, a taxa de efluxo de etanol
era superior à capacidade de produção de etanol e, por outro, a concentração intracelular de
etanol determinada era similar à concentração do composto presente no meio extracelular
[Guijarro & Lagunas, 1984]. Suportados nestes resultados, Dombek e Ingram (1986),
confirmaram a elevada permeabilidade da célula ao etanol, fornecendo evidências da
existência de concentrações similares de etanol produzido na célula e no meio extracelular
[Dombek & Ingram, 1986]. Estudos recentes indicaram que a expressão do gene FPS1, que
codifica para uma aquagliceroporina que, por sua vez, medeia o efluxo de glicerol em
condições de stresse ao etanol, contribui para uma diminuição da acumulação de etanol no
interior de células de leveduras, sugerindo que Fps1p pode ser igualmente responsável pela
regulação dos níveis intracelulares de etanol durante os processos de fermentação [Teixeira
et al., 2009].
Para além do efeito da temperatura sobre a dinâmica de população, Torija e
colaboradores (2003) estudaram igualmente o efeito da temperatura de fermentação no
metabolismo das leveduras, na medida em que a temperatura determina a composição
química do vinho [Torija et al
concentração de álcool no meio diminuiu à m
aumenta, estando estes resultados de acordo com o decréscimo do rendimento de etanol e
com a redução da utilização de substrato, observadas por Casey
& Ingledew, 1986].
1.4.1.3. Disponibilidade de oxig
O oxigénio molecular (O2) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,
a síntese do grupo hemo [Snoek & Steensma, 2007], dos esteróis [Rosenfeld & Beauvoit,
2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidi
al., 1992] e dos desoxirribonucleótidos [Chabes
Os esteróis são produzidos através de uma via dependente de O
Figura 4: Representação das etapas de consumo de OSnoek & Steensma, 2007).
Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O
molécula de O2 para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O
conversão de lanosterol a zimosterol e 2 moléculas de O
ergosterol [Rosenfeld & Beauvoit, 2003].
São conhecidas pelo menos 3 razões para as adaptações celulares necessárias para a
célula crescer em anaerobiose [Snoek & Steensma, 2007]: (1) baixo rendimento energético
em anaerobiose, (2) necessidade de O
fluxo de diferentes moléculas entre o interior e exterior da célula.
Em condições de anaerobiose, as células de leveduras são incapazes de completar a
biossíntese de ácidos gordos insaturad
intermediários do metabolismo dos lípidos [Bardi
al., 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose,
altera progressivamente a composi
superficial das membranas dos organelos), “diluindo
1982]. Isto faz com que se observe que em anaerobiose, a membrana plasmática contém
uma maior percentagem de ácido
totais, ergosterol e esqualeno [Nurminen
explicadas através da incapacidade da célula em sintetizar estes compostos na ausência de
O2. Os resultados obtidos por
et al., 2003a]. Nos ensaios realizados, verificou
concentração de álcool no meio diminuiu à medida que a temperatura de fermentação
aumenta, estando estes resultados de acordo com o decréscimo do rendimento de etanol e
com a redução da utilização de substrato, observadas por Casey e Ingledew (1986)
Disponibilidade de oxigénio
) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,
a síntese do grupo hemo [Snoek & Steensma, 2007], dos esteróis [Rosenfeld & Beauvoit,
2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidi
., 1992] e dos desoxirribonucleótidos [Chabes et al., 2000].
Os esteróis são produzidos através de uma via dependente de O2 (Figura
Representação das etapas de consumo de O2 na biossíntese de ergosterol (Adaptado de
Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O
para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O
conversão de lanosterol a zimosterol e 2 moléculas de O2 para a conversão de zimosterol a
ergosterol [Rosenfeld & Beauvoit, 2003].
São conhecidas pelo menos 3 razões para as adaptações celulares necessárias para a
célula crescer em anaerobiose [Snoek & Steensma, 2007]: (1) baixo rendimento energético
cessidade de O2 de diversas vias metabólicas de biossíntese e (3)
fluxo de diferentes moléculas entre o interior e exterior da célula.
Em condições de anaerobiose, as células de leveduras são incapazes de completar a
biossíntese de ácidos gordos insaturados (UFAs) e de ergosterol, e acumulam
intermediários do metabolismo dos lípidos [Bardi et al., 1998; Bardi et al
, 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose,
altera progressivamente a composição das suas fracções lipídicas (reduzindo a área
superficial das membranas dos organelos), “diluindo-a” até ao limite de viabilidade [Henry,
1982]. Isto faz com que se observe que em anaerobiose, a membrana plasmática contém
uma maior percentagem de ácidos gordos saturados e uma menor quantidade de esteróis
totais, ergosterol e esqualeno [Nurminen et al., 1975]. Estas diferenças podem ser
explicadas através da incapacidade da célula em sintetizar estes compostos na ausência de
. Os resultados obtidos por Rosenfeld e colaboradores (2003) demonstraram que um
INTRODUÇÃO GERAL
21
verificou-se que a
edida que a temperatura de fermentação
aumenta, estando estes resultados de acordo com o decréscimo do rendimento de etanol e
Ingledew (1986) [Casey
) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,
a síntese do grupo hemo [Snoek & Steensma, 2007], dos esteróis [Rosenfeld & Beauvoit,
2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidinas [Nagy et
Figura 4).
na biossíntese de ergosterol (Adaptado de
Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O2: 1
para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O2 para a
rsão de zimosterol a
São conhecidas pelo menos 3 razões para as adaptações celulares necessárias para a
célula crescer em anaerobiose [Snoek & Steensma, 2007]: (1) baixo rendimento energético
de diversas vias metabólicas de biossíntese e (3)
Em condições de anaerobiose, as células de leveduras são incapazes de completar a
os (UFAs) e de ergosterol, e acumulam
et al., 1999; Belviso et
, 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose, S. cerevisiae
ção das suas fracções lipídicas (reduzindo a área
a” até ao limite de viabilidade [Henry,
1982]. Isto faz com que se observe que em anaerobiose, a membrana plasmática contém
uma menor quantidade de esteróis
., 1975]. Estas diferenças podem ser
explicadas através da incapacidade da célula em sintetizar estes compostos na ausência de
Rosenfeld e colaboradores (2003) demonstraram que um
INTRODUÇÃO GERAL
22
pulso de O2 (1 a 10 mg.L-1) pode estimular a fermentação alcoólica em anaerobiose
[Rosenfeld et al., 2003]. Por esta razão, a adição de O2 durante as fermentações vinárias é
uma prática comum e legal. O O2 é utilizado para aumentar a taxa de fermentação em
fermentações amuadas [Sablayrolles et al., 1996], sendo que a sua adição (1,5 a 3,5mg
O2.g-1 p.s. células) é eficiente apenas se for feita no momento em que as células se
encontram no final da fase exponencial [Sablayrolles & Barre, 1986; Sablayrolles, 1990;
Blateyron et al., 1998].
A biossíntese de ergosterol parece ser essencial para a tolerância ao etanol,
particularmente durante a fermentação de mosto de uva, processo em que as leveduras
estão activas em condições de baixa oxigenação e crescentes concentrações de etanol
[Shobayashi et al., 2005]. De facto, a eficiência fermentativa e a resistência ao etanol estão
geralmente associadas a um aumento na razão ergosterol/fosfolípido e a um decréscimo do
índice de saturação de ácidos gordos nas células de levedura [Sajbidor et al., 1995; Chi &
Arneborg, 1999], podendo estar na origem da entrada em fase estacionária de crescimento.
Em condições de anaerobiose, as células não conseguem sintetizar esteróis, tendo
necessidade de os obter a partir do meio. O transporte de esteróis para o interior da célula é
pois essencial para a fisiologia da célula quando esta se encontra em condições de
anaerobiose [Wilcox et al., 2002]. Os níveis celulares de ergosterol e de oleato são
importantes para os processos de transferência de solutos entre os meios intra e
extracelular [Burke et al., 1997; Ness et al., 1998]. No crescimento celular, em condições de
ausência de O2, o oleato pode ser adicionado ao meio na forma de Tween 80, podendo ser
igualmente utilizado como fonte de ácidos gordos insaturados (UFAs).
O efeito de limitação de oxigénio sobre a biossíntese de lípidos é exercido quer de forma
directa, por bloqueio das enzimas dependentes de O2 (e.g. ∆9-dessaturase, esqualeno
epoxidase, complexo de desmetilação lanosterol) [Ratledge & Evans, 1989], quer
indirectamente, ao causar a acumulação de ácidos gordos saturados (SFAs) [Bloomfield &
Bloch, 1960] e percursores de ergosterol [Parks, 1978], que regulam negativamente a
expressão da acetil-CoA carboxilase e hidroximetilglutaril-CoA redutase, respectivamente
[Mannazzu et al., 2008].
1.4.2. Respostas ao stresse
São vários os tipos de resposta ao stresse que S. cerevisiae dispõe e que são
mencionados na literatura. Lindquist e Craig caracterizam a resposta das células de S.
cerevisiae através da aquisição de uma maior termotolerância resultante de síntese de
proteínas de choque térmico (HSPs) [Lindquist & Craig, 1988], que actuam como
chaperonas na tentativa de sequestro e remoção de proteínas danificadas ou
incorrectamente conformadas [Sanchez & Lindquist, 1990; Schlensinger, 1990]. Sob
INTRODUÇÃO GERAL
23
condições laboratoriais, a proteína de choque térmico Hsp104p demonstrou ser responsável
pela tolerância a uma série de condições de stresse (calor, etanol, arsenito e
armazenamento a baixa temperatura) [Sanchez et al., 1992] e a sua expressão demonstrou
ser suficiente para célula adquirir termotolerância [Lindquist & Kim, 1996]. Para além disso,
esta termotolerância pode também ser adquirida através de vários mecanismos fisiológicos:
produção de trealose [Wiemken, 1990], água celular não congelável [Komatsu et al., 1991],
retenção do ciclo celular na fase G0 [Plesset et al., 1987], fosforilação independente de
cAMP [Coote et al., 1992] e actividade da H+-ATPase membranar [Coote et al., 1991]. Em
2000, Sales e colaboradores demonstraram que Hsp12p desempenha funções protectoras
da membrana plasmática face ao stresse induzido pela desidratação e pelo etanol [Sales et
al., 2000].
Por outro lado, as modificações na actividade da H+-ATPase membranar de S. cerevisiae
vêm igualmente referidas como uma resposta da célula ao stresse. A enzima actua na
regulação da homeostase do pH durante situações de stresse letais, de forma a manter a
viabilidade celular. Experiências onde foram utilizados inibidores de H+-ATPase membranar
(dietilstilboestrol - DES) [Coote et al., 1991] e mutantes com actividade reduzida da H+-
ATPase [Panaretou & Piper, 1990] parecem suportar esta hipótese. Há evidências de que o
stresse térmico sub-letal resulta em 50% de redução dos níveis da enzima H+-ATPase
membranar e Panaretou (1993) demonstrou que os restantes 50% de enzima são
fosforilados, tornando-se a enzima duplamente activa [Panaretou, 1993]. Segundo Coote e
colaboradores (1994), a célula nestas condições de stresse térmico sub-letal reduz o seu
número de H+-ATPases na membrana, colocando-se a hipótese de que estas possam
constituir pontos fracos ou canais por onde se realiza uma grande parte do influxo de
protões para o interior da célula [Coote et al., 1994]. Relativamente ao stresse provocado
pelo etanol nas células de S. cerevisiae, os resultados obtidos por Rosa e Sá-Correia (1991)
revelaram que a activação da enzima H+-ATPase membranar constitui seguramente uma
resposta aos efeitos adversos deste álcool nas células (inibição da actividade da H+-ATPase
e aumento da permeabilidade da membrana ao influxo de protões) [Rosa & Sá-Correia,
1991].
Como tal, uma adaptação celular de sucesso a alterações de parâmetros extracelulares
que ocorrem durante a fermentação vinária requer a percepção (sensing) atempada de
factores ambientais químicos e físicos, seguidos de uma transmissão perfeita de informação
para os compartimentos relevantes da célula (Figura 5) [Pretorius, 2000].
Os sinais químicos que são emitidos durante a fermentação vinária incluem a
disponibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto
assimilável, oxigénio, vitaminas, minerais, ergosterol e ácidos gordos insaturados) e a
presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resídu
agroquímicos e toxinas killer
temperatura, a agitação e a pressão osmótica [Pretorius, 2000].
estão normalmente relacionadas com a m
do ciclo celular e a alteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado
[Pretorius, 2000].
1.4.3. Biodiversidade
O conhecimento da biodiversidade de leveduras (associadas à uva e à produção de
vinho) tem sido proporcionado po
influência que este tema exerce na produção de vinhos de qualidade.
Numerosos géneros e espécies de leveduras são encontrados durante a produção de
vinho. As leveduras que influenciam a composição do v
e/ou da adega, podem ter sido disseminadas por insectos voadores (mosca da fruta,
abelhas e vespas) ou podem provir de inoculações efectuadas a partir de preparações
comerciais de levedura [Boulton
muitos géneros e espécies de leveduras no mosto, o género
principalmente as espécies
responsáveis pela fermentação alcoólica [Pretorius, 2000].
A diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação
explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini
Fleet et al., 2002; Prakitchaiwattana
Renouf et al., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma
concentração de leveduras de 3
apontam para valores entre 10
Figura 5: transmissão datravés dumavias de transdução de numa célula de levedura (adaptado de Pretorius, 2000).
Os sinais químicos que são emitidos durante a fermentação vinária incluem a
ibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto
assimilável, oxigénio, vitaminas, minerais, ergosterol e ácidos gordos insaturados) e a
presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resídu
killer) [Pretorius, 2000]. Os sinais de natureza física incluem a
temperatura, a agitação e a pressão osmótica [Pretorius, 2000]. As respostas adaptativas
estão normalmente relacionadas com a mudança dos padrões de transcrição
lteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado
de leveduras
O conhecimento da biodiversidade de leveduras (associadas à uva e à produção de
vinho) tem sido proporcionado por numerosos estudos que têm realçado a importância e a
influência que este tema exerce na produção de vinhos de qualidade.
Numerosos géneros e espécies de leveduras são encontrados durante a produção de
vinho. As leveduras que influenciam a composição do vinho podem pertencer à flora da uva
e/ou da adega, podem ter sido disseminadas por insectos voadores (mosca da fruta,
abelhas e vespas) ou podem provir de inoculações efectuadas a partir de preparações
comerciais de levedura [Boulton et al., 1996; Fleet et al., 2002]. Embora sejam encontrados
muitos géneros e espécies de leveduras no mosto, o género Saccharomyces
principalmente as espécies Saccharmomyces cerevisiae e S. bayanus
responsáveis pela fermentação alcoólica [Pretorius, 2000].
diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação
explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini
., 2002; Prakitchaiwattana et al., 2004; Combina et al., 2005; Raspor
., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma
concentração de leveduras de 3x105 células.cm-2 [Rosini et al., 1982], enquanto outros
apontam para valores entre 104 e 106 células. cm-2 [Fleet et al., 2002]. Sã
INTRODUÇÃO GERAL
24
Representação da transmissão de sinais ambientais através duma rede interligada de vias de transdução de sinais numa célula de levedura (adaptado de Pretorius, 2000).
Os sinais químicos que são emitidos durante a fermentação vinária incluem a
ibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto
assimilável, oxigénio, vitaminas, minerais, ergosterol e ácidos gordos insaturados) e a
presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resíduos
) [Pretorius, 2000]. Os sinais de natureza física incluem a
As respostas adaptativas
udança dos padrões de transcrição, a modificação
lteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado
O conhecimento da biodiversidade de leveduras (associadas à uva e à produção de
r numerosos estudos que têm realçado a importância e a
Numerosos géneros e espécies de leveduras são encontrados durante a produção de
inho podem pertencer à flora da uva
e/ou da adega, podem ter sido disseminadas por insectos voadores (mosca da fruta,
abelhas e vespas) ou podem provir de inoculações efectuadas a partir de preparações
., 2002]. Embora sejam encontrados
Saccharomyces, e,
S. bayanus são as grandes
diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação
explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini et al., 1996;
., 2005; Raspor et al., 2006;
., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma
., 1982], enquanto outros
., 2002]. São 3 as espécies
INTRODUÇÃO GERAL
25
principais encontradas nas uvas: Hanseniaspora uvarum (forma anamórfica: Kloeckera
apiculata), Metschnikowia pulcherrima (forma anamórfica: Candida pulcherrima) e Candida
stellata. Segundo alguns autores, o género Hanseniaspora é normalmente o que domina a
superfície do bago de uva [Beltran et al., 2002; Combina et al., 2005; Hierro et al., 2006],
enquanto outros indicam que o género dominante é Candida [Torija et al., 2001; Clemente-
Jimenez et al., 2004]. O factor chave que determina as espécies presentes na superfície das
uvas parece ser o estado de sanidade com que se encontra a uva, nomeadamente a
ausência ou presença de lesões na película. No caso de ruptura da película do bago, quer
por lesões físicas (mediadas por insectos, aves ou espécies fúngicas invasivas), quer por
enrugamento (provocado pela desidratação do bago), pode ocorrer um enriquecimento em
leveduras ascomicetas (Hanseniaspora, Candida e Metschnikowia) [Parish & Carroll, 1985;
Fleet et al., 2002; Prakitchaiwattana et al., 2004], que vão dominar a flora superficial do bago
à medida que a uva amadurece [Rosini et al., 1982; Prakitchaiwattana et al., 2004]. Pode
ainda ocorrer a presença de outros géneros de leveduras, apesar de este tema não ser
consensual.
Durante o amadurecimento da uva ocorre uma modificação das espécies que estão
presentes na superfície das uvas, dominando, numa primeira fase, as leveduras
basidiomicetas (Aureobasidium, Cryptococcus, Rhodosporidium e Rhodotorula), enquanto
no final do amadurecimento as leveduras basidiomicetas são substituídas por ascomicetas
(Hanseniaspora, Candida e Metschnikowia) [Bisson & Joseph, 2009]. Nos diversos estudos
existentes em que as uvas foram colhidas de vinhas de diferentes regiões no mundo, as
diferenças observadas ao nível das espécies que dominam a superfície podem ser
atribuídas a factores como o clima, a altitude, os vectores existentes (e.g. insectos
voadores), a variedade da uva, a sanidade do bago e as práticas na vinha [Bisson & Joseph,
2009].
Um número reduzido de estudos tem sido dedicado à flora existente nas superfícies de
equipamentos e do material utilizado em adega. Foi demonstrado por alguns autores que a
flora de adega representa uma fonte significativa de inoculação do mosto e do vinho [Fleet &
Heard, 1993; Renouf et al., 2007]. O material utilizado e as práticas de sanificação e de
suplementação de nutrientes determinam a flora de adega. Dos estudos realizados às
superfícies dos barris, há a indicação da presença de uma elevada concentração de
Saccharomyces, enquanto Candida, Cryptococcus e Brettanomyces estão presentes em
concentração baixa [Renouf et al., 2006a, 2007]. As bactérias e bolores podem ser
igualmente encontrados à superfície do equipamento [Picco & Rodolf, 2004].
Os estudos realizados à flora existente durante a fermentação vinária permitiram dividir a
fermentação em: inoculada ou espontânea. A fermentação espontânea é a que é conduzida
pela flora indígena das uvas e da adega. Numerosos estudos têm sido dedicados à
INTRODUÇÃO GERAL
26
persistência da flora não-Saccharomyces durante as fermentações espontâneas [Torija et
al., 2001; Beltran et al., 2002; Hierro et al., 2006; Xufre et al., 2006] e o crescimento
significativo destas espécies durante as fermentações tem vindo a ser associado à produção
de vinhos de baixo carácter e resultantes de fermentações amuadas [Bisson, 1999]. Todos
estes estudos relativos à flora de não-Saccharomyces demonstraram um padrão
semelhante de evolução das espécies de fermentação. No início do processo, as espécies
presentes na superfície da uva (leveduras basidiomicetas e oxidativas ascomicetas)
parecem ser as que dominam a fermentação. À medida que a fermentação prossegue, os
níveis destas leveduras diminuem, ao passo que os níveis de Saccharomyces aumentam
[Fleet & Heard, 1993]. No final de fermentação, Saccharomyces é o principal género
encontrado e possivelmente o único capaz de ser isolado. A biodiversidade de estirpes
vínicas do género Saccharomyces durante a fermentação alcoólica resulta provavelmente
dos processos de selecção natural e de mutagénese aleatória [Bisson & Joseph, 2009].
A origem de S. cerevisiae é ainda objecto de alguma discussão, muito embora já se
tenha descoberto que esta espécie se encontra praticamente ausente do bago de uva e dos
solos da vinha [Martini & Vaughan-Martini, 1990]. Alguns autores propõem que S. cerevisiae
tenha como habitat “natural” as plantas produtoras de frutos [Mortimer & Polsinelli, 1999;
Sniegowski et al., 2002]. Por outro lado, existem outros autores que postulam que S.
cerevisiae é uma espécie domesticada originada a partir da espécie selvagem S. paradoxus
largamente disseminada pelo mundo, associada a insectos, exsudados de árvores e a
extractos de planta fermentescíveis [Naumov, 1996]. A ocorrência de S. cerevisiae na vinha
seria, portanto, o resultado de uma transferência espacial da adega para a vinha, via
insectos [Naumov, 1996].
