Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del parásito al
glóbulo rojo
Angela Patricia Guerra Vega
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2019
Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del parásito al
glóbulo rojo
Angela Patricia Guerra Vega
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Doctor en Química
Director:
Ph.D., José Manuel Lozano Moreno1
Codirectora:
Ph.D., Jacqueline Chaparro Olaya2
Línea de Investigación:
Motores moleculares en Apicomplexa2
Grupo de Investigación:
Mimetismo molecular de los agentes infecciosos1-U Nacional/ Laboratorio de Parasitología
Molecular2-U El Bosque
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento que Química
Bogotá, Colombia
2019
A mi querida Osita
Agradecimientos
A las instituciones que financiaron este trabajo:
COLCIENCIAS. Convocatoria Nacional para la Conformación del Banco de Proyectos de
Investigación Científica o Tecnológica. Proyecto 110152128729.
DIB-Dirección de Investigación de la Sede Bogotá - Universidad Nacional de Colombia.
Convocatoria “Proyectos de investigación, desarrollo, innovación o creación artística de la
DIB”, en la modalidad “Proyectos de investigación, desarrollo, innovación o creación
artística en colaboración con instituciones académicas o de investigación
internacionales”. Proyecto 15828.
DIB-Dirección de Investigación de la Sede Bogotá - Universidad Nacional de Colombia.
Convocatoria “Apoyo de la DIB a tesis de investigación en Posgrados”. Proyecto 19106.
Instituto Nacional de Salud (INS), por acogerme en su plan de estímulos y beneficios y
concederme el tiempo para cursar el programa de doctorado.
Al bioterio del INS
A las personas:
Siempre estaré en deuda con la profesora Jacqueline Chaparro-Olaya; muchas gracias por
toda tu generosidad académica y acompañamiento a lo largo de estos años. Gracias por
tanta dedicación, guía, discusiones fértiles y paciencia en la consecución de los objetivos
de este trabajo.
Al profesor José Manuel Lozano por su apoyo, confianza y orientación.
A Eliana Calvo, por sus enseñanzas, acompañamiento profesional en el quehacer diario
del laboratorio y por su amistad.
Al profesor Moisés Wasserman por su asesoría y consejo crítico a lo largo del desarrollo
de este trabajo.
A la profesora Lisa Ranford-Cartwright, investigadora de la Universidad de Glasgow por
permitirme realizar la pasantía en su laboratorio, por todo su apoyo, dedicación,
amabilidad y confianza.
A la profesora Sylke Müller, investigadora de la Universidad de Glasgow, quien
generosamente nos donó el vector de transfección y a la doctora Eleanor H Wong de la
misma universidad, quien me enseñó la técnica para producir parásitos “knock-out”.
A Liliana Morales del grupo de Parasitología Molecular de la Universidad El Bosque y a
Ricardo Cubillos del grupo de Bioquímica del Instituto Nacional de Salud por toda su
ayuda y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.
A Magda, Luis, Paula y Rosalba, por compartir desinteresadamente su conocimiento y
experiencia y por toda la colaboración prestada en el trabajo de laboratorio.
A todas las personas que donaron un poquito de su sangre para darle vida a mis parásitos.
A Laurita y Marco por su apoyo, respaldo continuo, amor, paciencia y compañía.
A mis padres y hermanas por su cariño incondicional.
Resumen
Plasmodium falciparum es un parásito intracelular obligado cuya supervivencia y
proliferación depende de su capacidad para invadir células del hospedero. Como todos los
miembros del phylum Apicomplexa, P. falciparum presenta una forma inusual de locomoción
llamada “gliding”, la cual involucra una sofisticada maquinaria proteica (“glideosoma”) que es
impulsada por un motor actina-miosina. En P. falciparum se han identificado seis genes que
codifican para las miosinas PfMyoA a PfMyoF, pero hasta ahora sólo se ha caracterizado
funcionalmente a PfMyoA. Esta miosina hace parte del motor molecular del “glideosoma” y
participa activamente en la invasión a células hospederas. No se conoce la función de las
otras miosinas, pero se ha sugerido que PfMyoB también podría estar involucrada en este
proceso. Para explorar la posible participación de PfMyoB en la invasión y si tiene
redundancia funcional con PfMyoA, este trabajo se dirigió a identificar interacciones entre
PfMyoB y otras proteínas, así como a establecer el efecto del silenciamiento (“knock out”) del
gen pfmyo-b. Para lograr lo anterior, inicialmente se produjeron anticuerpos policlonales a
partir de proteínas recombinantes del “glideosoma” (PfMyoA, MTIP, GAP45 y GAP50) y de
PfMyoB. Aunque los anticuerpos anti-PfMyoB permitieron establecer que la localización
celular de esta proteína es distinta a la de PfMyoA, no fueron útiles para reconocer proteínas
de interacción porque fallaron al intentar inmunoprecipitar a PfMyoB. Por su parte, el
silenciamiento de pfmyo-a resultó en la muerte de la población “knock-out”, lo que impidió
estudiar el comportamiento de PfMyoB en ausencia de PfMyoA. Finalmente, el silenciamiento
de pfmyo-b no tuvo efecto aparente sobre la invasión, aunque alteró el desarrollo del
parásito. Los resultados obtenidos parecen indicar que pfmyo-b no es un gen esencial para la
supervivencia de los estadíos intraeritrocíticos de P. falciparum y PfMyoB parece no tener
una función complementaria con PfMyoA.
Palabras clave: Plasmodium falciparum, PfMyoB, “glideosoma”, invasión, proteínas
recombinantes, silenciamiento de genes.
X Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del
parásito al glóbulo rojo
Abstract
Plasmodium falciparum is an obligate intracellular parasite whose survival and proliferation
depend on its ability to invade host cells. Like all members of the phylum Apicomplexa, P.
falciparum has an unusual form of motility called gliding, which is powered by an
actomyosin-motor and involves the coordinate work of a sophisticated multi-protein
machinery named glideosome. In P. falciparum, the six genes coding for myosins (PfMyoA to
PfMyoF) have been identified, but until now only PfMyoA has been functionally
characterized. This myosin is part of the molecular motor of glideosome and actively
participates in the invasion process to host cells. The function of the other myosins is still
unknown, but it has been suggested that PfMyoB could also be involved in this process. To
explore the possible role of PfMyoB in host cell invasion and define its possible functional
redundancy with PfMyoA, our work was aimed at identifying the interactions between
PfMyoB and other proteins, and establishing the effect of knock out of the pfmyo b gene. To
achieve these objectives, polyclonal antibodies were initially produced from recombinant
proteins of the glideosome (PfMyoA, MTIP, GAP45, and GAP50) and of PfMyoB. Although the
anti-PfMyoB antibodies showed that the cellular localization of this protein is different from
that of PfMyoA, they were not useful to identify interaction proteins because they failed to
immunoprecipitate PfMyoB. In addition, the pfmyo-a gene knock out resulted in the death of
these parasites, which prevented the evaluation of the behavior of PfMyoB in the absence of
PfMyoA. Finally, the pfmyo-b gene knock out had no apparent effect on host cell invasion
process, although it altered the parasite development. Our results seem to indicate that
pfmyo-b is not an essential gene for the survival of the intraerythrocytic stages of P.
falciparum and its associated protein does not have a complementary function to PfMyoA.
Keywords: Plasmodium falciparum, PfmyoB, glideosome, invasion, recombinant proteins,
gene silencing (“knock-out”).
Contenido
1 MARCO TEÓRICO...................................................................................................................... 3
1.1 Epidemiología de la malaria ........................................................................................................................ 3
1.2 Biología de parásitos Apicomplexa .......................................................................................................... 5
1.3 Ciclo de vida de Plasmodium ....................................................................................................................... 7
1.4 Miosinas ................................................................................................................................................................ 9
1.4.1 Mecanismo molecular del motor actina-miosina ......................................................................................... 12
1.4.2 Miosinas de Plasmodium falciparum .................................................................................................................. 13
1.4.2.1 Miosina A................................................................................................................................................................................ 14
1.4.2.2 Miosina B ................................................................................................................................................................................ 15
1.4.2.3 Miosina C, D, E y F .............................................................................................................................................................. 16
1.5 Invasión del eritrocito por merozoítos de Plasmodium .............................................................. 17
1.6 El “glideosoma” ............................................................................................................................................... 20
1.6.1 Actina y miosina del “glideosoma” de Plasmodium ...................................................................................... 21
1.6.1.1 Actina en Plasmodium falciparum .............................................................................................................................. 22
1.6.1.2 PfMyoA y sus cadenas livianas .................................................................................................................................... 23
1.6.2 Proteínas asociadas a “glideosoma”: GAP45 y GAP50 ................................................................................ 25
1.6.2.1 GAP45 ...................................................................................................................................................................................... 25
1.6.2.2 GAP50 ...................................................................................................................................................................................... 26
1.6.3 Proteínas transmembranales tipo adhesinas que comunican el motor con receptores sobre la célula a invadir ................................................................................................................................................... 26
1.6.4 Proteínas que median la interacción del motor con las adhesinas ...................................................... 27
1.6.5 Proteínas que conducen al rompimiento de las interacciones con el sustrato .............................. 27
1.6.6 Mecanismos que controlan la función del “glideosoma” ........................................................................... 28
2 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 31
3 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 33
3.1 Objetivo general ............................................................................................................................................. 33
3.2 Objetivos específicos.................................................................................................................................... 33
4 MÉTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 35
XII Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
4.1 Cultivo de Plasmodium falciparum y preparación de extractos ..............................................36
4.1.1 Cultivo continuo ........................................................................................................................................................... 36
4.1.2 Obtención de parásitos libres ................................................................................................................................ 36
4.1.3 Extracción de ADN....................................................................................................................................................... 36
4.1.4 Extracción de ARN ....................................................................................................................................................... 37
4.1.5 Extracción de proteínas ............................................................................................................................................ 38
4.2 Producción de proteínas recombinantes: PfMyoA, PfMyoB, MTIP, GAP45 y GAP50 ....38
4.2.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 38
4.2.1.1 Diseño de cebadores y clonación ............................................................................................................................... 38
4.2.1.2 Expresión de las proteínas recombinantes ........................................................................................................... 40
4.2.1.3 Análisis bioinformático ................................................................................................................................................... 41
4.2.1.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ..................................................................... 42
4.2.1.5 Purificación de proteínas recombinantes .............................................................................................................. 42
4.2.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 43
4.2.2.1 Diseño de cebadores y clonación ............................................................................................................................... 44
4.2.2.2 Expresión de las proteínas recombinantes ........................................................................................................... 46
4.2.2.3 Análisis bioinformático ................................................................................................................................................... 49
4.2.2.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ..................................................................... 50
4.2.2.4.1 Efecto de la cepa .......................................................................................................................................................................................... 50
4.2.2.4.2 Efecto de la temperatura en la solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas en la cepa pG-KJE8 ....................................................................................................................................................................................................................... 51
4.2.2.5 Purificación de proteínas recombinantes .............................................................................................................. 52
4.2.3 Discusión .......................................................................................................................................................................... 54
4.3 Producción y evaluación de anticuerpos policlonales .................................................................56
4.3.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 56
4.3.1.1 Esquemas de inmunización .......................................................................................................................................... 57
4.3.1.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB) ............................................ 57
4.3.1.2.1 Detección de proteínas recombinantes ........................................................................................................................................... 57
4.3.1.2.2 Detección de proteínas sobre extractos del parásito ................................................................................................................ 59
4.3.1.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF) ............................. 59
4.3.1.4 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP) ............................. 60
4.3.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 61
4.3.2.1 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB) ............................................ 61
4.3.2.1.1 Detección de las proteínas recombinantes .................................................................................................................................... 61
4.3.2.1.2 Detección de las proteínas del parásito ........................................................................................................................................... 63
4.3.2.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF) ............................. 64
4.3.2.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP) ............................. 65
4.3.2.4 Alternativas para la producción del anticuerpo anti-PfMyoB ..................................................................... 66
4.3.2.4.1 Ensayos Western Blot (WB) con anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2. ....................................................................................... 68
Contenido XIII
4.3.2.4.2 Ensayos de IF con anti-MyoB-P2 ......................................................................................................................................................... 69
4.3.2.4.3 Ensayos de IP con anti-MyoB-P2 ......................................................................................................................................................... 70
4.3.3 Discusión .......................................................................................................................................................................... 73
4.4 Generación de parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-a o el gen pfmyo-b .................... 74
4.4.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 74
4.4.1.1 Diseño de constructos y PCR diagnóstico .............................................................................................................. 75
4.4.1.1.1 Diseño de constructos “knock-out” ..................................................................................................................................................... 75
4.4.1.1.2 Diseño de constructos control .............................................................................................................................................................. 79
4.4.1.1.3 Diseño de la PCR diagnóstica ................................................................................................................................................................ 83
4.4.1.2 Clonación y transfección................................................................................................................................................. 87
4.4.1.2.1 Extracción y purificación del ADNp ................................................................................................................................................... 88
4.4.1.2.2 Transfección de Plasmodium falciparum mediante electroporación................................................................................. 89
4.4.1.2.3 Monitoreo de los cultivos transfectados .......................................................................................................................................... 91
4.4.1.3 Evaluación de “knock-out” pfmyo-a y pfmyo-b .................................................................................................... 92
4.4.1.3.1 Ensayos de PCR ............................................................................................................................................................................................ 92
4.4.1.3.2 Ensayos de RT-PCR .................................................................................................................................................................................... 92
4.4.1.3.3 Ensayos WB ................................................................................................................................................................................................... 93
4.4.1.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo .............................................. 93
4.4.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 93
4.4.2.1 Monitoreo de los cultivos ............................................................................................................................................... 93
4.4.2.2 Evaluación de parásitos MyoA-KO y MyoA-C ....................................................................................................... 94
4.4.2.2.1 PCR diagnóstica ........................................................................................................................................................................................... 94
4.4.2.2.2 Ensayos RT-PCR y WB .............................................................................................................................................................................. 97
4.4.2.3 Evaluación de parásitos MyoB-KO y MyoB-C ....................................................................................................... 99
4.4.2.3.1 PCR diagnóstica ........................................................................................................................................................................................... 99
4.4.2.3.2 Ensayos adicionales de PCR ................................................................................................................................................................ 101
4.4.2.3.3 Ensayos RT-PCR (retrotranscripción reversa-PCR) ............................................................................................................... 102
4.4.2.3.4 Ensayos de WB .......................................................................................................................................................................................... 105
4.4.2.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos MyoB-KO en cultivo ................................................ 106
4.4.2.5 Localización de MTIP en parásitos MyoB-KO.................................................................................................... 109
4.4.3 Discusión ....................................................................................................................................................................... 111
4.5 Identificación de potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas informáticas .................................................................................................................................................. 115
4.5.1 Métodos ......................................................................................................................................................................... 115
4.5.1.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con modelos ocultos de Markov (HMM) .......................... 115
4.5.1.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares ...................................................... 116
4.5.2 Resultados .................................................................................................................................................................... 116
4.5.2.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con HMM.......................................................................................... 116
4.5.2.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares ...................................................... 117
4.5.3 Discusión ....................................................................................................................................................................... 119
XIV Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
5 DISCUSIÓN GENERAL.......................................................................................................... 121
6 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 125
7 ANEXOS .................................................................................................................................. 127
8 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 145
Contenido XV
Lista de figuras
Figura 1-1. Morfología comparativa de zoítos de Apicomplexa. ............................................................... 6
Figura 1-2. Ciclo de vida de Plasmodium. ............................................................................................................. 8
Figura 1-3.Modelo de cintas de una miosina clase II. ..................................................................................... 9
Figura 1-4. Organización por dominios de algunas miosinas .................................................................. 11
Figura 1-5. Dominios de cola de las miosina II y V confieren especificidad de función. ............. 12
Figura 1-6. Modelo de movimiento de la miosina. ........................................................................................ 13
Figura 1-7. Invasión del eritrocito por el merozoíto. ................................................................................... 19
Figura 1-8. Modelo para la movilidad “gliding” de Apicomplexas ......................................................... 21
Figura 1-9. Organización por dominios de PfMyoA y motivos IQ .......................................................... 24
Figura 4-10. Amplificación por PCR de los fragmentos de interés y ligación de los productos en el vector pGEM-T easy. .............................................................................................................. 45
Figura 4-11. Confirmación de colonias transformadas. .............................................................................. 45
Figura 4-12. Subclonación en vector de expresión pGEX-4T 2. .............................................................. 46
Figura 4-13. Expresión de 5 proteínas recombinantes en dos cepas de E. coli BL21. ................. 49
Figura 4-14. Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ...................................... 51
Figura 4-15. Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de GST-GAP50 y GST-MyoA .......... 52
Figura 4-16. SDS-PAGE de las 5 recombinantes purificadas y WB con anti-GST y Anti-His ..... 53
Figura 4-17. WB sobre las proteínas recombinantes con los anticuerpos producidos ............... 62
Figura 4-18. WB sobre extracto del parásito con los anticuerpos producidos. .............................. 63
Figura 4-19. WB sobre extractos del parásito con αMyoB-ratón usando quimioluminiscencia ..................................................................................................................................................................... 64
Figura 4-20. IF sobre parásitos en estadio de esquizontes, usando anti-MTIP producido en conejo y anti-MyoA producido en ratón. ................................................................................. 65
Figura 4-21. Inmunoprecipitación con anti-MyoB ........................................................................................ 66
XVI Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-22. Secuencia de las proteínas recombinantes de PfMyoB .....................................................67
Figura 4-23. Localización de los péptidos P1 y P2. ........................................................................................68
Figura 4-24. Western blot con anti-MyoB-P2 sobre extractos del parásito (esquizontes) ........69
Figura 4-25. Inmunofluorescencia sobre trofozoitos y esquizontes usando anti-MyoB-P2......70
Figura 4-26. IP con anti-MyoB-P2 ..........................................................................................................................71
Figura 4-27. IP con anti-MTIP ..................................................................................................................................72
Figura 4-28. Constructo pHH1-PfMyoA_knock-out .......................................................................................76
Figura 4-29. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_knock-out ....77
Figura 4-30. Constructo pHH1-PfMyoB_knock-out .......................................................................................78
Figura 4-31. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño del constructo pHH1-PfMyoB_knock-out ....79
Figura 4-32. Constructo pHH1-PfMyoA_Control .............................................................................................80
Figura 4-33. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_Control. .......81
Figura 4-34. Constructo pHH1-PfMyoB_Control .............................................................................................82
Figura 4-35. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño de constructo pHH1-PfMyoB_Control ...........83
Figura 4-36. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_knock-out .............................................................................................................................84
Figura 4-37. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_knock-out..............................................................................................................................85
Figura 4-38. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_Control ...................................................................................................................................86
Figura 4-39. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_Control ...................................................................................................................................87
Figura 4-40. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-KO ......................95
Figura 4-41. Estimación de la proporción de parásitos con integración en el cultivo MyoA-KO ......................................................................................................................................................................97
Figura 4-42. RT-PCR y WB sobre cultivo MyoA-KO .......................................................................................98
Figura 4-43. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-C..........................99
Figura 4-44. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-KO ................... 100
Figura 4-45. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-C ....................... 101
Figura 4-46. PCR semi-anidada para comprobar ausencia de parásitos silvestres (ADNg) en el cultivo MyoB-KO ............................................................................................................................... 102
Contenido XVII
Figura 4-47. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar pfmyo-b .......... 103
Figura 4-48. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar los genes hrp2 y gap50 ..................................................................................................................................................... 104
Figura 4-49. PCR diagnóstica y RT-PCR sobre parásitos MyoB-KO ................................................... 105
Figura 4-50. WB para comprobar ausencia de expresión de PfMyoB en parásitos MyoB-KO .................................................................................................................................................................. 106
Figura 4-51. Comportamiento de parásitos MyoB-KO y MyoB-C durante el proceso de invasión y de maduración ........................................................................................................... 107
Figura 4-52. Morfología de los parásitos MyoB-C y MyoB-KO en cultivo ....................................... 109
Figura 4-53. IF con anticuerpo anti-MTIP sobre esquizontes de P.falciparum ............................ 111
Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
XVIII
Lista de tablas
Tabla 4-1. Información de los genes de interés ...............................................................................................44
Tabla 4-2. Frecuencia de codones raros en las cinco proteínas recombinantes y dos tags .......50
Tabla 4-3. Motivos IQ identificados en las miosinas de Plasmodium falciparum con el modelo HMM ....................................................................................................................................................... 117
Tabla 4-4. Motivos IQ encontrados con tres estrategias de búsqueda .............................................. 118
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolo Término
°C grados celsius
g gramo
x g unidades por gravedad
h hora
kDa kiloDalton
L litro
μ micro
m mili
M molar
U unidades
rpm revoluciones por minuto
Abreviatura Término Aa Aminoácido ADN Acido desoxiribonucleico ADNg ADN genómico ADNp ADN plasmídico
ADNe ADN episomal
ARN Acido ribonucleic ARNm ARN mensajero CaM Calmodulina Cultivo MyoA-KO Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo
pHH1-PfMyoA_ knock out Cultivo MyoA-C Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo
pHH1-PfMyoA_control Cultivo MyoB- KO Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo
pHH1-PfMyoB_knock out Cultivo MyoB-C Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo
pHH1-PfMyoB_control FA Fosfatasa alcalina FA-ST Fosfatasa alcalina-Estreptavidina FITC Isotiocianato de fluoresceína GAP45 Proteína asociada al “glideosoma” 45 GAP50 Proteína asociada al “glideosoma” 50 GR Glóbulos rojos GRI Glóbulos rojos infectados
XX Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
GST Glutation S transferasa
HA Hemaglutinina
HMM Modelos ocultos de Markov HRP Peroxidasa de rábano HRP-ST Peroxidasa-estreptavidina Hto Hematocrito IMC Complejo interno de membranas IF Inmunofluorescencia IP Inmunoprecipitación IPTG Isopropyl-beta-thio-galactopyranoside Medio de selección Medio de cultivo completo + 5 nM de WR99210 min Minuto MP Membrana plasmática MTIP Proteína que interactúa con el dominio de cola de PfMyoA nt Nucleótido pb Pares de bases P. falciparum Plasmodium falciparum PfMyoA Miosina A de P. falciparum pfmyo-a Gen que codifica para la miosina A de P. falciparum PfMyoB Miosina B de P. falciparum pfmyo-b Gen que codifica para la miosina B de P. falciparum PM Peso molecular PVDF Membrana de fluoruro de polivinilideno RT-PCR Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la ADN Polimerasa SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes seg Segundo TRITC Tetrametilrodamina VP Vacuola Parasitófora WB Western Blot
Introducción
A pesar de los innegables logros alcanzados en la reducción de la morbilidad y mortalidad
por malaria en los últimos años (OMS, 2017), esta enfermedad infecciosa continúa siendo un
grave problema de salud pública mundial. La transmisión endemo epidémica persistente de
la malaria, junto con la aparición de cepas de Plasmodium falciparum resistentes a los
derivados de artemisininas (WHO, 2017) y de vectores resistentes a los insecticidas (Lol et
al., 2013), han planteado la necesidad de utilizar nuevas estrategias encaminadas ya no al
control sino a la eliminación de la transmisión local de la malaria en los países y territorios
donde la enfermedad es endémica (OPS, 2016). De manera simultánea, los grandes avances
de la ciencia han permitido un mayor entendimiento de los mecanismos biológicos del
parásito y la identificación y priorización de candidatos para el desarrollo de nuevos
medicamentos o de la tan anhelada vacuna contra la malaria. Siendo Plasmodium spp. un
organismo intracelular obligado, la invasión de la célula hospedera es un paso esencial
durante su ciclo de vida. Así, el proceso de invasión reviste gran importancia como blanco
terapéutico, ya que al bloquear la invasión se bloquearía la enfermedad.
Plasmodium spp. tiene un ciclo de vida complejo, el cual se lleva a cabo en dos hospederos
diferentes; el ciclo esporogónico o sexual, se desarrolla en mosquitos del género Anopheles y
el ciclo esquizogónico o asexual, en un hospedero vertebrado. Este parásito invade diferentes
tipos de células a través de tres formas infectantes distintas (zoítos) que aparecen a lo largo
de su ciclo de vida: el ooquinete, el esporozoíto y el merozoíto. Entre otras características
morfológicas/estructurales, estos “zoitos” comparten la maquinaria proteica que le permite
al parásito moverse e invadir células. Esta maquinaria, conocida como “glideosoma”, debido a
que dirige un tipo de movimiento llamado “gliding”, produce movimiento gracias a la fuerza
proporcionada por un motor molecular de actina-miosina. En P. falciparum se han
identificado seis genes que codifican para miosinas, las cuales se han nombrado con letras,
desde la A a la F (PfMyoA a PfMyoF). Hasta ahora sólo se ha dilucidado la función de PfMyoA,
proteína que constituye el motor molecular del “glideosoma” y que por tanto participa
2 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
activamente en el proceso de invasión (Pinder et al., 1998; Baum et al., 2006; Jones et al.,
2006). Para las otras miosinas aún no se conoce su función; sin embargo, diferentes
investigaciones (Chaparro-Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005; Foth et al., 2006;
Hernández et al., 2017; Hernández et al., 2018) han permitido establecer numerosas
similitudes entre la miosina A y B, evidencias que sugieren que PfMyoB puede tener una
función redundante con PfMyoA durante el proceso de invasión de P. falciparum.
En este trabajo se exploró la participación de PfMyoB en el proceso de invasión de P.
falciparum a glóbulos rojos, con el propósito de establecer si interactúa con el “glideosoma”
en la misma forma que lo hace PfMyoA, es decir a través de MTIP (“Myosin A Tail domain-
Interacting Protein”). Para estudiar esta interacción, fue necesario generar previamente una
serie de herramientas como constructos plasmídicos, proteínas recombinantes del
“glideosoma” y anticuerpos policlonales contra ellas. Para tratar de dilucidar el papel de
PfMyoB en la invasión, se usó una técnica de silenciamiento de genes, a partir de la cual se
generaron parásitos “knock-out”. Finalmente, mediante herramientas bioinformáticas se
buscaron motivos funcionales en PfMyoB que pudieran dar indicios sobre su posible función.
Los resultados generados en este estudio aportan conocimiento en torno a la posible
participación de PfMyoB en el proceso de invasión. Además, la estandarización y uso de
técnicas genéticas moleculares relacionadas con silenciamiento de genes nos permitió
establecer si PfMyoB es un gen esencial o no para el parásito. Este tipo de información sobre
el repertorio genético del parásito es de gran relevancia a la hora de priorizar blancos para el
desarrollo de fármacos antipalúdicos. Se espera que este acercamiento metodológico apoye
la búsqueda futura de la función de las demás miosinas de P. falciparum.
1 Marco teórico
1.1 Epidemiología de la malaria
La malaria es la infección parasitaria más importante a nivel mundial y uno de los grandes
retos en salud pública que enfrentan los países ubicados en la franja intertropical. Esta
enfermedad es causada por parásitos del género Plasmodium, los cuales son transmitidos al
humano por la picadura de mosquitos Anopheles sp infectados (OMS, 2018). Se conocen cinco
especies de Plasmodium que infectan humanos: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale y
P. knowlesi, siendo las dos primeras las causantes de la mayor morbi-mortalidad (OMS,
2018). La transmisión zoonótica de P. knowlesi, especie propia de monos catarrinos, sólo se
ha reportado en poblaciones humanas del sureste asiático (Millar y Cox-Singh, 2015).
La incidencia de la malaria depende de que los vectores locales se encuentren en condiciones
ambientales apropiadas en términos de altitud, clima, vegetación y de la implementación de
medidas de control (Ashley et al., 2018). Los cambios en los sistemas biológicos asociados
con el clima, así como la alteración en la distribución de mosquitos, indican que
enfermedades como la malaria tienen el potencial para propagarse a regiones donde no
existía, aumentando la población que estaría en riesgo de contraer la enfermedad (Short et
al., 2017).
Según el informe mundial 2018 sobre el paludismo, para el año 2017 se presentaron a nivel
mundial 219 millones de casos y 435.000 muertes debidas a esta enfermedad (WHO, 2018).
La mayoría de los casos se presentaron en Africa subsahariana (92%), seguidos por Asia
Suroriental (5 %) y la región del Mediterráneo Oriental (2%), siendo Plasmodium falciparum
la especie más prevalente en estas tres regiones. En las Américas, P. vivax fue la especie
predominante (74,1%), observándose un incremento en el número de casos debido en gran
medida al aumento en la transmisión en países como Brasil, Venezuela y Nicaragua, (WHO,
2018).
4 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Colombia ocupó en la región de las Américas el tercer lugar entre los países que más casos de
malaria reportaron (8%), después de Venezuela (53%) y Brasil (22%) (WHO, 2018). El 85 %
del territorio rural colombiano está situado por debajo de los 1.600 m.s.n.m y presenta
condiciones climáticas, geográficas y epidemiológicas aptas para la transmisión de la
enfermedad. En 2017 se presentó una disminución del 35 % en la notificación de casos de
malaria respecto al 2016, registrándose 55117 casos de malaria, de los cuales 54102 fueron
de malaria no complicada, 1015 de malaria complicada y 19 fueron fatales (INS, 2017). Los
casos se concentraron en los departamentos de Chocó (30,5 %) y Nariño (26,6 %), seguidos
en menor proporción por Antioquia (9,1 %), Córdoba (7,3 %), Guainía (5,4 %), Amazonas
(4,8 %), Cauca (3,8 %) y Vichada (3 %). En cuanto a las especies parasitarias circulantes hubo
predominio de infección por P. falciparum con 30170 casos (54,7 %), seguido por P. vivax con
23736 casos (43,1 %) y 1211 casos (2,2 %) correspondieron a infección mixta (P. falciparum
y P. vivax) (INS, 2017). Aunque para el año 2018 hubo un incremento de 7024 casos respecto
al año anterior, vale la pena resaltar que hubo una reducción del 52,6 % en el número de
muertes y del 5 % en los casos de malaria complicada. Para 2018 se conservó la misma
tendencia en cuanto a las especies parasitarias; es decir, mayor número de casos por P.
falciparum (50,1 %) que por P. vivax (47,9 %) (INS, 2018), al igual que los departamentos con
la mayor casuística.
Dentro de las estrategias que despliegan los países en la lucha contra la malaria, el
diagnóstico y el tratamiento oportunos constituyen la intervención más costo-efectiva, ya que
contribuyen a reducir la incidencia, los efectos mortales y la transmisión de la enfermedad
(OMS, 2018). Actualmente, las terapias disponibles a nivel mundial se basan en el
tratamiento combinado con derivados de artemisinina, medicamento que tiene la capacidad
de reducir la biomasa parasitaria rápida y eficientemente (10000 veces cada 48 horas) (Cui y
Su, 2009). Otra de las estrategias es la reducción de la transmisión, que se basa en la lucha
antivectorial y dentro de ésta se utilizan dos intervenciones, el uso de mosquiteros
impregnados con insecticidas y la fumigación de interiores con insecticidas de acción
residual (OMS, 2018). A pesar de las múltiples estrategias de control que se han
implementado a nivel mundial para reducir la morbi-mortalidad de la malaria, éstas no han
tenido el progreso esperado, especialmente durante los últimos 4 años, siendo prioritario
que los países reorienten sus programas y establezcan nuevas medidas que apunten al
cumplimiento de las metas propuestas en la Estrategia Técnica Mundial contra el paludismo
Marco teórico 5
2016-2030 de la OMS: reducir la incidencia de casos y las tasas de mortalidad en al menos un
40 % con respecto a los niveles de 2015 (WHO, 2018). A la par con esta situación, el
surgimiento de parásitos resistentes a los diferentes antimaláricos y la ausencia de una
vacuna efectiva, empeoran el panorama. Todas estas situaciones han llevado a la OMS a
proponer una nueva estrategia encaminada ya no al control, sino a la eliminación (OMS,
2017).
1.2 Biología de parásitos Apicomplexa
Los parásitos del phylum Apicomplexa constituyen uno de los grupos más significativos de
patógenos que infectan al hombre y a los animales de granja. Dentro de éstos se encuentran
los parásitos de los géneros Plasmodium, Toxoplasma, Eimeria, Teileria y Cryptosporidium.
Todos los Apicomplexa son parásitos intracelulares obligados que comparten una gran
variedad de características morfológicas y exhiben ciclos de vida complejos que involucran
diferenciación a formas que invaden tejidos distintos en huéspedes diferentes. Las formas
invasivas o móviles denominadas zoítos son elongadas y polarizadas, con un extremo basal y
un extremo apical claramente diferenciados. En el polo apical se observan organelos únicos
que participan en la invasión a la célula hospedera (Morrissette y Sibley, 2002). Dentro de
éstos se encuentran las roptrias, los micronemas, el anillo polar y el conoide (Figura 1-1); los
dos primeros secretan proteínas que se requieren durante la locomoción, la adhesión, la
invasión y la formación de la vacuola parasitófora, mientras que el anillo polar funciona como
uno de los 3 centros organizadores de microtúbulos, a partir del cual se originan los
microtúbulos subpeliculares (Morrissette y Sibley, 2002; Baum et al., 2006b). La estructura
denominada conoide juega un papel mecánico en la invasión, pero no está presente en
Plasmodium. Esta visible especialización de la región apical es la característica principal que
clasifica a estos protozoos dentro del phylum Apicomplexa.
