DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDAS DOS PRINCIPAIS CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM FÁRMACOS
POR ESPETROSCOPIA DE INFRAVERMELHO
Joana Anjos Ferreira Dissertação para obtenção do grau de mestre em Engenharia Farmacêutica
Orientador: Professor Doutor João Almeida Lopes, Faculdade de Farmácia Co-orientadora: Sofia Queirós, Generis Farmacêutica SA
Lisboa, 7 de Março de 2017
FACULDADE DE FARMÁCIA UNIVERSIDADE DE LISBOA
DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDAS DOS PRINCIPAIS CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM FÁRMACOS
POR ESPETROSCOPIA DE INFRAVERMELHO
Joana Anjos Ferreira Dissertação para obtenção do grau de mestre em Engenharia Farmacêutica
Orientador: Professor Doutor João Almeida Lopes, Faculdade de Farmácia Co-orientadora: Sofia Queirós, Generis Farmacêutica SA
Lisboa, 7 de Março de 2017
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
1
Resumo
A espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com refletância total
atenuada (FTIR-ATR) combinada com a análise multivariada de dados tem vindo a ser
proposta como um método para a discriminação de bactérias patogénicas a diferentes níveis
taxonómicos (p.e., espécie, sub-espécie e serotipo). O controlo microbiológico na indústria
farmacêutica é um fator extremamente importante para garantir a segurança e eficácia de um
medicamento. Durante a análise microbiológica de um produto, pode observar-se crescimento
de microrganismos provenientes de várias fontes e é necessário assegurar a qualidade do
produto fazendo a sua deteção e identificação. O principal objetivo deste trabalho é avaliar o
potencial da espetroscopia FTIR-ATR combinada com técnicas quimiométricas para diminuir
o tempo de identificação de microrganismos em medicamentos (formas sólidas). Esta
metodologia foi testada com Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa. Foram utilizados 52 isolados destas bactérias recolhidos do ambiente e de
fármacos não estéreis. Estes foram identificados pelo método VITEK implementado na
Generis Farmacêutica SA e em seguida analisados por FTIR-ATR. Após o tratamento
espectral foram construidos modelos de análise de componentes principais (PCA) e mínimos
quadrados parciais de tipologia discriminante (PLS-DA). O método FTIR-ATR permitiu
distinguir corretamente bactérias gram-negativas de gram-positivas, assim como discriminar
espécies do género Staphylococcus. Quanto ao género Pseudomonas, apesar de se ter
considerado um número muito reduzido de isolados, foi possível identificar o correto
agrupamento de cada espécie nos modelos PCA e de agrupamento hierárquico. Relativamente
ao género Escherichia, não se verificou a presença de microrganismos correspondentes. Dos
dois grupos de microrganismos em estudo (Staphylococcus e Pseudomonas) foi possível
observar agrupamentos correspondentes aos principais contaminantes patogénicos. Este
resultado confirma o potencial do método FTIR-ATR neste campo de utilização mostrando a
sua aplicabilidade num laboratório microbiológico de um laboratório farmacêutico.
Palavras-chave: FTIR-ATR; contaminação microbiológica; Staphylococcus; VITEK; análise
multivariada.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
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Abstract
Attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy combined
with multivariate data analysis has been proposed as a taxonomic method used to classify and
distinguish pathogenic bacteria at multiple levels (for example, species, subspecies and
serotype). The microbial contamination control in the pharmaceutical industry is a key factor
to be considered in order to assure the safety and efficacy of a drug. During microbiological
analysis of a drug, the growth of several microorganisms can be observed. Therefore it is
crucial their identification and classification to safeguard the quality of the product. The aim
of this work is to propose and describe a fastest method based on FTIR spectroscopy and
chemometric techniques to be used in the microbiological analysis of a drug (solid form).
This methodology was applied to distinguish different microorganisms, namely Escherichia
coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The fifty-two bacterial isolates
used in this methodology were collected from the environment and from the microbiological
analysis of non-sterile drugs. They were identified according to the reference method
(VITEK) used in Generis Farmacêutica SA, and the spectral analysis of each isolate was
performed by ATR-FTIR spectroscopy. PCA and PLS-DA models were correspondingly
constructed, and the two methods were compared. The results obtained revealed that both
methods are in agreement. The FTIR method correctly distinguished gram-negative from
gram-positive bacteria. It was also able to distinguish species belonging to the Staphylococcus
genus. Regarding the Pseudomonas genus although it was considered a reduced number of
samples, it was possible to identified accurately group each species when performing the PCA
and HCA analysis. Concerning the Escherichia genus, no microorganisms were found. For
the two groups of microorganisms considered in this study, well-defined clusters of the main
pathogens were identified: S.aureus and P.aerugionosa. Overall, the results of this study
demonstrate that ATR-FTIR spectroscopy combined with chemometrics serves as a valid
method to be considered in a microbial laboratory of a pharmaceutical company.
Key-words: FTIR-ATR; microbiological contamination, Staphylococcus; VITEK;
multivariate analysis
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
3
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta
para a realização desta dissertação.
Ao meu orientador, Professor Doutor João Almeida Lopes pela orientação e conselhos
prestados para a realização desta dissertação e por mostrar sempre disponibilidade.
À Dr.ª Sofia Queirós e à Generis por aceitarem este projeto e me disponibilizarem
todos os meios para o realizar.
Um agradecimento especial à Ana Paula Grancho cuja ajuda foi imprescindível e por
sempre se mostrar disponível para ajudar no que fosse preciso.
À Dr.ª Madalena Pimentel pelo apoio e acompanhamento demonstrado.
À Dr.ª Clara Sousa pelo tempo disponibilizado para esclarecer as dúvidas encontradas
desde o início deste projeto.
À Bárbara cujos conselhos e disponibilidade foram uma mais-valia ao longo de todo o
trabalho.
Ao meu irmão e aos meus pais cujo apoio foi fundamental a todos os níveis. Sem eles
não teria sido possível.
Aos meus amigos Alexandra, Maria e Marcelo por todo apoio e ajuda neste trabalho,
como em todos os momentos da minha vida.
Ao Paulo por toda a paciência, pelo apoio incondicional e por nunca me deixar
desanimar.
Por fim, resta-me agradecer a todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a
realização desta dissertação e para terminar esta etapa da minha vida.
Muito obrigada!
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
4
Índice
1. Introdução ........................................................................................................................... 9
1.1. Análise microbiológica de produtos não estéreis ....................................................... 9
1.2. Microrganismos relevantes ...................................................................................... 10
1.2.1. Enterobacteriaceae .............................................................................................. 10
1.2.2. Pseudomonas ........................................................................................................ 11
1.2.3. Staphylococcus ..................................................................................................... 11
1.3. Identificação de contaminantes microbiológicos ..................................................... 13
1.3.1. Métodos moleculares/biológicos .......................................................................... 13
1.3.2. Métodos bioquímicos ........................................................................................... 13
1.3.3. Métodos espetroscópicos ...................................................................................... 16
1.3.4. FTIR - ATR para identificação de microrganismos ............................................. 19
1.4. Análise Multivariada ................................................................................................ 22
1.4.1. Pré-processamento espetral .................................................................................. 22
1.4.2. Técnicas quimiométricas ...................................................................................... 24
2. Revisão da literatura ......................................................................................................... 28
3. Objetivos .......................................................................................................................... 29
4. Materiais e métodos ......................................................................................................... 30
4.1. Isolados ..................................................................................................................... 30
4.2. Análises espetroscópicas .......................................................................................... 33
5. Resultados e discussão ..................................................................................................... 35
5.1. Avaliação dos resultados pelo método VITEK ........................................................ 35
5.2. Discriminação pelo método FTIR ............................................................................ 36
5.2.1. Distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos ....................... 38
5.2.2. Distinção de microrganismos do género Pseudomonas ....................................... 42
5.2.3. Distinção de microrganismos do género Staphylococcus .................................... 44
6. Conclusões e perspetivas futuras ...................................................................................... 62
Referências ............................................................................................................................... 64
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
5
Índice de Figuras
Figura 1. Kits que incluem 20 testes bioquímicos (adaptado de (39)). .................................... 14
Figura 2. Carta de identificação gram-positiva para o VITEK (adaptado de (41)). ................. 15
Figura 3. Sistema VITEK adaptado de (41). ............................................................................ 15
Figura 4. Esquema de um espetrómetro com interferómetro: F - Fonte de radiação IV; D -
Divisor de feixe; E1 - Espelho fixo; E2 - Espelho móvel (Adaptado (52)). .............................. 17
Figura 5. Esquema de um cristal para refletância total atenuada (ATR) (Adaptado (56)). ...... 18
Figura 6. Espetro FTIR representativo de bactérias com respetiva identificação das principais
bandas (Adaptado de (64)). ...................................................................................................... 22
Figura 7. Ilustração do método de PCA (adaptado de ((74)). .................................................. 24
Figura 8. Ilustração de um modelo de PLS-DA com três classes em que o i é o número de
amostras e o j o número de variáveis (Adaptado de (78)). ....................................................... 27
Figura 9. Espetros FTIR-ATR dos microrganismos padrão (E. coli, S. aureus e P. aeruginosa)
sem pré-processamento. ........................................................................................................... 37
Figura 10. Espetros dos microrganismos padrão de E. coli, P. aerugionosa e S. aureus pré-
processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2) na região 1500-900 cm-1. ........................................ 38
Figura 11. Representação gráfica da variância capturada com o aumento do número de CPs.38
Figura 12. Mapa de scores dos dois componentes principais do modelo PCA de todos os
microrganismos em que a vermelho estão representados os gram-negativos e a verde os gram-
positivos de acordo com a informação dada pelo VITEK. ...................................................... 39
Figura 13.Mapa de scores do modelo de PCA de todos os microrganismos após eliminar
aswa02 e asxy02 ( modelo construído com 5 CPs). ................................................................. 40
Figura 14. Representação da estatística de Hotelling’s T2 do modelo de PCA de todos os
espetros. .................................................................................................................................... 40
Figura 15. Representação da estatística de resíduos do modelo de PCA de todos os espetros.
.................................................................................................................................................. 41
Figura 16. Dendrograma feito com os todos os espetros onde estão representados os
microrganismos gram-positivos a verde e os microrganismos gram-negativos a vermelho. ... 41
Figura 17. Mapa de scores da família Pseudomonas em que estão representados os CPs 1, 2 e
5. ............................................................................................................................................... 42
Figura 18. Representação da estatística de resíduos para o modelo PCA das Pseudomonas. . 42
Figura 19. Representação da estatística de Hotelling’s T2 para o modelo de PCA do género
Pseudomonas. ........................................................................................................................... 43
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
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Figura 20. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao
género Pseudomonas (foram usados 6 CPs). ........................................................................... 43
Figura 21. Variância capturada em função do número de CPs para o modelo PCA dos
espetros de Staphylococcus. ..................................................................................................... 44
Figura 22. Mapa de scores de todos os espetros de Staphylococcus com representação do 1º e
2º CPs. ...................................................................................................................................... 45
Figura 23. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 2º
CP. ............................................................................................................................................ 46
Figura 24. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 3º
CP. ............................................................................................................................................ 46
Figura 25. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de 3 isolados diferentes: S. aureus
(vermelho), S. capitis (azul) e S. auricularis (verde). Espetros pré-processados com SNV e
Sav-Gol (9,2,2). ........................................................................................................................ 47
Figura 26. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PCA
do género Staphylococcus. ....................................................................................................... 48
Figura 27. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao
género Staphylococcus (foram usados 10 CPs). ...................................................................... 48
Figura 28. Representação gráfica da percentagem de erro da validação cruzada em função do
número de variáveis latentes. ................................................................................................... 49
Figura 29. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS dos Staphylococcus. 50
Figura 30. Estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA dos
Staphylococcus. ........................................................................................................................ 51
Figura 31. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de isolados de S. warneri (verde, rosa,
preto e azul), comparado com o S. capitis (05)(vermelho). Espetros pré-processados com
SNV e Sav-Gol (9,2,2). ............................................................................................................ 52
Figura 32. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS-DA de Staphylococcus.
.................................................................................................................................................. 53
Figura 33. Mapa tridimensional de scores com as variáveis latentes 1,2 e 3 para o modelo
PLS-DA de Staphylococcus. .................................................................................................... 54
Figura 34. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-
DA de Staphylococcus. ............................................................................................................ 55
Figura 35. Mapa de scores do modelo PLS-DA de previsão com os dados de teste (SA01). .. 55
Figura 36. Previsão da amostra de teste SA01 como membro da classe de S. aureus. ............ 56
Figura 37. Previsão da classe da amostra para pssc02. ............................................................ 57
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
7
Figura 38. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra pssc02. .................... 57
Figura 39. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e dos resíduos com a projeção da
amostra desconhecida (pssc02). ............................................................................................... 58
Figura 40. Previsão da classe da amostra para pssc01. ............................................................ 58
Figura 41. Previsão da classe da amostra para aslt01. ............................................................. 59
Figura 42. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra aslt01. ...................... 59
Figura 43. Previsão da classe da amostra para psvt02. ............................................................ 60
Figura 44. Previsão restrita da classe da amostra para asxy02. ................................................ 60
Figura 45. Probabilidade de previsão da classe de S. xylosus para o isolado asxy02. ............. 61
Índice de Tabelas Tabela 1. Turbidez para preparação dos inóculos. ................................................................... 15
Tabela 2. Atribuição do número de onda ao grupo funcional existente nas células microbianas
(adaptado(61)). ......................................................................................................................... 20
Tabela 3. Revisão dos estudos publicados recentemente sobre identificação e discriminação
de m.o. com o uso de espetroscopia. DA: análise discriminante; CVA: análise canónica
variada; PAS: espetroscopia foto-acústica; CA: análise de clusters; SOM: (self-organized
maps) mapas auto-organizados; KNN: (K-nearest neighbor); ANN: redes neuronais artificiais.
