UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
Departamento de Farmácia - Escola de Farmácia
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos
Sub-área: Estudo e Desenvolvimento de Medicamentos
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES
CONTENDO CRISTAIS LÍQUIDOS UTILIZANDO ÓLEO
DE AÇAÍ (Euterpe oleracea) E RESVERATROL PARA
USO TÓPICO COMO RADIOPROTETOR
Vanessa Teixeira Jerônimo
Ouro Preto
Setembro/2013
VANESSA TEIXEIRA JERÔNIMO
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES
CONTENDO CRISTAIS LÍQUIDOS UTILIZANDO ÓLEO
DE AÇAÍ (Euterpe oleracea) E RESVERATROL PARA
USO TÓPICO COMO RADIOPROTETOR
Ouro Preto
Setembro/2013
Dissertação de mestrado apresentado
ao programa de pós-graduação em
Ciências Farmacêutica da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte das
exigências do programa.
Orientação: Prof. Dr. Orlando David
Henrique dos Santos
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha família pelo apoio, pelo amor e por sempre acreditar
em mim. Por me fornecer a base e os princípios necessários para essa
conquista.
Ao professor Orlando pela oportunidade.
Aos irmãos: Simone, Ricardo e Karen por todo crescimento que tivemos
juntos. E pela cumplicidade, conversas e risadas dentro e fora dos laboratórios.
Aos companheiros do Cipharma: Carol, Thaís, Shiara, Zabelê, Levi,
Renata, Patrícia, Lorena, Polly, Ana Paula, Fred, Giani e Liliam por todas as
experiências compartilhadas.
Agradeço a República Sedução, minha eterna casa, minha segunda
família.
À República MóiCana e a todos os móicanos que tive o prazer e a sorte
de conviver por tornarem meus dias em Ouro Preto muito mais felizes.
Aos amigos que conheci nessa etapa: Eveline, Júnia, André, Jamille,
Rockita.
Ao Leo, a Patrícia e a Mirela por todo auxílio e esclarecimento que
prestaram.
Aos professores Bibo, Gustavo, Luís Fernando por todos os ensinamentos
compartilhados.
À gloriosa Escola de Farmácia de Ouro Preto, por me permitir fazer parte
de sua longa, gloriosa e imortal história.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 17
2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 20
2.1. PATOGENIA E INCIDÊNCIA DO CÂNCER ............................................. 20
2.2 . RADIOTERAPIA ....................................................................................... 21
2.3 . RADIODERMATITES ............................................................................... 26
2.4 . RADIOPROTETORES ............................................................................. 33
2.5 . EMULSÕES E CRISTAIS LÍQUIDOS ..................................................... 37
2.6 . ÓLEO DE AÇAÍ ........................................................................................ 41
2.7 . RESVERATROL ....................................................................................... 45
3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 49
3.1 -OBJETIVOS GERAIS ............................................................................... 49
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 49
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 51
4.1. MATERIAL ................................................................................................. 51
4.2 MÉTODOS ................................................................................................. 51
4.2.1 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO DE AÇAÍ IN
VITRO ............................................................................................................ 51
4.2.2 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES .............................................. 53
4.2.3- DIAGRAMA DE FASES ...................................................................... 53
4.2.4 - DETERMINAÇÃO DO TIPO DE EMULSÃO ..................................... 56
4.2.5- AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE ...................................................... 57
4.2.6 - DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO REOLÓGICO ............ 58
4.2.7- TESTE DE LIBERAÇÃO ..................................................................... 59
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 62
5.1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO DE AÇAÍ IN
VITRO ............................................................................................................... 62
5.2- DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO ............................................. 65
5.3 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE ........................................................... 72
5.3.1 - AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA ....................................................... 72
5.3.2 - ANÁLISE MICROSCÓPICA .............................................................. 74
5.3.3 - TESTE DE CENTRIFUGAÇÃO ......................................................... 76
5.3.4- TESTE DE ESTRESSE TÉRMICO .................................................... 77
5.3.5 - ANÁLISE DO COMPORTAMENTO REOLÓGICO .......................... 78
5.4 - AVALIAÇÃO DO PERFIL DE LIBERAÇÃO DA FORMULAÇÃO ........... 82
6 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 86
7 - REFERÊNCIAS ............................................................................................... 88
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo celular. 24
Figura 2: Principais sinais e sintomas da radiodermatite: (a)
eritema, (b) hiperpigmentação, (c) descamação, (d) ulceração, (e)
necrose, (f) atrofia epitelial, (g) telangiectasia, (f) fibrose.
31
Figura 3: Classe de radioprotetores segundo tempo de utilização
em relação à exposição à radiação.
36
Figura 4: Representação dos glóbulos de emulsões do tipo A/O e
O/A.
38
Figura 5: Representação da ordenação tridimensional das fases
cristalinas, líquido-cristalinas e líquida isotrópicas.
40
Figura 6: Açaizeiro (Euterpe oleracea).
42
Figura 7: Estrutura química do trans-resveratrol.
46
Figura 8: Diagrama de fases.
56
ii
Figura 9: Gráfico correlacionando o percentual de sequestro do
radical DPPH• a diferentes concentrações do óleo de açaí.
62
Figura 10: Gráfico da curva de calibração com α-tocoferol no teste
de ABTS•1.
63
Figura 11: Diagrama de fases para a combinação de tensoativos
Brij CS20 e Brij S2 (50:50).
65
Figura 12: Diagrama de fases para a combinação de tensoativos
Brij CS20 e Brij S2 (50:50).
66
Figura 13: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a
36 com a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 (aumento
40 vezes).
68
Figura 14: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a
36 com a combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 (aumento
40 vezes).
69
iii
Figura 15: Fotografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20
nos dias 1, 8, 15, 22 e 29.
73
Figura 16: Fotomicrografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-
S2CS20 nos dias 1, 8, 15, 22 e 29.
74
Figura 17: Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-
S2CS20.
79
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais sinais e sintomas da radiodermatite. 29
Tabela 2: Concentração dos principais compostos fenólicos presentes
no óleo de açaí.
44
Tabela 3: Concentração dos ácidos graxos presentes no óleo de açaí. 44
Tabela 4: Formulações utilizadas no diagrama de fases e respectivas
concentrações de seus componentes.
53
Tabela 5: Descrição dos componentes e suas respectivas proporções
nas formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20.
71
Tabela 6: Resultados do teste de centrifugação. 76
Tabela 7: Resultados do teste de estresse térmico. 78
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
35-S2CS20 emulsão constituída de 10% de óleo de açaí, 10% de Brij
S2, 10% de Brij CS20 e 70% de água
35R-S2CS20 emulsão constituída de 10% de óleo de açaí, 10% de Brij
S2, 10% de Brij CS20, 1% de resveratrol e 69% de água
A/O água em óleo
ABTS Ácido 2,2’-azino-bis-(3- etilbenzotiazolina)-6-sulfônico
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
DNA ácido desoxirribonucléico
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
nm nanômetro
O/A óleo em água
r2 coeficiente de correlação linear
RNA ácido ribonucléico
RNAm ácido ribonucleico mensageiro
RPM rotação por minuto
UV ultravioleta
vii
Durante o tratamento radioterápico de tumores, comumente surgem
reações na pele em decorrência da exposição à radiação. Essas reações,
denominadas radiodermatites, afetam a qualidade de vida do paciente e podem
levar a interrupção da terapia. Nesse contexto, é interessante a utilização tópica
de substâncias radioprotetoras que têm a capacidade de atenuar ou impedir os
danos causados pela radiação.
Nesse estudo, desenvolveu-se emulsões com cristais líquidos utilizando
tensoativos não-iônicos da classe dos álcoois graxos etoxilados (Brij CS 20 e Brij
S2) e óleo de açaí como fase oleosa, na qual foi incorporada o ativo resveratrol.
As emulsões foram desenvolvidas através de diagrama de fases
ternário, onde foi possível determinar, por análise macroscópica e microscópica
sob luz polarizada, qual proporção dos componentes da formulação
(combinação de tensoativos, óleo e água) resultava em formulações estáveis e
com maior presença de cristais líquidos. Após a escolha da formulação, foram
realizados testes de estabilidade, nos quais a formulação mostrou-se estável.
A atividade antioxidante do óleo de açaí foi comprovada por dois
métodos. Na determinação através do sequestro do radical DPPH, apresentou
IC50 de 13,06 mg/mL. No teste que utiliza o radical ABTS•1 liofilizado, o resultado
encontrado foi de 1882 mg equivalente de tocoferol por kg do óleo.
O comprovado efeito radioprotetor do resveratrol somado à atividade
antioxidante do óleo de açaí e ao poder hidratante de emulsões indicam que a
formulação desenvolvida tem potencial para ser utilizada topicamente durante o
tratamento radioterápico com a finalidade de minimizar os efeitos da radiação
ionizante sobre a pele.
viii
Palavras-chave: radiodermatite, radioproteção, emulsão, cristal líquido,
atividade antioxidante, óleo de açaí, resveratrol.
x
During tumor radiotherapy, usually skin reactions arise as a result of
radiation exposure. These reactions, called radiodermatitis, affect the quality of
life of patients and may lead to discontinuation of therapy. In this context, it is
interesting to make use of topical substances that present radioprotector activity
which have the ability to mitigate or prevent the damage caused by radiation.
In the present study, emulsions with liquid crystals were developed using
non-ionic surfactants of the class of ethoxylated fatty alcohols (Brij CS 20 and Brij
S2) and acai oil as the oil phase, which was incorporated into the active
resveratrol.
The emulsions were developed using a ternary phase diagram. By this
diagram and using macroscopic analysis and microscopic under polarized light
analysis, the proportion of the components of the formulation (combination of
surfactants, oil and water) that result in stable emulsions and enhanced amount
of liquid crystals was determinate. After the choice of the formulation and the
incorporation of resveratrol (1% w/w), the stability tests were performed, in these
test the formulation showed to be stable.
The antioxidant activity of the acai oil was confirmed by two methods. In
determining through DPPH radical, was founded IC50 of 13.06 mg / mL. In the
test using the ABTS • 1 lyophilised, the result was equivalent to 1882 mg of
tocopherol per kg of oil.