Los Apicomplexa tienen otra característica estructural única que es fundamental para la
locomoción del parásito y que se conoce como el complejo interno de membranas (IMC por
su acrónimo en inglés), el cual está formado por dos membranas estrechamente asociadas,
una interna y otra externa, que se localizan por debajo de la membrana plasmática (MP) del
parásito y se extienden a lo largo de todo el cuerpo del zoíto. En conjunto esta estructura de 3
capas membranosas se denomina película (Morrissette y Sibley, 2002; Santos et al., 2009).
Adicionalmente, entre la membrana externa del IMC y la MP hay un pequeño compartimiento
6 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
que reviste una importancia fundamental, ya que éste contiene las proteínas que participan
en el proceso de invasión (Figura 1-1). Esta maquinaria proteica se conoce como
“glideosoma” (Frénal y Soldati-Favre, 2013).
Figura 1-1. Morfología comparativa de zoítos de Apicomplexa.
Taquizoíto de Toxoplasma gondii (izquierda) y merozoíto de Plasmodium falciparum (derecha). La
estructura apical constituye la característica más sobresaliente de los “zoitos” del phylum
Apicomplexa. Dentro de ésta se encuentran las roptrias y los micronemas (organelos secretores) y el
anillo polar, del cual se originan los microtúbulos sub-peliculares que se extienden hacia el polo
posterior del zoíto. Entre la membrana plasmática externa (MP) y los microtúbulos sub-peliculares se
encuentra el complejo interno de membranas, el cual junto con la MP forman la película. Tomado de
Baum et al., 2006b.
Los Apicomplexa presentan una estrategia única de locomoción denominada “gliding”, la cual
les permite atravesar membranas para invadir y salir activamente de las células hospederas
(Morrissette y Sibley, 2002; Keeley y Soldati, 2004; Frénal y Soldati-Favre, 2013). Esta
inusual forma de movimiento es dependiente de sustrato y se caracteriza por la ausencia de
cambios en la forma de la célula y por el mantenimiento de su polaridad antero posterior
(Pinder et al., 2000; Baum et al., 2006a). Este tipo de movilidad no requiere de estructuras
extracelulares como cilios o flagelos (Sibley, 2004; Baum et al., 2006ª) y es distinto al
movimiento de “arrastre” propio de las amebas, en el cual la célula no mantiene la polaridad
Marco teórico 7
y hay deformación y reorganización del citoesqueleto (Pinder et al., 2000). Para que se lleve a
cabo este movimiento por deslizamiento o “gliding”, los parásitos necesitan una compleja
maquinaria proteica denominada “glideosoma” (Sibley, 2004; Keeley y Soldati, 2004), la cual
se basa en la actividad de un motor molecular compuesto por actina-miosina (Pinder et al.,
2000; Jones et al., 2006).
Aunque el citoesqueleto de los Apicomplexa contiene los típicos elementos del citoesqueleto
de las células eucariotas, también presentan características específicas e inusuales. Así, los
microtúbulos subpeliculares de los Apicomplexa son muy estables y pueden soportar muchas
condiciones adversas (Morrissette y Sibley, 2002), los microfilamentos son cortos e
inestables, y la actina se encuentra mayormente en forma globular (Schmitz et al., 2005;
Vahokoski et al., 2014). En cuanto a las miosinas, se encuentra la miosina A, que es del tipo
no convencional, se localiza en la película y pertenece a la clase XIV, la cual se caracteriza
porque sus miembros tienen muy cortos dominios de cola (Pinder et al., 1998; Heintzelman y
Schwartzman., 1997; Foth et al., 2006). Estas características le proporcionan altísima
flexibilidad al citoesqueleto, asegurando no sólo el mantenimiento de la forma del parásito y
la integridad estructural, sino que durante el proceso de invasión y locomoción, el parásito es
capaz de ajustar su forma sin sufrir deformaciones mayores (Santos et al., 2009).
1.3 Ciclo de vida de Plasmodium
Plasmodium falciparum tiene un ciclo de vida complejo que se lleva a cabo en dos huéspedes
diferentes de modo que una parte se desarrolla en un mosquito del género Anopheles y la
otra en un hospedero vertebrado. A lo largo de todo su ciclo de vida, el parásito presenta tres
formas infectantes distintas: ooquinete, esporozoíto y merozoíto, que tienen la capacidad de
invadir diferentes tipos celulares (Figura 1-2) (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017). Los
esporozoítos y los merozoítos están diseñados para invadir únicamente hepatocitos y
glóbulos rojos, respectivamente, a diferencia de los taquizoítos de Toxoplasma gondii que
tiene la capacidad de invadir la mayoría de tipos celulares (Cowper et al., 2012).
Ciclo esporogónico: ocurre en mosquitos hembra del género Anopheles, los cuales se
infectan al ingerir sangre de una persona que porte parásitos sexualmente diferenciados
(gametocitos). Estas formas entran al estómago del mosquito y allí los microgametocitos
(gametocito masculino) por el proceso de exflagelación dan origen a formas flageladas
8 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
móviles que fecundan las células femeninas (macrogametocitos). Las cromatinas de las dos
células se fusionan dando origen al zigote, el cual se transforma en una célula alargada y
móvil llamada ooquinete, la cual penetra la pared del estómago del mosquito, crece y forma
el ooquiste. En su interior ocurre la división del núcleo y del citoplasma para dar origen a los
esporozoítos. Al estallar el ooquiste, se liberan los esporozoítos, que se localizan en las
glándulas salivares del mosquito (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017; Cowman et al., 2017).
Figura 1-2. Ciclo de vida de Plasmodium. Tomado de: http://www.nature.com/nature/journal/v419/n6906/images/419495a-f1.2.jpg
Ciclo esquizogónico: comienza con la penetración de esporozoítos a través de la piel,
durante la picadura del mosquito. Estas formas móviles rápidamente pasan a la circulación y
luego de 30 minutos invaden los hepatocitos. Allí se dividen formando el esquizonte tisular
primario, que después de 6 a 12 días sufre ruptura liberando miles de merozoítos tisulares,
los cuales van a la circulación para invadir los eritrocitos. Los merozoítos (1- 3µm) pasan a
una forma de anillo y luego maduran a trofozoítos, los cuales al dividir su cromatina forman
el esquizonte. A medida que el esquizonte madura se van formando los merozoítos (16-32),
los cuales son liberados por ruptura del eritrocito y salen a buscar un glóbulo rojo para
comenzar el ciclo nuevamente. Algunos parásitos se diferencian a gametocitos y cuando son
ingeridos por la hembra del mosquito dan inicio al ciclo esporogónico. Los parásitos del ciclo
sanguíneo tienen un genoma haploide, se reproducen exponencialmente y son los causantes
Marco teórico 9
de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017;
Cowman et al., 2017).
1.4 Miosinas
La miosina junto con la dineina y la kinesina constituyen los tres tipos de motores
moleculares que se encuentran en el citoesqueleto de las células eucariotas (Xiao et al.,
2016). Las miosinas constituyen una gran superfamilia de proteínas conocidas como
mecanoenzimas, ya que son capaces de moverse a lo largo de filamentos de actina utilizando
la energía liberada de la hidrólisis del ATP. Estructuralmente están constituidas por una o
dos cadenas pesadas idénticas y una o más cadenas livianas por cada cadena pesada. La
cadena pesada se compone típicamente de tres dominios funcionales (Sellers, 2000): una
cabeza o dominio motor N-terminal donde se encuentra el sitio de unión al nucleótido ATP
y el sitio de unión al filamento de actina; un dominio de cuello que contiene motivos IQ por
medio de los cuales se une a las cadenas livianas o a calmodulina (CaM) y un dominio de
cola C-terminal en el cual se pueden encontrar uno o varios motivos funcionales que sirven
para anclar la miosina o para unirse a otras proteínas (Figura 1-3).
Figura 1-3.Modelo de cintas de una miosina clase II.
ELC: cadena liviana esencial. RLC: cadena liviana reguladora. Modificado de Sellers, 2000.
10 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
En el dominio motor se encuentran secuencias y estructuras ampliamente conservadas entre
especies y un subdominio denominado región convertidora (converter region), que es el sitio
de unión con el brazo palanca. La región convertidora tiene una estructura de tipo bisagra
que permite que los pequeños cambios ocurridos en el dominio motor durante la hidrólisis
del ATP, se traduzcan en grandes cambios conformacionales de esta región, lo cual conlleva a
un desplazamiento mucho mayor de la miosina sobre la actina (Houdusse et al., 1999)
El domino del cuello está constituido por el brazo palanca, que es una larga hélice que se
extiende desde la región convertidora y que sirve como sitio de unión para las cadenas
livianas esenciales o reguladoras (Sellers, 2000). Las cadenas livianas esenciales se unirán al
sitio más cercano a la región convertidora y las reguladoras al más distal. La unión de estas
cadenas produce un cambio en la conformación α-helicoidal de esta región poniéndola rígida
(Lu et al., 2014), con lo cual se estabiliza el brazo palanca y así logra regular la función del
dominio motor (Masters et al., 2016). Los motivos helicoidales IQ presentes en el cuello
varían en número y tienen una secuencia consenso IQXXXRGXXXR (Rhoads y Friedberg,
1997), que en algunas miosinas es muy degenerada. El número de estos motivos determina la
longitud del brazo palanca de cada miosina.
El dominio de cola típicamente contiene regiones α-helicoidales tipo coiled-coil para
dimerización (generación de miosinas de dos cabezas) y una gran variedad de dominios o
motivos que determinan la interacción de la miosina con otras proteínas y por tanto, su
función y su localización intracelular (Sellers, 2000; Krendel y Mooseker, 2005; Masters et al.,
2016). Dentro de éstos se encuentran: dominios SH3 y PH propios de proteínas involucradas
en señalización celular; dominios MyTH4 y FERM para la asociación a membranas; dominios
GAP con actividad enzimática; dominio Smc relacionados con división celular y segregación
de cromosomas; dominios DIL relacionados con unión a vesículas secretoras; dominios TH1
los cuales interactúan con los lípidos de membrana y ayudan a la apropiada localización
celular; dominio SMC_N asociado con motores dependientes de microtúbulos; dominio SbcC
el cual es una ATPasa involucrada en reparación del ADN, entre otros (Sellers, 2000; Krendel
y Mooseker, 2005; Sattarzadeh et al., 2011; Mazerik et al., 2014) (Figura 1-4). A pesar de la
diversidad de subdominios presentes en el dominio de cola, se ha evidenciado que las
miosinas que están involucradas en procesos similares comparten los mismos subdominios.
Adicionalmente, los dominios de cabeza y cola no actúan independientemente, es decir, las
Marco teórico 11
propiedades mecánicas de un dominio motor dado, deben corresponder exactamente con los
requerimientos mecánicos de una función específica, la cual es dictada por el domino de cola
(Korn, 2000).
Figura 1-4. Organización por dominios de algunas miosinas
Se muestra la organización de la miosina II y 4 miosinas no convencionales. En el dominio de la cola se
pueden observan diferentes subdominios. Tomado de Lu et al., 2014.
Con base en su función, las miosinas se dividen en dos grupos, las convencionales o clase II,
las cuales se encargan de la contracción muscular y las no convencionales (Figura 1-5), las
cuales están implicadas en un sinnúmero de funciones fundamentales que se agrupan en dos
grandes actividades: transporte intracelular (Ross et al., 2008; Lu et al., 2014) y soporte
mecánico (es decir cuando se anclan a filamentos de actina) (Lu et al., 2014). Dentro de las
funciones que se han descrito para la miosinas están el transporte de cargas a través de
microfilamentos (ya sean organelos como vesículas endocíticas o mitocondrias o
macromoléculas como partículas de ARNm), endocitosis, exocitosis, mantenimiento de la
arquitectura celular, control de la dinámica de las extensiones celulares ricas en actina (como
en el caso del movimiento por arrastre de las amebas), transducción de señales, regulación
del ensamblaje de actina, cooperación entre el transporte dependiente de microtúbulos y
actina, regulación de las interacciones miosina-organelo, fagocitosis y generación de la fuerza
necesaria para que organismos como los Apicomplexa puedan desplazarse e invadir células
(Krendel y Mooseker, 2005; Wu et al., 2000; Titus, 1997; Buss et al., 2004; Hartman et al.,
2011; Foth et al., 2006).
En el año 2006, Foth y colaboradores clasificaron las miosinas con base en análisis
filogenéticos realizados con las secuencias del dominio motor y polimorfismos de
12 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
aminoácidos específicos. Los autores incluyeron miosinas que no habían sido clasificadas
previamente y enfatizaron sobre las secuencias de los Apicomplexa y otros protistos. Las
miosinas se agruparon en 24 clases distintas nombradas de la I a la XXIV y dentro de éstas,
las miosinas de los Apicomplexa se ubicaron en las clases XIV, VI, XXII, XXIII y XXIV (Foth et
Figura 1-5. Dominios de cola de las miosina II y V confieren especificidad de función.
Las cadenas pesadas tipo II poseen colas en espiral que median la dimerización y el ensamblaje en
estructuras filamentosas que funcionan en procesos como la contracción muscular. Las cadenas
pesadas de miosina V no convencional también se dimerizan, pero no se ensamblan en filamentos y
están implicadas en el transporte intracelular de una variedad de cargas. Las proteínas X y Y
representan proteínas de unión a la cola de miosina V que pueden mediar en las interacciones con la
carga. Tomado de Hutagalung et al., 2002.
al., 2006). Actualmente, con la clasificación propuesta por Sebé-Pedrós y colaboradores las
miosinas se agrupan en 31 clases de la I a la XXXIV y a diferencia de la clasificación previa, las
miosinas de los Apicomplexa se distribuyeron en tres clases: XIV, XXIII y XXVII (Sebé-Pedrós
et al., 2014).
1.4.1 Mecanismo molecular del motor actina-miosina
El movimiento de la miosina a lo largo del filamento de actina se produce gracias a la energía
liberada tras la hidrólisis del ATP. La actividad ATPasa de la miosina es activada por actina
asegurando que la miosina actúe a su máxima capacidad. El movimiento neto ocurre cada vez
Marco teórico 13
que se presenta el ciclo denominado puente cruzado, es decir cada vez que la miosina se une
y se libera del filamento de actina en respuesta al estado de unión del ATP (Figura 1-6).
Figura 1-6. Modelo de movimiento de la miosina.
Hipótesis del brazo palanca oscilante. Inicialmente, el motor está en estado rígido, unido a la actina
pero no al nucleótido. 1) La unión del ATP hace que el dominio motor se separe de la actina. 2) La
hidrólisis del ATP inclina el dominio motor que se vuelve a unir a la actina. 3) Se produce la liberación
de fosfato, lo que desencadena la ejecución de la carrera de trabajo. (4) Se libera ADP, completando el
ciclo. Tomado de Masters et al., 2016.
Durante este ciclo, el dominio motor de la miosina que se encuentra rígido y unido a la actina
se libera de ésta una vez entra una molécula de ATP al sitio ATPasa. La miosina rápidamente
hidroliza el ATP a ADP y un grupo fosfato (Pi), el cual permanece unido a la cabeza. En este
estado el dominio motor se une a la actina y a la par se libera el Pi, lo cual genera pequeños
cambios conformacionales en el dominio motor, que se amplifican y transmiten al brazo
palanca. Esta reorganización estructural del dominio motor se traduce en un movimiento
conocido como “power stroke”, el cual desplaza a la miosina a una nueva posición sobre el
filamento de actina, en dirección al extremo positivo. El dominio motor permanecerá unido a
la actina hasta que se libere el ADP y se una otra molécula de ATP, volviendo nuevamente a
un estado de rigor. Este modelo de movimiento de la miosina es denominado hipótesis del
brazo palanca oscilante, el cual se basó originalmente en estudios hechos con miosina
muscular clase II (Holmes, 1997).
1.4.2 Miosinas de Plasmodium falciparum
Hasta el momento se conocen seis genes que codifican para miosinas en P. falciparum, las
cuales se han denominado de la A a la F (PfMyoA-PfMyoF). Las miosinas PfMyoA, B y E tanto
en la clasificación del 2006, como en la del 2014, se agruparon en la clase XIV, mientras que
PfMyoC (clase XXII) y PfMyoD y F (clase VI) se reclasificaron en las clases XXVII y XXIII,
respectivamente (Foth et al., 2006; Sebé-Pedrós et al., 2014).
14 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
1.4.2.1 Miosina A
El gen pfmyo-a consta de 2841 pb, contiene dos intrones y como producto de su
transcripción se produce un ARN mensajero de 2457 pb. El gen se transcribe en los 3
estadios del ciclo intraeritrocítico aunque el nivel del transcrito es mucho mayor en
esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005). La proteína PfMyoA contiene 818 residuos, tiene
un peso molecular de 92.276 Da y no tiene dominios transmembrana o secuencias para
péptido señal (PlasmoDB). Posee un dominio motor canónico, pero adolece de un verdadero
dominio de cola (Foth et al., 2006); en el C-terminal, los últimos 50 residuos son en su
mayoría básicos y contienen dos motivos IQ degenerados (IQ1 e IQ2), lo cual identifica esta
región como un dominio de cuello y no de cola. PfMyoA sólo se expresa en esquizontes
maduros y merozoítos libres (y ooquinetes en el ciclo sexual) y se localiza en la periferia de
estos últimos o de merozoítos segmentados. Después que el merozoíto invade al eritrocito y
da paso a la forma de anillo, PfMyoA desaparece y vuelve a detectarse durante la
esquizogonia (Pinder et al., 1998; Pinder et al., 2000; Margos et al., 2004; Green et al., 2017).
Teniendo en cuenta la localización y el patrón de expresión de la proteína, se sugirió que
PfMyoA era la miosina del “glideosoma” y que participaba en el proceso de invasión. En su
momento, esta hipótesis fue reforzada por la similitud estructural con la miosina A de T.
gondii (TgMyoA), para la cual dicha función ya había sido comprobada.
En 2003, Bergman y colaboradores mediante ensayos de doble híbrido, utilizando como
anzuelo los 75 aa del C-terminal de la miosina A de P. yoelii (PyMyoA) lograron identificar
una proteína de 24 kDa que interactuaba con esta miosina y la denominaron “Proteína que
interactúa con la cola de la miosina”, en inglés MTIP (“Myosin A Tail domain-Interacting
Protein”). Adicionalmente, determinaron los aa críticos involucrados en esta interacción y
encontraron que correspondían a los 15 aa finales de la miosina A (residuo 903 al 917) y a
los residuos 79 a 204 de MTIP. La expresión de esta proteína solo se observó en esquizontes
y esporozoítos y se localizó en la periferia de los merozoítos, específicamente en el IMC,
donde colocalizó con miosina A (Bergman et al., 2003). Posteriormente, Green y
colaboradores demostraron que MTIP se expresa en merozoítos de P. falciparum, se localiza
en la periferia del zoíto e interactúa con PfMyoA (Green et al., 2006). Así, el dominio C-
terminal de PfMyoA media la unión con la proteína MTIP y ésta a su vez interactúa con otras
proteínas haciendo posible el anclaje del complejo PfMyoA/MTIP a componentes del
citoesqueleto (Bosch et al., 2006).
Marco teórico 15
1.4.2.2 Miosina B
El gen pfmyob consta de 3493 pb, contiene siete intrones y cuando se transcribe produce un
ARN mensajero de 2406 pb. El gen se transcribe en los 3 estadíos del ciclo intraeritrocítico
aumentando gradualmente hasta alcanzar el pico de transcripción en el estadio de
esquizonte (Chaparro-Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005). PfMyoB al igual que
PfMyoA es una miosina pequeña comparada con las otras miosinas de Plasmodium y se cree
que el tamaño puede estar relacionado con el compartimiento donde se localizan, es decir la
película. PfMyoB se compone de 801 residuos, tiene un peso molecular de 93176 Da, no
posee dominios transmembrana o secuencias de péptido señal (PlasmoDB) y comparte alta
identidad de secuencia con PfMyoA. En cuanto a su expresión, se detecta únicamente en
esquizontes tardíos (>de 40 horas) y merozoítos. PfMyoB no posee un verdadero dominio de
cola (Foth et al., 2006) y al igual que PfMyoA, los 50 aa del extremo C-terminal son básicos.
Esta particularidad se asemeja a otras miosinas no convencionales, como las miosinas clase I
que debido a su carga de aa básicos tienen la habilidad para unir fosfolípidos ácidos y así
mediar interacciones miosina-membrana (Mooseker y Cheney, 1996; Sellers et al., 1996).
Recientemente, Yusuf y colaboradores lograron establecer con precisión la localización
celular de MyoB, a partir de líneas transgénicas de P. falciparum, P knowlesi y P. berghei, en
las cuales la miosina B se expresó concomitantemente con la proteína verde fluorescente
(GFP por sus siglas en inglés) o con una etiqueta (tag) de HA. En esquizontes de P. knowlesi y
P. falciparum de 38 horas post-invasión, es decir esquizontes con 8 a 10 núcleos, no se
detectó señal fluorescente; sin embargo, cuando los parásitos tuvieron más de 10 núcleos (40
horas post-invasión) PfMyoB-GFP se detectó como un punto en el extremo apical de cada
merozoíto dentro del esquizonte y en merozoítos libres. El mismo patrón se encontró en
ooquinetes, esporozoítos y merozoítos dentro de esquizontes de P. berghei (Yusuf et al.,
2015).
En 2017, Hernández y colaboradores modelaron (in sílico) y compararon las estructuras 3D
de PfMyoA y PfMyoB, encontrando que las dos presentan alta similitud estructural.
Adicionalmente, simularon mediante docking molecular la posible unión entre PfMyoB y
MTIP y de acuerdo con los modelos de interacción 3D obtenidos y los valores de energía
encontrados, los autores sugirieron que es posible la interacción entre estas dos proteínas
(Hernández et al., 2017). Por otro lado y con el propósito de verificar experimentalmente los
resultados previos, se realizaron ensayos de interacción proteína-proteína in vitro con
16 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
PfMyoB y PfMTIP recombinantes y ensayos de inhibición con péptidos sintéticos, resultados
que mostraron unión específica entre estas dos proteínas (Hernández et al., 2018). En
conjunto estos resultados apoyan la hipótesis que estas dos miosinas pueden cumplir
funciones similares
1.4.2.3 Miosina C, D, E y F
Estas cuatro miosinas son de mayor tamaño que PfMyoA y PfMyoB y presentan dominios de
cola largos. Poco se conoce acerca de éstas, solo algunos datos en cuanto a las características
de la proteína y la abundancia del transcrito durante el ciclo eritrocítico. Así, para PfMyoC, el
gen se transcribe principalmente en trofozoítos (Chaparro et al., 2005), la proteína está
constituida por 2159 aa, su peso molecular es de 250 kDa y no tiene dominios
transmembrana. PfMyoC posee los tres dominios típicos de las miosinas, con 3-6 motivos IQ
en el dominio de cuello y 4-6 motivos WD40 en el dominio de cola (Foth et al., 2006).
Respecto a PfMyoD, el gen se transcribe principalmente en el estadio de trofozoítos y en
menor proporción en esquizontes, la proteína está constituida por 2287 aa, no tiene
dominios transmembrana y su peso molecular es de 272 kDa. PfMyoD se localiza en el
citoplasma de trofozoítos y esquizontes maduros; sin embargo, en algunos casos se evidenció
que la fluorescencia de los esquizontes maduros fue más débil comparada con la de las
formas más jóvenes, lo cual sugiere que puede ser importante en pasos intermedios de la
maduración de esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005). PfMyoD tiene 1 motivo IQ
degenerado (Foth et al., 2006). En PfMyoE, el pico de expresión del ARN mensajero se detectó
en esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005), la proteína está constituida por 2153 aa, su
peso molecular es de 255 kDa y no tiene dominios transmembrana. PfMyoE es expresada en
los estados invasivos del parásito y se detectó como un punto en el extremo basal de
ooquinetes y esporozoitos y como un punto en merozoitos; sin embargo, en estos últimos no
se ha podido identificar claramente su ubicación (Wall et al., 2019). PfMyoE es una miosina
de la clase XIV, no se le han asignado motivos IQ y su dominio de cola está constituido por
estructura coiled-coil (Foth et al., 2006). En PfMyoF, el gen se transcribe durante los 3
estadios del ciclo asexual (Chaparro et al., 2005), la proteína está constituida por 2160 aa, su
peso molecular es de 250 kDa y no tiene dominios transmembrana. PfMyoF, tiene 1 motivo
IQ y su dominio de cola está constituido por estructura coiled-coil y motivos WD40 (Foth et
al., 2006).
Marco teórico 17
1.5 Invasión del eritrocito por merozoítos de Plasmodium
Siendo Plasmodium un organismo intracelular obligado, la invasión es un proceso crítico para
su supervivencia y proliferación. Este proceso es complejo, dinámico, rápido, se lleva a cabo
en varios pasos secuenciales y es conducido activamente por el parásito (Weiss et al., 2016;
Cowman et al., 2017). El estudio molecular del proceso de invasión ha permitido generar
alternativas terapéuticas significativas en la lucha contra la malaria, ya que desde este campo
de investigación ha sido posible postular un número importante de proteínas del esporozoíto
y del merozoíto como posibles candidatos a vacuna (Regules et al., 2016; Kublin et al., 2017;
Beeson et al., 2016).
Los merozoítos son formas activamente móviles cuando entran en contacto con el glóbulo
rojo durante la invasión (Baum et al., 2006ª), se ha reportado que en cultivos pretratados con
compuestos que alteran la dinámica de la actina (Field et al., 1993) o la actividad ATPasa de
la miosina (Pinder et al., 1998), se inhibe la invasión de los eritrocitos, lo cual sugiere que los
merozoitos utilizan un motor basado en actina y miosina durante el proceso de invasión.
Evidencia experimental ha demostrado que los merozoítos poseen todos los componentes
proteicos (“glideosoma”) asociados con la invasión del glóbulo rojo (Baum et al., 2006; Jones
et al., 2006).
El proceso de invasión del eritrocito por el merozoíto se basa en una secuencia altamente
organizada de interacciones ligando-receptor y se divide en tres etapas: 1) interacción inicial
y deformación de la membrana del eritrocito (Preinvasión), 2) interacción apical e invasión
(Invasión) y 3) equinocitosis y recuperación de la célula hospedera invadida (Weiss et al.,
2016; Cowman et al., 2017) (Figura 1-7). La primera etapa comienza cuando un merozoíto
entra en contacto con la superficie del eritrocito. Luego, a través de la proteína 1 de
superficie del merozoíto (MSP1) (Lin et al., 2014), el parásito establece una interacción con la
membrana del glóbulo rojo, produciéndole una ligera deformación.
La segunda etapa inicia con la unión de ligandos de la vía denominada alterna, los cuales
establecen una unión más fuerte (que la anterior) con los receptores del glóbulo rojo, se
produce una deformación importante del eritrocito y la reorientación del merozoíto,
fenómenos que cursan con aumento en la fosforilación del citoesqueleto del eritrocito y la
participación activa de la actina del parásito (Weiss et al., 2016; Koch y Baum, 2016; Cowman
et al., 2017). Dentro de los ligandos de la vía alterna se encuentran dos familias
18 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
principalmente, los antígenos de unión al eritrocito (EBA) y homólogos de la proteína de
unión al reticulocito (Rh), proteínas secretadas desde los micronemas y las roptrias,
respectivamente. La liberación de EBA parece darse en respuesta a la baja concentración de
potasio que encuentra el merozoíto en el plasma humano una vez sale del eritrocito. Esta
señal activa la fosfolipasa C (PLC) citoplasmática del merozoito promoviendo la liberación de
calcio desde el retículo endoplásmico y este aumento del calcio citosólico activa una proteína
quinasa (CDPK1), que a su vez produce la liberación de los contenidos de los micronemas. La
proteína EBA-175 es translocada a la superficie del merozoíto y desde allí se une a la
glicoforina A del eritrocito. Una vez se restaura el nivel basal del Ca++ citosólico se liberan las
proteínas de las roptrias (Sharma y Chitnis, 2013). La función de las adhesinas PfRh1,
PfRh2a, PfRh2b y PfRh4 no está completamente definida, pero se cree que se relaciona con el
establecimiento de la especificidad de la célula hospedera que será invadida, mientras que
EBA-175, EBA-140 y EBA-181 son proteínas que presentan dominios ricos en cisteína, los
cuales le permiten unirse a glicoproteínas específicas (glicoforina A, C y banda 4) presentes
en la superficie del eritrocito (Cowman y Crabb, 2006). Estas proteínas son importantes en la
invasión, pero no son esenciales, cada una media rutas específicas de invasión a través de
receptores independientes, hecho que le proporciona al parásito un amplio rango de
ligandos. Lo anterior le ha permitido al merozoíto de P. falciparum desarrollar vías
redundantes para asegurar la entrada a la célula hospedera a través de múltiples
interacciones ligando receptor. Estos ligandos son proteínas altamente variables y esta
variabilidad se da como respuesta a la presión inmune ejercida por el hospedero (Cowman y
Crabb, 2006; Baum et al., 2005). Durante esta segunda etapa, el parásito logra colocar su
extremo apical en contacto directo con la membrana del eritrocito (Aikawa et al., 1978), se
produce un aumento del flujo de calcio en la interfase eritrocito-parásito y el ligando PfRh5
se une al receptor basigina, señales que disparan una nueva liberación del contenido de los
organelos apicales (micronemas y roptrias).
En general, las proteínas micronemales están involucradas en el reconocimiento y unión al
eritrocito, mientras que los contenidos de las roptrias participan en la formación de la
vacuola parasitófora (VP). La proteína micronemal AMA1 (proteína transmembrana) es
traslocada a la superficie del merozoíto antes que comience la invasión, mientras que el
complejo de proteínas RON procedente del cuello de las roptrias se inserta en la membrana
del eritrocito.
Marco teórico 19
Figura 1-7. Invasión del eritrocito por el merozoíto.
La invasión es un proceso de múltiples pasos, rápido, altamente regulado e involucra muchos ligandos.
En la parte superior se observa la duración de cada etapa en segundos y en la parte inferior cada uno
de los pasos que se llevan a cabo en las respectivas etapas. Tomado de Weiss et al., 2016 con algunas
modificaciones.
La proteína AMA1 utiliza a RON2 como su receptor y la unión de estas dos proteínas da
origen a la “unión móvil” o “unión fuerte” (Cao et al., 2009). En principio esta estructura se
observa como una cubierta o engrosamiento sobre la zona apical del merozoíto y luego como
un anillo alrededor del zoíto (Aikawa et al., 1978). Una vez se forma esta estructura,
permanece estable y fija en un punto de la célula hospedera proporcionando un sólido
anclaje que hala el parásito hacia adentro de la célula durante el proceso de invasión
(González et al., 2009). La unión móvil mantiene al merozoíto y al eritrocito en contacto
estrecho durante la invasión y a través de ésta el merozoíto entra al eritrocito en una VP
utilizando la fuerza proporcionada por el motor de actina –miosina (Koch y Baum, 2016). La
miosina A del merozoíto está anclada al ICM a través de MTIP. Esta interacción es esencial
para la generación de fuerza en una dirección específica, lo cual ocurre cuando PfMyoA une y
libera filamentos de actina que a su vez están asociados con proteínas transmembrana
(Thomas et al., 2010). A medida que el parásito se desplaza a través de la unión móvil la
membrana plasmática del eritrocito se invagina para formar la VP alrededor del parásito y el
20 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
parásito pierde la capa superficial que lo recubre por la acción de serin-proteasas; la invasión
se completa una vez la VP está totalmente formada y la unión móvil se localiza en el extremo
posterior del merozoíto (González et al., 2009; Aikawa et al., 1978). El proceso de invasión
dura alrededor de 60 segundos.
Durante la tercera etapa, el eritrocito recién infectado adquiere una apariencia de estrella,
fenómeno conocido como equinocitosis. Esta forma permanece durante 5 a 10 minutos para
luego regresar a su típica forma bicóncava (Cowman et al., 2017).
1.6 El “glideosoma”
El estudio de la movilidad “gliding” y del “glideosoma” comenzó en el modelo Toxoplasma, a
partir del cual se caracterizaron funcionalmente varias proteínas del “glideosoma”, dando
inicio a una explosión de investigaciones orientadas a explicar los mecanismos implicados en
la movilidad y la invasión. Aunque mucho de este conocimiento se ha extrapolado al modelo
Plasmodium, diferentes acercamientos bioinformáticos y experimentales han permitido
identificar ortólogos de la mayoría de estas proteínas en P. falciparum (Pinder et al., 1998;
Baum et al., 2006ª; Jones et al., 2006; Weiss et al., 2015; Cowman et al., 2017), encontrándose
que aunque comparten aspectos comunes, cada organismo tiene sus particularidades.
El “glideosoma” es un complejo molecular proteico localizado entre el IMC y la MP de los
zoítos, el cual se basa en un motor molecular actina-miosina, a partir del cual se genera la
fuerza necesaria para que el parásito pueda invadir, migrar a través de las células, o salir de
ellas (Figura 1-8). Esta maquinaria está compuesta por proteínas que constituyen el motor
molecular, proteínas que anclan el motor al complejo interno de membranas del parásito,
proteínas que median la interacción del motor con proteínas transmembranales tipo
adhesinas (las cuales se comunican con receptores sobre la célula a invadir), y proteínas que
conducen al rompimiento de las interacciones entre las adhesinas del parásito y los
receptores de la célula, a medida que el parásito avanza (Opitz y Soldati, 2002; Keeley y
Soldati, 2004). En general, las proteínas que hacen parte del “glideosoma” son
extremadamente conservadas en el phylum Apicomplexa, mostrando una identidad de
aminoácidos entre el 30 y el 60% (Soldati et al., 2004).
