Eletroforese
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Departamento de Biologia
Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc.
Fundamentos de Biofísica
Eletroforese migração de moléculas ionizadas, deacordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares emcampo elétrico.
Na rotina laboratorial os suportes podem ser:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
Introdução a Eletroforese
Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou proteínas, através da aplicação de uma diferença de potencial (corrente elétrica)• as partículas são separadas de acordo com o tamanho (massa)
Introdução a Eletroforese
• Acetato de celulose
• Gel de agarose
• Gel de amido
• Gel de poliacrilamida
• Eletroforese capilar
Introdução a Eletroforese
Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho.
Gel de poliacrilamida Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas
grandes
O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólopositivo
Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
Introdução a Eletroforese
Eletroforese em gel
A amostra é inserida nos “pocinhos”
Uma corrente elétrica é aplicada
Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro
Eletroforese em gel
Eletroforese em gel
CORRENTE ELÉTRICA:
A passagem da corrente elétrica através de uma
solução segue a lei de Ohm, na qual:
V = R . I
V = voltagem, R = resistência e I = amperagem
Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob
voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes.
VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:
* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga
líquida.
* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os
dois eletrodos e à viscosidade.
PROTEÍNAS: corante “coomasie blue”
ENZIMAS: solução específica (substrato,
coenzimas, solução-tampão e sais)
DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais
como:
- Fluorescência (Brometo de Etídio);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS
Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho.
O ladder é formado por diferentestamanhos de DNA e serve comomarcador de peso molecular
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS
AGAROSE POLIACRILAMIDA
COMPOSIÇÃOPó matriz AGA(Alga marinha)
Acrilamida (I) + Bisacrilamida (T)
CARACTERÍSTICAS Malha frouxa Malha complexa
OBJETIVO Longos fragmentos Deleção de bases
SOLIDIFICAÇÃO 15 – 20 minutos 24 horas
• Brometo de etídio• Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
• Composto fluorescente à luz UV
• Nitrato de prata
• Gel Red
Eletroforese em gel
• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha;
• Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria;
• Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA
Eletroforese em gel de agarose
• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as condições de pH do meio
Eletroforese em gel de agarose
Visualização do gel de agarose em luz UV
17
Eletroforese
Marcadores de peso molecular são usados
para estimar o tamanho das moléculas das
amostras.
Eletroforese em gel
GEL DE AGAROSE
A poliacrilamida também pode ser utilizada com gelpara a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura dedois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
Utilizada para observação de fragmentos menores(poucos pares de bases ou proteínas);
Melhor resolução do que a eletroforese em gel deagarose;
Desvantagem: Neurotóxica
Eletroforese em gel de poliacrilamida
• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical.
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Eletroforese em gel de poliacrilamida
36
• Gel de poliacrilamidaEletroforese em gel de poliacrilamida
GEL DE POLIACRILAMIDA
Gel acrilamida
52
Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria
Aplicações
• Identificação de pessoas: em testes de
paternidade, comparando o DNA do suposto pai,
da mãe e do filho.
• Na identificação de criminosos.
• Na Industria farmacêutica (vacinas, reagentes
de diagnóstico).
• Na agropecuária (animais e plantas
transgênicos).
• Na rotina:
• Análise do paciente
• Pesquisa genética
• Conduta terapêutica
• Prognóstico
• Aconselhamento
Aplicações
• Tamanho da molécula
• Tipo de molécula
• Concentração
• Conformação do DNA
• Voltagem
• Tampão (TAE, TPE, TBE, PBS, etc)
Fatores determinantes
Top Related