.................................................................................................................................................. 28
Tabela 4: Codificação e origem dos isolados utilizados neste estudo. ..................................... 31
Tabela 5.Resultados das identificações dos isolados utilizados neste estudo pelo método
VITEK. ..................................................................................................................................... 36
Tabela 6. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus lentus. 51
Tabela 7. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus capitis. 52
Tabela 8. Estatísticas para cada classe do modelo PLS-DA de Staphylococcus. ..................... 54
Tabela 9. Resumo dos resultados do VITEK e da previsão pelo modelo PLS-DA das amostras
utilizadas para testar o modelo. ................................................................................................ 61
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
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Abreviaturas ANN - Redes neuronais artificiais
API - Princípio ativo
ATR - Refletância total atenuada
CA - Análise de agrupamentos
CPs - Componentes principais
CVA - Análise canónica variada
DA - Análise discriminante
DNA - Ácido desoxirribonucleico
EP - Farmacopeia Europeia
FP - Farmacopeia Portuguesa
FTIR - Espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
GMP - Good Manufacturing Practices
HCA - Agrupamento hierárquico
IV - Radiação de infravermelho
KNN - K-nearest neighbors
m.o.- microrganismo
MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight
MRSA - Staphylococcus aureus resistentes à meticilina
MSC - Correção multiplicativa de sinal
NID – Não identificado
PAS - Espetroscopia foto-acústica
PCA - Análise de componentes principais
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PFGE – Eletroforese em gel de campo pulsado
PLS-DA - Regressão por mínimos quadrados parciais - discriminante
RNA - Ácido ribonucleico
Sav-Gol - Filtro de Savitzky-Golay
SNV- Variação de padrão normal
SOM - Mapa auto-organizativo
TAMC - Contagem de microrganismos aeróbios
TYMC - Contagem de fungos e leveduras
UFC - Unidades formadoras de colónias
USP - Farmacopeia Americana
UV - Radiação ultravioleta
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
9
1. Introdução
1.1. Análise microbiológica de produtos não estéreis
Na indústria farmacêutica, a análise microbiológica de medicamentos é uma das
etapas que garante a qualidade do produto final. Os fabricantes têm de garantir uma baixa
carga microbiana no produto acabado, sendo para isso necessária a implementação de boas
práticas de fabrico (Good Manufacturing Practices - cGMP). Estas práticas aplicam-se aos
procedimentos de produção, embalagem e distribuição dos fármacos. Deste modo, é
fundamental a análise microbiológica de matérias-primas, produtos a granel e produto
acabado, bem como da água purificada. A monitorização ambiental das áreas de produção e
embalagem são também um fator de grande importância na qualidade dos medicamentos(1–3).
Os métodos utilizados e os resultados obtidos devem estar em conformidade com as
especificações e critérios descritos na Farmacopeia Europeia (EP). As análises realizadas em
matérias-primas, produto a granel e produto acabado, envolvem contagem de microrganismos
aeróbios totais (TAMC) e contagem de leveduras e fungos totais (TYMC). Estas contagens
são expressas em unidades formadoras de colónias (UFC). Para além das análises referidas
anteriormente, são feitas pesquisas a microrganismos específicos, que variam consoante a
natureza das matérias-primas utilizadas e o método de produção. Normalmente os
microrganismos (m.o.) específicos em estudo, na análise de produtos não estéreis, são
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, e bactérias
gram-negativas tolerantes à bílis(4,5).
A comprovação da qualidade microbiológica de medicamentos existentes no mercado
nacional é avaliada pela autoridade reguladora portuguesa (INFARMED). As indústrias
farmacêuticas submetem ao INFARMED um dossier de Autorização de Introdução de
Mercado (AIM) para cada produto, onde estão estabelecidas as especificações de análise.
Estas podem variar consoante a natureza das matérias-primas utilizadas, o método de
produção estabelecido, as caraterísticas da substância ativa, a via de administração, a
população alvo, a indicação terapêutica e a duração do tratamento(6). Cada laboratório
farmacêutico rege-se pela AIM de cada medicamento para proceder à análise dos mesmos,
sendo as especificações mais frequentes, para produtos sólidos não estéreis, as seguintes(7):
-‐ TAMC < 103 UFC/g;
-‐ TYMC < 102 UFC/g;
-‐ Ausência de Escherichia coli verificada em 1 g;
-‐ Ausência de Staphylococcus aureus verificada em 1 g;
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
10
-‐ Ausência de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1 g;
-‐ Ausência de Salmonella verificada em 1 g;
-‐ Bactérias gram-negativas tolerantes à bílis < 100 UFC/g. Os critérios de aceitação devem ser interpretados da seguinte forma(7):
• 101 UFC: Contagem máxima aceitável = 20 UFC
• 102 UFC: Contagem máxima aceitável = 200 UFC
• 103 UFC: Contagem máxima aceitável = 2000 UFC
A avaliação microbiológica de produtos não estéreis é particularmente pertinente, uma
vez que a contaminação microbiana pode reduzir ou mesmo eliminar o efeito terapêutico dos
fármacos ou causar infeções induzidas pelos mesmos. Além destes fatores, a contaminação
microbiológica pode alterar as propriedades químicas, físicas e organoléticas dos fármacos,
ou alterar o conteúdo em substância ativa(8-10).
1.2. Microrganismos relevantes
1.2.1. Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae é uma família de bactérias gram-negativas muito abundante, com
uma grande variedade de organismos patogénicos. Os indivíduos da família
Enterobacteriaceae são bastante conhecidos, pertencendo alguns à flora intestinal de seres
humanos e animais, outros ao solo ou à água(11,12).
Escherichia coli (E. coli) é uma das bactérias com maior patogenicidade da família
Enterobacteriaceae. São bactérias anaeróbias facultativas em forma de bastonete e a maioria
colonizam o trato gastrointestinal dos seres humanos e animais(13). Existem diferentes estirpes
patogénicas de E. coli e a sensibilidade destas estirpes a antibióticos varia amplamente. Os
organismos gram-negativos por si só são bastante resistentes a antibióticos, quando
comparados com os organismos gram-positivos. Os antibióticos que podem ser utilizados no
tratamento de infecção por E. coli incluem a amoxicilina, penicilinas semi-sintéticas,
cefalosporinas, ciprofloxacina e nitrofurantoína(16,17). O uso excessivo de antibióticos em
seres humanos ou como promotores de crescimento em alimentos para animais torna a
resistência aos antibióticos um problema crescente. A E. coli, por exemplo tem uma taxa de
mutações adaptativas muito elevada o que torna este microrganismo muito preocupante em
caso de contaminação(16).
O género Salmonella também faz parte da família das Enterobacteriaceae. Este
género é composto por três espécies: Salmonella subterranea, Salmonella bongori e
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
11
Salmonella enterica(17,18). Uma infeção por Salmonella enterica pode provocar salmonelose,
que varia clinicamente da gastroenterite comum de Salmonella (diarreia, cólicas abdominais e
febre) a febres entéricas (incluindo febre tifóide) que são doenças sistémicas febris com risco
de vida que requerem administração de antibióticos(19). Um número crescente de estirpes
multirresistentes de Salmonella apresenta uma suscetibilidade diminuída a alguns antibióticos
como a ciprofloxacina, com falhas de tratamento concomitantes(20).
1.2.2. Pseudomonas
As espécies do género Pseudomonas são bacilos aeróbios gram-negativos contendo
mais de 140 espécies, em que cerca de 25 estão associadas a seres humanos. Estas incluem P.
aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. stutzeri, P. maltophilia e P. putrefaciens.
As bactérias são encontradas principalmente no ambiente, como no solo, água e plantas.
Apenas algumas das muitas espécies causam doenças, sendo a mais comum a Pseudomonas
aeruginosa(21). Infeções por Pseudomonas são frequentemente reconhecidas em hospitais
através das mãos dos técnicos de saúde ou por equipamentos hospitalares. As infeções por
Pseudomonas são consideradas infeções oportunistas, o que significa que estas bactérias
provocam doenças quando o sistema imunológico está comprometido. O aumento da
resistência a antibióticos de bactérias do género Pseudomonas tornou o tratamento das
infeções muito mais desafiante(21,22).
1.2.3. Staphylococcus
O género Staphylococcus é constituído por 39 espécies, incluindo 21 sub-espécies. É
caracterizado por m.o. de células esféricas gram-positivas, não esporoladas, com cocos
isolados, em pares ou em correntes curtas, formando assim grupos irregulares(23). O
metabolismo desta família é respiratório e fermentativo e a parede celular destas bactérias
contém peptidoglicano e ácido teicoico(24). Os principais habitats da maioria das espécies de
Staphylococcus são a pele e as membranas mucosas dos mamíferos e aves. S. aureus é
considerado o patogeno humano mais importante entre os Staphylococcus. Outras espécies
comuns deste género são: S. epidermidis, S. haemolyticus e S. saprophyticus. S. auricularis,
S. capitis ssp. capitis e urealyticus, S. caprae, S. cohnii ssp. cohnii e S. urealyticus, S. hominis
ssp. hominis, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. pettenkoferi, S. saccharolyticus, S. schleiferi
subsp. schleiferi, S. simiae, S. simulans, S. warneri e S. xylosus(25). As espécies do género
Staphylococcus podem ser diferenciadas pela coagulase. A atividade desta enzima é utilizada
para distinguir espécies patogénicas de Staphylococcus de espécies não patogénicas, sendo
um bom indicador da patogenicidade do S. aureus. Exemplos de espécies coagulase-positiva
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
12
são S. aureus, S. delphini e S. lutrae. A maior parte das restantes espécies de Staphylococcus
são coagulase-negativa, como é o caso do S. epidermidis que é a espécie encontrada mais
frequentemente em seres humanos. Staphylococcus aureus é um agente patogénico virulento
sendo atualmente a causa mais comum de infeções em doentes hospitalizados. Uma infeção
por S. aureus pode envolver qualquer sistema de órgãos e tem uma grande capacidade de
causar uma vasta gama de infeções(26). Colonizam-se à superfície do corpo, particularmente
em áreas húmidas como axilas, área inguinal e narinas. A colonização nasal desempenha um
papel crucial como fonte de infeções invasivas desta espécie, uma vez que através das
cavidades nasais pode ser transferido para a pele e para outras áreas do corpo. Os
profissionais de saúde têm uma elevada taxa de transporte nasal de S. aureus (50% a 90%),
assim como os doentes com diabetes, os doentes que recebem hemodiálise a longo prazo e os
utilizadores de fármacos por via intravenosa(27). Nas instalações de cuidados de saúde, as
estirpes de S. aureus são transmitidas de um paciente para o outro, principalmente pelos
profissionais de saúde. Isto é de extrema importância para a transmissão de S. aureus
resistentes à meticilina (MRSA). Os profissionais de saúde infetados podem servir como um
reservatório(28,29). S. auricularis faz parte da flora do canal auditivo externo humano e
coloniza exclusivamente esta região. O S. capitis é encontrado em torno das glândulas
sebáceas na testa e couro cabeludo após a puberdade. S. haemolyticus e S. hominis são
preferencialmente isolados de axilas e áreas púbicas ricas em glândulas apócrinas. S.
saprophyticus ssp. saprophyticus coloniza frequentemente o reto e o trato genital de mulheres
adolescentes(25,30,31). S. lugdunensis é frequentemente encontrado nas extremidades inferiores
e nas virilhas(32). No entanto, estas espécies podem ser encontradas ocasionalmente em outros
locais do corpo. As espécies S. sciuri e S. xylosus são comensais da pele e da membrana
mucosa de muitos animais e, ocasionalmente, de seres humanos. Ambas as espécies são
também encontradas em alimentos; S. kloosii, S. equorum subsp. equorum, e S. galinarum são
encontrados em vários mamíferos e produtos alimentares. S. chromogenes, S. hyicus, S. lentus
são residentes comuns de animais de casco e, além disso, podem ser isolados a partir dos seus
produtos alimentares. S. vitulinus é encontrado preferencialmente em cavalos e baleias. S.
arlettae é encontrado em mamíferos e aves e S. muscae é descrito nas moscas(23).
Os Staphylococcus podem tornar-se patogénicos dependendo da espécie e da estirpe,
após quebra na barreira epitelial cutânea, através de trauma ou intervenções médicas. A
recuperação de um isolado requer sempre a avaliação do significado clínico para determinar
se é um contaminante, colonizador ou patogénico(33).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
13
1.3. Identificação de contaminantes microbiológicos
1.3.1. Métodos moleculares/biológicos
A identificação de m.o. pode ser feita através de vários métodos, sendo os mais
precisos as técnicas de genética molecular, tais como impressão digital de DNA, perfis de
plasmídeo e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Estes métodos de identificação
são demorados, dispendiosos, e exigem profissionais especializados, o que pode impedir uma
resposta rápida à presença de espécies de bactérias patogénicas em laboratórios da indústria
farmacêutica(34). No entanto, a análise comparativa da sequência de DNA dos genes de
macromoléculas tornaram-se comuns na microbiologia como uma ferramenta para a
classificação de m.o. As moléculas mais úteis e extensivamente investigadas em termos de
taxonomia são os rRNAs e os seus genes correspondentes, especialmente 16S rRNAs e 23S
rRNAs. A identificação molecular baseada na análise da sequência de DNA tem como
principal vantagem uma maior precisão na identificação da espécie do m.o. em estudo e como
principal desvantagem, a presença de entradas de sequências defeituosas e/ou redundantes,
terminações de sequência irregulares e nomenclatura desatualizada nas bases de dados
atualmente disponíveis para esta identificação, podendo induzir a uma identificação
incorreta(35).
Por esses motivos, nos últimos anos, os métodos de reação em cadeia da polimerase
(PCR) em tempo real foram desenvolvidos e descritos para deteção e identificação rápidas de
várias estirpes bacterianas. O PCR em tempo real é uma ferramenta promissora para distinguir
sequências específicas a partir de uma mistura complexa de DNA e, portanto, é útil para
determinar a presença e quantidade de agentes patogénicos específicos numa amostra. Podem
facilmente detetar-se estirpes bacterianas diretamente a partir de amostras clínicas ou de
pequenas quantidades de células bacterianas em cultura, melhorando assim a sensibilidade e
reduzindo o tempo necessário para a identificação de bactérias. Este método tem sido
particularmente útil, facilitando a identificação de bactérias a qualquer nível taxonómico:
estirpe, espécie ou género(36–38).