Marco teórico 21
Figura 1-8. Modelo para la movilidad “gliding” de Apicomplexas
Una vez se da la unión inicial del zoíto con los receptores presentes en la célula hospedera, las
adhesinas tipo TRAP son liberadas de los micronemas a la membrana plasmática del zoíto. Los
filamentos cortos de actina (actina F) son nucleados desde un pool de actina G localizado en el
citoplasma del parásito. El C-terminal de la proteína TRAP interactúa con la actina F a través de la
enzima aldolasa. La miosina que está anclada al IMC a través de MTIP, GAP 45 y GAP50 se mueve a lo
largo del filamento de actina hacia el extremo positivo (+), moviendo las proteínas tipo TRAP hacia la
parte posterior del parásito con lo cual impulsa al parásito hacia adelante. Las proteínas tipo TRAP son
clivadas mediante proteasas romboides. Tomado y modificado de Kumpula y Kursula, 2015 y Baum et
al., 2006b
1.6.1 Actina y miosina del “glideosoma” de Plasmodium
La actina y la miosina son las dos proteínas que constituyen el motor molecular del
“glideosoma”. La participación de la actina en el proceso se evidenció experimentalmente
cuando el movimiento y la invasión de los zoítos fueron bloqueados usando citocalasina-D
(Miller et al., 1979; Field et al., 1993), compuesto que desestabiliza microfilamentos e inhibe
la polimerización de la actina. Los parásitos tratados con citocalasina-D son incapaces de
invadir células aún cuando permanecen unidos a la superficie de ésta y secretan los
componentes necesarios para la invasión. Así mismo, la participación de la miosina en el
“gliding” se evidenció experimentalmente al observar una disminución importante del
porcentaje de invasión al usar 2,3 butanedione monoxime (BDM), un inhibidor específico de
la actividad ATPAsa de la miosina (Pinder et al., 1998). PfMyoA fue la primera miosina
asociada con la movilidad “gliding” y el proceso de invasión en Plasmodium (Pinder et al.,
1998; Pinder et al., 2000).
22 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Se han propuesto varios modelos sobre la topología de la maquinaria de movilidad “gliding”
en Apicomplexa, los cuales han ido variando a medida que se caracterizan nuevos
componentes del “glideosoma” (Kappe et al., 2004). El primer modelo propuso que la miosina
se localizaba cerca de la membrana plasmática, mientras que la actina se ubicaba cerca del
IMC (King, 1988). Hoy en día se sabe que la ubicación de la miosina y la actina es la opuesta:
la actina se localiza cerca de la membrana plasmática, mientras que la miosina se ubica hacia
el IMC.
1.6.1.1 Actina en Plasmodium falciparum
La actina es una de las proteínas citoplasmáticas más abundantes, siendo el componente
predominante del citoesqueleto. En general la actina existe en dos formas, globular o
monómerica (actina G) y filamentosa (actina F). La polimerización de la actina G es
dependiente de ATP, se hace en dirección cabeza a cola y forma microfilamentos estables
(actina F) con longitudes que varían de cientos de nanómetros a micras (Baum, 2006b). La
formación o disociación de estos microfilamentos se da por la polimerización o
despolimerización de la actina G, procesos que se dan en respuesta a señales para producir
movimiento, cambiar la forma, transportar organelos, promover la división celular o invadir
células (Vahokoski et al., 2014). La propiedad fundamental de la actina que le permite
cumplir con un sinnúmero de funciones radica en su habilidad para formar estructuras
dinámicas con polaridad definida (Kumpula y Kursula, 2015).
Las primeras observaciones en merozoítos de P. falciparum revelaron que éstos contenían
microtúbulos pero parecían no tener filamentos de actina, a pesar que ya se había
demostrado que la invasión podía ser inhibida si los zoítos eran pretratados con citocalasina,
lo cual apoyaba la existencia de un sistema motor basado en actina (Miller et al., 1979).
Posteriormente, Wesseling y colaboradores identificaron dos secuencias de actina en el
genoma de P. falciparum y detectaron el ARNm de una de ellas en los estadíos
intraeritrocíticos del parásito (Wesseling et al., 1989). Más tarde se demostró la presencia de
actina en los merozoitos de P. falciparum y P. knowlesi (Field et al., 1993) y se estableció que
en T. gondii y P. falciparum la mayoría de la proteína (>97 %) se encontraba en forma
monomérica (Dobrowolski et al., 1997; Pinder et al., 1998). Por otro lado, al no poder
demostrar la existencia de microfilamentos mediante microscopía electrónica se propuso
que eran inestables o demasiado cortos para ser observados con esta técnica (Shaw y Tilney,
Marco teórico 23
1999; Pinder et al., 2000). Fue sólo hasta la introducción de un inductor de polimerización de
actina denominado Jasplakinolida (JAS), que fue posible aportar evidencia experimental de la
presencia de microfilamentos y por tanto sustentar la existencia de un motor basado en
actina. Así, los merozoitos de P. falciparum fueron estudiados por microscopía electrónica
después del tratamiento con JAS, y se determinó que los filamentos de actina de P. falciparum
tienen una longitud promedio de 100 nm (Schmitz et al., 2005).
Hoy en día se conoce que la actina de los Apicomplexa es codificada por un gen de copia
única, excepto en P. falciparum, el cual posee dos genes expresados diferencialmente, uno en
gametocitos y en los estadios que se desarrollan en el mosquito (Pfact II) y otro, que se
expresa a lo largo del ciclo de vida del parásito (Pfact I) (Wesseling et al., 1989). La actina 1,
es la isoforma más abundante, es expresada constitutivamente, se considera esencial para el
parásito y entre otras funciones está implicada en tráfico de vesículas y endocitosis
(Kumpula y Kursula, 2015). Las secuencias de PfActina 1 y PfActina 2 son muy divergentes
entre sí (Wesseling et al., 1988) y con la secuencia canónica de la actina de eucariotes
(identidad <80 %), que es una familia de proteínas altamente conservada. Esta gran
divergencia a nivel de secuencia se traduce en estructuras diferentes con dinámicas de
polimerización distintas. Esto podría explicar las diversidad funcional entre las dos actinas
de Plasmodium; así, mientras que la Actina 2 produce filamentos largos que serán usados en
funciones particulares en el mosquito como la exflagelación y formación de ookinete, la
Actina 1, está implicada en el proceso del “gliding” y se arregla en filamentos cortos, de vida
corta, que son usados por PfMyoA como caminos para moverse sobre ellos (Vahokoski et al.,
2014). Así, mientras la miosina constituye el componente que genera la fuerza, la Actina 1
constituye la pieza central estructural. En general, los componentes de este motor junto con
las proteínas reguladoras de la actina tienen características únicas comparadas con los otros
eucariotes; así, mientras en eucariotes superiores la dinámica de la actina es regulada por
alrededor de 100 proteínas, en Apicomplexa bastan 10, las cuales se dividen en el grupo de
las que se unen a actina G y en el grupo de las que se unen a actina F (Kumpula y Kursula,
2015).
1.6.1.2 PfMyoA y sus cadenas livianas
Sobre el dominio de cuello de PfMyoA se encuentran 2 motivos IQ degenerados: IQ1 ubicado
entre los aa 786 y 803 e IQ2 ubicado entre los aa 804 y 818 de PfMyoA (Green et al., 2017), a
24 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
los cuales se unen las 2 cadenas livianas: MTIP (Bergman et al., 2003; Green et al., 2006) y
ELC por sus siglas en inglés “Essential Light Chain of myosin” (Green et al., 2017; Bookwalter
et al., 2017)(Figura 1-9).
Figura 1-9. Organización por dominios de PfMyoA y motivos IQ
El óvalo azul representa el dominio de motor y el rectángulo gris el dominio de cuello. Dentro de este
último se muestran las secuencias de los dos motivos IQ identificados en PfMyoA.
MTIP es una proteína pequeña constituida por 204 aa con un peso molecular de 23491 Da, no
contiene dominios transmembrana, ni péptido señal, hace parte de la familia de proteínas EF
hand y no presenta homología de secuencia significativa con las cadenas livianas de otras
miosinas o con la calmodulina (Bergman et al., 2003; Bosch et al., 2006). Su función es anclar
el motor molecular al IMC a través de la interacción con otras proteínas del glideosoma. MTIP
se une mediante su extremo carboxilo al motivo IQ2 presente en PfMyoA y una vez se unen
estas dos proteínas, MTIP adopta una conformación compacta rodeando el C-terminal de la
miosina con sus dos dominios. La lisina ubicada en la posición 813 de MyoA es un residuo
clave de esta unión (Bosch et al., 2007). Lo anterior está acorde con los resultados de
Bergman y colaboradores, quienes usando un sistema de dos híbridos en levadura
demostraron que el motivo de 15 aminoácidos de la región C-terminal de MyoA (hoy
conocida como motivo IQ2) es necesario y suficiente para la interacción con MTIP (Bergman
et al., 2003).
Marco teórico 25
La proteína ELC es la primera cadena liviana esencial que se ha encontrado para PfMyoA, esta
proteína es altamente divergente de las cadenas livianas esenciales que se han descrito en T.
gondii y su unión a la cadena pesada PfMyoA mejora la velocidad del motor. Para que ELC se
una a PfMyoA, MTIP debe estar previamente unida. La unión de las dos cadenas livianas se
traduce en un aumento de la velocidad (hasta dos veces) a la cual PfMyoA se mueve sobre la
actina (3,8 μm/s), en comparación a cuando sólo se une MTIP. Al parecer, este incremento
obedece a que el dominio de unión a la ELC se comporta como el brazo de una palanca, que
permite amplificar el movimiento dependiente de la hidrólisis del ATP que ocurre en el
dominio motor (Green et al., 2017; Bookwalter et al., 2017). Por otro lado, aunque se ha
propuesto que MTIP ancla a PfMyoA al interactuar con otras proteínas sobre la MP o el IMC,
vale la pena mencionar que MTIP sufre una modificación post-traduccional tipo
palmitoilación (Jones et al., 2012), la cual podría regular la localización de la proteína a través
de uniones a membrana (Linder y Deschenes, 2007) con lo cual MTIP podría unirse
directamente al IMC (Jones et al., 2012) y anclar PfMyoA a este complejo de membranas; sin
embargo, falta evidencia experimental para sustentar esta hipótesis
1.6.2 Proteínas asociadas a “glideosoma”: GAP45 y GAP50
1.6.2.1 GAP45
La proteína Asociada al “glideosoma” 45 (GAP45 por sus siglas en inglés) tiene 204 residuos y
un peso molecular teórico de 23631 Da, no posee péptido señal, ni dominios transmembrana,
es altamente conservada entre Apicomplexas y no tiene homología de secuencia con
proteínas conocidas. La proteína GAP45 posee un dominio N-terminal, en el cual se predice la
formación de una estructura coil-coiled y un dominio C-terminal, para el cual se predice una
estructura globular (Gilk et al., 2009). Esta conformación estructural le permite unirse tanto
a la MP como al IMC, manteniendo la cohesión de estas dos membranas y preservando la
integridad de la película durante la invasión (Frénal et al., 2010). GAP45 posee en su dominio
N-terminal sitios de miristoilación y palmitoilación (Rees-Channer et al., 2006), con los
cuales se ancla a la MP, mientras que en su C-terminal recluta el complejo MyoA-MTIP al IMC
(Frénal et al., 2010). Así, MTIP ancla el motor actina-miosina al IMC a través de la interacción
con la proteína GAP45 (Frénal et al., 2010).
26 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
1.6.2.2 GAP50
La Proteína Asociada al “glideosoma” 50 (GAP50 por sus siglas en inglés) posee 396 residuos
y un peso molecular de 44603 Da, es una glicoproteína integral de membrana propia del IMC
que ancla e inmoviliza el proto-”glideosoma” (MyoA/MTIP/GAP45) a la membrana externa
del IMC en una manera dependiente de colesterol (Johnson et al., 2007). GAP50 posee tres
sitios de glicosilación (N-linked) en el extremo amino terminal (lumen del IMC), un dominio
transmembrana y un dominio citoplasmático de 6 residuos en el extremo carboxi terminal.
Esta proteína es insertada cotraduccionalmente en el retículo endoplásmico y trasportada al
IMC presumiblemente por tráfico vesicular (Gilk et al., 2009), donde en parásitos maduros se
asocia con el proto-”glideosoma” para formar el “glideosoma” funcional asociado a la
membrana (Gaskins et al., 2004).
Junto a estas proteínas también se han descrito otras como la familia de proteínas GAPM
(Bullen et al., 2009) y GAP40 (Green et al., 2017) de las cuales no se conoce exactamente su
función pero se encuentran en el “glideosoma”. Las proteínas de la familia GAPM poseen 6
pasos transmembrana, son muy conservadas y específicas en los Apicomplexa y se localizan
en el IMC donde forman complejos oligoméricos resistentes a la solubilización con
detergentes como el SDS. Se cree que están implicadas en anclaje del IMC al citoesqueleto
(Bullen et al., 2009).
En el año 2006, Baum y colaboradores y Jones y colaboradores demostraron que todos los
componentes del “glideosoma” presentes en esporozoítos de Plasmodium spp y taquizoítos de
T. gondii, también se expresan en merozoítos de P. falciparum y que su función estaba
asociada con la invasión de eritrocitos (Baum et al., 2006; Jones et al., 2006). Además,
PfMyoA colocaliza con MTIP, ELC, GAP45 y GAP50, lo cual es consistente con su coexistencia
dentro del “glideosoma” (Jones et al., 2006; Green et al., 2017).
1.6.3 Proteínas transmembranales tipo adhesinas que comunican el motor con receptores sobre la célula a invadir
Estas proteínas son miembros de la familia TRAP (Thrombospondin-Related Anonymous
Proteins). Se han encontrado en esporozoítos (TRAP), merozoítos (MTRAP) y ooquinetes
(CTRP) de P. falciparum y en taquizoítos (MIC2) de T. gondii. Todos los miembros de esta
familia presentan números variables de repeticiones en tandem de dos dominios adhesivos
Marco teórico 27
extracelulares: un dominio A o dominio I de integrinas y una repetición trombospondina tipo
I (Menard, 2001). Las proteínas TRAP exhiben un dominio citoplasmático ácido conteniendo
un triptófano subterminal y se ha visto que mutaciones o deleciones introducidas en este
dominio, incluyendo el reemplazo del residuo de triptófano por alanina, resulta en un
esporozoíto no invasivo con movilidad alterada o ausencia de movilidad (Kappe et al., 1999).
Experimentos han mostrado que el intercambio del dominio citoplasmático de TRAP por el
de MIC2 produce esporozoítos móviles o invasivos, aun cuando estos dominios muestran
poca similitud de secuencia.
1.6.4 Proteínas que median la interacción del motor con las adhesinas
Se ha visto que no hay interacción directa entre la actina F y la cola citoplasmática de las
proteínas de la familia TRAP. Evidencia reciente reveló que estas dos proteínas interactúan a
través de una enzima glicolítica tetramérica, la fructosa 1,6- fosfato aldolasa (Jewett y Sibley,
2003). Ensayos de “pull down” (o coprecipitación por afinidad) en taquizoítos de T. gondii
mostraron que la unión de MIC2 a la aldolasa era totalmente dependiente de la presencia del
residuo de triptófano subterminal propio de las proteínas de la familia TRAP, lo cual sugiere
que este aminoácido es crucial para la movilidad “gliding” (Jewett y Sibley, 2003). La aldolasa
tiene un motivo conservado de unión a actina y puede interactuar con la actina del
citoesqueleto de mamíferos (Kusakabe et al., 1997). En Plasmodium se encontraron los
mismos hallazgos y adicionalmente se evidenció que el residuo de triptófano no es el único
responsable de la unión, sino que también depende de interacciones electrostáticas que
involucran residuos cargados negativamente en el tallo citoplasmático de TRAP y una región
cargada positivamente en la aldolasa (Buscaglia et al., 2003).
1.6.5 Proteínas que conducen al rompimiento de las interacciones con el sustrato
El clivaje proteolítico de las proteínas de los micronemas incluyendo los miembros de la
familia TRAP y AMA-1 es un evento clave durante el proceso de invasión (Soldati et al., 2004;
Dowse y Soldati, 2004). En T. gondii se encontraron dos proteínas con actividad proteasa
denominadas MPP1 y MPP2 (“Microneme Protein Protease”). La actividad MPP1 ocurre
dentro del dominio transmembrana produciendo la liberación del dominio extracelular de
28 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
TgMIC2 en el medio extracelular. Urban y Freeman propusieron que las proteasas romboides
intramembrana pueden ser las responsables de este procesamiento proteolítico (Urban y
Freeman, 2003). En T. gondii se han caracterizado 5 proteasas romboides como posibles
candidatos con actividad MPP1 (Dowse y Soldati, 2004).
1.6.6 Mecanismos que controlan la función del “glideosoma”
El momento exacto, la duración y la orientación de la movilidad “gliding” debe ser altamente
regulada para asegurar el establecimiento de la infección; por lo tanto, el control de la
función del “glideosoma” debe ocurrir en varios niveles. Se han identificado 3 (Daher y
Soldati, 2009):
a) Control del ensamblaje y función del complejo motor, el cual es gobernado por
modificaciones post-traduccionales resultado de una cascada de señalización dependiente
de calcio. Dentro de estas modificaciones se encuentran la miristoilación y la
palmitoilación de GAP45. La primera modificación es irreversible, mientras que la
palmitoilación es reversible, lo cual puede jugar un papel en regular la función del motor
por afectar su anclaje al IMC (Rees-Channer et al., 2006). Otra modificación post-
traduccional es la fosforilación de GAP45 a expensas de quinasas dependientes de calcio
(CDPK1, PKB) o cGMP como parte de una cascada de señalización activada durante la
locomoción del parásito o invasión (Green et al., 2008; Wiersma et al., 2004; Vaid et al.,
2008).
b) Polimerización controlada de la actina. La polimerización controlada de los filamentos de
actina en tiempo y lugar gobierna la dirección y la duración de la movilidad “gliding”
(Wetzel et al., 2003). La actina de Apicomplexa difiere del resto de actinas y dentro de sus
propiedades atípicas se ha observado la formación de filamentos inusualmente cortos
(100 nm) que son altamente dinámicos y fragmentados (Sahoo et al., 2006; Schmitz et al.,
2005). Adicionalmente, la polimerización de la actina de T. gondii ocurre a
concentraciones críticas 3 a 4 veces más baja que las actinas clásicas (Sahoo et al., 2006).
El ensamblaje rápido de los filamentos se produce gracias a la acción de dos forminas,
proteínas que utilizan la habilidad de la profilina para acoplar la hidrólisis del ATP al
ensamblaje rápido del filamento (Romero et al., 2004). Respecto al desensamblaje de los
microfilamentos en Apicomplexa, es un proceso rápido provocado por un factor
Marco teórico 29
depolimerizante de actina (ADF) o cofilina (Van Troys et al., 2008). Lo anterior sugiere
que los Apicomplexa contienen las proteínas claves involucradas en la dinámica de la
actina; sin embargo, el mecanismo de acción y la forma de regulación hasta el momento no
es totalmente conocido.
c) Accesibilidad optimizada de fuentes energéticas para impulsar el “glideosoma”. El ATP es
requerido en altos niveles para abastecer localmente la actividad ATPasa de la miosina y
la activa reconstrucción del citoesqueleto de actina. La hidrólisis del ATP y la liberación de
Pi conducen la dinámica de la actina al controlar la estabilidad del filamento y la
interacción con proteínas de unión a actina reguladoras (Sablin et al., 2002). La energía
requerida para el “gliding” de T. gondii es derivada casi en su totalidad de la glicólisis y de
la producción de ácido láctico. Pomel y colaboradores demostraron que las enzimas
glicolíticas, entre ellas aldolasa, experimentan una marcada relocalización pasando del
citoplasma del parásito al espacio entre la membrana plasmática y el IMC y a la cara
citoplasmática del IMC. Las enzimas glicolíticas permanecen en la película hasta que el
parásito ha completado la invasión de la célula hospedera y posteriormente regresan al
citoplasma. Lo anterior sugiere que el parásito es capaz de relocalizar su principal fuente
de energía en respuesta al proceso de invasión y esta habilidad le permite optimizar la
liberación de ATP en aquellos eventos celulares que son más críticos para su
supervivencia (Pomel et al., 2008).
2 Justificación
Para convertir los combustibles químicos celulares como el ATP en energía mecánica, los
sistemas biológicos cuentan con un arsenal de proteínas motoras, conocidas como motores
moleculares. Dentro de éstos, la miosina que hace parte del grupo de los motores del
citoesqueleto está implicada en un sinnúmero de funciones esenciales para la vida celular.
Toxoplasma y Plasmodium, parásitos del phylum Apicomplexa, son organismos intracelulares
obligados que comparten una estrategia única de locomoción conocida como “gliding”,
movimiento que requiere una maquinaria proteica especializada denominada “glideosoma”
(Sibley, 2004; Keeley y Soldati, 2004), la cual se basa en la actividad de un motor molecular
compuesto por actina-miosina (Pinder et al., 2000; Jones et al., 2006).
En T. gondii se han identificado 11 miosinas (TgMyoA a TgMyoK) (Heintzelman, 2015) y fue
en este organismo en donde por primera vez se asoció a TgMyoA como la miosina
responsable del “gliding” (Meisner et al., 2002). Esta idea se mantuvo por años, hasta que
Andenmatten y colaboradores (2013) lograron obtener parásitos TgMyoA “knock-out”, lo
cual sugirió que TgMyoA podría no ser la única miosina implicada en el “gliding”, o que
podían existir mecanismos alternos de invasión. Poco después Frénal y colaboradores (2014)
reportaron la existencia de un segundo “glideosoma”, en el cual el motor molecular fue
TgMyoC y éste a diferencia del “glideosoma” TgMyoA se localizó en el polo basal del parásito.
Interesantemente, la ausencia de TgMyoA hizo que TgMyoC se relocalizará al sitio de acción
del “glideosoma” TgMyoA, es decir al polo apical y a la periferia del parásito, compensando
parcialmente la función de TgMyoA.
En P. falciparum se han identificado 6 genes que codifican para miosina, pero sólo se ha
caracterizado funcionalmente a PfMyoA (Pinder et al., 1998; Baum et al., 2006; Jones et al.,
2006), de la cual se sabe que hace parte del motor actina-miosina del “glideosoma”. Con
respecto a las demás miosinas nada se conoce acerca de su función; sin embargo, trabajos
recientes sobre PfMyoB han permitido establecer que esta proteína comparte numerosas
32 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
similitudes con PfMyoA, ya sea a nivel de tamaño (ambas miosinas son proteínas pequeñas,
818 y 801 aa y sus pesos moleculares son muy similares, 92,3 y 93,2 kDa), secuencia
(presentan una serie de aminoácido básicos en su C-terminal y poseen los residuos
necesarios para interactuar con otra proteína), estructura (ambas carecen de dominio de cola
y en el dominio del cuello presentan una hélice con estructura “coil-coiled”), clasificación
filogenética dentro de la familia de miosinas (ambas se ubican en la clase XIV), patrón de
transcripción (el gen se transcribe en los 3 estadios del ciclo intraeritrocítico aunque el nivel
del transcrito es mayor en esquizontes), patrón de expresión (ambas se expresan en estadio
de esquizontes y merozoitos) y de la ubicación y secuencia de los motivos IQ (Chaparro-
Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005; Foth et al., 2006; Hernández et al., 2017;
Hernández et al., 2018). Todas estas características hacen pensar que PfMyoB podría jugar
un papel importante durante la invasión al eritrocito, y teniendo en cuenta que este proceso
es vital para el parásito, no sería extraño que Plasmodium tuviera dos miosinas
funcionalmente redundantes (al menos parcialmente).
Con este trabajo se pretende explorar si PfMyoB está involucrada en la invasión de P.
falciparum a glóbulos rojos, de la misma forma que lo hace la miosina A, es decir, a través de
la articulación con el “glideosoma”. El conocimiento generado sobre las miosinas
involucradas en el proceso de invasión, podría sugerir una novedosa estrategia de control de
la enfermedad, orientada hacia el bloqueo del motor molecular involucrado en la invasión, ya
que al inhibir el motor, se impide la invasión y por tanto la propagación del parásito, sin
afectar al hospedero humano dado que las miosinas humanas son muy diferentes a las del
parásito.
3 Objetivos
3.1 Objetivo general
Explorar la participación de PfMyoB en el proceso de invasión al eritrocito y establecer si
interactúa con MTIP en el complejo molecular del “glideosoma”.
3.2 Objetivos específicos
Producir anticuerpos policlonales a partir de proteínas recombinantes de PfMyoA,
PfMyoB y tres proteínas del “glideosoma”: MTIP, GAP45 y GAP50.
Evaluar los anticuerpos producidos en ensayos de inmunoprecipitación para intentar
establecer si PfMyoB interactúa con estas proteínas del “glideosoma”.
Generar parásitos pfmyo-a “knock-out” o pfmyo-b “knock-out” para tratar de elucidar
el papel de PfMyoB durante el proceso de invasión.
Evaluar el comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo para explorar si el
silenciamiento del gen pfmyob afecta la invasión.
Identificar potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas
bioinformáticas.
4 Métodos, resultados y discusión
Para establecer si PfMyoB interactúa con las proteínas del “glideosoma”, se planteó como
estrategia metodológica el uso de técnicas inmunoquímicas, como inmunofluorescencia (IF),
western blot (WB) e inmunoprecipitación (IP). Todas estas metodologías requerían
anticuerpos específicos y por tanto se propuso la producción de proteínas recombinantes de
PfMyoA, MTIP, GAP45, GAP50 y PfMyoB, para generar los respectivos anticuerpos
policlonales en ratones y conejos. Una vez se comprobó que los anticuerpos obtenidos
detectaban específicamente la respectiva proteína en el parásito, se planteó su uso en
ensayos de inmunoprecipitación para revelar las interacciones proteína:proteína en las que
participara PfMyoB y hacer análisis de esas proteínas por espectrometría de masas.
Por otro lado, para explorar la posible participación de PfMyoB en la invasión, se hizo un
acercamiento de genética reversa. La estrategia propuesta fue el silenciamiento (“knock-out”)
del gen pfmyo-a o del gen pfmyo-b de P. falciparum (cepa 3D7) por recombinación homóloga.
La ausencia de proteína permitiría explorar la importancia de cada proteína en el proceso de
invasión al eritrocito. El comportamiento de los parásitos “knock-out” se evaluó en cultivo,
determinando porcentajes de invasión contra un cultivo control. También se determinó si
hubo variaciones en la localización de MTIP.
Finalmente se usaron herramientas bioinformáticas (como modelos ocultos de Markov o
expresiones regulares) para buscar motivos IQ sobre PfMyoB.
A continuación se describe en detalle la metodología que se llevó a cabo durante el desarrollo
de esta tesis.
36 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
4.1 Cultivo de Plasmodium falciparum y preparación de extractos
4.1.1 Cultivo continuo
La cepa 3D7 de P. falciparum fue cultivada de acuerdo con la metodología descrita por Trager
y Jensen (Trager y Jensen, 1976). Los parásitos fueron mantenidos en eritrocitos humanos
grupo O positivo al 5 % de hematocrito en medio RPMI-1640 suplementado con 25 mM de
hepes ácido, 0,19 mM de hipoxantina, 50 mg/L de sulfato de gentamicina, 0,86 mg/L de
glutatión reducido, 21 mM de bicarbonato de sodio y 10 % de suero humano (medio
completo) a 37 °C en una atmósfera baja en oxígeno (90 % N2, 5 % O2, 5 % CO2). Las formas
jóvenes del parásito fueron sincronizadas mediante varios tratamientos con sorbitol al 5 %
(Lambros y Vanderberg, 1979) y la concentración de esquizontes se realizó mediante
centrifugación en gradiente de densidad de percoll (Rivadeneira et al., 1983). El seguimiento
de la densidad parasitaria se realizó mediante recuento de extendidos teñidos con colorante
de Giemsa, expresado en porcentaje.
4.1.2 Obtención de parásitos libres
El primer paso en la preparación de cualquier extracto de P. falciparum consistió en la lisis de
los glóbulos rojos y la liberación de los parásitos. Para esto, el cultivo se centrifugó a 1110 xg
por 5 min, el sobrenadante se descartó y el “pellet” de eritrocitos se trató con 9 volúmenes de
saponina al 0,15 % en PBS durante 10 minutos a 4 °C. El hemolizado fue centrifugado a
23700 xg por 10 min a 4 °C, el sobrenadante se descartó y el “pellet” de parásitos obtenido se
lavó 3 veces con PBS frío, centrifugando a 23700 xg por 5 min a 4 °C. El “pellet” de parásitos
se almacenó a -70 °C y posteriormente se usó para preparar extractos proteicos o para
extraer ADN o ARN del parásito.
4.1.3 Extracción de ADN
La extracción del ADN de P. falciparum se realizó mediante el kit comercial QIAamp® DNA
Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAamp®
DNA Micro Handbook). Brevemente, se tomó 1 mL de cultivo con parasitemia entre 2 – 6 %
(1 – 3 x 107 parásitos), se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Al “pellet” se adicionaron
Métodos, resultados y discusión 37
100 µL de buffer ATL, 10 μL de proteinasa K y 100 μL de buffer AL, se mezcló en vortex por
15 segundos y se incubó a 56 °C por 10 min en agitación. Después de una corta centrifugación
se agregaron 50 μL de etanol absoluto, se mezcló en vortex por 15 segundos y se incubó a
temperatura ambiente por 3 min. La mezcla se centrifugó brevemente y se depositó sobre
una columna QIAamp MinElute unida a un tubo colector, se centrifugó a 6000 xg por 1 min y
se descartó el filtrado. La columna se colocó sobre un nuevo tubo colector y se adicionaron
500 µL de buffer de lavado AW1, se centrifugó a 6.000 xg por 1 min y se descartó el tubo
colector con el filtrado. El paso anterior se repitió, pero esta vez con 500 µL de buffer de
lavado AW2. Nuevamente se reemplazó el tubo colector y se centrifugó a 20000 xg por 3 min
para secar la membrana de la columna. La columna se transfirió a un tubo eppendorf nuevo y
para eluir el ADN se agregaron 70 μL de agua libre de nucleasas, se incubó a temperatura
ambiente por 5 min y se centrifugó a 20000 xg por 1min. El filtrado, el cual contiene el ADN,
se cuantificó en un espectrofotómetro para micro volúmenes BioSpec-nano (Shimadzu,
Kyoto, Japón) a 260 nm. Para estimar la pureza, se calculó la relación absorbancia a 260 nm/
absorbancia a 280 nm. El ADN se almacenó a -20 °C hasta su uso.
4.1.4 Extracción de ARN
Para la extracción del ARN de P. falciparum se utilizó TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
y el kit comercial Direct-zolTM RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA, USA) de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, a un “pellet” de parásitos de 15 µL
(proveniente de 15 mL de cultivo al 3 - 4 % de parasitemia: 2,2 - 3 x 108 parásitos) se le
agregaron 0,7 mL de TRIzol atemperado a 37 °C; esta mezcla se resuspendió por pipeteo
constante hasta lisis completa. Al lisado anterior se le agregó un volumen igual de etanol (95-
100 %) y esta mezcla se transfirió a una columna Zymo-Spin™ IIC montada sobre un tubo de
recolección de desechos y se centrifugó a 16000 xg por 1 min. La columna se transfirió a un
nuevo tubo recolector y se lavó con 400 µL de buffer Direct-zol RNA PreWash centrifugando
como se mencionó previamente. El filtrado se descartó y se repitió el lavado. Luego se
agregaron 700 µL de buffer de lavado RNA Wash y se centrifugó por 2 min para asegurar la
completa remoción del buffer. Finalmente, la columna se transfirió a un microtubo libre de
38 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
RNasas y el ARN se eluyó de la columna con 15 µL de agua tratada con DEPC1 mediante
centrifugación durante 1 min. El ARN se cuantificó inmediatamente y de acuerdo con la
concentración obtenida se hizo tratamiento con DNAsa a 37 °C durante 30 min, la reacción se
paró incubando a 65 °C x 15 min y el ARN se volvió a cuantificar y se almacenó a -70 °C hasta
su uso.
4.1.5 Extracción de proteínas
Pasadas las 42 horas de desarrollo o más, se recolectaron aproximadamente 2 x 109 parásitos
para preparar extractos proteicos ricos en los componentes del “glideosoma”. La extracción
de proteínas se realizó con buffer E2 (Gaskins et al., 2004) o con buffer RIPA3 (Bullen et al.,
2009) y siempre se trabajó sobre hielo. Por cada volumen de “pellet” de parásitos se
agregaron 4 volúmenes de buffer. Los parásitos tratados con buffer E se homogenizaron con
émbolo de teflón 10 veces a velocidad intermedia y los parásitos procesados con buffer RIPA
se sonicaron 2 a 3 veces por 3 a 4 segundos usando una amplitud del 30 %. Tanto el extracto
homogenizado como el sonicado se centrifugaron a 23700 xg por 20 min a 4 °C. En ambos
casos el sobrenadante se guardó a -70 °C en alícuotas y la cuantificación de las proteínas se
hizo mediante el método de Bradford o del ácido bicinconínico.
