ELETROFORESE CAPILARPRINCÍPIOS E APLICAÇÕES
PROF. Dr. MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA
EXPERIMENTO DE TISELIUS (1937)
Separação de parcial de proteínas constituintes do soro sanguíneo (Prêmio Nobel de 1948)
2
4239.0 rkQT
=∆
∆T – diferença entre o centro e a parede do tubo
Q – densidade de potência
(Watts/m3)
K – condutividade térmica
r – raio do tubo
1930 FRONTEIRA MÓVEL A. TISELIUS1948 PRÊMIO NOBEL Uppsala University, Suécia
Colunas de 300 µm S. HJERTÉNUppsala University, Suécia
1979 Capilares de 100 µm F. M. EVERAERTSSeparação de 16 ânions Eindhoven University of Technology, Holanda
1981 Capilares de 75 µm J. JORGENSONFSCE – teoria simplificada University of North Carolina, EUA
LIF – detector de R. ZAREfluorescência Stanford University, EUAinduzida por laser E. YEUNG
Iowa State University, EUA
Detectores E. EWINGEletroquímicos Pennsylvania State University, EUA
1984 MEKC S. TERABEKyoto University, Japão
1986 INSTRUMENTOS COMERCIAIS
1987 CGE B. KARGERNortheastern University, EUA
1991 CEC KNOX e GRANTseparação de HPA´s University of Edinburg, Escócia
1997 MICROCHIP TECHNOLOGY
PERFIL DE TEMPERATURANO INTERIOR DE UM CAPILAR
REVESTIMENTO DEPOLIIMIDACENTRO
PAREDE
TEM
PE
RA
TUR
A
0 25 175 190
DIÂMETRO, µm
r1 r2 r3
2
4239.0 rkQT
=∆
ELETROFORESE CAPILAR (CE): CONCEITO
Injeção
-+Comprimento efetivo
DetectorCátion
Ânion
Neutro
+
-
mAu
Tempo, min
www.ceandcec.com/meekc.htm
INSTRUMENTAÇÃO
1-Fonte de alta tensão 3-Reservatórios para eletrólito e amostra2-Eletrodos
5-Injeção 6-Compartimento estabilizado termicamente4-Capilares
7-Detectores
PROPRIEDADES DO CAPILAR
- sílica fundida (dióxido de silício amorfo SiO2) revestidocom poliimida ou acrilamida (15 µm);- dimensões precisas (25 a 75 µm d.i. x 330 µm d.e.);- alta constante dielétrica;- baixa condutividade elétrica;- resistência mecânica;- maleabilidade;- resistência ao ataque químico;- alta transmissão óptica para um intervalo apreciável de comprimento de onda (190 a 990 nm);- presença de FLUXO ELETROOSMÓTICO;
Si OH
O
Si O Si O
O H
Si O Si O
O H
Si O Si O
O
Si O Si
O O:
Si O Si
O
Si O Si OH
O OH
Si
OH
SILANOL
silanóis vicinais(ponte de hidrogênio)
SILOXANO
silanóis geminais
silanol isolado
silanol dissociado
Si OH + H2O
pKa = 5,9
Si O- + H+
SÍLICA FUNDIDA
SUPERFÍCIE SOLUÇÃO
MODOS
DE
INJEÇÃO
Pvácuo
hHIDROSTÁTICA
+
ELETROCINÉTICA
INJEÇÃO HIDRODINÂMICA
INJEÇÃO ELETROCINÉTICA
DETECTORES UTILIZADOS EM CE
1010--1010 –– 1010--12121010--1717 –– 1010--1919RadiométricoRadiométrico
1010--66 –– 1010--881010--1414 –– 1010--1616Índice de refração Índice de refração
1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1616CondutividadeCondutividade
1010--77 –– 1010--10101010--1818 –– 1010--1919AmperometriaAmperometria
1010--88 –– 1010--10101010--1616 –– 1010--1717Espectrometria de massasEspectrometria de massas
1010--1313 –– 1010--16161010--1818 –– 1010--2020fluorescência induzida por laserfluorescência induzida por laser
1010--66 –– 1010--881010--1414 –– 1010--1616Fluorescência indiretaFluorescência indireta
1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1717FluorescênciaFluorescência
1010--44 –– 1010--661010--1212 –– 1010--1515Absorvância Absorvância indiretaindireta
1010--55 –– 1010--771010--1313 –– 1010--1616Absorvância Absorvância no UV/visno UV/vis
MolaridadeMolaridade**NNoo de Molde MolDetectorDetectorLimites de detecção aproximadosLimites de detecção aproximados
* Depende sobretudo do volume de amostra injetado
I0 IT
Fonte de luz Capilar Fotodetector
abcT
A ==1log
I0
I0log = A = ε b C
I
LEI DE BEER
I
SOLUTOε = 103 L mol-1 cm–1
C = 1 mmol L-1 =FATOR DE
200
CUBETA DE 1 cm
A = 1
CAPILAR DE 50 µm
A = 0,005
MANEIRAS DE AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM DETECÇÃO POR UV/VIS
CAPILAR RETANGULAR CÉLULA EM Z
CÉLULA DE MULTIREFLEXÃO
Bubble i.d.