Loureiro e Malfeito-Ferreira (2003) atribuíram uma classificação em grupos empíricos das
leveduras associadas ao vinho, de acordo com as suas propriedades tecnológicas [Loureiro
& Malfeito-Ferreira, 2003]. Leveduras oxidativas basidiomicetas, sem interesse ao nível
enológico, como Sporobolomyces, Cryptococus, Rhodotorula, Filobasidium spp. e
Aureobasidium pullulans, dominam o ambiente vínico (solo, madeira, folhas e bagos de
uvas) [Davenport, 1974; Sabate et al., 2002; Subden et al., 2003; Prakitchaiwattana et al.,
2004; Renouf et al., 2005]. Nas espécies pertencentes aos ascomicetas estão inseridas as
leveduras apiculadas fracamente fermentativas (Hanseniaspora e Kloeckera spp.) e as
leveduras oxidativas ascomicetas (principalmente Candida, Pichia e Metschnikowia spp.),
presentes em bagos maduros sãos [Davenport, 1974; Sabate et al., 2002; Jolly et al., 2003;
Subden et al., 2003; Prakitchaiwattana et al., 2004; Renouf et al., 2005]. O último grupo
inclui as espécies fermentativas contaminantes da uva, que podem representar uma ameaça
para a alteração do vinho, principalmente nas situações em que a película do bago da uva
está danificada, com saída de mosto para a superfície do bago [Mortimer & Polsinelli, 1999;
INTRODUÇÃO GERAL
27
Barata et al., 2008]. Neste grupo estão compreendidos Torulaspora spp.,
Zygosaccharomyces spp. e Dekkera spp. [Fleet et al., 2002].
1.5. Objectivos da dissertação
Este trabalho teve como objectivo geral avaliar, de uma forma integrada, parâmetros
fisiológicos determinantes na manutenção da viabilidade celular da estirpe Saccharomyces
cerevisiae ISA 1000, acompanhando a sua evolução ao longo do processo de fermentação
vinária a duas temperaturas (15ºC e 30ºC).
Especificamente avaliaram-se vários parâmetros relacionados com a homeostase de
protões em pontos definidos ao longo de fermentação de mosto de uva branca,
nomeadamente:
� pH intracelular;
� Efluxo de H+ através da membrana plasmática;
� Permeabilidade da membrana a H+.
Paralelamente comparou-se o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 com o da
mesma estirpe em plena fase exponencial de crescimento (D.O.640nm 1), cultivada em
condições laboratoriais comuns (meio mineral, 2% (p/v) glucose).
MATERIAL E MÉTODOS
28
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado neste estudo foi a estirpe ISA 1000 de Saccharomyces
cerevisiae, pertencente à Colecção de Leveduras do Instituto Superior de Agronomia. Esta
estirpe foi isolada a partir de uma preparação comercial de levedura seca activa para
vinificação, de origem francesa, designada comercialmente por FERMIVIN®.
Para a execução dos ensaios de determinação do pH intracelular foi ainda utilizada uma
segunda estirpe de S. cerevisiae W303-1A (MATa his3 leu2 trp1 ura3 ade2) [Wallis et al.,
1989].
2.2. Meios de cultura
Para a manutenção das culturas utilizou-se o meio YPD (“Yeast extract Peptone
Dextrose”), com a seguinte composição: glucose 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de
levedura 0,5% (p/v), agar 2% (p/v), em água desmineralizada pH 5,6. Este meio de cultura
foi igualmente utilizado para a contagem em placas das unidades formadoras de colónias
(UFC).
Durante o presente trabalho realizaram-se ensaios em paralelo com células cultivadas
em meio mineral K [van Uden, 1967] (Anexo III) e em mosto de uva branca proveniente das
vindimas de 2008 das vinhas do Instituto Superior de Agronomia.
Nos casos em que se cultivou a estirpe S. cerevisiae W-303, suplementou-se o meio K
com uracilo (0,08 g/L), adenina (0,08 g/L), histidina (0,08 g/L), triptofano (0,32 g/L) e leucina
(0,16 g/L), tendo em consideração as marcas auxotróficas da estirpe (Anexo III).
Relativamente ao mosto de uvas brancas, nas etapas preliminares de preparação foi-lhe
adicionado 50 mg/l de SO2 e 10 mg/l de enzima clarificante Novoclair® Speed. Foi,
igualmente, sujeito a um processo de decantação de 2 dias, a 5ºC, com o objectivo de lhe
serem removidos os sólidos de maiores dimensões.
O processo de conservação e esterilização do mosto teve como premissa a preservação
máxima das suas características originais, executando procedimentos que visassem a
minimização da alteração por factores de deterioração, nomeadamente, através da
minimização da exposição ao O2, à luz e a temperatura elevadas.
Foram-nos disponibilizados 100 L de mosto pelo Instituto Superior de Agronomia, que foi
dividido em alíquotas de aproximadamente 1 L, colocadas em sacos de plástico
devidamente selados, aos quais foi retirado o O2. Estes sacos foram colocados dentro de
outros, de forma a reforçar a barreira mosto/O2, bem como a evitar possíveis condensações
de água que alterassem a sua composição e foram congelados na câmara a -80ºC.
MATERIAL E MÉTODOS
29
Sempre que necessário procedeu-se à descongelação à temperatura ambiente, durante a
noite e ao abrigo da luz, da fracção de mosto a utilizar. Posteriormente procedeu-se à sua
esterilização, de acordo com a seguinte metodologia: centrifugação (Eppendorf 5810R
Centrifuge) a 12000 g, a 4ºC, com o objectivo de serem removidos, tanto quanto possível, os
sólidos de maiores dimensões presentes em suspensão, seguida de filtrações sucessivas
com membranas de poros progressivamente menores, começando por uma membrana de
1,2 µm (Whatman GF/C), passando para uma membrana de 0,45 µm (Millipore TYPE HA),
terminando numa filtração esterilizante com membrana de 0,22 µm (Millipore TYPE GSWP).
O mosto estéril foi conservado a 4ºC, protegido da luz.
2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras
2.3.1. Manutenção das culturas
As estirpes foram repicadas para tubos com meio sólido inclinado (meio YPD, secção
2.2) e incubadas em estufa, durante 24 a 48h, a 28ºC, após o qual foram mantidas a 4ºC.
Executou-se este procedimento em todos os momentos que antecederam os ensaios, de
forma a manter a cultura fresca e/ou a obter suficiente biomassa para os inóculos
necessários.
2.3.2. Quantificação de biomassa
2.3.2.1. Acompanhamento das culturas
O acompanhamento do crescimento celular realizou-se através da leitura da densidade
óptica das culturas, a 640 nm (D.O.640nm), utilizando-se um espectrofotómetro Ultrospec 2100
pro (Amersham Biosciences®). As amostras foram retiradas em intervalos de tempo
adequados e diluídas com água desmineralizada sempre que a D.O.640nm excedeu o valor de
0,45, de forma a assegurar a proporcionalidade entre a D.O.640nm e a biomassa presente.
2.3.2.2. Peso seco
Para determinar a quantidade de biomassa presente nos ensaios de medição das
velocidades do efluxo protónico, permeabilidade aos H+ da membrana plasmática,
determinou-se o peso seco contido num volume de 100 µL de suspensão, utilizando
pequenas folhas de alumínio pré-pesadas. Estas foram colocadas numa estufa a 80ºC,
durante 24 horas. Após este período, foram colocadas num excicador e deixou-se arrefecer
até atingir a temperatura ambiente, pesando-se posteriormente numa balança analítica.
Nos ensaios de determinação do pH intracelular filtraram-se determinados volumes de
suspensão de células, utilizando membranas filtrantes Millipore TYPE GSWP de porosidade
0,22 µm, pré-taradas, de forma a obter um peso seco celular mínimo de 5 mg/membrana.
MATERIAL E MÉTODOS
30
2.3.3. Preparação do pré-inóculo
A preparação do pré-inóculo, foi realizada por transferência de uma ansada de biomassa
fresca (proveniente de um tubo com meio inclinado) para um balão de Erlenmeyer de 200
mL, contendo 100 mL de meio K ou de mosto estéril, conforme a experiência subsequente.
As culturas foram incubadas, com agitação orbital (Shel Lab SI Series), a 130 rpm, a 28ºC,
durante aproximadamente 24 horas, de modo a manter as células em fase exponencial no
momento da sua colheita. Preparou-se um pré-inóculo anteriormente a cada ensaio com o
objectivo de reavivar as células, diminuindo o choque que lhes é causado quando se
procede à sua transferência entre meios de cultura com estados físicos diferentes.
2.3.4. Ensaios em meio mineral
Nos ensaios em meio mineral, inoculou-se 200 mL de meio K em balões de Erlenmeyer
de 500 mL, a partir de uma cultura em crescimento exponencial (pré-inóculo). A quantidade
de células a inocular nestes balões foi controlada através da D.O.640nm, (D.O.640nm inicial
≈0,05). De seguida, incubaram-se as células com agitação magnética a 130 rpm, a 15ºC ou
30ºC (conforme o ensaio), até atingir D.O.640nm 1.
2.3.5. Ensaios em mosto estéril
No que respeita às inoculações em mosto estéril, as células foram contadas em
hemocitómetro (após crescimento do pré-inóculo até fase exponencial) e procedeu-se à
inoculação de 1 x 106 células/mL de mosto (concentração habitualmente utilizada nas
adegas a partir de inóculos comerciais), em 800 mL de mosto estéril, contidos num balão de
Erlenmeyer de 1000 mL, previamente termostatizado à temperatura do ensaio a realizar
(15ºC ou 30ºC). De seguida, incubou-se a cultura a 15ºC ou 30ºC, com agitação magnética
a 130 rpm e ausência de arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação.
2.3.6. Pontos de amostragem
Ao longo dos vários ensaios realizados em mosto recolheram-se células nos seguintes
pontos de amostragem:
a. Para 15ºC colheram-se células em 6 pontos, correspondentes a 6 fases diferentes
de crescimento: início da fase exponencial (P1), meio da fase exponencial (P2),
final da fase de exponencial (P3), início da fase estacionária (P4), meio da fase
estacionária (P5) e final de fermentação (P6).
b. Para 30ºC, dado a quase ausência de fase de latência, colheram-se células em 5
pontos, correspondentes a 5 fases diferentes de crescimento: meio da fase
MATERIAL E MÉTODOS
31
exponencial (P1), final da fase de exponencial (P2), início da fase estacionária
(P3), meio da fase estacionária (P4) e final de fermentação (P5).
2.4. Ensaios preliminares de crescimento
Com vista à determinação da duração da fase de latência e do tempo de duplicação das
culturas em meio mineral e em mosto, bem como à determinação do período de
fermentação e à selecção dos pontos de amostragem para recolha de células usadas nos
restantes ensaios, realizaram-se ensaios preliminares de crescimento nos dois meios de
cultura utilizados ao longo do trabalho.
2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral
Os ensaios em meio mineral para as duas estirpes de S. cerevisiae (ISA 1000 e W-303)
foram executados conforme descrito na secção 2.3., tendo-se colhido amostras para
medição de absorvância a 640nm ao longo do tempo, como regra de hora a hora.
2.4.2. Ensaios preliminares em mosto
Nos ensaios de crescimento em mosto estéril, para além de se ter acompanhado a
evolução das D.O.640nm, retiraram-se amostras para medir igualmente a evolução de
parâmetros físico-químicos do mosto e de parâmetros de crescimento da estirpe S.
cerevisiae ISA 1000.
2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos
Relativamente aos parâmetros físico-químicos do mosto, foi medido o pH extracelular por
leitura directa de uma amostra no eléctrodo de pH (PHM220, Lab pH METER), a massa
volúmica do mosto (pesando-se, em duplicado, volumes rigorosamente conhecidos, 1000 µL
e 500 µL, de sobrenadante recolhido após centrifugação, 5 minutos a 14000 rpm, de
amostra numa centrífuga de bancada) e ºBrix por leitura directa, recorrendo a um
refractómetro (Portable Refractometer Brix/ATC).
O teor em glucose no mosto, durante o processo de fermentação, foi seguido
qualitativamente recorrendo às tiras-teste DIABUR-TEST® 5000 (para controlo da
fermentação, considerando-se que esta terminou quando se observou o esgotamento da
glucose). Para além disso, recolheram-se amostras de sobrenadante que, após terem sido
centrifugadas durante 5 minutos a 14000 rpm, foram utilizadas para determinação mais fina
das concentrações de glucose (g/L) e de etanol (g/L).
MATERIAL E MÉTODOS
32
2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento
Paralelamente, determinou-se o peso seco de acordo com o descrito no ponto 2.3.2.2. e
o número de UFC/mL (determinado através do método de espalhamento em placa),
procedendo-se ao espalhamento de 100 µL de suspensão de células em placas de meio
YPD e incubação a 28ºC, durante 48 a 72 horas. Após este período contou-se o número de
colónias por placa. Sempre que necessário foram efectuadas diluições, de forma a garantir
que o número de colónias se situasse entre as 30 – 300 colónias / placa. As amostras foram
plaqueadas em triplicado.
2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto
2.5.1. Base do método
A determinação de glucose consumida ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a
15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM,
Roche, cat. 10.716.251.035).
Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:
(a) Na primeira, a D-glucose é fosforilada, na presença da enzima hexocinase (HK) e
de adenosina-5’-trifosfato (ATP), a D-glucose-6-fosfato (G-6-P), com consequente
formação de adenosina-5’-difosfato (ADP).
(b) Na segunda, na presença da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH),
a glucose-6-fosfato é oxidada pelo dinucleotídeo fosfatado de nicotinamida –
adenina (NADP) a 6-fosfoglucono-∂-lactona, com formação de dinucleotídeo
reduzido de nicotinamida – adenina (NADPH).
A quantidade de NADPH formada na reacção (2) é estequiometricamente equivalente à
quantidade de D-glucose consumida na reacção (1). O aumento da quantidade de NADPH
formada é medido através da leitura de absorvância a 340nm.
2.5.2. Procedimento experimental
Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:
Solução 1: 7,2g de mistura em pó (tampão trietanolamina, pH 7,6, NADP, 110mg; ATP, 260mg; sulfato de magnésio) com 45 mL de água redestilada. Solução 2: 1,1 mL de hexocinase, 320U; glucose-6-fosfato desidrogenase, 160U.
D-glucose + ATP G-6-P + ADP HK (1)
G-6-P + NADP+ 6-fosfoglucono-∂-lactona + NADPH + H+ G6P-DH
(2)
MATERIAL E MÉTODOS
33
(a)
Fase de crescimento Factor de diluição
Inocula ção 500
Início de exponencia l 500
Meio de exponencia l 500
Final de exponencia l 500
Início de esta cionária 500
Meio de estacionária 100
Final de fermentação 1
(b)
Fase de crescimento Factor de diluição
Inoculação 500
Meio de exponencia l 500
Fina l de exponencia l 500
Início de es tacionária 500
Meio de es tacionária 100
Fina l de fermentação 1
Foram pipetados 500µL da solução 1, 50µL da amostra, 950µL de água destilada para
uma cuvete e agitou-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionou-se
20µL da solução 2. Agitou-se novamente. Após 15 minutos leu-se novamente a absorvância.
Sempre que necessário diluiu-se a amostra, de forma a ficar dentro dos limites do método
(Tabela 3).
Tabela 3: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.
onde,
∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco
onde,
c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,520 mL MW – Massa molecular da glucose: 180,16g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL
2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto
2.6.1. Base do método
A determinação do etanol produzido ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a
15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM,
Roche, cat. 0.176.290).
Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:
∆A = (A2 - A1)amostra – (A2 – A1)branco (3)
c = ε.ν.1000
V. MW . ∆A (4)
MATERIAL E MÉTODOS
34
(a)
Fase de crescimento Factor de diluição
Inocul ação 10
Iníci o de exponencia l 100
Meio de exponencia l 1000
Fina l de exponencia l 1000
Iníci o de es taci onári a 5000
Meio da es taci onári a 5000
Fina l de fermentação 5000
(b)
Fase de crescimento Factor de diluição
Inocul ação 10
Meio de exponenci al 1000
Fina l de exponenci al 1000
Iníci o de es tacionária 5000
Meio da estacionária 5000
Fina l de fermentação 5000
(a) Na primeira, o etanol é oxidado a acetaldeído, através da acção do dinucleotídeo de
nicotinamida – adenina (NAD), na presença da enzima álcool desidrogenase (ADH).
O equilíbrio desta reacção tende naturalmente para o 1º membro (etanol e NAD). No
entanto, em condições alcalinas o equilíbrio pode ser completamente deslocado para o 2º
membro.
(b) Na segunda, o acetaldeído formado na reacção (6) é quantitativamente oxidado a
acido acético, na presença da enzima aldeído desidrogenase (Al-DH).
A quantidade de NADH formada na reacção (6) é estequiometricamente equivalente à
quantidade de etanol consumido na reacção (5). O aumento da quantidade de NADH
formado é medido através da leitura de absorvância a 340nm.
2.6.2. Procedimento experimental
Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:
Mistura 2: Pastilha (NAD, 4mg; aldeído desidrogenase, 0,8U) com 3mL de tampão disulfato de potássio a pH 9. Suspensão 3: ADH, 7000U.
Foram pipetados 1500µL da mistura 2 e 50µL de amostra para cuvetes, taparam-se com
parafilme e agitaram-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionaram-
se 25µL da suspensão 3, tapando e agitando novamente as cuvetes. Após 10 minutos leu-
se novamente a absorvância.
Sempre que necessário diluiu-se a amostra de modo a ficar dentro dos limites do método
(Tabela 4).
Tabela 4: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.
(5) Etanol + NAD+ Acetaldeído + NADH + H+ ADH
Ácido acético + NADH + H+ (6) Acetaldeído + NAD+ + H2O Al-DH
MATERIAL E MÉTODOS
35
Foram utilizadas as seguintes fórmulas:
onde,
∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco
onde,
c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,575 mL MW – Massa molecular do etanol: 46,07g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL
2.7. Determinação do pH intracelular
2.7.1. Base do método
O pH intracelular (pHin) foi determinado pelo método descrito por Rottenberg (1979) que
consiste na medição da distribuição relativa de um ácido orgânico fraco marcado
radioactivamente com 14C entre os meios intracelular e extracelular das células.
Este método baseia-se na utilização de ácidos ou bases cujas espécies neutras se
difundem através da membrana, sendo esta impermeável às respectivas formas iónicas.
Utilizam-se ácidos quando o pH intracelular é superior ao pH externo.
Sempre que um ácido (AH) atinge uma situação de equilíbrio no interior (in) e no exterior
(ex) da célula (AHin = AHex) e atendendo a que as suas moléculas se dissociam em ambos
os lados da membrana (assumindo que a constante de dissociação – Kd – não varia),
obtém-se:
no equilíbrio:
se o pH extracelular (pHex) > pK + 1, a maior parte do ácido está na forma ionizada nos dois
lados da membrana e a medida da razão da distribuição do ácido permite calcular o ∆pH, de
acordo com a equação anterior. Caso contrário, uma fracção significativa do ácido
∆A = (A2 - A1)amostra – (A2 – A1)branco (7)
c = ε . ν . 2 . 1000
V. MW . ∆A (8)
(10) pHin – pHex = ∆pH = log [A-]in
[A-]ex
(9) Kd = [H+]in [A
-]in
[AH]in
[H+]ex [A-]ex
[AH]ex =
MATERIAL E MÉTODOS
36
encontrar-se-á na forma não ionizada e, tendo em conta que a concentração total do ácido
(AT) é expressa por: AT = A- + AH, obtém-se, então, no equilíbrio:
onde, ATin e AT
ex são, respectivamente, as concentrações totais interna e externa do ácido
propiónico e Kd a sua constante de dissociação. Resolvendo a equação (11) em ordem ao
pH intracelular, vem:
a qual permite estimar o valor do pH intracelular.
2.7.2. Características das soluções utilizadas
Para a execução deste ensaio foram preparadas soluções radioactivas de [1– 14C] ácido
propiónico (NENTM) e de [7-14C] ácido benzóico (NENTM) (utilizado com a mesma
metodologia que o anterior), tendo por base as suas características iniciais:
(a) [1- 14C] ácido propiónico: quantidade de radioactivo presente em 0,25 mL de etanol - 9,25 MBq = 0,25 mCi ; actividade especifica - 2,0 GBq / mmol = 54,10 mCi / mmol.
(b) [7- 14C] ácido benzóico: quantidade de radioactivo presente no composto sólido - 18,5 MBq = 0,5 mCi ; actividade especifica - 588,3 MBq / mmol = 15,90 mCi / mmol.
Para a dissolução do [7 - 14C] ácido benzóico foi necessária a utilização de uma solução
de hidróxido de sódio (NaOH) 10 µM, uma vez que este composto radioactivo demonstrou
ser insolúvel a 25ºC em água.
Uma vez feitas as soluções radioactivas procedeu-se à contagem preliminar de CPM de 5
µL de cada uma das soluções em 5 mL de líquido de cintilação. O resultado foi de ≈ 7,0 x
106 CPM para o [1 - 14C] ácido propiónico e ≈ 1,0 x 107 CPM para o [7 - 14C] ácido benzóico.
Como tal, dadas as contagens preliminares terem sido elevadas, procedeu-se a uma
diluição de 1:3 (v/v) dos respectivos compostos, tendo sido estas as soluções utilizadas nos
ensaios.
(11) 1
1
ATin
=
1
[H+]in
+ Kd
[H+]ex
+ AT
ex 1
Kd
1
[H+]ex
1
Kd
ATin
ATex
1
Kd
(12) + - pHin = log
MATERIAL E MÉTODOS
37
2.7.3. Procedimento experimental
O pH intracelular foi determinado nas culturas de células cultivadas às duas temperaturas
de estudo (15ºC e 30ºC), para os diferentes pontos correspondentes a diferentes fases de
crescimento (referidos na secção 2.3.6.).
2.7.3.1. Ensaios em meio mineral
Nos ensaios em meio mineral, cultivaram-se as células em 200 mL de meio K, em balões
de Erlenmeyer de 500mL, até se atingir uma D.O.640nm ≈ 1. Fez-se uma divisão equitativa da
cultura (100mL) para 2 balões de Erlenmeyer de 500mL. Procedeu-se à marcação
radioactiva de um dos balões (balão A) com 5 µL de composto radioactivo (Cf < 1µM),
mantendo-se o outro balão não marcado (balão B). Não foi necessário adicionar ácido não
radioactivo ao segundo balão (designado de balão “frio”), pois a concentração final da forma
dissociada no primeiro balão (designado de balão “quente”) era desprezável (Cf < 1µM), não
interferindo no valor de pH extracelular. Incubaram-se os dois balões nos banhos
termostatizados à temperatura de 15ºC ou de 30ºC, conforme a experiência, com agitação
magnética fraca (cerca de 130 rpm). O período de incubação máximo foi de 120 minutos a
30ºC e 210 minutos a 15ºC, com vista a garantir que se atingia o equilíbrio da forma não
dissociada do composto radioactivo entre os meios extracelular e intracelular. Recolheram-
se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos a 30ºC e ao fim de 90, 120, 150, 180 e 210
minutos a 15ºC, dos dois balões:
Balão A – Determinação da concentração extracelular e intracelular de ácido fraco Balão B – Determinação do pH extracelular e do peso seco Este procedimento foi realizado paralelamente com [1 - 14C] ácido propiónico e [7 - 14C]
ácido benzóico para as estirpes S. cerevisiae ISA 1000 e W-303.
