UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO EM CARDIOMIÓCITOS DE RATOS DESNUTRIDOS
Autor: Carlos Augusto Costa Cabral Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva (UFOP)
Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali (UFV)
OURO PRETO - MG 2013
ii
Catalogação: [email protected]
C117e Cabral, Carlos Augusto Costa. Efeitos do exercício físico em cardiomiócitos de ratos desnutridos
[manuscrito] / Carlos Augusto Costa Cabral. - 2013. 89f.: il. color.; grafs., tabs. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva. Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Exercícios físicos - Aspectos fisiológicos - Teses. 2. Nutrição - Teses. 3. Desnutrição - Teses. 4. Morfologia (Biologia) - Teses. 5. Miocárdio - Contratilidade - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II. Natali, Antônio José. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.
CDU: 612.172:616.39
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO EM CARDIOMIÓCITOS DE RATOS DESNUTRIDOS
Autor: Carlos Augusto Costa Cabral Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva (UFOP)
Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali (UFV)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
OURO PRETO – MG 2013
CABRAL, C. A. C. Dedicatória
iv
DEDICATÓRIA
Ao meu querido e único irmão, Fernando Costa Cabral, falecido em 11/10/1983, e
à minha querida mãe, Léa da Costa Cabral, falecida em 31/03/2004. Vocês me ensinaram
verdadeiramente o sentido da luta pela vida, pois eu, que sou judoca, passei grande parte
de minha vida achando que lutava. Eu os amo e sinto falta de vocês.
Saudades!
CABRAL, C. A. C. Agradecimentos
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida.
À minha família, base de sustentação de minha caminhada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, pela oportunidade de realizar este Curso.
À Universidade Federal de Viçosa pelo investimento em meu treinamento.
Aos professores Dr. Marcelo Eustáquio Silva e Dr. Antônio José Natali, pela
acolhida, pela orientação e pelos conselhos, que me permitiram não só realizar este
estudo, mas, também, crescer como pessoa e profissionalmente.
Aos professores Dr.a Maria do Carmo Gouveia Peluzio, Dr. Mauro César Isoldi
e Dr. Wanderson Geraldo de Lima pela rica contribuição prestada durante o meu Exame
de Qualificação.
Ao professor Dr. Carlos Henrique Osório Silva, pela ajuda nas análises
estatísticas.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Ouro Preto, os quais, direta ou indiretamente, contribuíram
para o êxito deste trabalho.
Aos funcionários do NUPEB, da Coordenação do Programa, em especial à ex-
secretária Cida Trópia, pela eficiência e competência.
Aos funcionários e colegas do Laboratório de Nutrição Experimental
(LABNEX), da Escola de Nutrição da UFOP, e do Laboratório de Biologia do Exercício
(BIOEX), do Departamento de Educação Física da UFV.
A todos os colegas do doutorado, pela convivência, pelo aprendizado e pela
força.
CABRAL, C. A. C. Resumo
vi
RESUMO
Este estudo avaliou os efeitos de um programa de corrida, de baixa intensidade (50-60%
do VO2max), em esteira, nas propriedades morfológicas e mecânicas dos miócitos
cardíacos isolados do ventrículo esquerdo (VE) de ratos desnutridos. Após oito semanas
de dieta hipoproteica para o grupo desnutrido e treinamento para o grupo treinado, os
miócitos do VE destes animais e dos respectivos controles foram isolados, tendo suas
dimensões e função contrátil medida. Não houve interação entre o exercício e estado
nutricional para os parâmetros analisados, portanto, esses foram analisados
separadamente: nutridos versus ratos desnutridos, e treinados contra ratos sedentários.
Os resultados mostraram que os ratos desnutridos exibiram massa corporal inferior aos
do controle. Notou-se que os miócitos dos animais nutridos, em comparação aos dos
desnutridos, apresentaram comprimento, largura e volume celular médio superior, de
acordo com o parâmetro nutrição. Entretanto, em relação ao treinamento, o
comprimento celular não diferiu estatisticamente entre treinados e sedentários; já a
largura e o volume celular dos treinados apresentaram valor médio superior aos dos
sedentários. A restrição de proteína na dieta provocou disfunções dos miócitos,
reduzindo a amplitude de contração, a velocidade de contração e relaxamento celular. O
treinamento físico em contraste inverteu essas disfunções dos miócitos do VE,
restaurando estes parâmetros celulares mecânicos para os níveis de controle.
CABRAL, C. A. C. Abstract
vii
ABSTRACT
This study evaluated the effects of a treadmill running program on the
morphological and mechanical properties of single left ventricular (LV) myocytes
isolated from malnourished rats. After eight weeks of protein restricted diet
(malnourished group) and exercise training (exercised group), LV myocytes were
isolated from this rats and their respective controls and had its dimensions and
contractile function measured. There was no interaction between the exercise and
nutritional status for the analyzed parameters, thus the factors were analyzed separately:
control versus malnourished rats, and trained versus sedentary rats. The results showed
that malnourished rats exhibited lower body, heart and ventricular mass, and cell length,
width and volume than control rats. Trained rats presented higher cell width and volume
than sedentary rats. The protein restricted diet induced LV myocyte dysfunctions by
reducing cell shortening amplitude and prolonging the time courses of cell shortening
and relaxation. Exercise training in contrast reversed these LV myocyte dysfunctions by
restoring these cell mechanical parameters to the control levels.
CABRAL, C. A. C. Lista de Tabelas
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dieta dos animais de experimentação e suas respectivas concentrações em g/kg ................................................................................................................................. 16
Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão do teste de exaustão no final do experimento com resultados* das comparações entre médias dos Grupos de animais Nutridos (NT vs NS) e Desnutridos (DT vs DS) ............................................................ 27
Tabela 3 - Valor de referência, valor médio e desvio-padrão dos parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina dos Grupos de animais NT, NS, DT e DS ................................................................................................................................... 28
Tabela 4 - Modelos de regressão ajustados para o perfil semanal da média de massa corporal dos Grupos NT, NS, DT e DS .......................................................................... 29
Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R1) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ................................................................................... 31
Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R2) com resultados* das comparações entre os Grupos ded animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ................................................................................... 32
Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia ventricular (IHV) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ................................................................................... 33
Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão do comprimento celular, da largura celular e do volume celular de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ................................................................................................................. 35
Tabela 9 - Valores médios e desvios-padrão da amplitude de contração (PPA) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ........................... 37
Tabela 10 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de contração (MVC) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ......... 39
Tabela 11 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de relaxamento (MVR) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ......... 40
CABRAL, C. A. C. Lista de Figuras
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação dos pontos de mensuração da imagem dos miócitos cardíacos. ........................................................................................................................................ 18
Figura 2 - Câmara experimental acoplada ao microscópio invertido. ............................ 20
Figura 3 - Representação do programa utilizado para aquisição das imagens e dos registros das contrações dos miócitos cardíacos (Ionoptix, EUA). ................................. 20
Figura 4 - Registro experimental de encurtamento de uma célula do ventrículo esquerdo estimulada na frequência de 3 Hz, em temperatura ambiente (~25 oC).......................... 21
Figura 5 - Diagrama demonstrativo do encurtamento de um cardiomiócito estimulado na frequência de 3 Hz (~25 oC) e dos respectivos parâmetros da contração analisados. .... 22
CABRAL, C. A. C. Lista de Abreviaturas e Siglas
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – Análise de variância
ATPase – Enzimas que catalisam a hidrólise do ATP 0C – Graus Celsius
Ca2+ - Íon cálcio
CaCl2 – Cloreto de cálcio
CaMKII – Cálcio calmodulina quinase II
Cl – Íon cloreto
cm – centímetro
DEP - Desnutrição energético-proteica
DS – Desnutrido sedentário
DT – Desnutrido treinado
CEUA - Comissão de Ética para Uso de Animais
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COMP - Comprimento celular
CO2 – Dióxido de carbono
DES-UFV – Departamento de Educação Física – Universidade Federal de Viçosa
DP – Desvio padrão
EGTA – Ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid
ENDO – Endocárdio
EPI - Epicárdio
g/L – Gramas por litro
HCO3 – Íon bicarbonato
HEPES – N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid
Hz – Hertz
IHC - Índice de hipertrofia cardíaca
IHC1 - Índice de hipertrofia cardíaca = massa coração (mg)/massa corporal (g),
denominado R1
IHC2 - Índice de hipertrofia cardíaca = massa coração (g)/comprimento da tíbia (cm),
denominado R2
IHV - Índice de hipertrofia ventricular
K+ - Íon potássio
KCL – Cloreto de potássio
CABRAL, C. A. C. Lista de Abreviaturas e Siglas
xi
L – Litro
LARG - Largura celular
M – Molar
m – Metro
mg – Miligrama
min – Minuto
mL – Mililitro
mm – Milímetro
mM – Milimolar
ms – Milisegundo
MVC - Máxima velocidade de contração
MVR - Máxima velocidade de relaxamento
min/d – Minuto por dia
m/min – Metro por minuto
µL – Microlitro
µm – Micrômetro
µM – Micromolar
MgCl2 – Cloreto de magnésio
Mg2+ - Íon magnésio
NaCl – Cloreto de sódio
Na+ - Íon sódio
NCX – Trocador de sódio-cálcio
NS – Nutrido sedentário
NT – Nutrido treinado
O2 – Oxigênio
pH – Potencial hidrogeniônico
pL – Picolitro
PLB - Fosfolambam
PPA - Amplitude de contração
RPM – Rotação por minuto
RS – Retículo sarcoplasmático
RyR2 – Canais receptores de rianodina
SAS - Statistical Analysis System
seg – Segundo
CABRAL, C. A. C. Lista de Abreviaturas e Siglas
xii
SERCA2a – Cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático
SO4 – Íon sulfato
TGO - Transaminase glutâmica oxalacética
TGP - Transaminase glutâmica pirúvica
VE – Ventrículo esquerdo
VOLM - Volume celular
VO2máx – Consumo máximo de oxigênio
Vs – Versus
CABRAL, C. A. C. Índice
xiii
ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 4
2.1. Objetivo geral ........................................................................................................ 4
2.2. Objetivo específico ................................................................................................ 4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 5
3.1. Desnutrição ............................................................................................................ 5
3.3. O coração: miocárdio e miócitos ........................................................................... 8
3.4. O exercício físico e as adaptações morfológicas provocadas no coração .............. 9
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 14
4.1. Animais de experimentação ................................................................................. 14
4.2. Grupos experimentais .......................................................................................... 14
4.3. Adaptação ao treinamento físico .......................................................................... 14
4.4. Teste de exaustão ................................................................................................. 15
4.5. Protocolo de treinamento físico ........................................................................... 15
4.6. Dietas ................................................................................................................... 15
4.7. Parâmetros sanguíneos ......................................................................................... 16
4.8. Análises do tecido muscular cardíaco .................................................................. 16
4.8.1. Massa do coração e dos ventrículos .............................................................. 16
4.8.2. Isolamento dos miócitos cardíacos ............................................................... 17
4.8.3. Comprimento, largura e volume celular ....................................................... 18
4.8.4. Contração celular .......................................................................................... 19
4.9. Soluções ............................................................................................................... 22
4.10. Análises estatísticas ........................................................................................... 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 26
5.1. Desempenho físico dos animais ........................................................................... 26
5.1.1. Teste de exaustão .......................................................................................... 26
5.2. Caracterização dos Grupos de animais ................................................................ 27
5.2.1. Parâmetros bioquímicos ................................................................................ 27
5.2.2. Massa corporal .............................................................................................. 28
5.3. Tecido muscular cardíaco .................................................................................... 30
5.3.1. Índice de hipertrofia cardíaca (IHC) ............................................................. 30
5.3.1.1. Variável IHC1, denominada R1 ............................................................. 31
5.3.1.2. Variável IHC2, denominada R2 ............................................................. 31
5.3.2. Índice de hipertrofia ventricular (IHV) ......................................................... 32
5.3.3. Propriedades morfológicas dos cardiomiócitos ............................................ 33
CABRAL, C. A. C. Índice
xiv
5.3.3.1. Relação de comprimento celular (COMP), largura celular (LARG) e volume celular (VOLM) entre animais nutridos versus desnutridos e treinados versus sedentários ............................................................................................... 34
5.4. Propriedades mecânicas dos cardiomiócitos ........................................................ 36
5.4.1. Amplitude de contração (PPA) ..................................................................... 36
5.4.2. Máxima velocidade de contração (MVC) ..................................................... 38
5.4.3. Máxima velocidade de relaxamento (MVR) ................................................ 39
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 412
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 423
ANEXO ....................................................................................................................... 478
CABRAL, C. A. C. Introdução
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, o número de praticantes de atividade física cresceu
vertiginosamente; entretanto, a principal causa não foi a saúde e sim a questão estética.