4.2 Producción de proteínas recombinantes: PfMyoA, PfMyoB, MTIP, GAP45 y GAP50
4.2.1 Métodos
4.2.1.1 Diseño de cebadores y clonación
Con base en las secuencias de los genes pfmtip, pfgap45, pfgap50 y pfmyo-a (PlasmoDB gen
ID: PF3D7_1246400, PF3D7_1222700, PF3D7_0918000 y PF3D7_1342600,
respectivamente), se diseñaron iniciadores específicos (Anexo A) usando el programa primer
1 Agua DEPC: agua ultrapura tipo I tratada con dietilpirocarbonato al 0,1% por 1 hora a 37 °C y autoclavada 15 minutos a 15 psi. 2 Buffer E: Tris-HCl 50mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%, Deoxicolato de sodio 1% e inhibidores de proteasas 1X 3 Buffer RIPA: Tris-HCl 20mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 1%, Deoxicolato de sodio 0,5%, , SDS 0,1% e inhibidores de proteasas 1X
Métodos, resultados y discusión 39
34. Tanto el iniciador sentido como el antisentido fueron diseñados para contener en su
extremo 5' una secuencia de reconocimiento para las enzimas de restricción BamHI y NotI
respectivamente. Cada fragmento fue amplificado a partir de 50 ng de ADN de la cepa 3D7 de
P. falciparum, extraído por lisis con proteinasa K, extracción fenol cloroformo y posterior
diálisis contra buffer TE5 pH 7,4 (Sambrook y Russell, 2001). Para PfMTIP y PfGAP45 se
amplificó la secuencia completa del gen y para PfMyoA y PfGAP50, una secuencia parcial. Las
condiciones de la mezcla de PCR fueron: 200 µM de dNTPs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),
1µM de iniciadores, 1,5 mM de MgSO4 y 0,625 U de Pfu ADN polimerasa (EP0502, Thermo
Scientific, Carlsbad, CA, USA) que tiene actividad correctora exonucleasa 3' → 5'. El programa
de amplificación consistió en un ciclo de denaturación inicial de 94 °C x 5 minutos, 35 ciclos
de 94 °C x 30 segundos, 50 °C x 30 seg y 72 °C x 1 min, seguido por una extensión final de 72
°C x 7 min. Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison,
WI, USA) (Anexo B.), usando las recomendaciones del fabricante, previa adición de una cola
de adeninas al extremo 3’ de los amplicones. Los productos de la ligación (vector
recombinante) se emplearon para transformar bacterias competentes Escherichia coli TOP10
mediante choque térmico. La detección de colonias positivas se realizó con base en el sistema
de selección presente en el vector, mediante selección blanco/azul sobre cajas de agar LB
adicionado con ampicilina, IPTG y X-Gal a concentraciones de 100 µg/mL, 0,5 mM y 80
µg/mL, respectivamente. Las colonias blancas escogidas se repicaron en una caja nueva y se
confirmaron mediante PCR, usando iniciadores del vector y del inserto. Una colonia positiva
se sembró en caldo LB-ampicilina (100 µg/mL) y a partir de este cultivo se hizo extracción de
ADN plasmídico mediante kit comercial (Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification
System-Promega, Madison, WI, USA).
Los fragmentos clonados en pGEM-T easy fueron liberados por digestión con las enzimas
BamHI y NotI. La digestión fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa, desde
donde las bandas correspondientes a los insertos se cortaron y se purificaron (Montage gel
extraction kit, Millipore, Bedford, MA, USA) y el ADN se cuantificó por espectrofotometría.
Los insertos se ligaron al vector de expresión pGEX-4T2 (Amershan Pharmacia Biotech,
4 http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ 5 Buffer TE pH 7,4: Tris-HCl 100mM pH 7.4, EDTA 10 mM pH 8.0
40 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Buckinghamshire, UK), que previamente había sido digerido con las mismas enzimas, en una
proporción 3:1 (inserto:vector) durante 16 horas a 22 °C en presencia de T4 ADN ligasa
(Promega, Madison, WI, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos
de la ligación se usaron para transformar bacterias E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) por choque térmico y las colonias obtenidas se confirmaron por PCR usando iniciadores
del inserto y del vector. Una colonia positiva se creció en caldo LB-ampicilina y a partir de
este cultivo se extrajo ADN plasmídico, el cual se envió a secuenciar para verificar la
presencia del fragmento de interés.
El vector pGEX-4T-2 (Anexo B) contiene una secuencia que codifica para la proteína glutatión
S transferasa seguida por un sitio de corte para trombina y un sitio de clonación múltiple en
el cual se encuentran las secuencias de corte para las enzimas BamHI y NotI. Así, cuando se
produce la proteína de interés, ésta queda unida en su extremo amino a GST (26,3 kDa),
característica que permite la purificación de la proteína recombinante por cromatografía de
afinidad.
4.2.1.2 Expresión de las proteínas recombinantes
Para la expresión de las recombinantes se usaron dos cepas de E. coli genéticamente
modificadas, BL21 CodonPlus (DE3)-RIL (Agilent, Upton, NY, USA) y BL21 pG-KJE8 (Takara,
Kusatsu, Japón). La primera cepa sobreexpresa cuatro tARNs normalmente escasos en cepas
silvestres de E. coli y que frecuentemente limitan la producción de proteínas heterólogas en
esta bacteria. Por su parte, la cepa BL21 pG-KJE8 sobreexpresa cinco chaperonas (dnaK, dnaJ,
grpE, groES y groEL), las cuales promueven el correcto plegamiento de las proteínas evitando
la formación de cuerpos de inclusión.
Previamente en el laboratorio se había producido el plásmido recombinante pET-pfmyo-b, el
cual contiene un inserto de 438 pb del gen pfmyo-b que abarca la región comprendida entre
los nucleótidos 1525 y 1962, la cual se localiza en el dominio motor que se denominó clon
B38. El vector pET-15b contiene una secuencia que codifica para 6 histidinas seguida por un
sitio de corte para trombina y tres sitios de clonación para las enzimas BamHI, XhoI y NdeI
(Anexo B). Las proteínas expresadas en este vector contienen en su N-terminal una cola de 6
histidinas, etiqueta que permite su purificación mediante cromatografía de afinidad con
metales inmovilizados (iones metálicos tales como Ni++).
Métodos, resultados y discusión 41
Las dos cepas bacterianas fueron transformadas con los 5 plásmidos recombinantes (pGEX-
Pfmtip, pGEX-Pfgap45, pGEX-Pfgap50, pGEX- pfmyo-a y pET-pfmyo-b) y para determinar las
condiciones de tiempo y cepa en las cuales se obtenía la mejor expresión de cada proteína, se
tomó una colonia de cada una de las cepas (incluida TOP10) y se creció en 5 mL de medio LB
suplementado con 100 μg/mL de ampicilina y 50 μg/mL de cloranfenicol durante toda la
noche a 37 °C con agitación constante a 200 rpm. Al medio para el plásmido pET
adicionalmente se le agregó glucosa al 1 %. Al día siguiente, cada cultivo se diluyó 1:50 con el
respectivo medio y para el sistema BL21 pG-KJE8, el medio se suplementó adicionalmente
con 1 mg/mL de arabinosa y 10 ng/mL de tetraciclina (agentes inductores de la expresión de
las chaperonas). Los cultivos se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica de 0,6 a 0,8 a
una longitud de onda de 600 nanómetros (OD600), momento en el cual se adicionó IPTG en
concentración 0,1 mM para los plásmidos pGEX y 1 mM para el plásmido pET y se permitió el
crecimiento por 16 horas a 37 °C. Se tomaron alícuotas de 1 mL justo antes de la inducción
(tiempo 0) y a las 2, 4 y 16 horas post inducción para los plásmidos recombinantes pGEX y a
las 3 y 16 horas para el plásmido pET y se determinó la densidad óptica de cada alícuota,
para posteriormente calcular la masa bacteriana y cargar los geles con la misma cantidad.
Estas alícuotas se centrifugaron a 1000 xg por 5 minutos, el sedimento se solubilizó en buffer
carga6 1X y esta mezcla de calentó a 95 °C por 5 min. El extracto obtenido se corrió en
condiciones denaturantes en geles de poliacrilamida al 10 % y las proteínas recombinantes
se detectaron por tinción con azul de coomassie y/o WB usando el anticuerpo policlonal anti-
GST (Abcam, Cambridge, MA, USA) y el anticuerpo monoclonal anti-His (Abcam, Cambridge,
MA, USA).
4.2.1.3 Análisis bioinformático
Para cada proteína recombinante se evaluaron los siguientes parámetros: el contenido A/T
mediante el programa GC Content Calculator
(http://www.biologicscorp.com/tools/GCContent); el peso molecular teórico y el punto
isoeléctrico (pI) con la herramienta ExPASy compute pI/Mw
(http://web.expasy.org/compute_pi/) y la carga y el número de aminoácidos ácidos con
6 Buffer de carga: Tris-HCl 100 mM pH 6.8, SDS al 4%, azul de bromofenol al 0.2%, glicerol al 20%, ditiotreitol (DTT) o ß-mercaptoetanol 200 mM
42 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
PEPSTATS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/). También se evaluó el
uso del codon, teniendo en cuenta que éstos se utilizan de manera desigual en diferentes
organismos, el sesgo de uso del codón entre E. coli y P. falciparum se examinó utilizando la
base de datos de uso de codones en http://www.kazusa.or.jp/codon/. Para evaluar las
preferencias de determinados codones sinónimos, el número y la frecuencia de cada codón
en las secuencias recombinantes se calcularon utilizando Sequence Manipulation Suite (SMS)
(http://www.bioinformatics.org/sms2/reference.html).
4.2.1.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes
Una vez se determinaron las condiciones de tiempo y cepa en las cuales se obtuvo la mayor
cantidad de cada proteína, se hizo producción a 1 litro de cultivo, siguiendo el protocolo
establecido en el paso previo. El cultivo bacteriano se centrifugó a 1000 xg y el sedimento se
resuspendió con 5 volúmenes de buffer R7 y lisozima a una concentración final de 1 mg/mL y
coctel de inhibidores de proteasas 1:200 (Sigma P8465, Saint Louis, MO, USA), se hicieron 5
ciclos de congelamiento (nitrógeno líquido x 45 seg) y descongelamiento (baño de agua a 37
°C x 2 min) y finalmente la suspensión se centrifugó a 15.000 xg por 15 minutos para separar
el sobrenadante de la fracción particulada. La presencia de la proteína de interés se
monitoreó en ambas fracciones mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones denaturantes (SDS-PAGE) y WB.
4.2.1.5 Purificación de proteínas recombinantes
La purificación de las proteínas recombinantes solubles se hizo mediante cromatografía de
afinidad en resina de glutatión-agarosa (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) a partir de 1
litro de cultivo bacteriano. La purificación se realizó por lote (batch) incubando 300 μL de
cama de resina por cada 6 mL de extracto durante 30 min a 4 °C con agitación suave, luego la
mezcla se centrifugó a 1000 xg durante 2 min y se guardó el sobrenadante. La resina se lavó
10 veces con 10 volúmenes de buffer de lavado8 o hasta que la absorbancia a 280 nm de la
7 Buffer R: NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y glicerol al 5% 8 Buffer de lavado-resina: Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 150 mM
Métodos, resultados y discusión 43
solución de lavado fue igual o inferior a 0,010. La proteína recombinante se eluyó con 300 µL
de buffer de elución9 y los eluídos obtenidos se almacenaron a -70 °C.
La purificación de las proteínas recombinantes insolubles se hizo a partir de la fracción
particulada. Para obtener los cuerpos de inclusión (CI) se tomó un gramo de sedimento, el
cual se homogenizó en 4 mL de buffer de lavado10 y se centrifugó a 22.000 xg por 30 min a 4
°C. El precipitado obtenido se volvió a lavar 2 veces más. Los CI obtenidos se resuspendieron
en buffer de lavado sin urea ni tritón y se centrifugó 2 veces como se mencionó antes. Al
sedimento se le adicionaron 0,5 mL de buffer de extracción11, se homogenizó y la suspensión
se centrifugó a 17.000 xg por 1 hora a 4 °C. El sobrenadante se dializó contra 1litro de buffer
de diálisis12 haciendo dos cambios de buffer (Sambrook y Russell, 2001). La solución
dializada se sembró en un gel preparativo de 16 cm x 21 cm x 1,5 cm y se sometió a SDS-
PAGE. Para ubicar exactamente la proteína en el gel, una tira de éste fue teñida con azul de
coomassie y por comparación se cortó la franja correspondiente a la recombinante en el
resto de gel. Este trozo se homogenizó con jeringa y la proteína fue eluída del gel con cuatro
volúmenes de agua ultra pura (conductividad 0,055 µS/cm) a 37 °C durante 4 h (Scheer y
Ryan, 2001).
En ambos casos la pureza de la recombinante obtenida se analizó por SDS-PAGE y WB y la
concentración se determinó por comparación contra un patrón de albúmina sérica bovina de
concentración conocida.
4.2.2 Resultados
La expresión heteróloga de un determinado gen en E. coli depende, entre otros factores, de la
facilidad del plegamiento de la proteína, de la degradación de la proteína por proteasas de la
célula hospedera y de las potenciales diferencias en el uso de codón entre la bacteria y el
organismo del cual proviene el gen foráneo (Jonasson et al., 2002). Por eso, la expresión de
las proteínas de P. falciparum de interés, se evaluó en dos cepas de E. coli diferentes, BL21
CodonPlus (DE3)-RIL y BL21 pG-KJE8 (en adelante se denominarán CodonPlus y pG-KJE8).
9 Buffer de elución: Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 150 mM y glutatión reducido 10 mM 10 Buffer de lavado-cuerpos de inclusión: Tris-HCl 100 mM pH 7,0, EDTA 5 mM, DTT 5mM, Urea 2M, triton X-100 al 2% 11 Buffer de Extracción-cuerpos de inclusión: Tris-HCl 50 mM pH 7,0, EDTA 5 mM, DTT 5mM, Guanidina HCl 8M 12 Buffer de diálisis: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0
44 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
4.2.2.1 Diseño de cebadores y clonación
A partir de las secuencias de los genes pfgap45, pfgap50, pfmtip y pfmyoa, disponibles en
plasmoDB (Tabla 4-1), se diseñaron 4 parejas de iniciadores (Anexo A), a los cuales se les
adicionaron sitios de reconocimiento para las enzimas BamHI y NotI, secuencias presentes en
el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pGEX-4T 2. En el anexo C se muestran
las regiones que fueron expresadas en las 5 proteínas.
Tabla 4-1. Información de los genes de interés
pb: pares de bases; aa: aminoácidos; Amplicón: corresponde al tamaño del producto de PCR.
Mediante PCR se amplificó la secuencia completa del gen pfmtip y pfgap45 y una secuencia
parcial de los genes pfmyo-a y pfgap50 (figura 4-10A) a partir de ADN genómico (ADNg) del
parásito y cada amplicón se ligó con el vector pGEM-T easy. Los constructos obtenidos se
comprobaron mediante PCR con los iniciadores del vector (T7 y SP6) (figura 4-10B) y se
usaron para transformar bacterias E. coli Top10. La detección de colonias positivas, es decir,
bacterias que contienen el plásmido recombinante (pGEM-myoa, pGEM-mtip, pGEM-gap45 y
pGEM-gap50) se hizo mediante PCR usando iniciadores del inserto o del vector (figura 4-11).
Luego, para cada gen se seleccionó una colonia positiva, la cual se inoculó y cultivó en medio
LB para extraer y purificar ADN plasmídico (ADNp), y éste, junto con el vector de expresión
pGEX-4T 2, fueron digeridos con las enzimas de restricción BamHI y NotI. Los insertos
liberados de los plásmidos recombinantes pGEM fueron purificados y ligados en el vector
pGEX linearizado.
PfMyoA PfMyoB MTIP GAP45 GAP50
Cromosoma 13 5 12 12 9
PlasmoDB PF3D7_1342600 PF3D7_0503600 PF3D7_1246400 PF3D7_1222700 PF3D7_0918000
Intrones 2 7 0 0 0
Tamaño con intrones/pb 2841 3493 615 615 1191
Tamaño sin intrones/pb 2457 2406 615 615 1191
Tamaño de la proteína/aa 818 801 204 204 396
Inserto/pb 753 438 615 615 456
Amplicon iniciadores
específicos/pb766 455 629 629 470
Amplicon pGEM T7-SP6/pb 945 808 808 649
Amplicon pGEX S-AS/pb 902 765 765 606
Métodos, resultados y discusión 45
Figura 4-10. Amplificación por PCR de los fragmentos de interés y ligación de los productos en
el vector pGEM-T easy.
Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. A. PCR con iniciadores específicos para cada gen: carril 1: control negativo (sin plantilla); carril 2: Marcador de peso (ladder) de 100 pb; carril 3: iniciadores para pfgap45 (629 pb); carril 4: iniciadores para pfgap50 (470pb); carril 5: iniciadores para pfmtip (629 pb); carril 6: iniciadores para pfmyoa (766 pb). B. PCR de los constructos pGEM-T easy con los iniciadores del vector: (T7 y SP6) carril 1: Marcador de peso (ladder) de 100 pb; carril 2: control negativo: vector vacio; carril 3: PCR sobre constructo pGEM-gap45 (808 pb); carril 4: PCR sobre constructo pGEM-gap50 (649 pb); carril 5: PCR sobre constructo pGEM-mtip (808 pb); carril 6: PCR sobre constructo pGEM-myoa (945 pb).
Figura 4-11. Confirmación de colonias transformadas.
Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV.
Rastreo de colonias por PCR con iniciadores específicos de cada gen sobre un determinado número de
colonias, para confirmar la presencia del plásmido recombinante. En los 4 paneles el carril 1
corresponde al control negativo y el carril 13 y 10 del último gel al control positivo. Carril 2: ladder de
100 pb. Los carriles restantes corresponden a las colonias rastreadas.
A continuación, con los productos de ligación obtenidos se transformaron bacterias TOP10 y
mediante PCR con iniciadores del vector se hizo el rastreo de colonias. En la figura 4-12A se
Rastreo para pGEM/gap45
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13
Rastreo para pGEM/myoa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Rastreo para pGEM/mtip
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13
Rastreo para pGEM/gap50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13
1000
500
46 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
muestran los resultados para pGEX- pfmyo-a y en la figura 4-12B se presentan los resultados
de la PCR para los clones pGEX-gap45, pGEX-gap50 y pGEX-mtip. A partir de estos 4 clones (y
del clon pET-myo-b, previamente obtenido en el laboratorio) se purificó ADNp con el kit
Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega, Madison, WI, USA). El ADN
se envió a secuenciar (Servicio de secuenciación y análisis molecular del Instituto de genética
de la Universidad Nacional) para comprobar la identidad de los fragmentos clonados.
Figura 4-12. Subclonación en vector de expresión pGEX-4T 2. Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. A. Rastreo de 10 colonias pGEX-pfmyo-a, de éstas 3 tuvieron el plásmido recombinante (902 pb) (flecha). Carril 1: ladder 100 pb; carril 2: control positivo; carriles 3-12 PCR de 10 colonias pGEX/pfmyo-a; carril 13: control negativo. B. PCR con iniciadores del vector sobre los siguientes clones: Carril 1: ladder 100 pb; carril 2: pGEX-gap45 (765 pb); carriles 3 y 4: pGEX-gap50 (606 pb), carriles 5 y 6: pGEX-mtip (765 pb) y carriles 7: pGEX-control
El alineamiento de la secuencia esperada (tabla 4-1) que codifica cada proteína contra la
secuencia obtenida (reportada por el Instituto de genética de la Universidad Nacional)
permitió comprobar identidad del 100 % en los todos los casos (Anexo D).
4.2.2.2 Expresión de las proteínas recombinantes
Cada constructo pGEX se usó para transformar las cepas de E. coli, CodonPlus y pG-KJE8. Las
dos cepas provienen de la cepa BL21 y son ampliamente usadas en expresión de proteínas, ya
que no sólo presentan una actividad proteasa disminuida, sino que facilitan la traducción
(CodonPlus) o el plegamiento de las proteínas (pG-KJE8). Para los ensayos de expresión se
Métodos, resultados y discusión 47
tomó una colonia positiva de cada cepa para cada constructo y se creció en medio LB
suplementado con 100 μg/mL de ampicilina y 50 μg/mL de cloranfenicol durante toda la
noche a 37°C con agitación constante a 200 rpm. Al día siguiente, cada cultivo se diluyó 1:50
con medio fresco y para el sistema pG-KJE8, el medio se suplementó con 1 mg/mL de
arabinosa y 10 ng/mL de tetraciclina (agentes inductores de la expresión de las chaperonas).
Los cultivos se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica (OD600) entre 0,6 y 0,8,
momento en el cual se adicionó Isopropil-beta-tio galactopiranósido (IPTG) en concentración
0,1 mM y se permitió el crecimiento por 16 horas a 37°C. Se tomaron alícuotas de 1 mL justo
antes de la inducción (tiempo 0) y a las 2, 4 y 16 ó 3 y 16 horas post inducción. Estas alícuotas
se centrifugaron a 1000 x g por 5 minutos, el sedimento se solubilizó en buffer carga 1X para
SDS-PAGE y las proteínas se denaturaron a 95°C por 5 min. El extracto obtenido se corrió en
geles denaturantes de acrilamida del 10 % y las proteínas recombinantes se detectaron por
tinción con azul de coomassie y/o WB. La aparición de bandas de aproximadamente 60, 55,
43, 52 y 19 kDa en los ensayos de SDS-PAGE, confirmó la producción de las proteínas
recombinantes GST-GAP451-204, GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 e His-
MyoB357-502, respectivamente, en las cepas probadas (Figura 4-13). Sin embargo, se
observaron diferencias significativas en la cantidad de proteína producida dependiendo de la
cepa hospedadora y del tiempo de incubación.
En CodonPlus la expresión de GST-GAP451_204, GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-
502 fue mucho mayor que en pG-KJE8 (Figura 4-13). La recombinante GST-PfGAP451_204 tuvo
el mismo peso molecular de una de las chaperonas moleculares (groEL) expresada en la cepa
pG-KJE8, lo que ocasionó sobrelapamiento de bandas, por ello en el tiempo cero se observa
una banda, la cual corresponde a la chaperona; la expresión de la recombinante se confirmó
mediante WB observándose expresión débil en este sistema. E. coli pG-KJE8 no fue capaz de
expresar GST-MTIP1-204 e His-MyoB357-502, a diferencia de las otras tres proteínas (Figura 4-
13).
48 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Métodos, resultados y discusión 49
Figura 4-13. Expresión de 5 proteínas recombinantes en dos cepas de E. coli BL21.
La producción de cada proteína recombinante se indujo con IPTG 100 µM y se monitoreó a las 2, 4 y 16
horas y para MyoB con IPTG 1 mM a las 3 y 16 horas. Las células fueron recolectadas y resuspendidas
en buffer de carga 1X e incubadas a 95°C por 5 min. Las muestras fueron corridas en gel de acrilamida
al 10 % ó 12 % en condiciones denaturantes y la presencia de la proteína de interés se verificó por
tinción con azul de Coomassie y/o por WB con anti-GST de los carriles 0, 2, 4 y 16 en GAP45 y MyoA.
M: Marcador de peso molecular en kDa (Sigma). En la parte superior se especifica la cepa y el tiempo
de inducción (horas). C: Control-células que solo expresan el tag de GST (27 kDa). La flecha negra (o
roja para His-PfMyoB) indica la proteína de interés: GST-PfGAP451-204 (~60 kDa), GST-PfMTIP1-204
(~55 kDa), GST-PfGAP5026-175 (~43 kDa), GST-PfMyoA227-476 (~52 kDa) y His-PfMyoB357-502 (~19 kDa).
Los pesos moleculares de las recombinantes se calcularon comparando el Rf de la proteína con el de
las proteínas de peso molecular conocido (marcador de peso). La cepa E.coli pG-KJE8 sobre-expresa 5
chaperonas moleculares: dnaK ( 70), groEL ( 60), dnaJ ( 40), grpE ( 22) y groES ( 10). Todas las
proteínas recombinantes fueron expresadas en ambas cepas de E.coli, excepto GST-PfMTIP1-204 e His-
MyoB357-502 que no se produjeron en E. coli BL21 pG-KJE8. En los WB no se observó señal en el tiempo
0 pero si en los tiempos post inducción con IPTG.
En cuanto al tiempo de incubación para el sistema CodonPlus, tenemos que GST-GAP451-204
se expresó desde las 2 horas post inducción; sin embargo, a las 16 horas se observó
disminución de la señal, lo que sugiere degradación proteolítica. GST-MTIP1-204 se expresó
bastante bien desde las 2 horas y fue en aumento hasta las 16 horas. Para GST-GAP5026-175, la
expresión fue considerablemente mayor con respecto a las otras dos recombinantes, la
proteína se produjo en gran cantidad desde las 2 horas y se mantuvo así hasta las 16 horas.
En el caso de His-MyoB357-502, solo se evaluaron 2 puntos de tiempo, 3 y 16 horas post-
inducción; y en ambos puntos la proteína se expresó bien (Figura 4-13). La expresión de GST-
MyoA227-476 no aumentó en la cepa CodonPlus y fue casi indetectable con azul de coomasie;
por el contrario, en la cepa pG-KJE8 la síntesis de la proteína fue evidente entre las 2 y las 4
horas de incubación (Figura 4-13).
La expresión de las recombinantes His-MyoB357-502 y GST-MyoA227-476 también se evaluó a
30°C; para His-MyoB357-502 se observó aumento de la expresión respecto a la obtenida a 37°C,
siendo mayor a las 16 horas. Para GST-MyoA227-476 no hubo diferencias significativas en la
expresión.
4.2.2.3 Análisis bioinformático
El contenido de A/T de las secuencias que codifican las cinco proteínas recombinantes fue de
alrededor del 65% en todos los casos. El peso molecular teórico y el pI de las recombinantes
GST-MyoA227-476, GST-MTIP1-204, GST-GAP451-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-502 fueron
50 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
54,6 kDa/5,67, 49,8 kDa/4,71, 49,9 kDa/4,83, 43,6 kDa/6,33 y 19,4 kDa/5,05,
respectivamente. La herramienta PEPSTATS encontró 70, 77, 90, 51 y 27 aminoácidos ácidos
equivalentes al 15%, 18%, 21%, 13% y 16% del total de aminoácidos en las proteínas
mencionadas. Se calculó la frecuencia de los diez codones más raros en E. coli cepa B para
cada proteína recombinante producida, utilizando la base de datos del uso del codón, Codon
Usage Database (https://www.kazusa.or.jp/codon/); los 10 codones fueron AGG, AGA, CCC,
CGA, CUA, UGU, AUA, CGG, CCU y UGC (Tabla 4-2).
Tabla 4-2. Frecuencia de codones raros en las cinco proteínas recombinantes y dos tags
La frecuencia de diez codones (codones menos usados en E. coli cepa B) fue calculada para cada
proteína recombinante y dos tags. Los 4 primeros codones de la izquierda corresponden a los 4 ARNt
que son suplementados por la cepa CodonPlus. El tag 6His no contiene cualquiera de estas tripletas.
4.2.2.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes
4.2.2.4.1 Efecto de la cepa
Una vez se establecieron las condiciones óptimas para la producción de cada recombinante,
se procedió a evaluar su solubilidad; para ello se prepararon extractos proteicos en
condiciones no denaturantes y se evaluó la presencia de la proteína de interés tanto en el
extracto citosólico como en el sedimento. GST-GAP451-204 y GST-MTIP1-204 se encontraron
tanto en la fracción citosólica como en el sedimento, mientras que GST-GAP5026-175, GST-
Aminoácido / Codon / Frecuencia por mil en E. coli cepa B
Arg Arg Ile Leu Arg Pro Cys Arg Pro Cys
AGG AGA AUA CUA CGA CCC UGU CGG CCU UGC
2,1 2,4 5,0 3,4 2,4 2,4 4,2 5,0 5,8 5,8
Proteína recombinante
Frecuencia por cien en cada proteína recombinante (%)
GST-MTIP1-204 0,23 0,7 2,33 0,47 0,7 0,47 1,63 0 1,86 0,47
GST-GAP451-204 0 1,86 2,09 0,47 0,47 0,93 2,33 0 2,33 0,23
GST-GAP5026-175 - 1,06 2,39 0,80 0,53 0,53 0,80 - 1,86 0,27
GST-MyoA227-476 0,42 1,89 3,15 0,42 0,42 0,42 1,05 - 1,47 0,21
His-MyoB357-502 - 1,17 7,06 1,17 - - 1,17 - 1,17 -
Etiqueta Frecuencia por cien en cada etiqueta (tag) (%)
GST-tag 0 0,88 1,77 0,88 0,88 0,88 1,33 0 2,65 0,44
6His-tag - - - - - - - - - -
Métodos, resultados y discusión 51
MyoA227-476 e His-MyoB357-502 en el sedimento (Figura 4-14); estas tres proteínas sólo fueron
solubles en presencia de agentes caotrópicos fuertes como la guanidina-HCl 8M, lo que indicó
que forman agregados proteicos insolubles o cuerpos de inclusión (CI). No se observó un
efecto en la solubilidad de GST-GAP451-204, GST-GAP5026-175 o GST-MyoA227-476 al utilizar
como cepa hospedadora la cepa que co-expresa chaperonas ya que no se observó incremento
de la producción de la proteína en la fracción soluble con respecto a la fracción particulada.
Figura 4-14. Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes
Los clones GST se crecieron a 37°C y el clon His-MyoB a 30°C, se cosecharon luego de 2 (GST-MyoA227-
476 y GST-GAP451-204) ó 16 horas de inducción (GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357357-502). Se prepararon extractos a partir de 5 mL de cultivo bacteriano y la presencia de la proteína de interés en la fracción soluble (S) y/o en el sedimento (P) se detectó por SDS-PAGE y WB con anti-GST. M: marcador de peso molecular (Sigma). GST-GAP451-204 se encuentra en ambas fracciones, GST-MTIP1-204 se encuentra mayormente en la fracción soluble y GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502 se encuentran en el sedimento.
4.2.2.4.2 Efecto de la temperatura en la solubilidad de las proteínas recombinantes
expresadas en la cepa pG-KJE8
Dado que la actividad y expresión de algunas chaperonas de E. coli son incrementadas a
temperaturas alrededor de 30°C, que las interacciones hidrofóbicas que conllevan a la
agregación son fuertemente dependientes de la temperatura, y que la reducción de la
temperatura al momento de la inducción ha sido utilizada favorablemente para mejorar la
solubilidad de las proteínas recombinantes (Donovan et al., 1996; Jonasson et al., 2002;
Sørensen y Mortensen, 2005), se hizo un ensayo de expresión incubando a 30°C los clones de
la cepa pG-KJE8 productores de GST-MyoA227-476 y GST-GAP5026-175. A pesar de esta
52 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
modificación, no se observó un aumento en la solubilidad de ninguna de las dos proteínas
(Figura 4-15).
Figura 4-15. Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de GST-GAP50 y GST-MyoA
Los plásmidos recombinantes para MyoA y GAP50 mantenidos en la cepa E.coli pG-KJE8 se crecieron a
30°C y se cosecharon a las 2h en el caso de GST-MyoA y a las 16 h para GST-GAP50. Se prepararon
extractos a partir de 5 mL de cultivo bacteriano y la presencia de la proteína de interés se detectó por
SDS-PAGE y WB con anti-GST en la fracción soluble (S) y/o en el sedimento (P). M: marcador de peso
molecular (Sigma). En ambos casos la solubilidad de la proteína no mejoró cuando los cultivos se
crecieron a 30°C, encontrándose siempre en el precipitado. La mayor expresión de las proteínas se
produjo a 37°C.
4.2.2.5 Purificación de proteínas recombinantes
Con base en los resultados previos se escaló el cultivo a 1 L para obtener suficiente materia
prima para iniciar el proceso de purificación. La proteína GST-MTIP1-204 soluble se purificó
por cromatografía de afinidad y aunque en el SDS-PAGE se evidenciaron otras bandas de
menor tamaño, siempre GST-PfMTIP1-204 se encontró en mayor cantidad respecto a las demás
especies. Las bandas de diferentes pesos moleculares corresponden muy probablemente a
proteínas truncadas o degradadas cuyo tag GST en el extremo amino, permitió co-purificarlas
en la cromatografía de afinidad y reconocerlas con el anticuerpo anti-GST. Por otro lado,
aunque GST-GAP451-204 se detectó en el extracto citosólico, no pudo ser purificada por
afinidad con la resina glutatión–agarosa y fue necesario extraerla desde geles de acrilamida.
De GST-MTIP1-204 se obtuvieron 7 mg, mientras que de GST-GAP451-204 se recuperó tan solo 1
mg. GST-MyoA227-476, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-502 se solubilizaron a partir de cuerpos
Métodos, resultados y discusión 53
de inclusión con guanidina-HCl (8M) y se analizaron por SDS-PAGE. GST- MyoA227-476 e His-
MyoB357-502 a diferencia GST-GAP5026-175, presentaron proteínas contaminantes, por lo cual
fue necesario extraerlas desde geles de acrilamida. De GST-GAP5026-175 se recuperaron
alrededor de 3,2 mg, mientras que de GST-MyoA227-476 e His-MyoB357-502 se recuperaron 800 y
1500 µg, respectivamente. Una vez purificadas, todas las proteínas se confirmaron mediante
WB con anti-GST y para el caso de MyoB, con anti-His (Figura 4-16).
Figura 4-16. SDS-PAGE de las 5 recombinantes purificadas y WB con anti-GST y Anti-His
Panel de la izquierda: SDS-PAGE: gel teñido con azul de coomassie mostrando las 5 proteínas
recombinantes purificadas. Las flechas rojas corresponden a las recombinantes GST y la flecha verde
corresponde a His-MyoB357-502. Panel de la derecha: WB de las proteínas recombinantes GST y His
revelado con anti-GST y anti-His respectivamente, usando un sistema de amplificación (anti-IgG-
biotina/streptavidina-fosfatasa alcalina).