CÉLULA EM FORMA DE BOLHA
DETECÇÃO DIRETA POR UV/vis
+ -
Detector
Injeção
mAu
Tempo, min
A
C
B
Comprimento efetivo
A, B e C com alta absortividade molar
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DETECÇÃO INDIRETA
DetectorÂnionCátion+
-
+ -
Injeção
Baixa absortividade
molar
Zona translúcida do solvente
Zona escura do solvente
Zona translúcida do solvente
MECANISMO DE SEPARAÇÃO
MOBILIDADE ELETROFORÉTICA
MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA
MOBILIDADE OBSERVADA
FLUXO NORMAL
FLUXO INVERTIDO
MOBILIDADE EFETIVA
MOBILIDADE ELETROFORÉTICA
E
+++
---+
EeZF ielétrica =
eFr
iiatrito vrηπ6F =
aFr
Evµ i
i = Mobilidade do íon correspondente a sua velocidade limite vi em um campo elétrico de valor unitário
ii
ii rηπ6
qrηπ6eZ
µ ==iii vrηπ6EeZ =
ii
ii rηπ6
qrηπ6
eZµ ==
B AC
- +
Detector
Injeção
mAu
Tempo, min
Comprimento efetivo
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MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA-FLUXO NORMAL
E
+
-
SUPERFÍCIE
IHP OHP
CAMADACOMPACTA
CAMADADIFUSA
PLANO DECISALHAMENTO
SOLUÇÃO
Si Si Si Si
++ +Camada compacta
Plano de cisalhamento
++ + + +Camada móvel
+ -ânodo cátodo
Fluxo eletrosmótico (EOF)
Parede interna do capilar
πηεζ4Evosm =
Velocidade eletroosmótica
πηεζµ4
=osm
Mobilidade eletroosmótica
επδeζ 4
=
Potencial zeta
C1αδ
Evosm
osm =µ∑=i
2ii zc
21FI
PERFIL RADIAL DA VELOCIDADE
FLUXO
ELETROOSMÓTICO
FLUXO
LAMINAR
FLUXO ELETROOSMÓTICOEM DIFERENTES MATERIAIS
PYREX
SÍLICA
TEFLON
3 4 5 6 7 8
4
3
2
1
MO
BIL
IDA
DE
ELET
RO
OSM
ÓTI
CA
(104
cm2
V-1
s-1 )
pH
MOBILIDADE OBSERVADA
osmefobs vvv +=
Evµ i
i =
osmefobs µµµ +=
mAu
Tempo, min
Detector
+ -
Injeção osmµ
+efµ osmµ
obsv
osmobs vv =
-efµ
obsv
osmµ
CO-ELETROSMÓTICO
VETOR µef DO ANALITO E A µosm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO E SENTIDO
µosmµef
osmefobs µµµ +=
CONTRA-ELETROSMÓTICO
VETOR µef E µosm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO, SENTIDOS CONTRÁRIOS
µosmµef
osmefobs µµµ +−=
DETECTOR
INLET OUTLET
µef
µosm
DETECTOR
INLETOUTLET
µef
µosm
DETECTOR
INLET OUTLET
µef
µosm
MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA - FLUXO INVERTIDO
--
-
-
-
IHP
+
+
CAMADADIFUSA
-
-
-
OHP
CAMADACOMPACTA
-
-E
+
-
PLANO DECISALHAMENTO
SOLUÇÃO
DETECTOR
µef
µosm
INLETOUTLET
+-Detector
Comprimento efetivo
A
Bxx