The proved radioprotective effect of resveratrol, the antioxidant activity of
acai oil and the moisturizing capacity of emulsions indicate that the proposed
formulation can be used topically during radiotherapy treatment in order to
minimize the effects of ionizing radiation on the skin.
xi
Keywords: radiodermatitis, radioprotection, emulsion, liquid crystal, antioxidant,
acai oil, resveratrol.
Introdução
17
1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma doença com alta incidência em todo o planeta, ocupando
o primeiro lugar na lista de doenças que mais resultam em óbito
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).
Uma técnica muito comum e eficiente no tratamento dessa doença é a
radioterapia que, através de radiações ionizantes, forma radicais livres e
desencadeia reações intracelulares que culminam em alterações no material
genético e morte das células tumorais. No entanto, durante a utilização desse
tratamento, comumente tecidos saudáveis também são afetados, causando
efeitos adversos principalmente em tecidos com alta taxa de divisão celular como
os formados por células epiteliais.
Inevitavelmente a radiação ionizante atravessa a pele para atingir o sítio
alvo da terapia, desse modo, esse órgão é o mais frequentemente afetado. Há
estudos que estimam que ocorra pelo menos uma forma de reação cutânea em
aproximadamente 95% dos pacientes que utilizam esse tratamento (CONNO;
VENTAFTIDDA, 1991). Tais reações cutâneas, denominadas radiodermatites,
se manifestam como prurido, edema, eritema, descamação seca e úmida,
sangramento e necrose. Seus sinais e sintomas resultam em desconforto para o
paciente, descontinuação da radioterapia e aumento do risco de infecções
(HYMES et al., 2006).
Desse modo, faz-se necessário o desenvolvimento de uma formulação
tópica que minimize os efeitos da radiação sobre a pele, evitando a interrupção
do tratamento e melhorando a qualidade de vida do paciente.
Introdução
18
As emulsões são amplamente utilizadas para veiculação de fármacos.
Esse tipo de formulação pode alterar a biodisponibilidade do ativo de diferentes
formas. Suas características podem resultar em aumento da hidratação da pele,
controle na taxa de difusão do ativo, além de aumentar a permeação pelo estrato
córneo (ECCLESTON, 1997). A formação dos cristais líquidos nesse sistema é
vantajosa, pois auxilia na estabilização da emulsão e na solubilização de alguns
ativos (SANTOS, 2006).
Nesse contexto, a utilização do óleo de açaí é adequada. Suas
propriedades antioxidantes podem exercer ação sinérgica com o resveratrol, um
radioprotetor com atividade comprovada, em atuar na diminuição da incidência
e intensidade dos sinais e sintomas das reações cutâneas em resposta a
exposição à radiação.
Revisão da Literatura
20
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Patogenia e incidência do câncer
A Organização Mundial de Saúde utiliza o termo câncer para definir um
amplo conjunto de doenças que podem afetar qualquer parte do organismo. Esse
grupo possui como característica comum o rápido e exacerbado surgimento de
células anormais que crescem além de seus limites habituais e podem atingir
tecidos adjacentes e posteriormente invadir outros órgãos (ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).
O câncer surge de uma única célula. A transformação de uma célula
normal em uma célula tumoral é um processo com múltiplas etapas. Tais
mudanças são resultantes da interação entre fatores genéticos do indivíduo e
agentes externos físicos, químicos ou biológicos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE
SAÚDE, 2013).
O envelhecimento é outro fator fundamental, pois a incidência da doença
aumenta drasticamente com a idade. Isso ocorre pela ação sinérgica de dois
fatores: a menor eficiência dos mecanismos de reparo à medida que a pessoa
envelhece e a exposição cumulativa aos fatores de risco (ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).
Câncer é a principal causa de morte em todo mundo e é responsável por
13% do total de mortes por ano, essa porcentagem corresponde a 7,6 milhões
de óbitos. A previsão é que este número continue aumentando e atinja 13,1
milhões de mortes em 2030 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).
Revisão da Literatura
21
No Brasil, desde 2003, as neoplasias malignas são classificadas como a
segunda causa de morte na população, representando quase 17% dos óbitos de
causa conhecida, notificados no Sistema de Informações sobre Mortalidade. E
esta situação tende a se agravar devido ao crescimento e envelhecimento da
população (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2009).
O tratamento engloba uma série de intervenções que objetiva a cura da
doença ou a prolongação e melhora na qualidade de vida do paciente.
Geralmente, utiliza-se radioterapia, cirurgia, quimioterapia, suporte psicossocial,
ou uma combinação desses procedimentos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE
SAÚDE, 2013).
2.2 . Radioterapia
Radiação pode ser definida como a propagação de energia através do
espaço ou da matéria. Essa propagação é classificada em duas categorias:
corpuscular e eletromagnética. As propagações corpusculares são constituídas
por partículas subatômicas, quando estas obtém energia necessária para
adquirir velocidade. Já as eletromagnéticas não são formadas por partículas, são
radiações que possuem oscilações elétricas e magnéticas e viajam numa
velocidade característica (SCAFF, 1997).
Radiações ionizantes podem ser eletromagnéticas ou corpusculares.
São caracterizadas por possuírem energia suficiente para ionizar átomos ou
moléculas, ou seja, promover a ejeção de elétrons de seus orbitais (SCAFF,
1997).
Revisão da Literatura
22
Desde o final do século XIX, quando houve a descoberta de meios de
gerar Raios X por Wilhelm Röentgen, a terapia com radiação tem sido
desenvolvida como uma parte essencial do tratamento contra o câncer (IARC,
2008). A submissão do artigo de Roentgen sumarizando a descoberta dos raios
X em 28 de dezembro de 1895 a Wurzburg Physico-Medical Society é
considerada o marco para o nascimento dos campos de radiologia e da
oncologia da radiação. Apenas sete meses após essa descoberta, um trabalho
da Medical Record descreveu um paciente com carcinoma gástrico que se
beneficiou da radioterapia (CONNEL e HELLMAN, 2012). Essa técnica contribui
tanto para a cura quanto para a paliação da doença. Estima-se que mais de 50
% dos pacientes utilizam essa forma de terapia em algum momento do
tratamento (DELANEY et al., 2005).
A radioterapia se divide em duas categorias: teleterapia e braquiterapia.
A teleterapia ou radioterapia externa é realizada mantendo uma distância física
entre o paciente e a fonte da radiação. Na braquiterapia, são usadas fontes de
radiação em contato direto com os tecidos a serem irradiados (MARTA, 2012).
O objetivo dos tratamentos radioterápicos é irradiar uniformemente o
tumor, enquanto se poupa o máximo possível de tecido saudável adjacente,
evitando-se com isto o surgimento de efeitos colaterais (WARDE, 2004).
Os efeitos da radiação podem ser divididos em quatro etapas:
Física, na qual há absorção da radiação nos tecidos, resultando na
ionização e excitação dentro dos átomos;
Revisão da Literatura
23
Química, na qual os átomos e moléculas alteradas reagem com
outros componentes celulares resultando na quebra de ligações
químicas e formação de radicais livres;
Biológica, que inclui os processos subsequentes, como lesões na
membrana da célula, alteração de processos bioquímicos, danos ao
material genético;
Clínica, que inclui manifestação dos sinais e sintomas da exposição
à radiação (GWYNNE e STAFFURTH, 2012) (BOURGIER, 2012).
A radioterapia exerce sua atividade através da lesão de componentes
intracelulares. Quando a radiação ionizante atravessa tecidos vivos radicais
livres são gerados. Esses radicais tem a capacidade de interagir com moléculas
vitais como o DNA, proteínas ou lipídios de membranas, e podem induzir danos
celulares, culminando em uma célula disfuncional ou morta (BOURGIER, 2012).
O dano ao DNA é o fator mais importante nas alterações celulares.
(GWYNNE; STAFFURTH, 2012). Radiação ionizante causa uma variedade de
lesões no DNA, incluindo oxidação de bases, perda de bases, quebras simples
de fita e quebra dupla de fita. Esses danos culminam em alterações na divisão
celular, morte celular, depleção das células tronco, disfunção em órgãos e
sistemas e, se a dose for suficientemente alta, a morte do organismo (BEGG et
al., 2011).
O efeito máximo da radiação ocorre imediatamente antes (G2) ou durante
(M) a divisão celular (NAYLOR; MALLETT, 2001).
Revisão da Literatura
24
Figura 1: Ciclo celular (NAYLOR; MALLETT, 2001).
,
Na Figura 1, está representado o ciclo celular, onde:
G0 = Fase de repouso, onde divisão celular está interrompida, mas a
célula mantém suas funções;
S = Fase de síntese, na qual há replicação dos cromossomos (síntese de
DNA);
G2 = Fase pré-mitótica, onde há crescimento da célula e produção de
RNA;
M= Fase mitótica, durante a qual há a divisão celular (NAYLOR;
MALLETT, 2001).
A radioterapia é um tratamento de sucesso para muitos tipos de tumores
devido, principalmente, a soma de dois fatores. Primeiramente, as células
tumorais sofrem mitose em uma taxa anormalmente alta, o que as torna muito
propensas a sofrer os efeitos da radioterapia. Além disso, células tumorais não
Revisão da Literatura
25
possuem a capacidade de reparar danos intracelulares (NAYLOR; MALLETT,
2001).
Efeitos indiretos como redução da vascularidade ao redor do tumor ou
aumento do reconhecimento imunológico também podem ser importantes
durante a utilização da radioterapia (GWYNNE; STAFFURTH, 2012).
Os tecidos normais também são afetados pela radiação resultando em
sintomas e sinais, classificados em agudos ou tardios. Esses efeitos adversos
são causados por uma combinação de morte celular e estimulação dos
processos inflamatórios, trombóticos e fibrogênicos (BEGG et al, 2011).
Embora células e tecidos sejam equipados com enzimas endógenas
capazes de detoxificar e remover os produtos da radiólise, quando essas
espécies reativas de oxigênio estão muito altas nos sistemas biológicos após a
exposição à radiação, os sistemas endógenos são incapazes de proteger as
células dos efeitos nocivos dos radicais livres.
Os efeitos agudos da radiação são mais proeminentes em tecidos com
alta taxa de proliferação, como a superfície epitelial da pele e ou sistema
digestivo (STONE et al., 2003). Os sintomas variam conforme o local irradiado,
mas comumente são observados náusea, xerostomia, vômitos, alopecia,
mucosite, diarreia, e alteração transitória do estado neurológico (WARDE, 2004;
BEGG et al, 2011).