A cada tempo de incubação mencionado, recolheram-se células dos dois balões, para as
seguintes determinações:
Determinação do pH extracelular: do balão B recolheu-se um determinado volume calculado
de suspensão de células para um copo, medindo-se o pH extracelular directamente no
eléctrodo (PHM220, Lab pH METER) previamente calibrado.
Determinação do peso seco: filtrou-se um determinado volume de suspensão recolhido do
balão B, utilizando membranas Millipore TYPE GSWP, com poro de 0,22 µm e procedeu-se
conforme o descrito em 2.3.2.2.. O volume recolhido teve em conta o facto de se pretender
manter ≈ 5 mg de células em cada membrana pesada.
MATERIAL E MÉTODOS
38
Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio extracelular: do balão
marcado com ácido radioactivo (balão A) pipetou-se 500 µL da suspensão para dois tubos
(2 mL) eppendorf de rosca e centrifugou-se durante 5 minutos, a 14.000 rpm, numa
centrífuga de bancada. Recolheu-se 100 µL do sobrenadante para dois frascos com 5 mL de
líquido de cintilação Optiphase “HiSafe” 2 (Perkin Elmer).
Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio intracelular: foi realizada
através da determinação do número de CPM existente num volume de células conhecido
(Tabela 5), recolhido por filtração em membrana com pressão negativa. Lavou-se o sistema
de filtração (Figura 6) com água desmineralizada gelada, com o auxílio de uma membrana
GF/B (Whatman). De seguida, filtrou-se um determinado volume de suspensão de células
recolhidas do balão A, com o auxílio de uma membrana GF/C (Whatman), previamente
humedecida com água gelada. Após a filtração, lavou-se a membrana com 5 mL de água
gelada e recolheu-se a membrana para um tubo com 5 mL de líquido de cintilação
Optiphase “HiSafe” 2 (Perkin Elmer). Fizeram-se duplicados de todas as determinações.
A contagem da radioactividade das amostras foi efectuada num contador Beckman LS
6000 LL, programável para leituras de carbono, com erro inferior a 1%.
Figura 6: Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de composto radioactivo presente no meio intracelular.
2.7.3.2. Ensaios em mosto
As determinações do pH intracelular para as várias fases de fermentação em mosto de
uva branca foram realizadas às 2 temperaturas e para a estirpe S. cerevisiae ISA 1000.
O procedimento utilizado foi semelhante ao descrito para os ensaios com células
cultivadas em meio K, com as seguintes modificações:
1) As células foram cultivadas em mosto, tendo-se recolhido amostras para a
determinação do pHin nos pontos de amostragem definidos (secção 2.3.6.).
MATERIAL E MÉTODOS
39
2) O volume de células recolhido a cada fase de fermentação foi calculado de forma a
utilizar em cada ensaio uma quantidade de biomassa seca aproximadamente igual
(≈5 mg/mL) (Tabela 5).
3) Utilizou-se apenas [7-14C] ácido benzóico, tendo-se adicionado ao balão A um
determinado volume de ácido marcado (Tabela 5). A Cf do [7-14C] ácido benzóico,
nestes casos, nem sempre foi inferior a 1µM, no entanto, não foi necessário adicionar
ao balão “frio” o mesmo volume de ácido benzóico (não radioactivo), uma vez que se
tiver em consideração que o pH do mosto é de ≈ 3 e o pKa do ácido benzóico é de ≈
4,2, a forma não dissociada estará em predominância, não influindo, portanto, no pH
extracelular.
4) Incubaram-se os balões A e B, por 120 minutos a 30ºC e 210 minutos a 15ºC. Nos
ensaios a 30ºC recolheram-se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos, enquanto a
15ºC os tempos de amostragem foram 90, 120, 150, 180 e 210 minutos de forma a
garantir o estabelecimento do equilíbrio.
5) O volume filtrado dos balões A e B para determinação da quantidade de ácido
radioactivo e de peso seco, respectivamente, diferiu em função da D.O.640m da cultura
em mosto correspondente a cada fase de fermentação, muito embora se tenha
adoptado filtrar 1 mL para todos casos em que os volumes determinados tiveram um
valor inferior a 1mL (Tabela 5).
Tabela 5: Dados utilizados nos ensaios de pHin.
Fase de crescimentoVolume recolhido
(mL)
Volume balão A
(mL)
Volume de ác. benzóico*
adicionado (µL)
[ác. benzóico] no
balão A (µM)
Volume filtrado
(mL)
Início de exponencial 300 150 7,5 1,05 10,00
Meio de exponencial 150 75 15 4,19 2,50
Final de exponencial 111 56 20 7,55 1,00
Início de estacionária 107 53 20 7,86 1,00
Meio de estacionária 106 53 20 7,89 1,00
Final de fermentação 106 53 20 7,92 1,00
Fase de crescimentoVolume recolhido
(mL)
Volume balão A
(mL)
Volume de ác. benzóico*
adicionado (µL)
[ác. benzóico] no
balão A (µM)
Volume filtrado
(mL)
Meio de exponencial 220 110 5,5 1,05 10,00
Final de exponencial 130 65 13 4,19 2,50
Início de estacionária 105 53 20 7,95 1,00
Meio de estacionária 104 52 20 8,08 1,00
Final de fermentação 104 52 20 8,10 1,00
30ºC
15ºC
2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a
2.8.1. Base do método
A permeabilidade passiva a protões mediu
suspensão de células, durante um determinado perí
apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão
de levedura quando se adiciona um pulso de ácido.
A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H
unidade de tempo, tendo em consideração a velocidade do papel registador e os dados
obtidos para a calibração do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume
de células utilizado (determinado pelo método descrito em 2.3.2.2.)
Estas experiências foram realizadas na presença de 2
antimicina (0,4 mg/mL) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade
da H+-ATPase membranar.
2.8.2. Procedimento experimental
A medição do movimento de protões
Figura 8, constituído por um eléctrodo de pH de vidro combinado
um potenciómetro PHM82, Radiometer. Este, por sua vez, estava ligado a um registador
linear BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado
um dispositivo de amplificação de sinal, construído nas oficinas do Instituto Gulbenkian de
Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que p
realizar, no registador, a medição da variação da concentração de protões, com elevada
sensibilidade.
MATERIAL E MÉTODOS
Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da membrana
Base do método
A permeabilidade passiva a protões mediu-se com base no registo do pH de uma
las, durante um determinado período de tempo.
apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão
de levedura quando se adiciona um pulso de ácido.
A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H
unidade de tempo, tendo em consideração a velocidade do papel registador e os dados
ção do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume
de células utilizado (determinado pelo método descrito em 2.3.2.2.).
Figura 7: Variação de pH de uma suspensão aquosa de cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4.
Estas experiências foram realizadas na presença de 2-desoxi-D-glucose (
) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade
Procedimento experimental
ovimento de protões foi efectuada através do dispositivo representado na
, constituído por um eléctrodo de pH de vidro combinado (Mettler Toledo
um potenciómetro PHM82, Radiometer. Este, por sua vez, estava ligado a um registador
BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado
um dispositivo de amplificação de sinal, construído nas oficinas do Instituto Gulbenkian de
Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que p
realizar, no registador, a medição da variação da concentração de protões, com elevada
Figura 8: Representação do equipamento utilizado na medição da velocidade do movimento de Hatravés da membrana plasmática de cerevisiae
MATERIAL E MÉTODOS
40
rana a H+
se com base no registo do pH de uma
odo de tempo. Na Figura 7 é
apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão de células
A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H+ por
unidade de tempo, tendo em consideração a velocidade do papel registador e os dados
ção do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume
Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação
glucose (0,2 M) e
) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade
foi efectuada através do dispositivo representado na
Mettler Toledo), ligado a
um potenciómetro PHM82, Radiometer. Este, por sua vez, estava ligado a um registador
BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado
um dispositivo de amplificação de sinal, construído nas oficinas do Instituto Gulbenkian de
Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que possibilitou
realizar, no registador, a medição da variação da concentração de protões, com elevada
Figura 8: Representação do equipamento utilizado na medição da
locidade do movimento de H+ através da membrana plasmática de S.
cerevisiae ISA 1000.
MATERIAL E MÉTODOS
41
2.8.2.1. Preparação das suspensões de células
Para cada ensaio realizado para avaliação do influxo de protões através da membrana
plasmática foram utilizadas suspensões concentradas de células em água, preparadas de
forma a obter ≈ 100 mg p.s. / mL.
Para cada situação (pontos de amostragem de crescimento em mosto e D.O.640nm 1 no
crescimento em meio K) recolheu-se um volume apropriado de células em função do peso
seco calculado com base no ensaio preliminar realizado (secção 2.4.). As células foram
centrifugadas a 12.000 rpm, durante 4 minutos a 4ºC, numa centrífuga (Eppendorf centrifuge
5810R).
A suspensão de células obtida foi mantida em gelo, pelo menos 1 hora antes do início do
ensaio, bem como durante a execução do mesmo.
2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada
O eléctrodo de pH foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, termostatizado a
15ºC ou a 30ºC (conforme o ensaio) e munido de agitação magnética. Neste reactor
colocou-se 800 µL de água desmineralizada ou de soluções previamente termostatizadas a
15ºC ou a 30ºC, com diferentes concentrações de etanol (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20%
(v/v)). De seguida, adicionou-se 200 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL), 5 µL de
antimicina 0,4 mg/mL e 5 µL de 2-desoxi-D-glucose 0,2 M. Ajustou-se a pH 4 com uma
solução de HCl (10 mM ou 100 mM), conforme a situação e registou-se as alterações de pH,
durante um periodo de tempo variável, dependente da temperatura a que se realizou o
ensaio, da fase de crescimento das células e da concentração de etanol testada. Após a
obtenção da curva pretendida (Figura 9), calibrou-se o sinal utilizando um volume conhecido
de HCl (10 mM ou 100 mM).
Figura 9: Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade da membrana plasmática a H+, onde é possível observar uma alcalinização do meio extracelular. A calibração foi feita com soluções de HCl.
Calibração
X nmol H+
pH
Velocidade do papel (cm.min-1)
Alcalinização do meio extracelular
2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas
No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem
fermentação (meio da estacionária e final de fermentação)
células ressuspendidas em água desmineralizada, foram ainda
equivalentes em que se prepararam suspensões de células (100 mg/mL) ressuspendidas
em tampão Tris-citrato (10mM Tris, pH 5) e T
concentrações finais de etanol de 0, 6, 10, 16 e 20% (v/v).
2.9. Avaliação do efeito do etanol sobre
plasmática
2.9.1. Base do método
A avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana
plasmática tem por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso d
glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada
velocidade de movimento de H
variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [
1977].
Figura ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.
2.9.2. Procedimento experimenta
O sistema utilizado durante os ensaios
foi similar ao utilizado para medição das velocidades de influxo de H
2.9.2.1. Preparação de suspensões de células
Os ensaios foram realizados a partir de suspensões de células preparadas de acordo
com o descrito em 2.8.2.1.
2.9.2.2. Ensaio experimental a diferent
O eléctrodo foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, munido de agitação
magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou
800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentraçõ
MATERIAL E MÉTODOS
Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares
No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem
(meio da estacionária e final de fermentação), para além dos ensaios com
células ressuspendidas em água desmineralizada, foram ainda realizados ensaios
equivalentes em que se prepararam suspensões de células (100 mg/mL) ressuspendidas
citrato (10mM Tris, pH 5) e Tris-citrato (10mM Tris, pH 6,3), testando
concentrações finais de etanol de 0, 6, 10, 16 e 20% (v/v).
ção do efeito do etanol sobre o efluxo de H+ através da membrana
Base do método
o efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana
por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso d
glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada
velocidade de movimento de H+ é calculada através de uma calibração que relaciona
variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [
Figura 10: Variação de pH de uma suspensão aquosa de ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.
experimental
O sistema utilizado durante os ensaios de medição das velocidades de efluxo protónico
utilizado para medição das velocidades de influxo de H+, descrito na Figura 9.
paração de suspensões de células
Os ensaios foram realizados a partir de suspensões de células preparadas de acordo
Ensaio experimental a diferentes temperaturas
O eléctrodo foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, munido de agitação
magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou
800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentraçõ
MATERIAL E MÉTODOS
42
a diferentes pH extracelulares
No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem do período de
, para além dos ensaios com
realizados ensaios
equivalentes em que se prepararam suspensões de células (100 mg/mL) ressuspendidas
citrato (10mM Tris, pH 6,3), testando
através da membrana
o efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana
por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso de
glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada (Figura 10). A
através de uma calibração que relaciona
variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [Serrano,
Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae
de medição das velocidades de efluxo protónico
descrito na Figura 9.
Os ensaios foram realizados a partir de suspensões de células preparadas de acordo
O eléctrodo foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, munido de agitação
magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou-se
800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentrações de etanol
MATERIAL E MÉTODOS
43
(previamente termostatizadas a 15ºC ou a 30ºC), de forma a obter durante o ensaio uma
concentração final de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% e 25%. De
seguida, adicionou-se 100 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL). Ajustou-se o pH a
5 com uma solução de HCl (10 mM ou 100 mM) ou NaOH (10 mM ou 100 mM), conforme a
situação e registou-se durante aproximadamente 1 minuto, de forma a obter a linha de base.
Ao fim desse tempo adicionou-se 100 µL de uma solução de glucose 20% (p/v) (Cfinal 2%)
e registou-se o pH durante um período de tempo (Figura 11) que se revelou novamente
dependente da temperatura a que se realizou o ensaio, da fase de crescimento das células
e da concentração de etanol testada.
A taxa específica de efluxo de protões foi calculada com base na variação da quantidade
de H+ por unidade de tempo, tendo em conta a velocidade do papel registador e os dados
obtidos para a calibração do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume
de células utilizado.
Figura 11: Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico, onde se pode verificar uma acidificação do meio extracelular após a adição de 100 µL de glucose (Cf = 2% (p/v)). A calibração foi feita com soluções de NaOH.
Linha de base
100 µL glucose 20% (p/v)
X nmol OH-
Calibração
Acidificação do meio extracelular
pH
Velocidade do papel
(cm.min-1)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
44
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho apresentado surge no seguimento de um projecto anterior, em que os ensaios
foram realizados a 25ºC, onde se estudaram vários parâmetros fisiológicos e bioenergéticos
de forma a avaliar o desempenho de uma estirpe vínica de Saccharomyces cerevisiae (ISA
1000) ao longo de fermentação vinária. No presente estudo pretendeu-se avaliar parâmetros
relacionados com a homeostase protónica de células ao longo de fermentação, quando
cultivadas em mosto de uva a temperaturas às quais se realizam fermentações vínicas para
produção de vinho branco e tinto. Num cômputo geral, procurou-se reproduzir em
laboratório, tanto quanto possível, a situação real em que são efectuadas estas
fermentações, com o objectivo final de uma possível transposição dos resultados obtidos
para os resultados numa situação real em adega, com vista a melhorar a produção de vinho
nos aspectos que dependem do desempenho da levedura.
Com este objectivo, cultivou-se uma estirpe vínica de S. cerevisiae, isolada a partir de um
fermento comercial liofilizado (FERMIVIN®) e seleccionada pela sua elevada capacidade
fermentativa, em mosto estéril de uva branca, a duas temperaturas (15ºC e 30ºC usadas na
produção de vinhos branco e tinto, respectivamente). O mosto utilizado sofreu os
tratamentos comuns em adega, tais como clarificação com 10 mg/L de enzima e adição de
enxofre, de forma a garantir 50 ppm de sulfitos livres para estabilização, sendo
posteriormente esterilizado por filtrações sucessivas em membranas (com pressão
negativa). A fermentação decorreu em balões de Erlenmeyer de 1000mL, preenchidos com
800mL de mosto, incubados em banhos termostatizados a 15ºC ou a 30ºC, com agitação
magnética fraca e sem arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação. O
final de fermentação foi estabelecido como o ponto a partir do qual não se detectou a
presença de açúcares através dos métodos comuns em adega.
Com vista a possibilitar a comparação entre os resultados obtidos em células recolhidas
ao longo de fermentação de mosto de uva branca e células cultivadas em condições
laboratoriais (para as quais o número de dados existentes na literatura é muito superior),
realizaram-se paralelamente ensaios com a mesma estirpe cultivada em meio mineral (meio
K) e recolhidas em plena fase exponencial de crescimento (D.O.640nm ≈ 1).
Ao longo do trabalho, para a apresentação dos valores relativos aos vários parâmetros
determinados, foi realizada na maior parte dos casos, pelo menos uma repetição, garantindo
a reprodutibilidade dos mesmos.
3.1. Ensaios preliminares
Com o intuito de se avaliar o desempenho fermentativo de Saccharomyces cerevisiae
ISA 1000 a 15ºC e a 30ºC, e, de definir os pontos de amostragem para os ensaios
posteriores, foi necessário realizar
uma destas temperaturas. Procedeu
estudo conforme o descrito em 2.3.5.,
mosto estéril, em balões de Erlenmeyer de 1000 mL
temperatura do ensaio, com fraca
suplementar, durante todo o período
colhidas amostras, de acordo com o descrito
verificar a evolução de parâmetros físico
extracelular e teor de glucose
(D.O.640nm, peso seco e UFC/mL).
3.1.1. Ensaio preliminar de
3.1.1.1. Avaliação dos par
O crescimento da estirpe S
através da determinação da D.O.
com a do peso seco e UFC/mL (
T4
T3 T2
T1
(a)
(b)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
realizar ensaios preliminares de crescimento da
Procedeu-se ao crescimento de células às duas temperaturas de
conforme o descrito em 2.3.5., com inoculação de 1 x 106 células/mL
mosto estéril, em balões de Erlenmeyer de 1000 mL previamente termost
fraca agitação magnética (130 rpm) e ausência de arejamento
suplementar, durante todo o período de fermentação. Ao longo da fermentação foram
colhidas amostras, de acordo com o descrito em 2.3.6. Os ensaios preliminares
e parâmetros físico-químicos do mosto (massa volúmica,
teor de glucose) e a evolução de parâmetros de crescimento
peso seco e UFC/mL).
Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC
Avaliação dos parâmetros de crescimento da estirpe
S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril a 15ºC
da D.O.640nm (descrito em 2.3.2.1.), comparando
e UFC/mL (Figura 12)
Figura crescimento de cerevisiaefermentação de mosto a 15ºC. peso secoD.O.gráfico assinalados os pontos de amostragem escolhidos (círculo laranja)
T5 T6
RESULTADOS E DISCUSSÃO
45
ensaios preliminares de crescimento da estirpe a cada
se ao crescimento de células às duas temperaturas de
células/mL em 800 mL de
previamente termostatizados à
agitação magnética (130 rpm) e ausência de arejamento
de fermentação. Ao longo da fermentação foram
preliminares permitiram
químicos do mosto (massa volúmica, pH
de crescimento da estirpe
a 15ºC
da estirpe
a 15ºC foi monitorizado
comparando-se a sua evolução
Figura 12: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC. (a) D.O.640nm e peso seco e (b) D.O.640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de amostragem escolhidos (círculo laranja).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
O ensaio foi iniciado por inoculação de ≈ 1x106 células/mL a partir de um pré-inóculo em
fase exponencial, preparado em mosto a 28ºC.
Através da observação da curva de crescimento obtida a 15ºC (Figura 12a), foi possível
verificar que, de acordo com as determinações de D.O.640nm, a cultura apresentou uma fase
de latência de ≈13 horas, seguida de uma fase exponencial que se prologou por ≈ 41 horas
(com um tempo de duplicação de ≈ 6h 30m). Ao fim de 87 horas, a cultura entrou em fase
estacionária, terminando a fermentação às 304 horas, altura em que se verificou um
esgotamento total da glucose (Anexo IV).
A partir da curva de crescimento obtida a 15ºC definiram-se 6 pontos de amostragem
(Tabela 6), atendendo ao comportamento de estirpes vínicas comerciais sujeitas a
variações, descritas na literatura, ao longo do processo de fermentação e à monitorização
do trancriptoma de uma estirpe comercial de S. cerevisiae em mosto sintético [Querol et al.,
2003; Rossignol et al., 2003].
Tabela 6: Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações conduzidas a 15ºC.
Pontos de amostragem Tempo de recolha das células (h)
Início da exponencial (T1) ≈24
Meio da exponencial (T2) ≈36
Final da exponencial (T3) ≈65
Início da estacionária (T4) ≈87
Meio da estacionária (T5) ≈202
Final da fermentação (T6) ≈304
A fase de latência observada nas fermentações a 15ºC caracterizou-se essencialmente
por um período em que as células se adaptaram ao stresse térmico imposto, uma vez que a
passagem de 28ºC (do pré-inóculo) para 15ºC possivelmente abrandou o metabolismo
celular.
Ao se observar a evolução do peso seco durante a fermentação a 15ºC (Figura 12a),
verificou-se que, tal com esperado, este acompanhou a evolução da D.O.640nm, uma vez que
ambos os parâmetros têm em consideração todo o tipo de células, independentemente da
sua capacidade metabólica e de multiplicação. A partir de um determinado peso seco de
células foi possível calcular o volume de colheita necessário para cada ponto de
amostragem.