1.3.2. Métodos bioquímicos
Atualmente, na indústria farmacêutica utilizam-se maioritariamente: um método
manual que recorre a galerias API (índice analítico de perfil) e um método automatizado que
utiliza o sistema VITEK. Recorre-se as estes métodos devido à fácil e rápida execução da
técnica, e também porque são facilmente adaptados à rotina de um laboratório de análises
microbiológicas de produtos farmacêuticos. Para a velocidade, padronização, redução de
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
14
custos e conveniência, os testes clássicos de fermentação, oxidação, degradação e hidrólise de
vários substratos são incorporados em sistemas de teste comerciais e testes bioquímicos
automatizados. Os resultados com testes convencionais podem ser ligeiramente diferentes
daqueles obtidos com sistemas de testes bioquímicos rápidos devido ao uso de outros
indicadores mais sensíveis(23).
Galerias API
As galerias API tornaram a identificação microbiana fácil e rápida, baseada no
conceito da identificação numérica. Os sistemas API são produtos comerciais. A galeria API
20 E (comercializada pela BioMérieux) é um método de identificação de m.o., que utiliza tiras
que contêm até 20 pequenos compartimentos onde ocorrem as reações bioquímicas (Figura
1).
Figura 1. Kits que incluem 20 testes bioquímicos (adaptado de (39)).
Os vinte compartimentos são inoculados com uma suspensão bacteriana de uma
cultura idealmente pura. Após incubação, as reações traduzem-se em mudanças de cor que
são espontâneas ou manifestadas pela adição de reagentes. As reações são lidas de acordo
com uma tabela ou quadro de leitura. A identificação é feita usando um sistema informático
de identificação ou um catálogo analítico, onde se obtém a identificação do perfil numérico
com sete algarismos, que é denominada de índice analítico de perfil (API). O programa
interpreta um grande número de perfis que permite a identificação de cerca de 600 espécies de
bactérias e leveduras. O kit de teste API consiste em testes de assimilação de elementos
enzimáticos e compostos de carbono, cujo número varia dependendo do tipo de kit API de
ensaio utilizado(39,40).
VITEK
O VITEK é um sistema automatizado de identificação direcionado a laboratórios de
microbiologia clínica que fornece condições de identificação de colónias através de testes
bioquímicos. Este sistema de identificação de bactérias e leveduras, utiliza cartas
colorimétricas com 64 poços, contendo substratos para testes individuais, que são incubadas e
interpretadas automaticamente(41). No entanto existem requisitos para a preparação adequada
do inóculo: meios de cultura adequados, idade da cultura, condições de incubação e turbidez
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
15
do inóculo. A turbidez é ajustada em conformidade (Tabela 1) e medida utilizando um
medidor de turbidez chamado DensiChek (42).
Tabela 1. Turbidez para preparação dos inóculos.
Produto Gama de turbidez McFarland Gram-negativa 0,50-0,63 Gram-positiva 0,50-0,63
Levedura 1,80-2,20 Bacilos 1,80-2,20
As cartas de identificação (Figura 2) são inoculadas com suspensões de m.o.
utilizando uma cassete. A carta é colocada na ranhura vizinha ao tubo que contém a suspensão
com o inóculo. A cassete pode acomodar até 10 testes (ou seja, até 10 cartas de identificação).
A cassete é colocada manualmente numa estação de câmara de vácuo. O vácuo que se forma
dentro do equipamento faz com que a suspensão do organismo seja forçada, através do tubo
de transferência, a preencher os micro-canais que chegam a todos os poços do carta.
Figura 2. Carta de identificação gram-positiva para o VITEK (adaptado de (41)).
Cada um dos poços contém um teste individual a um substrato. Estes medem atividade
metabólica como a acidificação, alcalinização, a hidrólise enzimática e crescimento na
presença de substâncias inibidoras. Uma película opticamente transparente presente em
ambos os lados do cartão permite o nível adequado de transmissão de oxigénio, mantendo o
recipiente selado e impedindo o contacto com as misturas organismo-substrato. Os cartões
têm códigos de barras que contêm informações sobre o tipo de produto, número de lote, data
de validade, e uma identificação exclusiva que pode ser ligada à amostra, quer antes ou depois
de carregar a carta no sistema (Figura 3)(42).
Figura 3. Sistema VITEK adaptado de (41).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
16
1.3.3. Métodos espetroscópicos
Espetroscopia de massa (MALDI-TOF)
A espetrometria de massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-
time of flight) é outra técnica utilizada para identificação molecular. Através da análise da
massa e da carga dos iões, pode fornecer uma identificação de género e espécie de um
microrganismo em apenas alguns minutos. A amostra é depositada numa matriz com um
suporte de metal apropriado e é ionizada por um feixe de laser cujo comprimento de onda
pode ir desde a gama de ultravioleta (UV) a infravermelho (IV) (impulsos com duração de
pico-segundos a alguns nano-segundos)(7).
O MALDI-TOF é um método rápido, preciso e de baixo custo para a identificação de
bactérias, em comparação com técnicas convencionais de biologia molecular. Além disso,
permite a identificação de bactérias diretamente a partir de amostras clínicas(43,44).
Espetroscopia Raman
A espetroscopia Raman é uma forma de espetroscopia vibracional, assim como a
espetroscopia IV. No entanto, enquanto que as bandas do IV surgem a partir de uma alteração
no momento dipolar de uma molécula (devido a uma interação da luz com a molécula), as
bandas Raman surgem a partir de uma alteração na polarizabilidade da molécula devido à
mesma interação. Isto significa que estas bandas observadas (correspondentes a transições de
energia específicas) são provenientes de vibrações moleculares específicas. Quando as
energias destas transições são representadas como um espetro, proporcionam uma "impressão
digital molecular" da molécula que está a ser observada. Certas vibrações que são permitidas
no Raman são proibidas no IV, ao passo que outras vibrações podem ser observadas em
ambas as técnicas (embora com diferentes intensidades), podendo assim, estas técnicas serem
consideradas como complementares(45,46).
A espetroscopia de Raman não requer preparação especial da amostra e os tempos de
medição são bastante curtos (a partir de uma fração de segundo a vários minutos)(47,48). Cada
m.o. produz um espetro único o que faz com que a especificidade da técnica analítica, em
combinação com o processamento quimiométrico apropriado, permita a caracterização, a
discriminação e a identificação de bactérias, fungos e leveduras ao nível da espécie e da sub-
espécie(49).
Espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
Os métodos implementados para a identificação de contaminantes microbiológicos na
indústria farmacêutica são igualmente métodos dispendiosos e demorados. A espetroscopia de
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
17
IV é um método rápido, barato e bastante simples. Esta técnica encontra-se detalhadamente
descrita no ponto 1.3.4. e tem características comuns com a técnica de Raman.
A espetroscopia de IV consiste no estudo da interação da radiação infravermelha com
a matéria. A luz analisada após ter interatuado com a matéria contém informação sobre a
estrutura desta. Um espetro é o registo desta interação(50). Para que uma molécula apresente
absorção de radiação de IV deve possuir características específicas: a molécula precisa que o
momento dipolar sofra uma variação durante a vibração. A região do espetro eletromagnético
correspondente à radiação de infravermelho divide-se em três regiões principais:
infravermelho próximo (13000-4000 cm-1), infravermelho médio (4000-400 cm-1) e
infravermelho distante (< 400 cm-1). A espetroscopia FTIR baseia-se na absorção de radiação
infravermelha média e as principais vantagens dos espetrómetros FTIR com interferómetro
em relação aos dispersivos são(51):
• uma relação sinal/ruído muito superior para um espetro acumulado no mesmo
intervalo de tempo;
• uma maior exatidão nos números de onda, associada a uma resolução constante em
toda a gama espectral.
O método de espetroscopia de IV com transformada de Fourier é baseado na
interferência da radiação entre dois feixes resultando um interferograma. Um interferograma é
o registo do sinal produzido pela combinação das múltiplas frequências possíveis de obter
com a transformada de Fourier.
Figura 4. Esquema de um espetrómetro com interferómetro: F - Fonte de radiação IV; D - Divisor de feixe; E1 - Espelho
fixo; E2 - Espelho móvel (Adaptado (52)).
O instrumento transformada de Fourier mede todas as frequências em simultâneo. Isso
faz com que o método FTIR seja um método rápido. É utilizado um interferómetro (p.e., de
Michelson), que permite uma ampla faixa de frequências de vibração a ser monitorizadas
simultaneamente. Este interferómetro é constituído por um divisor de feixe (D) e dois
espelhos: E1 que é fixo e E2 que é móvel (Figura 4). O divisor de feixe consiste numa placa
que reflete metade da radiação incidente. Assim metade da radiação segue para o espelho E1 e
metade para o E2. Após a reflexão em ambos os espelhos, as duas componentes recombinam-
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
18
se no divisor de feixe. A única parte que se move continuamente no instrumento é o
movimento do espelho (E2) no interferómetro. Em suma, o processo instrumental é composto
pelas seguintes etapas: a energia infravermelha é emitida por uma fonte (D) de corpo negro
(este feixe passa através de uma abertura que controla a quantidade de energia presente na
amostra (e consequentemente no detetor); o feixe entra no interferómetro onde é feita a
“codificação espectral”, e o sinal resultante do interferograma sai do interferómetro; no
compartimento da amostra, esta é atravessada pelo feixe ou reflete-o, dependendo do tipo de
análise a ser feita (é aqui que frequências específicas de energia, características de cada
amostra, são absorvidas); o feixe passa finalmente para o detector para uma medição final (os
detetores utilizados são apropriados para medir o sinal especial do interferograma). O sinal
medido é digitalizado e enviado para o computador onde é aplicada a inversa da transformada
de Fourier. O espetro final é apresentado ao utilizador para interpretação e posterior
processamento dos dados(52–55).
O modo de refletância total atenuada (ATR) pode ser utilizado em amostras sólidas ou
líquidas e tem de existir um contato muito próximo entre a amostra e o cristal para que este
tipo de refletância ocorra. Uma grande vantagem do ATR é o facto de não ser necessária
qualquer preparação da amostra a analisar. O cristal é fabricado com materiais com um
elevado nível de refração como por exemplo o germânio, zinco-selénio ou diamante. Um
acessório de ATR funciona medindo as alterações que ocorrem num feixe de infravermelho
totalmente refletido internamente quando o feixe entra em contato com uma amostra (Figura
4). O componente principal de um acessório de ATR é um prisma de uma substância
transparente ao IV, de elevado índice de refração. As faces laterais do prisma são cortadas
segundo um ângulo tal que a luz incidente é refletida com um ângulo superior ao ângulo
crítico. Nestas condições, há reflexão total e a luz permanece dentro do cristal durante
sucessivas reflexões. Se a amostra estiver depositada na face do cristal, com um bom contato
ótico, em cada reflexão alguma radiação penetra na amostra e pode ser absorvida, como se
esquematiza na Figura 5.
Figura 5. Esquema de um cristal para refletância total atenuada (ATR) (Adaptado (56)).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
19
Depois de um certo número de reflexões, a luz deixa o prisma e é focada no detetor. A
radiação resultante atenuada é medida e representada graficamente como uma função do
comprimento de onda e dá origem a absorções características da amostra(51,56,57).
1.3.4. FTIR - ATR para identificação de microrganismos
A técnica FTIR-ATR pode ser utilizada para a classificação, identificação e deteção de
microrganismos. Tem sido aplicada com sucesso na identificação e classificação de m.o. por
espécie e sub-espécie(58). Quando aplicada a células microbianas inteiras, o espetro de
infravermelho reflete a composição bioquímica qualitativa das células(4,59), permitindo
caracterizar e diferenciar células microbianas com base em componentes das células de
membrana incluindo os lipopolissacáridos, lipoproteínas, e fosfolípidos(34,54). A base da
espetroscopia FTIR é a interação da radiação infravermelha com uma amostra, neste caso
específico com o isolado bacteriano, proporcionando uma impressão digital específica que
reflete a estrutura e a composição de toda a célula. No modo ATR a magnitude da atenuação
depende das bactérias em contato com o feixe. A compreensão dos espetros de IV das células
microbianas requer uma perceção geral da sua composição, dos principais tipos de células,
das estruturas químicas presentes, e do conhecimento da diferenciação de células e tecidos(60).
Ao contrário dos organismos eucariotas (animais, plantas, leveduras ou fungos), os
procariotas (bactérias) existem apenas num número limitado de formas morfológicas (p.e.
bacilos e cocos). No entanto, a sua composição química e as suas estruturas variam
consideravelmente. As estruturas citoplasmáticas de bactérias são menos compartimentadas e
mais simples do que as das leveduras e fungos, mas têm estruturas moleculares e supra-
moleculares complexas. A maior parte das diferenças estruturais que fornecem a possibilidade
de diferenciação entre as bactérias por FTIR residem no envelope celular, que é geralmente
definido como a parede celular além da membrana citoplasmática. A parede celular de
bactérias gram-positivas é formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a
parede celular de bactérias gram-negativas é mais complexa, uma vez que é formada por uma
camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeo e
proteína(64).
As bandas de absorção observadas na região IV entre aproximadamente 1800 cm-1 e
400 cm-1 surgem principalmente a partir dos modos de vibração fundamentais e podem ser
atribuídas a determinados grupos funcionais. A partir da literatura podem ser obtidas
descrições de espetros de vários m.o. e correlações entre estrutura de espetros e as
macromoléculas biológicas mais importantes. A interpretação dos espetros IV de moléculas
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
20
biológicas baseia-se principalmente na análise de estruturas conhecidas (Tabela 2). Os ácidos
nucleicos, proteínas, lípidos e hidratos de carbono estão sempre presentes em diferentes
quantidades e numa grande diversidade de células microbianas(61).