Para atingir o “padrão” de beleza, muitos indivíduos sacrificam-se com dietas radicais e
exercícios extenuantes, principalmente os de sobrecarga progressiva, não respeitando os
limites como sexo, condição física etc. Dentro desse raciocínio, a fim de obter melhor
performance, há o temor em relação ao malefício do resultado de forças repetitivas
sobre uma estrutura, que, somado ao desequilíbrio nutricional, pode se tornar um
agravante, potencializando os fatores de risco para a saúde do praticante
A combinação de exercícios que exaurem e dietas radicais ou comportamentos
nutricionais inadequados foi pesquisada por Cabral et al. (2006), os quais
diagnosticaram o estado nutricional de atletas de levantamento de peso. A restrição
calórica é frequente nesse esporte, por ser uma modalidade em que se compete em
categorias de peso corporal. No trabalho desses autores, foram encontrados níveis muito
baixos de porcentual de gordura corporal, o que torna esse tipo de estratégia inviável ou
perigoso, tanto na questão de rendimento físico como na de saúde.
A alimentação é fator primordial na rotina diária da humanidade, não apenas
por se constituir em necessidade básica, mas principalmente porque a sua utilização
tornou-se um problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso ou falta pode
causar doenças (WHO, 2011).
Segundo Antiwi (2008), a desnutrição energético-proteica é caracterizada pela
existência de um desequilíbrio entre o fornecimento de nutrientes e a demanda corporal.
O coração é um órgão cujas porções atriais e ventriculares trabalham com a
função de fornecer o fluxo sanguíneo adequado a todos os órgãos do corpo, atendendo
as diferentes exigências metabólicas, em resposta às interferências do meio externo, e
garantindo a homeostase (MOORE; DALLEY, 2009).
O músculo cardíaco é composto por tecido que apresenta expressiva adaptação
ao treinamento físico, o que torna esse músculo capaz de suportar mudanças em suas
propriedades bioquímicas, funcionais e morfológicas. Os mecanismos dessas
adaptações não estão completamente esclarecidos; entretanto, em nível intracelular,
esses parecem ser decorrentes de estímulos externos, associados à nutrição sobre
diferentes vias de sinalização, que induzem adaptações na atividade de enzimas
intracelulares (DRÖGE, 2007).
CABRAL, C. A. C. Introdução
2
As principais adaptações morfológicas do coração ao exercício físico crônico
são as alterações no tamanho do músculo, como a hipertrofia concêntrica, caracterizada
pelo aumento da espessura das paredes ventriculares e a excêntrica, que é a resposta
adaptativa ao aumento do volume sanguíneo, durante a diástole, que promove a adição
de sarcômeros em série, resultando em aumento da dimensão interna da câmara
ventricular (NATALI, 2004).
As diversas situações, que requerem adaptações do organismo para manter seu
equilíbrio interno, provocam alterações no funcionamento do sistema cardiovascular por
meio da regulação neuro-humoral. É o caso, por exemplo, de variações na temperatura
ambiental, na mudança de altitude, nas infecções, no estresse, no envelhecimento, na
atividade física e na alimentação (PENALOZA; ARIAS-STELLA, 2007).
No início dos estudos sobre os efeitos da desnutrição, acreditou-se que o
coração seria poupado em relação aos outros órgãos. Atualmente, após mais de um
século de pesquisas realizadas in vivo e in vitro, utilizando diferentes modelos
experimentais, é comprovado que a desnutrição também afeta o coração e pode
provocar danos à sua estrutura e função como atrofia do miocárdio, com mudanças na
contratilidade e elasticidade, levando a alterações no débito cardíaco e na pressão
arterial (OKOSHI et al., 2009).
Ao contrário da desnutrição, que provoca danos ao sistema cardiovascular, a
prática regular de atividade física pode trazer grandes benefícios à saúde, incluindo a
melhora das condições cardiorrespiratórias. Essa prática tem sido recomendada para
prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares e seus fatores de risco, como
sedentarismo, diabetes, hipertensão, dislipidemia e obesidade, visando à melhoria do
condicionamento físico e da qualidade de vida. O exercício físico, de acordo com a
modalidade, intensidade, duração e freqüência, atua como fator de estresse fisiológico
para o organismo por causa da sobrecarga energética imposta, levando a diversas
adaptações hemodinâmicas e autonômicas, que diferenciam indivíduos treinados de
sedentários, e tem efeito, principalmente, sobre a frequência cardíaca, contratilidade do
miocárdio e pressão arterial (MORAES, 2009).
Muitos estudos demonstram as adaptações provocadas pelo exercício físico,
poucos trabalhos investigam os efeitos benéficos ou estressantes da interação entre
desnutrição e prática de exercício físico (OLIVEIRA, 2007). A partir dessa lacuna na
literatura, objetivou-se investigar se há algum tipo de interação entre essas variáveis,
avaliando a atuação do exercício físico regular de baixa intensidade, sobre as
CABRAL, C. A. C. Introdução
3
propriedades morfológicas e mecânicas dos cardiomiócitos do coração de ratos
submetidos à desnutrição proteica desde o desmame até a eutanásia.
CABRAL, C. A. C. Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar os efeitos do exercício físico em cardiomiócitos de ratos desnutridos.
2.2. Objetivo específico
Verificar se um programa de corrida em esteira, de baixa intensidade (50-60%
do VO2max), altera as propriedades morfológicas (comprimento, largura e volume
celular) e mecânicas (amplitude de contração, máxima velocidade de contração e
máxima velocidade de relaxamento) dos miócitos cardíacos isolados do ventrículo
esquerdo de ratos desnutridos.
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Desnutrição
A desnutrição energético-proteica (DEP) é caracterizada pela existência de um
desequilíbrio entre o fornecimento de nutrientes e a demanda corporal, responsável por
assegurar o bom funcionamento do organismo (ANTIWI, 2008).
A alimentação é fator primordial na rotina diária da humanidade, não apenas
por se constituir em necessidade básica, mas principalmente porque a sua utilização
tornou-se problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso ou falta pode causar
doenças. Para Lochs et al. (2006), a desnutrição está definida como o estado nutricional
em que ocorre deficiência ou excesso de energia, proteína e outros nutrientes, causando
alteração física, tecidual, funcional e clínica.
Hoje em dia é cada vez mais claro que, para uma compreensão real das
doenças e suas conseqüências, é fundamental o entendimento dos aspectos
antropológicos, o dinamismo psicológico e o diagnóstico social das pessoas em situação
de debilidade física (SAWAYA, 2006). A Organização Mundial de Saúde (OMS)
preconiza que, para que aconteça melhora na situação alimentar do mundo, os
problemas de saúde e social precisam ser reconhecidos e corrigidos, uma vez que a
desnutrição grave é uma desordem em que a situação de saúde da criança resulta, em
parte, das condições sociais do domicílio em que essa vive (WHO, 2011). Por se tratar
de uma doença de natureza clínico-social multifatorial, cujas raízes se encontram na
pobreza, a prevenção e o controle da desnutrição dependem de medidas mais amplas e
eficientes de combate à pobreza e à fome e de políticas de inclusão social. Talvez pela
dificuldade de se definirem estratégias de prevenção e tratamento que englobem todas
as necessidades acerca da desnutrição, a deficiência ou a falta de nutrição ainda seja
responsável por 55% das mortes de crianças no mundo inteiro, estando associada a
várias outras patologias e sendo considerada a doença que mais mata crianças abaixo de
cinco anos (SAWAYA, 2006).
No Brasil, apesar de os estudos epidemiológicos indicarem que a prevalência
da desnutrição energético-proteica tem diminuído, a doença continua a ser um relevante
problema de saúde pública no País, principalmente nas regiões Norte e Nordeste, na
área rural do Brasil e nos bolsões de pobreza das periferias das grandes metrópoles, com
consequências desastrosas para a sobrevida e saúde das crianças (WHO, 2011).
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
6
A desnutrição causada por deficiência proteica é também vastamente
encontrada no Brasil e em países em desenvolvimento. Nesse tipo de desnutrição, a
disponibilidade de calorias pode existir, porém sem ingestão de produtos ricos em
proteínas. Esse fato deve-se em geral à dificuldade de obter alimentos que sejam fonte
de proteínas, principalmente por se tratarem de produtos com custo mais elevado (DE
SOUZA; MIRANDA-NETO, 2007). A desnutrição proteica é altamente prejudicial ao
organismo uma vez que as proteínas são moléculas essenciais aos organismos dos
animais, devendo, portanto, estar presentes na alimentação em quantidades adequadas.
A composição de proteína da dieta é fator importante a ser considerado, a partir do
momento que dos 20 aminoácidos que constituem as proteínas, nove são considerados
essenciais, ou seja, não são sintetizados pelo organismo e devem ser adquiridos através
da alimentação (GURMINI et al., 2005).
Sabe-se que, em humanos, estudos sobre a desnutrição são muito mais
observacionais do que averiguações experimentais, tornando-se importante a avaliação
por meio de práticas experimentais em modelo animal. O uso de animais em pesquisa
permite controle do tempo e dos níveis desejados da carência nutricional que se
pretende estudar; o rato, modelo animal mais utilizado em estudos, apresenta vantagens
como facilidade de manejo e alta capacidade de adaptação aos diferentes protocolos de
desnutrição empregados, bem como possui metabolismo acelerado, o que permite
investigações experimentais rápidas, principalmente daqueles distúrbios promovidos
pela desnutrição apenas tardiamente no ser humano (BELLO et al., 2005).
