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High Performance Liquid High Performance Liquid ChromatographyChromatography
CLAECromatografia a Lquida de Alta
Eficincia
HPLCHPLC
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ContedoContedo
Parte I: FUNDAMENTOS DE HPLC
1. Introduo2. Histrico3. reas de aplicao / vantagens4. Modos de separao / tipos de HPLC5. Caractersticas cromatograma /
eficincia coluna
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Contedo Contedo (cont.)(cont.)
Parte II: INSTRUMENTAO / FUNCIONAMENTO HPLC
1. Colunas2. Bombas / fase mvel3. Injeo da amostra4. Detectores5. Tratamento dados6. Dicas de manuteno
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Contedo Contedo (cont.)(cont.)
Parte III: APLICAES
1. Desenvolvimento de metodologias2. Validao de metodologias2. Aplicaes
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Parte I
FUNDAMENTOS
HPLC
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IntroduoIntroduo
CROMATOGRAFIA = mtodo fsico de separao no qual os constituintes de uma amostra a serem separados so distribudos entre 2 fases:
estacionriaestacionria: geralmente de grande rea, slida ou lquida
mvel: um fluido insolvel que percola atravs da primeira
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FASE MVEL
injeo separao eluio
Fase estacionria
DETECTOR
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FASE MVEL:
Lquido HPLC
Gs GC
Gs em condies supercrticas SFC (Cromatografia a fluido supercrtico)
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FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.
LCCromatografia a
Lquido
SFCCromatografia a
Fluido Supercrtico
GCCromatografia a
Gs
LCPlanar
LCColuna
CromatografiaPapel
CCDCromatografia
Camada Delgada
ColunaEmpacotada
Coluna "Open Tubular" Capilar
dc < 350 um
Coluna Capilarempacotadadc = 8 mm
CROMATOGRAFIA
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HistricoHistrico
1903 - TSWETT, botnico russo: separao e isolamento de pigmentos de plantas em colunas de slica gel (cromatografia = color writing)
1931 - LEDERER & KUHN: trabalhos utilizando cromatografia na separao de carotenides
1938 - ISMAILOV & SHRAIBER: CCD 1941 - MARTIN & SYNGE: cromatografia partio 1944 - CONSDEN, GORDON & MARTIN: cromatografia papel 1949 - SPEEDING & TOMPKINS: cromatografia troca inica 1952 - MARTIN & JAMES: GC 1957 - GOLAY: colunas capilares para GC 1959 - PORATH & FLODIN: cromatografia excluso tamanho 1965-1969 - HALASZ; HORVATH; KIRKLAND; PRETORIUS;
SCOTT; SNYDER; etc: HPLC moderna*
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Cromatografia Lquida Cromatografia Lquida ClssicaClssica
Fluxo por gravidade
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HPLC Moderna*HPLC Moderna*
Partculas da fase estacionria extremamente pequenas (dimetro < 10 m) bombas para operaes a altas presses (at 500 atm) e baixas vazes (0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure LC
Solventes especiais e ultra-puros
Detectores seletivos e super-sensveis, com tamanho de clula de deteco < 10 L
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DetectorSistema de Tratamentode Dados
Bomba HPLC
Injetor
Precoluna
Coluna Analitica
Filtro em linha Scavenger
Reservatrios para os solventes
HPLC Moderna*HPLC Moderna*
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reas aplicao / vantagensreas aplicao / vantagens
HPLC x GCHPLC x GC
AnalitosTcnicaPr-requisito Interao
GC Volteis e termicamente
estveis (nas consies de
operao)
Fase estacionria
HPLC Solveis na fase mvel Fase estacionria e
fase mvel
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Substncias no analisveis por GC:
compostos inicos sais inorgnicos e orgnicos aminocidos puros compostos polares de alto PM polmeros compostos termicamente instveis corantes salinos
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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCSubstncias qumicasSubstncias qumicas
Protenas cidos nucleicos Aminocidos Corantes Polissacardeos Pigmentos plantas Metablitos plantas Produtos
farmacuticos
Compostos inicos ons metlicos Ctions e nions Lipdeos polares Complexos metais
pesados Explosivos Polmeros
sintticos
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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCreasreas
PESQUISA QUMICA/BIOQUMICA (Universidade e Indstria) Anlise de misturas complexas Purificao de compostos qumicos Desenvolvimento de processos de sntese de compostos
qumicos Isolamento de produtos naturais com caractersticas biolgicas
benficas
CONTROLE QUALIDADE Garantia pureza de materiais brutos Teste in process para controle e otimizao de processos de
produo Ensaios quantitativos de produtos finais (garantia
especificaes) Avaliao estabilidade de produto e monitorizao degradao
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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCreas reas
CONTROLE AMBIENTAL Anlise de poluentes do ar e gua
Monitorizao materiais perigosos - Sade ocupacional
Monitorizao nveis agrotxicos no ambiente
AGNCIAS REGULAMENTAO (Federais e
Estaduais)
Vigilncia de medicamentos / alimentos
Identificao narcticos confiscados
Conformidade - reclamaes etiquetas
FONTE: BIDLINGMEYER, 1993.