En resumen, se produjeron cinco proteínas recombinantes en un sistema de expresión
procariote, las cuales fueron expresadas como proteínas de fusión, cuatro con el tag GST y
una con el tag 6xHis. En el caso de GST-GAP451-204 y de GST-MTIP1-204 las proteínas se
expresaron completas y éstas fueron solubles, mientras que para GST-GAP5026-175, GST-
MyoA227-476 y His-MyoB357-502 se expresó una parte de la proteína y las tres fueron insolubles.
Para PfMyoA y PfMyoB se expresó un segmento correspondiente a la región de la cabeza de
la miosina. Todas las proteínas fueron usadas como inmunógenos para la producción de
anticuerpos, herramienta fundamental para el desarrollo de este trabajo.
54 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
4.2.3 Discusión
Las particularidades de cada proteína juegan un papel importante al momento de
expresarlas; la dificultad en la expresión de proteínas del parásito P. falciparum en sistemas
heterólogos se correlaciona fuerte e independientemente con características físicas de éstas
como el peso molecular, el grado de desorden de la estructura, el punto isoeléctrico (pI) y la
carencia de homología con proteínas de E. coli (Mehlin et al., 2006). Así, a mayor peso
molecular, mayor pI o mayor desorden de la estructura, menor posibilidad de expresar la
proteína. El pI también fue correlacionado con la solubilidad de la proteína, observándose
una mayor tendencia a la insolubilidad cuando éste se vuelve más básico; los pIs por debajo
de 6 tienen mayor probabilidad de generar proteínas solubles (Mehlin et al., 2006). En este
trabajo se expresaron 5 proteínas y al revisar algunos de los parámetros mencionados por
Mehlin, éstas se encontraron en rangos de pI y peso molecular donde se esperaría una
adecuada expresión. GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502 tuvieron los pI más
altos de las 5 recombinantes (6,33, 5,67 y 5,05, respectivamente) y justamente estas tres
proteínas se produjeron como agregados proteicos. GST-GAP451-204 y GST-PfMTIP1-204, las
cuales se encontraron en la fracción citoplasmática tuvieron pI de 4,83 y 4,71,
respectivamente.
Las proteínas GST-PfGAP451-204, GST-PfGAP5026-175 y GST-PfMyoA227-476 fueron expresadas en
las dos cepas de E. coli, mientras que GST-PfMTIP1-204 y His-PfMyoB357-502 solo pudieron ser
expresadas en una cepa. De las dos cepas probadas, CodonPlus mostró la expresión más
eficiente para cuatro de las cinco recombinantes. Esta cepa posee un plásmido que contiene
copias extras de los genes argU, ileY y leuW, los cuales codifican tARNs específicos para los
codones arginina (AGA/AGG), isoleucina (AUA) y leucina (CUA), codones poco frecuentes en
E. coli. Así, la co-expresión de este plásmido provee a la bacteria con un suplemento de tARNs
específicos para codones propios del parásito. Al hacer un análisis de las secuencias clonadas,
se encontró que AGA es el codón más usado para arginina, AUA y AUU para isoleucina y UUA
para leucina. Cuando se compara la frecuencia de uso del codón entre P. falciparum y E. coli,
los codones AGA y AUA son usados 6,6 y 10 veces más por Plasmodium. Esta gran diferencia
en el uso del codón explica por qué en la cepa CodonPlus, la expresión de las proteínas GST-
PfMTIP1-204, GST-PfGAP451-204 y GST-PfGAP5026-175 está aumentada, comparada con la
expresión en la cepa pG-KJE8, que solo cuentan con niveles basales de estos tARNS. Lo
Métodos, resultados y discusión 55
anterior pone de manifiesto la utilidad de la cepa CodonPlus en la expresión de proteínas de
P. falciparum y concuerda con lo reportado en otros estudios (Baca y Hol, 2000; Karmodiya et
al., 2005).
Para GST-PfMyoA227-476, no se observó un aumento significativo de la expresión en la cepa
CodonPlus. Aunque no hay parámetros que predigan con exactitud si la expresión de un gen
heterólogo en E. coli será afectada o no por el uso del codón, se ha propuesto que puede
haber baja o nula expresión si la frecuencia de al menos un tipo de codón escaso en la
bacteria es ≥3% en la proteína a expresar (Carstens, 2003). En el caso de GST-MyoA227-476 y
His-MyoB357-502 se encontró que el codón AUA, alcanzó una frecuencia del 3,15% y 7,06%
respectivamente, cifras que sobrepasan el valor límite. Estas dos proteínas fueron expresadas
débilmente, especialmente GST-MyoA227-476. Por otro lado, Carstens sugirió que la presencia
de codones raros consecutivos es el factor más importante que incide sobre la expresión de
una proteína heteróloga en E.coli (Carstens, 2003). En MyoA227-476 se encontraron tres casos:
dos dupletes (AUAAGA) y un triplete (AUAAUAAGA), en MyoB357-502 se encontró un triplete
(AUAUGUAGA) y un duplete (AGAAUA), en GAP451-204 se encontró un solo caso (duplete
AGAAGA) y en GAP5026-175 y MTIP1-204 ninguno. Goldman y colaboradores reportaron que el
efecto de codones raros consecutivos sobre la expresión es más notable cuando ellos se
localizan cerca al extremo amino de la proteína, especialmente cuando los codones codifican
para arginina (Goldman et al., 1995). Chen e Inouye explican esta situación como resultado
de la inestabilidad que sufre la maquinaria de síntesis proteica al estar cerca del inicio del
mensaje (Chen e Inouye, 1990). Al analizar las 5 secuencias, solo MyoA227-476 presentó esta
condición en los codones 14-15 y 36-37. Todos los argumentos mencionados ponen de
manifiesto la notable influencia de las características de la secuencia de PfMyoA sobre su
expresión en un sistema heterólogo y cómo a pesar del uso de dos cepas genéticamente
distintas no se logró aumentar en forma importante su producción.
Aunque la cepa CodonPlus favorece la expresión de ciertas proteínas de P. falciparum,
también se ha reportado un efecto negativo: la insolubilidad de las recombinantes. Al hacer
más eficiente la traducción, el conjunto de chaperonas disponibles para asistir el plegamiento
se satura, lo que causa la acumulación y agregación de proteínas mal plegadas en el
citoplasma (Rosano y Ceccarelli, 2009). La cepa E. coli BL21 pG-KJE8 sobre-expresa los dos
complejos multi-componente de chaperonas presentes en E.coli: las proteínas gro, EL (60
kDa) y ES (10 kDa) y el complejo KJE conformado por las chaperonas dnaK, dnaJ y grpE
56 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
(Schumann y Ferreira, 2004); de esta manera si hay un plegamiento deficiente por la
saturación del sistema de chaperonas propio de la célula, la presencia de moléculas extra
facilitan el plegamiento adecuado de la proteína, lo cual se ve reflejado en un aumento de su
solubilidad. En nuestro caso, la evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes
producidas en las dos cepas hospedadoras, arrojó resultados similares, independiente de la
cantidad de proteína producida y de la temperatura de incubación. Así, el uso de un sistema
bacteriano que provee chaperonas extras, no evitó la formación de agregados insolubles de
GST-GAP5026-175 ni de GST-MyoA227-476, lo cual indica que factores adicionales a la cantidad de
proteína producida y a la disponibilidad de la maquinaria encargada del plegamiento,
determinan la solubilidad de una recombinante producida en E.coli. De acuerdo con Wall y
Plϋckthun el papel específico de la coproducción de chaperonas sobre la expresión de un gen
en E. coli no es claro y parece ser específico de cada proteína (Wall y Plϋckthun, 1995).
El propósito principal de producir las 5 recombinantes fue obtener proteína suficiente para
inmunizar animales y generar anticuerpos. Para esto se probaron diferentes cepas de E. coli,
no sólo para establecer la cepa y las condiciones en las cuales se obtenía la expresión más
eficiente, sino también buscando la expresión de las recombinantes de forma soluble. Los
resultados indicaron que el uso de las cepas E. coli genéticamente modificadas favoreció la
expresión de la mayoría de las proteínas (4 de 5), pero no su solubilidad. Todo lo anterior
puso de manifiesto que no hay un método universalmente aplicable a la expresión de
proteínas de Plasmodium y que cada proteína tiene características intrínsecas que la hacen
única e impiden generalizar las estrategias de expresión heteróloga.
4.3 Producción y evaluación de anticuerpos policlonales
4.3.1 Métodos
Todos los procedimientos realizados en los animales de experimentación conducentes a la
producción de los anticuerpos, se realizaron en el bioterio del Instituto Nacional de Salud, y
fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de
Laboratorio-CICUAL del INS, de acuerdo con el acta No. 9 de 2010 y por el Comité de Etica de
la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional según acta No. 5 de 2010.
Métodos, resultados y discusión 57
4.3.1.1 Esquemas de inmunización
Para la producción de los anticuerpos se utilizaron los modelos murino y lagomorfo (conejo).
Las proteínas recombinantes GST-MyoA227-476, GST-MTIP1-204, GST-GAP451-204, GST-GAP5026-
175 y His-MyoB357-502 purificadas se usaron como antígeno para la producción de anticuerpos;
así, por cada proteína se inocularon 3 ratones hembra BALB/c de 5 - 6 semanas de edad por
vía intraperitoneal. Un cuarto ratón fue dejado como control sin inoculación. El esquema de
inmunización consistió en tres dosis de antígeno administradas los días 1, 14 y 35, la primera
dosis con 100 µg de proteína en adyuvante completo de Freund´s y dos refuerzos con 50 µg
de antígeno en adyuvante incompleto. El máximo volumen inoculado por ratón fue de 400 µL.
El día 42 se hizo sangría en blanco mediante punción cardíaca y uso de anestesia (Harlow y
Lane, 1988). Una vez la sangre obtenida en la punción se coaguló, se centrifugó por 10 min a
2500 rpm y el suero obtenido se guardó en alícuotas a -70 °C con 10% de glicerol estéril.
La producción de los anticuerpos en conejo se realizó con el siguiente protocolo: las
proteínas recombinantes purificadas GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 y His-MyoB357-502 se
inocularon por vía intradérmica en dos conejos cepa Nueva Zelanda con un peso aproximado
de 1000-1500 gramos. El esquema de inmunización consistió en cuatro inoculaciones por
conejo los días 1, 30, 60 y 90. La primera inyección se hizo con 200 μg de proteína en
adyuvante completo de Freund’s y los tres refuerzos con adyuvante incompleto y 100 μg de
antígeno. Antes de la primera inoculación se tomó una muestra de sangre de los conejos para
obtención del suero pre-inmune. El día 40 se practicó una sangría parcial, con el propósito de
hacer un seguimiento a la producción de anticuerpos. El día 96 se hizo sangría en blanco
mediante punción cardíaca y uso de anestesia (Harlow y Lane, 1988). La especificidad de los
anticuerpos se evaluó mediante WB contra cada proteína recombinante y posteriormente, se
realizó la detección de las respectivas proteínas en extractos del parásito.
4.3.1.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB)
4.3.1.2.1 Detección de proteínas recombinantes
El protocolo de WB que se describe a continuación se usó a lo largo del desarrollo de este
trabajo; sin embargo, cada WB tuvo sus particularidades en cuanto a la dilución del
anticuerpo primario, la concentración del Tween 20 y de la leche descremada en los buffers
de bloqueo y de lavado, y el conjugado usado. El protocolo general consistió en la
58 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
electrotransferencia a membranas de PVDF o nitrocelulosa de las proteínas recombinantes
previamente separadas mediante SDS-PAGE. La detección de cada recombinante se hizo
mediante la adición de su correspondiente anticuerpo primario (el anticuerpo producido),
seguido de la adición del anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (FA) o
peroxidasa de rábano (HRP por sus siglas en ingles “horseradish peroxidase”). Finalmente, se
agregó el sustrato específico para cada enzima.
Cada proteína recombinante purificada (250 ng) fue resuspendida en buffer carga para SDS-
PAGE e incubada a 95 °C durante 5min. Las proteínas se sembraron en geles de
poliacrilamida del 9-12% y se resolvieron por electroforesis vertical, la cual se corrió en
buffer de electroforesis13 a voltaje constante (80 voltios gel concentrador y 120 voltios gel
separador). Las proteínas presentes en el gel se transfirieron a membranas de PVDF
(Immobilon P-Millipore, Darmstadt, Alemania) o Nitrocelulosa (Thermo Scientific, Rockford,
IL, USA) empleando buffer de transferencia14 durante 16 horas a 30mA ó durante 1 hora a
200mA y al cabo de este tiempo, la membrana se bloqueó con una solución de leche
descremada en TBST15 durante toda la noche. La detección de cada proteína se realizó
mediante la adición del anticuerpo específico producido en ratón (para las cinco proteínas) o
en conejo (para GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 y His-MyoB357-502). El exceso de anticuerpo no
unido se retiró mediante 4 lavados de 10 minutos cada uno con TBST solo o con leche
descremada (porcentaje entre el 3% y 5% dependiendo del anticuerpo usado) y luego se
adicionó el anticuerpo secundario (anti-IgG conjugado a FA o a HRP, o anti-IgG
covalentemente unido a biotina). El exceso de anticuerpo se retiró mediante 4 lavados de 10
min con TBST y se procedió a revelar o se continuó con el sistema de amplificación mediante
la adición de estreptavidina conjugada a una enzima. Mediante 4 lavados con TBST se retiró
el material no unido y se reveló con el sustrato apropiado para la enzima: Nitro Blue
Tetrazolium/Bromo Cloro Indolil Fosfato, (NBT/BCIP) (Sigma, Saint Louis, MO, USA) para FA
y 3,3' Diaminobencidina (DAB) (Sigma, Saint Louis, MO, USA) para HRP.
13 Buffer de electroforesis- SDS-PAGE: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM y SDS al 1%. 14 Buffer de transferencia: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM y metanol 10% v/v. 15 Buffer de lavado: TBST: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 al 0,1 ó 0,05% v/v
Métodos, resultados y discusión 59
4.3.1.2.2 Detección de proteínas sobre extractos del parásito
A continuación se evaluó si los anticuerpos producidos eran capaces de detectar las cuatro
proteínas del “glideosoma” y PfMyoB en extractos proteicos del parásito. El extracto del
parásito (25-100 µg) se sometió a SDS-PAGE y posterior transferencia a membrana PVDF o
nitrocelulosa. El bloqueo de sitios inespecíficos se hizo con leche descremada al 5% en
TBST16. Para la detección de las proteínas se probaron tanto los sueros producidos en ratón
como los producidos en conejo y como anticuerpo secundario se usó anti-IgG hecho en ratón
o anti-IgG hecho en conejo (dependiendo del origen del anticuerpo primario), conjugados a
FA o HRP. El exceso de anticuerpo se retiró mediante 4 lavados de 10 min con el mismo
buffer y se procedió a revelar por reacción colorimétrica o quimioluminiscente. En esta
última, HRP cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2),
reacción que genera luz. Para detectar esta reacción, se colocó una película fotográfica sobre
la membrana; así, la exposición a la luz que se desprende en esta reacción permite detectar la
actividad enzimática al impresionar la película.
4.3.1.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF)
Cultivos sincrónicos de P. falciparum en estadio de esquizontes y parasitemia superior al 3%
fueron lavados 2 veces con PBS17 a 1100 x g por 5 minutos. El procedimiento de preparación
de las células y el ensayo de inmunofluorescencia se realizaron a temperatura ambiente. Un
mililitro de eritrocitos parasitados al 5% de parasitemia y hematocrito del 10% fue fijado con
paraformaldehido18 (Polysciences, Warrington, PA, USA) al 4% y glutaraldehído19 (Sigma,
Saint Louis, MO, USA) al 0,0075%, durante 30 minutos en rotación. Las células fijadas fueron
lavadas 2 veces con PBS y entonces permeabilizadas con Triton X-100 a una concentración
final de 0,1%20 durante 10 min en rotación. El detergente se eliminó mediante 2 lavados con
PBS y los eritrocitos se trataron con borohidruro de sodio (NaBH4) preparado fresco en PBS a
una concentración final de 0,1 mg/mL durante 10 min para reducir cualquier grupo aldehído
libre. Las células se lavaron 2 veces con PBS y se procedió al bloqueo de sitios inespecíficos
16 TBST: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 al 0,1 ó 0,05% v/v 17 PBS-buffer fosfato salino: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2P04 2 mM, pH 7,4 18 Paraformaldehido grado microscopia electrónica. Solución al 4% en PBS, pH 7,4 y filtrada por membrana de 0,45 µM 19 Glutaraldehído grado I. Solución stock al 2,5% en PBS 20 Triton X-100 al 0,1% en PBS
60 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
con albúmina de suero bovino, BSA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) al 3% en PBS por 1 hora.
Las células se centrifugaron, se retiró el sobrenadante y se adicionó 1 mL del anticuerpo
primario en dilución 1:100 en solución de bloqueo durante 1 hora en rotación. Las células se
lavaron 3 veces con PBS durante 1 minuto a 8000 rpm para remover el exceso de anticuerpo
y se agregó el correspondiente anticuerpo secundario marcado con Alexa fluor (anti-IgG
ratón/alexa 488 o anti-IgG conejo/alexa 488 ó 594) en dilución 1:1000 en solución de
bloqueo durante 1 hora en rotación. Diez minutos antes de completar la hora se adicionó un
colorante fluorescente de ADN como Dapi o Hoechst a una concentración final de 0,1 µg/mL y
finalmente los eritrocitos fueron lavados nuevamente 3 veces con PBS a 8000 rpm (Tonkin et
al., 2004). Durante el periodo de incubación, láminas portaobjetos y cubreobjetos nuevas
fueron tratadas con una solución de poli-L-lisina al 0,1% en agua, colocando 1 ó 2 gotas que
se extendieron para cubrir la lámina y se dejaron secar a temperatura ambiente. Sobre estas
láminas se colocaron dos gotas de la suspensión de células obtenida, una en cada extremo y
una más concentrada que la otra, se extendieron con una punta de micropipeta y se dejó
secar la preparación. Luego se adicionó 1 gota pequeña de medio de montaje (VECTASHIELD
hardset antifade, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y se colocó encima una laminilla
nueva. Las láminas se visualizaron en microscopio de epifluorescencia Axio-imager A2 (Zeiss,
Thornwood, NY, USA) y la adquisición de imágenes se hizo mediante el software ZEN 2012. A
la par se hizo el mismo ensayo pero utilizando un suero preinmune como anticuerpo
primario. Vale la pena mencionar que los primeros ensayos se hicieron con un anti-IgG
conejo marcado con Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) y un anti-IgG ratón marcado con
Isotiocianato de Tetrametil Rodamina (TRITC) y posteriormente se usaron los colorantes
Alexa.
4.3.1.4 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP)
El extracto usado en la IP fue aclarado previamente con proteína G agarosa durante 30
minutos a 4 °C para eliminar proteínas inespecíficas. Brevemente, a 1 mg de extracto
aclarado se le adicionó un volumen igual de buffer de co-inmunoprecipitación21(Co-IP) e
21 Buffer de co-inmunoprecipitación: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y Tritón X-100 0,1%.
Métodos, resultados y discusión 61
inhibidores de proteasas (Sigma, Saint Louis, MO, USA) y 10 µL de anticuerpo. Esta mezcla se
incubó por 2 horas a 4 °C en rotación para permitir la formación del complejo antígeno-
anticuerpo, luego se adicionaron 50 µL de proteína G agarosa previamente lavada, durante
toda la noche a 4 °C en rotación. Al día siguiente el microtubo se centrifugó y el
inmunoprecipitado se lavó 10 veces con buffer de Co-IP. Finalmente las proteínas atrapadas
en la resina se procesaron para SDS-PAGE y WB con el mismo anticuerpo con el que se hizo la
IP u otro anticuerpo.
4.3.2 Resultados
La producción de los anticuerpos policlonales en ratón y conejo se realizó de acuerdo con la
metodología descrita previamente. La sangría en blanco para ambos animales se hizo
mediante punción cardíaca bajo anestesia. Los anticuerpos producidos constituyeron una
herramienta clave, proyectada para detectar las proteínas del “glideosoma” en el parásito,
explorar posibles interacciones proteína-proteína y monitorear la expresión en parásitos
“knock-out”.
4.3.2.1 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB)
4.3.2.1.1 Detección de las proteínas recombinantes
Una vez se obtuvieron los sueros de los ratones y los conejos, se hizo un inmunoblot para
probarlos contra los antígenos usados. Para esto, 250 ng/carril de cada una de las cinco
recombinantes fueron sometidos a SDS-PAGE y posterior electrotransferencia a membranas
PVDF o nitroceluosa. Como anticuerpo primario se probaron los sueros obtenidos en la
sangría final de los ratones y conejos. En la figura 4-17 se presentan los resultados de la
inmunodetección, donde se puede apreciar que los anticuerpos producidos reconocen
específicamente cada recombinante.
62 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-17. WB sobre las proteínas recombinantes con los anticuerpos producidos
A. Membrana de PVDF. Anticuerpos primarios producidos en ratón: Anti-MTIP 1:20000, anti-
GAP45 1:30000, anti-GAP50 1:15000, anti-MyoA 1:15000, anti-MyoB 1:10000. Anticuerpo
secundario: anti-IgG ratón biotinilado 1:2000. Sustrato NBT/BCIP. GST-MTIP1-204 (55 kDa), GST-
GAP451-204 (60 kDa), GST-GAP5026-175 (43 kDa), GST-MyoA227-476 (52 kDa), 6His-MyoB357-502 (19
kDa). Las flechas señalan las recombinantes. B. Membrana de nitrocelulosa. Anticuerpos primarios producidos en conejo: Anti-MTIP 1:5000,
anti-GAP50 1:2000, anti-MyoB 1:7000. Anticuerpo secundario: anti-IgG conejo biotinilado 1:7500.
HRP-ST 1:10000. GST-MTIP: 55 kDa, GST-GAP50 43 kDa, y 6His-MyoB 19 kDa.
Métodos, resultados y discusión 63
4.3.2.1.2 Detección de las proteínas del parásito
Extractos proteicos del parásito en estadio de esquizonte fueron preparados con buffer E,
sometidos a SDS-PAGE (10-50 µg/carril) y posterior electrotransferencia a membranas de
PVDF o nitrocelulosa. Estas membranas se usaron en ensayos WB con los anticuerpos
producidos en ratón y conejo. Para el revelado se usó un sistema colorimétrico con la enzima
FA o HRP y sus respectivos sustratos. Los anticuerpos generados contra GST-MTIP, GST-
GAP50, GST-GAP45 y GST-MyoA detectaron una banda en ~32 kDa, ~45 kDa, ~50kDa y ~97
kDa, respectivamente. Estos tamaños son similares a los reportados por Jones y
colaboradores (Jones et al., 2006) y corresponden a las proteínas PfMTIP, PfGAP50, PfGAP45
y PfMyoA, respectivamente (Figura 4-18).
Figura 4-18. WB sobre extracto del parásito con los anticuerpos producidos.
Membrana bloqueada con leche descremada al 3% en TBS-Tween al 0,1%. Anticuerpos primarios:
anti-MTIP y anti-MyoA 1:3000 en TBS-Tween al 0,1%+ leche descremada al 3%, anti-GAP50 y anti-
GAP45 1:2000 en TBS-Tween al 0,1%. Anticuerpo secundario: anti-IgG ratón o conejo biotinilado
1:5000 en TBS-Tween al 0,05%. HRP-ST 1:10000 en TBS-Tween al 0,05%. Lavados con TBS-Tween
al 0,1%. Panel de la izquierda, anticuerpos producidos en ratón y panel de la derecha, en conejo.
Para PfMyoB no se obtuvo señal con ninguno de los anticuerpos (ratón y conejo), los cuales
estaban dirigidos contra el segmento comprendido entre los aa 357 a 502 del dominio de
cabeza de PfmyoB. Ante la falta de señal se probó quimioluminiscencia por ser un sistema de
detección más sensible; sin embargo, tampoco se logró detectar a PfMyoB en el extracto del
parásito. En la figura 4-19 se muestran los resultados con el anticuerpo hecho en ratón.
64 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-19. WB sobre extractos del parásito con
αMyoB-ratón usando quimioluminiscencia
Membrana de nitrocelulosa bloqueada con TBS-
Tween al 0,05% por 2 horas. Anticuerpos primarios:
Anti-MyoA 1:5000 (ratón), Anti-MyoB 1:500 (ratón)
y pre-inmune 1:500 (ratón) en TBS-Tween al 0,05%.
Anticuerpo secundario: anti-IgG ratón conjugado con
HRP 1:5000 en TBS-Tween al 0,05%. Sustrato:
luminol. La membrana se expuso contra una película
fotográfica y se reveló con dektol (Kodak). Se
observa una señal intensa para PfMyoA en el carril
izquierdo, pero no se observa señal para PfMyoB en
ninguno de los dos carriles (100 y 50 µg).
4.3.2.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF)
Para establecer si los anticuerpos producidos tenían la capacidad de inmunolocalizar las
proteínas del “glideosoma” en el parásito, se probaron los anticuerpos anti-MTIP y anti-MyoA
y adicionalmente anti-MyoB en ensayos de IF. En la figura 4-20 se muestra la localización de
MTIP y MyoA en esquizontes de P. falciparum, donde se observa que MTIP y MyoA se
localizan en la periferia de los merozoítos.
Estos hallazgos están de acuerdo con lo reportado en la literatura donde se observa la misma
localización, es decir cerca a la membrana plasmática y el complejo interno de membranas
(Jones et al., 2006; Baum et al., 2006). Con el anticuerpo anti-MyoB no se logró detectar señal
en el parásito.
Métodos, resultados y discusión 65
Figura 4-20. IF sobre parásitos en estadio de esquizontes, usando anti-MTIP producido en conejo y anti-MyoA producido en ratón.
4.3.2.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP)
La ausencia de detección de PfMyoB en los ensayos previos nos llevó a pensar que la cantidad
de PfMyoB podía ser muy baja y que por esta razón no se había podido detectar. Ante esta
posibilidad, se intentó concentrar la proteína mediante IP (Trieu y Targoff, 2015) con el anti-
MyoB. Como control de la técnica se hizo al mismo tiempo una IP con anti-MTIP y con suero
preinmune. En la figura 4-21 se aprecia que el control de la técnica funcionó correctamente,
es decir, el anticuerpo anti-MTIP inmunoprecipitó a MTIP. En cuanto a la IP con anti-MyoB,
en el WB se evidenció una banda ubicada por encima de la banda correspondiente a 97 kDa
(aproximadamente 103 kDa), la cual se pensó podría corresponder a PfMyoB.
66 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-21. Inmunoprecipitación con anti-MyoB
En la película de la derecha se muestra la IP con anti-MTIP, usada como control de la técnica. Las
flechas rojas muestran la banda correspondiente a MTIP tanto en la IP como en el extracto del
parásito. En la película de la izquierda se puede observar la IP con anti-MyoB, la flecha blanca señala la
banda que posiblemente es PfMyoB y la flecha roja corresponde a MTIP inmunoprecipitada. S.Pre-I:
Suero pre-inmune, αMTIP: anti-MTIP, αMyoB: anti-MyoB.
Para confirmar la identidad de esta banda, el inmunoprecipitado se resolvió por SDS-PAGE y
el gel se tiñó con el kit SilverSNAP® Stain (for Mass Spectrometry, Pierce, Rockford, IL, USA).
La zona cercana a la banda de 97 kDa del marcador de peso, se cortó del gel y se envió para
análisis por espectrometría de masas (Applied Biomics, Hayward, CA, USA). Ninguna de las
proteínas detectadas correspondió a PfMyoB y de hecho las proteínas con los mayores
niveles de confianza tuvieron pesos moleculares bastante alejados del tamaño esperado
(erythrocyte membrane protein-PM 21882 kDa y conserved Plasmodium protein-PM 221918
kDa).
4.3.2.4 Alternativas para la producción del anticuerpo anti-PfMyoB
Resumiendo los resultados anteriores, se generaron anticuerpos contra las 4 proteínas del
“glideosoma” pero no se logró obtener un anticuerpo contra PfMyoB. Paralelamente en el
Métodos, resultados y discusión 67
laboratorio se intentó producir un anti-PfMyoB en rata usando como inmunógeno tres
proteínas recombinantes de PfMyoB, producidas previamente (Morales et al., 2018;
Hernández et al., 2018). En la figura 4-22, se muestra la ubicación en la secuencia de PfMyoB
de las recombinantes MBP-PfMyoB1-346, MBP-PfMyoB671-801, MBP-PfMyoB740-801 y de la
recombinante His-MyoB357-502. Seis ratas Wistar macho de 5 semanas de edad, fueron
inmunizadas con las proteínas MBP-PfMyoB1-346, MBP-PfMyoB671-801 y MBP-PfMyoB740-801
(dos ratas por recombinante) y una séptima rata, la cual no fue inoculada, se usó como
control de no inmunización. Una vez concluyó el tiempo del esquema de inmunización, las
ratas fueron sangradas en blanco y con los sueros obtenidos se hizo WB contra extractos
proteicos del parásito. No se logró detectar PfMyoB con ninguno de los 6 sueros obtenidos.
MVNKINELNNYFRINSTFINKSENESENFYVWTYKSPNVDLYPDLVFFKCQVLNINGDNYEVKEIS
PETNSVYTVKKEHLFNCNNMVNINSHRLNDMVHQNSAEVLNTLALRYEKNYIYTIAEPMLISVNPY
QVIDTDMNEYKNKSTDLLPPHVYTYAKDAMLDFINTKNSQSIIISGESGSGKTEASKLVIKFYLSG
VREDNDISKTLWDSNFILEAFGNAKTVKNNNSSRYGKYIKIQLDENQNIVSSSIEIFLLEKIRVVS
QEPDERCYHIFYEILKGMNDEMKKKYKIKSEEDYKYISNKSINIPEIDDAKDFENLMISFDKMKMS
DLKDDLFLTLSGLLLLGNIQFNGIEKGGKSNCSELDDENLEVVNEASELLGIDYESLKNSLVITEK
SIANQKIEIPLSIEESLSICRSISKDIYNKIFEYITKRINNFLNNNKELENFIGILDIFGFEIFVK
NSLEQLLINIANEEIHNIYLFVVYEKESNLYKKEGIIIESVKYTNNESIIDLLRGKTSIISILEDN
CLAPGKKDESIVSVYTNKFSKNEHYSVCKKNITESFVIKHTVSDVTYSISNFISKNKDILSPNILK
LLKVSNNKLIQNLYDDAEVTDSLGRKNLITYKYLENLKKICSYLKSTNIYFIKCIKPNETKEKNNF
NPKKVYPQLFSLSIVETLNIKYFFQYKYTFASFLSYYQYLDIAVSNDSSLDEKTKVTMLLERNFDK
DSYKVGHTMVFLKKEAVHKIRDIINSNLKCYRNLCCITSALIMKIKKKRIVEENIKNLQLAQAYFR
KYKYIKEHE
Figura 4-22. Secuencia de las proteínas recombinantes de PfMyoB
Los diferentes formatos corresponden a las 3 proteínas recombinantes con las cuales se intentó
producir un anticuerpo contra PfMyoB: MBP-PfMyoB1-346 (negrita), la secuencia de esta proteína
corresponde al N-terminal del dominio motor de PfMyoB; MBP-PfMyoB671-801 (negrita y cursiva), su
secuencia corresponde al C-terminal del dominio motor de PfMyoB y MBP-PfMyoB740-801, (negrita,
cursiva y subrayado), la cual corresponde al domino de cola (en esta región se encuentra un motivo
IQ, motivo que hace parte del dominio del cuello de las miosinas). La secuencia sombreada correspode
a la recombinante His-MyoB357-502 expresada en este trabajo.
Como último recurso para obtener un anticuerpo anti-PfMyoB, se buscó una opción
comercial para la compra del anticuerpo en la empresa de biotecnología GenScript
(Piscataway, NJ, USA), previo análisis de las regiones inmunogénicas de PfMyoB. Se eligieron
dos péptidos de acuerdo con los valores de antigenicidad, baja hidrofobicidad, facilidad de
síntesis, solubilidad y especificidad para el genoma de P. falciparum. Las secuencias de estos
68 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
péptidos se ubicaron entre los residuos 56 a 69 (NGDNYEVKEISPET) y 720 a 733
(LERNFDKDSYKVGH) de PfMyoB y se denominaron P1 y P2, respectivamente (Figura 4-23).
Figura 4-23. Localización de los péptidos P1 y P2.
Se muestra la ubicación de los péptidos P1 y P2 sobre PfMyoB, con los cuales se produjeron los
anticuerpos anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2, respectivamente.
Los anticuerpos anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2 fueron producidos (en conejo) y purificados
(por afinidad) (Brown et al., 2015) por GenScript y con éstos se intentó la detección de
PfMyoB sobre extractos del parásito mediante WB e IF. Para todos los ensayos se utilizaron
parásitos en estadio avanzado de desarrollo (>44 horas), teniendo en cuenta que la proteína
no se expresa, ni se detecta en anillos o trofozoitos (Chaparro et al., 2005).