Vários são os modelos experimentais utilizados para provocar a desnutrição em
ratos como a indução dessa doença durante a gestação, diminuindo o teor protéico da
dieta das fêmeas grávidas ou após o nascimento; e o aumento da ninhada durante a
amamentação (TATLI et al., 2007). Pode-se também reduzir o conteúdo de proteínas da
dieta oferecida à fêmea que está amamentando ou, ainda diminuir esse conteúdo da
dieta oferecida aos filhotes, logo após o desmame; esse último modelo foi o escolhido
para este trabalho.
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
7
3.2. Desnutrição, estresse e patologias associadas
De acordo com Vieira e De Lima (2002), a vida existe por causa da
manutenção da homeostase. Essa condição de equilíbrio das propriedades físico-
químicas e metabólicas do meio interno é constantemente desafiada por forças adversas
intrínsecas e extrínsecas. O estresse pode ser entendido como um estado de homeostase
ameaçado ou em desequilíbrio. Se os mecanismos para lidar com o enfrentamento de
situações em que existem estressores não forem eficientes, ocorre o estresse via ativação
de sistemas complexos, que resultam em alterações hormonais, autonômicas e
comportamentais. Os estressores potenciais podem ser ambientais (frio, calor),
psicológicos (depressão, ansiedade), sociais (desemprego, morte de pessoas próximas) e
nutricionais (deficiência de alimentação adequada quantitativa e qualitativa); aliados às
características individuais da pessoa, são determinantes na ruptura da homeostase
interna do organismo humano (GREENBERG, 2002).
Diversos sistemas são afetados pela desnutrição, o que pode levar ao mau
funcionamento de órgãos e, consequentemente, ao desenvolvimento de doenças. A
gravidade dessas alterações é dependente do tempo de exposição e da fase da vida que o
indivíduo é submetido à desnutrição. Vários autores já demonstraram em humanos que
a desnutrição na fase inicial da vida leva a um crescimento deficiente, ou seja, crianças
desnutridas são mais baixas e pesam menos do que deveriam para a idade delas. Em
animais, também se nota um prejuízo no desenvolvimento, com depleção de massa
muscular e diminuição do peso. Observou-se em ratos desnutridos, durante a gestação,
significativa redução no peso e tamanho de diversos órgãos como o rim, adrenal e
tecido cerebral e prejuízo na função desempenhada por esses (SAWAYA et al., 1998).
Segundo Bernardis et al. (1986), o hipotálamo é a principal região do sistema
nervoso central (SNC), que atua no controle da homeostase, e seus efeitos estão
diretamente envolvidos na regulação central da ingestão de alimentos, no peso corporal,
no metabolismo e na atividade autonômica cardiovascular; portanto, essa área é
fortemente afetada pela desnutrição.
Estudos apresentaram efeitos deletérios da desnutrição após o período de
amamentação sobre o sistema cardiovascular. Tropia e colaboradores, em 2001,
demonstraram aumento da sensibilidade do barorreflexo e do reflexo Bezold-Jarisch em
animais submetidos a uma dieta contendo 6% de proteína. Ainda nesse trabalho, foi
observado aumento do tônus vasomotor simpático nos animais.
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
8
Utilizando o mesmo modelo animal, Oliveira e colaboradores (2004)
observaram aumento dos níveis basais de frequência cardíaca (FC) e pressão arterial
(PA), além do aumento da variabilidade desses parâmetros quando analisados no
domínio do tempo. Loss et al., em 2007, demonstraram uma perturbação da homeostase
cardiovascular decorrente da desnutrição proteica. Nesse trabalho, foram evidenciadas
mudanças no ganho do barorreflexo antes e após bloqueios autonômicos, além de
alteração no período de latência da resposta barorreflexa. Ainda segundo os autores,
essas alterações na modulação da atividade autonômica eferente seriam responsáveis
pela manutenção dos altos valores de FC e da PA média basal.
3.3. O coração: miocárdio e miócitos
O miocárdio dos mamíferos é constituído por fibras musculares cardíacas,
vasos sanguíneos e tecido conjuntivo. No coração normal, esse estroma conjuntivo se
distribui, formando o epimísio, que envolve toda a musculatura cardíaca (conjuntivo
subepicárdico); o perimísio, que separa feixes de fibrocélulas; e o endomísio, que se
dispõe ao redor de cada miócito. Esse tecido conjuntivo exerce papel importante na
manutenção da integridade funcional do miocárdio (BURLEW; WEBER, 2000).
Os miócitos cardíacos são células alongadas e ramificadas, que se unem por
meio dos discos intercalares. Essas células exibem estriações transversais e possuem um
ou, no máximo, dois núcleos localizados centralmente. Entre os miócitos cardíacos, o
tecido delicado (endomísio) sustenta uma rica rede capilar necessária para atender a
elevada demanda metabólica de uma atividade contrátil forte e contínua (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2000).
Embora o volume do miocárdio seja quase inteiramente ocupado pelos
miócitos, esses constituem apenas de, aproximadamente, 25% do número total de
células; o restante é representado pelas células do endotélio e do conjuntivo,
predominantemente fibroblastos. No coração adulto, a matriz extracelular consiste de
colágenos tipos I (80%), III, IV, V e VI, proteoglicanos e fibras elásticas. Essa matriz é
sintetizada por fibroblastos, dispostos ao longo dos miócitos; células endoteliais; e
células musculares lisas dos vasos (COTRAN et al., 1994; AIRES, 2008).
As modificações estruturais que ocorrem no coração dependem não só do
processo de desenvolvimento normal como também das exigências funcionais do órgão;
com o envelhecimento e a falta de atividade física, o coração sofre também alterações
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
9
importantes que atingem não só as suas células e o tecido adjacente, mas, sobretudo, o
leito vascular terminal (ANVERSA et al., 1994).
De modo geral, a inatividade física, assim como o envelhecimento, produz, na
maioria dos indivíduos, modificações cardiovasculares de caráter estrutural e,
principalmente, funcional, caracterizada como perda de miócitos (com subsequente
hipertrofia das células remanescentes) e diminuição da complacência das artérias. No
entanto, a etiologia das modificações cardiovasculares se encontra ainda sob intensa
investigação. Os mecanismos mais prováveis estão relacionados ao dano cumulativo
mediado por uma diversidade de agentes agressores. Os benefícios dos exercícios
continuam sendo pesquisados juntamente com a farmacoterapia, oferecendo
oportunidades de se intervir nesse processo, mediante o uso de atividades e drogas que
podem reduzir a rigidez arterial, a fibrose cardíaca e a hipertrofia ventricular (PUGH;
WEI, 2001; FERRARI, 2002).
Diferentes estudos demonstraram os efeitos benéficos do exercício físico sobre
os diversos fatores de risco isolados para a doença cardiovascular; entretanto, são
escassos os trabalhos que avaliam os efeitos do treinamento físico em modelo
experimental de desnutrição proteica.
Por meio desta pesquisa experimental, foram analisados os efeitos do exercício
físico nos parâmetros morfológicos e mecânicos de cardiomiócitos de ratos com
desnutrição proteica.
3.4. O exercício físico e as adaptações morfológicas provocadas no coração
O coração é um dos primeiros órgãos a ser formado no período embrionário;
todas as etapas seguintes de desenvolvimento do embrião dependem da habilidade desse
órgão de moldar o rendimento dele à demanda do organismo por oxigênio e nutrientes.
A hipertrofia do músculo cardíaco é o aumento da massa muscular cardíaca (aumento
da razão peso do coração/peso corporal) causado primariamente pela ampliação das
dimensões dos cardiomiócitos (ATCHLEY; DOUGLAS, 2007).
O termo hipertrofia caracteriza o crescimento celular, que, na ausência de
divisão celular, é usado para fazer distinção entre crescimento hiperplásico e
hipertrófico. A hipertrofia ocorre em respostas a estímulos, como exercício crônico e
gravidez, e apresenta ampliação das dimensões dos cardiomiócitos e do número de
mitocôndrias, proporcional ao aumento do conteúdo de miofibrilas, crescimento de
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
10
cardiomiócitos sem o desenvolvimento de fibrose ou alterações em artérias intramurais,
em que a função cardíaca é mantida ou melhorada.
A hipertrofia cardíaca, em resposta ao exercício físico, que corresponde à
hipertrofia fisiológica, inclui alterações morfológicas e funcionais. Esse tipo de
hipertrofia ocorre em ambos os ventrículos, mas em grau mais elevado no ventrículo
esquerdo. As principais adaptações ao treinamento físico no que diz respeito à
morfologia do coração são alterações no tamanho do músculo e no volume das câmaras
cardíacas (WANG et al., 2008).
O treinamento físico determina dois tipos de hipertrofia, a excêntrica e a
concêntrica. A hipertrofia cardíaca do tipo excêntrica é induzida por exercícios de
resistência aeróbica e ocorre em função do aumento no retorno venoso e sobrecarga
volumétrica no músculo cardíaco, ocorrendo aumento no comprimento dos
cardiomiócitos sem grandes alterações na largura. Esse tipo de adaptação pode ter
impacto no aumento da dimensão interna da câmara ventricular, atenuando o estresse
sobre a parede ventricular, que ocorre durante a função cardíaca em repouso ou durante
o exercício, contribuindo para a função cardíaca normal (ATCHLEY; DOUGLAS,
2007). A do tipo concêntrica é induzida por exercícios de força e potência, que
promovem aumento de tensão contra resistência e sobrecarga pressórica no músculo
cardíaco, levando ao aumento da espessura das paredes do miocárdio (DÍAZ-
HERRERA, 2001; NAYLOR et al., 2008).
Diante disso, vários estudos envolvendo o treinamento físico vêm sendo
desenvolvidos, com o objetivo de verificar as adaptações morfológicas do miócito e
miocárdio.
Kemi et al., em 2002, realizaram treinamento intervalado em camundongos
machos e fêmeas durante oito semanas, 2 h por sessão (alternaram-se 8 min de 85-90%
do VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max), cinco dias na semana. Esses autores
verificaram o aumento do comprimento e do volume celular em ratos e ratas
exercitados. Além disso, notou-se aumento da massa ventricular esquerda e direita de
ambos os grupos treinados.
No estudo de Kemi et al., em 2004, em que os animais foram treinados
aerobicamente de forma intervalada na esteira, por 1 h a sessão (alternando 8 min de 85-
90% do VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max,) cinco dias por semana, durante 10
semanas, verificou-se aumento no comprimento, na largura e no volume celular.
Posteriormente, esses autores realizaram um trabalho em que camundongos fêmeas
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
11
treinaram em esteira inclinada em 25º, durante 1h30 (alternaram-se 8 min de 85-90% do
VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max) a sessão, cinco dias na semana, no decorrer de
oito semanas. Ao final do experimento, o comprimento relativo dos cardiomiócitos dos
animais treinados foi maior que o dos controles (KEMI et al., 2007).