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Vantagens da HPLCVantagens da HPLC
Sensvel a diversas amostras, incluindo orgnicas, biomolculas e ons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC
Alta resoluo
resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas
Deteco de alta sensibilidade
detecta nos limites de pg - ng
Anlises rpidas e precisas
anlises de 1 - 60 min
Anlises automatizadas
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Modos de SeparaoModos de Separao
Cromatografia de adsoro (slido-
lquido)
Cromatografia de partio (lquido-
lquido)
Cromatografia de troca inica
Cromatografia por excluso de tamanho
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Cromatografia de adsoro (slido- Cromatografia de adsoro (slido- lquido)lquido)
ADSORO = tendncia de acmulo de uma substncia sobre a superfcie de outra, quando 2 fases imiscveis so colocadas em contato
FASE MVEL
FASE ESTACIONRIA (slida)
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AdsoroAdsoro
QUMICA = formao de ligaes qumicas
FSICA = envolve interaes como pontes de hidrognio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, etc
* temperatura : adsoro fsica adsoro qumica
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Slida Apresenta na superfcie cargas inicas
ou polares.
Exemplos: Slica gel Alumina Florisil Carvo Carbonato de clcio
Fase EstacionriaFase Estacionria
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Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofrmio Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol gua
Fase MvelFase Mvel
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Cromatografia de partio Cromatografia de partio (lquido- lquido)(lquido- lquido)
PARTIO = distribuio de uma substncia entre 2 fases heterogneas fluidas, imiscveis entre si. Por exemplo: um gs e um lquido, ou 2 lquidos imiscveis
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FASE ESTACIONRIA
Fina camada de lquido que cobre as partculas de um suporte slido
Este lquido pode ser:
polar: polietilenoglicol, ODPN (, -oxidipropionitrila)
apolar: hexano
FASE MVEL
Sempre de polaridade contrria
Baixa estabilidade
Cromatografia de partio Cromatografia de partio clssicaclssica
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FASE ESTACIONRIA Lquido quimicamente ligado ao suporte
slido.
FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade
Cromatografia de partio com Cromatografia de partio com fases quimicamente ligadasfases quimicamente ligadas
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Hidrocarbonetos aromticos, leos, esterides, plsticos, polmeros, alcalides (C18)
cidos urinrios, cidos carboxlicos, sulfonamidas, hormnios tireide, azocorantes (C8)
AplicaesAplicaes
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Classificao baseada na Natureza da Fase Mvel
NPC
Fase mvel Apolar hexano, isooctano
Fase estacionria Polar slica, alumina
RPC
Fase mvel Polar metanol, gua
Fase estacionria Apolar C8, C18
Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)
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GERALMENTE:
NPC Cromatografia Adsoro
RPC Cromatografia Partio
Portanto..........
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Cromatografia de troca inicaCromatografia de troca inica
FASE ESTACIONRIA = grupos inicos quimicamente ligados a um suporte (slica ou polmeros de alto PM).
FASE MVEL = solues tampes (controle pH). Por exemplo: cido ctrico, fosfato amnia, acetato sdio, borato sdio.
APLICAES = compostos inicos, aminocidos, protenas/peptdeos, etc
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Cromatografia por excluso de Cromatografia por excluso de tamanhotamanho
A separao baseada no tamanho da molcula e no em fenmenos de interaes fsicas ou qumicas
FASE ESTACIONRIA = partculas com dimetro mdio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas molculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros mdios, ou seja, so permeadas seletivamente. As molculas grandes so excludas excluso tamanho.