Tabela 2. Atribuição do número de onda ao grupo funcional existente nas células microbianas (adaptado(61)).
Número de onda (cm-1) Designação
3500 Movimentos de distensão O-H de grupos hidroxilo 3200 Movimentos de distensão N-H das proteínas 2955 Movimentos de distensão assimétricos C-H de -CH3 em ácidos gordos 2930 Movimentos de distensão assimétricos C-H de >CH2 2918 Movimentos de distensão assimétricos C-H de >CH2 em ácidos gordos 2898 Movimentos de distensão C-H em grupos metilo 2870 Movimentos de distensão simétricos C-H de –CH3 2850 Movimentos de distensão simétricos C-H de >CH2 em ácidos gordos 1740 Movimentos de distensão >C=O dos ésteres 1715 Movimentos de distensão >C=O dos ácidos carbónicos 1680-1715 Movimentos de distensão >C=O dos ácidos nucleicos 1695 Componentes da banda da amida I 1685 Resultante de folhas β -antiparalelas 1675 Configuração β das proteínas 1655 Estruturas α–helicoidais da amida I 1637 Estruturas das folhas -β da amida I 1550-1520 Amida II 1515 Banda da tirosina 1468 Deformação C-H de >CH2 1400 Movimentos de distensão simétricos C=O de COO 1310-1240 Banda da amida III das proteínas 1250-1220 Movimentos de distensão assimétricos P=O de >PO2 de fosfodiésteres
1200-900 Movimentos de distensão de C-O e C-C e deformação de C-O-C de hidratos de carbono
1090-1085 Movimentos de distensão simétricos P=O de >PO2 720 Vibração de rotação da ligação C-H de >CH2 900-600 Região da impressão digital (fingerprint)
Na maioria das implementações descritas na literatura, os m.o. são analisados na
forma de colónias (tal como neste estudo), dando origem a espetros muito complexos, uma
vez que o espetro resultante depende da composição química total das células (do material
intracelular, da membrana e da parede). Devido à complexidade do espetro resultante, é
indispensável uma avaliação por intermédio de análise multivariada (quimiometria)(63).
A técnica FTIR-ATR para identificação de contaminantes microbiológicos tem como
principais vantagens(52,61):
• técnica aplicável a todos os m.o.;
• os requisitos de biomassa podem ser reduzidos para colónias individuais tomadas
diretamente a partir das placas de cultura;
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
21
• os resultados estão disponíveis em poucos minutos após a obtenção de amostras
adequadas de cultura pura;
• classificação dos m.o. em níveis muito diferentes de discriminação taxonómica sem
qualquer pré-seleção de estirpes por outros critérios taxonómicos;
• a especificidade do método é de um modo geral extremamente alta;
• a deteção in situ de componentes celulares específicos é possível (p.e. materiais de
armazenamento de formação de esporos e a encapsulação de m.o.).
Por outro lado, também existem desvantagens(52):
• apenas os m.o. que podem ser cultivados em cultura e estão disponíveis como culturas
puras devem ser analisados;
• culturas mistas só podem ser investigadas com a ajuda de um microscópio de IV;
• a classificação e identificação são baseadas na análise de impressões espectrais;
• as informações específicas sobre um ou apenas alguns compostos específicos
presentes nas células geralmente não está disponível;
• a técnica proporciona uma impressão digital espectral de todos os constituintes
celulares, resultados estáveis só podem ser obtidos desde que os parâmetros
microbiológicos (meio de cultura, tempo de cultivo, e temperatura) sejam controlados
de forma rígida;
• as bases de dados espetrais que são utilizadas em diferentes laboratórios exigem a
utilização de meios de cultura adequados disponíveis no mercado;
• a aceitação da técnica de IV pela comunidade científica pressupõe que a informação
espetral pode ser transformada com esquemas de classificação que sejam pelo menos
semelhantes aos obtidos por quimio-taxonómica ou por técnicas de genética molecular
(tarefa realizada apenas por profissionais qualificados)(61).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
22
Figura 6. Espetro FTIR representativo de bactérias com respetiva identificação das principais bandas (Adaptado de (64)).
1.4. Análise Multivariada
Para processar os dados espetrais complexos (de isolados intactos) obtidos por
espetroscopia de IV são necessários métodos estatísticos multivariados ou quimiométricos. A
quimiometria pode ser definida como uma ciência relacionada a medidas realizadas num
sistema ou processo químico, obtendo informações sobre o estado do sistema através da
aplicação de métodos matemáticos ou estatísticos(65,66). Para garantir robustez dos modelos
quimiométricos baseados em análises FTIR-ATR de m.o., é necessária uma base de dados
muito completa de isolados. Apenas deste modo é possível a validação e estabelecimento do
método para análise de rotina. Todos estes métodos requerem um conjunto muito completo de
isolados e técnicas de pré-processamento espetrais adequadas de modo a construir modelos
que permitam inequivocamente a discriminação de m.o.(54).
Na análise de espetros IV de m.o. são utilizadas duas abordagens quimiométricas(67):
• análise por métodos não supervisionados - os dados são analisados independentemente
da identidade da amostra. Estes são considerados métodos qualitativos uma vez que o
objetivo é a distinção de microrganismos;
• análise por métodos supervisionados - parte-se de um conjunto de amostras, bem
caracterizadas, para a construção de um modelo que será posteriormente utilizado para
a identificação de uma amostra desconhecida.
1.4.1. Pré-processamento espetral
O tratamento quimiométrico dos espetros deve ser feito após uma primeira etapa
designada por pré-processamento espetral. Esta etapa consiste na aplicação de métodos
Número de onda (cm-1)
Abs
orvâ
ncia
(u.a
.)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
23
corretivos dos espetros. As interferências nos espetros devem-se ao facto dos aparelhos das
medições espetrais serem afetadas por vários fenómenos tanto ao nível químico como físico.
Por exemplo, variações de temperatura, quantidade de amostra e efeito causado pela dispersão
da luz devem ser eliminados dos espetros de forma a que estes evidenciem apenas informação
química ou bioquímica da amostra. Também podem ocorrer distorções causadas pela
saturação do detetor ou relacionadas com o ruído atribuível ao detetor. Os métodos de pré-
tratamento permitem eliminar algumas destas perturbações de forma a melhorar o
desenvolvimento dos modelos quimiométricos(68). Existem vários tipos de pré-processamento
que podem ser aplicados aos espetros, traduzindo diferentes alterações nos dados. Os mais
utilizados são as derivadas (combinados com filtros de Savitzky-Golay), variação de padrão
normal (SNV) e correção multiplicativa de sinal (MSC)(69).
Derivação
Os filtros de Savitzky-Golay têm como principais objetivos reduzir o ruído existente
nos espetros originais e derivação do sinal para remoção de efeitos de linha de base. Esta
operação envolve a derivação matemática de uma função, sendo a função o espetro de uma
amostra em vários comprimentos de onda. Estes filtros são essencialmente funções locais que
são aplicadas a cada espetro sendo posteriormente aplicadas as derivadas. A primeira ou
segunda derivada do espetro original amplificam as diferenças entre espetros enquanto
minimizam perturbações causadas pelos fenómenos descritos atrás(72,73).
Variação de padrão normal
A variação de padrão normal (SNV) é um pré-processamento que centra cada espetro
em torno do zero, por subtração da média e divisão pelo desvio padrão. Este método permite
reduzir interferências causadas pelo tamanho de partícula e pelas diferenças de densidade das
amostras(71). Para este método o espetro de uma amostra i transformado X(i)’, é dado pela
Equação 1. X(i) representa o espetro da amostra i inicial, mi a média das leituras espetrais
para a amostra i e si o desvio padrão(72).
𝑋(𝑖)! = ! ! !!!!!
[Equação 1]
Correção multiplicativa de sinal
A correção multiplicativa de sinal (MSC) é um pré-processamento que reduz o efeito
de luz dispersa em espetros de refletância. A MSC seleciona um espetro de referência no
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
24
conjunto total de espetros disponíveis para análise. Na maioria das vezes o espetro de
referência consiste no espetro médio do conjunto usado no desenvolvimento do método
(calibração). Através de regressão linear são corrigidos todos os espetros tendo o espetro de
refência como alvo(72,73).
1.4.2. Técnicas quimiométricas
Análise de Componentes Principais
A análise de componentes principais (PCA) é um método utilizado para reduzir a
dimensão de um conjunto de dados tornando-o mais interpretável. A PCA evidencia em que
aspeto uma determinada amostra difere de outra e quais as variáveis que mais contribuem
para essa diferença. Esta análise permite criar um padrão das amostras, formando grupos entre
as amostras semelhantes. Esta técnica é utilizada para identificar correlações entre um
conjunto de variáveis e transformar o conjunto original de variáveis num novo conjunto de
variáveis não correlacionadas denominadas por componentes principais (CPs)(67). Os CPs são
uma combinação linear das variáveis originais, neste caso as absorvâncias em diversos
comprimentos de onda. Os CPs individuais podem ser interpretados através da sua conexão
com as variáveis originais. Ou seja, mostram-se os mesmos dados num sistema de
coordenadas diferente. As relações entre amostras são reveladas através das suas projeções
nos CPs (scores). A distância entre amostras pode ser avaliada no espaço dos PCs
constituindo uma medida mais fiável para análise de similaridade. A tabela de dados original
é transformada numa nova matriz reorganizada cuja estrutura revela as relações entre linhas
(amostras) e colunas (variáveis) que podem estar ocultas na matriz original, assim, a nova
estrutura constitui a parte explicada dos dados originais(74). Em termos matriciais o modelo de
PCA pode ser descrito através da Equação 2 e da Figura 7.
𝑋 = 𝑇×𝑃! + 𝐸 [Equação 2]
Figura 7. Ilustração do método de PCA (adaptado de ((74)).
X : Matriz original de dados (n linhas e p colunas)
T : Matriz de scores (n linhas e d colunas)
Pt : Matriz transposta dos loadings (p linhas e d colunas)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
25
E : Matriz de resíduos ( mesmo tamanho de X)
p : Número de variáveis (absorvâncias)
n : Número de amostras (isolados)
d : Número de fatores
O objetivo do modelo de PCA é encontrar as direções no espaço de dados que
descrevem a maior variação do conjunto de dados. Cada direção é uma combinação linear das
variáveis iniciais que mais contribuem para a variação real entre amostras. Pela construção,
CPs são ortogonais entre si e também são classificados de modo que cada um carrega mais
variância que qualquer um dos que se seguem. A prioridade é dada à interpretação destes CPs,
começando com o primeiro, que incorpora a maior variação e, portanto, constitui um sistema
alternativo menos complexo que é mais adequado para a interpretação da estrutura de dados.
Normalmente, apenas os primeiros CPs contêm informações pertinentes.
Os resíduos (E) mantêm a variação que não está incluída no modelo, como uma
medida de quão bem as amostras ou variáveis se enquadram no modelo. Se todos os CPs
fossem retidos, não haveria nenhuma aproximação e o ganho de simplicidade consistiria
apenas em ordenar a variação dos próprios CPs pelo tamanho. Decidir sobre o número de
componentes a reter num modelo de PCA é um compromisso entre simplicidade e
robustez(67,75).
Análise hierárquica
A análise hierárquica de grupos (HCA) permite comparar e categorizar os dados de
acordo com as ponderações de importância/variabilidade das variáveis. Assim, os dados serão
incluídos em grupos de acordo com a sua similaridade. Um agrupamento consiste num grupo
de objetos semelhantes entre si. Os pontos de um agrupamento específico partilham algumas
características comuns que os diferenciam daqueles reunidos em outros agrupamentos. Estes
são caracterizados tendo em conta três propriedades principais: tamanho, forma e distância
para o agrupamento mais próximo. HCA é um modelo não supervisionado de análise de
dados que é utilizado tanto para análise explicativa como para a confirmatória. Este método
difere da análise discriminante (técnica de classificação supervisionada) em que um objeto
não rotulado é atribuído a um grupo de objetos pré-classificados(74,76).
O dendrograma consiste na representação gráfica dos resultados. O agrupamento
hierárquico encontra aglomerados em modo aglomerativo (de baixo para cima) ou divisor (de
cima para baixo) para formar uma estrutura em forma de árvore. O modo aglomerativo
começa com a definição de cada ponto como seu próprio agrupamento e a estes juntam-se
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
26
aglomerados semelhantes em pares até que o conjunto de dados seja classificado. O eixo
horizontal de um dendrograma descreve a variância ou heterogeneidade crescente. A
magnitude dessa heterogeneidade depende do número de espetros num agrupamento e das
semelhanças entre eles. Os dendrogramas são usados para identificar as semelhanças entre
espetros de bactérias que representam a mesma espécie ou género, e além disso pode
identificar uma bactéria desconhecida através do cálculo da distância espectral entre ela e
bactérias conhecidas(53). O modo divisivo começa considerando todo o conjunto de dados
como um único agrupamento, que é então recursivamente dividido até que somente
agrupamentos contendo pontos de dados exclusivos sejam obtidos. Algoritmos diferem na
forma como eles calculam a similaridade entre agrupamento(73,74).
Regressão por mínimos quadrados parciais – discriminante (PLS-DA)
O PLS-DA consiste na clássica regressão PLS onde a variável resposta é categórica e
representativa de classes(76). O PLS-DA é realizado para modelar a separação entre grupos de
observações(77). PLS-DA é um caso especial de PLS onde as variáveis independentes (matriz
X) é regredida numa matriz Y consistindo de uns e zeros identificativa das classes. Estes uns
e zeros indicam a classe à qual as amostras pertencem(74). O PLS-DA permite melhorar a
separação entre classes quando comparado com o método PCA, pois força a que se obtenha a
máxima separação entre classes(75). Este método supervisionado requer o conhecimento da
identidade de cada amostra (isolado). Com um conjunto de amostras bem caracterizadas, um
modelo pode ser calibrado para que possa prever a identidade de novas amostras,
relacionando um conjunto de variáveis de resposta Y (classes) com um conjunto de variáveis
X (espetros)(34). Esta abordagem visa maximizar a covariância entre as variáveis
independentes X (espetros) e a variável dependente Y correspondente (classes, grupos, isto é,
a classe que se deseja prever). Permite a previsão da variável Y com base num número
reduzido de fatores (variáveis latentes). Estes fatores descrevem o comportamento das
variáveis dependentes Y e abrangem o espaço no qual as variáveis independentes X são
projetadas (Figura 8).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
27
Figura 8. Ilustração de um modelo de PLS-DA com três classes em que o i é o número de amostras e o j o número de variáveis (Adaptado de (78)).