Outros estudos evidenciaram resultados opostos em relação ao que foi relatado
anteriormente. Diffee et al., em 2001, utilizaram ratas treinadas em esteira de forma
intensa, com 20% de inclinação, 1 h por sessão, cinco dias por semana, durante 11
semanas, não observando alterações no comprimento e na largura dos sarcômeros.
Quando foram comparadas as respostas em relação às regiões do epicárdio e
endocárdio de ratas treinadas aerobicamente, de forma intermitente e em alta
intensidade, verificou-se que as células do endocárdio de animais treinados obtiveram
valores superiores, confrontando aos seus pares sedentários, quanto a largura e ao
volume, podendo sugerir que houve hipertrofia concêntrica (NATALI et al., 2001).
Esses resultados divergentes indicam que fatores como: diferença nos modelos
de exercício; condições experimentais; propriedades morfológicas, mecânicas,
bioquímicas e elétricas dos miócitos nas diferentes regiões da parede do miocárdio;
sexo; e idade podem ter influenciado tais resultados (NATALI, 2004).
Mesmo que haja estudos com resultados diferentes, a maioria desses evidencia
que o exercício físico é capaz de promover adaptações morfológicas em níveis celular e
tecidual, contribuindo para a melhora da capacidade cardíaca, tanto em corações
normais quanto na presença de alguma cardiomiopatia.
3.5. O exercício físico e as adaptações mecânicas provocadas no coração
Durante o exercício, o coração se ajusta aos requeridos aumentos das
atividades metabólicas e mecânicas. O treinamento físico provoca adaptações
bioquímicas, elétricas, morfológicas e mecânicas no músculo cardíaco, proporcionando
melhora na função cardíaca. Essas adaptações ocorrem basicamente para reduzir o
estresse sobre as paredes ventriculares e, ao mesmo tempo, atender a maior demanda de
suprimento sanguíneo dos músculos em exercício (KEMI et al., 2007).
Com o propósito de investigar as adaptações que levam à melhora da função
contrátil do coração pelo treinamento físico, muitos estudos com modelos animais têm
sido realizados com protocolos e intensidades variadas (NATALI et al., 2001; NATALI
et al., 2002; WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2004; KEMI et al., 2005).
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
12
No que diz respeito à bioquímica da contração, sabe-se que a excitação elétrica
causada pelo potencial de ação faz com que aumente a concentração de ions Ca2+ no
retículo sarcoplasmático (RS), promovendo a contração (AIRES et al., 2008). Com o
potencial de ação despolarizando a membrana, ions de Ca2+ entram na célula pelos
canais de Ca2+ tipo L, ativando os RyR2 que estão na membrana do retículo
sarcoplasmático, fazendo com que seja liberado Ca2+ de dentro do RS, processo
conhecido como liberação de Ca2+ induzido por Ca2+. Ca2+ se juntam à outra parte que
entrou na célula pelos canais de Ca2+ tipo L para que se liguem à troponina C e ativem a
contração (BERS, 2002).
No relaxamento, ocorre a dissociação do Ca2+ da troponina C. Dessa forma, o
Ca2+ é transportado para fora do citosol, processo realizado pela SERCA2a, pelo
transporte de Ca2+ mitocondrial para o sarcolema, via trocador de Na+/Ca2+ (NCX) e
pela Ca2+ ATPase presente no sarcolema (BERS, 2002).
Com base nisso, estudos recentes demonstraram que o exercício altera a
homeostasia de Ca2+ em animais normais por meio do aumento da expressão de
proteínas reguladoras do ciclo do Ca2+ no cardiomiócito, como SERCA2a, fosfolambam
(proteína que regula a função da SERCA2a), NCX e cálcio calmodulina quinase II
(CaMKII), proteína que fosforila a treonina, bem como é a responsável pela ativação da
fosfolambam (WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2007; KEMI et al., 2008).
Além disso, o exercício pode aumentar a sensibilidade dos miofilamentos ao
Ca2+ (WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2007). Outros estudos apresentam que essas
adaptações promovem alterações contráteis em nível celular durante estimulação
elétrica, melhorando, assim, a função cardíaca em animais treinados aerobicamente
(WISLOFF et al., 2005; KEMI et al., 2007). A partir disso, alguns trabalhos verificaram
as respostas contráteis do cardiomiócito diante do treinamento físico.
Wisloff et al. (2001), utilizando ratas treinadas em esteira, 2 h por sessão, cinco
sessões por semana, durante quatro semanas, verificaram a diminuição no tempo para o
pico de Ca2+ e no tempo para o decaimento do Ca2+ intracelular, além do aumento do
número de SERCA2a e fosfolambam nos cardiomiócitos dos animais treinados. Essas
adaptações colaboram para a melhora da função contrátil do coração (WISLOFF et al.,
2001).
Já no estudo de Kemi et al. (2004), os animais foram treinados aerobicamente
de forma intervalada na esteira, durante 1 h por sessão, cinco sessões na semana, em um
período de 13 semanas. Observou-se que quando os cardiomiócitos foram estimulados
CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica
13
em frequências de 7-10 Hz, os animais treinados obtiveram maior fração de
encurtamento e fluxo de Ca2+ nas células. Além disso, o tempo de contração, o tempo
para o relaxamento, o tempo para o pico de Ca2+ e o tempo para o decaimento do Ca2+
intracelular foram reduzidos nos animais treinados. Os mesmos autores, em um estudo
posterior, utilizaram ratas adultas, treinadas de forma intervalada em esteira, 1 h por
sessão, cinco sessões por semana, durante 10 semanas. Nesse estudo, uma parte dos
animais treinou a uma intensidade alta (85-90% do VO2max) e a outra, em uma
moderada (65-70% do VO2max). Verificou-se que ambos os grupos diminuíram o tempo
para o pico de contração, em comparação aos seus pares sedentários. (KEMI et al.,
2005).
As ratas, que foram submetidas a um treinamento intervalado que consistia em
sessões de 1h30, cinco sessões por semana e durante seis semanas, obtiveram
diminuição do tempo para o relaxamento do cardiomiócito, em relação aos animais-
controle. Além disso, foi verificada diminuição do tempo para o decaimento de Ca2+
intracelular e aumento da amplitude do fluxo de Ca2+. Foram observados aumento no
conteúdo de SERCA2a e maior expressão de CaMKII, nos miócitos dos animais
treinados (KEMI et al., 2007).
Stolen et al. (2009) submeteram camundongos com sete semanas de vida a um
treinamento aeróbico e intervalado, alternando entre 4 min de 85-90% do VO2max e 2
min de 50% do VO2max, 80 min/dia, uma sessão por dia, cinco dias/semana, durante 13
semanas. O treinamento aumentou a fração de encurtamento celular, além de diminuir o
tempo para o decaimento dos íons Ca2+ presentes no citosol.
Essas alterações em nível celular, em resposta aos treinamentos físicos
reportados por Wisloff et al. (2001), Kemi et al. (2002) e Wisloff et al. (2002),
acarretaram adaptações funcionais em nível de órgão, como maior fração de
encurtamento ventricular esquerdo, menor frequência cardíaca de repouso e aumento do
VO2max, o que contribuiu para a melhora do funcionamento cardíaco, justificando a
importância dos estudos que analisam as adaptações mecânicas no miócito cardíaco de
animais treinados.
O aumento na contratilidade intrínseca dos miócitos é um mecanismo em
potencial para explicar a melhora da função contrátil do miocárdio induzida pelo
exercício, que pode estar associado ao processo de aumento do volume dos miócitos
cardíacos (NATALI, 2004).
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais de experimentação
Foram utilizados 24 ratos machos (Rattus novergicus) da linhagem Wistar,
com 30 dias de idade, após o desmame, provenientes do Biotério Central do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Viçosa. Os animais foram
identificados com uma numeração na cauda, alojados em gaiolas coletivas, com seis
animais cada, recebendo água e ração própria ad libitum e mantidos em ambiente com
temperatura média de 22 oC e regime de luminosidade de 12 h de escuridão por 12 h de
claridade. Os animais foram pesados no início do experimento; semanalmente, durante a
fase de treinamento em esteira rolante; e no dia da eutanásia, utilizando-se balança
eletrônica digital (Marte – Brasil, modelo AS5500C) com precisão de 0,01 g.
4.2. Grupos experimentais
Os animais foram divididos em quatro grupos: Nutrido Treinado (NT), n=6;
Nutrido Sedentário (NS), n=6; Desnutrido Treinado (DT), n=6; e Desnutrido Sedentário
(DS), n=6. Para a definição desses grupos, foi realizado o teste de exaustão, em que,
após os resultados, os animais foram divididos em dois grupos homogêneos, em
igualdade de massa corporal e desempenho no teste, definindo-se que animal
pertenceria a cada Grupo (Treinado ou Sedentário).
Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os Princípios
Éticos na Experimentação Animal, elaborados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). O projeto recebeu aprovação da Comissão de Ética
para Uso de Animais (CEUA), do Departamento de Veterinária da Universidade
Federal de Viçosa, Processo nº 39/2010 (Anexo).
4.3. Adaptação ao treinamento físico
Durante quatro dias consecutivos, foi realizada a adaptação desses animais à
corrida em esteira rolante (Insight Instrumentos – Ribeirão Preto, SP), à velocidade
constante de 10 m/min, durante 10 min/d, conforme o protocolo de Moraes-Silva et al.
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
15
(2010). No quinto dia, realizou-se o teste de exaustão, para avaliar a condição física
inicial dos animais e definir os grupos experimentais.
4.4. Teste de exaustão
Com a esteira rolante na posição plana, iniciou-se a corrida a 10 m/min e, a
cada 3 min, aumentou-se a velocidade em 3 m/min, até a exaustão do animal, momento
em que esse era retirado da esteira, anotando-se o tempo, a velocidade final e a distância
percorrida (MORAES-SILVA et al., 2010).
Esse procedimento foi realizado no início do experimento, para a definição dos
grupos experimentais, e, também, no final, a fim de avaliar o efeito do treinamento.
4.5. Protocolo de treinamento físico
Os animais do Grupo NT e os do Grupo DT foram submetidos a um programa
de corrida de baixa intensidade (50-60% do VO2max), cinco vezes por semana, 60 min
por sessão, com aumento gradual na velocidade de 1 m/min por semana, durante oito
semanas, conforme o protocolo descrito por Moraes-Silva et al. (2010), usando-se uma
esteira rolante (Insight Instrumentos – Ribeirão Preto, SP).
4.6. Dietas
Trinta dias após o nascimento e definidos os grupos experimentais, os animais
começaram a alimentar das suas respectivas dietas.
Em razão da variação dos modelos experimentais encontrados na literatura, e
no intuito de facilitar comparações com dados semelhantes, optou-se pelo modelo
modificado de desnutrição de Oliveira (2007), em que os animais desnutridos
receberam dieta hipoproteica, AIN-93G (REEVES et al., 1993), que modifica o teor de
proteína para 6%, sendo a diferença substituída por amido; e, os do grupo-controle,
dieta normoproteica, contendo 12% de proteína (caseína de alto valor biológico),
conforme descrita na Tabela 1.