Efeitos tardios se desenvolvem meses ou anos após o tratamento. Os
sintomas podem ser brandos ou severos, autolimitados ou progressivos, e
podem se desenvolver gradualmente ou repentinamente. Efeitos tardios tendem
a ocorrer em tecidos com baixa taxa de renovação celular, como o tecido
Revisão da Literatura
26
subcutâneo, tecido adiposo, muscular, cerebral, renal e hepático. As lesões são
patologicamente diversas, mas comumente ocorre fibrose, necrose, atrofia, dano
vascular e insuficiência cardíaca (STONE et al., 2003; BEGG et al, 2011).
Durante a radioterapia externa, o feixe de raios ionizantes inevitavelmente
necessita atravessar a pele para atingir o tecido alvo, desse modo os efeitos
adversos cutâneos, conhecidos como radiodermatites, são os mais
frequentemente observados (HARRIS, 2011).
2.3 . Radiodermatites
A pele é um dos maiores órgãos do corpo humano e reveste toda a
superfície corporal. Apresenta-se constituída por dois segmentos: epiderme e
derme (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A epiderme possui origem ectodérmica e é constituída por epitélio
estratificado pavimentoso queratinizado. Essa camada forma-se principalmente
por melanócitos, células de Langerhans, células de Merkel e queratinócitos,
sendo essas últimas a classe mais abundante (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Além disso, contém uma ampla gama de sistemas sensores capazes de detectar
mudanças nas condições ambientais como temperatura, pressão e estímulos
químicos (OMATA, 2012).
Pode-se dividir a região epidérmica em cinco camadas distintas:
A camada córnea é a mais superficial e atua como barreira contra a
perda excessiva de água (HYMES et al., 2006). Representa o produto
final da diferenciação da epiderme e é caracterizada por uma matriz
celular rica em lipídios. Além disso, há a presença de células cujo
Revisão da Literatura
27
citoplasma está repleto de queratina e apresentam-se como
estruturas achatadas, anucleadas e mortas, que se descamam
continuamente (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A camada lúcida se localiza imediatamente abaixo do estrato córneo
e distingue-se por possuir células achatadas, eosinófilas e
translúcidas, cujos núcleos e organelas citoplasmáticas foram
digeridos por enzimas dos lisossomos e desapareceram
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A terceira camada é denominada granulosa e apresenta-se como
fileiras de células achatadas com núcleo centralizado e citoplasma
carregado de grânulos basófilos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A próxima é denominada espinhosa, devido ao fato que as células
que a compõem possuem expansões citoplasmáticas que se
assemelham a espinhos. Essas células são cuboides e apresentam
núcleo central. Há ainda a presença de células-tronco dos
queratinócitos, que auxiliam na renovação celular (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004).
A última camada epidérmica é chamada de basal ou germinativa.
Suas células prismáticas e basófilas se localizam acima da
membrana basal que separa a epiderme da derme. Outro fator
importante é a existência de grande quantidade de células-tronco e
alta atividade mitótica, tornando assim, esse estrato, o responsável
pela constante renovação da epiderme (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2004)
Revisão da Literatura
28
Após as cinco camadas que formam a epiderme, é possível observar a
camada dérmica, composta por tecido conjuntivo. Essa é responsável por
fornecer suporte à epiderme e uni-la ao tecido celular subcutâneo ou hipoderme
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Reações de pele provocadas por radiação, denominadas radiodermatites,
são os efeitos adversos mais comuns do tratamento radioterápico externo
(HARRIS, 2011). A alta incidência dessas reações é explicada pela rápida
divisão celular que ocorre na camada basal da epiderme somada ao fato que
durante o tratamento com radiação externa inevitavelmente os feixes necessitam
atravessar a pele para alcançar o sítio alvo (NAYLOR; MALLET, 2001;
MADDOCK-JENNINGS et al., 2005).
Mesmo quando a pele não é o alvo principal do tratamento radioterápico,
ela geralmente apresenta danos funcionais, estruturais ou moleculares (HYMES
et al., 2006). Estima-se que 95% dos pacientes apresentem algum tipo de reação
cutânea em resposta ao tratamento com radiação (CONNO; VENTAFTIDDA,
1991).
O primeiro caso de radiodermatite publicado foi registrado por Frieben em
1902, apenas seis anos após a descoberta dos raios X por Roetgen. Foi um
relato de caso cujo paciente apresentava carcinoma de célula escamosa no
dorso da mão após trabalhar com tubos Roentgen por quatro anos (VAN
VLOTTEN et al., 1987).
As alterações podem durar horas ou perdurar por muitos meses. Em
alguns casos essas mudanças se tornam permanentes (MADDOCK-JENNINGS,
2005).
Revisão da Literatura
29
A pele é um órgão em constante renovação, e a radioterapia interfere com
a maturação, reprodução e repopulação das células germinativas e dos folículos
pilosos. Além disso, causa danos aos fibroblastos e as células da vasculatura
cutânea (HYMES et al., 2006). A fisiopatologia é uma complexa combinação dos
danos diretos causados pela radiação e a reação inflamatória subsequente,
culminando em comprometimento da função de barreira exercida pela pele,
colonização bacteriana e superprodução de antígenos (HEMATI et al., 2011).
Os principais sinais e sintomas estão apresentados na Tabela 1:
Tabela 1: Principais sinais e sintomas da radiodermatite
Alteração
na pele
Tempo de
surgimento
Descrição Tempo de
cura
Eritema Horas – 3
semanas
Aumento do volume
sanguíneo abaixo da
epiderme, resultando em
aspecto avermelhado
Meses após
o tratamento
Pigmentação e
epilação
Horas – 3
semanas
Destruição celular devido
à ativação de enzimas
proteolíticas
Meses após
o tratamento
Descamação
seca
3-6 semanas Queratinização atípica
devido a redução de
células linolênicas
resultando em
reprodução reduzida.
6-8 semanas
após o
tratamento
Descamação
úmida
4-6 semanas Perda de epiderme
devido à esterilização de
células linolênicas
3-6 semanas
após o
tratamento
Revisão da Literatura
30
Ulceração
secundária
Superior a 6
semanas
Dano secundário a
epiderme devido à
desidratação e infecção a
partir de um prolongado
processo de descamação
úmida
Dano
permanente
Necrose
epitelial
Superior a
10 semanas
Morte do tecido devido à
insuficiência vascular
Dano
permanente
Atrofia epitelial Superior a
26 semanas
Contração da área
irradiada
Dano
permanente
Telangiectasia Superior a
52 semanas
Dilatação atípica dos
capilares da superfície
dérmica
Dano
permanente
Fibrose
invasiva
Sem prazo Processo curativo
resultante em formação
de cicatriz
Dano
permanente
Ulceração
aguda
Inferior a 10
dias
Perda precoce da
epiderme devido à morte
celular na interfase
Cicatriz
permanente
Necrose aguda Inferior a 10
dias
Morte de queratinócitos Dano
permanente
A Figura 2 representa as principais alterações na pele em decorrência do
tratamento com radiação externa.
Revisão da Literatura
31
Figura 2: Principais sinais e sintomas da radiodermatite: (a) eritema, (b)
hiperpigmentação, (c) descamação, (d) ulceração, (e) necrose, (f) atrofia epitelial,
(g)telangiectasia, (f) fibrose. (colocar a fonte)
Eritema Hiperpigmentação
Descamação Ulceração
Necrose Atrofia epitelial
Telangiectasia Fibrose
a b
c d
e f
g
c
h
c
Revisão da Literatura
32
De acordo com National Cancer Institute Common Terminology Criteria for
Adverse Events (versão 3), as radiodermatites são classificadas em cinco graus
diferentes.
Grau 1: eritema fraco ou descamação seca.
Grau 2: eritema moderado a intenso, descamação úmida irregular
principalmente nas regiões com dobras e vincos; edema moderado.
Grau 3: descamação úmida não limitada a dobras e vincos; sangramento
induzido por pequenos traumas ou abrasões.
Grau 4: necrose ou ulcerações na pele; sangramento espontâneo.
Grau 5: morte.
As alterações na pele em decorrência da terapia com radiação dependem
de fatores associados ao tratamento e ao paciente, tais como: local irradiado,
tipo de radiação, estado nutricional do paciente, presença de dobras na pele e
quimioterapia concomitante (MADDOCK-JENNINGS, 2005).
Além do desconforto físico, essas manifestações cutâneas estão
associadas com prejuízos na qualidade de vida do paciente, incluindo: fadiga,
problemas com a imagem corporal, alterações de sono, stress emocional e
mudanças na funcionalidade cotidiana do paciente. O aumento nos custos do
tratamento devido a gastos com medidas para minimizar os distúrbios físicos e
emocionais também é relatado (SCHNUR, 2011; SCHNUR, 2012).
Em casos graves, esses efeitos adversos frequentemente causam
limitação das doses da terapia ou interrupção do tratamento, fatos que podem
afetar negativamente o resultado da radioterapia e consequentemente, a
evolução do paciente (HEMATI, 2011).
Revisão da Literatura
33
Não existe consenso na literatura quanto à orientação para procedimentos
e cuidados que o paciente e a equipe de saúde devem se ater para minimizar
esses prejuízos. Com isso, torna-se necessário um tratamento tópico efetivo
para radiodermatite que evite, reduza e amenize os efeitos adversos da radiação
na pele.Isto irá permitir um tratamento radioterápico mais eficiente, aumentando,
desse modo a possibilidade de cura do paciente (BLECHA et al., 2004).
2.4 . Radioprotetores
Radioprotetores podem ser conceituados como substâncias capazes de
reduzir os efeitos prejudiciais da radiação (ESCO et al., 2004).
Durante a guerra fria, o governo dos Estados Unidos iniciou um programa
com o objetivo de pesquisar agentes químicos que tivessem a capacidade de
proteger os soldados dos efeitos da exposição à radiação durante um possível
ataque nuclear. Em 1979, aproximadamente quatro mil substâncias já estavam
caracterizadas (BOURGIER, 2012; FERNANDEZ, 2009).