Por exemplo, se considerarmos a divisão de amostras em diferentes classes, então a
variável Y será composta por vetores que terão uma entrada 0 para todas as amostras na
primeira classe e uma entrada 1 para todas as amostras da segunda classe (ou vice-versa)(78).
Para avaliar um modelo de PCA e de PLS-DA avaliam-se normalmente duas
estatísticas: a estatística de Hotelling’s T2 que incorpora a informação retida nos CPs e a
estatística dos resíduos que permite avaliar a componente não modelada (ou seja a
componente que não ficou retidas nos CPs). A avaliação destas duas estatísticas permite-nos
concluir sobre isolados atípicos, ou seja, ‘outliers’ do modelo construído(73).
PLS-DA
!!
X (espetros) Y (classes)
Cla
sse
1 C
lass
e 2
Cla
sse
3
PLS-DA
!!
X (espetros) Y (classes)
Cla
sse
1 C
lass
e 2
Cla
sse
3
X (espetros) Y (espetros)
Cla
sse
2 C
lass
e 1
Cla
sse
3
PLS-DA
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
28
2. Revisão da literatura
O potencial da espetroscopia FTIR o âmbito da identificação de microrganismos está
documentado desde a década de 90. A técnica tem sido aplicada em muitos campos
diferentes, como a microbiologia alimentar, diagnóstico médico e ecologia microbiana. A sua
aplicação pode abranger identificação de patogenos, contaminantes alimentares, culturas
probióticas e microrganismos ambientais. Alguns estudos centram-se apenas na diferenciação
de espécies enquanto outros tentaram mostrar bases de dados abrangentes para aplicação em
microbiologia(79). Existe um elevado número de estudos sobre este tema. Alguns
especialmente relevantes e recentes encontram-se listados na Tabela 3.
Tabela 3. Revisão dos estudos publicados recentemente sobre identificação e discriminação de m.o. com o uso de espetroscopia. DA: análise discriminante; CVA: análise canónica variada; PAS: espetroscopia foto-acústica; CA: análise de
clusters; SOM: (self-organized maps) mapas auto-organizados; KNN: (K-nearest neighbor); ANN: redes neuronais artificiais.
Género(s)/ Espécie(s) Técnica espetroscópica Percentagem de
identificação/discriminação correta
Abordagem quimiométrica Ref.
Células microbianas intactas FTIR; NIR Raman (Estudo pioneiro) CA, ANN (60)
Bactérias intactas e fungos ATR (Estudo pioneiro) CA, ANN (61)
Staphylococcus Transmissão 97% dos isolados de S. aureus PCA, FDA (80)
Salmonella Enteritidis Transmissão 100% dos tipos de fagos (utilizando extratos das proteínas de membrana externa)
PLS-DA (34)
E.coli Transmissão 77,92% das estirpes de E. coli PLS-DA (59) Lactobacillus casei, B. cereus, E.coli, S.cerevisiae, A.niger e F.verticilliodes
PAS 100% das estirpes de E. coli CVA; Distância de Mahalanobis
(55)
Pichia Pastoris ATR 100% entre células cultivadas sob condições de nitrogénio e de limitação de carbono
PCA; PLS-DA (4)
E. coli; S. aureus; B. subtilis; C.albicans
Espetroscopia Microscópica Elevada precisão HCA; CA (62)
Acinetobacter baumannii; A. calcoaceticus ATR Superior a 90% PLS-DA; HCA (81)
Listeria Espetroscopia Microscópica 93% CVA; PCA;
PLSDA (82)
S. aureus ATR 98% pela KNN 93% pelos SOM 92% pelo PCA
PCA; KNN; SOM (83)
L. plantarum, L. acidophilus, L. kefirgranum, L. kefiranofaciens e L. cassei
ATR 100% ao nível da espécie HCA (84)
O. limosa, A. platensis, P. laminosum, Phormidium sp, S. javanicum, N. punctiforme e P. angustissimum
ATR 80% PCA; SIMCA (85)
A. flavus, A. fumigatus e A. parasiticus ATR 75%-100% ao nível da
toxigenicidade HCA; DA (86)
S. aureus ATR 100% ao nível das estirpes ANN (87) Yersinia enterocolitica Transmissão 79,9% ao nível da espécie ANN (88) B. cereus, Salmonella enterica, E. Coli, Listeria ATR 94% PCA; SIMCA (89)
Burkholderia cepacia complex ATR 90% ao nível da espécie PCA; PLS-DA; (54)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
29
3. Objetivos
O principal objetivo deste trabalho é avaliar o potencial da técnica FTIR como técnica
de identificação e discriminação de microrganismos contaminantes de medicamentos (formas
sólidas). Os objetivos deste trabalho são:
• a construção de uma biblioteca no FTIR-ATR para os principais microrganismos
contaminantes de medicamentos sólidos não estéreis;
• a identificação de estirpes através do método FTIR-ATR;
• a comparação do desempenho do método baseado em FTIR-ATR com o método
VITEK usado em rotina;
• a diminuição do tempo de identificação de microrganismos com consequente
diminuição do tempo de análise microbiológica de um medicamento.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
30
4. Materiais e métodos
A parte prática desta dissertação foi realizada no Laboratório de Microbiologia da
Generis Farmacêutica SA na Venda Nova, Lisboa.
4.1. Isolados
As amostras biológicas são colónias recolhidas de crescimentos bacterianos presentes
na análise de produtos e no controlo microbiológico ambiental feito nas áreas de produção e
embalagem da unidade fabril da Generis Farmacêutica SA. Foram recolhidos 52
microrganismos cujas identificações pelo método VITEK correspondiam a microrganismos
dos géneros Staphylococcus e Pseudomonas (Tabela 4).
Para além de bactérias isoladas da rotina do laboratório foram ainda utilizados
microrganismos padrão de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Estes padrões foram preparados
a partir de microrganismos Bioball(90). Estes padrões contém um número exato de UFC
viáveis. A Bioball é uma bola liofilizada de aproximadamente 3 mm de diâmetro que é
conservada individualmente em frascos entre -33ºC a -18ºC.
As abreviaturas referentes a cada microrganismo dão-nos informação sobre a origem
do mesmo, uma vez que a primeira letra ‘a’ ou ‘p’, refere-se ao fato desta colónia ter sito
obtida da monitorização ambiental ou da análise de um produto. A segunda letra ao género:
‘s’ – Staphylococcus e ‘p’ - Pseudomonas. As terceira e quarta letras indicam a espécie e o
número distingue isolados da mesma espécie.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
31
Tabela 4: Codificação e origem dos isolados utilizados neste estudo.
Abreviatura m.o. Origem
Staphylococcus
ST01 S. aureus Bioball ST02 S. aureus Bioball ST03 S. aureus Bioball ST04 S. aureus Bioball psau01 S. auricularis produto psep01 S. epidermidis ambiente psep02 S. epidermidis ambiente asep03 S. epidermidis ambiente asep04 S. epidermidis ambiente asep05 S. epidermidis ambiente aslt01 S. lentus ambiente pslt02 S. lentus produto pslt03 S. lentus produto pslt04 S. lentus produto pslt05 S. lentus produto ascc01 S. cohnii ssp cohnii ambiente ascc02 S. cohnii ssp cohnii ambiente asxy01 S. xylosus ambiente asxy02 S. xylosus ambiente ashh01 S. hominis ssp hominis ambiente pshh02 S. hominis ssp hominis ambiente assp01 S. saprophyticus ambiente assp02 S. saprophyticus ambiente assp03 S. saprophyticus ambiente assp04 S. saprophyticus ambiente assp05 S. saprophyticus ambiente aswa01 S. warneri ambiente aswa02 S. warneri ambiente pswa03 S. warneri ambiente aswa04 S. warneri ambiente aswa05 S. warneri ambiente pssc01 S. sciuri produto pssc02 S. sciuri produto psvt01 S. vitullinus produto psvt02 S. vitullinus produto ascp01 S. capitis ambiente ascp02 S. capitis ambiente ascp03 S. capitis ambiente ascp04 S. capitis ambiente ascp05 S. capitis ambiente
Pseudomonas
PS01 Pseudomonas auriginosa Bioball
PS02 Pseudomonas auriginosa Bioball
PS03 Pseudomonas auriginosa Bioball
PS04 Pseudomonas auriginosa Bioball
apfr01 Pseudomonas fluorescens ambiente
apst01 Pseudomonas stutzeri ambiente apst02 Pseudomonas stutzeri ambiente
ppor01 Pseudomonas oryzihabitans produto
Escherichia
EC01 E. coli Bioball EC02 E. coli Bioball EC03 E. coli Bioball EC04 E. coli Bioball
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
32
a) Preparação dos isolados
As colónias após serem detetadas, ao fim de 5 dias de incubação entre 30 °C a 35 °C e
20ºC a 25ºC (conforme procedimentos de análise microbiológica), foram repicadas com uma
ansa estéril e isoladas em placa, com um meio de TSA (Trypticase Soy Agar). Tal
procedimento foi realizado numa câmara de fluxo laminar para que não ocorressem
contaminações cruzadas. As placas, nas quais foram feitos os isolamentos, foram incubadas
durante 18 horas entre 30 °C a 35 °C. Em todas as repicagens e isolamentos deste estudo foi
utlizado apenas o meio TSA, uma vez que é um meio de cultura não seletivo onde crescem
várias bactérias. Este meio é rico em triptona e peptona, proteínas e lípidos.
b) Preparação dos microrganismos padrão
A preparação dos microrganismos padrão iniciou-se pela reidratação do Bioball num
líquido de hidratação (pode ser uma solução salina). O líquido de reidratação deve estar à
temperatura ambiente e cada Bioball foi reidratado em 1,1 ml deste liquído. Em seguida foi
agitado no vortex e usaram-se alíquotas de 100 µl para o espalhamento em cada placa de
TSA. As placas onde foram feitos os espalhamentos dos m.o. são incubadas a 30 ºC – 35 ºC
durante 18 horas. Este procedimento foi feito para três microrganismos padrão: E. coli , S.
aureus e P. aeruginosa. Entre a preparação de cada m.o. procedeu-se à limpeza da câmara de
segurança biológica com iso-propanol estéril a 70%.
c) Identificação no VITEK
Após 18 horas de incubação dos microrganismos de acordo com as alíneas a) e b),
estes foram postos em identificação no VITEK, método atualmente em uso no laboratório de
microbiologia da Generis Farmacêutica SA. Para este método de identificação foi necessário
seguir os seguintes passos para cada microrganismo:
-‐ Num tubo de ensaio de poliestireno, foram colocados 3 ml de uma solução aquosa a
0,45% de NaCl, pH 5,0 - 7,2;
-‐ Com uma ansa estéril transferiu-se um número suficiente de colónias isoladas da placa
com a cultura fresca (18 horas);
-‐ Homogeneizou-se a suspensão no vortex;
-‐ A quantidade de colónias necessárias para a suspensão mediu-se pela turbidez do
inóculo, com o auxílio de um Densicheck (aparelho que mede a turbidez da amostra
dentro do tubo de ensaio);
-‐ Verificou-se que o valor McFarland apresentado variava entre 0,50 - 0,63 após várias
medições da mesma;
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
33
-‐ Após esta preparação, foram colocados 25 µl da suspensão, num cartucho de
identificação de bactérias no ID Endosafe®-PTS ™ Gram (sistema que classifica a
amostra em colónias gram-negativas/ gram-positivas / leveduras);
-‐ Após esta classificação foi atribuída uma carta correspondente a esta identificação e a
amostra foi colocada no VITEK para identificação;
-‐ Os resultados da identificação demoraram em média 4 a 18 horas, consoante a espécie
em identificação.
Estes isolados foram identificados no VITEK três vezes, a partir de culturas frescas de
dias diferentes como forma de garantir que os isolados selecionados corresponderiam a
microrganismos puros.
4.2. Análises espetroscópicas
Foram utilizados 52 isolados para a aquisição de 468 espetros no FTIR. Para cada
amostra adquiriram-se espetros em triplicado em três dias diferentes, ou seja, para cada
isolado foram obtidos 9 espetros. Antes de iniciar cada aquisição, limpou-se o suporte do
FTIR com álcool a 70% e fez-se um background. Para cada isolado, foi colocado com uma
ansa estéril uma quantidade mínima de material biológico no suporte do FTIR de forma a não
ser possível visualizar o cristal quando este estava depositado. Esperou-se aproximadamente 3
minutos entre a deposição de cada amostra e a aquisição da primeira réplica para que fosse
mais fácil obter 3 réplicas consecutivas de cada amostra.
O espetrofotómetro utilizado para a aquisição de espetros neste estudo foi o Spectrum
One FT-IR Spectrometer-Perkin Elmer com um intervalo de números de onda de 4000 cm-1 a
600 cm-1, resolução de 4 cm-1 e 32 acumulações de varrimentos. Após a aquisição espetral
seguiu-se o tratamento quimiométrico dos espetros através do software SOLO. O tratamento
quimiométrico dos espetros teve início pela construção de modelos PCA em que foi
necessário transformar a transmitância (T) em absorvância (A) utilizando a equação 3.
𝐴 = log !!