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
16
Tabela 1 - Dieta dos animais de experimentação e suas respectivas concentrações em g/kg
Componente Concentração (g/kg)
Normoproteica (12% de proteína)
Concentração (g/kg) Hipoproteica
(6% de proteína) Caseína* 150 75 Amido 608,9 683,9 Sacarose 100 100 DL-metionina 3,6 3,6 Mistura de sais** 35 35 Mistura de vitaminas*** 10 10 Colina cloridrato 2,5 2,5 Celulose 50 50 Óleo de milho 40 40
* Valor corrigido para o teor de proteína contido na caseína. ** (REEVES et al., 1993 – AIN-93G-MX) *** (REEVES et al., 1993 – AIN-93-GX)
4.7. Parâmetros sanguíneos
Durante a eutanásia, foram coletadas amostras de sangue da aorta, para
avaliação das dosagens das concentrações séricas de proteínas totais (g/dL), albumina
(g/dL) e hemoglobina (g/dL).
Os métodos e equipamentos utilizados para as análises foram, respectivamente:
colorimétrico (Cobas Mira – EUA), para proteínas totais e albumina; e
cianometahemoglina (ABX micros – França), para hemoglobina.
4.8. Análises do tecido muscular cardíaco
4.8.1. Massa do coração e dos ventrículos
Quarenta e oito horas após a última sessão do treinamento físico, o animal foi
pesado, realizando-se a eutanásia, com inalação de gás carbônico, em dois animais por
dia, alternando os dos Grupos NT e NS e, posteriormente, DT e DS. Após a eutanásia, o
coração foi removido, lavado em solução contendo 750 mM de CaCl2, para retirar o
excesso de sangue, e, imediatamente, pesado em balança de precisão (Gehaka – Brasil,
modelo AG 200). Além do coração, também foi retirada a tíbia direita para medição do
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
17
comprimento, distância da borda distal até a borda proximal. Para esse procedimento,
foi utilizado um paquímetro de aço inox (Stainless Hardened – China).
Após a perfusão, os ventrículos (direito e esquerdo) foram separados dos átrios
e pesados. O índice de hipertrofia cardíaca foi calculado pela razão entre a massa do
coração (mg) e a massa corporal (g) e também pela razão entre a massa do coração (g) e
o comprimento da tíbia (cm). Já o índice de hipertrofia ventricular, foi calculado pela
razão entre a massa do ventrículo (mg) e a massa corporal (g).
4.8.2. Isolamento dos miócitos cardíacos
Após a remoção, o coração foi canulado via aorta e perfundido com solução de
isolamento, contendo 750 µM de CaCl2 (solução A, item 4.6), em fluxo constante até
que os vasos coronarianos estivessem limpos de sangue. Em seguida, trocou-se a
perfusão para a solução livre de cálcio, contendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis (β-
aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA) (solução B, item 4.6), durante 4
a 6 min, para a destruição das bandas escalariformes. Na sequência, o coração foi
perfundido com solução 1 mg. Ml-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 100 µM
de CaCl2 (solução C, item 4.6), durante 20 a 25 min, para a destruição das fibras de
colágeno e matriz extracelular. Todas as soluções utilizadas no procedimento de
isolamento foram oxigenadas (O2 100% - White Martins, Brasil) e mantidas em
temperatura de 35 oC. Ao final da perfusão, os ventrículos foram separados dos átrios e
pesados. O ventrículo direito foi removido e o esquerdo, aberto na região do septo
interventricular. Fragmentos finos (< 1 mm) foram obtidos das regiões próximas ao
epicárdio (EPI) e ao endocárdio (ENDO), que foram colocados, separadamente, em
frascos contendo 5 mL da solução enzimática (colagenase) e albumina sérica bovina
(solução D, item 4.6). Agitaram-se os frascos, moderadamente, durante 5 min, em
banho-maria, à temperatura de 37 oC, sendo o tecido cardíaco oxigenado (O2 100% -
White Martins, Brasil). Em seguida, retiraram-se os fragmentos de tecido dos frascos e o
restante foi centrifugado (3.000 rpm). O sobrenadante foi removido e os miócitos
cardíacos foram suspendidos em solução contendo 750 µM de CaCl2 (solução A, item
4.6). Esse processo foi repetido e os miócitos cardíacos foram armazenados em placas
de Petri, em refrigerador (5 oC), até serem utilizados.
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
18
4.8.3. Comprimento, largura e volume celular
Acomodaram-se os miócitos cardíacos em uma câmara experimental (Figura
2), banhados em solução-tampão de perfusão (item 5.6), em temperatura ambiente (~25 oC). O comprimento e a largura dos miócitos foram medidos, usando-se sistema de
captação de imagens. Visualizaram-se as imagens das células horizontalmente (aumento
de 40 x – lente de imersão em óleo S Flúor) no monitor de um microcomputador, por
meio de uma câmera (Myocam, Ionoptix, EUA) acoplada a um microscópio invertido
(Nikon Eclipse – TS100, EUA), utilizando-se um programa de captação de imagens (M-
Vision 5X, Ionoptix, EUA). O comprimento celular foi determinado, medindo-se a
imagem da célula gerada no monitor, desde a borda direita até a esquerda, no ponto
médio da largura do cardiomiócito. A largura celular foi medida com a imagem gerada
da mesma forma; entretanto, desde a borda superior até a inferior, no ponto médio do
comprimento dos miócitos cardíacos (Figura 1).
As linhas indicam como foram obtidos o comprimento (verde) e a largura (amarelo).
Figura 1 - Representação dos pontos de mensuração da imagem dos miócitos cardíacos.
Para a mensuração do comprimento e da largura dos miócitos cardíacos, usou-
se uma régua com precisão de 1 mm. Na calibração do sistema, cada centímetro
correspondia a 12 µm. Utilizaram-se somente as células que estavam em boas
condições, com as bordas (direita/esquerda e superior/inferior) e estriações sarcoméricas
bem definidas, relaxadas em repouso, sem apresentarem contrações voluntárias.
O volume celular foi calculado, usando-se a fórmula proposta por Satoh et al.
(1996):
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
19
Volume (pL) = comprimento (µm) x largura (µm) x (7,59 x 10- 3 pL/µm2)
em que pL é picolitros; µm, micrômetros; e 7,59 x 10- 3 pL/µm2, constante obtida pela
medida direta do volume celular, por meio de microscopia confocal, dada em picolitros
por micrômetros ao quadrado.
4.8.4. Contração celular
As contrações celulares foram medidas por meio da técnica de alteração do
comprimento dos miócitos cardíacos, utilizando-se o sistema de detecção de bordas
(Ionoptix, EUA), montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, EUA).
Os miócitos foram acomodados em câmara experimental, com a base de vidro,
banhados em solução-tampão de perfusão (item 5.6), em temperatura ambiente, ~25 oC,
(Figura 2), e visualizados em monitor, com aumento de 40x, por meio de lente de
imersão em óleo S Flúor, 40x (Nikon, EUA). Utilizaram-se, para as análises das
contrações, somente os miócitos cardíacos que estavam em boas condições, com as
bordas (direita e esquerda) e estriações sarcoméricas bem definidas, relaxadas em
repouso, sem apresentarem contrações voluntárias.
Os miócitos cardíacos foram estimulados externamente na frequência de 3 Hz
(10 v, duração de 5 ms), usando-se um par de eletrodos de aço, colado nas bordas
internas da câmara, por meio de um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix,
EUA). Esses miócitos foram visualizados em um monitor por meio de uma câmara
(Myocam, Ionoptix, EUA) acoplada ao microscópio invertido, utilizando-se um
programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix, EUA), com frequência de 240
Hz.
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
20
Observam-se o par de eletrodos conectados ao estimulador (fios preto e vermelho) e os tubos usados para
levar e retirar a solução de perfusão dessa câmara. Figura 2 - Câmara experimental acoplada ao microscópio invertido.
Identificaram-se as bordas dos miócitos cardíacos com duas janelas (direita e
esquerda), alinhadas ao longo do comprimento das células. A definição das bordas foi
ajustada por meio do contraste (preto e branco), gerado pela qualidade da imagem
projetada dos miócitos cardíacos (Figura 3).
A borda direita e a esquerda da célula são projetadas pelos picos verde e vermelho para baixo.
Figura 3 - Representação do programa utilizado para aquisição das imagens e dos
registros das contrações dos miócitos cardíacos (Ionoptix, EUA).
Os movimentos das bordas dos miócitos foram capturados pelo sistema de
detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix, EUA) (Figura 3), durante 30 s, e armazenados
para análise posterior (Figura 4).
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
21
Figura 4 - Registro experimental de encurtamento de uma célula do ventrículo esquerdo
estimulada na frequência de 3 Hz, em temperatura ambiente (~25 oC).
Analisaram-se a amplitude de contração (PPA), que é a variação do
comprimento celular em repouso, em %; a máxima velocidade de contração (MVC),
que é a velocidade pico de encurtamento celular, em µm/s; e a máxima velocidade de
relaxamento (MVR), que compreende a velocidade pico de relaxamento celular, em
µm/s (Figura 5). Esses parâmetros foram analisados após a sobreposição de pelo menos
seis contrações estáveis de cada cardiomiócito, conforme Roman-Campus et al. (2009).
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
22
O ponto inicial representa um estímulo elétrico (célula em repouso) e o ponto final,
o fim do estímulo (célula em repouso).
Figura 5 - Diagrama demonstrativo do encurtamento de um cardiomiócito estimulado na frequência de 3 Hz (~25 oC) e dos respectivos parâmetros da contração analisados.
4.9. Soluções
As soluções utilizadas para o isolamento dos miócitos cardíacos ventriculares
foram feitas, usando-se uma solução básica com água milli-Q e a seguinte composição
(em mM): NaCl (130) – 7,6 g/L; MgCl2 (1,43) – 0,28 g/L; KCl (5,4) – 0,4 g/L; N-2-
hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES) (5) – 0,062 g/L; glicose (10)
– 1,8 g/L; taurina (20) – 2,38 g/L; creatina (10) – 1,3 g/L; e pH = 7,3, em temperatura
ambiente.
Solução A
Para fazer a solução de isolamento, contendo Ca2+, adicionaram-se 375 µL de
CaCl2 (1 M), em 500 mL da solução básica.
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
23
Solução B
Para a solução de isolamento livre de Ca2+, acrescentaram-se 250 µL de EGTA
(100 mM), em 250 mL da solução básica.
Solução C
Para a solução enzimática de isolamento, foram acrescidos 20 mg de
colagenase e 15 µL de CaCl2 (100 mM), em 20 mL da solução básica.
Solução D
Para a solução com 1% de albumina bovina, adicionaram-se 500 mg de
albumina sérica bovina, em 5 mL de solução básica. Após o isolamento, 1 mL de
albumina foi adicionado para cada 10 mL da solução enzimática C.