CuuBAH ++=
C
MODOS DA ELETROFORESE
ELETROFORESE DE ZONA (CZE ou FSCE)
ELETROCROMATOGRAFIA MICELAR (MECC ou MECK)
CROMATOGRAFIA ELETROCINÉTICA EM MICROEMULSÃO (MEEKC)
ELETROFORESE CAPILAR EM GEL(CGE)
FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA CAPILAR (CIEF)
ISOTACOFORESE CAPILAR
ief rηπ6
qµ =
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ief rηπ6
qµ =
ELETROFEROGRAMAS DE ALGUMAS AMOSTRAS DE MEL
Eletrólito PDC 20 mM, CTAB 0,5 mM, pH=12,1, -20 kV, 280 nm, capilar de sílica 87 cm total (80 cm até detector) x 50µm ID.
2 3 4 5
1234
56
7
min
DETERMINAÇÃO INDIRETA DEÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E MÉDIA
1- ácido acético (C2)2- ácido propiônico (C3)3- ácido butírico (C4)4- ácido valérico (C5)5- ácido capróico (C6)6- ácido caprílico (C8)7- ácido cáprico (C10)
4 6 8 10 120
10
20
30
40
50
C18:0
C18:1t
C18:1c
C18:2tt
C16:0
C18:2cc
C18:3ccc
C14:0
C13:0
C12:0
min
DETERMINAÇÃO INDIRETA POR UV DE ÁCIDOS GRAXOS CIS-TRANS
ANÁLISE INDIRETA DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES EM AMOSTRA DE AZEITE DE OLIVA
4 5 6 7 8min
1
23
1-ácido oleico (C18:1c)2-ácido palmítico (C16:0)3-ácido linoleico (C18:2cc)
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POR DETECÇÃO CONDUTOMÉTRICO
DETERMINAÇÃO DE FLUOROQUINOLONAS
2 2.5 3 3.5min
1
2
3
4
5 1-Moxifloxacina2-Gatifloxacina3-Sparfloxacina4-Ciprofloxacina5-Levofloxacina
2.5 3.5 4.5 min
1
2
3
DETERMINAÇÃO DE LOZARTAN ASSOCIOADO A DIURÉTICOS
1- Losartan2- Clortalidona3-Hidroclorotiazida
FSCE
ELETROFORESE CAPILAR
•CAPILARES DE SÍLICA FUNDIDA(25-100 mm diâmetro, 30-100 cm comprimento)
•DISSIPAÇÃO EFETIVA DO CALORRAZÃO ELEVADA ÁREA/VOLUMEALTA RESISTÊNCIA ELÉTRICA (109 ohms)
•ALTA TENSÃO (5-30 kV)CAMPO ELÉTRICO ELEVADO (100-500 V/cm)CORRENTE BAIXA (< 200 µA)
•ALTA EFICIÊNCIA DE COLUNA (105-106 pratos)ALTA RESOLUÇÃO E CAPACIDADE DE PICOTEMPO DE ANÁLISE CURTO
•VÁRIOS MODOS DE SEPARAÇÃO(FSCE, NACE, MEKC, MEEKC, CEC, CGE,CIEF, CITP)
NACEMEKC
CEC
CGE
CIEFCITP
•EXTENSA GAMA DE APLICAÇÕESíons, compostos orgânicos, quirais,biomoléculas
•MEIO AQUOSO
•PEQUENO VOLUME DE AMOSTRA1-50 nL volume injetado
•FORMATO INSTRUMENTALINJEÇÃO E DETECÇÃO EM FLUXO COM COLETA DE FRAÇÕES
•OTIMIZAÇÃO SIMPLIFICADA DAS CONDIÇÕES XPERIMENTAIS
MEEKC
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