[Equação 3]
Neste estudo, apesar de terem sido adquiridos espetros numa gama de 4000 cm-1 a 600
cm-1, para a análise quimiométrica dos espetros foi feita uma restrição espetral para um
intervalo de 1500 cm-1 a 900 cm-1. Desta forma é possível eliminar a banda da água na zona
dos 3250 cm-1 e as restantes zonas dos espetros que não revelam diferenças taxonómicas das
diferentes espécies.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
34
Em seguida foram aplicados os pré-processamentos: a variação do padrão normal
(SNV) para minimizar interferências causadas pelas diferenças das amostras; um filtro
Savitzky-Golay para reduzir o ruído, considerando a segunda derivada. Após o pré-
processamento escolhe-se o número de componentes principais para a construção do modelo.
Em seguida analisou-se os mapas de agrupamentos em função dos componentes principais
escolhidos assim como as estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos.
A partir do modelo de PCA foram construídos modelos de HCA, ou seja,
dendrogramas de forma a avaliar as semelhanças dos espetros. Para isso, utilizou-se o método
de Ward. Este destina-se a medidas escalonadas e faz uso de distâncias euclidianas. A
dissimilaridade entre agrupamentos é baseada na distância euclidiana entre os centros dos
agrupamentos(91).
Em relação aos espetros de Staphylococcus, como é o género que tem maior número
de isolados(40) foi feita uma análise supervisionada dos dados recorrendo ao PLS-DA. Para
construção destes modelos é necessário escolher um método de validação cruzada.
A validação cruzada envolve a remoção de um sub-conjunto de espetros (o conjunto
de teste) do conjunto de dados. O modelo é construído com os restantes objetos e em seguida
aplicou-se ao modelo resultante os espetros removidos. Dessa forma, cada experiência de
validação envolve o teste de um modelo com objetos que não foram usados para a sua
construção. Neste estudo escolheu-se como método de validação os blocos contíguos, pela
sua simplicidade e facilidade de implementação(92). Para implementar este método é
necessário escolher o número de espetros para cada sub-conjunto, um número de divisão de
dados, neste caso escolheu-se 34 que corresponde ao número de isolados que foram utilizados
(cada isolado tem nove espetros). O número de isolados utilizados corresponde ao número de
microrganismos do género Staphylococcus com identificações coerentes no VITEK, e em que
existe pelo menos mais do que um isolado da mesma espécie.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
35
5. Resultados e discussão
5.1. Avaliação dos resultados pelo método VITEK
As identificações que foram feitas no VITEK para garantir que os microrganismos
utilizados fossem puros, assim como a informação sobre a origem do microrganismo e a
respetiva abreviatura atribuída para facilitar as identificações no VITEK estão descritas na
Tabela 5.
De acordo com os resultados do VITEK, existem alguns isolados em que as três
identificações não são concordantes. Por exemplo quando o resultado de uma das três
identificações foi não identificado (NID). Esta discordância entre os isolados pode revelar a
presença de colónias mistas em alguns casos, ou pode estar relacionado com contaminações
cruzadas, uma vez que as identificações foram feitas a partir de culturas frescas em dias
diferentes. No entanto, como o VITEK é um método desenvolvido para a área clínica, a não
concordância das identificações através desta técnica também pode estar relacionada com esse
fator. No caso dos microrganismos padrão da Bioball não foram feitas as três identificações
no VITEK uma vez que já existia a certeza de serem puros.
O grupo dos Staphylococcus é o maior grupo, uma vez que estas bactérias são as que
mais aparecem na flora residente da unidade fabril, sendo facilmente transmissíveis pelos
humanos.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
36
Tabela 5.Resultados das identificações dos isolados utilizados neste estudo pelo método VITEK.
VITEK
Abreviatura 1ª Identificação
2ª Identificação
3ª Identificação
Staphylococcus
ST01 99% 99% - ST02 99% - - ST03 99% - - ST04 99% - - psau01 94% 97% 97% psep01 99% 99% 99% psep02 96% 93% 94% asep03 99% 99% 99% asep04 99% 99% 99% asep05 99% 96% 99% aslt01 95% NID NID pslt02 88% 89% 89% pslt03 97% 89% S. sciuri 89% S. sciuri pslt04 99% NID 85% S. sciuri pslt05 99% NID 97% E.casseliflavus ascc01 99% 98% 98% ascc02 95% 97% 97%
asxy01 99% S. galinarium 89% 89%
asxy02 89% 89% 94% K. Kristinae ashh01 95% Baixa discriminação Baixa discriminação pshh02 94% Baixa discriminação Baixa discriminação assp01 99% 99% 99% assp02 95% 95% 95% assp03 99% 99% 98% assp04 99% 98% 99% assp05 95% 99% 99% aswa01 97% 97% 97% aswa02 95% 99% K. Kristinae 99% K. Kristinae pswa03 96% 98% 98% aswa04 98% 97% 97% aswa05 95% 95% 95% pssc01 90% 93% 93% pssc02 90% 93% S. lentus - psvt01 91% 93% S. sciuri 93% S. sciuri psvt02 97% 93% 87% S. sciuri ascp01 99% Baixa discriminação Baixa discriminação ascp02 96% 96% 96% ascp03 97% 97% 97% ascp04 98% 98% 98% ascp05 93% 93% S. warneri 95% S. warneri
Pseudomonas
PS01 98% - - PS02 98% - - PS03 98% - - PS04 98% - - apfr01 99% 96% 95% apst01 98% 95% 98% apst02 89% Klebsiella 99% 90% ppor01 93% 99% 99%
Escherichia
EC01 99% - - EC02 99% - - EC03 99% - - EC04 99% - -
5.2. Discriminação pelo método FTIR
Os espetros FTIR-ATR de todos os isolados revelaram alta similaridade e bandas
atribuídas com componentes bacterianos tais como lípidos (3000-2800 cm-1),
proteínas/amidas I e II (1700-1500 cm-1), fosfolípidos/DNA/RNA (1500-1185 cm-1),
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
37
polissacáridos (1185-900 cm-1) e a região da impressão digital (900-600 cm-1)(93). As
principais diferenças espetrais foram detetadas nas regiões dos fosfolípidios/DNA/RNA e
polissacáridos (1500-900 cm-1): estas regiões foram anteriormente utilizadas em estudos para
discriminação em diferentes níveis taxonómicos em diferentes espécies bacterianas.
Como se pode observar na Figura 9, os espetros de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa
são bastante complexos e semelhantes entre si. A cada isolado correspondem 9 espetros (três
réplicas em três dias diferentes).
Figura 9. Espetros FTIR-ATR dos microrganismos padrão (E. coli, S. aureus e P. aeruginosa) sem pré-processamento.
Os pré-processamentos utilizados após a aquisição dos espetros foram: a variação do
padrão normal (SNV) e um filtro Savitzky-Golay com segunda derivada. Os parâmetros do
filtro de Savitzky-Golay foram 9 pontos, um polinómio de segunda ordem e segunda
derivada. Apesar de existirem outros métodos de pré-processamento para a mesma finalidade,
os métodos de processamento utilizados produziram os melhores resultados na modelação.
Após o pré-processamento e restrição da zona espectral (Figura 10), pode observar-se que
existe uma diferença visual significativa principalmente entre as bactérias gram-negativas
(linhas azul e vermelha) e as gram-positivas (linha a vermelho).
Número de onda (cm-1)1000150020002500300035004000
% T
rans
mitâ
ncia
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Número de onda (cm-1)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
38
Figura 10. Espetros dos microrganismos padrão de E. coli, P. aerugionosa e S. aureus pré-processados com SNV e Sav-Gol
(9,2,2) na região 1500-900 cm-1.
5.2.1. Distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos
Inicialmente, fez-se uma análise mais abrangente dos espetros, recorrendo a uma análise
de PCA de todos os espetros adquiridos, em que o primeiro passo foi a determinação do
número de CPs. Uma das formas de determinar este número baseia-se na representação
gráfica dos valores próprios em função do número de CPs. O número a usar deverá ser aquele
a partir do qual se observa uma descida repentina no declive das retas do gráfico (que por sua
vez corresponde ao ponto para o qual a adição de maior número de CPs não trará maior
significância ao modelo): no caso da Figura 11 foram utilizados 3 CPs.
Figura 11. Representação gráfica da variância capturada com o aumento do número de CPs.
900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)
-0.025
-0.02
-0.015
-0.01
-0.005
0
0.005
0.01
0.015
0.02
Abso
rvân
cia n
orm
aliza
da
ECSAPA
Principal Component Number2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Varia
nce
Cap
ture
d (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
Var
iânc
ia c
aptu
rada
(%)
Número de componentes principais
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
39
É possível visualizar a distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos
ao fazer um PCA de todos os espetros (Figura 12): nesta situação existem espetros que não
são concordantes com esta discriminação. Na zona dos gram-negativos (vermelhos) aparecem
os isolados aswa02 e asxy02 incorretamente. Estes não têm identificações no VITEK
concordantes. Este método identificou como Kocuria kristinae (gram-positivo) e como
Staphylococcus, embora ambas as identificações correspondam a microrganismos gram-
positivos, sabemos que estes isolados não são puros pela discordância de identificações, o que
pode justificar a sua localização no mapa de scores.
Figura 12. Mapa de scores dos dois componentes principais do modelo PCA de todos os microrganismos em que a vermelho estão representados os gram-negativos e a verde os gram-positivos de acordo com a informação dada pelo VITEK.
Na Figura 13 pode observar-se a representação tridimensional dos scores do modelo
de PCA após a eliminação dos isolados aswa02 e o asxy02, sendo possível distinguir
claramente as bactérias gram-negativas das gram-positivas.
Os pontos verdes fora do agrupamento são o psau01 e o pssc02. Estes m.o. têm
poucos isolados (e consequentemente poucos espetros) desta espécie, tornando-se bastante
diferentes dos restantes, o que poderá justificar a sua localização. Para avaliar toda a
informação do modelo é necessário observar as estatísticas de Hotelling’s T2 (Figura 14) e
dos resíduos (Figura 15). Este é um modelo construído com todos os espetros adquiridos, que
correspondem a isolados muito diferentes e por esse motivo seria de esperar que os que têm
Scores on PC 1 (44.84%)-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1
Scor
es o
n PC
2 (1
8.26
%)
-0.15
-0.1
-0.05
0
0.05
0.1
0.15 Gram-negativaGram-positiva95% Confidence Level
Scores no CP 1 (43,82%)
Sco
res
no C
P 2
(17,
75%
)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
40
identificações discordantes no VITEK não sejam contemplados pelo modelo construído que
descreve as características da maior parte das amostras.
Figura 13. Mapa de scores do modelo de PCA de todos os microrganismos após eliminar aswa02 e asxy02 ( modelo
construído com 5 CPs).
Figura 14. Representação da estatística de Hotelling’s T2 do modelo de PCA de todos os espetros.
0.1
Scores on PC 1 (44.45%)
0
-0.1-0.05
Scores on PC 5 (5.01%)
0
0.05
0.05
0
-0.05
-0.1
Scor
es o
n PC
3 (6
.35%
)Scores on PC 5 (5.01%)Gram-negativaGram-positiva
Sample50 100 150 200 250 300 350 400
Hot
ellin
g T^
2 (7
9.96
%)
0
10
20
30
40
50
60
70Gram-negativaGram-positivaModel-specific T2 Limit95% Confidence Level
Scores no CP 5 (5,13%) Scores no CP 1 (43,45%)
Sco
res
no C
P 3
(6,7
4%)
Hotelling’s
T2 (8
2,17
%)
Amostra
pssc02
psau01
ppor01
apfr01
psau01
pssc02
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
41
Figura 15. Representação da estatística de resíduos do modelo de PCA de todos os espetros.
A análise de agrupamento hierárquico aglomerado (HCA) ajuda a identificar
semelhanças entre os espetros de microrganismos recorrendo às distâncias entre espetros e a
algoritmos de agregação. A distância utilizada foi a distância euclidiana e o algoritmo de
Ward(94). Este modelo (Figura 16) foi construído a partir dos agrupamentos do modelo de
PCA com 6 CPs. Neste caso, o eixo horizontal dá-nos a distância entre os grupos e avalia a
categorização dos m.o. de acordo com a sua importância para o modelo, em que o grupo dos
m.o. gram-positivos (verde) engloba as variações impostas a m.o. com maior relevância para
o modelo.
Figura 16. Dendrograma feito com os todos os espetros onde estão representados os microrganismos gram-positivos a verde e os microrganismos gram-negativos a vermelho.
Variance Weighted Distance Between Cluster Centers0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center
Class 0Gram-negativaGram-positiva
Amostra
Res
íduo
s Q
(17,
83%
)
Distância ponderada de variância entre centros dos grupos
apfr01
apst01
pslt04
pssc02
pslt03
psau01 pslt02
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
42
5.2.2. Distinção de microrganismos do género Pseudomonas
Foi construído um modelo PCA para os isolados deste género com 5 CPs, em que o 1º
CP descreve aproximadamente 64% do modelo e o 5º, embora não contribua
significativamente para o modelo, permite identificar de forma clara a presença de quatro
espécies diferentes (Figura 17), mostrando-se o número de componentes adequado à
modelação em estudo. É ainda possível observar a elevada similaridade entre as amostras de
cada espécie.
Figura 17. Mapa de scores da família Pseudomonas em que estão representados os CPs 1, 2 e 5.
Na Figura 18 e na Figura 19 estão representadas as estatísticas de resíduos e de
Hotelling’s T2 respetivamente.
Figura 18. Representação da estatística de resíduos para o modelo PCA das Pseudomonas.
0.1
Scores on PC 2 (17.61%)
0.050
-0.05-0.1-0.03
-0.02-0.010
Scores on PC 5 (2.64%)
0.010.02
0.030.04
0.05
0.15
0.1
0.05
0
-0.05
Scor
es o
n PC
1 (6
3.51
%)
Scores on PC 5 (2.64%)P.aerugionosaP.fluorescensP.oryzihabitantsP.stutzeri
Sco
res
no C
P 1
(63,
51%
)
Scores no CP 5 (2,64%) Scores no CP 2 (17,61%)
Res
íduo
s Q
(4,5
6%)
Amostra
ppor01 apfr01 apst01
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
43
Figura 19. Representação da estatística de Hotelling’s T2 para o modelo de PCA do género Pseudomonas.