4.3.2.4.1 Ensayos Western Blot (WB) con anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2.
En un trabajo simultáneo en el laboratorio, se demostró la ineficacia del anticuerpo anti-
MyoB-P1 para detectar a PfMyoB en ensayos de WB e IF sobre extractos de parásitos. Para
evaluar el anticuerpo anti-MyoB-P2, se prepararon extractos proteicos con buffer E, T o RIPA
a partir de cultivos del parásito en estadio de esquizonte, los cuales se resolvieron en SDS-
PAGE (50-100 µg/carril) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante
transferencia húmeda por 16 horas a 20 V. La membrana fue incubada con una solución de
leche descremada al 3% en TBS-twen 0,05% durante 16 horas a 4 °C horas en agitación para
bloquear sitios de unión inespecíficos. El anticuerpo anti-MyoB-P2 se usó en dilución 1:1000
en TBS-tween 0,05% + leche descremada al 3% durante toda la noche en agitación a 4 °C.
Posteriormente se hicieron 3 lavados de 10 min cada uno con TBS-tween 0,05% y se adicionó
el anticuerpo secundario anti-IgG/HRP hecho en conejo en dilución 1:5000 TBS-tween 0,05%
+ leche descremada al 3% durante 1 hora en agitación a temperatura ambiente. Luego la
Métodos, resultados y discusión 69
membrana se lavó 3 veces x 10 min como se indicó previamente y se le adicionó el respectivo
sustrato. En el caso de la detección con sustrato cromogénico, se utilizó DAB (DAB Enhanced
Liquid Sustrate System, Sigma, Saint Luis, MO, USA), la cual al reaccionar con HRP y H2O2,
produce un precipitado café. Para la detección quimioluminiscente se usó luminol (kit
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo ScientificTM, Rockford, IL, USA),
que en presencia de HRP y H2O2 se oxida y forma 3–aminoftalato, compuesto que emite luz.
Después de reaccionar con el sustrato, la membrana se guardó dentro de un protector
plástico en un cassette para autorradiografía. En el cuarto oscuro se expuso contra una
película (CL-XPosure film, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) durante 5 minutos y al cabo
de este tiempo se reveló el film. En algunos casos la membrana se reveló posteriormente con
DAB. En la figura 4-24 se muestra el resultado del WB con el anticuerpo anti-MyoB-P2, donde
por primera vez, se obtuvo una señal por debajo de la banda de 100 kDa, acorde con el
tamaño esperado para PfMyoB (93 kDa).
Figura 4-24. Western blot con anti-MyoB-P2
sobre extractos del parásito (esquizontes)
Se muestran las membranas correspondientes a
dos WB distintos. En la membrana de la
izquierda, el anticuerpo anti-MyoB-P2 reconoció
a PfMyoB en extractos del parásito (flecha roja).
En la membrana de la derecha, se hicieron dos
WB, uno con anti-MyoA y otro con anti-MyoB.
Nótese la diferencia sutil que hay en el tamaño
de estas dos proteínas, PfMyoA (flecha azul) está
ligeramente por encima de PfMyoB (flecha roja).
4.3.2.4.2 Ensayos de IF con anti-MyoB-P2
Para establecer la localización celular de PfMyoB en el parásito, se hizo IF con anti-MyoB-P2
utilizando la metodología previamente mencionada. En la parte derecha de la figura 4-25 se
observa un esquizonte con al menos 12 merozoitos, lo cual se evidencia por el número de
núcleos (cuadro DAPI). La señal fluorescente para PfMyoB se concentra en un punto
específico de cada merozoito, al parecer en uno de sus polos. La imagen de campo claro
muestra al esquizonte dentro del eritrocito, el cual presenta una zona oscura que
70 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
corresponde al pigmento malárico. En el panel izquierdo se presenta un trofozoito en el cual
no hay señal para PfMyoB. Estos hallazgos están de acuerdo con lo reportado por Chaparro y
colaboradores, quienes encontraron que PfMyoB sólo se expresa en esquizontes maduros y
merozoitos libres (Chaparro et al., 2003). Por otro lado, Yusuf y colaboradores encontraron el
mismo patrón puntual (Yusuf et al., 2015).
Figura 4-25. Inmunofluorescencia sobre trofozoitos y esquizontes usando anti-MyoB-P2
Ensayo de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo anti-MyoB-P2 y DAPI. Anticuerpo
secundario anti-conejo acoplado a Alexa 546. Bar: 20 μm.
4.3.2.4.3 Ensayos de IP con anti-MyoB-P2
Teniendo en cuenta los resultados previos, es decir que finalmente se obtuvo un anticuerpo
que podía reconocer a PfMyoB en extractos del parásito, se procedió a evaluar si este
anticuerpo podría funcionar en ensayos de IP, para así poder explorar interacciones entre
PfMyoB y otras proteínas. Para la IP, a 1000 μg del extracto proteico se le adicionaron 10 μL
de anti-MyoB-P2. Luego de realizar el procedimiento ya descrito en métodos, el
inmunoprecipitado fue resuelto mediante SDS-PAGE y posteriormente se hizo transferencia a
Métodos, resultados y discusión 71
membranas de nitrocelulosa. El WB se hizo con anti-MyoB-P2 como se mencionó en el ítem
anterior y como ensayo control se hizo IP con anti-MTIP o anti-MyoA y WB con los mismos
anticuerpos.
En la figura 4-26 se presentan los resultados donde claramente se observa señal para PfMyoB
en el carril donde se cargó extracto del parásito, pero ausencia de señal en los carriles de la
IP. En cuanto a la IP control se observa señal para PfMyoA en la IP con anti-MyoA. Estos
resultados sugieren que el anticuerpo anti-MyoB-P2 no es capaz de inmunoprecipitar a
PfMyoB y por tanto, no es posible identificar proteínas de unión a esta miosina.
Figura 4-26. IP con anti-MyoB-P2
Tanto la membrana como la película corresponden al mismo ensayo. La membrana fue revelada con
sustrato quimioluminiscente y con DAB. La flecha roja indica la banda correspondiente a PfMyoB y
la flecha azul a MyoA. Las bandas intensas a la altura de 55 kDa corresponden a la cadena pesada de
las inmunoglobulinas.
Ante la falta de un anticuerpo capaz de inmunoprecipitar a PfMyoB, se buscó otra alternativa
para tratar de establecer si PfMyoB interactúa con MTIP y para ello se realizó una IP con anti-
MTIP y se reveló con anti-MyoB-P2 y con anti-MyoA como control. En la figura 4-27 se
presentan los resultados de esta IP, donde PfMyoA aparece en el carril revelado con anti-
72 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
MyoA, pero no hay señal alguna en el carril revelado con anti-MyoB. Estos resultados revelan
la interacción ya reportada entre MTIP y PfMyoA y nos permiten deducir que PfMyoB no
interactúa con MTIP bajo las condiciones experimentales usadas.
Figura 4-27. IP con anti-MTIP
Tanto la membrana como la película corresponden al mismo ensayo. La membrana fue revelada con
sustrato quimioluminiscente y con DAB. La flecha roja en el carril 3 indica la banda correspondiente a
PfMyoB y la flecha azul en los carriles 1 y 2 a MyoA.
En resumen, se generaron seis anticuerpos policlonales contra PfMyoB usando como
inmunógenos cuatro proteínas recombinantes y dos péptidos sintéticos. Sólo uno de los
anticuerpos logró detectar a PfMyoB en ensayos de WB sobre extractos proteicos del
parásito, pero infortunadamente no fue útil para inmunoprecipitarla. Por esta razón, no fue
posible explorar interacciones entre PfMyoB y otras proteínas. Sin embargo, haciendo uso de
un anticuerpo anti-MTIP se logró establecer que PfMyoB no interactúa con MTIP. Todos los
demás anticuerpos, producidos contra las otras proteínas del glideosoma, reconocieron
específicamente a sus respectivas proteinas blanco.
Métodos, resultados y discusión 73
4.3.3 Discusión
Se produjeron anticuerpos policlonales en diferentes modelos animales (ratón y conejo) a
partir de cuatro proteínas recombinantes. Los cuatro anticuerpos (anti-MyoA, anti-MTIP,
anti-GAP45 y anti-GAP50) reconocieron las recombinantes contra las que fueron producidos
y a las proteínas específicas en extractos del parásito. Simultáneamente, se trabajó en la
generación de un anticuerpo anti-MyoB en ratón, rata o conejo; sin embargo, los anticuerpos
obtenidos solo reconocieron la recombinante usada como antígeno y no lograron detectar la
proteína en extractos del parásito. Posteriormente, se usaron dos péptidos sintéticos para
inmunizar conejos Nueva Zelanda y solo a partir de uno de ellos se logró obtener un
anticuerpo anti-MyoB que tuvo la capacidad de detectar la proteína en extractos del parásito
(mediante WB) y en células fijadas (mediante IF). El anticuerpo, llamado anti-MyoB-P2,
detectó específicamente a PfMyoB y no produjo reacción cruzada con PfMyoA. La señal para
PfMyoB se detectó cerca al marcador de 100 kDa, ligeramente por debajo de la señal
observada para PfMyoA. Por otro lado, el patrón de fluorescencia con anti-MyoA y anti-
MyoB-P2 fue completamente distinto. En el año 2003 (Chaparro-Olaya et al., 2003) y luego en
el año 2015 (Yusuf et al., 2015), dos trabajos describieron para PfMyoB un patrón de
fluorescencia puntual localizado en la región apical de los merozoitos dentro de esquizontes
maduros con más de 10 núcleos. En el presente trabajo también se encontró un patrón
puntual, que se observó en esquizontes maduros. Los patrones de fluorescencia hallados
para PfMyoA y PfMyoB son muy distintos, mientras que PfMyoA se distribuye en la periferia
del merozoito, excepto en el polo apical, PfMyoB tiene una localización apical. Esta diferencia
lleva a pensar que PfMyoB no reemplaza a PfMyoA en el “glideosoma”-MyoA, sino que
PfMyoB puede ser el motor de otro “glideosoma” distinto, como ya se ha reportado en
Toxoplasma gondii (Graindorge et al., 2016).
A pesar de los promisorios resultados en los ensayos WB e IF con el anticuerpo anti-MyoB-
P2, éste no logró inmunoprecipitar PfMyoB en extractos del parásito y por lo tanto no se
pudo establecer con qué proteínas interactúa esta miosina. La IP es un inmunoensayo
comúnmente utilizado para estudiar proteínas en solución; sin embargo, hay dos factores
relevantes que determinan su éxito, uno es la abundancia del antígeno en la preparación
original y otro la afinidad del anticuerpo por el antígeno (Harlow y Lane, 1988). Con relación
al primer factor, PfMyoB parece estar en menor cantidad respecto a PfMyoA, ya que para
lograr su detección en ensayos de WB, siempre fue necesario usar una mayor cantidad de
74 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
extracto por carril. Obviamente hay que tener en mente que la afinidad de los anticuerpos
puede variar pero la señal para PfMyoB siempre fue más tenue con respecto a la señal para
PfMyoA. Adicionalmente, los estudios del transcriptoma de los estadíos intraeritrocíticos de
P. falciparum han revelado que la cantidad de transcrito para PfMyoB en esquizontes, es 6
veces más baja que la de PfMyoA o MTIP, lo cual puede indicar que la cantidad de proteína
también puede ser mucho menor (Otto et al., 2010; plasmodb.org). Esta observación sobre la
menor cantidad de PfMyoB en el parásito ha sido discutida tambien en trabajos anteriores
(Yusuf et al., 2015; Hernández et al., 2018). Con relación a la afinidad del anticuerpo, los
ensayos de IP requieren anticuerpos con una afinidad más alta (109 mol-1), mientras que el
WB y la IF funcionan con anticuerpos de menor afinidad (108 mol-1); es posible que la
afinidad del anticuerpo anti-MyoB-P2 esté por debajo del valor requerido y esto explicaría
por qué este anticuerpo no funcionó en ensayos de IP. Adicionalmente, una menor afinidad
del anticuerpo repercute sobre la avidez haciendo que el complejo no sea lo suficientemente
estable para ser inmunoprecipitado.
Finalmente, para investigar si PfMyoB interactúa con MTIP y aprovechando que el anticuerpo
anti-MTIP sí inmunoprecipitaba a su respectivo antígeno, se hizo un ensayo de co-
inmunoprecipitación, en el cual se evidenció que MTIP no interactúa con PfMyoB en
parásitos donde el “glideosoma”-MyoA está intacto. Estos resultados apoyan la idea que
PfMyoB en condiciones normales del parásito no hace parte del “glideosoma”-MyoA, lo cual
permite sugerir que PfMyoB no participa en el proceso de invasión.
4.4 Generación de parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-a o el gen pfmyo-b
4.4.1 Métodos
Para silenciar los genes pfmyo-a y pfmyo-b se usaron técnicas de genética reversa que
permitieron anular la expresión de los genes de interés y establecer si son esenciales para la
invasión y supervivencia del parásito. La estrategia usada fue la generación de parásitos
pfmyo-a o pfmyo-b “knock-out” por recombinación homóloga.
Métodos, resultados y discusión 75
4.4.1.1 Diseño de constructos y PCR diagnóstico
Los estadios asexuales de Plasmodium tienen un genoma haploide, característica que permite
la generación de parásitos “knock-out” vía recombinación homóloga. En este trabajo se
diseñaron constructos para ser integrados en el genoma del parásito mediante
recombinación sitio específica; es decir, el gen de interés (pfmyo-a o pfmyo-b) fue
intercambiado por una secuencia modificada del mismo gen. Se generaron dos tipos de
constructos: el “knock-out” y el control del “knock-out”, ambos en el plásmido pHH1 (Crabb y
Cowman, 1996), el cual es ampliamente utilizado para transfección de P. falciparum. El vector
pHH1 (Anexo B) contiene el gen humano de la dihidrofolato reductasa (hdhfr), marcador de
selección positiva que le confiere resistencia al medicamento antifolato WR99210; este gen
está bajo el control del promotor de la calmodulina (CaM) y de la región 3' del gen de la
proteína rica en histidina 2 del parásito (hrp2). Finalmente, la región 3'PbDT corresponde a
la región 3’UTR del gen de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa de Plasmodium
berghei (Anexo B). Con este vector se espera que la integración del constructo en el
cromosoma del parásito ocurra mediante un evento de recombinación homóloga sencilla.
4.4.1.1.1 Diseño de constructos “knock-out”
Los constructos pHH1-PfMyoA_Knock out y pHH1-PfMyoB_Knock out, denominados pHH1-
AKO y pHH1-BKO, fueron diseñados de tal forma que una vez se lleva a cabo la
recombinación homóloga sencilla con el gen endógeno, se producen dos copias no
funcionales del gen. Para lograr lo anterior, los constructos se diseñaron de modo que
carecían de un codón de inicio (ATG) en su extremo 5’ y contenían un codón de parada
prematuro en el extremo 3’. Así, la primera copia del gen retiene el promotor endógeno y el
codón de inicio, pero su extremo 3’ está alterado por la introducción de un codón de parada
prematuro, mientras que la segunda copia del gen no tiene promotor ni codón de inicio.
Constructo pHH1-AKO
El gen que codifica a PfMyoA se localiza en el cromosoma 13, tiene 2 intrones y un tamaño de
2841 pb. Para construir a pHH1-AKO, el fragmento de PCR de pfmyo-a (714 pb), el cual
portaba en sus extremos las secuencias de reconocimiento de las enzimas BglII y XhoI, se ligó
al plásmido pHH1 previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. Este
fragmento se encontraba 1911 pb corriente abajo del primer codón (ATG) en la secuencia de
PfmyoA. En la figura 4-28 se esquematiza el diseño del constructo pHH1-AKO y en la figura 4-
76 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
29 se presenta la secuencia del constructo, su ubicación en la secuencia del gen y otros
detalles considerados cuando se diseña un constructo de esta naturaleza.
Figura 4-28. Constructo pHH1-PfMyoA_knock-out
A. Gen endógeno pfmyo-a. B. Constructo pHH1-AKO: el vector pHH1 contiene un fragmento de 714 pb
del gen pfmyo-a, el cual se ubica 1911 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno y
un codón de parada introducido artificialmente en el extremo 3’. ΔATG denota ausencia de codón de
inicio ATG, STOP prematuro denota la introducción artificial de un codón de parada, 216 pb antes del
codón de parada propio del gen endógeno. C. Constructo integrado en el gen pfmyo-a, producto de un
evento de recombinación homóloga sencilla entre la secuencia del gen pfmyo-a presente en el
plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias no funcionales del gen, una copia corresponde a un
fragmento de 2625 pb que contiene un codón de parada prematuro y la segunda copia de 930 pb sin
promotor y con el codón de parada original.
ATGGCTGTTACAAATGAAGAAATAAAAACGGCAAGTAAGATTGTTAGAAGAGTTTCAAATGTAGAAGCATTTGACAAAAGT
GGTTCAGTTTTTAAGgtaatagaattgtatatctttatatacatacatatatttttttttttgtatatgtagttttatttt
tcgcatctcctatatataattgtttacatattttcccaatgtgtattaaaaaaaaaatttttttctttttttttttttctc
atttttttagGGTTATCAAATATGGACTGATATATCTCCGACAATAGAAAATGATCCAAATATTATGTTTGTAAAATGTGT
TGTACAACAAGGATCAAAAAAAGAAAAATTAACCGTTGTACAAATTGATCCACCCGGAACAGGAACTgtaaatgataaacg
aataaaaaaaaaaaaaaaaaatatatatatatatatatataatagaataattatatatacatattgaaaaaaaaaaatata
catgtttatggaattaaacatattcaaatatttatatacttgatgtcttttgagagattatattacatatacatgtatatt
attttttattatattatattatattataattttaatttattttatttacagCCATACGATATTGATCCAACTCACGCATGG
AACTGCAACTCTCAAGTAGACCCCATGTCTTTTGGTGATATTGGTCTTTTAAATCACACCAACATCCCATGTGTTCTTGAC
TTTTTAAAGCACAGATATTTAAAAAATCAAATATACACCACTGCTGTTCCCCTTATTGTTGCAATAAACCCATACAAGGAT
TTAGGAAACACAACTAATGAATGGATTCGTAGATATCGTGATACAGCTGATCATACTAAGTTGCCACCACACGTGTTCACA
TGTGCTAGGGAAGCTTTGTCTAATCTCCATGGTGTAAACAAGAGCCAAACTATTATTGTATCTGGTGAATCTGGTGCAGGA
AAAACCGAAGCAACAAAACAAATCATGAGATATTTTGCTTCTTCTAAGAGTGGAAATATGGATTTACGTATTCAGACAGCA
ATAATGGCTGCAAATCCAGTTCTTGAAGCTTTTGGTAATGCGAAAACTATAAGAAATAACAATTCATCTCGTTTTGGTCGT
TTCATGCAGTTGGTTATATCCCATGAAGGAGGTATAAGATACGGTTCCGTTGTTGCTTTTCTGTTGGAAAAATCTAGAATT
ATTACACAAGATGATAATGAAAGGTCATATCATATATTTTATCAATTTCTTAAGGGTGCAAATAGTACGATGAAATCTAAA
Métodos, resultados y discusión 77
TTTGGTTTAAAAGGAGTTACTGAATACAAATTATTGAACCCAAATTCAACAGAGGTAAGTGGAGTAGATGATGTAAAAGAT
TTTGAAGAGGTAATTGAATCGTTGAAAAATATGGAATTAAGTGAATCAGATATTGAAGTAATATTTTCAATAGTAGCTGGT
ATATTAACATTAGGAAATGTAAGATTAATTGAGAAGCAAGAAGCTGGATTAAGTGATGCTGCTGCTATTATGGATGAGGAT
ATGGGTGTGTTTAATAAAGCTTGTGAATTGATGTATTTAGACCCTGAATTAATAAAAAGGGAAATATTAATTAAGGTAACT
GTTGCTGGAGGAACAAAAATTGAAGGTAGATGGAATAAAAATGATGCAGAAGTGTTGAAATCTTCCTTATGTAAAGCTATG
TATGAGAAATTGTTTTTATGGATAATAAGACATTTGAATTCAAGAATTGAACCAGAAGGAGGATTTAAAACATTTATGGGT
ATGTTAGATATTTTTGGTTTTGAAGTATTTAAAAATAATTCATTGGAACAATTATTTATTAACATTACTAACGAAATGCTT
CAGAAAAATTTTGTAGATATTGTTTTTGAAAGAGAATCAAAATTATATAAAGACGAAGGAATATCAACAGCTGAATTAAA
GTACACCAGTAATAAGGAAGTAATAAACGTACTTTGTGAGAAGGGTAAATCAGTACTTTCATACTTAGAGGACCAATGTTT
AGCACCTGGAGGAACCGATGAAAAGTTTGTAAGTTCCTGTGCTACAAATTTAAAGGAAAATAATAAGTTTACCCCAGCAAA
AGTAGCATCGAATAAAAATTTTATAATACAACATACTATAGGACCAATTCAATATTGTGCTGAAAGCTTTTTGCTTAAAAA
CAAGGATGTCTTAAGAGGTGATTTAGTTGAAGTAATTAAGGATTCCCCCAATCCAATAGTACAACAGTTATTTGAAGGTCA
AGTAATTGAGAAGGGTAAAATAGCTAAAGGTTCATTAATAGGTTCTCAATTTTTAAATCAATTGACATCTTTAATGAACTT
GATAAATAGTACTGAACCACATTTCATACGTTGTATTAAACCAAATGAAAATAAAAAACCATTAGAATGGTGTGAACCAAA
AATATTAATTCAGCTTCATGCCTTATCAATTTTAGAAGCATTAGTATTAAGACAATTAGGATATTCTTATAGAAGAACCTT
TGAAGAATTCTTATATCAATATAAATTTGTGGACATTGCTGCTGCTGAAGATTCATCAGTTGAAAACCAAAATAAATGTGT
TAATATATTAAAGTTGTCTGGACTATCTGAATCCATGTATAAGATAGGAAAAAGCATGGTCTTTTTGAAACAAGAAGGTG
CAAAAATATTGACAAAAATACAAAGAGAGAAACTTGTTGAATGGGAAAATTGTGTGAGTGTAATTGAAGCTGCTATACTTA
AACACAAATACAAACAAAAGGTTAACAAAAATATACCTTCTCTTTTGAGAGTACAAGCTCATATAAGAAAAAAAATGGTAG
CTCAATAA
Figura 4-29. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_knock-out
El gen pfmyo-a tiene un tamaño de 2841 pb. Las letras minúsculas corresponden a los 2 intrones
presentes en el gen. ATG señala la ubicación de los 20 codones ATG presentes en la secuencia,
posiciones que se tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de un
ATG inicial. Las CAJAS corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto
en ÍTÁLICA Y SOMBREADO corresponde al fragmento de 714 pb que fue clonado en el vector pHH1 y
que corresponde al constructo KO. Las letras subrayadas corresponden a la secuencia del gen que
codifica la región de la cola de la miosina A. TAA corresponde al codón de parada del gen endógeno.
Constructo pHH1-BKO
El gen que codifica para PfMyoB se localiza en el cromosoma 5, tiene 7 intrones y un tamaño
de 3493 pb. Se diseñó un constructo “knock-out” utilizando una región ubicada 1559 pb
corriente abajo del primer ATG presente en el gen. En la figura 4-30 se esquematiza el diseño
del constructo pHH1-BKO y en la figura 4-31 se presenta la secuencia del constructo, su
ubicación en la secuencia del gen y las particularidades consideradas en su diseño.
78 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-30. Constructo pHH1-PfMyoB_knock-out
A. Gen endógeno pfmyo-b. B. Constructo pHH1-BKO: el vector pHH1 contiene un fragmento de 918 pb
del gen pfmyo-b, el cual se ubica 1559 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno y
un codón de parada introducido artificialmente en el extremo 3’. ΔATG denota ausencia de codón de
inicio ATG, STOP prematuro denota la introducción artificial de un codón de parada, 1017 pb antes del
codón de parada propio del gen endógeno. C. Constructo integrado en el gen de miosina b, producto de
un evento de recombinación homóloga sencilla entre la secuencia del gen de la miosina b presente en
el plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias no funcionales del gen, una copia corresponde a
un fragmento de 2477 pb que está precedido por el promotor endógeno del gen Pfmyo-b y que
contiene un codón de inicio ATG y un codón de parada prematuro en la posición 2476 y la segunda
copia de 1935 pb sin promotor, sin codón de inicio y con el codón de parada original del gen.
ATGGTGAATAAAATCAACGAATTAAATAATTATTTCAGGATTAATAGTACATTTATAAATAAAAGTGAAAATGAAAGTGAA
AATTTTTATGTGTGGACATATAAAAGTCCAAATGTTGATCTATATCCTGATTTGGTTTTTTTTAAATGTCAAGTTCTTAAT
ATAAATGGAGATAATTATGAGGTAAAAGAAATATCTCCTGAAACTAACAGTGTATATACGGTGAAAAAGGAACATTTATTT
AATTGCAATAATATGGTAAATATAAATAGTCATCGATTAAATGATATGGTTCATCAAAACTCAGCAGAGGTATTAAACACT
TTAGCTTTAAGATATGAAAAGAATTATATATATACTATAGCTGAGCCAATGCTAATATCGGTAAATCCTTATCAAGTAATT
GATACTGATATGAATGAGTATAAGAATAAGAGCACAGATTTATTACCACCTCACGTGTATACATATGCAAAGGATGCAATG
CTTGATTTTATAAATACAAAAAATAGTCAGTCAATAATTATAAGTGGAGAAAGTGGATCAGGAAAAACAGAAGCATCCAAA
CTTGTAATCAAATTTTATTTATCTGGTGTTAGGGAGGATAATGATATATCAAAAACGTTATGGGACTCGAACTTTATATTG
GAGgtgggaagacaatacataaatataTaaataaataaataaataaataaataaataaatatatatatatatatatatata
tatgtatatacgtatatctcttttttatgatattttaattagGCGTTTGGTAATGCAAAAACTGTAAAGAACAATAATTCC
AGTAGATACGGAAAGTATATTAAAATCCAATTAGATGAAAATCAGAATATTGTATCATCAAGTATTGAAATATTTTTGCTG
GAAAAAATAAGAGTAGTATCACAGgttaattgaaataaataatatacatatatatgtatgtatatgtgactatatttatat
atttatatatttacatatttacatattttatcttataattttaaaaataatagGAACCAGACGAACGATGTTATCACATTT
TTTATGAAATTCTAAAAGGAATGAATGATGAAATGAAAAAAAAGTACAAGATAAAATCAGAAGAAGATTACAAATATATTT
CAAATAAATCTATTAACATTCCTGgtaggcatgatatgcgtaaatgcctacataactatatatttatatatatatatatat
ttactatatggttaaaacatacttcatatatttattaaacatatagAAATTGATGACGCAAAGGATTTTGAGAATTTAATG
ATATCTTTTGATAAAATGAAAATGTCTGATTTAAAAGATGACCTTTTCCTTACTTTGTCAGgtaaagattgaaagataatt
atgagtagttatataaaattacatgttatatattatgaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata
tatatatgttataattatttagGGTTGTTACTTTTGGGAAATATTCAATTTAATGGGATCGAAAAGGGTGGTAAATCTAAT
Métodos, resultados y discusión 79
TGTAGTGAACTTGATGATGAGAACTTAGAGGTGGTTAATGAGGCTAGTGAATTATTAGGTATAGATTATGAGAGTTTAAAG
AATAGTTTAGTTATTACTGAAAAGAGTATAGCTAATCAGAAAATCGAAATTCCTTTGAGTATAGAAGAGTCTTTATCAATA
TGTAGATCGATATCTAAGGATATATATAATAAGATATTTGAGTACATTACGAAAAGAATAAATAATTTTTTAAATAATAAT
AAAGAATTAGAGAATTTCATAGGTATTTTGGATATTTTTGGATTTGAGATTTTTGTTAAGAATTCATTAGAGCAGTTGCTA
ATTAATATAGCGAATGAAGAGATACATAATATATATTTATTTGTTGTATATGAAAAAGAAAGCAATTTATATAAAAAGGAA
GGAATTATAATTGAATCAGTAAAATATACAAATAATGAAAGTATAATTGATTTATTAAGAGGTAAAACATCTATTATTTCT
ATATTGGAAGATAATTGTTTAGCACCTGGAAAGAAGGATGAGgtgggttttaaaaaaaaaaaaaaatataaatatAtatat
atatatatataataaatcaatacataatatgtgtgtaaatatatgaatctaggaatatattgataaaccTtatttatataa
ttgtgttaatagtatatctttgcattatatatatatatatatatatatatatataattattatttttattttttttttttt
aattattaagTCGATCGTAAGTGTTTATACAAATAAATTTTCTAAGAATGAACATTATTCAGTATGTAAGAAAAACATAAC
GGAAAGTTTTGTAATTAAGCATACTGTAAGTGATGTAACATATAGTATTTCTAATTTCATTTCAAAAAATAAGGACATCCT
TTCGCCTAACATTTTGAAATTATTGAAGgtgaggacgagtgatcatggaataaacagaaaaatataaaatgatatatatat
atatattaatatatatgtgtgtatatttatttatttgaaTaattatatagagatatcatcatatatatatatatatatata
tatatatatatatttatttatttatttatttatttatctttctgattagGTGTCGAATAACAAATTAATTCAGAACTTGTA
TGATGATGCTGAAGTAACGGATTCATTAGGACGTAAAAACTTAATAACTTATAAATATTTAGAAAATCTAAAAAAAATATG
CTCCTATTTAAAGAGCACAAATATATATTTTATAAAATGTATTAAACCAAATGAAACAAAAGAGAAAAATAACTTTAATCC
GAAAAAAGTATATCCTCAATTATTTTCTTTATCTATTGTTGAAACGTTAAATATAAAATATTTTTTTCAGTATAAATATAC
GTTTGCTTCTTTCTTAAGTTATTATCAATATTTGGATATTGCTGTTTCAAATGATTCAAGTTTGGATGAAAAAACTAAAGT
AACCATGTTGTTGGAAAGGAACTTTGACAAGGATTCATATAAGgttaaaatgtatatatatatatatatatatatataTat
atttatatatatgtgtgtgtttattttaataacgtactttttttttttatttttttttattttatttttcgtTaaatatat
tattatatactcatgtagagtacatccgtatgtactcatatattaatatatccatatatatatatatatatatatatatat
atatatatataatacctttacatatttaacttcttagGTTGGACATACCATGGTATTTTTAAAAAAGGAAGCGGTTCATAA
AATTCGGGATATCATAAATTCCAACTTGAAATGTTATAGAAATTTATGTTGTATAACTAGTGCACTCATCATGAAAATAAA
GAAAAAGAGAATAGTAGAAGAAAACATAAAAAATTTACAACTAGCTCAAGCATATTTTAGGAAATATAAATATATTAAGGA
ACACGAATAA
Figura 4-31. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño del constructo pHH1-PfMyoB_knock-out
El gen de la miosina b tiene un tamaño de 3493 pb. Las letras minúsculas de color azul corresponden a
los 7 intrones presentes en el gen. ATG corresponde a la ubicación de los 14 codones ATG presentes en
la secuencia, posiciones que se tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo pHH1-
PfMyoB_Knock out, el cual debe carecer de ATG inicial. Las letras rojas en negrilla corresponden a las
secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado en azul corresponde al
fragmento de 918 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras subrayadas corresponden a la
secuencia del gen que codifica la región de la cola de la miosina B. TAA corresponde al codón de
parada del gen endógeno.
4.4.1.1.2 Diseño de constructos control
Los constructos pHH1-PfMyoA_Control y pHH1-PfMyoB_Control, designados pHH1-AC y
pHH1-BC, se diseñaron teniendo en cuenta que una vez ocurre el evento de recombinación
homóloga sencilla se debe generar al menos una copia funcional del gen. Para lograr lo
anterior, los constructos fueron diseñados sin codón de inicio (ATG) en su extremo 5' y con
una extensión que sobrepasada al codón de parada propio del gen de interés, es decir hasta la
región 3' UTR del gen. De ese modo, una de las copias del gen retiene el promotor endógeno,
el codón de inicio y el extremo 3' completo, es decir corresponde a una copia funcional del
gen, mientras que la otra copia no posee promotor ni codón de inicio.
80 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Constructo pHH1-AC
En la figura 4-32 se esquematiza el diseño del constructo pHH1-AC. En la figura 4-33 se
muestra la secuencia del constructo, su ubicación en la secuencia del gen y otros detalles
considerados a la hora de diseñar el constructo control.
Figura 4-32. Constructo pHH1-PfMyoA_Control
A. Gen endógeno pfmyo-a. B. Constructo pHH1-AC: el vector pHH1 contiene un fragmento de 981 pb
del gen PfmyoA, el cual se ubica 1909 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno.
ΔATG denota ausencia de codón de inicio ATG, STOP denota el codón de parada (TAA) propio el gen
endógeno. C. Constructo integrado en el gen de miosina a, producto de un evento de recombinación
homóloga sencilla entre la secuencia de la miosina a presente en el plásmido y el gen endógeno: se
generan dos copias del gen, una funcional y otra no funcional; en la primera, se reconstituye el gen
completamente y éste no posee ninguna modificación, el gen esta precedido del promotor endógeno
de pfmyo-a y no tiene codones prematuros de parada. La segunda copia corresponde a un fragmento
de 932 pb sin promotor, sin codón de inicio y con codón de parada original.