Se tivermos em consideração a Figura 12b que relaciona a evolução do crescimento de
S. cerevisiae ISA 1000 e o número de células viáveis (com capacidade de multiplicação
activa, expresso em UFC/mL), constata-se que a população inicial sofreu inicialmente um
decréscimo atingindo um mínimo ao fim de 12-13h. Este decréscimo foi observado quer ao
nível de D.O.640nm (para as primeiras 2h), quer ao nível de células viáveis, correspondendo a
uma redução efectiva da população
crescimento [Pham et al., 2006]
as células foram inoculadas,
ensaio, mas a 28ºC, a explicação
D.O.640nm e no número de células viáveis
sofrido pela passagem de 28ºC para 15ºC
proveniente do pré-inóculo. Após o período inicia
crescimento prosseguiu, constatando
exponencial de crescimento, atingindo uma
12b). Por outro lado, é perceptível na
curva de crescimento de S. cerevisiae
indicia que as células permanece
3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico
Para além dos parâmetros de crescimento
volúmica, do ºBrix e do teor de glucose
longo da fermentação a 15ºC.
Através da observação dos gráficos da
do mosto manteve-se relativamente constante ao longo do processo de fermentação
oscilando entre 3,04 (pHinoculação
volúmica decresceu ao longo da
até atingir ≈990 mg/mL no final de fermentação;
solúveis no mosto) diminuiu ao longo da fermentação,
só começou a diminuir quando a cultura termin
fase estacionária.
(a)
(c)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
população, igualmente observada por alguns autores
., 2006]. Tendo em consideração que o pré-inóculo
, foi preparado em mosto exactamente igual ao utilizado no
explicação mais plausível para a redução observada
no número de células viáveis poderá estar relacionada com
pela passagem de 28ºC para 15ºC e com a diluição efectuada à população
. Após o período inicial de decréscimo de população,
, constatando-se que ocorreram 6 a 7 duplicações
atingindo uma D.O.640nm de ≈ 8 no final da mesma fase (
Por outro lado, é perceptível na Figura 12b que a curva de UFC/mL acompanh
cerevisiae ISA 1000, ao longo da fermentação a 15ºC, o que
indicia que as células permaneceram viáveis até ao final de fermentação.
Avaliação dos parâmetros físico-químicos do mosto
dos parâmetros de crescimento, foi observada a evolução do pH, da massa
volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol do mosto, com colheita de amostras ao
longo da fermentação a 15ºC.
rvação dos gráficos da Figura 13, foi possível constatar
se relativamente constante ao longo do processo de fermentação
inoculação), 2,87 (pHinício estacionária) e 3,02 (pHfinal fermentação
ao longo da fermentação, partindo de um valor inicial de
990 mg/mL no final de fermentação; (c) o ºBrix (que quantifica os
ao longo da fermentação, no entanto foi possível
ir quando a cultura terminou a fase exponencial e começ
Figura 13: Evolução do (a)
(b) massa volúmica (mg/mL)
mosto, ao longo de fermentação de
ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC.
(b)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
alguns autores nesta fase de
inóculo, a partir do qual
igual ao utilizado no
redução observada nas leituras de
poderá estar relacionada com o choque térmico
e com a diluição efectuada à população
l de decréscimo de população, o
duplicações durante a fase
no final da mesma fase (Figura
que a curva de UFC/mL acompanhou a
ISA 1000, ao longo da fermentação a 15ºC, o que
, foi observada a evolução do pH, da massa
do mosto, com colheita de amostras ao
el constatar-se que: (a) o pH
se relativamente constante ao longo do processo de fermentação (pH≈3),
final fermentação); (b) a massa
fermentação, partindo de um valor inicial de ≈1074 mg/mL
) o ºBrix (que quantifica os açúcares
possível constatar que
a fase exponencial e começou a entrar em
(a) pH extracelular, da
massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do
ao longo de fermentação de S. cerevisiae
branca a 15ºC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
Os resultados relativos à variação do pH do mosto ao longo da fermentação a 15ºC
permitiram concluir que o mosto pode ser considerado um meio com uma capacidade
tampão considerável, uma vez que manteve o seu pH relativamente constante durante o
processo fermentativo (pH≈3).
No que respeita à massa volúmica, foi possível constatar que houve uma grande variação
nos resultados obtidos para este parâmetro, que pode estar relacionada com o facto do
método utilizado para a sua determinação ter inerente um grau elevado de erro, uma vez
que a avaliação deste parâmetro apenas teve como objectivo monitorizar qualitativamente a
fermentação vinária a 15ºC. No entanto, o valor de massa volúmica correspondente ao final
de fermentação (990 mg/mL) está próximo da gama de valores admissíveis (991-996
mg/mL) para esta fase [Ribéreau-Gayon et al., 2006]. A medição da massa volúmica,
segundo estes autores, deixa de ser precisa na monitorização da fermentação a partir do
momento em que este parâmetro diminui para valores inferiores a 1000 mg/mL [Ribéreau-
Gayon et al., 2006], o que pode explicar a grande variabilidade dos valores registados
inferiores a 1000 mg/mL.
A avaliação do ºBrix das várias amostras colhidas ao longo da fermentação permitiu
monitorizar qualitativamente igualmente os teores de glucose e frutose ao longo do
processo. A razão pela qual se observou uma diminuição deste parâmetro a partir do
momento em que as células terminaram a fase exponencial e iniciaram a fase estacionária
(Figura 13c), poderá ter como possível explicação o facto de a sua determinação avaliar
simultaneamente o consumo de glucose e frutose que, a par da baixa sensibilidade do
método, não permitiu detectar pequenas quantidades de glucose consumidas no início de
fermentação, onde existe uma quantidade elevada de açúcares (≈200 g/L).
Relativamente à concentração de glucose (Tabela 7, Figura 14), doseada pelo método
descrito em 2.5., constata-se que o teor de açúcares (glucose e frutose) presente no mosto
de uva branca utilizado no presente trabalho (≈193 g/L) esteve de acordo com a gama
normal de valores de açúcares totais (160-300 g/L) [Fleet & Heard, 1993] admitindo que as
uvas e consequentemente o mosto contêm quantidades semelhantes de frutose e de
glucose, apesar de alguns autores referirem que as alterações ambientais recentes têm
vindo a aumentar a proporção de frutose comparativamente à de glucose nas uvas [Jones et
al., 2005]. Por outro lado, a observação da Figura 14 permite afirmar que ≈24% de glucose
foi consumida entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T3), ≈23%
foi consumida entre o final de fase exponencial (T3) e o início de fase estacionária (T4) e
mais de 50% de glucose foi consumida após a cultura entrar em fase estacionária (T4),
vindo ao encontro das observações de Rossignol e colaboradores (2003), que verificaram
que a maior parte do açúcar é fermentado por resting cells [Rossignol et al., 2003]. No final
de fermentação (T6), as células praticamente esgotaram a glucose presente no meio,
RESULTADOS E DISCUSSÃO
49
considerando-se terminada a fermentação. Outro facto interessante foi o baixo consumo de
glucose observado em células compreendidas entre as fases meio de estacionária e final de
fermentação (Figura 14), estando de acordo com os resultados obtidos no estudo a 25ºC
onde foi possível constatar uma elevada actividade dos transportadores de hexoses de
baixa afinidade nas fases iniciais de fermentação, ao passo que a actividade observada no
final de fermentação, para além de ter sido baixa, foi essencialmente devida aos
transportadores de alta afinidade [C. Prista, comunicação pessoal]. Estas observações do
estudo a 15ºC e a 25ºC demonstraram ser coerentes com os estudos de alguns autores, na
medida em que Brejning e colaboradores (2003) observaram a existência de elevada
indução de HXT1, HXT2 e HXT3 (genes de transportadores de hexoses de baixa afinidade)
nos primeiros 20 minutos após se ter efectuado a inoculação [Brejning et al., 2003]. Perez e
colaboradores (2005) ao analisarem a expressão dos transportadores de hexoses de S.
cerevisiae ao longo da fermentação de mosto sintético, verificaram que HXT1 foi expresso
apenas no início de fermentação (não tendo qualquer função na fase estacionária), HXT3 foi
expresso ao longo do processo fermentativo, no entanto, a quantidade de Hxt3p diminuiu a
partir da fase estacionária de crescimento [Perez et al., 2005]. Estes autores constataram
que Hxt2p foi o único transportador que só foi expresso durante a fase de latência
(sugerindo que este transportador tem uma função importante no arranque do crescimento),
ao passo que Hxt6p e Hxt7p, com perfis de expressão semelhantes, foram expressos a
partir do início de fase estacionária [Perez et al., 2005].
Quando se comparam os gráficos da evolução do ºBrix (Figura 13c) e do consumo de
glucose (Figura 14) observa-se que o valor do ºBrix que se atingiu no final de fermentação
não foi próximo do nulo, tal como aconteceu face ao teor de glucose quantificado no final de
fermentação (Figura 14), na medida em que o ºBrix quantifica, embora de uma forma menos
sensível, teores de glucose e frutose, indicando que o seu valor no final de fermentação
poderá estar relacionado com a presença de frutose no final de fermentação como açúcar
residual, uma vez que S. cerevisiae tem preferência para o consumo de glucose, dando
origem a uma discrepância de consumo destas duas hexoses ao longo da fermentação
[Berthels et al., 2004]. É precisamente esta a causa, segundo alguns autores, da ocorrência
de doçura indesejável no final de fermentação, uma vez que a frutose tem um carácter mais
edulcorante do que a glucose [Lee, 1987; Boulton et al., 1996]. Para além disso, esta
discrepância no consumo de glucose e de frutose provoca baixos rendimentos de produção
de etanol e aumenta os riscos de contaminação do vinho resultante [Berthels et al., 2004;
Gafner & Schütz, 1996].
No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 15ºC (Tabela 7, Figura
14), verificou-se que ≈21% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de
fase exponencial (T3), ≈27% foi produzido entre o final de fase exponencial (T3) e o início de
fase estacionária (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido
estacionária (T4), coincidindo com a fase de mai
Tabela 7: Teor de glucose e de etanolamostragem escolhidos.
Fase de crescimento
Inoculação
Início da exponencial
Meio da exponencial
Final de exponencial
Início de estacionária
Meio da estacionária
Final de fermentação
Figura 14: Consumo de glucose e produção de etanol efermentações de mosto a 15ºC.
Em teoria, se partíssemos do pressuposto de que tod
convertidas em etanol durante a fermentação
≈12,4% (v/v) de etanol. No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de
9,4% (v/v), que possivelmente pode ficar a dever
do consumo de glucose para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicero
acético) e, por outro, à possível
fermentação, tal como anteriormente se referiu.
nossos ensaios a 15ºC está
respeita ao título alcoométrico volúmico total dos v.q.p.r.d.
Anexo VI-F-nº5) que não pode ser inferior a 9% (v/v)
volúmico mínimo total seja de 8,5% (v/v)
de uma lista a aprovar, que não tenham s
RESULTADOS E DISCUSSÃO
fase estacionária (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase
, coincidindo com a fase de maior consumo de glucose.
e de etanol em fermentações conduzidas a 15ºC, para os 6 pontos de
[glucose]
(g/L)
% consumo
glucose
[etanol]
(g/L)
% etanol
(v/v)
96,50 0,00 0,20 0,03
89,54 7,21 1,51 0,19
81,72 15,32 10,02 1,27
73,46 23,87 16,01 2,03
51,73 46,40 35,70 4,52
2,87 97,03 51,25 6,49
0,03 99,97 74,29 9,41
Consumo de glucose e produção de etanol em S. cerevisiae ISA 1000
Em teoria, se partíssemos do pressuposto de que toda a glucose
em etanol durante a fermentação teríamos um valor volúmico
No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de
9,4% (v/v), que possivelmente pode ficar a dever-se, por um lado, à ocorrência de desvios
para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicero
por outro, à possível existência de quantidades residuais de frutose no final de
, tal como anteriormente se referiu. No entanto, o teor final em etanol obtido nos
de acordo com os valores mencionados no
o título alcoométrico volúmico total dos v.q.p.r.d. (descrito no REG (CE) nº1493/99
não pode ser inferior a 9% (v/v), muito embora, o título alcoométrico
volúmico mínimo total seja de 8,5% (v/v) para determinados v.q.p.r.d. brancos
de uma lista a aprovar, que não tenham sofrido qualquer enriquecimento.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
50
após a cultura entrar em fase
das a 15ºC, para os 6 pontos de
% produção
etanol
0,27
2,03
13,49
21,55
48,06
68,99
100,00
ISA 1000 ao longo de
glucose e frutose seriam
valor volúmico final teórico de
No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de
à ocorrência de desvios
para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicerol e ácido
ncia de quantidades residuais de frutose no final de
No entanto, o teor final em etanol obtido nos
o Anexo II, no que
REG (CE) nº1493/99
, muito embora, o título alcoométrico
eterminados v.q.p.r.d. brancos, constantes
Atendendo à metodologia de determinação do etanol (
as várias manipulações e os tempos de espera
(considerando inclusivamente o momento da sua colheita) tenham conduzido a uma
evaporação parcial do etanol presente na amostra
3.1.2. Ensaio preliminar de
3.1.2.1. Avaliação de parâmetros
Após monitorização do crescimento através d
ao longo da fermentação, obteve
30ºC (Figura 15a), determinando
expresso em UFC/mL (Figura
Figura 15: Curva de crescimento de D.O.640nm e peso seco e (b) D.O.amostragem escolhidos (círculo laranja).
Nas fermentações a 30ºC,
latência da cultura, notando-
T2
T1
(a)
(b)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Atendendo à metodologia de determinação do etanol (descrita em 2.6.
e os tempos de espera a que as amostras foram sujeitas
(considerando inclusivamente o momento da sua colheita) tenham conduzido a uma
etanol presente na amostra.
Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC
Avaliação de parâmetros de crescimento
pós monitorização do crescimento através de leitura da D.O.640nm de
ao longo da fermentação, obteve-se a curva de crescimento de S. cerevisiae
determinando-se igualmente o peso seco e o número de células viáv
Figura 15)
Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a D.O.640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de
hidos (círculo laranja).
, as leituras de D.O.640nm não permitiram identificar
-se, por outro lado, uma fase de aceleração
T5 T4 T3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
51
descrita em 2.6.), é provável que
mostras foram sujeitas
(considerando inclusivamente o momento da sua colheita) tenham conduzido a uma
ISA 1000 a 30ºC
de amostras colhidas
cerevisiae ISA 1000 a
o número de células viáveis,
ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC. (a) estão assinalados os pontos de
identificar uma fase de
se, por outro lado, uma fase de aceleração nas primeiras 2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
52
horas após a inoculação. No entanto, nesta fase compreendida entre o momento de
inoculação e o início de exponencial, quando se compara a leitura de D.O.640nm à de
UFC/mL, é possível verificar uma diminuição do número de células viáveis, que reduz a
população para 1/10 da população inicial, apesar do aumento observado de D.O.640nm.
Constatou-se, portanto, que ocorreu uma perda de viabilidade inicial que poderá ser
possivelmente explicada, por um lado, pela modificação da temperatura de crescimento
(28ºC no pré-inóculo) para uma temperatura ligeiramente superior (30ºC na fermentação).
Por outro lado, se atendermos ao facto de que a D.O.640nm contabiliza células totais (mortas
e vivas) existentes numa suspensão, enquanto a contagem do número de UFC/mL
contabiliza apenas células com capacidade de se multiplicar e formar colónias
individualizadas, é possível inferir que o aumento observado da D.O.640nm possa ter sido o
resultado da cultura ter começado a multiplicar-se no início de fermentação, não permitindo
a separação das gémulas e células adultas, traduzindo-se num menor número de colónias
e, consequentemente, numa contagem inferior de UFC/mL comparativamente à D.O.640nm
lida. Após ultrapassar este período inicial de fermentação, a cultura entrou em fase
estacionária ao fim de 24 horas, dando-se o final de fermentação às 71 horas, altura em que
se verificou um esgotamento total da glucose (Anexo II).
A partir da curva de crescimento obtida a 30ºC e atendendo às razões similares às
referidas para a fermentação a 15ºC, definiram-se 5 pontos de amostragem que englobaram
o meio da fase exponencial (T1, às ≈5 horas), o final da fase exponencial (T2, às ≈9 horas),
o início da fase estacionária (T3, às ≈24 horas), meio da estacionária (T4, às ≈48 horas) e o
final da fermentação (T5, às ≈71 horas).
O peso seco acompanhou tal como esperado a D.O.640nm durante a fermentação a 30ºC
(Figura 15a), uma vez que ambos os métodos contabilizam o número total de células.
Constatou-se que a população inicial que cresceu a 30ºC sofreu 3 a 4 duplicações
durante a fase exponencial de crescimento, atingindo uma D.O.640nm de ≈ 2,5 no final da
mesma fase (Figura 15b). Quando se compara o número de duplicações obtido a 15ºC e a
30ºC, durante a mesma fase de crescimento, constata-se que as 3 a 4 duplicações que as
células a 30ºC sofreram repercutiram-se numa fase exponencial de crescimento mais curta,
entrando no período de desaceleração mais cedo, comparativamente a 15ºC, onde a fase
exponencial foi mais longa, permitindo à população sofrer 6 a 7 duplicações.
3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos
À semelhança do que foi efectuado a 15ºC, ao longo da fermentação a 30ºC observaram-
se as variações do pH, da massa volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol no
mosto.
A partir dos dados obtidos (
se relativamente constante ao longo do pro
apenas durante a fase exponencial, o seu valor inicial de 3,0 para 2,8
(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de
mg/mL até atingir ≈948 mg/mL, no final de fermentaçã
fermentação, mais significativamente
começou a desacelerar para entrar em fase estacionária.
Os resultados obtidos a 30ºC no que respeita ao pH extracelular confirmam o que fora
referido a 15ºC relativamente ao
considerável, que mantém o seu
fermentativo (pH≈3).
Relativamente à variação da massa volúmica, foi interessante verificar que apenas se
notou o decréscimo deste parâmetro durante a mesma fase de crescimento para a qual se
notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da
exponencial e o início da fase
situação a 15ºC e ao facto da massa volúmica
ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e
diminuição da massa volúmica
explicação a evaporação do CO
deste método utilizado ter inerente um grau elevado de erro
de massa volúmica correspondente ao final de fermentação
próximo da gama de valores admissíveis (991
(a)
(c)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir dos dados obtidos (Figura 16) foi possível observar: (a) o pH do mosto manteve
te constante ao longo do processo fermentativo, decrescendo ligeiramente,
durante a fase exponencial, o seu valor inicial de 3,0 para 2,8; (b) a massa volúmica
(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de
948 mg/mL, no final de fermentação; (c) o ºBrix diminui
mais significativamente quando a cultura terminou a fase exponencial e
a desacelerar para entrar em fase estacionária.
Figura 16: Evolução do (a)(b) massa volúmica (mg/mL) e mosto, ao longo de fermentação de ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.
Os resultados obtidos a 30ºC no que respeita ao pH extracelular confirmam o que fora
do a 15ºC relativamente ao mosto ser um meio com uma capacidade tampão
mantém o seu pH relativamente constante durante o processo
Relativamente à variação da massa volúmica, foi interessante verificar que apenas se
notou o decréscimo deste parâmetro durante a mesma fase de crescimento para a qual se
notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da
exponencial e o início da fase estacionária. Atendendo ao que foi mencionado para
da massa volúmica poder essencialmente reflectir
ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e
a massa volúmica obervada ao longo da fermentação poderá ter como
explicação a evaporação do CO2. Tal como acontecera a 15ºC e tendo em conta o facto
deste método utilizado ter inerente um grau elevado de erro, foi curioso verificar
de massa volúmica correspondente ao final de fermentação a 30ºC (9
a de valores admissíveis (991-996 mg/mL) [Ribéreau-Gayon
(b)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
53
(a) o pH do mosto manteve-
cesso fermentativo, decrescendo ligeiramente,
; (b) a massa volúmica
(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de ≈1058
o; (c) o ºBrix diminuiu ao longo da
a fase exponencial e
(a) pH extracelular, da massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do
ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.
Os resultados obtidos a 30ºC no que respeita ao pH extracelular confirmam o que fora
com uma capacidade tampão
pH relativamente constante durante o processo
Relativamente à variação da massa volúmica, foi interessante verificar que apenas se
notou o decréscimo deste parâmetro durante a mesma fase de crescimento para a qual se
notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da fase
Atendendo ao que foi mencionado para mesma
reflectir a variação que
ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e de CO2, a
ao longo da fermentação poderá ter como
tendo em conta o facto
foi curioso verificar que o valor
(948 mg/mL) esteve
Gayon et al., 2006].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
54
Relativamente aos teores de glucose determinados nas fermentações a 30ºC (Tabela 8,
Figura 17), é possível afirmar que ≈20% do seu teor foi consumido entre o momento da
inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T2), ≈40% foi consumido entre o final da fase
exponencial (T2) e o início da fase estacionária (T3) e ≈40% foi consumido a partir do início
da fase estacionária (T3). No último ponto de amostragem (T5), as células praticamente
esgotaram a glucose presente no meio, considerando-se terminada a fermentação. Tal
como se verificou a 15ºC e a 25ºC, a partir de meio da fase estacionária verificou-se um
baixo consumo de glucose por parte das células, constatando-se novamente uma possível
discrepância entre o consumo de glucose e de frutose, por comparação das Figuras 16c e
17, indicando a possível presença de quantidades residuais de frutose no final de
fermentação.
No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 30ºC (Tabela 8, Figura
17), verificou-se que ≈11% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de
fase exponencial (T2), ≈58% foi produzido entre o final de fase exponencial (T2) e o início de
fase estacionária (T3) e ≈31% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase
estacionária (T3).
A transição entre o final da fase exponencial e o início da fase estacionária a 30ºC foi o
período de fermentação onde ocorreu uma grande parte do consumo de glucose (≈40%) e a
maior parte da produção de etanol (≈58%), ao invés do que acontecera a 15ºC, onde estes
acontecimentos ocorreram a partir da fase estacionária de crescimento.
Tabela 8: Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.