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Cromatografia por excluso de Cromatografia por excluso de tamanhotamanho
FLUXO
Poro
Gel
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Controle qualidade de polmeros de alto
PM (assegurar propriedades fsicas)
Separao polmeros de baixo PM
(poliestireno, ftalatos)
AplicaesAplicaes
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Escolha do sistema Escolha do sistema cromatogrficocromatogrfico
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Amostra
PM < 1.000
PM > 1.000
Insolvel gua
Solvel gua
InicaNo-inicaSolvel metanol
Solvel hexano
Amostra aquosa
Amostra no-aquosa
Cromatografiatroca inica
RPC"ion-pair"RPC
NPC(fase ligada)
NPC(slica)
Polmeros insolveis gua
Biopolmeros solveis gua
Condies no-desnaturantes
Condies desnaturantes
(separao analtica)
RPC
PreparativaPreparativaInformao tamanho
Cromatografiatroca inica
Cromatografiafiltrao gel
Cromatografiapermeao gel
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Caractersticas cromatograma / Caractersticas cromatograma / eficincia colunaeficincia coluna
Tempo de reteno (tr)
Largura do pico (wb)
Fator de Capacidade (k)
Seletividade ()
Resoluo (Rs)
Rendimento da coluna / nmero de pratos tericos
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Parte II
INSTRUMENTAO /
FUNCIONAMENTO HPLC
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DetectorSistema de Tratamentode Dados
Bomba HPLC
Injetor
Precoluna
Coluna Analitica
Filtro em linha Scavenger
Reservatrios para os solventes
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1. Colunas1. Colunas
Sistema separao (adsoro, partio, etc)
Comprimento (10-25 cm)
cromatografia rpida 3 cm
Dimetro interno*
Tipo de suporte (slica gel ou polmeros)
Grupos quimicamente ligados (amino, ciano,
C8, C18, sulfonato)
Tamanho da partcula (3-20 m)
Tamanho do poro (60-300 )
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2. Bombas / Fase Mvel2. Bombas / Fase Mvel
Velocidade fluxo
0,1-3,0 mL/mim para colunas analticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativas
Presso operao
500-2000 psi para colunas analticas
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Eluio Isocrtica / Eluio Isocrtica / GradienteGradiente
ISOCRTICA = a composio da fase
mvel no muda durante a corrida.
GRADIENTE = a composio da fase
mvel varia de acordo com a polaridade
dos analitos. Bomba binria/quaternria.
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Eluio Eluio GradienteGradiente
Passo Solvente A Solvente B Tempo
1 30 % 70 % 3 min
2 50 % 50% 2 min
3 50 % 50 % 3 min
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Injeo da AmostraInjeo da Amostra
INJETOR MANUAL
Amostra da seringa
Da bomba
Para coluna
Descarte
Loop Loop
Da bomba
Para coluna
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Injeo da AmostraInjeo da Amostra
AUTOSAMPLER
SolventeCorpodaSeringa
Amostragemda Seringa
Vlvula deinjeo
Frasco de lavagem
Vials na bandeja
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DetectoresDetectores
Equipamento com uma pequena clula de fluxo conectado na sada da coluna e que monitora a concentrao dos analitos.
Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvncia) Fluorescncia ndice de Refrao Outros: Eletroqumico, Condutividade,
Infravermelho, etc.
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Detectores UV/Vis e Rede de Diodos Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD)(DAD)
PRINCPIO: quando vrios grupos funcionais so expostos radiao, sofrem excitao eletrnica a qual resulta na absoro de energia em comprimentos de onda especficos para os grupos.
Comprimento onda: 210-380 nm UV
Comprimento onda: 380-800 nm Visvel
90% compostos orgnicos absorvem luz em algum lugar da regio UV-Vis
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DetectoresDetectores
SENSIBILIDADE Fluorescncia: 1.000 vezes mais sensvel
que UV-Vis
UV-Vis: 1.000 vezes mais sensvel que IR
ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade
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Tratamento dos DadosTratamento dos Dados
Integradores
Software / Computador
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Analgsicos Comprimidos
Coluna: Pecosphere 3x3 C18(3-m, 33 x 4.6 mm i.d.)
Fase Mvel: 15% ACN em HAc a 0.1%
Fluxo: 2 mL/min
Deteco: UV a 240 nm
Identificao Picos
1.Acetaminofeno2. Cafena3. Salicilamida4. cido Acetilsaliclico
1
LC Application Note LCPH-1.
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Teofilina
Coluna: Pecosphere 3x3 C18(3-m, 33 x 4.6 mm i.d.)
Fase Mvel: 11% ACN em gua
Fluxo: 3 mL/min
Deteco: UV a 273 nm
Identificao Picos:
1. Teobromina2. Teofilina3. -OH-etilteofillina4. Cafena
LC Application Note LCCL-7.
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Prednisona Comprimidos
Coluna: Pecosphere 3 C18(3-m, 83 x 4.6 mm
i.d.)
Fase Mvel: 50% metanol em gua
Fluxo: 2.0 mL/min
Deteco: UV a 254 nm
Identificao Picos
1. Acetanilida2. Prednisona
Application Note LCPH-14.
2.5 mgDeltasone Tablet
Standards
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