ATGGCTGTTACAAATGAAGAAATAAAAACGGCAAGTAAGATTGTTAGAAGAGTTTCAAATGTAGAAGCATTTGACAAAAGT
GGTTCAGTTTTTAAGgtaatagaattgtatatctttatatacatacatatatttttttttttgtatatgtagttttatttt
tcgcatctcctatatataattgtttacatattttcccaatgtgtattaaaaaaaaaatttttttctttttttttttttctc
atttttttagGGTTATCAAATATGGACTGATATATCTCCGACAATAGAAAATGATCCAAATATTATGTTTGTAAAATGTGT
TGTACAACAAGGATCAAAAAAAGAAAAATTAACCGTTGTACAAATTGATCCACCCGGAACAGGAACTgtaaatgataaacg
aataaaaaaaaaaaaaaaaaatatatatatatatatatataatagaataattatatatacatattgaaaaaaaaaaatAta
catgtttatggaattaaacatattcaaatatttatatacttgatgtcttttgagagattatattacatatacatgtatatt
attttttattatattatattatattataattttaatttattttatttacagCCATACGATATTGATCCAACTCACGCATGG
AACTGCAACTCTCAAGTAGACCCCATGTCTTTTGGTGATATTGGTCTTTTAAATCACACCAACATCCCATGTGTTCTTGAC
TTTTTAAAGCACAGATATTTAAAAAATCAAATATACACCACTGCTGTTCCCCTTATTGTTGCAATAAACCCATACAAGGAT
TTAGGAAACACAACTAATGAATGGATTCGTAGATATCGTGATACAGCTGATCATACTAAGTTGCCACCACACGTGTTCACA
Métodos, resultados y discusión 81
TGTGCTAGGGAAGCTTTGTCTAATCTCCATGGTGTAAACAAGAGCCAAACTATTATTGTATCTGGTGAATCTGGTGCAGGA
AAAACCGAAGCAACAAAACAAATCATGAGATATTTTGCTTCTTCTAAGAGTGGAAATATGGATTTACGTATTCAGACAGCA
ATAATGGCTGCAAATCCAGTTCTTGAAGCTTTTGGTAATGCGAAAACTATAAGAAATAACAATTCATCTCGTTTTGGTCGT
TTCATGCAGTTGGTTATATCCCATGAAGGAGGTATAAGATACGGTTCCGTTGTTGCTTTTCTGTTGGAAAAATCTAGAATT
ATTACACAAGATGATAATGAAAGGTCATATCATATATTTTATCAATTTCTTAAGGGTGCAAATAGTACGATGAAATCTAAA
TTTGGTTTAAAAGGAGTTACTGAATACAAATTATTGAACCCAAATTCAACAGAGGTAAGTGGAGTAGATGATGTAAAAGAT
TTTGAAGAGGTAATTGAATCGTTGAAAAATATGGAATTAAGTGAATCAGATATTGAAGTAATATTTTCAATAGTAGCTGGT
ATATTAACATTAGGAAATGTAAGATTAATTGAGAAGCAAGAAGCTGGATTAAGTGATGCTGCTGCTATTATGGATGAGGAT
ATGGGTGTGTTTAATAAAGCTTGTGAATTGATGTATTTAGACCCTGAATTAATAAAAAGGGAAATATTAATTAAGGTAACT
GTTGCTGGAGGAACAAAAATTGAAGGTAGATGGAATAAAAATGATGCAGAAGTGTTGAAATCTTCCTTATGTAAAGCTATG
TATGAGAAATTGTTTTTATGGATAATAAGACATTTGAATTCAAGAATTGAACCAGAAGGAGGATTTAAAACATTTATGGGT
ATGTTAGATATTTTTGGTTTTGAAGTATTTAAAAATAATTCATTGGAACAATTATTTATTAACATTACTAACGAAATGCTT
CAGAAAAATTTTGTAGATATTGTTTTTGAAAGAGAATCAAAATTATATAAAGACGAAGGAATATCAACAGCTGAATTAAAG
TACACCAGTAATAAGGAAGTAATAAACGTACTTTGTGAGAAGGGTAAATCAGTACTTTCATACTTAGAGGACCAATGTTTA
GCACCTGGAGGAACCGATGAAAAGTTTGTAAGTTCCTGTGCTACAAATTTAAAGGAAAATAATAAGTTTACCCCAGCAAAA
GTAGCATCGAATAAAAATTTTATAATACAACATACTATAGGACCAATTCAATATTGTGCTGAAAGCTTTTTGCTTAAAAAC
AAGGATGTCTTAAGAGGTGATTTAGTTGAAGTAATTAAGGATTCCCCCAATCCAATAGTACAACAGTTATTTGAAGGTCAA
GTAATTGAGAAGGGTAAAATAGCTAAAGGTTCATTAATAGGTTCTCAATTTTTAAATCAATTGACATCTTTAATGAACTTG
ATAAATAGTACTGAACCACATTTCATACGTTGTATTAAACCAAATGAAAATAAAAAACCATTAGAATGGTGTGAACCAAAA
ATATTAATTCAGCTTCATGCCTTATCAATTTTAGAAGCATTAGTATTAAGACAATTAGGATATTCTTATAGAAGAACCTTT
GAAGAATTCTTATATCAATATAAATTTGTGGACATTGCTGCTGCTGAAGATTCATCAGTTGAAAACCAAAATAAATGTGTT
AATATATTAAAGTTGTCTGGACTATCTGAATCCATGTATAAGATAGGAAAAAGCATGGTCTTTTTGAAACAAGAAGGTGCA
AAAATATTGACAAAAATACAAAGAGAGAAACTTGTTGAATGGGAAAATTGTGTGAGTGTAATTGAAGCTGCTATACTTAAA
CACAAATACAAACAAAAGGTTAACAAAAATATACCTTCTCTTTTGAGAGTACAAGCTCATATAAGAAAAAAAATGGTAGCT
CAATAAgcataaacaatttttgaaaaaatatacactcatagatgcaacatgtaagtatacaaataaatatggtatgtagag
tacgttataatattgatcaaataa
Figura 4-33. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_Control.
Las letras azules en minúscula corresponden a los 2 intrones presentes en el gen. ATG o ATG
corresponde a la localización de los 20 codones ATG presentes en la secuencia, posiciones que se
tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de ATG. Las letras rojas
en negrilla corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado en
amarillo corresponde al fragmento de 981 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras
subrayadas corresponden a la región de la cola de la miosina A. TAA corresponde al codón de parada
del gen endógeno. Las letras en marrón corresponden a la región 3' no traducible (3' UTR) del gen de
la miosina a.
Constructo pHH1-BC
En la figura 4-34 se muestra un esquema con el diseño del constructo pHH1-BC y en la figura
4-35 se presenta la secuencia del gen pfmyo-b y la ubicación del inserto.
82 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-34. Constructo pHH1-PfMyoB_Control
A. Gen endógeno pfmyo-b. B. Constructo pHH1-BC: el vector pHH1 contiene un fragmento de 904 pb, el
cual se ubica 2628 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen pfmyo-b. ΔATG denota
ausencia del codón de inicio ATG, STOP denota el codón de parada (TAA) propio el gen endógeno. C.
Constructo integrado en el gen de miosina b, producto de un evento de recombinación homóloga
sencilla entre el plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias del gen, una funcional y otra no
funcional; en la primera se reconstituye el gen completamente y éste no posee ninguna modificación,
está precedido por el promotor de myob y contiene la secuencia de parada del gen. La segunda copia
corresponde a un fragmento de 866 pb sin promotor, sin codón de inicio y con el codón de parada
original.
ATGGTGAATAAAATCAACGAATTAAATAATTATTTCAGGATTAATAGTACATTTATAAATAAAAGTGAAAATGAAAGTGAA
AATTTTTATGTGTGGACATATAAAAGTCCAAATGTTGATCTATATCCTGATTTGGTTTTTTTTAAATGTCAAGTTCTTAAT
ATAAATGGAGATAATTATGAGGTAAAAGAAATATCTCCTGAAACTAACAGTGTATATACGGTGAAAAAGGAACATTTATTT
AATTGCAATAATATGGTAAATATAAATAGTCATCGATTAAATGATATGGTTCATCAAAACTCAGCAGAGGTATTAAACACT
TTAGCTTTAAGATATGAAAAGAATTATATATATACTATAGCTGAGCCAATGCTAATATCGGTAAATCCTTATCAAGTAATT
GATACTGATATGAATGAGTATAAGAATAAGAGCACAGATTTATTACCACCTCACGTGTATACATATGCAAAGGATGCAATG
CTTGATTTTATAAATACAAAAAATAGTCAGTCAATAATTATAAGTGGAGAAAGTGGATCAGGAAAAACAGAAGCATCCAAA
CTTGTAATCAAATTTTATTTATCTGGTGTTAGGGAGGATAATGATATATCAAAAACGTTATGGGACTCGAACTTTATATTG
GAGgtgggaagacaatacataaatatataaataaataaataaataaataaataaataaatatatatatatatatatatata
tatgtatatacgtatatctcttttttatgatattttaattagGCGTTTGGTAATGCAAAAACTGTAAAGAACAATAATTCC
AGTAGATACGGAAAGTATATTAAAATCCAATTAGATGAAAATCAGAATATTGTATCATCAAGTATTGAAATATTTTTGCTG
GAAAAAATAAGAGTAGTATCACAGgttaattgaaataaataatatacatatatatgtatgtatatgtgactatatttatat
atttatatatttacatatttacatattttatcttataattttaaaaataatagGAACCAGACGAACGATGTTATCACATTT
TTTATGAAATTCTAAAAGGAATGAATGATGAAATGAAAAAAAAGTACAAGATAAAATCAGAAGAAGATTACAAATATATTT
CAAATAAATCTATTAACATTCCTGgtaggcatgatatgcgtaaatgcctacataactatatatttatatatatatatatat
ttactatatggttaaaacatacttcatatatttattaaacatatagAAATTGATGACGCAAAGGATTTTGAGAATTTAATG
ATATCTTTTGATAAAATGAAAATGTCTGATTTAAAAGATGACCTTTTCCTTACTTTGTCAGgtaaagattgaaagataatt
atgagtagttatataaaattacatgttatatattatgaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata
Métodos, resultados y discusión 83
tatatatgttataattatttagGGTTGTTACTTTTGGGAAATATTCAATTTAATGGGATCGAAAAGGGTGGTAAATCTAAT
TGTAGTGAACTTGATGATGAGAACTTAGAGGTGGTTAATGAGGCTAGTGAATTATTAGGTATAGATTATGAGAGTTTAAAG
AATAGTTTAGTTATTACTGAAAAGAGTATAGCTAATCAGAAAATCGAAATTCCTTTGAGTATAGAAGAGTCTTTATCAATA
TGTAGATCGATATCTAAGGATATATATAATAAGATATTTGAGTACATTACGAAAAGAATAAATAATTTTTTAAATAATAAT
AAAGAATTAGAGAATTTCATAGGTATTTTGGATATTTTTGGATTTGAGATTTTTGTTAAGAATTCATTAGAGCAGTTGCTA
ATTAATATAGCGAATGAAGAGATACATAATATATATTTATTTGTTGTATATGAAAAAGAAAGCAATTTATATAAAAAGGAA
GGAATTATAATTGAATCAGTAAAATATACAAATAATGAAAGTATAATTGATTTATTAAGAGGTAAAACATCTATTATTTCT
ATATTGGAAGATAATTGTTTAGCACCTGGAAAGAAGGATGAGgtgggttttaaaaaaaaaaaaaaatataaatatatatat
atatatatataataaatcaatacataatatgtgtgtaaatatatgaatctaggaatatattgataaaccttatttatataa
ttgtgttaatagtatatctttgcattatatatatatatatatatatatatatataattattatttttattttttttttttt
aattattaagTCGATCGTAAGTGTTTATACAAATAAATTTTCTAAGAATGAACATTATTCAGTATGTAAGAAAAACATAAC
GGAAAGTTTTGTAATTAAGCATACTGTAAGTGATGTAACATATAGTATTTCTAATTTCATTTCAAAAAATAAGGACATCCT
TTCGCCTAACATTTTGAAATTATTGAAGgtgaggacgagtgatcatggaataaacagaaaaatataaaatgatatatatat
atatattaatatatatgtgtgtatatttatttatttgaataattatatagagatatcatcatatatatatatatatatata
tatatatatatatttatttatttatttatttatttatctttctgattagGTGTCGAATAACAAATTAATTCAGAACTTGTA
TGATGATGCTGAAGTAACGGATTCATTAGGACGTAAAAACTTAATAACTTATAAATATTTAGAAAATCTAAAAAAAATATG
CTCCTATTTAAAGAGCACAAATATATATTTTATAAAATGTATTAAACCAAATGAAACAAAAGAGAAAAATAACTTTAATCC
GAAAAAAGTATATCCTCAATTATTTTCTTTATCTATTGTTGAAACGTTAAATATAAAATATTTTTTTCAGTATAAATATAC
GTTTGCTTCTTTCTTAAGTTATTATCAATATTTGGATATTGCTGTTTCAAATGATTCAAGTTTGGATGAAAAAACTAAAGT
AACCATGTTGTTGGAAAGGAACTTTGACAAGGATTCATATAAGgttaaaatgtatatatatatatatatatatatatatat
atttatatatatgtgtgtgtttattttaataacgtactttttttttttatttttttttattttatttttcgttaaatatat
tattatatactcatgtagagtacatccgtatgtactcatatattaatatatccatatatatatatatatatatatatatat
atatatatataatacctttacatatttaacttcttagGTTGGACATACCATGGTATTTTTAAAAAAGGAAGCGGTTCATAA
AATTCGGGATATCATAAATTCCAACTTGAAATGTTATAGAAATTTATGTTGTATAACTAGTGCACTCATCATGAAAATAAA
GAAAAAGAGAATAGTAGAAGAAAACATAAAAAATTTACAACTAGCTCAAGCATATTTTAGGAAATATAAATATATTAAGGA
ACACGAATAAAAATCGGGAAAATAAAATGGATGACCAGAAAGTTGTATACTTTGGCAAATTTATTCTTTTAAAAGTGTAGG
AATATA
Figura 4-35. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño de constructo pHH1-PfMyoB_Control
Las letras azules en minúscula corresponden a los 7 intrones presentes en el gen. ATG o ATG
corresponde a la localización de los 14 codones ATG presentes en la secuencia, posiciones que se
tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de un ATG inicial. Las
letras rojas corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado
en gris corresponde al fragmento de 904 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras subrayadas
corresponden a la secuencia del gen que codifica la región de la cola de la miosina B. TAA corresponde
al codón de parada del gen endógeno. Las letras en marrón corresponden a la región 3’ no traducible
(3’ UTR) del gen.
4.4.1.1.3 Diseño de la PCR diagnóstica
El seguimiento de las formas integradas en los cultivos se hizo mediante PCR diagnóstica,
estrategia que demandó un diseño cuidadoso de los iniciadores para poder rastrear
correctamente cada una de las posibles formas presentes en el cultivo: parásitos con
integración, parásitos con episomas y parásitos silvestres. Una vez ocurre la recombinación
homóloga, el plásmido pHH1 queda insertado en el genoma, flanqueado por los dos
fragmentos del gen endógeno que fue interrumpido. Así, el término integración 5’ hace
referencia a la región del gen endógeno que quedó corriente arriba del plásmido integrado.
En ese orden de ideas, esta región puede ser monitoreada por PCR usando un iniciador
sentido sobre la secuencia del gen endógeno y un iniciador anti-sentido sobre la secuencia
84 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
del plasmido pHH1. Por su parte, el término integración 3’ hace referencia a la región del gen
endógeno que quedó corriente abajo del plásmido integrado. Así, esta región puede ser
monitoreada por PCR usando un iniciador sentido sobre la secuencia del plásmido pHH1 y un
iniciador anti-sentido sobre la secuencia del gen endógeno. En las figuras 4-36, 4-37, 4-38 y
4-39 se muestra la ubicación de los iniciadores.
Figura 4-366. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_knock-
out
A. Pareja de iniciadores A y Z: amplifican un fragmento de 977 pb presente únicamente en el gen
pfmyo-a endógeno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no
hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 911pb
presente exclusivamente en el constructo, es decir parásitos que contienen el constructo como un
episoma, pero que no lo integraron. C. Pareja de iniciadores A y D y C y Z: amplifican un fragmento de
982 y 906 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser posible
cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos integraron el
constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina a.
Métodos, resultados y discusión 85
Figura 4-37. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos
PfMyoB_knock-out
A. Pareja de iniciadores Y y B: amplifican un fragmento de 1198 pb presente únicamente en el gen
Pfmyo-b endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no
hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 1115 pb
presente exclusivamente en el constructo, es decir parásitos que contienen el constructo como un
episoma, pero que no lo integraron C. Pareja de iniciadores Y y D y C y B: amplifican un fragmento
de 1071 y 1242 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser
posible cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos
integraron el constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina b.
86 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-388. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos
PfMyoA_Control
A. Pareja de iniciadores A y W: amplifican un fragmento de 1272 pb presente únicamente
en el gen pfmyo-a endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en
parásitos donde no hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D:
amplifican un fragmento de 1178 pb presente exclusivamente en el constructo, es decir
parásitos que contienen el constructo como un episoma, pero que no lo integraron. C.
Pareja de iniciadores A y D y C y W: amplifican un fragmento de 1246 y 1120 pb,
respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser posible
cuando hay formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos integraron el
constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina
Métodos, resultados y discusión 87
Figura 4-39. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_Control
A. Pareja de iniciadores E y G: amplifican un fragmento de 1294 pb presente únicamente en el gen
pfmyo-a endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no
hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 1101pb
presente exclusivamente en el constructo, es decir parásitos que contienen el constructo como un
episoma, pero que no lo integraron C. Pareja de iniciadores E y D y C y G: amplifican un fragmento de
1211 y 1184 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser
posible cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos
integraron el constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina b.
4.4.1.2 Clonación y transfección
De acuerdo con las secuencias reportadas en PlasmoDB para los genes pfmyo-a y pfmyo-b
(PF3D7_1342600 y PF3D7_0503600, respectivamente), se diseñaron oligonucleótidos
específicos (Anexo A) con secuencias de reconocimiento para las enzimas BglII y XhoI en su
extremo 5’, sitios que también están presentes en el vector de transfección pHH1. Cada
fragmento fue amplificado a partir de 50 ng de ADN de la cepa 3D7 de P. falciparum con las
siguientes condiciones de PCR: buffer 1X (cloned Pfu buffer), dNTPs 200 µM (Invitrogen,
88 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Carlsbad, CA, USA), primers 0,1µ M, Pfu ADN polimerasa 1,25 U (Agilent Technologies, La
Jolla, CA, USA) y MgSO4 2,0 mM. El programa de amplificación consistió en un ciclo de
denaturación inicial de 94 °C x 4 minutos, 30 ciclos de 94 °C x 45 segundos, 50 °C x 30
segundos y 60 °C x 2 minutos, seguido por una extensión final de 60 °C x 10 minutos. Los
amplicones de pfmyo-a se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, USA) y
los de pfmyo-b en el vector pSC-B-amp/kan (Stratagene, La Jolla, CA, USA) (ver Anexo B)
mediante T4 ADN ligasa (Promega, Madison, WI, USA) y con estos plásmidos recombinantes
se transformaron, mediante choque térmico, bacterias competentes E. coli JM109 (Promega)
y E. coli DH5α (MAX Efficient DH5 α competent cells, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),
respectivamente. El rastreo de colonias se hizo mediante PCR usando iniciadores del inserto
y del vector. Los insertos clonados fueron liberados del vector con las enzimas BglII y XhoI y
la digestión fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa, desde donde las bandas
correspondientes a los insertos se cortaron y se purificaron (Montage gel extraction kit,
Millipore, Bedford, MA, USA) y el ADN extraído se cuantificó por espectrofotometría. Los
insertos puros se ligaron al vector pHH1, que previamente había sido digerido con las
mismas enzimas, en una proporción 3:1 (inserto:vector) durante 16 horas a 22 °C en
presencia de T4 ADN ligasa (Promega, Madison, WI, USA). Se transformaron bacterias E. coli
JM109 competentes y los clones se confirmaron mediante secuenciación. Una vez se
comprobó que los clones poseían la secuencia correcta se hizo cultivo a gran escala y se
extrajo el ADN plasmídico (ADNp) que se usaría para transfectar los parásitos.
4.4.1.2.1 Extracción y purificación del ADNp
Los clones bacterianos pHH1/AC, pHH1/AKO, pHH1/BC y pHH1/BKO se sembraron por
agotamiento en agar LB/amp22 y se incubaron a 37 °C durante toda la noche. Al día siguiente
se tomó una colonia y se sembró en 5 mL de medio LB/amp y se incubó a 37 °C durante toda
la noche en agitación (200 rpm). A partir de este cultivo se hizo una dilución 1:1600 (250 µL
22Agar LB-amp: caja de agar LB suplementado con 100 µg/mL de ampicilina. El caldo Luria está constituido por peptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 10 g/L.
Métodos, resultados y discusión 89
en 400 mL de medio) en caldo Terrific23 suplementado con ampicilina (100 µg/mL) y se
incubó a 37 °C en agitación a 200 rpm durante toda la noche. Posteriormente, el cultivo se
transfirió a botellas de 250 mL y se centrifugó a 5000 x g durante 20 min (de aquí en
adelante se trabajo a temperatura ambiente). Se descartó el sobrenadante y a cada “pellet”
bacteriano se le adicionaron 12 mL de solución de resuspensión celular (kit PureYieldTM
Plasmid Maxiprep system, Promega, Madison, WI, USA). Luego de mezclar muy bien, se
adicionaron 12 mL de solución de lisis celular, se mezcló por inversión varias veces y la
suspensión se incubó por 3 min. Se agregaron 12 mL de solución de neutralización se mezcló
por inversión y se centrifugó a 14000 x g por 20 min. El lisado obtenido se agregó lentamente
sobre una columna (ensamblada de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se filtró
todo el volumen, se removió la columna superior y se hicieron dos lavados mediante
aspiración por vacío. El primero, con 5 mL de buffer de lavado (Endotoxin Removel Wash) y
el segundo, con 20 mL de buffer de lavado (Column Wash). La membrana de la columna se
secó mediante la aplicación de vacío durante 5 min y posteriormente, se hizo la elución del
ADNp con 1,5 mL de agua libre de nucleasas por centrifugación a 2000 x g durante 10 min y
se guardó a -20 °C hasta su uso. Se dejó una pequeña alícuota para cuantificar y hacer
electroforesis para verificar la pureza del material obtenido.
4.4.1.2.2 Transfección de Plasmodium falciparum mediante electroporación
La electroporación es un proceso físico que permite introducir ADN a células en cultivo y se
lleva a cabo mediante la aplicación de pulsos eléctricos a las células, lo que provoca la
apertura transitoria de poros en la membrana plasmática. En este trabajo se electroporaron
eritrocitos mediante un pulso eléctrico tipo caída exponencial, y de esa forma se obtuvieron
eritrocitos precargados (con el ADN de interés) que fueron adicionados al cultivo de P.
falciparum. El objetivo era lograr que los parásitos infectaran estos eritrocitos precargados y
tuvieran así la oportunidad de internalizar los plásmidos. El protocolo de transfección es un
protocolo complejo que contempla varios pasos, los cuales van desde la preparación del
23 Caldo terrific: es un medio altamente enriquecido para mejorar la obtención de bacterias en menor tiempo. plásmidos en E. coli. Sus componentes son triptona 11.8 g/L, extracto de levadura 23,6 g/L, K2HPO4 9,4 g/L y KH2PO4 2,2 g/L.
90 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
ADNp hasta el mantenimiento de los parásitos transfectados en cultivo. A continuación se
describe cada uno:
Preparación del ADN plasmídico
Para cada transfección, 100 µg de ADNp fueron precipitados adicionando 2,5 – 3 volúmenes
de etanol al 100 % y 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M pH 5,2. La solución de ADNp se
centrifugó a 13000 x g por 20 min a 4 °C. El sobrenadante se removió y el “pellet” fue lavado
con etanol al 70 % y centrifugado por 10 min usando las condiciones anteriores. El
sobrenadante fue removido en cabina de flujo laminar, el ADNp se dejó secar y luego fue
resuspendido en 30 µL de Buffer TE 1X estéril y almacenado a 4 °C.
Cultivo de Plasmodium falciparum
El cultivo de P. falciparum cepa 3D7 fue sincronizado mediante 2 ó 3 tratamientos con
sorbitol, de tal forma que el día previo a la transfección se tuviera un cultivo sincrónico en
anillos a al menos 5 % de parasitemia.
Transfección
Todas las actividades realizadas durante la transfección se llevaron a cabo en cabina de flujo
laminar y bajo condiciones de esterilidad. Dos cubetas de electroporación (2 mm de
separación entre los electrodos) nuevas y estériles se colocaron sobre hielo. Diez mililitros de
sangre total fresca grupo O positivo fue centrifugada a 710 x g por 5 min a temperatura
ambiente en un tubo falcon estéril. El plasma y la capa de glóbulos blancos fueron removidos
y los eritrocitos fueron lavados con HBS 1X 3 veces. El cuarto lavado se realizó con buffer
Cytomix24 centrifugando las células a 400 x g por 5 min a 4 °C. El sobrenadante fue
descartado y con el botón de glóbulos rojos se realizaron las electroporaciones. En un tubo
eppendorf de 1,5 mL se colocaron 175 µL de glóbulos rojos lavados del paso anterior, 30 µL
de ADNp en buffer TE 1X y 195 µL de Cytomix para obtener un volumen final de 400 µL. La
mezcla fue transferida a una de las cubetas teniendo cuidado de no introducir burbujas, se
tapó y se dejó en hielo mientras se realizó la misma mezcla, para la segunda cubeta. Luego
cada cubeta se colocó en la celda del electroporador (Gene Pulser XcellTM Electroporation
24 Cytomix: KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM, Hepes 25 mM, EDTA 2 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,6. Estéril
Métodos, resultados y discusión 91
system, BioRad, Hercules, CA) y los eritrocitos se electroporaron usando las siguientes
condiciones: Protocolo exponencial: voltaje: 310V, Capacitancia: 950µF, Cubeta: espacio
entre electrodos 2mm, Resistencia: ∞. Inmediatamente, el contenido de la cubeta se
transfirió a un tubo falcon estéril de 15 ó 50 mL en cabina de flujo laminar y la cubeta fue
lavada suavemente dos veces utilizando 2,5 – 3 mL de medio sin suero (RPMI 1640), el cual
también se depositó en el tubo falcón. Las células fueron centrifugadas a 400 x g por 5 min a
temperatura ambiente y el sobrenadante fue descartado. Los eritrocitos obtenidos en las dos
electroporaciones (aproximadamente 200 µL) se llevaron a un flask de 25 cm3 con 5 mL de
medio completo, al cual se le adicionaron glóbulos rojos parasitados con formas maduras,
ajustando el hematocrito al 5 % y la parasitemia en 1 %.
4.4.1.2.3 Monitoreo de los cultivos transfectados
A las 24 horas después de la transfección, se hizo cambio de medio de los cultivos con medio
completo suplementado con el medicamento antifolato WR99210 a una concentración de 5
nM (medio de selección). La evaluación de los cultivos se hizo diariamente mediante
extendido teñido con Giemsa y cambio de medio con medio suplementado25 durante los
primeros siete días. Al cabo de ese tiempo el cultivo se continuó alimentando día de por
medio y una vez por semana se hicieron extendidos y se adicionaron 100 µL de glóbulos
rojos frescos y lavados al 50% de hematocrito. Los cultivos se mantuvieron con medio de
selección hasta que se detectaron eritrocitos parasitados en los extendidos, lo cual de
acuerdo con la literatura puede tomar entre 4 a 5 semanas, aunque en algunos casos las
formas asexuales pueden aparecer más tardíamente (60 días); el experimento se abortó si al
cabo de 60 días no se observaron parásitos. Los cultivos transfectados donde se detectaron
formas asexuales se mantuvieron por 6 meses, alternando un mes de mantenimiento con
medio sin medicamento, y un mes de mantenimiento con medio de selección (con WR99210)
Este procedimiento se realizó con el objeto de enriquecer las formas integradas; así, durante
el ciclo de presión con el antifolato se seleccionan los parásitos que tienen el plásmido
integrado y durante la fase sin presión continúan creciendo los transfectantes y se espera que
se reduzca la población de parásitos que albergan el plásmido como un episoma. Sin
25 Medio suplementado: medio de cultivo completo adicionado con 5 nM de WR99210
92 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
embargo, debido a la persistencia del plásmido episomal en algunos parásitos, cuando se
aplica la presión con WR99210, también se seleccionan los parásitos que contienen
episomas. Durante cada mes se congelaron alícuotas de los cultivos que tuvieron
parasitemias ≥2 % en anillos y también se tomaron alícuotas de 0,5-1 mL para extraer ADN
genómico y realizar PCR diagnóstica y así comprobar la integración del plásmido en el
genoma del parásito.
4.4.1.3 Evaluación de “knock-out” pfmyo-a y pfmyo-b
4.4.1.3.1 Ensayos de PCR
A partir del ADNg extraído de los parásitos PfMyoA-KO se hizo PCR diagnóstica con las
parejas de cebadores A y D y C y Z para detectar integración 5´ y 3´. También se usaron las
parejas A y Z y C y D, para detectar ADNg y ADN episomal, respectivamente. Brevemente, las
condiciones de la mezcla de reacción fueron 1U Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, WI,
USA), 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0,1 µM de
cebadores (Eurofins e IDT) y como plantilla se usaron 5 µL de ADN. Las condiciones de PCR
fueron: denaturación inicial 95 °C x 3 min, seguido por 35 ciclos a 95 °C x 30 seg, 55 °C x 45
seg y 60 °C x 1 min, con una extensión final a 72 °C x 5 min.
Para los parásitos PfMyoB-KO se hizo PCR diagnóstica con las parejas de cebadores Y y D y C
y B para detectar integración 5´ y 3´. A la par se usaron las parejas Y y B y C y D para detectar
ADNg y ADN episomal. Las condiciones de la mezcla de reacción fueron las mismas de la PCR
para PfMyoA-KO. Las condiciones de PCR fueron: denaturación inicial 94 °C x 4 min, seguido
por 30 ciclos a 94 °C x 45 seg, 50 °C x 30 seg y 60 °C x 2 min, con una extensión final a 60 °C x
10 min.
4.4.1.3.2 Ensayos de RT-PCR
Para determinar si en los parásitos “knock-out” había transcripción de los genes silenciados,
se extrajo ARN a partir de cultivos PfMyoA_KO y PfMyoB_KO como se describió previamente.
Despues de ser tratado con DNasa, el ARN se usó para sintetizar ADN complementario
(ADNc) usando la enzima transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)
(Promega, Madison, WI, USA) y el iniciador oligo-dT. Brevemente, 1000 ng de ARN se
Métodos, resultados y discusión 93
incubaron con 500 ng de oligo-dT durante 5 min a 70 °C. La reacción se enfrió colocándola en
hielo y se le adicionó una mezcla de transcriptasa reversa M-MLV, buffer de la enzima, dNTPs
y RNasin, y se incubó a 42 °C durante 1 hora. Con el ADNc producido se hizo una PCR usando
cebadores específicos para los genes pfmtip, pfcrt, pfgap50, previo tratamiento con DNasa.
Posteriormente se hizo PCR con cebadores para los genes pfmyo-a y pfmyo-b.
4.4.1.3.3 Ensayos WB
Para comprobar la ausencia de la proteína en los cultivos de parásitos “knock-out” se
crecieron cultivos hasta obtener parásitos de más de 40 horas y a partir de éstos se hicieron
extractos de proteínas con buffer RIPA, los cuales fueron usados en ensayos WB.
4.4.1.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo
El comportamiento de los parásitos “knock-out” se evaluó comparando los porcentajes de
invasión contra un cultivo control y la morfología de los diferentes estadios asexuales
presentes en ambos cultivos. También se determinó si hubo variaciones en la localización de
MTIP tanto en parásitos “knock-out” como control mediante inmunofluorescencia.
4.4.2 Resultados
Con el propósito de explorar la posible participación de PfMyoB en el proceso de invasión
del merozoíto al eritrocito y obtener mayor conocimiento acerca del papel que juega
PfMyoA durante este proceso, se produjeron parásitos “knock-out” por recombinación
homóloga sencilla. Así, los genes que codifican para PfMyoB (3493 pb) y PfMyoA (2841 pb)
fueron truncados con el constructo pHH1-BKO y pHH1-AKO respectivamente, con lo cual se
esperaba, que al ocurrir la recombinación, se produjeran dos copias no funcionales del gen. A
la par, los constructos “knock-out” control pHH1-BC y pHH1-AC fueron diseñados para
integrarse en el gen pfmyo-b y pfmyo-a, y producir una copia funcional y otra no funcional del
gen en cuestión.
4.4.2.1 Monitoreo de los cultivos
Eritrocitos fueron precargados mediante electroporación con 100 µg de ADNp de cada
constructo generado (pHH1-BKO; pHH1-BC; pHH1-AKO y pHH1-AC) y puestos en cultivo con
medio completo. A cada frasco de cultivo se le adicionaron esquizontes de P. falciparum a una
94 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
parasitemia final del 1% y al cabo de 24 horas el medio se reemplazó por medio de selección;
de aquí en adelante los cultivos fueron mantenidos en medio suplementado con WR99210.
Durante los primeros 8 días post-transfección, se evidenció la disminución progresiva de los
parásitos asexuales, cambios en la morfología de los parásitos y la aparición de gametocitos.