Fase de crescimento [glucose]
(g/L)
% consumo
glucose
[etanol]
(g/L)
% etanol
(v/v)
% produção
etanol
Inoculação 96,50 0,00 0,20 0,03 0,35
Meio da exponencial 83,89 13,06 1,84 0,23 3,27
Final de exponencial 80,41 16,67 6,45 0,82 11,43
Início de estacionária 40,42 45,59 39,16 4,96 69,39
Meio da estacionária 4,26 87,21 43,19 5,47 76,53
Final de fermentação 0,05 93,82 56,44 7,15 100,00
Figura 17: Consumo de glucose e produção de etanfermentações de mosto a 30ºC.
Os resultados referentes
15ºC e 30ºC permitiram constatar que
30ºC entrou em fase de crescimento desacelerado (i.e.,
fases exponencial e estacionária de crescimento)
exponencial) à concentração
lidar na fase correspondente.
demasiado baixas para serem responsáveis
Tal como aconteceu a 15ºC,
concentração de etanol que se obteve nos diversos ensaios
de determinação do etanol utilizada e a provável ocorrência
etanol para a produção de metabolitos
rendimento etanol/glucose observado durante a fase estacionária, bem como o
final em etanol obtido na fermentação a 30ºC (
3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos
Existem vários estudos,
diferenças fisiológicas significativas entre as células nas várias fases do processo
fermentativo, nomeadamente entre as células em crescimento exponencial (primeiras horas
de fermentação) e células em fase estacionária [
Rossignol et al., 2009], estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das
células em condições de concentrações elevadas de etanol e esgotamento de nutrientes
como as que se observam a partir de um determinado ponto de fe
Heard, 1993; Bisson, 1999, Querol
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de
Os resultados referentes ao etanol produzido durante as fermentações conduzidas a
15ºC e 30ºC permitiram constatar que a concentração de etanol para a qual a população a
fase de crescimento desacelerado (i.e., no período de transição entre as
e estacionária de crescimento) foi inferior (6,45g/L de etanol no final de
exponencial) à concentração de etanol (16g/L de etanol) que as células a
. No entanto, é importante referir que estas concentrações são
demasiado baixas para serem responsáveis per si pela paragem do crescimento.
15ºC, é provável que a 30ºC tenha sido subestimado
que se obteve nos diversos ensaios, tendo em conta a
utilizada e a provável ocorrência de desvio
metabolitos secundários. Estes desvios podem explicar o
observado durante a fase estacionária, bem como o
na fermentação a 30ºC (≈7,15% (v/v)).
parâmetros fisiológicos
Existem vários estudos, antigos e recentes, que apontam no sentido d
diferenças fisiológicas significativas entre as células nas várias fases do processo
fermentativo, nomeadamente entre as células em crescimento exponencial (primeiras horas
e células em fase estacionária [Rossignol et al., 2003; Varela
, estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das
células em condições de concentrações elevadas de etanol e esgotamento de nutrientes
como as que se observam a partir de um determinado ponto de fermentação vinária
, Querol et al., 2003; Zuzuarregui et al., 2006].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
55
ISA 1000 ao longo de
etanol produzido durante as fermentações conduzidas a
a concentração de etanol para a qual a população a
período de transição entre as
inferior (6,45g/L de etanol no final de
(16g/L de etanol) que as células a 15ºC tiveram que
estas concentrações são
pela paragem do crescimento.
tenha sido subestimado o valor de
, tendo em conta a metodologia
desvios da produção de
podem explicar o menor
observado durante a fase estacionária, bem como o baixo teor
recentes, que apontam no sentido de existirem
diferenças fisiológicas significativas entre as células nas várias fases do processo
fermentativo, nomeadamente entre as células em crescimento exponencial (primeiras horas
Varela et al., 2005;
, estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das
células em condições de concentrações elevadas de etanol e esgotamento de nutrientes
rmentação vinária [Fleet &
RESULTADOS E DISCUSSÃO
56
Os resultados obtidos nos ensaios preliminares realizados a 15ºC e a 30ºC, em paralelo
com os resultados previamente obtidos a 25ºC, apontaram no sentido da manutenção de
viabilidade das células nas etapas finais de fermentação, levando a postular a existência de
diferenças significativas no comportamento de células ao longo da fermentação, à
semelhança do que fora descrito pelos autores acima referidos.
Atendendo a este facto, procurou-se estudar o comportamento das células nos vários
estádios de fermentação centrando a atenção em aspectos tais como: pH intracelular,
capacidade de expulsar H+ e permeabilidade passiva aos H+, uma vez que estes aspectos
permitem avaliar a capacidade de homeostase protónica da célula, como indicador do seu
estado fisiológico e capacidade de sobrevivência nas situações de stresse encontradas.
3.2.1. pH intracelular
Com o intuito de se observar o efeito das alterações que ocorrem ao longo da
fermentação vinária no pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 nas várias fases do
processo, procedeu-se à determinação deste parâmetro pelo método descrito por
Rottenberg (1979) (secção 2.7.), para células cultivadas a 15ºC e a 30ºC.
3.2.1.1. Em meio K
Tendo em conta que a maioria dos ensaios descritos na literatura para avaliação do pHin
foram realizados em condições standard, a 25ºC com estirpes laboratoriais, foi necessário
realizar um ensaio preliminar em meio mineral às duas temperaturas. Estes ensaios tiveram
como finalidade avaliar o período de incubação mínimo ao fim do qual a forma não
dissociada do ácido fraco marcado atingia o equilíbrio, uma vez que as velocidades de
difusão passiva do ácido marcado estão directamente dependentes da fluidez de
membrana, da constante de difusão da forma não dissociada através da bicamada lipídica e
consequentemente da temperatura. Os resultados de estudos prévios realizados a 25ºC
com esta estirpe indicaram que, após 90 minutos de incubação, o equilíbrio estabeleceu-se
[C. Prista, comunicação pessoal]. Atendendo a estas condicionantes, estabeleceu-se como
tempos de incubação:
� 150 minutos a 15ºC;
� 90 minutos a 30ºC.
Considerou-se que se atingiu o valor de pH intracelular assim que se verificou um
equilíbrio do composto radioactivo nos meios intracelular e extracelular, que correspondeu a
uma estabilização dos valores de pH intracelular nos gráficos que o relacionaram com o
tempo de incubação do composto radioactivo.
O método padrão descrito por Rosenberg (1979) utiliza14C] ácido propiónico. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de
cerevisiae ISA 1000, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico
recolheram células ao longo do tempo durante os períodos
a 15ºC não foi possível atingir
propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AH
todos os tempos em que se recolheram células,
significativamente alargado de 350 minutos (
observar que ocorreu uma alcalinização
constante ao longo do tempo.
O valor de pH intracelular
após 350 minutos de incubação com [1
aos valores de pHin normalme
et al., 2008]).
Como tal, após a análise destes resultados,
mesmos, foi testada a utilização de [1
pH intracelular (utilizando a mesma metodologia, a 15ºC e a 30ºC) para a estirpe auxotrófica
W-303 de S. cerevisiae, com o objec
da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W
comummente utilizada em ensaios laboratoriais, exibia ou não o mesmo comportamento.
Tal como se pode observar
possível estabelecer-se um equilíbrio
do [1-14C] ácido propiónico nos meios intracelular e extracelular de
cultivada em meio K, a 15ºC. No entanto,
observada foi menos acentuada do que a
mesmas condições (Figura 19
benzóico obteve-se uma maior estabilização do
inferiores, mais próximos d
[Kresnowati et al., 2008].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método padrão descrito por Rosenberg (1979) utiliza como ácido fraco marcado o
. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de
, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico
recolheram células ao longo do tempo durante os períodos estabelecidos, observou
atingir uma condição de equilíbrio entre a quantidade de ácido
propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AH
todos os tempos em que se recolheram células, inclusive para um perí
significativamente alargado de 350 minutos (Figura 18). Nestas situações
uma alcalinização aparente do meio intracelular relativa
.
Figura 18: Valores medidos para de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, meio K, utilizando [1-14C] ácido propiónico.
de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em
minutos de incubação com [1-14C] ácido propiónico, foi de de 7,
normalmente referenciados na literatura (entre 5,50 e 6,50
Como tal, após a análise destes resultados, e dado o carácter surpreendente dos
mesmos, foi testada a utilização de [1-14C] ácido propiónico nos ensaios de determinação do
pH intracelular (utilizando a mesma metodologia, a 15ºC e a 30ºC) para a estirpe auxotrófica
, com o objectivo de se averiguar se tal comportamento era exclusivo
da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W
comummente utilizada em ensaios laboratoriais, exibia ou não o mesmo comportamento.
Tal como se pode observar através da Figura 19, ao fim de 210 minutos
um equilíbrio, para estirpes laboratoriais, da forma não dissociada
C] ácido propiónico nos meios intracelular e extracelular de S.
K, a 15ºC. No entanto, a alcalinização aparente do meio
menos acentuada do que a observada para S. cerevisiae
19). Substituindo o [1-14C] ácido propiónico pelo [7
se uma maior estabilização do pHin ao longo do tempo,
mais próximos da gama de valores de pHin normalmente referenciados
RESULTADOS E DISCUSSÃO
57
como ácido fraco marcado o [1 -
. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de S.
, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico marcado e se
estabelecidos, observou-se que
entre a quantidade de ácido
propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AHex ≠ AHin para
inclusive para um período de tempo
Nestas situações foi possível
do meio intracelular relativamente
Valores medidos para pH intracelular a 15ºC, cultivada em
C] ácido propiónico.
ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral,
de 7,38, sendo superior
entre 5,50 e 6,50 [Kresnowati
e dado o carácter surpreendente dos
C] ácido propiónico nos ensaios de determinação do
pH intracelular (utilizando a mesma metodologia, a 15ºC e a 30ºC) para a estirpe auxotrófica
tivo de se averiguar se tal comportamento era exclusivo
da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W-303),
comummente utilizada em ensaios laboratoriais, exibia ou não o mesmo comportamento.
ao fim de 210 minutos também não foi
da forma não dissociada
cerevisiae W-303,
do meio intracelular
S. cerevisiae ISA 1000, nas
C] ácido propiónico pelo [7-14C] ácido
ao longo do tempo, obtendo-se valores
normalmente referenciados
A 30ºC foi possível determinar
propiónico, podendo afirmar-se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de
20). O valor de pHin determinado
se próximo da gama de valores de
al., 2008], no entanto a utilização de
dentro do intervalo referido (pH
Perante as evidências de, por um lado, não ter sido possível obter uma es
pH intracelular, por impossibilidade de estabelecimento de
dissociada do composto radioactivo nos me
ácido propiónico nas determinações
outro, o pHin determinado com [1
referidos na literatura, colocou
ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido
determinado nas células filtradas
da forma dissociada retida em consequência do desvio do equilíbrio
ser mais alcalino, conduzindo
poderá contribuir para a hipótese
membranas incide no facto de se ter obtido uma
intensa durante o ensaio em meio mineral
comparativamente à acidificação extracelular observada
Anexo VI). A maior intensidade com que se deu a
estar relacionada com uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 19: pH intracelular de 303, cultivada em meio K a 14C] ácido propiónico ou [7-Estão igualmente representados os valores de pHin de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada nas mesmas condições.
A 30ºC foi possível determinar-se o pHin de S. cerevisiae W-303 utilizando
se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de
determinado com este composto (pHin 6,75 após 90 minutos) encontra
valores de pHin normalmente referidos na literatura
utilização de [7-14C] ácido benzóico permitiu obter um valor de pH
pHin 6,14 após 90 minutos).
Figura 20: pH intracelular de
303, cultivada em meio K a 3014C] ácido propiónico ou [7-14
, por um lado, não ter sido possível obter uma es
pH intracelular, por impossibilidade de estabelecimento de equilíbrio entre a forma não
do composto radioactivo nos meios extracelular e intracelular,
nas determinações realizadas a 15ºC para ambas as estirpes
determinado com [1-14C] ácido propiónico ter sido muito superior
referidos na literatura, colocou-se a hipótese de estar a ocorrer a 15ºC uma incorporação do
ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido
nas células filtradas, sem que tal correspondesse efectivamente
retida em consequência do desvio do equilíbrio por
conduzindo a uma sobrestimação do valor de pHin
hipótese de incorporação da forma não dissociada do ácido
incide no facto de se ter obtido uma alcalinização intracelular
urante o ensaio em meio mineral a 15ºC, onde foi utilizado [1-14C] ácido propiónico,
comparativamente à acidificação extracelular observada nessas condições
A maior intensidade com que se deu a alcalinização intracelular
uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,
RESULTADOS E DISCUSSÃO
58
pH intracelular de S. cerevisiae W-em meio K a 15ºC, utilizando [1 -
-14C] ácido benzóico. Estão igualmente representados os valores de
ISA 1000 cultivada nas
303 utilizando [1-14C] ácido
se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de 90 minutos (Figura
6,75 após 90 minutos) encontra-
literatura [Kresnowati et
permitiu obter um valor de pHin
pH intracelular de S. cerevisiae W-
em meio K a 30ºC, utilizando [1-14C] ácido benzóico.
, por um lado, não ter sido possível obter uma estabilização do
equilíbrio entre a forma não
ios extracelular e intracelular, utilizando [1-14C]
realizadas a 15ºC para ambas as estirpes e de, por
superior aos valores
uma incorporação do
ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido fraco
sem que tal correspondesse efectivamente a um aumento
o meio intracelular
in. Outro factor que
ociada do ácido em
alcalinização intracelular aparente mais
C] ácido propiónico,
nessas condições (Tabela 16,
alcalinização intracelular aparente poderá
uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,
resultando numa menor acumulação de H
acidificaria o meio intracelular ou
acidificação do meio extracelular.
superior ao pH extracelular
lipossolúvel do ácido. Esta poderá ser, igualmente, outra
extracelular não ocorreu devid
somente garantindo a predominância da forma n
método descrito por Rottenberg
intracelular mais intensa do que a aci
um argumento a favor da ocorrência d
propiónico para a sua incorporação
Com vista a testar se se tratava de um artefacto, realizaram
condições, substituindo o ácido propiónico
existia a certeza de não ser
comunicação pessoal], utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos
resultados.
Os resultados obtidos p
representados nas Figuras 19
equilíbrio ao fim de 150 minutos a 15ºC e 90 minutos a 30ºC.
Atendendo a estes resultados optou
do pHin em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando
ácido benzóico em substituição do
longo do tempo de forma a garantir uma situação de eq
deste ácido entre os meios intra
Na Figura 21 está descrito o comportamento de
K, a 15ºC e a 30ºC, relativamente a
fim de 150 minutos) e a 30ºC (ao fim de 90 minutos) foram, respectivamente, 6,48 e 6,60.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
resultando numa menor acumulação de H+ no meio intracelular que
intracelular ou provocaria a expulsão de H+, com consequente
acidificação do meio extracelular. Garantindo que o pKa do ácido propiónico utilizado era
superior ao pH extracelular, assegurou-se a predominância da forma não dissociada
poderá ser, igualmente, outra das razões pela
devido à dissociação do ácido no meio extracelular
a predominância da forma não dissociada do ácido é
Rottenberg. A observação da ocorrência de uma
intracelular mais intensa do que a acidificação extracelular, poderá, portanto,
um argumento a favor da ocorrência de um desvio da forma não dissociada do
para a sua incorporação em membranas de células incubadas a 15ºC.
Com vista a testar se se tratava de um artefacto, realizaram-se ensaios nas mesmas
condições, substituindo o ácido propiónico marcado por ácido benzóico marcado para a qual
existia a certeza de não ser incorporado em experiências anteriores [M. C. Loureiro
utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos
Os resultados obtidos para pHin determinado por este método encontram
19 e 20, onde se pode verificar que foi possível atingir o
150 minutos a 15ºC e 90 minutos a 30ºC.
endo a estes resultados optou por se realizar todos os ensaios para determinação
em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando
ácido benzóico em substituição do [1-14C] ácido propiónico, recolhendo
longo do tempo de forma a garantir uma situação de equilíbrio da forma não dissociada
intracelular e extracelular.
está descrito o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio
K, a 15ºC e a 30ºC, relativamente ao pH intracelular. Os valores de pHin
fim de 150 minutos) e a 30ºC (ao fim de 90 minutos) foram, respectivamente, 6,48 e 6,60.
Figura 21: pH intracelular de 1000, cultivada em meio K, a 15ºC (curva a 30ºC (curva vermelha), utilizando [7benzóico. Em abcissa representaincorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
59
que, caso ocorresse,
, com consequente
Garantindo que o pKa do ácido propiónico utilizado era
da forma não dissociada
qual a acidificação
o do ácido no meio extracelular. Por outro lado,
é que seria válido o
a ocorrência de uma alcalinização
, portanto, contituir mais
desvio da forma não dissociada do [1-14C] ácido
células incubadas a 15ºC.
se ensaios nas mesmas
marcado por ácido benzóico marcado para a qual
em experiências anteriores [M. C. Loureiro-Dias,
utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos
determinado por este método encontram-se
oi possível atingir o
ensaios para determinação
em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando [7-14C]
ácido propiónico, recolhendo-se amostras ao
uilíbrio da forma não dissociada
ISA 1000 cultivada em meio
obtidos a 15ºC (ao
fim de 150 minutos) e a 30ºC (ao fim de 90 minutos) foram, respectivamente, 6,48 e 6,60.
de S. cerevisiae ISA em meio K, a 15ºC (curva azul) e
a 30ºC (curva vermelha), utilizando [7-14C] ácido Em abcissa representa-se o tempo de
C] ácido benzóico no
3.2.1.2. Em mosto estéril
Os resultados obtidos para o pH
e a 30ºC encontram-se descritos
Tal como foi possível observar, verific
1) Quer a 15ºC, quer a 30ºC
medida que a fermentação
dois últimos pontos de
2) O pHin das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para
ambas as temperaturas;
3) A 15ºC existiram dois comportamentos nitidamente distintos con
fermentação nas quais as células foram recolhidas, sendo o pH
mais ácido para as células recolhidas em plena fase estacionária do que o observado
para células recolhidas até à entrada
4) A 30ºC não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso
das células cultivadas
processo fermentativo
moderada do que a 15ºC. Para além disso, o valor de pH
de final de fermentação a 30ºC foi
de crescimento a 15ºC.
Figura 22: Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7tempo de incorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
osto estéril
Os resultados obtidos para o pHin de células recolhidas ao longo de fermentação a 15ºC
se descritos na Tabela 9 e nas Figuras 22 e 23.
possível observar, verificou-se que:
Quer a 15ºC, quer a 30ºC ocorreu uma nítida acidificação do meio intracelular à
medida que a fermentação foi decorrendo, com maior expressão
dois últimos pontos de amostragem a 15ºC;
das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para
ambas as temperaturas;
dois comportamentos nitidamente distintos con
fermentação nas quais as células foram recolhidas, sendo o pHin
mais ácido para as células recolhidas em plena fase estacionária do que o observado
para células recolhidas até à entrada desta fase.
não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso
das células cultivadas a 15ºC, uma vez que a acidificação intracelular
processo fermentativo de células cultivadas a 30ºC decorreu de uma forma mais
moderada do que a 15ºC. Para além disso, o valor de pHin observado para as células
de final de fermentação a 30ºC foi superior ao atingido pelas células na mesma fase
de crescimento a 15ºC.
Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico. Em abcissa representa
C] ácido benzóico no ensaio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
60
de células recolhidas ao longo de fermentação a 15ºC
uma nítida acidificação do meio intracelular à
principalmente nos
das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para
dois comportamentos nitidamente distintos conforme as fases de
in significativamente
mais ácido para as células recolhidas em plena fase estacionária do que o observado
não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso
a 15ºC, uma vez que a acidificação intracelular ao longo do
células cultivadas a 30ºC decorreu de uma forma mais
observado para as células
superior ao atingido pelas células na mesma fase
Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae bcissa representa-se o
Figura 23: pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7incorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.
Tabela 9: Valores de pH intracelular de diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.
Fase
Início de aceleração
Meio da exponencial
Final de exponencial
Início de estacionária
Meio da estacionária
Final de fermentação
Em meio mineral, o efeito d
de S. cerevisiae, cultivada a 25ºC,
estudo, estes autores observaram a ocorrência de
citoplasmático após a adição de etanol a uma suspensão de células
desenergizadas.
As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol),
identificadas por Piper (1993)
membranar a H+, provocando um decréscimo do pH
se observou ao longo das fermentações a 15ºC e a 30ºC
aumento do influxo de H+, muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol
na membrana plasmática [Gurtovenko & Anwar, 2009]
ATPase membranar, resultando num aumento da expulsão de protões para o exterior das
células, como tentativa destas
RESULTADOS E DISCUSSÃO
pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiaemosto estéril, a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico. Em abcissa representa
C] ácido benzóico no ensaio.
Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.
Fase de crescimento Temperaturas
15ºC 30ºC
Início de aceleração 6,44 -
xponencial 6,30 6,42
Final de exponencial 6,09 6,22
Início de estacionária 6,09 5,95
Meio da estacionária 5,16 5,94
Final de fermentação 5,02 5,84
efeito do etanol no pH intracelular de uma estirpe mutante respiratória
, cultivada a 25ºC, foi estudado por Loureiro-Dias e Santos (1990). Neste
observaram a ocorrência de uma forte acidificação do compartimento
o após a adição de etanol a uma suspensão de células
As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol),
por Piper (1993) como indutoras de um aumento da permeabilidade
, provocando um decréscimo do pHin [Piper, 1993]. O declínio do pH
das fermentações a 15ºC e a 30ºC, em consonância com
muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol
membrana plasmática [Gurtovenko & Anwar, 2009], pode estimular a actividade da H
ATPase membranar, resultando num aumento da expulsão de protões para o exterior das
stas reagirem face à descida do pHin [Piper, 1993]
RESULTADOS E DISCUSSÃO
61
cerevisiae ISA 1000 em sa representa-se o tempo de
ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as
Temperaturas
30ºC
-
6,42
6,22
5,95
94
5,84
o etanol no pH intracelular de uma estirpe mutante respiratória
Dias e Santos (1990). Neste
uma forte acidificação do compartimento
o após a adição de etanol a uma suspensão de células energizadas e
As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol), foram
um aumento da permeabilidade
declínio do pHin que
em consonância com o possível
muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol
a actividade da H+-
ATPase membranar, resultando num aumento da expulsão de protões para o exterior das
[Piper, 1993].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
62
Com o objectivo de se tentar perceber de que forma é que as células incubadas a 15ºC
exibiram no final de fermentação um pHin tão baixo (pHin≈5) e mesmo assim se mantiveram
metabolicamente activas, procedeu-se à avaliação das velocidades de efluxo e de influxo de
H+ através da membrana plasmática.