Os radioprotetores podem exercer sua atividade por diferentes
mecanismos, sendo estes: (1) supressão da formação de espécies reativas, (2)
detoxificação das espécies reativas, (3) estabilização do alvo, (4) aumento dos
processos de recuperação e reparo (NAIR et al., 2001).
Na supressão da formação de espécies reativas, os compostos
radioprotetores agem induzindo hipóxia local. Por exemplo, algumas substâncias
tem a capacidade de sofrer reações que resultam no consumo químico ou
bioquímico de oxigênio, tornando esse menos disponível para a formação de
espécies reativas de oxigênio (NAIR et al., 2001; FERNANDEZ, 2003). Para
Revisão da Literatura
34
causar a morte de células em hipóxia é necessária de duas a três vezes a dose
de radiação suficiente para matar as células em condições normais (POGGI et
al, 2001).
A eliminação ou detoxificação dos radicais livres pode abrandar
significativamente os danos produzidos pela radiação. Sequestradores de
radicais livres interagem com esses e previnem a morte da célula. Outro
mecanismo de eliminação de radicais livres é através da estimulação das
enzimas com atividade antioxidante como a glutationa redutase, superóxido
dismutase e catalase. Um terceiro mecanismo possível para a eliminação de
radicais livres é através da neutralização dessas espécies reativas através da
doação de um átomo de hidrogênio (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al., 2001).
Os radioprotetores também podem interagir com as moléculas de DNA
formando complexos que estabilizam essas estruturas e previnem os danos da
radiação (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al., 2001).
Em uma última forma, o processo de recuperação celular é reforçado por
algumas substâncias que, por exemplo, possuem a capacidade de reparar
rupturas nas cadeias de ácidos nucléicos (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al.,
2001).
O conhecimento sobre as propriedades dos radioprotetores adquirido
durante as pesquisas militares e sobre os mecanismos envolvidos nas
consequências da exposição à radiação ionizante gerou interesse em
abordagens farmacêuticas sobre o tema (BOURGIER, 2012).
Revisão da Literatura
35
A radioproteção farmacológica pode ser dividida em três categorias, de
acordo com o período em que exercem sua atividade em relação à exposição:
protetores, mitigadores e agentes de tratamento (BRIZEL, 2007).
Os agentes protetores são aqueles administrados previamente à
exposição, usados como estratégia profilática (BOURGIER, 2012). Incluem-se,
nessa classe, os antioxidantes que possuem a capacidade de doar um átomo de
hidrogênio como o ácido ascórbico, tocoferóis, polifenóis e tióis. Nesse caso os
oxidantes formados são neutralizados pela doação de um átomo de hidrogênio,
resultando em produtos menos reativos ou não reativos (CITRIN et al., 2010;
STONE et al., 2004).
A segunda classe é chamada de mitigadores e são administrados durante
ou imediatamente após a irradiação, mas antes do surgimento de sinais e
sintomas (BOURGIER, 2012). Após ocorrer o dano no DNA, uma variedade de
processos ocorre na célula, tecido ou organismo, incluindo ativação dos
processos de reparo de DNA, ativação da transdução de sinal, expressão de
genes em resposta a radiação e estimulação da inflamação. Essas vias podem
ser importantes para recuperação dos danos, mas podem também desempenhar
um papel importante no desenvolvimento da toxicidade. A administração de
compostos mitigadores objetiva agir nesses processos para prevenir ou reduzir
os danos causados pela radiação (CITRIN et al., 2010). Um exemplo é
administração de inibidores da enzima conversora de angiotensina para reduzir
os danos pulmonares, renais e neurológicos (STONE et al., 2004).
As substâncias para tratamento são utilizadas após o surgimento de sinais
e sintomas, com a intenção de revertê-los ou minimizá-los (BOURGIER, 2012).
Revisão da Literatura
36
Exemplos dessa classe são a pentoxifilina para tratar a fibrose resultante e os
fatores de crescimento hematopoiético que auxiliam na recuperação dos danos
hematológicos (STONE et al., 2004).
Figura 3: Classe de radioprotetores segundo tempo de utilização em relação a exposição à radiação. Adaptado de CITRIN et al. 2010 e BOURGIER, 2012.
Revisão da Literatura
37
Tióis são moléculas contendo grupos sulfidrilas livres ou em potencial nas
suas estruturas. Tióis e seus derivados foram a primeira geração de
radioprotetores e receberam grande atenção, de 1950 a 1985, como
radioprotetores de células de mamíferos. Muitos mecanismos foram propostos
para este grupo, incluindo inativação de radicais livres, transferência de
hidrogênio, indução de hipóxia e estabilização de DNA através de ligação direta.
Apesar da comprovada eficácia dessa geração de radioprotetores, o perfil
de efeitos adversos gerados por essas substâncias criou a necessidade da
busca por uma segunda geração de fármacos que fossem mais efetivos, menos
tóxicos e com rotas de administração mais confortáveis (HOSSEINIMEHR,
2007).
Muitos estudos têm estudado os efeitos radioprotetores de compostos
naturais objetivando utilizá-los como uma alternativa ao perfil de toxicidade
exibido pelos compostos tiólicos (SAMMARTH et al., 2007; ARORA, 2005;
SINGH, 2005; GOEL et al., 2004; VEERAPUR et al.,2007).
O radioprotetor ideal deve ser estável, com possibilidade de uma fácil
administração e sem toxicidade relevante e/ou permanente (ESCO et al., 2004).
2.5 . Emulsões e cristais líquidos
A biodisponibilidade do fármaco em um sítio de ação é afetada pelas
características da formulação utilizada para veicular o ativo (ECCLESTON,
1997).
A pele representa uma barreira natural à penetração de substâncias
Desse modo, dificilmente um fármaco administrado por via tópica, sem uma
Revisão da Literatura
38
formulação adequada, conseguirá atingir as camadas mais profundas da pele
em concentrações suficientes para exercer atividade terapêutica (FLEURY,
2009).
Veículos com propriedades coloidais podem influenciar a difusão do ativo
para a pele, além de interagir com as camadas do estrato córneo, tornando-o
mais permeável. Outro efeito que pode ser observado é a oclusão, a qual reduz
a evaporação e aumenta o grau de hidratação da pele, resultando em maior
permeabilidade (ECCLESTON, 1997).
Uma emulsão é conceituada como um sistema no qual um líquido
encontra-se disperso em outro líquido no qual é imiscível. A estrutura de uma
emulsão consiste em gotículas da fase interna (dispersa) envoltas na fase
externa (dispersante). Podem ser A/O, na qual a fase dispersa é aquosa e a fase
externa é oleosa ou O/A, onde o óleo representa a fase interna e a parte aquosa
é a fase dispersante (AGUIAR, 2010).
Figura 4 - Representação dos glóbulos de emulsões do tipo A/O e O/A
Os cristais líquidos com frequência se formam em sistemas emulsionados
(MORAIS, 2006). Esses são uma fase intermediária da matéria, descoberta pelo
cientista Friedrich Reinitzer ao observar o comportamento do benzoato de
colesterila. Reinitzer ao estudar as características ópticas desse material em
função da temperatura observou que ele apresentava dois pontos de transição,
no primeiro a substância passava do estado cristalino para um líquido translúcido
Revisão da Literatura
39
e no segundo havia a mudança desse líquido translúcido para um líquido
transparente (LAGERWALL; SCALLIA 2012).
Quando uma substância está no estado sólido cristalino apresenta
ordenamento tridimensional de suas moléculas. Há ordem translacional,
orientacional e rotacional de longo alcance, formando uma rede no qual os
átomos ou moléculas estão fixos em uma posição. Normalmente são
anisotrópicos, ou seja, possuem propriedades que se alteram de acordo com a
direção analisada (ECCHER, 2010).
Quando uma substância se encontra no estado líquido, suas moléculas
constituintes estão distribuídas aleatoriamente em um determinado volume. Não
há ordem posicional de longo alcance, orientacional e rotacional em nenhuma
direção do espaço. Desse modo, apresentam isotropia, ou seja, possuem
propriedades que não se alteram qualquer que seja a direção da análise
(ECCHER, 2010).
Os cristais líquidos representam uma fase intermediária entre os cristais
sólidos e os líquidos isotrópicos. Essa mesofase apresenta características de
ambos os estados. Possui ordem estrutural, ligações definidas, e rigidez como
os sólidos e possui simultaneamente fluidez e regiões desordenadas como os
líquidos (MORAIS, 2006).
Revisão da Literatura
40
Figura 05:Representação da ordenação tridimensional das fases cristalinas,
líquido-cristalinas e líquida isotrópicas (ECCHER, 2010).
Os cristais líquidos podem ser classificados em termotrópicos e
liotrópicos.
Os primeiros são constituídos por uma substância pura ou por uma
mistura de moléculas que possuem forma geométrica semelhante e se
apresentam no estado mesofásico em uma determinada temperatura (SANTOS,
2006; MORAIS, 2006). Ou seja, a temperatura é o parâmetro fundamental para
o controle termodinâmico dessa fase. Há dois pontos chaves que determinam o
início e o término da fase líquido cristalina: a temperatura de fusão que marca a
passagem do sólido cristalino para a mesofase e a ponto de clareamento que
marca a transformação dessa mesofase em um líquido isotrópico (LAGERWALL,
2012).
Os cristais liotrópicos, os mais comumente encontrados em emulsões,
são formados por uma mistura de moléculas que sofrem influência crítica da
concentração do solvente durante sua estruturação (SANTOS, 2006; MORAIS,
2006). São misturas de moléculas anfifílicas e solventes, e o ponto chave que
determina a formação da mesofase é a proporção entre esses componentes
(NETO, 2013).
Revisão da Literatura
41
Uma propriedade compartilhada por todas as substância mesogênicas é
serem anisométricas, isto é, são moléculas em que uma ou duas dimensões são
muito maiores que a terceira (MARTINS, 2013).
A presença de cristais líquidos na formulação pode resultar em algumas
propriedades vantajosas. Uma delas é a prevenção de processos de
coalescência, devido à formação de multicamadas ao redor das gotículas da
emulsão, que atuam como barreira reológica contra a coalescência. Ainda é
possível que haja a liberação controlada do ativo, proteção do ativo contra
degradação e aumento da concentração de água no estrato córneo (SANTOS,
2006; MORAIS, 2006).