Pode comprovar-se a correta associação das diferentes espécies através da
classificação do dendrograma da Figura 20. O facto da ramificação correspondente à P.
aeruginosa ser a mais distante das restantes é uma grande vantagem para este estudo, uma vez
que essa é a espécie considerada mais patogénica no género das Pseudomonas. Esta
associação está relacionada também com o número de isolados desta espécie ser maior do que
o das restantes em estudo.
Figura 20. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao género Pseudomonas (foram
usados 6 CPs).
Sample10 20 30 40 50 60 70
Hot
ellin
g T^
2 (9
5.99
%)
0
2
4
6
8
10
12P.aerugionosaP.fluorescensP.oryzihabitantsP.stutzeriModel-specific T2 Limit95% Confidence Level
0 5 10 15 20 250
10
20
30
40
50
60
70
PA01_1 PA01_2 PA01_3 PA03_1 PA03_2 PA03_3 PA02_1 PA02_2 PA02_3 PA04_1 PA04_3 PA04_2 PA01_4 PA01_5 PA01_6 PA04_7 PA04_8 PA04_9 PA02_7 PA02_9 PA02_8 PA03_7 PA03_8 PA03_9 PA03_4 PA03_6 PA03_5 PA01_7 PA01_9 PA01_8 PA02_4 PA02_5 PA02_6 PA04_4 PA04_5 PA04_6 apfr01_1apfr01_3apfr01_2apfr01_7apfr01_8apfr01_9apfr01_4apfr01_5apfr01_6ppor01_1ppor01_2ppor01_3ppor01_4ppor01_6ppor01_5ppor01_7ppor01_8ppor01_9apst01_1apst01_2apst01_3apst01_4apst01_5apst01_6apst01_7apst01_9apst01_8apst02_1apst02_2apst02_3apst02_4apst02_6apst02_5apst02_7apst02_9apst02_8Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center
Class 0P. aeruginosaP. fluorescensP. oryzihabitantsP. stutzeri
0 5 10 15 20 250
10
20
30
40
50
60
70
PA01_1 PA01_2 PA01_3 PA03_1 PA03_2 PA03_3 PA02_1 PA02_2 PA02_3 PA04_1 PA04_3 PA04_2 PA01_4 PA01_5 PA01_6 PA04_7 PA04_8 PA04_9 PA02_7 PA02_9 PA02_8 PA03_7 PA03_8 PA03_9 PA03_4 PA03_6 PA03_5 PA01_7 PA01_9 PA01_8 PA02_4 PA02_5 PA02_6 PA04_4 PA04_5 PA04_6 apfr01_1apfr01_3apfr01_2apfr01_7apfr01_8apfr01_9apfr01_4apfr01_5apfr01_6ppor01_1ppor01_2ppor01_3ppor01_4ppor01_6ppor01_5ppor01_7ppor01_8ppor01_9apst01_1apst01_2apst01_3apst01_4apst01_5apst01_6apst01_7apst01_9apst01_8apst02_1apst02_2apst02_3apst02_4apst02_6apst02_5apst02_7apst02_9apst02_8Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center
Class 0P. aeruginosaP. fluorescensP. oryzihabitantsP. stutzeri
Hotelling’s
T2 (95.
99%
)
Amostra
Distância ponderada de variância entre centros dos grupos 0
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
44
5.2.3. Distinção de microrganismos do género Staphylococcus
O grupo do género Staphylococcus é o que tem maior relevância neste estudo, uma
vez que é o único grupo que tem um número de isolados suficientemente representativo para
uma análise mais conclusiva. Tal como para os estudos dos géneros anteriores, iniciou-se pela
análise exploratória não supervisionada dos espetros deste grupo, fazendo-se em seguida uma
análise supervisionada dos dados através da construção de modelos PLS-DA.
• Análise exploratória
A construção de um modelo PCA com todos os espetros de Staphylococcus teve início
na observação da variância capturada pelo modelo para cada número de CP. Selecionou-se o
número de CPs com maior variância, neste caso 4 (Figura 21). Neste primeiro modelo
também foram incluídos os espetros dos isolados que não tiveram identificações concordantes
no VITEK.
Figura 21. Variância capturada em função do número de CPs para o modelo PCA dos espetros de Staphylococcus.
Ao observarmos o mapa de scores (Figura 22) com todos os espetros, percebe-se que
os isolados pssc02, asxy02 e aswa02 não são concordantes com os restantes, tal como se tinha
constatado pelas identificações não concordantes do VITEK. Estes isolados foram eliminados
e foi feito um novo modelo de PCA.
Variâ
ncia
cap
tura
da (%
)
Número de componentes principais
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
45
Figura 22. Mapa de scores de todos os espetros de Staphylococcus com representação do 1º e 2º CPs.
Os dois primeiros CPs do novo modelo (4 CPs) mostram na Figura 23, que o S.
auricularis (psau01) não se encontra próximo dos restantes. Este isolado embora seja do
mesmo género dos restantes, é o único isolado desta espécie neste modelo. Quando se fala de
distinção entre Staphylococcus, a espécie auricularis apresenta diferenças genéticas
significativas nomeadamente ao nível dos genes sodA, gap, 16S rRNA e hsp60 em relação às
restantes espécies em estudo(95). Estas diferenças genéticas podem refletir-se em diferenças
fenotípicas captadas nos espetros FTIR.
Quando se observa o terceiro CP (Figura 24) podemos ver que o ascp02 se revela
bastante diferente dos restantes. Com o objetivo de compreender a posição destes isolados,
foram feitas as representações dos espetros do ascp02, do psau01 em simultâneo com S.
aureus (Figura 25). Ambos os isolados (psau01 e ascp02) foram identificados de forma
coerente no VITEK, no entanto quanto aos espetros pré-processados observam-se várias
diferenças entre eles, tanto na região dos hidratos de carbono, como na região dos
fosfolípidos/DNA/RNA, o que pode justificar a esta diferença no modelo de PCA.
Scores on PC 1 (24.97%)-0.1 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08
Scor
es o
n PC
2 (1
9.41
%)
-0.1
-0.08
-0.06
-0.04
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
0.08
S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.warneriS.xylosus95% Confidence Level
Sco
res
no C
P 2
(19,
10%
)
Scores no CP 1 (24,60%)
pssc02 psau01
asxy02 aswa02
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
46
Figura 23. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 2º CP.
Figura 24. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 3º CP.
Scores on PC 1 (28.02%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08
Scor
es o
n PC
2 (1
7.80
%)
-0.12
-0.1
-0.08
-0.06
-0.04
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level
Scores on PC 1 (28.02%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08
Scor
es o
n PC
3 (1
0.24
%)
-0.1
-0.05
0
0.05
S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level
Sco
res
no C
P 2
(14,
72%
)
Scores no CP 1 (28,98%)
Sco
res
no C
P 3
(11,
59%
)
Scores no CP 1 (28,98%)
ascp0
2
psau01
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
47
Figura 25. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de 3 isolados diferentes: S. aureus (vermelho), S. capitis (azul) e S. auricularis (verde). Espetros pré-processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2).
As estatística de Hotelling’s T2 e de resíduos (Figura 26) neste modelo consideram
como amostras atípicas ao modelo: psau01, ascp02, pslt02, pslt03, pslt04 e ascc01. O psau01
é uma amostra atípica devido ao facto de existir apenas um isolado desta espécie no conjunto
de amostras. Os isolados pslt02, pslt03 e pslt04 têm identificações não concordantes no
VITEK, e por isso seria de esperar que também fossem atípicas para o modelo. É de salientar
que a maioria destes isolados são provenientes de microrganismos em condições de stress. Os
isolados ascp02 têm identificações concordantes no VITEK, no entanto a análise dos seus
espetros já revelou ter algumas diferenças (Figura 25), o que pode estar relacionado com
alguma contaminação durante a aquisição dos espetros ou durante o crescimento das culturas.
O ascc01 revelou-se concordante na identificação pelo FTIR.
900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)
-0.025
-0.02
-0.015
-0.01
-0.005
0
0.005
0.01
0.015
0.02
Abso
rvân
cia
norm
aliz
ada
SAScp02Sau01
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
48
Figura 26. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PCA do género Staphylococcus.
A HCA foi utilizada para complementar o método de PCA usando o método de Ward e
as distâncias euclidianas. O dendrograma foi obtido a partir dos scores do modelo de PCA(96).
Embora a associação dos seis grupos não seja correta, o grupo dos isolados de S. aureus é o
que se encontra mais distante.
Figura 27. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao género Staphylococcus (foram usados 10 CPs).
Variance Weighted Distance Between Cluster Centers0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
0
50
100
150
200
250
300Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center
S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
Hotelling’s
T2 (6
4,50
%)
Q Resíduos (35,50%)
Distância ponderada de variância entre centros dos grupos
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
49
• Análise supervisionada
Para iniciar a modelação com PLS-DA, incluíram-se todos os espetros de
Staphylococcus, mesmo os que se revelaram não concordantes no VITEK, com exceção do S.
auricularis que por ser apenas um isolado desta espécie não poderia ser incluído no modelo
devido à necessidade de execução da validação cruzada. Antes de criar o modelo PLS-DA foi
também eliminado um isolado – SA01 – para avaliar posteriormente a previsão do modelo
com um isolado puro. O pré-processamento e a gama espectral utilizados foram iguais aos
usados nos modelos PCA. Como é um método supervisionado é necessário nomear as classes,
neste caso com o nome das diferentes espécies em causa. O passo a tomar antes de criar o
modelo é a escolha do método para a validação cruzada do modelo. Os modelos PLS-DA
exigem validação cruzada para garantir a confiabilidade do modelo, pois produzem
separações entre os agrupamentos de diferentes grupos(75). Neste caso, escolheram-se: blocos
contíguos (divide o conjunto em conjuntos de amostras que são contíguas) com um número
máximo de variáveis latentes de 20 e um número de divisão de dados igual a 38 (corresponde
ao número de diferentes microrganismos utilizados neste modelo).
Após a construção do modelo é necessário escolher o número de variáveis latentes.
Para fazer essa escolha deve analisar-se o gráfico do erro da validação cruzada em relação ao
número de variáveis latentes (Figura 28). Neste modelo utilizaram-se três variáveis latentes.
Figura 28. Representação gráfica da percentagem de erro da validação cruzada em função do número de variáveis latentes.
Quando observamos as variáveis latentes 1 e 2 no mapa de scores (Figura 29), existem
três isolados - psvt02, pssc01 e pssc02 - que não são descritos por estas e estão bastante
Latent Variable Number2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
CV
Cla
ssifi
catio
n Er
ror A
vera
ge
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
0.26
0.28
0.3
0.32
Número de variáveis latentes
Méd
ia d
o er
ro d
a cl
assi
ficaç
ão C
V
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
50
distantes das restantes. É necessário reforçar que estes isolados correspondem a amostras
cujas identificações no VITEK não foram coerentes. Além disso, são amostras que foram
recolhidas de contaminações em produtos, o que pode justificar a sua grande diferença das
restantes. As bactérias que crescem numa análise de produto estão em condições de stress por
estarem em contacto com uma substância ativa. A presença microbiana em fármacos é um
fenómeno no qual uma subpopulação de microrganismos é capaz de sobreviver sem adquirir
alterações genéticas que confiram resistência. No entanto, a resistência num estado de stress
intracelular ativo pode acelerar processos de evolução adaptativa(97).
Figura 29. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS dos Staphylococcus.
Ao analisar o mapa de scores e as estatísticas de Hotelling’s T2 e resíduos (Figura 30)
eliminaram-se os isolados psvt02, pssc01, psc02 e aswa02. O aswa02 é um isolado em que as
identificações no VITEK não foram coerentes, por esse motivo seria expectável que não fosse
incluído no modelo.
Scores on LV 1 (81.57%)-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
Scor
es o
n LV
2 (4
.82%
)
-0.06
-0.04
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.vitulinusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level
Sco
res
na v
ariá
vel l
aten
te 2
(4,8
4%)
Scores na variável latente 1 (81,73%)
psvt0
2
pssc0
1
pssc0
2
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
51
Figura 30. Estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA dos Staphylococcus.
Construiu-se um modelo PLS-DA, com 5 variáveis latentes, com alteração do número
de divisão de dados utilizado na validação cruzada(34) correspondente ao número de isolados
deste modelo.
Na Figura 32 é possível ver a discrepância entre os grupos de S. lentus e S. capitis.
Esta discrepância pode justificar-se com as diferenças entre as identificações no VITEK.
Nestas duas classes existem identificações não concordantes no mesmo isolado. Quanto aos S.
lentus, o agrupamento que fazem entre eles no modelo corresponde às identificações do
VITEK, uma vez que o pslt03 e pslt04 são isolados que identificaram espécies diferentes
(Tabela 6). Em relação aos Staphylococcus capitis (Tabela 7) o isolado ascp01 deverá
corresponder a esta espécie embora esta informação não seja conclusiva no VITEK.
Tabela 6. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus lentus.
1ª ID VITEK
2ª ID VITEK
3ª ID VITEK
pslt02 88% 89% 89% pslt03 97% 89% S. sciuri 89% S. sciuri pslt04 99% NID 85% S. sciuri
Os isolados ascp01, ascp03 e ascp04 deverão ser da mesma espécie. Em relação ao
ascp02 já não existe tanta proximidade. No entanto identificações em relação a este m.o. no
VITEK são coerentes. O isolado ascp05 está representado no grupo dos S. warneri o que
Hotelling T^2 (89.02%)0 5 10 15
Q R
esid
uals
(10.
98%
)
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.vitulinusS.warneriS.xylosusModel-specific T2 LimitModel-specific Q Limit95% Confidence Level
Res
íduo
s Q
(11,
01%
)
Hotelling’s T2 (88,99%)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
52
confirma a informação retirada do VITEK em que duas das três identificações indicavam
ascp05 como S. warneri. O espetro deste isolado sobrepõe-se em praticamente toda a região
espetral dos espetros de S. warneri (Figura 31).
Tabela 7. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus capitis.