3.2.2. Efluxo de H+ através da membrana plasmática
A membrana plasmática é um dos principais alvos do etanol nas leveduras (van Uden,
1985). Estudos prévios de alguns autores indicaram que o etanol inibe processos de
transporte mediado [Loureiro-Dias & Peinado, 1982; Leão & van Uden, 1984b; Sousa et al.,
1996] e estimula os processos de difusão simples [Leão & van Uden, 1984a; Casal et al.,
1998; Salgueiro et al., 1988]. Estas alterações na permeabilidade da membrana plasmática
podem ser prejudiciais para as células uma vez que limitam a entrada de nutrientes
essenciais e promovem a perda de constituintes intracelulares ou a entrada de substâncias
extracelulares as quais alteram a composição do citoplasma e, consequentemente, a
homeostasia celular.
Os protões estão usualmente em concentrações muito elevadas no meio extracelular e
as células, nomeadamente as células de levedura, possuem H+-ATPases que mantêm os
valores de pH intracelular a níveis compatíveis com a actividade fisiológica e geram força
protomotriz através da membrana plasmática. Em 3.2.1. observou-se que o comportamento
das células de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, a 15ºC e 30ºC, ao nível do pH
intracelular, pode ser influenciado pelo etanol, uma vez que células colhidas nas fases finais
de fermentação apresentaram um pHin inferior ao pHin de células de início de fermentação.
De forma a serem observadas as alterações que ocorrem ao nível da capacidade de
expulsão de H+ através da membrana em células colhidas ao longo da fermentação vinária
em S. cerevisiae ISA 1000, principalmente por intermédio da actividade da H+-ATPase
membranar, procedeu-se à determinação deste parâmetro através da metodologia descrita
na secção 2.9. Sucintamente observou-se o movimento de protões, nas diferentes fases de
crescimento, às duas temperaturas testadas (15ºC e 30ºC), através do registo do pH ao
longo do tempo de uma suspensão de células desenergizadas, após adição de um pulso de
glucose que permitiu verificar uma acidificação do meio extracelular. Iniciou-se o registo a
pH 5, constatando-se que a acidificação extracelular ocorreu em todos os casos após a
adição de glucose e resultou do balaço da actividade de transportadores de H+
(principalmente da H+-ATPase membranar) e do influxo de protões (por difusão passiva de
H+ através da membrana plasmática em função do ∆pH existente).
Para o cálculo da velocidade de expulsão de protões traçou-se a tangente de cada curva
de acidificação (posterior à adição de glucose) e registou-se o declive que, associado a uma
calibração (com adição de X nmol de OH-) relaciona variações de pH com quantidades de
base adicionadas ao sistema, num determinado instante.
gráficos das velocidades de efluxo de H
ensaio original e na sua repetição.
3.2.2.1. Em meio K
Para a execução do primeiro ensaio
protónico de S. cerevisiae ISA 1000 foram
na secção 2.3..
Na Figura 24 estão represent
H+.g-1.h-1) a 15ºC e 30ºC, para
concentrações crescentes de etanol
efluxo de H+ obtida a 15ºC foi
observações de diversos autores
elevadas de efluxo observadas
reagirem face à dissipação da força protomotriz
A 15ºC a velocidade de expulsão de protões é muito baixa (valores compreendidos entre
0,17 e 0,57 mmol H+.g-1.h-1) e é
etanol no meio extracelular.
A 30ºC observou-se que um aumen
diminuição da velocidade de efluxo de protões
16% (v/v) de etanol (0,63 mmol H
de etanol (0,57 mmol H+.g-1.h
desde concentrações muito baixas
cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo
acentuado de 3,81 mmol H+
etanol), continuando a velocidade de efluxo de protões
com o aumento da concentração de etanol.
Apesar de se ter constatado que
sempre superiores aos observados a 15ºC,
RESULTADOS E DISCUSSÃO
dicionadas ao sistema, num determinado instante. Cada ponto representado nos
gráficos das velocidades de efluxo de H+ constitui a média das velocidade
repetição.
eio K
a a execução do primeiro ensaio em meio K, de determinação da velocidade de efluxo
ISA 1000 foram utilizadas as condições experimentais
estão representadas as velocidades de efluxo de H+ (expressas em mmol
para S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio K,
concentrações crescentes de etanol entre 0% e 20% (v/v). Verificou-se que
foi muito menor do que a obtida 30ºC, estando de acordo com as
diversos autores [Ahlers, 1981; Viegas et al., 1995]. As velocidades mais
as a 30ºC poderiam, em parte, indicar uma tentativa
issipação da força protomotriz.
A 15ºC a velocidade de expulsão de protões é muito baixa (valores compreendidos entre
) e é praticamente insensível a concentrações crescentes de
que um aumento da concentração de etanol
velocidade de efluxo de protões, de tal forma que o valor obtido
(0,63 mmol H+.g-1.h-1) é muito próximo do valor obtido a 15ºC para 0%
.h-1). Para além disso, foi possível constatar que o etanol
desde concentrações muito baixas na diminuição da velocidade de efluxo de células
cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo +.g-1.h-1 (0% (v/v) etanol) para 1,98 mmol H
velocidade de efluxo de protões a diminuir de uma forma progressiva,
com o aumento da concentração de etanol.
Figura 24: Efluxo de protões atrmembrana plasmática de S. em meio K, a 15ºC (pontos azuis(pontos vermelhos), utilizando diferentconcentrações de etanol no me
e ter constatado que os valores de velocidade de efluxo de
sempre superiores aos observados a 15ºC, foi possível constatar uma relativa
RESULTADOS E DISCUSSÃO
63
Cada ponto representado nos
velocidades registadas no
velocidade de efluxo
as condições experimentais descritas
(expressas em mmol
em meio K, utilizando
que a velocidade de
, estando de acordo com as
As velocidades mais
uma tentativa das células
A 15ºC a velocidade de expulsão de protões é muito baixa (valores compreendidos entre
insensível a concentrações crescentes de
de etanol provocou uma
valor obtido a 30ºC para
) é muito próximo do valor obtido a 15ºC para 0%
Para além disso, foi possível constatar que o etanol actuou
na diminuição da velocidade de efluxo de células
cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo
mmol H+.g-1.h-1 (2% (v/v)
diminuir de uma forma progressiva,
Efluxo de protões através da cerevisiae ISA 1000,
pontos azuis) e a 30ºC , utilizando diferentes
concentrações de etanol no meio extracelular.
os valores de velocidade de efluxo de H+ a 30ºC foram
relativa aproximação
dos valores obtidos às duas temperaturas para
H+.g-1.h-1 a 30ºC) e 16% (v/v)
etanol, uma vez que a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a
etanol, na medida em que o valor de influxo
uma acidificação extracelular após pulso de glucose.
3.2.2.2. Em mosto estéril
No caso das velocidades de efluxo de
a 15ºC para as diferentes fases de crescimento
concentração de etanol, em cada fase de cr
25).
Figura 25: Efluxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC
possível fazer as seguintes observações
1) De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsa
protões a uma baixa velocidade (V
fase exponencial, na ausência de etanol).
2) O perfil de velocidades de efluxo protónico em f
observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças
velocidades de células colhidas a partir da fase
início da fase exponencial,
mmol.g-1.h-1, quer por est
com o aumento da concentração de etanol
RESULTADOS E DISCUSSÃO
dos valores obtidos às duas temperaturas para 14% (0,49 mmol H+.g-1.h-1
16% (v/v) (0,30 mmol H+.g-1.h-1 a 15ºC, 0,63 mmol H
a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a
que o valor de influxo foi superior para este caso, não
r após pulso de glucose.
osto estéril
das velocidades de efluxo de protões obtidas nos diferentes ensaios realizados
para as diferentes fases de crescimento em mosto, avaliou-se
em cada fase de crescimento, neste parâmetro fisiológico
Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC
fazer as seguintes observações (Figura 25; Anexo VII):
De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsa
ixa velocidade (Vmáx registada = 0,73 mmol H+.g-
exponencial, na ausência de etanol).
O perfil de velocidades de efluxo protónico em função da concentração de etanol
observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças
células colhidas a partir da fase estacionária, quer
início da fase exponencial, velocidades de efluxo relativamente próximas de 0
por estas velocidades não terem sofrido oscilações
com o aumento da concentração de etanol (Vmédia ≈ 0,20 mmol H+.g
RESULTADOS E DISCUSSÃO
64
a 15ºC, 0,90 mmol
mmol H+.g-1.h-1 a 30ºC) de
a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a 20% (v/v) de
não se observando
obtidas nos diferentes ensaios realizados
se a influência da
neste parâmetro fisiológico (Figura
cerevisiae ISA 1000, para as , utilizando diferentes concentrações de etanol no
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC, foi
De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsaram -1.h-1 para o final da
unção da concentração de etanol
observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças com o perfil de
, quer por apresentar, no
relativamente próximas de 0
oscilações pronunciadas
.g-1.h-1).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
65
3) O perfil de velocidades de efluxo de H+ para as fases meio e final de exponencial foi
algo irregular, no entanto foi possível observar que as velocidades permaneceram
relativamente constantes até aos 8% (v/v) (na fase meio da exponencial) e 10% (v/v)
(na fase final de exponencial) de etanol, notando-se em ambas as fases um aumento
da velocidade de efluxo protónico para a gama de concentrações de etanol de 10% a
12% (v/v). A partir de 14%, igualmente para as duas fases de crescimento, registou-
se um decréscimo das velocidades de efluxo protónico. A velocidade máxima de
efluxo de H+ a 15ºC registou-se para as células em fase final de exponencial, na
ausência de etanol (Vmáx = 0,73 mmol H+.g-1.h-1). Outro facto observado foi o de as
velocidades de efluxo protónico destas duas fases terem sido superiores em valor
absoluto às velocidades de células colhidas noutros pontos de amostragem pré-
definidos. Por outro lado, quando se comparam velocidades de expulsão de H+ de
células em plena fase exponencial, cultivadas em meio mineral e em mosto,
constata-se que em mosto as velocidades são menores do que em meio K a partir de
14% (v/v) de etanol (inclusive), muito embora não tenham sido registadas as
velocidades de efluxo de H+ de células cultivadas em meio K, para a gama de 2% a
6% (v/v) de etanol, não sendo possível portanto concluir se as velocidades de efluxo
protónico nessa gama de concentrações de etanol continuariam a ser superiores em
mosto.
4) No início da fase estacionária as velocidades de efluxo de H+ decaíram para valores
muito próximos de 0 (zero) mmol H+.g-1.h-1, registando-se uma baixa variação de
velocidades com o aumento da concentração de etanol.
5) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da
estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram uma menor variação
com o aumento da concentração de etanol e as que tiveram um valor inferior ao da
velocidade de difusão de H+ para o interior da célula.
O etanol apenas teve influência nas velocidades de efluxo protónico das fases meio e
final da fase exponencial, observando-se nestas mesmas fases uma diminuição inicial da
taxa de efluxo de H+ para concentrações baixas de etanol (i.e., para 2% (v/v) etanol) e uma
diminuição mais significativa para concentrações superiores a 10% (v/v), muito próximas das
concentrações habitualmente encontradas no vinho. A situação observada no final de
fermentação, a 15ºC, de velocidades de difusão superiores às de efluxo de H+ origina
questões acerca de qual (ou quais) o(s) mecanismo(s) fisiológico(s) que está(ão) implícito(s)
na perda da capacidade da célula expulsar os protões, mantendo ainda assim a capacidade
metabólica.
Nas condições experimentais testadas
de efluxo protónico a 16% (v/v) de etanol para células recolhidas nas fases início e meio de
exponencial, uma vez que as
de efluxo, não tendo sido possível observar uma acidificação extracelular após pulso de
glucose.
Figura 26: Efluxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento em mosto a 30meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de
possível fazer as seguintes observações
1) Para as fases iniciais de fermentação,
exponencial, o perfil de velocidades de efluxo de H
que sofreu variações ascendentes e descendentes relativamente pronunciadas com
o aumento da concentração de etanol, não obstante terem sido superiores em valor
absoluto às velocidades de efluxo protónico de células a partir de meio da fase
estacionária de crescimento;
2) Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de
efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir d
estacionária;
3) A velocidade máxima de efluxo protónico foi obtida
exponencial de crescimento (2,58 mmol.g
crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto
provocou uma diminuição da velocidade até 1,17 mmol.g
mínimo para esta fase
velocidade de efluxo protónico até 1,81 mmol.g
pequena a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas condições experimentais testadas a 15ºC não foi possível determinar as velocidades
de efluxo protónico a 16% (v/v) de etanol para células recolhidas nas fases início e meio de
as velocidades de influxo neste caso foram muito
possível observar uma acidificação extracelular após pulso de
Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no
s células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC
fazer as seguintes observações (Figura 26; Anexo VII):
Para as fases iniciais de fermentação, que engloba o meio e
exponencial, o perfil de velocidades de efluxo de H+ foi algo irregular, na medida em
que sofreu variações ascendentes e descendentes relativamente pronunciadas com
o aumento da concentração de etanol, não obstante terem sido superiores em valor
absoluto às velocidades de efluxo protónico de células a partir de meio da fase
estacionária de crescimento;
Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de
efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir d
A velocidade máxima de efluxo protónico foi obtida para célula
exponencial de crescimento (2,58 mmol.g-1.h-1), na ausência de etanol. Nesta fase de
crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto
provocou uma diminuição da velocidade até 1,17 mmol.g-1.h-1,
mínimo para esta fase. A adição de 8% (v/v) de etanol provocou
velocidade de efluxo protónico até 1,81 mmol.g-1.h-1. De 8% a 14% (v/v) de etanol, foi
a a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das
RESULTADOS E DISCUSSÃO
66
ão foi possível determinar as velocidades
de efluxo protónico a 16% (v/v) de etanol para células recolhidas nas fases início e meio de
muito superiores às
possível observar uma acidificação extracelular após pulso de
S. cerevisiae ISA 1000, para as ncentrações de etanol no
fermentações conduzidas a 30ºC foi
engloba o meio e o final de fase
foi algo irregular, na medida em
que sofreu variações ascendentes e descendentes relativamente pronunciadas com
o aumento da concentração de etanol, não obstante terem sido superiores em valor
absoluto às velocidades de efluxo protónico de células a partir de meio da fase
Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de
efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir de meio de
células em plena fase
), na ausência de etanol. Nesta fase de
crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto (até 4% (v/v))
, atingindo o valor
8% (v/v) de etanol provocou um aumento da
. De 8% a 14% (v/v) de etanol, foi
a a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das
RESULTADOS E DISCUSSÃO
67
velocidades para esta gama de concentrações de etanol. Não foi possível obter
velocidades para concentrações superiores a 14% (v/v) de etanol, pois observou-se
durante a execução destes ensaios que as velocidades de influxo passivo de protões
foram superiores às de efluxo de H+. Comparativamente às velocidades de expulsão
de H+ de células na mesma fase de crescimento, mas cultivadas em meio mineral,
constata-se que as células cultivadas em meio K até 6% (v/v) (inclusive) de etanol
expulsaram H+ a uma velocidade superior relativamente às cultivadas em mosto. A
partir de 8% aconteceu precisamente o inverso, pertencendo as velocidades
superiores de efluxo de H+ às células cultivadas em mosto.
4) As velocidades de efluxo protónico de células em fase final de exponencial foram as
que variaram mais o seu perfil com o aumento da concentração de etanol. Tal como
o observado para a fase anterior, a adição de concentrações baixas de etanol (até
4% (v/v) inclusive) diminuiu a velocidade de efluxo até 0,72 mmol.g-1.h-1, atingindo
novamente o seu valor mínimo para esta fase de crescimento. A adição de 8% (v/v)
de etanol provocou um aumento pronunciado da velocidade de efluxo protónico para
2,25 mmol.g-1.h-1 sendo que, para concentrações superiores de etanol (i.e., de 8% a
16% (v/v)), observou-se uma diminuição relativamente constante das velocidades de
efluxo atingindo um valor de 0,68 mmol.g-1.h-1, para 16% (v/v) de etanol. Novamente
não foi possível obter velocidades para concentrações superiores a 16% (v/v) de
etanol pelas mesmas razões acima referidas.
5) Para células em início de fase estacionária a adição de 4% de etanol provocou um
ligeiro aumento da velocidade de efluxo, comparativamente com a velocidade obtida
na ausência de etanol, atingindo o valor 1,64 mmol.g-1.h-1 que foi máximo para esta
fase. A adição de 6% (v/v) de etanol provocou um decréscimo da velocidade de
efluxo, sendo que para a gama de concentrações de 8% a 16% (v/v) (inclusive) de
etanol foi possível observar uma relativa estabilização das velocidades de efluxo de
H+ (Vmédia ≈ 0,72 mmol.g-1.h-1).
6) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da
estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram os valores mais
baixos, comparativamente com as outras fases, e são as que tiveram uma menor
variação com o aumento da concentração de etanol. Apesar disso, foi possível
constatar que a adição de 2% e de 4% (v/v) provocou um ligeiro aumento da
velocidade de efluxo protónico para as células em plena fase estacionária. A partir de
6% até 20% a velocidade de efluxo protónico de células em plena fase estacionária
estabilizou-se nos ≈0,50 mmol.g-1.h-1. Para células em final de fermentação, a
velocidade de efluxo protónico foi praticamente constante (≈0,45 mmol.g-1.h-1) para
todas as concentrações de etanol testadas.
3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões
Paralelamente às determinações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados
ensaios com o intuito de se observarem as alterações que ocorrem ao nível da
permeabilidade da membrana plasmática
processo de fermentação vinári
os diferentes pontos de amostragem
30ºC), bem como foi estudada
etanol na permeabilidade da membrana.
2.8, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À
semelhança do que aconteceu nos ensaios de efluxo de H
gráficos de permeabilidade de H
original e na sua repetição.
3.2.3.1. Em meio K
A observação da Figura 2
células a 30ºC são superiores
todas as concentrações de etanol testada
em que é conhecida a relação
bicamada lipídica e é conhecido o efeito
[Jiménez & van Uden, 1985].
diferente as velocidades de influxo protónico conforme o crescimento
30ºC. A 15ºC, embora a variação de velocidade
geral tenha sido baixa, é notório
aumento da concentração de etanol
de H+ para as mesmas condições
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Permeabilidade da membrana ao influxo de protões
terminações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados
ensaios com o intuito de se observarem as alterações que ocorrem ao nível da
permeabilidade da membrana plasmática relativamente aos H+, em célula
processo de fermentação vinária. Foram determinadas as velocidades de influxo de
os diferentes pontos de amostragem (definidos em 2.3.6.), às duas temperaturas (15ºC e
foi estudada em simultâneo a influência de diferentes concentrações de
e da membrana. A metodologia utilizada está descrita na secção
, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À
semelhança do que aconteceu nos ensaios de efluxo de H+, cada ponto representado nos
bilidade de H+ constitui a média das velocidades registadas
eio K
Figura 27: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. em meio K a 15ºC (pontos azuis)(pontos vermelhos), utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
27 permite constatar que as velocidades de
são superiores comparativamente a 15ºC. Este resultado é observável
de etanol testadas, estando de acordo com o esperado, na medida
é conhecida a relação entre a temperatura e a difusão passiva
é conhecido o efeito do etanol no estímulo do influxo
. Por outro lado, verifica-se que o etanol influenci
diferente as velocidades de influxo protónico conforme o crescimento tenha sido
30ºC. A 15ºC, embora a variação de velocidade em função da concentração de etano
baixa, é notório que houve um ligeiro estímulo de entrada de H
aumento da concentração de etanol, enquanto a 30ºC se verificou uma diminui
para as mesmas condições.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
68
terminações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados
ensaios com o intuito de se observarem as alterações que ocorrem ao nível da
em células ao longo do
. Foram determinadas as velocidades de influxo de H+ para
às duas temperaturas (15ºC e
a influência de diferentes concentrações de
utilizada está descrita na secção
, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À
, cada ponto representado nos
constitui a média das velocidades registadas no ensaio
nfluxo de protões através da cerevisiae ISA 1000,
(pontos azuis) e a 30ºC , utilizando diferentes
concentrações de etanol no meio extracelular.
as velocidades de influxo de H+ nas
Este resultado é observável para
, estando de acordo com o esperado, na medida
passiva de H+ através da
influxo passivo de H+
que o etanol influenciou de forma
tenha sido a 15ºC ou a
em função da concentração de etanol no
um ligeiro estímulo de entrada de H+ com o
diminuição do influxo
3.2.3.2. Em mosto estéril
3.2.3.2.1. Células suspensas
Nas Figuras 28 e 29 estão representadas as velocidades de influxo de protões através da
membrana plasmática, para diferentes fases de crescimento de
fermentações vinárias conduzidas a 15ºC
Figura 28: Influxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento em meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a
possível fazer as seguintes observações
1) Para as fases iniciais de fermentação, incluindo o final d
de velocidades de influxo
adicionada à suspensão de células
de influxo de H+ foram
de meio da fase estacionária de crescimento;
2) As fases início e meio de exponencial demonstraram ter um
semelhante, no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações
observadas em função da concentração de etanol no meio extracelular, se verificou
uma relativa estabiliza
Vmédia ≈ 0,24 mmol.g-1.h
influxo aumentou substancialmente
3) A fase final de exponencial
velocidades de influxo de H
extracelular, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma
tendência de aumento da
concentração de etanol;
RESULTADOS E DISCUSSÃO
osto estéril
Células suspensas e incubadas em água desmineralizada
estão representadas as velocidades de influxo de protões através da
membrana plasmática, para diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae
fermentações vinárias conduzidas a 15ºC e a 30ºC, respectivamente.
nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no
células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a
fazer as seguintes observações (Figura 28; Anexo VIII):
Para as fases iniciais de fermentação, incluindo o final da fase exponencial, o perfil
influxo de H+ variou consoante a concentração de etanol
adicionada à suspensão de células, no entanto, de uma forma geral
foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir
de meio da fase estacionária de crescimento;
início e meio de exponencial demonstraram ter um perfil de velocidades
no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações
observadas em função da concentração de etanol no meio extracelular, se verificou
uma relativa estabilização do influxo protónico no início da fase exponencial a uma
.h-1, enquanto no caso das células em plena fase exponencial o
aumentou substancialmente a 20% (v/v) de etanol;
exponencial foi a que demonstrou sofrer maiores oscilações
velocidades de influxo de H+ perante concentrações crescentes
, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma
tendência de aumento da velocidade de influxo de H+, com o aumento da
concentração de etanol;
RESULTADOS E DISCUSSÃO
69
desmineralizada
estão representadas as velocidades de influxo de protões através da
cerevisiae ISA 1000 em
cerevisiae ISA 1000, para as , utilizando diferentes concentrações de etanol no
células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC foi
fase exponencial, o perfil
consoante a concentração de etanol
de uma forma geral as velocidades
superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir
perfil de velocidades
no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações
observadas em função da concentração de etanol no meio extracelular, se verificou
ção do influxo protónico no início da fase exponencial a uma
, enquanto no caso das células em plena fase exponencial o
foi a que demonstrou sofrer maiores oscilações nas
de etanol no meio
, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma
, com o aumento da
4) As velocidades de influxo protónico de células e
muito próximas de 0 (zero) mmol.g
etanol no meio extracelular.
5) Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as
velocidades de influxo protónic
de etanol testadas.
Figura 29: Influxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi
possível fazer as seguintes observações
1) Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento
velocidades de influxo de H
etanol adicionada à suspensão de células, no entanto,
foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da
fase estacionária de crescimento;
2) Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase
exponencial mantiveram relativamente constantes as suas velocidades até à
concentração de 16% (v/v) de etanol
velocidade de influxo para concentrações superiores deste composto. Por
comparação, as células nas fases final de exponencial e início de estacionária viram
aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concent
a 14% e 18% (v/v) de etanol
de uma forma geral, demonstrou ter velocidades de influxo protónico superiores às
das restantes fases;
RESULTADOS E DISCUSSÃO
velocidades de influxo protónico de células em início de fase estacionária
muito próximas de 0 (zero) mmol.g-1.h-1, independentemente da concentração de
etanol no meio extracelular.
Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as
velocidades de influxo protónico medidas foram nulas para todas as concentrações
nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentraçõe
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi
fazer as seguintes observações (Figura 29; Anexo VIII):
Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento
velocidades de influxo de H+ sofreram oscilações consoante a concentração de
etanol adicionada à suspensão de células, no entanto, foi possível constatar que
superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da
ria de crescimento;
Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase
exponencial mantiveram relativamente constantes as suas velocidades até à
concentração de 16% (v/v) de etanol (Vmédia ≈ 0,55 mmol.g-1.h
velocidade de influxo para concentrações superiores deste composto. Por
comparação, as células nas fases final de exponencial e início de estacionária viram
aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concent
(v/v) de etanol, respectivamente. A fase final de exponencial foi a que,
de uma forma geral, demonstrou ter velocidades de influxo protónico superiores às
RESULTADOS E DISCUSSÃO
70
m início de fase estacionária foram
, independentemente da concentração de
Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as
o medidas foram nulas para todas as concentrações
cerevisiae ISA 1000, para as , utilizando diferentes concentrações de etanol no
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi
Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento as
consoante a concentração de
foi possível constatar que
superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da
Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase
exponencial mantiveram relativamente constantes as suas velocidades até à
.h-1), aumentando a
velocidade de influxo para concentrações superiores deste composto. Por
comparação, as células nas fases final de exponencial e início de estacionária viram
aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concentrações superiores
A fase final de exponencial foi a que,
de uma forma geral, demonstrou ter velocidades de influxo protónico superiores às
RESULTADOS E DISCUSSÃO
71
3) As velocidades de influxo protónico de células colhidas das fases finais de
fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) foram muito próximas de
0 (zero) mmol.g-1.h-1, independentemente da concentração de etanol no meio
extracelular.
3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões
As constatações retiradas dos ensaios de efluxo de H+, onde especificamente foi possível
verificar que S. cerevisiae ISA 1000 apresentou velocidades de efluxo muito próximas de
zero em todas as fases de crescimento a 15ºC (onde inclusivamente a partir de meio da fase
estacionária as velocidades de efluxo de H+ observadas foram inferiores às de influxo -
Figura 25) e dos ensaios de influxo de H+ a 15ºC, onde as velocidades obtidas para as
células colhidas e ressuspendidas em água desmineralizada a partir de fase estacionária
foram nulas (Figura 28), independentemente da concentração de etanol adicionada ao meio
extracelular, despoletou a necessidade de se procurar entender este comportamento
peculiar das células, uma vez que todas estas observações indiciaram uma possível
impermeabilização da membrana plasmática das células nas fases finais de fermentação a
15ºC e a 30ºC.
A hipótese do pH interno de células colhidas a partir de meio da fase estacionária a 15ºC
ser inferior ao pH extracelular poderia justificar as baixas velocidades de efluxo e a baixa
permeabilidade observadas nesta fase por distúrbios que o pH interno estivesse a provocar
nas componentes da força protomotriz (∆pH e ∆ψ).
Houve, então, a necessidade de se proceder a novas determinações de velocidades de
influxo protónico, neste caso utilizando soluções tamponizadas (Tris 10mM citrato) a pH 5
(valor de pH que já garantia um ∆pH) e a pH 6,3 (valor de pH de células “saudáveis” no vaso
reactor do ensaio) como meio de suspensão e de incubação das células, de forma a garantir
que a causa da ocorrência de velocidades muito baixas de efluxo e de influxo protónico de
células colhidas a partir de meio da fase estacionária não seria devido à ausência de ∆pH,
mas à possibilidade de impermeabilização das células nesta fase de crescimento.
Perante os resultados evidenciados através das Figuras 30 e 31 foi possível confirmar
que as baixas velocidades de influxo protónico corresponderam efectivamente a uma
permeabilidade a H+ extremamente baixa de células em plena fase estacionária, cultivadas
a 15ºC e a 30ºC, muito embora se tenha observado através da Figura 30 que as células a
15ºC evidenciaram uma permeabilidade que demonstrou ser ainda inferior (quase nula) à de
células cultivadas a 30ºC (Figura 31).
Figura 30: Influxo de protões através da membrana plasmática de fermentações de mosto a 15ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pontos azuis), Tris 10mM citrato pH diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases final de fermentação.
Figura 31: Influxo de protões através da membrana plasmática de fermentações de mosto a 30ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pontos azuis), Tris 10mM citrato pHdiferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases final de fermentação.
3.3. Discussão Geral
Foi pretendido com este trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura
nos aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo
vinária realizada a 15ºC e a 30ºC
Ao contrário da maioria dos estudos realizados ant
se com este trabalho aproximar
condições em que normalmente são realizad
simular esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores
entre: 1) estirpes industriais vs estirpes laboratoriais
laboratoriais vs condições de a
vínica de S. cerevisiae, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN
mosto de uva branca, que
condições de fraca agitação e
tintos (30ºC) e os vinhos brancos (15ºC).
condições de estudo das condições de adega, onde normalmente são utilizadas cubas sem
(a)
(a)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água
os azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pH diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e
nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água
(pontos azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pHdiferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da est
trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura
s aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo
e a 30ºC por Saccharomyces cerevisiae ISA 1000
contrário da maioria dos estudos realizados anteriormente sobre este tema
aproximar tanto quanto possível as condições de estudo das
condições em que normalmente são realizadas as fermentações em adega,
esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores
entre: 1) estirpes industriais vs estirpes laboratoriais [Pizarro et al., 2007
laboratoriais vs condições de adega [Pretorius, 2000]. Para tal, utilizou-
, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN
sofreu previamente os habituais tratamentos em adega,
a agitação e 4) temperaturas a que normalmente são produzido os vinhos
tintos (30ºC) e os vinhos brancos (15ºC). Estas condições descritas permitiram aproximar as
condições de estudo das condições de adega, onde normalmente são utilizadas cubas sem
(b)
(b)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
72
cerevisiae ISA 1000, em , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água
rmelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando meio da estacionária e (b)
cerevisiae ISA 1000, em , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água
5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando meio da estacionária e (b)
trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura
s aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo da fermentação
ISA 1000.
eriormente sobre este tema, procurou-
tanto quanto possível as condições de estudo das
as as fermentações em adega, procurando
esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores
., 2007] e 2) condições
-se: 1) uma estirpe
, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN®), 2)
os habituais tratamentos em adega, 3)
4) temperaturas a que normalmente são produzido os vinhos
Estas condições descritas permitiram aproximar as
condições de estudo das condições de adega, onde normalmente são utilizadas cubas sem
RESULTADOS E DISCUSSÃO
73
agitação e sem arejamento (atingindo-se rapidamente condições de semi-anaerobiose) e
onde frequentemente se utilizam pré-inóculos de leveduras liofilizadas com 1x106 células/mL
de mosto.
O estabelecimento de pontos de amostragem às duas temperaturas de estudo, com base
nos pontos escolhidos a partir do estudo de Rossignol e colaboradores (2003), permitiu-nos
monitorizar de uma forma mais eficiente os diversos ensaios realizados a 15ºC e a 30ºC e
avaliar as diferenças de comportamento da estirpe em vários aspectos de homeostase
protónica.
Atendendo às curvas de crescimento obtidas a 15ºC e a 30ºC, facilmente se pôde
constatar que a temperatura demonstrou ser, de facto, um dos factores principais que
influenciam as fermentações vinárias, pois o seu efeito fez-se sentir nos diferentes aspectos
da fisiologia da levedura estudados.
A utilização de temperatura baixa de crescimento provocou, tal como esperado, a
diminuição da taxa específica de crescimento da estirpe e da taxa de fermentação,
aumentando a duração do período de fermentação do mosto de uva branca (≈304h),
comparativamente ao obtido a 30ºC (≈71h), à semelhança dos resultados obtidos por
diversos autores em fermentações realizadas em mosto sintético [Torija et al., 2003a; Torija
et al., 2003b, Novo et al., 2003]. O rendimento em biomassa (gbiomassa/molglucose) foi mais
elevado a 30ºC (≈114gbiomassa/molglucose) durante a fase exponencial de crescimento,
comparativamente a 15ºC (≈87gbiomassa/molglucose), podendo este resultado estar relacionado
com (1) uma maior taxa específica de transferência de glucose obtida a 30ºC
(≈5,24mmolglucose.g-1
biomassa.h-1), comparativamente à obtida a 15ºC (≈1,25mmolglucose.g
-
1biomassa.h
-1) durante a fase exponencial de crescimento, o que significa que a esta
temperatura houve uma maior quantidade de glucose mobilizada por quantidade de
biomassa formada durante a fase exponencial e com (2) a diminuição de expressão de
HXT1 (gene que codifica para transportador de hexoses de baixa afinidade, normalmente
expresso durante a fase exponencial de crescimento), observada por Pizarro e
colaboradores (2008) em fermentações de mosto sintético a 15ºC [Pizarro et al., 2008],
pressupondo que o mesmo se verifica em mosto real. A concentração final de etanol obtida
a 30ºC foi mais baixa comparativamente à concentração obtida a 15ºC, confirmando as
observações de diversos autores de ocorrência de uma menor produção de etanol para
temperaturas altas de fermentação [Casey & Ingledew, 1986]. A possível explicação para
este resultado poderá estar relacionada com o aumento da quantidade de produtos de
outras vias metabólicas (e.g. acido acético e glicerol), durante a fermentação a 30ºC, que
perturbam o metabolismo da levedura e conduzem a rendimentos mais baixos em etanol
[Torija et al., 2003a; Pizarro et al., 2008].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
74
No período que comprende o final da fase exponencial e o início da fase estacionária de
fermentações conduzidas a 30ºC ocorreu um resultado interessante referente ao consumo
de glucose e produção de etanol. Durante este período foi consumido ≈40% da glucose e foi
produzido ≈58% do etanol, indiciando que a transição entre estas fases teve uma
importância acrescida nas fermentações a 30ºC. Até à data não são conhecidos estudos
que tenham referido este comportamento das células neste período de desaceleração entre
as fases final de exponencial e início de estacionária, deixando a questão em aberto.
Para além do efeito conjugado do etanol e da temperatura mais pronunciado em
fermentações conduzidas a 30ºC, existem outros factores que podem igualmente ter
actuado no aumento da sensibilidade de células de levedura que se encontraram à entrada
de fase estacionária, tais como: (1) baixa disponibilidade em O2 e consequente implicação
na biossíntese de ergosterol e (2) acção conjunta do etanol e ácidos fracos. A baixa
disponibilidade de O2 é particularmente relevante nas fermentações decorridas a 30ºC, uma
vez que a solubilidade do O2 é menor, quanto maior for a temperatura, razão pela qual a
condição de anaerobiose é atingida mais cedo nas fermentações a 30ºC. Uma vez atingida
esta condição, deixa de ocorrer a síntese de ergosterol, sendo comprometidas a biossíntese
de membranas e o processo de gemulação e as células iniciam o seu processo de entrada
em fase estacionária. Relativamente à acção conjunta do etanol e dos ácidos fracos, apesar
de não se ter efectuado a quantificação de ácido acético neste estudo, se tivermos em
consideração os resultados de Torija e colaboradores (2003b), onde foi referida uma maior
produção de ácido acético a temperaturas mais altas de fermentação, podemos pressupor
que a 30ºC o teor deste composto vai sendo superior ao longo das diferentes fases de
fermentação a esta temperatura, comparativamente a 15ºC, razão pela qual o efeito
sinérgico do etanol/ácido acético não poderá ser desprezado nas fermentações a 30ºC,
onde possivelmente poderá ocorrer a acumulação intracelular da forma dissociada do ácido,
perturbando o metabolismo e o crescimento das células em fase exponencial.
Neste trabalho foi utilizada uma metodologia de “reavivamento” das células (prévia à
inoculação) diferente da usual na indústria vínica, onde é feita comummente a rehidratação
das leveduras liofilizadas comerciais em água a ≈38ºC para se proceder posteriormente à
inoculação. O perfil de viabilidade (considerando apenas a leitura de UFC/mL) demonstrado
pelas células a 15ºC e a 30ºC permitiu destacar dois períodos críticos: o início e o final de
fermentação. No período inicial de fermentação constatou-se que houve um decréscimo da
população viável face à população inicialmente inoculada (i.e., 1x106 células/mL) para as
duas temperaturas de estudo. No entanto, esse decréscimo foi mais evidente a 30ºC, uma
vez que nas primeiras 2 horas de fermentação se observou uma redução de 1/10 da
população inicial. Se atendermos a que as células em plena fase exponencial, provenientes
de um pré-inóculo em mosto a 28ºC, foram inoculadas em 800 mL de mosto estéril a 30ºC,
RESULTADOS E DISCUSSÃO
75
temos pelo menos 3 factores que podem ter actuado de uma forma sinérgica na redução da
população viável inicial: (1) stresse provocado pela diluição efectuada à população
proveniente do pré-inóculo, (2) aumento, pequeno mas significativo, da temperatura de
crescimento, que possivelmente a aproximou da temperatura de morte térmica [van Uden,
1984] e (3) estado fisiológico das células no pré-inóculo, na medida em que as células em
fase exponencial, mais sensíveis ao stresse [Mager & Varela, 1993], encontravam-se na
presença de etanol quando foram colhidas. Como foi comprovado que qualquer aumento da
temperatura de crescimento, mesmo que seja de pequena amplitude, pode provocar um
distúrbio muito superior no crescimento das células, quando comparado com um
abaixamento da temperatura de crescimento [van Uden, 1984], este aspecto terá de ser tido
em consideração no procedimento de fermentação vinária em adega, uma vez que é
frequente nestes casos a subida de temperatura do mosto para valores acima dos 30ºC, o
que poderá conduzir a paragens prematuras de fermentação. Em condições de temperatura
controlada, como foi o caso dos ensaios apresentados, a temperatura não funcionou per si
na diminuição acentuada da população viável observada a 30ºC, uma vez que se observou
a manutenção da viabilidade celular durante todo o processo fermentativo. Outros factores,
tais como o efeito de diluição, a maior sensibilidade das células em fase exponencial de
crescimento, o baixo pH extracelular e a presença de SO2 e de resíduos de pesticidas
[Querol et al., 2003; Zuzuarregui & del Olmo, 2004], têm de ser igualmente tidos em
consideração, pois provavelmente actuaram, de uma forma sinérgica, na criação de um
ambiente inicial mais adverso para a população que provinha do pré-inoculo a 28ºC. No final
de fermentação, quer a 15ºC, quer a 30ºC, foi possível constatar que a população viável
acompanhou as leituras de D.O.640nm, indicando que as células se mantiveram viáveis até
esgotarem a glucose. As temperaturas 15ºC e 30ºC de crescimento não demonstraram ser
suficientemente nefastas para, em paralelo com outros os factores anteriormente
mencionados presentes no final de fermentação, serem capazes de criar um meio inóspito
para a manutenção da população viável até ao final de fermentação.
Ensaios realizados em paralelo, para os quais foi prolongado o período de recolha de
pontos para além do final de fermentação, possibilitaram a observação de diminuição da
viabilidade quer a 15ºC, quer a 30ºC [V. Salvador, comunicação pessoal]. O estudo de
Pizarro e colaboradores (2008) revelou que os factores maioritariamente afectados pelas
temperaturas sub-óptimas de crescimento são o processamento de RNA, o metabolismo da
trealose e a resposta ao stresse [Pizarro et al., 2008]. Por outro lado, a perda de viabilidade
a 30ºC poderá estar relacionada com as perturbações celulares provocadas pelo efeito
conjunto do etanol e da temperatura [van Uden, 1984; Casey et al., 1984]: (1) alteração da
estrutura da membrana plasmática [Walton & Pringle, 1980; Lucero et al., 2000] e
consequente aumento de fluidez da membrana [Ingram & Buttke, 1984], perda de
RESULTADOS E DISCUSSÃO
76
integridade membranar (que afecta uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão &
van Uden, 1984a,b]) e aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos
[Quintas et al., 2000], (2) diminuição da síntese proteica [Warner & Gorenstein, 1977;
Hinnebusch, 2005], (3) formação de uma fase interdigitada na camada lipídica, criando
zonas mais permeáveis a moléculas polares e a iões [Gurtovenko & Anwar, 2009], (4)
dissipação do gradiente de protões, repercutindo-se na inibição da actividade da H+-ATPase
membranar [Cartwright et al., 1987] e no estímulo de influxo passivo de H+ [Salgueiro et al.,
1988; van Uden, 1985] e (5) actuação sinérgica do etanol e do ácido acético [Pampulha &
Loureiro-Dias, 1989].
Como o intuito de avaliar a capacidade de homeostase protónica das células e inferir
sobre o seu estado fisiológico e a sua capacidade de sobrevivência nas diferentes situações
de stresse ao longo da fermentação, centrou-se o estudo nos seguintes aspectos: pH
intracelular, efluxo de H+ e permeabilidade passiva a H+.
Os resultados obtidos a partir dos ensaios preliminares de determinação do pHin de S.
cerevisiae ISA 1000 e de S. cerevisiae W-303, em meio mineral a 15ºC, com utilização de
[1-14C] ácido propiónico, permitiram colocar a hipótese de estar a ocorrer uma incorporação
da forma não dissociada do ácido fraco na membrana plasmática da célula a esta
temperatura de crescimento. Se atendermos a que, por um lado, os ácidos gordos
constituintes da membrana plasmática se tornam mais insaturados à medida que a
temperatura de crescimento diminui [Watson, 1987] e por outro, os ácidos gordos de cadeia
curta têm um efeito similar, em termos físicos, na membrana plasmática ao de uma dupla
ligação de um ácido gordo de cadeia longa [Quinn & Chapman, 1980], a hipótese colocada
de incorporação de ácido propiónico poderá fazer sentido numa perspectiva da célula
aumentar a fluidez da sua membrana plasmática, permitindo a manutenção da actividade
das proteínas constituintes da membrana, assim como os transportes membranares
associados. Verificou-se igualmente, a partir das determinações do pHin, a ocorrência de
acidificação intracelular ao longo das fermentações conduzidas a ambas as temperaturas,
estando de acordo com as observações de alguns autores, que constataram que o etanol
aumenta a permeabilidade da membrana plasmática ao influxo passivo de protões [Leão &
van Uden, 1984a; Salgueiro et al., 1988; van Uden, 1985] e pode inibir a actividade da H+-
ATPase membranar [Cartwright et al., 1987], resultando num aumento da concentração de
protões no citoplasma. No entanto, é importante ressalvar que, no caso específico das
determinações de pHin efectuadas neste trabalho, os ensaios foram realizados com células
recolhidas directamente do mosto e sujeitas a situações de stresse inerentes ao próprio
mosto. Como tal, o stresse provocado pelo etanol aplica-se, neste caso, à quantidade de
composto formado durante a fermentação. Foi curioso ter observado a 15ºC que as células
colhidas a meio da fase estacionária e no final de fermentação se mantiveram viáveis e
RESULTADOS E DISCUSSÃO
77
metabolicamente activas, apresentando valores de pHin muito baixos (pHin≈5,00). Até à data,
não se encontraram estudos que expliquem este comportamento das células observado no
final de fermentação, apenas se pode acrescentar que a manutenção da viabilidade não
está relacionada com a substituição de células mortas por novas células, uma vez que a
observação ao microscópio confirmou que as células não se encontram a gemular nesta
fase de fermentação.