Uma formulação com aplicação dermatológica deve possuir bom perfil de
estabilidade químico e físico, além de promover um ambiente adequado para
que o princípio ativo possa alcançar o sítio alvo. Outros fatores importantes são
a facilidade na aplicação e remoção, e a ausência de componentes que possam
exercer atividade irritante sobre a pele (ECCLESTON, 1997).
2.6 . Óleo de açaí
A palmeira Euterpe oleracea Mart, conhecida como açaizeiro, é nativa no
Brasil principalmente na região amazônica, se estendendo por todo esse
estatuário, e ainda pelas regiões litorâneas do Amapá, Pará, Piauí, Guiana e
Venezuela (FAVACHO, 2009). Pertencente à família Arecaceae (Palmae), é uma
espécie de clima tropical quente e úmido (BENTES-GAMA, 2005).
O açaizeiro cresce por brotações sucessivas a partir de uma unidade de
dispersão. Pode alcançar uma altura de 30 metros. Cada uma das
inflorescências gera um cacho com centenas de frutos, caracterizados pela
Revisão da Literatura
42
forma esférica com diâmetro de 1,0 a 1,5 centímetros e cor violácea escura
(FAVACHO, 2009).
Figura 6: Açaizeiro (Euterpe Oleracae).
O Brasil tem grande destaque, posicionando-se como o maior produtor,
consumidor e exportador dessa espécie que se caracteriza como a palmeira
mais produtiva da região, tanto em frutos como em gêneros derivados da planta
(MENEZES, 2005).
Grande interesse tem surgido a cerca da espécie Euterpe oleracea devido
a estudos que comprovam suas atividades farmacológicas (KANG et al., 2010;
FERRARI; ROCHA-FILHO, 2011; FAVACHO et al., 2011; COSTA et al., 2010).
A polpa desse fruto possui grande quantidade de antocianinas, pigmentos
hidrossolúveis responsáveis pela cor arroxeada (MENEZES, 2008). As
antocianinas são glicosídeos das antocianidinas, fazem parte do grupo dos
flavonóides, em que o núcleo básico é a estrutura do íon 4-hidroxiflavilium, e são
compostos de duas ou três partes: a aglicona (antocianidina); o carboidrato e,
freqüentemente, um grupo acil (GUIMARÃES, 1987). São reconhecidas por
diversas propriedades farmacológicas, incluindo anticarcinogênica,
Revisão da Literatura
43
antiinflamatória e antimicrobiana e a prevenção da oxidação de proteínas de
baixa densidade (MENEZES, 2008). E, além disso, agem como antioxidante,
eliminando diretamente as espécies reativas de oxigênio (PACHECO-
PALENCIA et al., 2009; ZHANG et al., 2010).
Schauss et al. (2006) investigaram por meio de diferentes ensaios a
capacidade antioxidante de um pó formado pela liofilização da polpa e casca do
fruto da Euterpe oleracea. Foi demonstrada a atividade antioxidante mais alta
relatada para qualquer fruta ou vegetal contra o radical livre peroxila (RO2.-).
Além disso, foi mostrada atividade excelente contra superóxido e atividade
moderada contra os radicais peroxinitrito (ONOO-) e hidroxila (OH.). Ainda nesse
estudo, o liofilizado apresentou capacidade para inibir as enzimas COX-1 e COX-
2, indicando potencial atividade anti-inflamatória.
O óleo fixo de Euterpe oleracea contem diversos compostos fenólicos,
que possuem propriedades antioxidantes. Esse fato o torna interessante para o
mercado alimentício, cosmético e farmacêutico (PACHECO-PALENCIA et al.,
2008).
Esse óleo é constituído majoritariamente de ácidos graxos
monoinsaturados (60%) e poliinsaturados (14%). Os ácidos graxos tem
reconhecido efeito em atenuar o processo inflamatório interferindo em diferentes
pontos da cascata inflamatória como a vasoconstrição, quimiotaxia, adesão,
diapedese, ativação e morte celular (FAVACHO, 2009).
Tabela 2: Concentração dos principais compostos fenólicos presentes
no óleo de açaí (PACHECO-PALENCIA, 2008).
Revisão da Literatura
44
Composto fenólico Concentração relativa (%)
Trímeros de Procianidinas 27,0
Ácido Vanílico 21,6
Dímeros de Procianidinas 14,3
Ácido Siríngico 14,3
Ácido p-Hidrobenzóico 11,9
Ácido Protocatecuico 8,4
Ácido Ferúlico 1,4
Outros 1,1
Tabela 3 - Concentração dos ácidos graxos presentes no óleo de açaí
(NASCIMENTO, 2006).
Ácidos Graxos Concentração relativa (%)
C16:0 Ácido Palmítico 22,0
C16:1 Ácido Palmitoléico 2,0
C18:0 Ácido Esteárico 2,0
C18:1 Ácido Oléico 60,0
C18:2 Ácido Linoléico 12,0
C18:3 Ácido Linolênico Traços
C20:0 Ácido Araquídico 2,0
Revisão da Literatura
45
2.7 . Resveratrol
Os compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas no
reino vegetal. São subdivididos em duas categorias: os flavonóides, tais como a
quercetina e a catequina e os não-flavonóides, que incluem o resveratrol
(BACHUR, 2008).
O resveratrol é uma fitoalexina polifenólica da classe dos estilbenos,
produzida por uma grande variedade de vegetais como uvas, amendoins,
oxicocos, mirtilos (SAUTTER, 2008; CARSTEN, 2008). Fitoalexinas são
compostos antimicrobianos de baixo peso molecular e fazem parte do
mecanismo de auto-defesa de diversas plantas. Sua síntese é naturalmente
desencadeada em situações de estresse (MORENO, 2009).
A biossíntese do resveratrol ocorre através de um sinal químico, gerado
por estresse, que induz o aumento da expressão do gene estibeno sintetase, o
qual promove o acúmulo de mRNAestilbeno sintetase, responsável pela
formação da enzima estilbeno sintetase. Por sua vez, esta enzima catalisa a
reação entre uma molécula de p-coumaroyl-CoA e três moléculas de malonyl-
CoA, substratos estes presentes nas plantas, originando o resveratrol na área
afetada (MORENO, 2009).
Essa fitoalexina pode ser encontrada sob duas formas isoméricas trans-
resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno) e cis-resveratrol (cis-3,5,4’-
trihidroxiestilbeno) (SAUTTER, 2008).
Revisão da Literatura
46
Figura 7: Estrutura química do trans-resveratrol.
Muitos estudos atribuem atividades terapêuticas ao isômero trans-
resveratrol: como ação antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante,
anticarcinogênica, radioprotetora e a redução do risco de aterosclerose
(SAUTTER, 2008; FANG, 2012; CHAN et al., 2002; CARSTEN, 2008; SHAW,
2007).
As atividades antioxidantes são relacionadas com sua habilidade de
neutralizar diretamente os radicais livres. Somada a isso, há ainda capacidade
de promover a ativação de enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase,
catalase, peroxidase, glutationa redutase, glutationa redutase, selenofosfato
sintetase (CARSTEN, 2008; DENISSOVA, 2011).
O resveratrol tem a habilidade de aumentar o tempo de permanência das
células na fase S do ciclo celular, e consequentemente provocar uma diminuição
das fases G2 e M. Desse modo, as células permanecem menos tempo nas fases
mais susceptíveis aos danos causados pela radiação. (SGAMBATO et al., 2001).
Carsten et al. (2008), em um estudo sobre a atividade radioprotetora in
vivo, constataram que o grupo camundongos não-tratados submetidos a
radiação desenvolveu muito mais aberrações cromossômicas nas células da
Revisão da Literatura
47
medula óssea que o grupo de camundongos submetido a mesma quantidade de
radiação mas sob tratamento prévio com resveratrol.
O resveratrol tem potencial para inibir as infecções secundárias que
muitas vezes são observadas em casos de dermatites. Foi demonstrado por
Chan e colaboradores (2002) o potencial antimicrobiano do resveratrol. Essa
substância inibe in vitro o crescimento das bactérias Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococus aureus e Enterococcus faecalis; e de alguns fungos dos gêneros
Tricophyton, Epidermophyton e Microsporum.
As atividades antioxidantes, a capacidade de alterar a duração das fases
ciclo celular e sua baixa toxicidade fazem o resveratrol um candidato atraente
para a radioproteção das células saudáveis (JUAN et al., 2002; CARSTEN,
2008).
Ainda não é descrito na literatura um procedimento padrão para evitar e
tratar casos de radiodermatite. Devido a isso, é necessário o desenvolvimento
de uma terapia tópica que resulte na redução dos efeitos adversos da radiação
na pele e que não altere a ação da radiação ionizante no tratamento
antineoplásico. Desse modo, evita-se a interrupção do tratamento radioterápico
e aumenta a qualidade de vida do paciente (NAIR et al., 2001)..
Objetivos
49
3. OBJETIVOS
3.1 - Objetivos gerais
O objetivo desse estudo é desenvolver e caracterizar emulsões estáveis
com a presença de cristais líquidos utilizando tensoativos não-iônicos e
empregando óleo de açaí como fase oleosa para a incorporação do ativo
resveratrol, para aplicação como radioprotetor de uso tópico
3.2 - Objetivos específicos
Avaliar a atividade antioxidante do óleo de açaí;
Realizar diagrama de fases da composição óleo de açaí/ Brij O3 e Brij
O20/Água;
Realizar diagrama de fases com a combinação de tensoativos Brij S2 e
Brij CS20.
Escolher entre as formulações desenvolvidas uma emulsão estável e com
presença de cristais líquidos e incorporar 1 % de resveratrol;
Caracterizar e avaliar a estabilidade das emulsões obtidas com
resveratrol;
Avaliar o perfil de liberação do resveratrol a partir da formulação.
Material e métodos
51
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material
Para o desenvolvimento das emulsões foram utilizados:
Óleo de açaí (Euterpe oleracea Mart.) refinado - Beraca Ingredientes Ltda.