1ª ID VITEK
2ª ID VITEK
3ª ID VITEK
ascp01 99% Baixa Discriminação
Baixa Discriminação
ascp02 96% 96% 96% ascp03 97% 97% 97% ascp04 98% 98% 98%
ascp05 93% 93% S. warneri
95% S. warneri
Figura 31. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de isolados de S. warneri (verde, rosa, preto e azul), comparado com o
S. capitis (05)(vermelho). Espetros pré-processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2).
No que diz respeito às classes dos S. epidermis, S. cohnii, S. warneri e S.
saprophyticus podemos confirmar os resultados do VITEK com os espetros FTIR, uma vez
que podem observar-se grupos bem definidos destas espécies.
Os isolados inicialmente considerados da espécie S. hominis, embora não existam três
identificações coerentes no VITEK, têm semelhanças nos seus espetros e teria de ser utilizado
um terceiro método de identificação para podermos avaliar se realmente são colónias puras.
Poderia ser feito PCR com estes microrganismos seguido de sequenciação para avaliar a sua
900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)
-0.025
-0.02
-0.015
-0.01
-0.005
0
0.005
0.01
0.015
0.02
Abso
rvân
cia
norm
aliz
ada
Swa01Swa03Swa04Swa05Scp05
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
53
espécie com segurança. A diferença entre os dois isolados desta espécie estará relacionada
com o facto de um dois isolados ser proveniente de uma análise de um fármaco e o outro
recolhido da monitorização ambiental. Outra possibilidade para a resolução desta espécie
seria utilizar-se maior amostragem para que conseguisse definir com maior precisão o grupo
correspondente.
Em relação ao S. xylosus, têm identificações não concordantes no VITEK mas as suas
réplicas dos espetros são concordantes, e pela análise dos espetros FTIR fazem pelo menos
parte do género Staphylococcus.
Figura 32. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS-DA de Staphylococcus.
A distância entre scores (Figura 33) permite avaliar a aptidão do modelo para a
definição de classes: distância de cada amostra ao centro da respetiva classe e distância entre
classes. A classe mais discrepante é a dos Staphylococcus lentus sendo que é na classe
Staphylococcus capitis que existe maior variabilidade entre amostras.
Scores on LV 1 (32.83%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08
Scor
es o
n LV
2 (9
.81%
)
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level
pslt02
ascp02
pslt03, pslt04
ascp01, ascp03, ascp04
ascp05
Sco
res
na v
ariá
vel l
aten
te 2
(9,8
1%)
Scores na variável latente 1 (32,83%)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
54
Figura 33. Mapa tridimensional de scores com as variáveis latentes 1,2 e 3 para o modelo PLS-DA de Staphylococcus.
Na Tabela 8 estão os valores de sensibilidade e especificidade dos dados de calibração para
cada classe, em que a classe com menor sensibilidade é a dos S. capitis e a que tem menor
especificidade é a classe da espécie warneri. Estão também os valores dos erros calculados
sobre os conjuntos que dividem os dados a analisar pela validação cruzada (RMSECV) e o
erro de calibração (RMSEC). A classe que apresenta maiores RMSECV e RMEC é a dos S.
warneri (sendo, portanto, esta a espécie para o qual o modelo demonstra uma menor
performance e um ajuste menos adequado). As estatísticas dos resíduos e de Hotelling’s T2
detetaram como amostras atípicas as amostras da espécie lentus (Figura 34).
Tabela 8. Estatísticas para cada classe do modelo PLS-DA de Staphylococcus.
Espécie Sensibilidade Especificidade RMSECV RMSEC 1- S. aureus 1,000 1,000 0,231 0,170 3- S. capitis 0,778 0,986 0,330 0,225 4- S. conhii 1,000 0,935 0,276 0,232 5- S. epidermidis 1,000 0,952 0,307 0,214 6- S. hominis 1,000 1,000 0,250 0,184 7- S. lentus 1,000 1,000 0,206 0,137 8- S. saprophyticus 0,933 0,952 0,323 0,220 11- S. warneri 1,000 0,864 0,374 0,281 12- S. xylosus 1,000 0,867 0,201 0,186
Scores on LV 1 (32.83%)
0.05
0
-0.05-0.04-0.03
-0.02
Scores on LV 2 (9.81%)
-0.010
0.010.02
0.03
-0.03
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04
Scor
es o
n LV
3 (8
.49%
)
Scores on LV 2 (9.81%)S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
Sco
res
na v
ariá
vel l
aten
te 3
(8,4
9%)
Scores na variável latente 1 (32,83%) Scores na variável latente 2 (9,81%)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
55
Figura 34. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA de Staphylococcus.
De forma a testar o modelo PLS-DA criado, projetou-se o isolado SA01, que não foi
utilizado neste modelo. O modelo consegue prever a classe deste isolado como se pode ver no
mapa de scores da Figura 35 a cinzento, no grupo dos S. aureus. A Figura 36 é uma das
representações que serve de forma a avaliar uma amostra de previsão verificando-se que o
modelo considera o SA01 como S. aureus, tal como esperado.
Figura 35. Mapa de scores do modelo PLS-DA de previsão com os dados de teste (SA01).
pslt04 pslt03
pslt02
Hotelling’s
T2 (65,
28%
)
Residuos Q (p=0.950) (34,72%)
Scor
es n
a va
riáve
l lat
ente
5 (4
,12%
)
Scores na variável latente 2 (9,81%) Scores na variável latente 1 (32,83%)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
56
Figura 36. Previsão da amostra de teste SA01 como membro da classe de S. aureus.
De forma a avaliar a robustez do método proposto, foi necessário determinar a
possibilidade de identificar isolados que não pertençam às espécies modeladas. Esperava-se
que quando um isolado pertencente a um tipo de espécie diferente fosse examinado com este
modelo, este seria identificado como diferente ou não pertencente a qualquer um dos tipos de
espécie incluídos. Assim, foram utilizados nove isolados para testar o modelo, não tendo sido
estes utilizados no modelo PLS-DA.
Para avaliar a capacidade de prever o pssc02 (este isolado foi identificado como S.
sciuri e depois como S. lentus no VITEK), pode observar-se na Figura 37 através da previsão
de classes que este não associa a amostra desconhecida a nenhuma destas. No entanto, existe
probabilidade de ser S. lentus quando vemos a probabilidade de previsão desta classe (Figura
38). Esta amostra considera-se desconhecida para o modelo, tanto pela análise da sua
contribuição para o mesmo como pela análise das estatísticas de Hotelling’s T2 e resíduos
(Figura 39).
SA01
S. aureus utilizados na calibração
Amostra
Pre
visã
o de
cla
sses
(S.aureus)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
57
Figura 37. Previsão da classe da amostra para pssc02.
Figura 38. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra pssc02.
pssc02
pssc02
S. lentus utilizados na calibração
Pre
visã
o re
strit
a de
cla
sses
Amostra
Pre
visã
o de
cla
sses
(S.lentus
)
Amostra
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
58
Figura 39. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e dos resíduos com a projeção da amostra desconhecida (pssc02).
A amostra seguinte utilizada para testar o modelo foi o pssc01. Este isolado foi
coerentemente identificado pelo VITEK, no entanto como a classe S. sciuri não está
representada no modelo: este não o conseguiu associar a nenhuma das restantes classes
(Figura 40).
Figura 40. Previsão da classe da amostra para pssc01.
pssc02
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pr
ed S
trict
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
pssc01
Pre
visã
o re
strit
a de
cla
sses
Amostra
Hotelling’s T2 (p=0.950)(62,44%)
Res
íduo
s Q
(p=0
.950
)(37,
56%
)
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
59
Quando se faz a projeção do isolado aslt01 no modelo, este não o associa a nenhuma
classe (Figura 41), no entanto na Figura 42 revela-se semelhante à classe dos S. lentus.
Figura 41. Previsão da classe da amostra para aslt01.
Figura 42. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra aslt01.
Foram considerados os espetros do isolado psau01 como amostra desconhecida para o
modelo e como seria expectável, o modelo considera-a uma amostra atípica, uma vez que esta
classe não se encontra representada no modelo. O mesmo acontece para o isolado psvt01 e
psvt02 (Figura 43).
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pr
ed S
trict
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
aslt01
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pr
ed M
embe
r S.le
ntus
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
aslt01
S. lentus utilizados na calibração
Pre
visã
o re
strit
a da
cla
sse
Amostra
Pre
visã
o re
strit
a da
cla
sse
S.lentus
Amostra
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
60
Figura 43. Previsão da classe da amostra para psvt02.
Em relação à classe S. warneri, embora esteja representada no modelo de previsão, o
isolado aswa02 é considerado desconhecido, o que está de acordo com os resultados do
VITEK em que este tem identificações como K. kristinae.
Tal como acontece anteriormente, o modelo PLS-DA também não associa o asxy02 a
outra classe (Figura 44), uma vez que este isolado teve identificações como K. kristinae
poderá não ser uma amostra pura e por esse motivo bastante diferente da classe de S. xylosus
representada neste modelo (Figura 45).
Figura 44. Previsão restrita da classe da amostra para asxy02.
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pr
ed S
trict
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
psvt02
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pr
ed S
trict
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
asxy02
Pre
visã
o re
strit
a da
cla
sse
Amostra
Pre
visã
o re
strit
a da
cla
sse
Amostra
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
61
Figura 45. Probabilidade de previsão da classe de S. xylosus para o isolado asxy02.
Em suma, na Tabela 9 estão os resultados dos 9 isolados utilizados para testar o
modelo PLS-DA construído com os espetros dos isolados dos Staphylococcus. Os resultados
pelo FTIR comprovam os resultados do VITEK. No entanto seria necessário testar o modelo
com maior número de amostras pertencentes às restantes classes, uma vez que só foi testada
uma amostra pertencente à classe de S. aureus.
Tabela 9. Resumo dos resultados do VITEK e da previsão pelo modelo PLS-DA das amostras utilizadas para testar o modelo.
Amostra/ Isolado Resultado VITEK Resultados PLS-DA
SA01 Concordantes (m.o. padrão) Previsão na classe correta
psau01 Concordantes Não prevê
pssc01 Concordantes Não prevê
pssc02 Não concordantes Não prevê
aslt01 Não concordantes Não prevê
aswa02 Não concordantes Não prevê
psvt01 Não concordantes Não prevê
psvt02 Não concordantes Não prevê
asxy02 Não concordantes Não prevê
Sample50 100 150 200 250
Clas
s Pre
d M
embe
r S.xy
losus
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus
asxy02
Amostra
Pre
visã
o re
strit
a da
cla
sse
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
62
6. Conclusões e perspetivas futuras
Neste estudo provou-se que o método utilizado é eficaz na distinção de
microrganismos gram-positivos de gram-negativos dentro dos géneros de Staphylococcus e
Pseudomonas. Esta distinção permite que este método possa vir a ser utilizado em parceria
com o VITEK, uma vez que esta distinção é necessária para a escolha das cartas a utilizar
neste método bioquímico. Devido à rapidez e facilidade de aquisição de espetros de
contaminantes de fármacos pelo método espetroscópico em estudo, esta ferramenta poderia
ser utilizada no laboratório de microbiologia como técnica de distinção de m.o. gram-
positivos de gram-negativos. Este passo permitiria reduzir os custos do método atualmente em
uso - ID Endosafe®-PTS ™ Gram - que requer cartuchos de identificação descartáveis.
A separação da P. aeruginosa das restantes amostras do mesmo género revelou-se
coerente com os resultados do VITEK, apenas com a construção de modelos de PCA. Seria
necessária a recolha de um maior número de amostras para poder avaliar os dados com maior
detalhe num modelo supervisionado como o PLS-DA.
Em relação aos Staphycoccus, os resultados na sua maioria são coerentes com os
resultados do VITEK. No caso do ascp05 foram necessárias três identificações no VITEK
para perceber que a primeira identificação (por norma apenas existe uma identificação quando
há crescimento bacteriano) não correspondia ao microrganismo correto, o isolado em questão
seria uma S. warneri que foi imediatamente localizado no mapa de agrupamentos junto à
classe dos S. warneri. Em relação aos nove microrganismos utilizados para testar o modelo
PLS-DA construído, os resultados foram concordantes com os do VITEK, apenas porque
excepcionalmente foram feitas três identificações por este método. Tal não acontece numa
situação de rotina o que permite concluir que existem alguns erros associados a este método
de identificação.
Durante a recolha de m.o., não foi possível detetar, na flora residente, estirpes do
género Escherichia, por esse motivo, apenas foram utilizados m.o. padrão da espécie
Escherichia coli para a construção de modelos de PCA para distinção de bactérias gram-
negativas de gram-positivas.
No entanto, para que o FTIR-ATR pudesse ser implementado como um método
alternativo ao VITEK, seria necessário construir modelos de PLS-DA com um maior número
de amostras, tanto a nível de variabilidade de espécie como de amostras da mesma espécie.
Para aumentar a robustez do modelo seria necessária a utilização de métodos como a
sequenciação para identificação dos isolados puros. Para além disso seria necessário repetir
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
63
este procedimento para cada um dos géneros dos m.o. específicos que são alvo de pesquisa na
análise microbiológica de medicamentos não-estéreis: Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, e bactérias gram-negativas tolerantes à bílis.
O método FTIR-ATR na identificação de m.o. revelou-se vantajoso para a
discriminação de espécies do género Staphylococcus, sendo este método significativamente
mais rápido e com um custo muito inferior ao do VITEK. Cada identificação no VITEK tem
um preço de aproximadamente de 14€ (somente em consumíveis) e um tempo de
identificação mínimo de 4 horas, enquanto que o custo de um espetro é aproximadamente de
1€ (somente em consumíveis) e o tempo de aquisição ronda os minutos, o que revela que este
seja um método com potencial para a indústria farmacêutica.
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
64
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Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
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Anexos
Anexo 1: Diferenciação das espécies de Staphylococcus através das suas características biológicas e bioquímicas (23).
Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho
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Anexo 2: Resultado do VITEK para uma amostra padrão de S. aureus.
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