Solução de Perfusão Tampão HEPES
Para fazer um litro da solução de perfusão tampão HEPES, foram
acrescentados 100 mL da solução-estoque, 10 mL da solução-sopa e 1 mL de CaCl2 (1)
em água milli-Q. Essa solução foi equilibrada para um pH=7,4 e mantida em
temperatura ambiente.
Solução-estoque (em mM): NaCl (113) – 65,99 g/L; HEPES (5) – 11,9 g/L;
NaH2PO4 (1) – 1,42 g/L; MgSO4 (1) – 2,46 g/L; e KCl (5) – 3,72 g/L.
Solução-sopa (em mM): Na acetato (20) – 16,4 g/100 mL; glicose (10) –
18,1g/100 mL; e insulina (5µ/L) – 0,5 g/100 mL.
4.10. Análises estatísticas
As médias e os desvios-padrão, referentes aos valores das variáveis respostas
estudados, foram comparados entre os Grupos, por meio de análise de variância
(ANOVA), seguido do teste de Tukey, com a correção de Kramer para dados
desbalanceados. As análises foram implementadas com o auxílio do sistema SAS
(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA - versão 9.2), licenciado
para a Universidade Federal de Viçosa, em 2012.
Os dados das massas corporais dos animais, em cada um dos quatro Grupos,
foram avaliados individualmente, durante oito semanas. O ganho de massa corporal
médio (𝑌𝑌𝑖𝑖) semanal (𝑋𝑋𝑖𝑖), em cada Grupo, foi descrito por análise de regressão, tendo-se
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
24
ajustado um modelo linear simples (𝑌𝑌𝑖𝑖 = 𝛽𝛽0 + 𝛽𝛽1𝑋𝑋𝑖𝑖 + 𝜀𝜀𝑖𝑖), que se denominou completo,
pois foram alocados parâmetros (𝛽𝛽0 𝑒𝑒 𝛽𝛽1) específicos para cada Grupo, em que (β0) é a
estimativa do peso médio inicial; (β1), o acréscimo médio estimado no peso para cada
semana; e (𝜖𝜖𝑖𝑖), o efeito do erro aleatório não observável associado à i-ésima observação.
Esse modelo permitiu testes de igualdade entre os parâmetros dos Grupos NS, DS e DT,
com os respectivos parâmetros do Grupo NT, tomado como referência.
Após a análise de variância, teste F (ANOVA), dos dados de morfologia e
contratilidade, considerando os fatores treinamento (treinados e sedentários) e nutrição
(nutridos e desnutridos) e as regiões EPI (epicárdio) e ENDO (endocárdio), observou-se
que não houve diferença estatística entre o p-valor obtido nessas regiões (p > 0,05). Os
dados dessas regiões foram colocados juntos e analisados como os dos miócitos
isolados do ventrículo esquerdo (VE) como um todo.
Convencionaram-se as seguintes variáveis respostas:
− IHC = índice de hipertrofia cardíaca, que pode ser calculado pela razão entre a massa
do coração e a massa corporal ou pela razão entre a massa do coração e o
comprimento da tíbia.
− IHC1 = massa do coração (mg)/massa corporal (g), denominou-se R1.
− IHC2 = massa do coração (g)/comprimento da tíbia (cm), denominou-se R2.
− IHV = índice de hipertrofia ventricular, que é a razão entre a massa do ventrículo
(mg) e a massa corporal (g).
− COMP = comprimento celular (µm).
− LARG = largura celular (µm).
− VOLM = volume celular (pL).
− PPA = amplitude de contração (%).
− MVC = máxima velocidade de contração (µm/s).
− MVR = máxima velocidade de relaxamento (µm/s).
Os dados de IHC, IHV, COMP, LARG, VOLM, PPA, MVC e MVR (variáveis
respostas Y) foram submetidos à análise de variância (ANOVA), tendo como fontes de
variação o treinamento (exer=tre, para o Grupo Treinado; e exer=sed, para o Grupo
Sedentário) e a nutrição (alim=nutr, para o Grupo Nutrido; e alim=desn, para o Grupo
Desnutrido). Adotou-se o seguinte modelo de efeitos fixos: 𝑌𝑌𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 = 𝜇𝜇 + 𝐸𝐸𝑖𝑖 + 𝑁𝑁𝑖𝑖 +
(𝐸𝐸x𝑁𝑁) 𝑖𝑖𝑖𝑖 + 𝜖𝜖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 , em que 𝑌𝑌𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 é a variável resposta avaliada no i-ésimo nível de
exercício (treinados ou sedentários) no j-ésimo nível de nutrição (nutridos ou
CABRAL, C. A. C. Material e Métodos
25
desnutridos); 𝜇𝜇, a média geral; 𝐸𝐸x𝑁𝑁, o efeito aleatório da interação entre exercício e
nutrição; e 𝜖𝜖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 , o efeito do erro aleatório não observável associado à k-ésima
observação, com as pressuposições usuais de normalidade e homogeneidade de
variâncias entre os Grupos.
A estratégia adotada nas análises foi de comparar os efeitos separadamente:
treinados versus sedentários, bem como nutridos versus desnutridos, pois o efeito da
interação 𝐸𝐸x𝑁𝑁 não foi significativo (valor p > 0,05).
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Desempenho físico dos animais
5.1.1. Teste de exaustão
O efeito do treinamento foi evidenciado, de acordo com a Tabela 2, com os
resultados do desempenho físico dos animais no final do experimento.
Para o Grupo Nutrido (treinados versus sedentários), a velocidade final, o
tempo final e a distância percorrida dos animais treinados foram significativamente
superiores aos valores médios dos sedentários (treinados = 31,80 ± 4,16 m/min vs
sedentários = 20,00 ± 3,13 m/min; treinados = 22,23 ± 4,54 min vs sedentários = 11,48
± 2,71 min; e treinados = 744,01 ± 223,78 m vs sedentários 310,67 ± 269,66 m,
respectivamente; p < 1%), conforme a Tabela 2.
Em relação ao Grupo Desnutrido (treinados versus sedentários), a velocidade
final, o tempo final e a distância percorrida dos animais treinados também foram
significativamente superiores aos valores médios dos sedentários (treinados = 38,33 ±
6,89 m/min vs sedentários = 20,80 ± 5,69 m/min; treinados = 29,14 ± 6,82 min vs
sedentários = 12,10 ± 5,75 min; e treinados = 1.158,75 ± 475,19 m vs sedentários
280,75 ± 179,24 m, respectivamente, p < 1%), de acordo com a Tabela 2.
Quanto ao desempenho físico do Grupo DT ser melhor que o grupo-controle
(NT), isso poderia ser explicado em razão de o peso dos animais desnutridos ser bem
menor que o dos nutridos, pois esses são animais mais leves e ágeis. Estes resultados
poderiam sugerir um efeito modulador do exercício físico para aumentar a
biodisponibilidade dos aminoácidos para o coração, à custa de reduzir o crescimento do
corpo, a fim de assegurar uma função cardíaca adequada, em condições de sobrecarga
cardiovascular, minimizando o risco de insuficiência cardíaca mecânica em animais
treinados e submetidos à restrição de proteínas na dieta.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
27
Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão do teste de exaustão no final do experimento com resultados* das comparações entre médias dos Grupos de animais Nutridos (NT vs NS) e Desnutridos (DT vs DS)
Grupos Velocidade final (m/min) Tempo final (min) Distância percorrida
(m)
NT (n=6) 31,80 ± 4,16a 22,23 ± 4,54a 744,01 ± 223,78a
NS (n=6) 20,00 ± 3,13b 11,48 ± 2,71b 310,67 ± 269,66b
DT (n=6) 38,33 ± 6,89a 29,14 ± 6,82a 1.158,75 ± 475,19a
DS (n=6) 20,80 ± 5,69b 12,10 ± 5,75b 280,75 ± 179,24b
*Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de Tukey-
Kramer.
5.2. Caracterização dos Grupos de animais
5.2.1. Parâmetros bioquímicos
A avaliação bioquímica representa importante área de estudo sobre o estado de
saúde dos animais, que pode auxiliar o diagnóstico e o prognóstico de diversas
enfermidades (CUBAS et al., 2007).
Os valores médios dos parâmetros bioquímicos dos animais, caracterizando o
estado de nutrição e desnutrição, são apresentados na Tabela 3.
Observou-se que os parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina
dos animais do Grupo DT e o do DS apresentaram valores médios inferiores aos de
referência (CUBAS et al., 2007), caracterizando a condição de desnutrição proteica.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
28
Tabela 3 - Valor de referência, valor médio e desvio-padrão dos parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina dos Grupos de animais NT, NS, DT e DS
Parâmetro bioquímico
Valor de referência
Nutrido treinado (NT)
n=6
Nutrido sedentário (NS)
n=6
Desnutrido treinado (DT)
n=6
Desnutrido sedentário (DS)
n=6 Proteína (g/dL) 5,6 – 7,6 7,03 ± 0,18 7,10 ± 0,15 5,46 ± 0,39 5,1 ± 0,20
Albumina (g/dL) 3,3 – 4,9 4,15 ± 0,20 4,17 ± 0,16 3,17 ± 0,15 3,05 ± 0,15
Hemoglobina (g/dL) 12,8 – 17,8 13,76 ± 1,54 14,25 ± 2,23 11,63 ± 0,60 12 ± 0,95
Valor de referência: Cubas et al. (2007).
5.2.2. Massa corporal
A fim de confirmar o efeito da desnutrição em cada grupo de animais, na
Figura 6 e na Tabela 4, são apresentados os modelos de regressão ajustados para a perda
de massa corporal média por semana, com os respectivos testes de igualdade dos
parâmetros, para os Grupos NS, DS e DT, comparados ao NT.
Os animais do Grupo Desnutrido (DT e DS) comprovaram que tiveram o
crescimento prejudicado em relação aos do Grupo Nutrido (NT e NS), ao longo do
experimento.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
29
Figura 6 - Modelos ajustados do perfil semanal da média de massa corporal dos Grupos
NT, NS (Control), DS (MS) e DT (MT). Tabela 4 - Modelos de regressão ajustados para o perfil semanal da média de massa
corporal dos Grupos NT, NS, DT e DS
Grupo Y = β0 + β1 x semana
β0 β1
NT (n=6) 104,51 30,01 NS (n=6) (=) (=) DT (n=6) (=) 10,080,02% DS (n=6) (=) 16,900,67%
(=) indica que o Teste T não rejeitou a hipótese de igualdade entre os parâmetros do modelo e os do Grupo de referência (NT), valor p > 5%. As estimativas foram apresentadas somente quando o Teste t indicou diferença significativa.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
30
Entre os nutrientes necessários à manutenção da homeostase, podem-se
destacar as proteínas, definidas como moléculas de estruturas complexas que
desempenham papéis fundamentais no corpo humano. Essas moléculas devem ser
continuamente ressintetizadas pelo organismo, por meio da ingestão de proteínas pela
dieta, em que veicularão os aminoácidos essenciais e os não essenciais. A desnutrição
hipoproteica no período inicial da vida do animal pode afetar a proliferação celular,
acarretando prejuízo ao desenvolvimento corporal por meio da depleção da massa
muscular e diminuição de peso (ALBUQUERQUE, 2009).