Brij O20 (álcool oleíco etoxilado - Oleth-20 ) – Croda do Brasil
Brij O3 (álcool oleíco etoxilado - Oleth-3 ) – Croda do Brasil
Brij S2 (álcool esterarílico etoxilado - Steareth-2) – Croda
Brij CS20 (álcool cetoestearílico etoxilado - Ceteareth 20) – Croda
Água recém destilada
Resveratrol - FAGRON
4.2 Métodos
4.2.1 Avaliação de atividade antioxidante do óleo de açaí in vitro
4.2.1.1 Sequestro do radical DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
1,0 ml de uma solução etanólica de DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
(0,3 mM) foi adicionado a 2,5 ml de soluções do óleo em diferentes
concentrações.
Após incubação de 30 e de 60 minutos, a absorbância resultante no
comprimento de onda de 517 nm foi determinada com auxílio de um
espectrofotômetro (Thermo Spectronic modelo - Helios α).
Como controle negativo foi utilizada uma solução de 1 ml DPPH (0,3mM)
somada a 2,5 ml de acetona. Para cada concentração do óleo foi utilizado uma
Material e métodos
52
referência (branco) diferente contendo solução do óleo na concentração avaliada
(2,5 mL) e acetona (1,0 mL).
A partir do decréscimo da absorvância foi calculado o percentual de inibição
segundo a fórmula (Equação 1):
Eq. 1:
Percentual de inibição = (Aborvânciacontrole-Absorvânciaamostra/Absorvânciacontrole) x 100
Na qual:
absorvânciacontrole equivale a absorbância do controle negativo;
absorvânciaamostra é a absorbância corrigida da amostra (absorvância resultante
subtraída do branco com mesma concentração do óleo);
Através do gráfico construído com base no percentual de inibição
calculado e as concentrações do óleo foi determinada a concentração que
resulta em 50 % de inibição do radical (IC50 %) (MEZADRI, 2010).
4.2.1.2 Método do ABTS.liofilizado
Para se obter o liofilizado, o radical ABTS foi solubilizado com uma
solução de persulfato de sódio 2,45 mM a fim formar uma solução de ABTS 7
mM (RE, 1999). Essa solução foi mantida protegida da luz por 16 horas a
temperatura ambiente e posteriormente congelada em freezer a -80 oC. Após o
completo congelamento, o material foi liofilizado em um equipamento Liobras
L101. O tempo de liofilização somado ao tempo de congelamento foi equivalente
a 6 horas. O liofilizado resultante foi usado nas análises.
Em seguida, um grama de óleo foi diluído 10 vezes em uma solução
metanol: clorofórmio (1:1). O liofilizado foi dissolvido no mesmo solvente para
Material e métodos
53
formar uma solução com absorvância de 0,700±0,030 no comprimento de onda
de 752 nm.
Uma quantidade equivalente a 100 µL do óleo diluído foi misturada com
2,9 ml da solução do liofilizado e após 10 minutos de incubação a temperatura
ambiente, a absorvância resultante foi medida no comprimento de onda de 752
nm. A curva de calibração foi construída através de concentrações conhecidas
de α-tocoferol e o resultado expresso em mg de α-tocoferol equivalente por kg
do óleo (DURMAZ, 2012).
4.2.2 Preparação das formulações
As emulsões foram desenvolvidas segundo o método de inversão de
fases, no qual a fase aquosa e a fase oleosa (óleo de açaí e combinação de
tensoativos) foram aquecidas separadamente até atingirem a temperatura de 75
± 1 graus Celsius. Posteriormente, a fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa
sob agitação de 600 RPM com o agitador FISATOM Mod. 315D e manteve-se
agitação constante até que a formulação atingisse a temperatura ambiente.
Durante a preparação das formulações contendo o Resveratrol, seguiu-
se o mesmo procedimento, porém foi acrescentada a quantidade equivalente a
1% (p/p) do fármaco na fase oleosa previamente ao aquecimento.
4.2.3- Diagrama de fases
Foi elaborado um diagrama de fases ternário, construído a partir da
variação das concentrações dos constituintes em valores correspondentes a
10% da formulação (Tabela 3). As formulações foram avaliadas
Material e métodos
54
macroscopicamente e microscopicamente após 24 horas e determinou-se a
região do diagrama onde as emulsões se apresentaram estáveis e com presença
de cristais líquidos.
Tabela 3: Concentrações dos constituintes das formulações
desenvolvidas através do diagrama de fases
Formulação Concentração
do óleo (%p/p)
Concentração
da mistura de
tensoativos
(%p/p)
Água
(%p/p)
1 80 10 10
2 70 20 10
3 70 10 20
4 60 30 10
5 60 20 20
6 60 10 30
7 50 40 10
8 50 30 20
9 50 20 30
10 50 10 40
11 40 50 10
Material e métodos
55
12 40 40 20
13 40 30 30
14 40 20 40
15 40 10 50
16 30 60 10
17 30 50 20
18 30 40 30
19 30 30 40
20 30 20 50
21 30 10 60
22 20 70 10
23 20 60 20
24 20 50 30
25 20 40 40
26 20 30 50
27 20 20 60
28 20 10 70
29 10 80 10
Material e métodos
56
30 10 70 20
31 10 60 30
32 10 50 40
33 10 40 50
34 10 30 60
35 10 20 70
36 10 10 80
Figura 08 - Diagrama de fases
4.2.4 - Determinação do tipo de emulsão
Material e métodos
57
Para avaliação do tipo de emulsão (A/O ou O/A) foi utilizado o teste de
diluição que consiste na determinação da solubilidade da fase externa da
emulsão em água (DAVIS, 1977). Foram adicionados 3 gramas da emulsão em
um tubo de ensaio contendo 7,0 mL de água destilada. Após agitação, o sistema
foi avaliado e classificado através do seguinte critério:
Emulsão O/A = quando a mistura apresentou-se com aspecto
homogêneo;
Emulsão A/O = quando a mistura apresentou-se com aspecto não
homogêneo, com aparência de mistura coagulada.
4.2.5- Avaliação de estabilidade
4.2.5.1 – Análise macroscópica
As formulações, após 24 horas do preparo, foram submetidas à
verificação do surgimento de sinais de instabilidade. Baseado no aspecto
macroscópico, foram classificadas em um dos seguintes padrões:
inalterado;
separação de fases.
4.2.5.2 - Análise microscópica
Sobre uma lâmina de vidro, foi colocada uma gota da formulação e cobriu-
se com lamínula. As amostras foram analisadas sob luz polarizada em um
microscópio Zeiss Scope A1 e as fotos obtidas com câmera AxioCam ICc3.
4.2.5.3 Teste de estresse térmico
Material e métodos
58
As amostras, em duplicata, foram submetidas ao aumento gradual de
temperatura em banho-maria termostatizado (Thermomix®18BU B.Braun
Biotech Internacional) e analisadas macroscopicamente quanto ao surgimento
de sinais de instabilidade. O teste iniciou-se em 40º e a cada 30 minutos, as
amostras eram analisadas e a temperatura era elevada em 5ºC. O procedimento
foi repetido até que a temperatura atingisse 80ºC.
4.2.5.4 Teste de centrifugação
Um grama de cada formulação foi colocado em microtubo e submetido a
ciclos de 10 minutos em três taxas de rotações (7500 RPM, 10000 RPM e 12500
RPM) em uma centrífuga Eppendorf 5415D. O teste foi realizado em duplicada
e ao final de cada ciclo as amostras eram analisadas macroscopicamente quanto
ao surgimento de sinais de instabilidade.
4.2.6 - Determinação do comportamento reológico
As determinações foram realizadas em Reômetro (Brookfield modelo
RVDV -III) tipo cone/placa, acoplado a um Software Rheocalc versão V 3.0,
utilizando o spindle CP51 e 1,0 g de amostra a 25°C. As medidas foram feitas
utilizando velocidade de rotação de 1 a 60 RPM, com variação em intervalo de
10 em 10 rpm, para se obter uma curva ascendente. O procedimento foi repetido
no sentido inverso, com velocidades progressivamente decrescentes (60-10
RPM), para se obter a curva descendente.
Material e métodos
59
4.2.7- Teste de liberação
4.2.7.1 - Diálise
Três gramas amostra da emulsão foram colocadas dentro de uma solução
tampão acetato (pH=5,5) contendo 5 % de PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides
(Labrasol®-Gateffosse). Dentro desta solução foram acomodadas as bolsas de
diálise constituídas por membrana de celulose (Dialysis tubing cellulose
membrane, Sigma-Aldrich) e contendo 2 mL da mesma solução citada
anteriormente. O sistema foi mantido a 37 ± 1°C por um banho-maria
termostatizado e sob agitação constante. Alíquotas de 1 mL do meio doador e
do saco de diálise foram coletadas a intervalos de tempos pré-determinados (0h,
0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 3h, 4h, 6h, 12h e 24h) e 1 mL de tampão foi adicionado ao
sistema em reposição a cada alíquota retirada. O conteúdo de fármaco foi
quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE e a
percentagem de liberação foi calculada pela relação entre a concentração de
princípio ativo dentro do saco de diálise e no meio doador.
4.2.7.2 – Quantificação do resveratrol
A quantificação da concentração de Revesratrol no teste de liberação foi
feita através de CLAE. Foram utilizadas condições estabelecidas pelo método
desenvolvido e validado por Nenem (2010) para dosagem de resveratrol.
Material e métodos
60
Fase móvel: Metanol : Água (47:53)
Fase estacionária: Coluna cromatográfica Nucleosil 100-5 (MACHEREY-
NAGEL, Duren, Alemanha) de octedecilsílica C18,
tamanho de partícula 3µm, dimensões 4,6X150mm
Fluxo: 1,0 mL/min
Detecção: UV 312 nm
Volume de injeção: 20 µL
Resultados e discussão
62
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 – Avaliação da atividade antioxidante do óleo de açaí in vitro
Para avaliar a atividade antioxidante do óleo de açaí, soluções com
diferentes concentrações foram utilizadas para a verificação de sua capacidade
de sequestro do radical DPPH•. Os resultados para as diferentes concentrações
do óleo de açaí são apresentados na Figura 09.
A correlação entre o percentual de inibição e a concentração de óleo de
açaí (y = 31,685ln(x) - 31,44) forneceu um IC50 de 13,06 mg/mL. Uma alta
atividade antioxidante é indicada por um baixo valor de IC50. O resultado
encontrado para o óleo de açaí é comparável ao valor encontrado para o óleo de
buriti (12,60 mg/mL), um óleo com potencial antioxidante previamente descrito
na literatura e com alta quantidade de substâncias como carotenoides e α-
tocoferol (ZANATTA et al., 2010).