Como o pHin está associado à concentração de H+ no citoplasma, era importante verificar
os fluxos membranares, avaliando o efluxo e o influxo de H+ nas diferentes fases de
fermentação a 15ºC e a 30ºC.
Os resultados referentes ao efluxo de H+ demonstraram que a 30ºC a expulsão de
protões foi superior à de 15ºC em todas as fases de fermentação, tanto em meio mineral,
como em mosto, estando de acordo com as observações de vários autores [Ahlers, 1981;
Viegas et al., 1995]. Este resultado poderá constituir uma explicação para o pHin obtido no
final de fermentação a 30ºC ter sido mais alto ao homólogo obtido a 15ºC, garantindo a 30ºC
uma menor acumulação de H+ no citoplasma. Constatou-se igualmente que baixas
concentrações de etanol tiveram efeito na redução do efluxo a 30ºC, o que possivelmente
poderá estar relacionado com a ocorrência de inibição, a 30ºC, da actividade da H+-ATPase
membranar promovida pelo etanol [Cartwright et al., 1987]. Por outro lado, foi possível
observar, tanto a 15ºC, como a 30ºC, que as velocidades máximas de efluxo protónico
foram atingidas em células colhidas durante a fase exponencial, que se encontram
metabolicamente mais activas.
Os resultados obtidos em meio mineral e em mosto, referentes à medição da
permeabilidade a H+ da membrana plasmática, revelaram a ocorrência de um maior influxo
de H+ a 30ºC, estando de acordo com os estudos de diversos autores, que explicaram a
ocorrência de maior permebilidade da membrana plasmática, com base no efeito sinérgico
do etanol e da temperatura [Ingram & Buttke, 1984; Quintas et al., 2000].
A constatação da ocorrência de velocidades muito baixas de influxo e de efluxo de H+, a
15ºC e a 30ºC, obtidas em células no final de fermentação, levou a colocar a hipótese de o
pH interno ser inferior ao pH externo de células lavadas e ressuspendidas em água
desmineralizada, no período que precede este tipo de ensaios. O possível distúrbio nas
componentes da força protomotriz que o pH interno estivesse a provocar, justificaria as
velocidades baixas de efluxo e de influxo obtidas. No entanto, os resultados obtidos nos
ensaios posteriores de determinação do influxo protónico, onde foram utilizadas duas
soluções tampão, a pH’s que garantissem a existência de ∆pH, permitiram concluir que as
baixas velocidades de influxo protónico obtidas em células nas fases finais de fermentação
corresponderam a uma permeabilidade extremamente baixa a H+.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
78
O presente trabalho cumpriu com os objectivos propostos permitindo, por um lado,
sustentar a hipótese defendida por vários autores de que existem diferenças significativas
nos resultados obtidos quando se utilizam (1) condições laboratoriais e condições de adega
e (2) estirpes laboratoriais e estirpes industriais. Por outro lado, este trabalho permitiu
constatar que as células nas fases finais de fermentação a 15ºC são fisiologicamente
diferentes das células presentes noutras fases, pois permanecem metabolicamente activas
e viáveis até à conclusão do processo fermentativo por esgotamento da glucose, apesar de
apresentarem baixo pHin, baixo efluxo de H+ e permeabilidade a H+ muito baixa.
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS
79
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS
Durante a fermentação vinária, as leveduras são submetidas a uma diversidade de
situações de stresse. O estado fisiológico das células sofre alterações significativas,
tornando as células em fase estacionária fisiologicamente muito diferentes das células nas
primeiras fases de fermentação.
Diversos autores têm referido que o etanol afecta aspectos chave da fisiologia de
leveduras comprometendo, em condições laboratoriais, os principais sistemas de transporte
membranar [van de Mortel et al., 1988], reduzindo a actividade metabólica [Martini et al.,
2004] e induzindo mecanismos apoptóticos e de morte celular [Kitagakia et al., 2007].
Apesar do mecanismo de toxicidade do etanol ser complexo, tudo indica que o principal alvo
deste tipo de stresse seja a membrana plasmática [D’Amore et al., 1990]. Como
consequência desta situação tem-se um aumento da fluidez da membrana e um decréscimo
na integridade da sua estrutura [Gurtovenko & Anwar, 2009], acompanhado de um aumento
da permeabilidade [Leão & van Uden, 1984a] e dos processos de difusão não-mediada
[Henriques et al., 1997].
Recentemente têm sido feitos esforços no sentido de identificar genes específicos
responsáveis pela tolerância ao etanol e a outros factores de stresse existentes nas
fermentações vinárias [Dinh et al., 2009; Zhao & Bai, 2009]. Alguns autores têm referido que
a expressão mais elevada ou mais reduzida de diversos genes pode possivelmente estar
relacionada com: (1) diversas vias regulatórias (e.g. HOG e TOR) [Hayashi & Maeda, 2006;
Rossignol et al., 2003], (2) função e transporte vacuolar [Teixeira et al., 2009], (3)
biossíntese da membrana plasmática e da parede celular [Lei et al., 2007] e (4) homeostase
iónica [Alexandre et al., 2001]. Apesar do carácter extensivo das análises genómicas, os
seus resultados normalmente põem em evidência a complexidade da resposta celular ao
stresse [Marks et al., 2008; Garay-Arroyo et al., 2004], originando novas linhas de
investigação para estudos mais aprofundados do seu significado fisiológico.
Embora tenham sido realizados alguns estudos relacionando o etanol e outros factores
de stresse, onde foi destacada a importância do estado fisiológico da célula [Loureiro & van
Uden, 1986], a maioria dos estudos têm sido realizados com utilização de células em fase
exponencial de crescimento, não existindo até à data estudos suficientes dedicados às
células em fase estacionária [Yoshikawa et al., 2009].
Nesse sentido, este trabalho realizado no âmbito da dissertação de Mestrado permitiu
constatar que as células de S. cerevisiae que se encontravam nas fases finais de
fermentação exibiram um comportamento fisiológico peculiar, pois não só foram capazes de
manter a sua actividade metabólica, como apresentaram igualmente capacidade de
sobreviver face às condições de stresse existentes e características dessas fases.
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS
80
No entanto, certamente que muitas questões ficaram por esclarecer. Numa primeira
análise, ficou por se determinar e identificar os lípidos de membrana, com o objectivo de
testar a validade da hipótese de incorporação de [1-14C] ácido propiónico em membranas,
bem como, noutra perspectiva, os níveis de oxigénio e azoto e controlar a produção de
metabolitos secundários nos diferentes pontos de amostragem ao longo da fermentação. A
médio/longo prazo seria particularmente importante “descodificar” os mecanismos
responsáveis pela sobrevivência e manutenção da capacidade fermentativa de células nas
fases finais de fermentação e atribuir-se uma função às vias regulatórias responsáveis pela
aquisição deste carácter resistente das células. Como forma de atingir este objectivo,
poderia começar por se fazer uma selecção de estirpes com mutações em determinados
genes que estivessem envolvidos em diversas vias celulares (e.g. vias HOG e TOR,
biossíntese de membrana e de parede celular, homeostase protónica), avaliando a
capacidade das estirpes conduzirem a fermentação e permanecerem viáveis até ao final de
fermentação de mosto sintético a 25ºC. Com estas estirpes seleccionadas, sob condições
que simulassem tanto quanto possível as fermentações vinárias, proceder-se-ia a uma
caracterização fisiológica e bioenergética, avaliando a tolerância ao etanol, o desempenho
fermentativo (sob diferentes concentrações de etanol, de H+ e de ácido acético), o teor em
ATP, trealose e glicogénio, o pH intracelular, a capacidade tampão do meio intracelular e o
pKa intracelular de populações de células e de células individualizadas, o efluxo e o influxo
de protões, a viabilidade (incluindo medições dos indicadores de apoptose e de necrose) e a
actividade metabólica. Posteriormente, poder-se-ia construir e caracterizar um número
reduzido de estirpes que seriam seleccionadas para sobre-expressar genes específicos. As
que apresentassem o melhor desempenho fermentativo iriam, por fim, ser testadas em
mosto de uva, simulando as condições reais de adega.
O conhecimento dos mecanismos moleculares de sobrevivência responsáveis pela
homeostase protónica, durante as fases finais de fermentação, contribuiria para o
desenvolvimento de estirpes vínicas mais robustas que tornariam o processo fermentativo
mais eficiente, diminuindo o tempo de fermentação e a ocorrência de fermentações
amuadas, melhorando consequentemente a qualidade do vinho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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98
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ANEXOS
99
ANEXO I
.
Tabela 10: Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para vinificação
FERMIVIN®
Aplicação FERMIVIN® é uma preparação comercial de levedura que se
responsabiliza pelo processo de fermentação de qualquer tipo de vinho.
Qualidades do
starter para
vinificação
Cinéticas de
fermentação Curta fase de latência e crescimento rápido.
Rendimento
açúcar/álcool 16,5 g de açúcar para 1% álcool.
Características
técnicas
Temperaturas óptimas: 15 – 35ºC
Tolerância ao álcool: 14% em condições standard e
16% na presença de nutrientes (incluindo azoto).
Resistência ao SO2 livre: 50 mg/L.
Baixa produção de espuma.
Características
metabólicas
Média de produção de glicerol: 6 – 8 g/L.
Baixa produção de acidez volátil (< 0,15 g/L).
Baixa produção de acetaldeído (< 20 mg/L).
Baixa produção de H2S.
Baixa produção de SO2 (< 10 mg/L).
Outras
características
Baixa produção de álcoois superiores.
Degrada parcialmente o ácido málico (20 a 30%),
estimulando o arranque da “fermentação”
maloláctica.
Boa capacidade de fermentar mosto clarificado.
Fenótipo: neutro ao factor killer.
ANEXOS
100
ANEXO II
Tabela 11: Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) (informação recolhida a partir de uma página web do Instituto da Vinha e do Vinho - http://www.ivv.min-agricultura.pt/np4/89, 07/10/09)
Bebida alcoólica Título alcoométrico %(v/v)
Referências
Vinhos adquirido vinhos de mesa > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº13
vinhos espumantes > 9,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-H-nº11 c)
v.e.q. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-I-nº3 d)
v.e.q.p.r.d. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº10 d)
v.e.q.p.r.d. > 10 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº4
vinhos licorosos > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº14-A
v.l.q.p.r.d. > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 b)
vinhos frisantes > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº17
vinho frisante gaseificado > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº18
vinhos aguardentados > 18 e < 24 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº23
vinhos de uvas sobreamadurecidas > 12 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24
total
vinho de mesa < 15 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº13
v.q.p.r.d., v.e.q.p.r.d. > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-F-nº5
v.l.q.p.r.d. > 17,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 c)
vinho frisante > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº17
vinho frisante gaseificado > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº18
vinho de uvas sobreamadurecidas > 16 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24
Bebidas espirituosas
aguardente vínica > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1
aguardente bagaceira > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1
brandy > 36,0 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1
ANEXOS
101
ANEXO III
Para a preparação do meio K, descrito por van Uden (1967), utilizaram-se as seguintes
soluções:
(a) Meio base:
(NH4)2SO4 0,50% (p/v)
KH2PO4 0,50% (p/v)
MgSO4.7H2O 0,05% (p/v)
CaCl2.2H2O 0,015% (p/v)
em 900 mL de água desmineralizada
Acertou-se o pH do meio a 4,5, utilizando pastilhas de NaOH. Esterilizou-se por
autoclavagem (121ºC, 20 minutos, 1 atm).
(b) Solução de oligoelementos A (Cfinal 0,5 g/L):
H3BO3 0,18% (p/v)
KI 0,02% (p/v)
NaMoO4.2H2O 0,04% (p/v)
(c) Solução de oligoelementos B (Cfinal 0,5 g/L), pH 3,5:
CuSO4.5H2O 0,08% (p/v)
FeCl3.6H2O 0,04% (p/v)
MnSO4.H2O 0,08% (p/v)
ZnSO4.7H2O 0,08% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
(d) Solução de vitaminas (Cfinal 0,5 g/L):
Biotina 0,001% (p/v)
Pantotenato de cálcio 0,08% (p/v)
Mio-inositol 4,00% (p/v)
Niacina 0,16% (p/v)
Piridoxina (HCl) 0,16% (p/v)
Tiamina (HCl) 0,16% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
ANEXOS
102
(e) Fonte de carbono e energia (Cfinal 20 g/L):
D(+)-Glucose 20% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
A solução de glucose foi preparada numa concentração 10 vezes superior à
concentração final pretendida no meio de cultura (2%).
As soluções referidas (solução de glucose, soluções de oligoelementos A e B, solução de
vitaminas) foram esterilizadas por filtração a vácuo com membranas Millipore TYPE GSWP
de porosidade 0,22 µm.
As várias soluções foram misturadas assepticamente para a obtenção do meio completo,
constituído por 2% (p/v) glucose, 0,05% (v/v) de oligoelementos A e B e 0,05% (v/v) de
vitaminas.
Para a preparação do meio necessário ao crescimento da estirpe auxotrófica
Saccharomyces cerevisiae W-303 foi utilizado meio K indicado anteriormente, suplementado
com os seguintes compostos (de acordo com as marcas auxotróficas da estirpe):
Histidina 0,08 g/L
Adenina 0,08 g/L
Uracilo 0,08 g/L
Leucina 0,16 g/L
Triptofano 0,32 g/L
Os produtos químicos utilizados pertencem às marcas BDH®, Merck® e Sigma®.
ANEXOS
103
ANEXO IV
Parâmetros físico-químicos do mosto
Tabela 12: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC.
Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)
Início de fermentação (T0) 3,04 1,074 96,50 0,20
Início de exponencial (T1) 2,88 1,061 89,54 1,51
Meio de exponencial (T2) 2,87 1,037 81,72 10,02
Final de exponencial (T3) 2,80 1,033 73,46 16,01
Início de estacionária (T4) 2,87 1,036 51,73 35,70
Meio de estacionária (T5) 2,97 0,996 2,87 51,25
Final de fermentação (T6) 2,93 0,980 0,03 74,29
Tabela 13: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC.
Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)
Início de fermentação (T0) 2,91 1,056 96,50 0,20
Meio de exponencial (T1) 2,87 1,060 83,89 1,84
Final de exponencial (T2) 2,79 1,054 80,41 6,45
Início de estacionária (T3) 2,70 1,018 40,42 39,16
Meio de estacionária (T4) 2,75 - 4,26 43,19
Final de fermentação (T5) 2,74 0,995 0,05 56,44
ANEXOS
104
Fase de
crescimento
Tempo
(h)
D.O.
640nm
UFC/ mL
(x106)
Peso Seco
(mg/mL)
Iníc. ferm. 0,0 0,066 0,70 0,25
2,0 0,057 0,69 -
7,0 0,069 - -
10,0 0,086 0,48 0,35
13,0 0,098 0,40 0,25
17,0 0,103 - -
21,3 0,265 - 0,26
Iníc. exp. 24,0 0,366 2,97 -
25,0 0,346 2,17 -
27,0 0,470 8,78 -
30,0 0,875 8,53 0,52
33,3 1,255 2,80 -
36,0 1,505 3,03 0,85
37,3 1,330 2,30 0,61
Meio expo. 41,0 2,360 6,27 -
45,3 3,340 2,94 1,26
48,3 4,960 6,60 2,00
49,0 5,300 - -
51,0 5,940 11,00 -
54,3 6,040 44,80 2,53
59,0 8,600 42,00 2,98
61,0 - 32,60 -
Final exp. 65,0 8,100 45,75 -
69,0 12,000 65,00 3,18
72,0 11,000 99,38 3,18
73,0 9,400 67,47 -
75,0 13,000 126,83 -
78,2 13,900 - 4,55
81,3 12,400 138,33 -
84,0 17,800 143,83 5,08
Iníc. est. 87,0 16,300 94,40 4,95
93,0 14,700 366,05 -
97,0 15,400 - 5,45
98,0 17,700 108,33 6,03
104,0 16,900 152,25 -
(…)
Fase de
crescimento
Tempo
(h)
D.O.
640nm
UFC/ mL
(x106)
Peso Seco
(mg/mL)
(…)
108,0 18,200 161,45 6,53
111,0 15,500 108,15 5,20
119,4 15,900 113,00 5,33
122,0 19,200 124,40 5,83
130,4 19,400 149,33 5,90
134,8 21,300 117,92 5,95
143,8 21,500 126,13 5,58
145,8 - - 6,40
154,8 20,200 128,50 5,65
165,0 - 151,38 -
176,0 20,000 144,00 5,60
184,0 18,400 112,50 4,93
191,0 18,800 104,53 5,50
195,0 18,000 145,20 5,13
Meio est. 202,0 20,100 117,67 5,50
208,8 16,900 - 5,70
215,1 15,800 107,70 5,90
219,8 17,500 109,05 5,80
226,1 17,300 125,92 6,40
232,4 17,200 103,92 6,60
239,1 18,300 129,13 5,85
243,4 18,200 117,45 6,50
250,1 - - 6,05
256,3 16,900 112,78 6,40
263,0 17,100 118,45 -
267,3 18,000 107,00 5,80
274,0 17,600 119,00 5,85
280,0 16,700 - 6,20
287,3 18,100 106,93 5,50
291,0 17,400 102,60 6,00
299,0 16,900 - 5,50
Final ferm. 304,0 17,300 146,50 6,00
311,0 24,300 100,10 5,60
315,0 17,400 129,07 5,90
322,0 17,300 124,33 5,05
ANEXO V
Tabela 14: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 15ºC.
ANEXOS
105
Fase de
crescimento
Tempo
(h)
D.O.
640nm
UFC/ mL
(x106)
Peso Seco
(mg/mL)
(…)
23,0 9,400 103,57 -
Iníc. est. 24,0 11,100 95,07 4,38
26,0 11,000 75,55 -
28,0 11,500 107,68 4,35
31,0 12,900 93,70 -
33,0 12,800 107,33 5,43
35,0 11,900 106,60 5,28
38,2 15,700 126,48 4,50
41,0 14,400 124,18 -
42,0 15,600 - -
44,0 15,200 107,70 -
Meio est. 48,0 15,200 99,27 4,80
49,2 17,200 126,62 5,63
52,0 15,600 97,28 -
56,0 16,000 129,53 -
59,0 15,100 100,27 5,55
62,0 15,000 93,42 5,45
65,0 16,100 81,73 -
68,0 16,400 96,22 -
Final ferm. 71,0 17,700 116,67 5,60
73,0 14,700 85,20 5,50
79,0 15,200 67,00 -
88,4 17,000 72,07 5,08
99,4 15,400 87,80 4,88
Fase de
crescimento
Tempo
(h)
D.O.
640nm
UFC/ mL
(x106)
Peso Seco
(mg/mL)
Iníc. ferm. 0,0 0,044 1,02 0,18
1,0 - 1,49 -
2,0 0,059 0,23 0,22
2,1 0,085 0,12 -
3,0 0,123 0,38 0,22
4,0 0,181 1,89 -
Meio expo. 5,3 0,307 2,29 0,39
6,0 0,660 2,07 -
7,0 1,110 6,50 0,77
8,0 1,670 9,73 -
Final exp. 9,1 2,510 14,53 1,47
10,0 - 17,30 -
11,0 - 16,40 2,06
12,0 - 25,00 -
13,0 4,550 23,26 1,95
14,0 4,030 - -
15,0 5,600 - 1,92
16,1 5,600 38,04 -
17,0 6,500 39,90 2,65
18,0 7,300 60,88 -
20,0 8,000 65,33 3,53
21,0 8,300 82,47 -
22,0 9,100 87,45 3,48
(…)
Tabela 15: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 30ºC.
ANEXOS
106
pH
ex
pH
inp
He
xp
Hin
pH
ex
pH
inp
He
xp
Hin
pH
ex
pH
inp
He
xp
Hin
pH
ex
pH
inp
He
xp
Hin
90
--
3,0
96,
42
2,9
36
,34
2,8
66
,24
2,8
35
,87
2,8
16
,10
2,8
85
,17
2,9
05,
06
10
03
,20
7,0
4-
--
--
--
--
--
--
-
12
0-
-3
,06
6,4
92
,90
6,4
12
,85
6,3
22
,80
5,9
92
,81
6,2
12
,89
5,1
32
,90
5,2
3
15
03
,16
7,1
93
,04
6,4
82
,87
6,4
42
,86
6,3
02
,80
6,0
92
,80
6,0
92
,89
5,1
62
,91
5,0
2
18
0-
-3
,02
6,4
92
,89
6,2
92
,83
6,2
42
,79
6,0
62
,80
6,0
52
,89
5,2
32
,90
5,2
3
20
03
,11
7,2
8-
--
--
--
--
--
--
-
21
0-
-3
,01
6,4
12
,89
6,1
92
,83
6,1
92
,80
6,2
72
,80
5,9
72
,88
5,1
82
,91
5,2
5
25
03
,07
7,3
2-
--
--
--
--
--
--
-
30
03
,04
7,3
5-
--
--
--
--
--
--
-
35
02
,98
7,3
8-
--
--
--
--
--
--
-
Fin
al
exp
on
enci
alm
ost
o
[7-14
C]
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ANEXO VI
Tab
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16:
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ANEXOS
107
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--
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3,2
56
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90-
--
-
180
3,2
37
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--
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--
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4 C]
ác.
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Outros dados:
Constante de dissociação (kd) do ácido propiónico = 1,35 x10-5 mol
Constante de dissociação (kd) do ácido benzóico = 6,4 x10-5 mol
Volume intracelular de S. cerevisiae = 1,9 µL / mg (p.s.)
pH
exp
Hin
pH
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pH
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--
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me
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C] á
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C] á
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17:
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18:
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ANEXOS
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--
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ANEXO VII
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109
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K (
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30º
C.
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0,04
0,68
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48
18
--
--
--
--
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20
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--
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--
--
--
200,
230,
270,
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ANEXO VIII
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--
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--
1,2
90
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no
l]
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l
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Tri
s 1
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ato
pH
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gu
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22:
Vel
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A 1
000,
cul
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pena
s) e
em
mos
to (
para
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rent
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a 3
0ºC
.
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