A diferença de peso entre os Grupos Nutridos e Desnutridos foi
estatisticamente diferente, o que garante que a dieta hipoproteica oferecida foi eficiente
em promover a desnutrição, uma vez que a redução do peso corporal pode ser utilizada
como indicador básico dessa condição (SAWAYA, 2006). O reduzido de ganho de peso
observada nos animais desnutridos utilizados nesse trabalho ganhou respaldo na
literatura, sugerindo que o baixo teor proteico da dieta, provavelmente, não
disponibilizou aminoácidos suficientes para que o organismo pudesse ter seu
desenvolvimento ideal.
Outros trabalhos desenvolvidos com ratos sugeriram que há associação entre a
desnutrição e o peso corporal, em razão dos processos adaptativos, que acontecem
fundamentalmente para se ajustarem às condições nutricionais adversas, às quais o
animal está sendo submetido (OLIVEIRA, 2007). Diante desses parâmetros, é possível
afirmar que a dieta composta de 6% de proteína (caseína) é eficaz na promoção de um
quadro de desnutrição experimental.
5.3. Tecido muscular cardíaco
5.3.1. Índice de hipertrofia cardíaca (IHC)
Para as variáveis IHC1 (R1) e IHC2 (R2), não se observou efeito significativo
(valor p > 5%) da interação entre treinamento (treinados e sedentários) e nutrição
(nutridos e desnutridos), com valor de p igual a 37,69%, para R1; e 28,55%, para R2.
Os resultados foram analisados, separadamente, entre os animais nutridos versus
desnutridos, bem como entre treinados versus sedentários, conforme as Tabelas 5 e 6.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
31
5.3.1.1. Variável IHC1, denominada R1
Para o fator nutrição, em relação aos animais nutridos versus desnutridos, na
Tabela 5, é exibido que a R1 [massa do coração (mg)/massa corporal (g)] dos nutridos
não diferiu significativamente do valor médio dos desnutridos (nutr = 4,87 ± 0,72 mg/g
vs desn = 5,87 ± 1,07 mg/g, p = 1,04%).
Para o fator treinamento, de acordo com os animais treinados versus
sedentários, na Tabela 5, é apresentado que a R1 dos treinados também não divergiu
significativamente do valor médio dos sedentários (tre = 5,40 ± 1,15 mg/g vs sed = 5,33
± 1,00 mg/g, p = 84,87%).
Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R1) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos R1 (mg/g)
Nutridos (n=12) 4,87 ± 0,72a
Desnutridos (n=12) 5,87 ± 1,07a
Treinados (n=12) 5,40 ± 1,15a
Sedentários (n=12) 5,33 ± 1,00a
*Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de Tukey-
Kramer, com p = 1,04%, para nutridos vs desnutridos, e p = 84,87%, para treinados vs sedentários. 5.3.1.2. Variável IHC2, denominada R2
Em relação à nutrição, para os animais nutridos versus desnutridos, a R2
[massa do coração (g)/comprimento da tíbia (cm)] dos nutridos não diferiu
significativamente do valor médio dos desnutridos (nutr = 0,38 ± 0,08 g/cm vs desn =
0,34 ± 0,06 g/cm, p = 13,79%), conforme a Tabela 6.
Para o fator treinamento, para os animais treinados versus sedentários, na
Tabela 6, é apresentado que a R2 dos treinados também não distinguiu
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
32
significativamente do valor médio dos sedentários (tre = 0,34 ± 0,06 g/cm vs sed = 0,38
± 0,07 g/cm, p = 12,31%).
Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R2) com resultados* das comparações entre os Grupos ded animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos R2 (g/cm)
Nutridos (n=12) 0,38 ± 0,08a
Desnutridos (n=12) 0,34 ± 0,06a
Treinados (n=12) 0,34 ± 0,06a
Sedentários (n=12) 0,38 ± 0,07a
*Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de Tukey-
Kramer, com p = 13,79%, para nutridos vs desnutridos, e p = 12,31%, para treinados vs sedentários.
5.3.2. Índice de hipertrofia ventricular (IHV)
Na interação entre os fatores treinamento (treinados e sedentários) e nutrição
(nutridos e desnutridos), com p valor igual a 59,74%, não se observou efeito
significativo (valor p > 5%), no índice de hipertrofia ventricular, que é a razão entre a
massa do ventrículo (mg) e a massa corporal (g). Os resultados foram analisados,
separadamente, entre nutridos versus desnutridos, assim como entre treinados versus
sedentários. Na Tabela 7, estão os resultados dessas análises.
Para o parâmetro nutrição, animais nutridos versus desnutridos, na Tabela 7, é
apresentado que o IHV dos nutridos não diferiu significativamente do valor médio dos
desnutridos (nutr = 4,46 ± 0,44 mg/g vs desn = 4,91 ± 0,75 mg/g, p = 8,29%).
Para o fator treinamento, treinados versus sedentários, a Tabela 7, é
evidenciado que o IHV dos animais treinados também não divergiu significativamente
do valor médio dos sedentários (tre = 4,86 ± 0,80 mg/g vs sed = 4,51 ± 0,55 mg/g, p =
17,59%).
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
33
Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia ventricular (IHV) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos IHV (mg/g)
Nutridos (n=12) 4,46 ± 0,44a
Desnutridos (n=12) 4,91 ± 0,75a
Treinados (n=12) 4,46 ± 0,80a
Sedentários (n=12) 4,51 ± 0,55a
*Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de Tukey-
Kramer, com p = 8,29%, para nutridos vs desnutridos, e p = 17,59%, para treinados vs sedentários.
O padrão de hipertrofia cardíaca e ventricular depende das características do
estímulo mecânico e da carga humoral imposta ao miocárdio (PENALOZA; ARIAS-
STELLA, 2007). Neste estudo, os estímulos advindos da desnutrição - possível
hipertrofia cardíaca patológica de estímulo metabólico -, e também os impostos pelo
programa de treinamento - possível hipertrofia fisiológica, em razão da sobrecarga
volumétrica -, não ficaram evidenciados.
Essas adaptações esperadas em corações de animais desnutridos e também de
animais treinados poderiam contribuir para a melhora da função cardíaca desses, por
meio de aumento no volume de ejeção, no débito cardíaco e, consequentemente, para
melhora na capacidade aeróbica via aumento do consumo máximo de oxigênio (SHAO
et al., 2009).
5.3.3. Propriedades morfológicas dos cardiomiócitos
As variáveis morfológicas analisadas dos cardiomiócitos foram o comprimento
(COMP), a largura (LARG) e o volume (VOLM), em que não se observou efeito
significativo (valor p > 5%) da interação entre os fatores treinamento (treinados e
sedentários) e nutrição (nutridos e desnutridos), com valores de p, respectivamente,
iguais a 40,82%; 99,64%; e 55,31%.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
34
Os resultados foram analisados, separadamente, entre nutridos versus
desnutridos, bem como entre treinados versus sedentários. Na Tabela 8, são
apresentados os resultados dessas análises.
5.3.3.1. Relação de comprimento celular (COMP), largura celular (LARG) e volume celular (VOLM) entre animais nutridos versus desnutridos e treinados versus sedentários
Na Tabela 8, pode ser observado que os miócitos dos animais nutridos em
comparação aos desnutridos apresentaram COMP médio superior (nutr = 153,78 ±
21,34 µm vs desn = 144,63 ± 17,00 µm, p < 1%); LARG média superior (nutr = 21,29 ±
5,43 µm vs desn = 17,91 ± 4,46 µm, p < 1%); e VOLM médio superior (nutr = 24,67 ±
6,76 pL/µm2 vs desn = 19,62 ± 5,36 pL/µm2, p < 1%), de acordo com o fator nutrição.
Para o fator treinamento, os miócitos dos animais treinados não diferiram
significativamente do valor médio de COMP, comparados aos dos sedentários (tre =
149,32 ± 20,23 µm vs sed = 149,08 ± 19,12 µm, p = 88,78%). Entretanto, em relação a
LARG (tre = 20,18 ± 5,29 µm vs sed = 19,01 ± 5,07 µm, p < 1%) e VOLM (tre = 22,84
± 6,70 pL/µm2 vs sed = 21,46 ± 6,33 pL/µm2, p < 1%), os miócitos dos treinados
apresentaram valor médio superior aos dos sedentários, conforme a Tabela 8.
A desnutrição reduziu significativamente o comprimento, a largura e o volume
celular dos miócitos cardíacos; sugere-se que este fato está relacionado com a baixa
massa corporal desses animais.
Para Dyntar et al. (2006), a redução nas dimensões dos miócitos cardíacos pode
ser decorrente de distúrbios, entre esses a desnutrição, que provoca disfunções celulares
como redução do contato entre os miócitos, inibição da formação miofibrilar e
diminuição na expressão de miosina de cadeia pesada e actina cardíaca.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
35
Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão do comprimento celular, da largura celular e do volume celular de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos COMP (µm) LARG (µm) VOLM (pL/µm2)
Nutridos (n=511)
153,78 ± 21,34a 21,29 ± 5,43a 24,67 ± 6,76a
Desnutridos (n=511)
144,63 ± 17,00b 17,91 ± 4,46b 19,62 ± 5,36b
Treinados (n=511)
149,32 ± 20,23a 20,18 ± 5,29a 22,84 ± 6,70a
Sedentários (n=511)
149,08 ± 19,12a 19,01 ± 5,07b 21,46 ± 6,33b
* n= número de células. Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de Tukey-Kramer, com p = 88,78%, para a comparação do comprimento celular de treinados vs sedentários.
Trabalhos como o de Silva (2010) corroboram com o resultado desta pesquisa,
em que o efeito do treinamento físico provocou o aumento na largura e no volume
celular de cardiomiócitos isolados do VE. O aumento na largura e no volume celular é
sugestivo de formação de novos sarcômeros em paralelo, que resulta em aumento da
espessura da parede ventricular (MOORE; VOLKER, 2005), apesar de não ter ocorrido
esta hipertrofia ventricular neste estudo, como já foi demonstrado. O exercício aeróbico
implica em sobrecarga volumétrica ao miocárdio (DIFFE, 2004) o que resultaria em
aumento, principalmente, no comprimento dos miócitos, mantendo a mesma relação do
volume mitocondrial com o volume celular. Todavia, o fato de o comprimento celular
não ter sido significativamente maior entre os animais treinados em relação aos
sedentários pode ser o motivo pelo qual não se caracterizaram a hipertrofia ventricular e
a cardíaca.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
36
5.4. Propriedades mecânicas dos cardiomiócitos
A frequência cardíaca de ratos em repouso é de aproximadamente 300 bpm (5
Hz), numa temperatura ambiente de 37 oC; porém, raramente miócitos cardíacos
isolados respondem a essa frequência de estimulação em temperatura ambiente.