O radical DPPH• possui coloração arroxeada e apresenta absorvância no
comprimento de onda de 517 nm, mas há uma diminuição desta absorvância
quando o radical reage com algum agente antioxidante. Informações sobre a
capacidade antioxidante de uma substância podem ser fornecidas relacionando
o decréscimo da absorvância da solução de DPPH• com o percentual de inibição
da substância sobre esse radical.
Resultados e discussão
63
Figura 9: Gráfico correlacionando o percentual de sequestro do radical DPPH•
a diferentes concentrações do óleo de açaí.
Existem outros métodos para caracterização in vitro de atividade
antioxidante que se baseiam na reação do material a ser testado com um radical.
Um destes é a utilização do radical monocátion ABTS•1 (2,29-azinobis-(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) que é originado pela oxidação do ABTS
com persulfato de potássio e reduzido na presença de algum antioxidante doador
de oxigênio, resultando em diminuição da absorvância da solução no
comprimento de onda de 752 nm.
O resultado do teste é baseado na comparação da absorvância resultante
após a reação com a amostra com uma curva de calibração (Figura 10) feita com
o padrão α-tocoferol, uma vitamina lipofílica com atividade antioxidante bem
descrita pela literatura (ACKER, VAN et al., 2000).
y = 31,685ln(x) - 31,44R² = 0,9911
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60
Pe
rce
ntu
al d
e in
ibiç
ão (
%)
Concentração do óleo de açaí (mg/mL)
Resultados e discussão
64
Após a realização do teste com o radical DPPH, foi realizada a avaliação
do potencial antioxidante do óleo de açaí através da inibição do radical ABTS•1,
visando a confirmação e melhor caracterização de possível mecanismo de ação
deste material.
A solução de ABTS•1 após incubação com óleo de açaí apresentou
absorvância resultante de 0,523, a qual representa 1882 miligramas equivalente
de tocoferol por quilo do óleo, calculada com a utilização da curva de calibração
(Figura 10). Esse valor é superior aos valores descritos na literatura para os
óleos de milho, oliva, semente de uva, amêndoas e de gergelim (DURMAZ,
2012).
Figura 10: Gráfico da curva de calibração com α-tocoferol no teste de
ABTS•1
.
Durante o processo de extração do óleo de açaí, as antocianinas não são
retidas na polpa, resultando em um óleo de coloração verde escura e não a cor
violácea característica do fruto do açaizeiro (PEREIRA, 2008). A atividade
antioxidante do óleo de açaí provavelmente está relacionada aos compostos
y = -0,0005x + 0,6671R² = 0,991
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 100 200 300 400 500 600
Ab
sorv
ânci
a
Concentração de α-tocoferol (mg/mL)
Curva de calibração
Resultados e discussão
65
polifenólicos presentes em sua composição como o ácido vanílico, ácido p-
hidrobenzóico e ácido siríngico. Os polifenóis são agentes redutores capazes de
doar um elétron de hidrogênio, ou seja, esses compostos tem a capacidade de
neutralizar espécies reativas (CITRIN, 2010). A incorporação do óleo de açaí em
uma formulação para uso tópico pode ser extremamente útil para a diminuição
da formação de radicais livres, reduzindo, desse modo, os danos causados pela
radiação.
5.2- Desenvolvimento da formulação
Para que haja a formação de uma emulsão, normalmente combinam-se
os seguintes componentes: óleo, água e tensoativo. E quando necessário,
utiliza-se um co-tensoativo. Uma forma de determinar esse sistema de
componentes é através do diagrama de fase pseudoternário, no qual as fases
aquosa, oleosa e a mistura de tensoativo/co-tensoativo são representadas nos
vértices de um triângulo. O desenvolvimento de emulsões seguindo o diagrama
de fases permite identificar qual a proporção dos componentes (óleo, água e
tensoativos) que resulta em melhor estabilidade ou a obtenção de sistemas com
características distintas, como emulsões com cristais líquidos (OLIVEIRA, 2004).
Para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 na proporção (80:20),
as formulações 4, 6, 9, 11, 14, 16, 22, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35 e 36 mantiveram-
se estáveis durante a análise macroscópica de 24 horas.
Na análise macroscópica após 24 horas para a combinação de
tensoativos Brij CS20 e Brij S2 (50:50), as formulações 6, 9, 10,11, 14,15, 16,
22, 26,27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35 e 36 mantiveram-se estáveis.
Resultados e discussão
66
As regiões do diagrama de fases que fornecem proporções de água,
tensoativo e óleo adequadas para a formação de emulsões estáveis para as
combinações de tensoativos utilizadas estão representadas na Figura 11 e na
Figura 12.
Figura 11 - Diagrama de fases para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij
O20 (80:20)
Resultados e discussão
67
Figura 12 - Diagrama de fases para a combinação de tensoativos Brij CS20 e
Brij S2 (50:50)
Quando dois líquidos imiscíveis são colocados em um mesmo sistema e
mantidos sob agitação constante, há a tendência de que um dos líquidos forme
gotículas e se disperse no outro. No entanto, quando essa agitação cessa, o
fenômeno observado é a coalescência das gotículas e a consequente separação
dos líquidos (OLIVEIRA, 2004).
Termodinamicamente, esse processo de emulsificação resulta em
aumento da área interfacial e consequentemente em aumento da energia livre,
tornando o sistema instável. Nesse aspecto, os tensoativos tem a função
fundamental na estabilização das emulsões, pois possuem a capacidade de
reduzir a tensão interfacial entre a fase aquosa e a fase oleosa (OLIVEIRA,
2004).
Resultados e discussão
68
A estabilidade de uma emulsão é determinada pelas propriedades da
camada de tensoativos formada na superfície das gotículas. Essas propriedades
são dependentes da composição e concentração dos tensoativos utilizados
(MORAIS, 2006).
As fotomicrografias na Figura 13 mostram os resultados da análise
microscópica com luz polarizada para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij
O20 na proporção (80:20) e a Figura 14 para a combinação de tensoativos Brij
CS20 e Brij S2 (50:50).
Resultados e discussão
69
Figura 13:Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a 36 com a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 (aumento 40 vezes).
q
Resultados e discussão
70
Figura 14: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a 36 com a
combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 (aumento 40 vezes)
Resultados e discussão
71
Os cristais líquidos quando ocorrem em emulsões podem ser detectados
por microscopia com luz polarizada, pois possuem a característica de serem
birrefrigentes (FRIBERG et al., 1987).
Através da análise microscópica sob luz polarizada foi possível constatar
que a combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 resulta em maior
quantidade de estruturas birrefringentes identificadas como cristais líquidos.
A maior presença de cristais líquidos é vantajosa devido à possibilidade
de estas estruturas aumentarem a estabilidade da emulsão pela prevenção de
processos como a coalescência (SANTOS, 2006). Outra vantagem é que a
presença de cristais líquidos pode aumentar a permeação percutânea de
substâncias encapsuladas na formulação (BRINON, 1999), permitindo que maior
quantidade do ativo atinja camadas mais profundas da pele.
As emulsões consideradas macroscopicamente estáveis foram
submetidas ao teste para determinação do tipo de emulsão, no qual foi
constatado que as emulsões 14, 33, 34, 35 e 36 de ambas as combinações de
tensoativos apresentaram-se como emulsões óleo em água. É descrito na
literatura que a aplicação tópica de emulsões O/A resulta em maior hidratação
da pele. Esse fato contribui para a diminuição de reações como eritema,
descamação e prurido (JENSEN, 2011).
Desse modo, as emulsões 35 e 36 da combinação de tensoativos Brij S2
e Brij CS20 (50:50) foram selecionadas para avaliação prévia de estabilidade na
qual os emulsões foram submetidas ao teste de centrifugação. E como resultado
observou-se que a formulação 35 possuiu características mais adequadas para
Resultados e discussão
72
a veiculação do principio ativo, devido ao fato de apresentar maior resistência as
taxas de rotação que a formulação 36.
Por fim, determinou-se utilização da formulação 35 da combinação de
tensoativos Brij S2 e Brij CS20, doravante denominada 35-S2CS20 para a
incorporação 1% de resveratrol. A formulação com a adição do ativo foi
denominada como 35R-S2CS20, e ambas foram submetidas aos testes de
estabilidade e caracterização.
Tabela 5 - Descrição dos componentes e suas respectivas proporções
nas formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20.
Componente 35-S2CS20 35R-S2CS20
Óleo de açaí 10% 10%
Brij S2 10% 10%
Brij CS20 10% 10%
Resveratrol - 1%
Água 70% 69%
5.3 - Avaliação da estabilidade
5.3.1 - Avaliação macroscópica
As formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 foram consideradas estáveis
na avaliação macroscópica, como pode ser observado na Figura 15.
Resultados e discussão
73
Figura 15- Fotografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 nos dias 1,
8, 15, 22 e 29.
Foi possível observar que as emulsões se mantiveram homogêneas,
viscosas e com a cor original ao longo do tempo, indicando que não houve
nenhum processo de instabilidade macroscopicamente detectável nesse
período.
Para que uma emulsão seja considerada estável é necessário que ela
mantenha, dentro de limites pré-estabelecidos, a integridade química, físico-
química e microbiológica de todos os seus componentes.
A perda de estabilidade físico-química pode se manifestar através dos
seguintes processos:
Cremeação: processo no qual devido a diferença de densidade entre os
líquidos ocorre migração dos glóbulos, resultando em heterogenicidade
da distribuição dos mesmos pela fase dispersante.
Floculação: processo no qual o filme interfacial se mantém intacto, porém
há agregação dos glóbulos formando aglomerados.
Resultados e discussão
74
Coalescência: processo onde há junção de dois ou mais glóbulos,
formando uma gotícula maior. Esse fato resulta em separação irreversível
da emulsão em duas fases distintas (BOOCK, 2007).
Perda de estabilidade pode resultar em mudanças no aspecto da formulação,
diminuição da atividade terapêutica ou a formação de compostos tóxicos,
irritantes ou indesejáveis.
5.3.2 - Análise Microscópica
As formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 foram analisadas através de
microscopia sob luz polarizada e os resultados estão demonstrados na Figura
16.
Não foi observada diferença entre o perfil microscópico da formulação
com resveratrol e sem resveratrol, indicando que o ativo na concentração
utilizada não interfere no processo de formação dos cristais líquidos. Além
disso, ambas as formulações mantiveram a mesma distribuição e tamanho dos
cristais líquidos do primeiro ao vigésimo nono dia, demonstrando, que não
ocorreram alterações químicas ou físicas que poderiam alterar a estrutura dos
cristais líquidos formados.
Os cristais líquidos possuem a propriedade de alterar o plano de
polarização da luz quando esta os atravessa. Essa característica física é
denominada anisotropia óptica ou birrefringência. Desse modo, quando uma fina
camada de cristal líquido é observada entre polarizadores cruzados, é possível
visualizar diferentes padrões de cores e formas (ECCHER, 2010).
Resultados e discussão
75
Figura 16 - Fotomicrografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 nos dias 1, 8, 15, 22 e 29
Dia 1
Dia 8
Dia 15
Dia 22
Dia 29
35-S2CS20 35R-S2CS20
Resultados e discussão
76
5.3.3 - Teste de centrifugação
Na tabela 6 estão demonstrados os dados do teste de
centrifugação para as formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 ao longo do
tempo.
Tabela 6 - Resultados de centrifugação
Sem resveratrol Com resveratrol
7500
RPM
10.000
RPM
12.500
RPM
7500
RPM
10.000
RPM
12.500
RPM
Dia 1 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt
Dia 8 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt
Dia 15 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt
Dia 22 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt
Dia 29 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt
Em um teste de centrifugação, as amostras são submetidas a forças
gravitacionais muito mais elevadas que a força exercida pela gravidade em
condições normais. Consequentemente, possíveis processos de instabilidade
são acelerados e se tornam perceptíveis em um menor tempo (ANDRADE,
2008). Desse modo, pode-se estimar o comportamento das emulsões a longo
prazo com base do comportamento destas após ciclos de centrifugação
(TADROS, 2007).
Resultados e discussão
77
Ambas as formulações mantiveram-se estáveis ao longo do tempo
mesmo quando submetidas a rotações de 12500 RPM. Esse fato indica que as
formulações são fisicamente estáveis. Esse dado é condizente com dados da
literatura para formulações com cristais líquidos, pois o aumento da viscosidade
proporcionado pela presença destas estruturas diminui a ocorrência de
processos de instabilidade (ANDRADE, 2008).
5.3.4- Teste de estresse térmico
Foram notadas perda de viscosidade a partir da faixa de 60 ºC e
separação de fases na faixa de 65 ºC quando submetidas ao teste de estresse
térmico para as formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20, como pode ser
observado na Tabela 7. Isto indica que a presença do resveratrol na formulação
não acelera processos de instabilidade gerados pelo aumento de temperatura.
O aumento da temperatura é capaz de provocar processos de
instabilidade numa emulsão, devido à diminuição da viscosidade aparente da
fase dispersante. Essa perda de viscosidade aumenta a motilidade cinética das
partículas presentes no meio, favorecendo o processo de coalescência e
cremeação (AUTON, 2005).
Resultados e discussão
78
Tabela 7 - Resultados do teste de estresse térmico
35-S2CS20 35R-S2CS20
40ºC 45ºC 50ºC 55ºC 60ºC 65ºC 40ºC 45ºC 50ºC 55ºC 60ºC 65ºC
Dia
1
Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep
Dia
8
Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep
Dia
15
Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep
Dia
22
Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep
Dia
29
Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep
Legenda: Inalt = inalterado, pv= perda de viscosidade e sep= separação de fases
A perda de viscosidade e a separação de fases nas emulsões desse
estudo podem ser explicadas pela ocorrência de transição de fases dos cristais
líquidos presentes na formulação. Antes dessa faixa de temperatura, a principal
responsável pela estabilidade é a presença de uma rede liquido-cristalina que
forma uma barreira contra a coalescência dos glóbulos da fase oleosa.
Entretanto, é descrito que os cristais líquidos desaparecem em temperaturas
superiores a essa faixa devido a processo de transição de fases (fusão). Deste
modo, as emulsões ficam mais propensas a sofrerem processos de instabilidade
como a coalescência (SANTOS, 2007).
5.3.5 - Análise do comportamento reológico
De uma maneira geral, a reologia pode ser definida como a ciência que
estuda o escoamento da matéria. As propriedades reológicas de uma substância
Resultados e discussão
79
têm forte impacto nos processos de produção, transporte, armazenamento e nas
ações de enchimento e retirada do material da embalagem (MILAN, 2007).
Outro fator importante é a aceitação do produto, pois características como
espalhabilidade, textura, consistência e oleosidade exercem uma ampla
influência na preferência dos pacientes. Ainda deve-se levar em conta que essas
propriedades refletem na aderência, fator importante para que a formulação se
mantenha sobre a pele tempo suficiente para exercer efeito terapêutico ou
cosmético (MILAN, 2007).
A viscosidade também exerce influência na estabilidade física do sistema.
Uma maior viscosidade pode contribuir para que fenômenos como cremeação,
coalescência, floculação e sedimentação ocorram em menor grau, visto que
haverá uma maior resistência física à movimentação das partículas
proporcionada pelo sistema emulsionado (GOTO, 2011).
Com o teste de reologia, tem-se a intenção de observar ao longo do tempo
possíveis variações na viscosidade da formulação que poderiam indicar
processos de instabilidade ou degradação. E, além disso, caracterizar a emulsão
quando as suas propriedades de escoamento.
Na figura 17, são demonstrados os gráficos resultantes desse estudo.
Resultados e discussão
80
Figura 17 - Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20
35R-S2CS20
35-S2CS20
Dia 1
Dia 8
Dia 15
Dia 22
Dia 29
a b
a
c d
c
e f
g h
i j
Resultados e discussão
81
Observa-se que ambas as formulações apresentam perfis reológicos
semelhantes, indicando que a presença do resveratrol não induz processos de
instabilidade que resultam em alterações da viscosidade nesse sistema
emulsionado.
A viscosidade aparente diminui em função taxa de cisalhamento,
caracterizando perfil não-newtoniano das emulsões testadas. Fluidos não-
newtonianos são aqueles que sob temperatura e composição constantes
apresentam viscosidade aparente dependente da taxa de cisalhamento ou
tensão de cisalhamento (SILVA, 2011).
As formulações apresentaram comportamento pseudoplástico. Esse
comportamento é adequado para o uso tópico, pois promove maior facilidade de
aplicação. O cisalhamento causado durante aplicação resulta em diminuição da
viscosidade, permitindo melhor fluidez e consequentemente uma aplicação mais
homogênea e agradável.
Foi constatada a presença de tixotropia em ambas as formulações. A
tixotropia é uma alteração da viscosidade em função do tempo de deformação,
ou seja, cisalhamento aplicado ao fluido. Essa alteração é percebida como perda
de viscosidade do sistema. Caracteriza-se como um fenômeno reversível, pois
ocorre aumento da viscosidade quando se cessa a deformação, porém não se
recupera completamente seu estado inicial (ALMEIDA & BAHIA, 2003).
Formulações que apresentam tixotropia se tornam menos viscosas
quando sofrem pressão externa, consequentemente irão se espalhar mais
facilmente durante a aplicação. E a posterior recuperação da viscosidade no
Resultados e discussão
82
momento em que é finalizada a aplicação impede que a formulação escorra
durante o procedimento(MILAN, 2007).
5.4 - Avaliação do perfil de liberação da formulação
A emulsão 35R-S2CS20 foi submetida ao estudo do perfil de liberação do
resveratrol a partir da formulação.
Figura 18 - Curva de calibração do resveratrol
y = 153475x + 290821R² = 0,9992
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
160000000
180000000
0 200 400 600 800 1000 1200
Curva de calibração do resveratrol
Resultados e discussão
83
Figura 19: Gráfico de liberação do resveratrol por diálise inversa ao longo de
24 horas.
A emulsão com resveratrol apresentou perfil que atinge 25% do ativo
liberado em 6h e a partir de 12h todo o ativo já se encontrava livre. Para se obter
a eficácia da radioproteção, é necessário que os agentes radioprotetores
estejam livres e presentes no interior das células no momento ou logo após a
irradiação, pois o mecanismo de ação desses compostos é a captura dos
radicais livres presentes no meio celular (MORENO, 2009).
A quantidade de fármaco disponível para atingir os sítios alvos tem
relação direta com o processo de liberação do fármaco da formulação. Esse
processo, denominado cedência ou liberação, depende das características
físico-químicas do veículo utilizado e do modo de preparo da formulação. Desta
forma, é fundamental a avaliação desse parâmetro em um produto destinado a
uso dermatológico.
Apesar da alta incidência de radiodermatites não existe protocolo definido
para o tratamento e prevenção dos sinais e sintomas dessa doença. Resultando
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 5 10 15 20 25
Liberação
Resultados e discussão
84
muitas vezes em desconforto para o paciente, aumento nos custo e interrupção
do tratamento. Desse modo, faz-se necessário o desenvolvimento de uma
formulação para utilização tópica que diminua as consequências da exposição
da pele a radiação ionizante. Nesse contexto, foi possível obter uma emulsão
estável constituída por óleo de açaí e contendo cristais líquidos que devido às
características intrínsecas da emulsão e o poder antioxidante do óleo de açaí
tem o potencial para exercer efeito hidratante e a diminuição da formação de
radicais livres.
6 - CONCLUSÃO
O óleo de açaí possui relevante atividade antioxidante
As emulsões com os tensoativos Brij S2 e Brij CS20 apresentaram maior
quantidade de cristais líquidos que as formulações com a combinação de
tensoativos Brij O3 e Brij O20.
A incorporação do resveratrol na emulsão 35-S2CS20 não resultou em
perda de estabilidade ou diminuição na formação dos cristais líquidos.
As emulsões 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 mantiveram-se o mesmo perfil
de estabilidade nos testes de centrifugação, estresse térmico, análise
macroscópica e análise microscópica ao longo de 28 dias.
A partir de 12h o resveratrol já encontra-se totalmente livre da formulação
35R-S2CS20 no teste de liberação in vitro.
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