No período do experimento, o laboratório do DES-UFV, local onde se realizou
a pesquisa, não possuía equipamentos que ofereciam essa condição; por isso, usou-se a
frequência de 3 Hz, por ser a mais próxima da estimulação respondida pelos miócitos
cardíacos dos animais, em temperatura ambiente.
Para todas as variáveis analisadas (PPA, MVC e MVR), não se observou efeito
significativo (valor p > 5%) da interação entre os fatores treinamento (treinados e
sedentários) e nutrição (nutridos e desnutridos), com valores de p, respectivamente,
iguais a 43,68%; 27,78%; e 30,08%.
5.4.1. Amplitude de contração (PPA)
Os dados apresentados revelaram que não houve efeito significativo (p =
43,68%) na interação entre os parâmetros nutrição e treinamento, na amplitude de
contração (PPA); consequentemente, analisaram-se os efeitos marginalmente, ou seja,
animais nutridos versus desnutridos e também treinados versus sedentários.
Para o fator nutrição (nutridos versus desnutridos), na Tabela 9, está
evidenciado que, quando estimulados a 3 Hz, os miócitos dos animais nutridos
apresentaram PPA médio superior ao dos desnutridos (nutr = 9,00 ± 3,71% vs desn =
7,91 ± 3,10%, p < 1%), bem como para o parâmetro treinamento (treinados versus
sedentários), quando estimulados a 3 Hz, os miócitos dos animais treinados também
apresentaram o PPA médio superior aos dos sedentários (tre = 9,04 ± 3,35% vs sed =
7,87 ± 3,43%, p < 1%), conforme a Tabela 9.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
37
Tabela 9 - Valores médios e desvios-padrão da amplitude de contração (PPA) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos PPA (%)
Nutridos (n=257) 9,00 ± 3,71a
Desnutridos (n=257) 7,91 ± 3,10b
Treinados (n=257) 9,04 ± 3,35a
Sedentários (n=257) 7,87 ± 3,43b
* n = número de células. Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1%
pelo Teste de Tukey-Kramer.
Esses resultados apresentaram que a desnutrição e também o sedentarismo
foram suficientes para reduzir a amplitude de contração dos miócitos cardíacos, quando
estimulados em frequência próxima à fisiológica (3 Hz), em temperatura ambiente.
Segundo Shao et al. (2009), essa redução da amplitude de contração reflete alterações
importantes como a redução na fração de encurtamento, no diâmetro diastólico final, no
diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo e no débito cardíaco, em corações de
ratos com algum tipo de distúrbio. Portanto, evidenciou-se, neste trabalho, que a
desnutrição também refletiu essas alterações. Caracteristicamente, corações com algum
tipo de cardiomiopatia apresentam menor volume diastólico final, menor volume de
ejeção, menor fração de ejeção, menor débito cardíaco e maior volume sistólico final
(LOGANATHAN et al., 2007).
O aumento da amplitude de contração dos miócitos dos animais nutridos e
também dos treinados indicou que o estado nutricional e o treinamento promoveram
adaptações positivas nos cardiomiócitos, de maneira a atenuar ou recuperar algumas
anormalidades mecânicas não obtidas para os animais desnutridos e os sedentários. Isso
pode ter tido impacto importante no ventrículo esquerdo desses animais,
semelhantemente ao que acontece quando ocorrem outras doenças, em que animais
treinados apresentam melhoras na contratilidade cardíaca, especificamente com
aumento, in vivo, no débito cardíaco, na fração de encurtamento e no diâmetro
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
38
diastólico final, assim como na redução no diâmetro sistólico final do ventrículo
esquerdo (LOGANATHAN et al., 2007; BIDASEE et al., 2008; SHAO et al., 2009).
Em miócitos cardíacos isolados de animais sem doenças, alguns mecanismos
têm sido propostos como responsáveis pelo aumento da amplitude de contração em
resposta ao exercício físico regular como aumento na sensibilidade dos miofilamentos
ao Ca2+, aumento da [Ca2+], e hipertrofia do aparato contrátil dos cardiomiócitos (KEMI
et al., 2008; WISLOFF et al., 2009).
5.4.2. Máxima velocidade de contração (MVC)
Na máxima velocidade de contração (MVC), não houve efeito significativo (p
= 27,78%) na interação entre os fatores nutrição e treinamento; consequentemente,
analisaram-se os efeitos marginalmente, ou seja, animais nutridos versus desnutridos,
bem como treinados versus sedentários.
No parâmetro nutrição (nutridos versus desnutridos), na Tabela 10, são
evidenciados que, quando estimulados a 3 Hz, os miócitos dos animais nutridos
apresentaram valor médio maior da MVC em relação aos desnutridos (nutr = 57,68 ±
27,65 µm/s vs desn = 50,22 ± 21,40 µm/s, p < 1%).
Para o fator treinamento (treinados versus sedentários), quando estimulados a 3
Hz, os miócitos dos animais treinados apresentaram a MVC média superior aos dos
sedentários (tre = 58,89 ± 24,41 µm/s vs sed = 49,01 ± 24,14 µm/s, p < 1%), conforme a
Tabela 10.
Esses dados demonstraram que tanto a desnutrição quanto o sedentarismo
promoveram prolongamento do tempo necessário para o pico de contração celular,
reduzindo a MVC, indicando que os cardiomiócitos dos animais desnutridos e os dos
sedentários se contraíram mais lentamente que os dos animais nutridos e dos treinados.
Essa alteração tem implicações negativas na função cardíaca desses animais.
A velocidade de contração das células cardíacas é controlada pelas proteínas
reguladoras da movimentação de Ca2+ intracelular e pela taxa de hidrólise de ATP que,
por sua vez, regula a taxa de formação de pontes cruzadas (DIFFE, 2004). Como a
literatura não dispõe de dados semelhantes, imaginou-se que, em animais desnutridos, o
mecanismo de regulação da movimentação de Ca2+ apresentou redução na expressão
dessas proteínas comprometendo a contração.
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
39
Tabela 10 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de contração (MVC) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos MVC (µm/s)
Nutridos (n=257) 57,68 ± 27,65a
Desnutridos (n=257) 50,22 ± 21,40b
Treinados (n=257) 58,89 ± 24,41a
Sedentários (n=257) 49,01 ± 24,14b
* n = número de células. Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1%
pelo Teste de Tukey-Kramer.
5.4.3. Máxima velocidade de relaxamento (MVR)
De acordo com os dados, não houve efeito significativo (p = 30,08%) na
interação entre os parâmetros nutrição e treinamento na máxima velocidade de
relaxamento (MVR); com isso, analisaram-se os efeitos marginalmente, ou seja, animais
nutridos versus desnutridos e também treinados versus sedentários.
Para o fator nutrição (nutridos versus desnutridos), na Tabela 11, são
apresentados que, quando estimulados a 3 Hz, os miócitos dos animais nutridos
evidenciaram valor médio da MVR superior aos dos desnutridos (nutr = 51,66 ± 29,35
µm/s vs desn = 45,73 ± 23,65 µm/s, p < 1%). Já para o fator treinamento (treinados
versus sedentários), na Tabela 11, evidenciou-se que quando estimulados a 3 Hz, os
miócitos dos animais treinados apresentaram a MVR média superior aos dos sedentários
(tre = 54,19 ± 26,10 µm/s vs sed = 43,20 ± 25,97 µm/s, p < 1%).
CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão
40
Tabela 11 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de relaxamento (MVR) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários
Grupos MVR (µm/s)
Nutridos (n=257) 51,66 ± 29,35a
Desnutridos (n=257) 45,73 ± 23,65b
Treinados (n=257) 54,19 ± 26,10a
Sedentários (n=257) 43,20 ± 25,97b
* n = número de células. Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1%
pelo Teste de Tukey-Kramer.
Esses dados também apresentaram que tanto a desnutrição quanto o
sedentarismo promoveram prolongamento do tempo de relaxamento celular, reduzindo
a MVR, o que indicou que os cardiomiócitos de animais desnutridos e sedentários
relaxam mais lentamente que os dos animais nutridos e treinados.
Sabe-se que para o cardiomiócito relaxar é necessário que o Ca2+ seja removido
do citosol. Isso depende principalmente do retorno do Ca2+ para o retículo
sarcoplasmático, para o meio extracelular e para a mitocôndria. Como a literatura não
explica esse mecanismo em animais desnutridos, supôs-se que a desnutrição teve
influência negativa nesse mecanismo.
O relaxamento mais lento tem impacto importante no ciclo cardíaco, levando à
disfunção diastólica e redução da eficiência do coração (SHAO et al., 2009; STOLEN et
al., 2009).
O programa de treinamento aplicado, por sua vez, provocou redução no tempo
de relaxamento, aumentando a MVR. Esse resultado indicou efeito positivo do
treinamento em melhorar a função contrátil dessas células nesses animais, em relação
aos sedentários.
O relaxamento mais rápido dos cardiomiócitos tem impacto importante na
função cardíaca, revelado por meio do aumento da capacidade de trabalho, do volume
de ejeção e do débito cardíaco (LOGANATHAN et al., 2007; KEMI et al., 2008;
STOLEN et al., 2009).
CABRAL, C. A. C. Conclusão
6. CONCLUSÃO
Concluiu-se que:
− A dieta com 6% de proteína foi suficiente para provocar a desnutrição dos animais, o
que se comprovou com os parâmetros bioquímicos e com as da massa corporal.
− O programa de treinamento proposto foi eficiente para o ventrículo esquerdo como
um todo, ou seja, sem a divisão por regiões, pois houve aumento na largura e no
volume celular dos cardiomiócitos dos animais treinados, em relação aos sedentários,
mantendo o comprimento de ambos sem diferença significativa. Quanto aos animais
nutridos, comparados com os desnutridos, houve prejuízo significativo em relação ao
comprimento, à largura e ao volume celular dos cardiomiócitos dos animais
desnutridos.
− O programa de treinamento proposto melhorou consideravelmente a amplitude de
contração, a máxima velocidade de contração e a máxima velocidade de relaxamento
dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo dos animais treinados, em relação aos
sedentários. Também o mesmo aconteceu com os animais nutridos, em relação aos
desnutridos.
− Os exercícios físicos atenuaram as disfunções morfológicas e contráteis em
cardiomiócitos de animais treinados, em relação aos animais sedentários, e entre os
animais nutridos, em relação aos desnutridos; porém, neste estudo não ficou
evidenciada a interação entre exercício e nutrição (ExN). Em razão disso, são
sugeridos estudos com modelo de desnutrição, com estimulação elétrica de 5 Hz a
temperatura de 37 oC, novos protocolos de treinamento, para que se possa encontrar a
condição ideal, com a finalidade de tentar estabelecer essa interação e avaliar com
precisão os efeitos do exercício físico em cardiomiócitos de ratos desnutridos.
CABRAL, C. A. C. Referências
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CABRAL, C. A. C. Anexos
ANEXO
COMISSÃO DE ÉTICA PARA USO DE ANIMAIS (CEUA) DO DEPARTAMENTO DE VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
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