A partir del día 9 no se volvieron a encontrar parásitos en los extendidos, situación que se
mantuvo por varias semanas. A los 38 días post-transfección, se observaron parásitos en el
cultivo sometido a transfección con el constructo pHH1-AKO (MyoA-KO) y en el cultivo
control (MyoA-C). Diez días después aparecieron parásitos en el cultivo sometido a
transfección con el constructo pHH1-BC (MyoB-C) y 7 días más tarde en el cultivo “knock-out”
(MyoB-KO). Una vez aparecieron los primeros parásitos, los diferentes cultivos alcanzaron
rápidamente parasitemias del 2 %, momento en el cual se empezaron a congelar alícuotas.
Treinta días después de la aparición de parásitos resistentes al antifolato WR99210, se
suspendió la adición de este medicamento al medio de cultivo y de aquí en adelante se
iniciaron ciclos alternados de 30 días cada uno, en los cuales el cambio de medio se hizo sin
WR99210 y luego con WR99210 con el propósito de enriquecer las formas integradas. El
seguimiento de los cultivos para rastrear la integración del plásmido en el genoma del
parásito se hizo mediante PCR diagnóstica sobre el ADNg, el cual fue extraído la última
semana de cada ciclo (cada mes) usando un kit comercial o el método de saponina/chelex.
Los iniciadores para la PCR diagnóstica fueron diseñados de tal manera que cada pareja
amplifica un único tipo de ADN, es decir ADN genómico silvestre (de aquí en adelante,
genómico), ADN del plásmido no integrado (de aquí en adelante, episomal) o ADN genómico
integrado (de aquí en adelante, integración). Todos los procedimientos mencionados
previamente también se realizaron en los cultivos control, los cuales se produjeron para
verificar que en caso de obtener un “knock out”, los efectos observados fueran producto del
silenciamiento específico y no de la técnica per se.
4.4.2.2 Evaluación de parásitos MyoA-KO y MyoA-C
4.4.2.2.1 PCR diagnóstica
La primera PCR diagnóstica para detectar integración en los parásitos de los cultivos MyoA-
KO y MyoA-C se realizó 10 días después de observar parásitos en el cultivo; el resultado fue
negativo para integración. La siguiente PCR se hizo 21 días después cuando los cultivos
Métodos, resultados y discusión 95
tuvieron parasitemias cercanas al 2% y en esta ocasión se obtuvo una banda a la altura
esperada para la integración 5' y la integración 3' en el cultivo “knock-out” (figura 4-40) y en
el cultivo control. A la par con estas señales, también se observó una banda para ADNg y para
ADN episomal (ADNe), las cuales fueron más intensas que las de la integración.
Como se mencionó antes, cuando la recombinación homóloga ocurre, el plásmido pHH1
queda insertado en el genoma, flanqueado por los dos fragmentos del gen endógeno
interrumpido. Así, la integración 5’ puede ser monitoreada por PCR usando un iniciador
sentido sobre la secuencia del gen endógeno y un iniciador anti-sentido sobre la secuencia
del plásmido pHH1, mientras que la integración 3’ puede ser monitoreada por PCR usando un
iniciador sentido sobre la secuencia del plasmido pHH1 y un iniciador anti-sentido sobre la
secuencia del gen endógeno
Figura 4-40. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-KO
El constructo pHH1-MyoAKO se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los dos geles del
centro de la figura, los cuales corresponden a la integración 5’ y 3’; sin embargo, también se observa
señal para ADNg y ADN episomal (gel de la izquierda y de la derecha, respectivamente), lo que sugiere
que una parte de la población de parásitos no integró el plásmido en su genoma pero logran sobrevivir
en el cultivo con medio de selección ya que albergan el plásmido recombinante como un episoma. La
plantilla utilizada en los carriles AKO fue el ADN extraído de los cultivos MyoA-KO y en los carriles 3D7
fue ADN extraído a partir de cultivos de la cepa silvestre 3D7. En la parte superior de cada gel se
describe la PCR diagnóstica a la cual corresponde el gel, el tamaño en pb del producto amplificado y el
nombre de los iniciadores utilizados.
Los amplicones obtenidos a partir del ADN del cultivo MyoA-KO con los iniciadores A y D
(integración 5'-fragmento de 982 pb) y C y Z (integración 3'-fragmento de 906 pb), se
clonaron en el vector pGEM-T easy y se secuenciaron para verificar la integración (Macrogen,
INTEGRACION 5
982 pbIniciadores A y D
MW H2O AKO 3D7
1500
1000
500
1500
1000
500
INTEGRACION 3´906 pb
C y Z
MW H2O AKO 3D7
1000
500
ADNg977 pb
A y Z
MW H2O AKO 3D7
ADN episomal911 pb
C y D
1000
500
MW H2O AKO 3D7 pHH1
-AKO
96 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Korea). Estos clones se denominaron respectivamente clon AD y clon CZ. El alineamiento de
las secuencias de los clones contra la secuencia teórica esperada A-D (la cual está constituida
por una parte del gen pfmyo-a, un codon de parada, la secuencia de la enzima de restricción
XhoI y parte del segmento PbDT del vector pHH1) y C-Z (constituida por una parte del
segmento Cam del vector pHH1, la secuencia de la enzima de restricción BglII y parte del
extremo 3' del gen pfmyo) tuvo un porcentaje de identidad del 99,7% y 80,6%
respectivamente (Anexo E). Estos resultados evidencian sin lugar a dudas la integración del
constructo pHH1-AKO en el gen pfmyo-a.
Mes a mes se realizaron PCRs para detectar integración, el rastreo de los parásitos del sexto
mes (con WR99210) fue positivo para integración, aunque las bandas obtenidas en el sexto
mes fueron muy tenues. Este mes corresponde al último ciclo con WR99210, momento en el
cual los cultivos fueron congelados. Posteriormente, estos parásitos fueron descongelados y
mantenidos en cultivo por cinco meses bajo ciclos mensuales de presión y ausencia de
medicamento, con el propósito de enriquecer la población de transfectantes y eliminar los
parásitos con episomas. Esta fase de selección se volvió a realizar teniendo en cuenta que en
el cultivo predominaban los parásitos silvestres, sobre la población de transfectantes. El
seguimiento por PCR de estos cultivos tuvo el mismo comportamiento de los primeros
parásitos, es decir, en algunas PCR hubo amplificación exitosa para integración y en otras no
y siempre hubo amplificación cuando se analizaron las otras formas (ADNe y ADNg). Para
mejorar la sensibilidad del rastreo de las integraciones 5’ y 3’ se diseñó una PCR semi-
anidada (Anexo A) y todos los ADN obtenidos durante los 5 meses de cultivo se analizaron
usando esa técnica. Todas las amplificaciones fueron exitosas, lo cual apoya la idea del escaso
número de parásitos con integración en el cultivo, ya que fue necesario el uso de una
metodología más sensible que pudiera detectar esta población minoritaria.
Simultáneamente, se decidió explorar cual podría ser la proporción de parásitos integrados
frente a las demás poblaciones de parásitos, teniendo en mente que si era demasiado baja, un
ensayo de clonación por dilución límite fracasaría. La estrategia usada fue realizar una curva
de calibración con el clon AD y sobre ésta interpolar la señal obtenida a partir de un ADN de
concentración conocida proveniente del cultivo MyoA-KO. Se calculó el tamaño y la masa del
plásmido recombinante (clon AD), el cual fue de 4002 pb y 4,386192 x 10-9 ng
Métodos, resultados y discusión 97
respectivamente, y se prepararon las diluciones estimadas con valores que estuvieron entre
1 y 1x104 copias del plásmido.
Figura 4-41. Estimación de la proporción de parásitos con integración en el cultivo MyoA-KO
En la figura 4-41 se puede apreciar que la intensidad de la señal correspondiente a 100 ng de
ADN proveniente de un cultivo MyoA-KO (flecha roja) tiene la misma intensidad que la señal
del clon AD correspondiente a 156 copias (flecha negra). Teniendo en cuenta que la masa de
un genoma de P. falciparum es de 2,50477 x 10-5 ng (25 fg) podemos decir que en 100 ng de
ADN hay alrededor de 3.992.378 genomas. De lo anterior se concluye que en el cultivo MyoA-
KO se tiene aproximadamente 1 parásito que integró el constructo por cada 25592 parásitos
que no tuvieron integración. Estas cifras indicaron que la clonación por dilución límite no era
una opción viable.
4.4.2.2.2 Ensayos RT-PCR y WB
Aunque se quería explorar si el gen pfmyo-a se transcribe y si la proteína se expresa en
parásitos MyoA-KO, los resultados previos mostraron que en este cultivo los parásitos con
integración constituyen una población minoritaria frente a los parásitos silvestres. Al realizar
RT-PCR y WB, evidentemente no hubo diferencia alguna entre el cultivo KO y el cultivo
silvestre al analizar el transcrito pfmyo-a y la expresión de la proteína PfMyoA.
1500
1000
500
MW 1e4 5e3 2500 1250 625 H2O
MW 312 156 76 50ng 100ng H2O
1500
1000
500
Número de copias Número de copias en 100 ng
Genomas de
P.falciparum
3.992.378
De acuerdo con la intensidad de las
bandas mostradas en el gel, la intensidad
de la banda correspondiente a 156 copias
es muy similar a la señal obtenida a partir
de 100 ng de ADNg del cultivo MyoA-KO,
así 156 copias del clon AD están en
3.992.378 parásitos, entonces por cada
25.592 parásitos silvestres hay 1 parásito
integrado
98 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-42. RT-PCR y WB sobre cultivo MyoA-KO
A. RT-PCR con iniciadores que amplifican una parte del dominio de cabeza, la flecha negra señala la
banda obtenida a partir de ADNc proveniente de parásitos MyoA-KO; ADNc de 3D7 se usó como
control. B. WB con anti-MyoA, la flecha negra señala la banda correspondiente a PfMyoA tanto en la
cepa silvestre como en parásitos MyoA-KO.
En cuanto al cultivo MyoA-C, también se presentaron fluctuaciones en la positividad de la
PCR diagnóstica durante los 3 ciclos de selección; sin embargo, a partir del tercer ciclo sin
WR99210, y de ahí en adelante, todos los rastreos con PCR convencional fueron positivos
para integración 5’ y 3’ con señales muy fuertes (figura 4-43). La señal para el gen endógeno
fue muy tenue y la señal para el ADN episomal fue intensa, resultados que en conjunto
indican que la mayoría de parásitos presentes en el cultivo integraron el constructo control y
que estos parásitos además albergan el plásmido como un episoma. La presencia de
integración en los cultivos MyoA-C demuestra que la metodología realizada a lo largo de todo
el proceso de obtención de los parásitos “knock-out” fue adecuada, ya que hubo integración
del plásmido en el genoma del parásito y dicha integración no lo afectó.
ADNc: 1427 pb - ADNg: 1811pbIniciadores para MyoA (D. cabeza)
2000150012001000
23
MW 3D7 AKO 3D7 AKO
MyoA100
70
55
40
35
A. B.
ADNc
Métodos, resultados y discusión 99
Figura 4-43. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-C
El constructo pHH1-MyoAC se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles AC de
las PCR realizadas con los iniciadores A-D y C-W; se observa una señal muy tenue para ADNg y una
muy intensa para ADN episomal. Estos resultados sugieren que la gran mayoría de parásitos
integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN episomal.
4.4.2.3 Evaluación de parásitos MyoB-KO y MyoB-C
4.4.2.3.1 PCR diagnóstica
La primera PCR diagnóstica para detectar integración en los parásitos MyoB-C y MyoB-KO
fue negativa y se realizó a los 22 y a los 16 días (respectivamente) después de observar las
primeras formas asexuales en cultivo. Para MyoB-KO, la primera PCR positiva para
integración se evidenció en parásitos recolectados durante el segundo ciclo sin WR99210 y
de ahí en adelante se mantuvo positiva. Interesantemente, no se observó señal para ADN
genómico, mientras que para el ADN episomal se obtuvo una banda intensa (figura 4-44). A
diferencia de los parásitos MyoA-KO, el rastreo de la integración en los parásitos MyoB-KO
siempre se hizo mediante una sola ronda de amplificación, obteniéndose siempre bandas
intensas.
1500
1000
500
24
ADNg Integración Integración ADNe5’ 3’
Controles Negativos 1272pb 1246 pb 1120 pb 1178 pbA-W A-D C-W C-D A-W A-D C-W C-D H20 H20 H20 H20 L AC 3D7 AC 3D7 AC 3D7 AC 3D7
100 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-44. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-KO
El constructo pHH1-MyoBKO se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles BKO
de las PCR Y-D y C-B correspondientes a la integración 5’ y 3’, respectivamente; no se observa señal
para ADNg, mientras que la señal para el ADNe es muy intensa. Estos resultados sugieren que la
totalidad de los parásitos integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN
episomal.
Para los parásitos MyoB-C, inicialmente se observaron fluctuaciones en la positividad de la
PCR para integración, es decir algunas veces fue positiva y otras negativa. A partir del tercer
ciclo con WR99210, la PCR siempre fue positiva para integración 5’ y 3’. Al igual que los
parásitos MyoB-KO, la banda obtenida en la PCR para ADN episomal fue intensa y no se
detectó señal para ADNg (figura 4-45). Estos resultados sugieren que el constructo se integró
en la mayoría de parásitos y que el plásmido recombinante permanece dentro de éstos.
pb
1500
1000
500
ADNg Integración Integración ADNepisomal
1198pb 5’ 1071pb 3’ 1242pb 1115pb
Y-B Y-D C-B C-D Y-B Y-D C-B C-D H20 H20 H20 H20 L BKO 3D7 BKO 3D7 BKO 3D7 BKO 3D7
Métodos, resultados y discusión 101
Figura 4-45. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-C
El constructo pHH1-MyoBC se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles BC de
las PCR E-D y C-G correspondientes a la integración 5’ y 3’, respectivamente; no se observa señal para
ADNg, mientras que la señal para el ADNe es muy intensa. Estos resultados sugieren que la totalidad
de los parásitos integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN episomal.
4.4.2.3.2 Ensayos adicionales de PCR
Para confirmar los resultados previos de la PCR diagnóstica (los cuales indicaban que no
había parásitos silvestres), se hizo una PCR con mayor cantidad de plantilla, seguida de una
PCR semianidada. Para esto, 50 y 100 ng de ADN fueron usados en una primera reacción de
PCR, cuyos productos fueron usados como plantilla en una segunda reacción de
amplificación. En el panel izquierdo de la figura 4-46 se muestra que al usar los iniciadores Y-
B, aparece una señal muy tenue en el carril donde se usaron 100 ng de ADN, mientras que no
hay señal en el carril donde se usaron 50 ng. Con el amplicon obtenido en esta PCR se hizo
una PCR semi-anidada utilizando un iniciador que se ubica dentro de la secuencia
amplificada (H2F-B) (Anexo F), resultado que se muestra en el panel derecho de la figura 4-
46, en donde se aprecia amplificación en el tamaño esperado. Estos resultados ponen de
manifiesto que en el cultivo MyoB-KO existe una pequeña población de parásitos silvestres,
pero la gran mayoría de parásitos integraron el constructo.
1500
1000
500
ADNg Integración Integración ADNe
5’ 3’1294pb 1211pb 1184pb 1101pb
E-G E-D C-G C-D E-G E-D C-G C-DH20 H20 H20 H20 L BC 3D7 BC 3D7 BC 3D7 BC 3D7
25
102 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-46. PCR semi-anidada para
comprobar ausencia de parásitos
silvestres (ADNg) en el cultivo MyoB-
KO
PCR Universal con 50 y 100 ng de
plantilla (ADN de parásitos MyoB-KO): se
observa una banda muy tenue en el carril
de 100 ng. PCR semianidada usando
como plantilla el amplicón obtenido en la
PCR universal: se observa señal para
Pfmyo-b endógeno, sugiriendo la
presencia de una población minoritaria
de parásitos silvestres (parásitos donde
no hubo recombinación).
4.4.2.3.3 Ensayos RT-PCR (retrotranscripción reversa-PCR)
Para establecer si el gen truncado pfmyo-b presente en los parásitos que integraron el
constructo “knock-out” se transcribe, se hizo RT-PCR a partir del ARNm extraído del cultivo
MyoB-KO. Como control de la RT-PCR se utilizó ARNm proveniente de cultivos MyoB-C y de
parásitos P. falciparum cepa 3D7. Se utilizaron dos parejas de iniciadores, una que amplifica
un segmento del gen que codifica parte del dominio de cabeza de PfMyoB (H1F-H1R) y otra,
que amplifica un fragmento del gen que codifica la parte final del dominio de cabeza y el
dominio de cola (E-Tail) (Anexo F). En la figura 4-47 se presentan los resultados de la PCR
para ambas parejas de iniciadores, en los cuales se aprecia una banda tenue en el carril del
“knock-out” y señales intensas tanto en el control del “knock-out” como en la cepa 3D7.
Nótese que en ambas PCR la señal para MyoB-KO es tenue y no se observan diferencias en su
intensidad.
La señal tenue observada en el cultivo “knock-out” sugiere que el gen se transcribe; sin
embargo, hay que tener en cuenta, por un lado, la presencia de una población minoritaria de
parásitos silvestres en el cultivo y por otro, el tipo de ADN que puede amplificar cada pareja
de iniciadores. La pareja H1F-H1R amplifica ADNg y ADN de los parásitos donde hubo
integración (parásitos MyoB-KO), mientras que la pareja E-Tail solo puede amplificar ADNg
(Anexo F). Siendo similar la intensidad de la señal en ambas PCR, este resultado sugiere que
la amplificación observada proviene de la misma plantilla, es decir del ADNg de los parásitos
Métodos, resultados y discusión 103
que no integraron el constructo. Así, si realmente el gen truncado se transcribiera se
esperaría ver una señal fuerte con la primera pareja de iniciadores, ya que ésta dispondría de
otra plantilla (ADN de parásitos MyoB-KO). En conjunto estos resultados sugieren que el gen
truncado no se transcribe y que la leve señal observada en el carril BKO proviene de la
población minoritaria de parásitos que conservan el gen endógeno sin alteraciones. Sin
embargo, para poder tener absoluta certeza de si el gen truncado se transcribe o no, es
necesario obtener líneas clonales donde todos los parásitos tengan el mismo genoma.
Figura 4-47. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar pfmyo-b
A partir de ADNc proveniente de parásitos MyoB-KO, MyoB-C y 3D7 se hizo RT-PCR con dos parejas de
iniciadores distintas que amplifican diferentes regiones del gen PfMyoB. En ambas PCR se observa una
señal tenue en el carril donde se cargaron los parásitos “knock-out”.
Para corroborar que la señal tenue previamente obtenida en la RT-PCR no tenía que ver con
la calidad del ADNc, se amplificaron otros genes como hrp2 y gap50. Los resultados para
ambos genes muestran bandas de igual intensidad para todos los ADNc probados (figura 4-
48). Este resultado confirma que la señal tenue obtenida para los parásitos MyoB-KO no es
un artefacto ni se debe a mala calidad de la plantilla.
26
ADNc ADNcL H2O BKO BC 3D7 H2O L BKO BC 3D7
Iniciadores B-cabeza Iniciadores B-cola1039 pb 656pb
1500
1000
500
15001000
500
104 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-48. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar los genes hrp2 y
gap50
RT-PCR con iniciadores para amplificar el gen hrp2 (gel de la izquierda) y el gen gap50 (gel de la
derecha), usando como plantilla ADNc proveniente de parásitos MyoA-KO, MyoB-KO, MyoB-C y 3D7.
En el último carril se colocó ADNg de la cepa 3D7.
Con base en los resultados de la PCR diagnóstica y la RT-PCR, los cuales evidencian la
presencia de una población minoritaria de parásitos silvestres en el cultivo MyoB-KO, con el
propósito de eliminar aquellos parásitos que no integraron el constructo o que no lo
albergaron como un episoma, los parásitos fueron cultivados en adelante e
ininterrumpidamente en presencia de medio con WR99210. A partir de este nuevo cultivo,
permanentemente presionado con el medicamento, se hizo extracción de ADN y ARNm y se
volvieron a hacer los dos ensayos. Para la PCR se utilizaron los mismos iniciadores
(cebadores de la PCR diagnóstica) y para la RT-PCR además de la pareja 1 (H1F-H1R), se
utilizó otra que amplifica un fragmento similar, pero que se ubica un poco más abajo en la
secuencia de PfMyoB (H2F-H2R). Al igual que los iniciadores denominados B cola, esta
segunda pareja no puede amplificar el “knock-out”, pues el gen está truncado y el cebador
antisentido ya no encuentra un segmento complementario para anillarse. En la figura 4-49A
se observa la ausencia de señal para ADNg en la PCR semi-anidada, al igual que la ausencia de
señal en la RT-PCR (figura 4-49B). Estos resultados permiten afirmar que la adición continua
e ininterrumpida del antifolato eliminó la población de parásitos silvestres y que el gen
pfmyo-b truncado no se transcribe.
ADNc ADNg ADNc ADNgH2O L AKO BKO BC 3D7 3D7 H2O L AKO BKO BC 3D7 3D7
hrp2 - 816 pb gap50 - 468 pb
1500
1000
500
1500
1000
500
Métodos, resultados y discusión 105
Figura 4-49. PCR diagnóstica y RT-PCR sobre parásitos MyoB-KO
PCR y RT-PCR usando ADNg y ADNc a partir de parásitos MyoB-KO cultivados con medio completo
adicionado con WR99210 ininterrumpidamente. A. Para la PCR semi-anidada se usó como plantilla el
posible amplificado de la PCR denominada ADN genómico carril BKO y como control de la
amplificación ADNg de la cepa 3D7. No se observó señal en ninguno de los carriles de la PCR semi-
anidada, en los cuales se utilizaron diferentes volúmenes de plantilla (entre 0,5 y 5 µL). B. En la RT-
PCR no se observa señal de amplificación en los carriles BKO con ninguna de las dos parejas de
iniciadores usadas. Como control de la reacción se utilizó ADNc de parásitos MyoB-C, en los cuales se
genera una copia funcional del gen pfmyo-b luego de la integración del constructo y ADNc de la cepa
silvestre 3D7.
4.4.2.3.4 Ensayos de WB
Para comprobar que la integración del constructo en el gen endógeno causó el silenciamiento
del gen y por tanto no hay expresión de PfMyoB, se hicieron ensayos WB sobre extractos
proteicos del parásito en estadio de esquizonte con el anticuerpo anti-MyoB P2 y revelado
con quimioluminiscencia. Como control se utilizaron parásitos silvestres cepa 3D7. En la
figura 4-50 se muestran los resultados del WB donde claramente se observa señal a la altura
esperada para PfMyoB en los parásitos silvestres y ausencia de señal en los parásitos “knock-
out”.
Los resultados hasta aquí presentados permiten afirmar que se produjo la integración del
constructo “knock-out” pHH1-BKO en el parásito y que esta integración causó el
silenciamiento del gen, lo cual provocó la no expresión de la proteína, es decir se obtuvieron
parásitos P. falciparum “knock-out” para el gen de la miosina B.
Integración3´
1242 pb
30002000150012001000
500
ADN Genómico1198 pb
Integración5´
1071 pb
5 2 1 0,5 M 0,5 1 CN (µl)
ADN genómico
BKO
ADNg3D7
M 3D7 CN BKO M 3D7 CN BKO M 3D7 CN BKO
RT-PCR
PCR universal
Iniciadores H2F-B 1176 pb
ADNc ADNc
H2O BKO BC 3D7 M H2O BKO BC
PCR semi-anidada
Iniciadores IniciadoresH1F-H1R H2F-H2R1039 pb 934 pb
1500
1000
500
A.
B.
106 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Figura 4-50. WB para comprobar ausencia de expresión de PfMyoB en parásitos MyoB-KO
WB sobre extractos de parásitos 3D7 (silvestre) y MyoB-KO con anti-MTIP P2. En el carril de los
parásitos “knock-out” no se observa señal, mientas que en el carril de los parásitos silvestres la señal es
intensa. La gráfica inferior muestra la región que reconoce el anticuerpo, la cual no está presente en
PfMyoB de los parásitos noqueados.
4.4.2.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos MyoB-KO en cultivo
Parásitos MyoB-KO y MyoB-C fueron mantenidos en cultivo a un hematocrito del 2% por 7
días consecutivos sin adición de glóbulos rojos y alimentándolos diariamente con medio de
selección. Todos los días se hicieron extendidos de los cultivos, recuento de las parasitemias
y observación minuciosa de la morfología de los parásitos. Con los datos de los recuentos de
cada cultivo se estimó el porcentaje de invasión en cada ciclo, interpretado como el número
de anillos encontrados después de la invasión con respecto al número de esquizontes y
trofozoitos maduros vistos el día anterior. En la figura 4-51a se muestra el comportamiento
de la invasión en el cultivo “knock-out” y control y se observa que en ambos fue similar y que
no hubo diferencias significativas, lo que sugiere que el silenciamiento del gen pfmyo-b no
altera el proceso de invasión. Interesantemente, se observó que en el cultivo MyoB-KO un
número importante de parásitos en estadio de anillo no logró pasar al estadio de trofozoito y
BKO 3D7 MW
kDa
130
100
70
55
40
MW 3D7 BKO 3D7 BKO
Extracto BKO: 35 µg/carrilExtracto 3D7: 35 µg/carril
Myo B
1 aa ATG 597 Stop prematuro 801
MyoB-KO
Anti-MyoBP2 (conejo)Dirigido contra péptido 720-733 aa
B
Métodos, resultados y discusión 107
esta disminución paulatina de los parásitos redujo notablemente la parasitemia durante los 7
días de cultivo (figura 4-51b).
Figura 4-51. Comportamiento de parásitos MyoB-KO y MyoB-C durante el proceso de invasión y
de maduración
En las figuras A y B se muestra el comportamiento de los parásitos durante tres ciclos de
invasión. Los datos corresponden a tres experimentos independientes.
Los parásitos que no lograron avanzar a trofozoítos experimentaron cambios en su
morfología tornándose pequeños y poco a poco se compactaron (figura 4-52). En todos los
recuentos del cultivo “knock-out” el número de trofozoitos siempre fue menor comparado
con el número de anillos del día anterior. Estos resultados preliminares parecen indicar que
la deficiencia de PfMyoB afecta el crecimiento del parásito causándole la muerte pero no
afecta al parásito que está próximo a invadir.
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
BKO BCNú
me
ro d
e v
ece
s q
ue
in
va
dió
el
cu
ltiv
o
Comparación entre el número de veces que invadió el cultivo
MyoB-KO versus el cultivo
MyoB-Control
0
20
40
60
80
100
120
BKO BC
Po
rce
nta
je
Porcentaje de maduraciónB.A.
108 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Métodos, resultados y discusión 109
Figura 4-52. Morfología de los parásitos MyoB-C y MyoB-KO en cultivo
En el panel superior de imágenes se muestra la morfología de parásitos en estadio de anillos
(0-30 horas), en el panel central parásitos en estadio de esquizonte maduros (44-48 horas) y
en el panel inferior parásitos en estadio de trofozoíto (32-40 h). En los 3 paneles la fila
superior corresponde a parásitos MyoB-C (fila superior) mientras que la/las fila(s) inferior
corresponde a parásitos MyoB-KO. Estos parásitos fueron mantenidos en cultivo con medio
completo suplementado con WR99210.
4.4.2.5 Localización de MTIP en parásitos MyoB-KO
Para explorar si la ausencia de PfMyoB conlleva a algún cambio en la localización de MTIP, se
realizaron ensayos de IF con anti-MTIP ratón y anti-MTIP conejo en parásitos “knock-out” y
parásitos silvestres 3D7. En la figura 4-53 se presentan las imágenes de la IF sobre
esquizontes MyoB-KO y esquizontes de la cepa 3D7 y se observó que MTIP se localiza en la
periferia de los merozoítos bordeando el cuerpo de los mismos y que este patrón es igual en
parásitos “knock-out” y en parásitos silvestres.
110 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Esquizontes de P. falciparum procedentes de un cultivo MyoB-KO
Métodos, resultados y discusión 111
Esquizontes de P. falciparum procedentes de un cultivo silvestre (cepa 3D7)
Figura 4-53. IF con anticuerpo anti-MTIP sobre esquizontes de P.falciparum
En el panel superior se muestran esquizontes de parásitos MyoB-KO y en el panel inferior parásitos
silvestres 3D7
4.4.3 Discusión
Con el fin de explorar el posible papel funcional de PfMyoB en el proceso de invasión del
merozoíto al eritrocito, se utilizó la genética reversa para intentar silenciar los genes pfmyo-
a y pfmyo-b mediante recombinación homóloga sencilla utilizando el plásmido de
transfección pHH1. Los resultados obtenidos en este trabajo evidenciaron que el gen pfmyo-
a no es un gen refractario a la deleción genética, sino que puede sufrir eventos de
recombinación homóloga, como se demostró por la integración del constructo control y del
constructo “knock-out” en el gen endógeno. Sin embargo, y a la luz de la evidencia
experimental obtenida, se observó que los parásitos transfectados con el constructo “knock-
112 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
out” se comportaron distinto a los parásitos transfectados con el constructo control, mientras
que en el primer cultivo los parásitos con integración fueron escasos (PCR positiva para
integración 5’ y 3’ intermitente y con bandas débiles), en el segundo los parásitos con
integración fueron abundantes (PCR positiva para integración 5’ y 3’ todo el tiempo con
bandas intensas). Es importante al analizar este resultado tener en mente que a lo largo de
todo el proceso de transfección pudo ocurrir un problema técnico con el procedimiento de
electroporación y manejo de cultivos que provocara daño al parásito; sin embargo, este
aspecto pierde validez ya que se usó un constructo control que se procesó bajo las mismas
condiciones del constructo “knock-out”; en estos cultivos la población de parásitos MyoA-C
fue la más abundante con señales muy fuertes para integración 5’ y 3’ y con un población
minoritaria de parásitos silvestres. Estos cultivos crecieron normalmente y los parásitos no
mostraron cambios en su morfología. Con base en los resultados obtenidos se propone que la
alteración que sufre el gen pfmyo-a causa un efecto perjudicial sobre el parásito (muy pocos
parásitos integrados y muchos parásitos silvestres con episoma); sin embargo, no es posible
establecer si el efecto es nocivo (afecta al parásito sin causarle la muerte) o es letal (mata al
parásito). Se sugieren dos posibles hipótesis para tratar de explicar qué ocurrió con los
parásitos que integraron el constructo “knock-out”: 1) los parásitos PfMyoA-KO continúan
invadiendo pero con una eficiencia mucho menor, por lo tanto las nuevas generaciones de
parásitos con integración es muy baja y no incrementa con el tiempo y 2) Una vez el
constructo “knock-out” se integra en el gen blanco los parásitos mueren; sin embargo,
teniendo en cuenta que los parásitos mantienen el plásmido replicando episomalmente, en
éstos es posible que se lleven a cabo nuevos eventos de integración generando una PCR
positiva para integración 5’ y 3’ con fluctuaciones de la positividad en el tiempo. En este caso
la inmensa mayoría de los parásitos presentes en cultivo son parásitos silvestres con
episoma, ya que la integración del constructo es letal para el parásito.
El vector utilizado en este trabajo está diseñado para hacer recombinación homóloga sencilla
con el gen endógeno y de esta forma truncar el gen. Sin embargo, esta metodología tiene dos
desventajas, una es la integración del esqueleto del plásmido en la copia cromosomal de la
secuencia blanco y dos, debido a que el ADN que se integra viene desde un plásmido circular,
todas las poblaciones de parásitos en las que hay integración exitosa, contienen tanto
parásitos con el plásmido integrado como parásitos con el plásmido como un episoma
(Gardiner et al., 2003). Lo anterior implica que si la integración confiere un fenotipo nocivo,
Métodos, resultados y discusión 113
aunque no letal, es imposible separar parásitos con formas integradas del plásmido, de
parásitos que únicamente alberguen el plásmido como un episoma, ya que estos últimos
crecerán mucho más rápido que las formas integradas (Crabb, 2002). Debido a las
limitaciones del sistema usado, no es posible establecer con certeza cuál es el efecto que
causa la integración del constructo “knock-out”, es decir si es nocivo o si es letal, y en ninguno
de los dos casos sería posible obtener una línea clonal, ya que en el primer caso, dependiendo
de lo severo que resulte el defecto, la población “knock out” crecerá muy lentamente con
respecto a una población silvestre con episoma, lo que conlleva a la generación de
poblaciones de parásitos con enormes diferencias en la proporción de cada una de ellas en
cultivo. Por otro lado, si la alteración del gen es letal, no será posible obtener una población
de parásitos vivos que tengan el gen pfmyo-a truncado.
Aunque con la estrategia utilizada sólo se pueden generar parásitos “knock-out” de genes que
no sean indispensables para el parásito, los resultados obtenidos no nos permiten concluir
que el gen pfmyo-a es un gen esencial para el parásito. Para poder establecer lo anterior es
necesario utilizar otro tipo de metodología, como podría ser un sistema condicional que
permita la generación eficiente de mutantes “knock-out” condicionales en los que se pueda
estudiar claramente el fenotipo sin tener la expresión de fondo del gen endógeno (Collins et
al., 2013).
Conocer con exactitud el efecto del silenciamiento del gen pfmyo-a, permitiría sugerir la
existencia en Plasmodium de un “glideosoma” alterno con una miosina distinta a PfMyoA. La
obtención de parásitos noqueados para pfmyo-a ayudaría a establecer si en ausencia de
MyoA, ésta puede ser reemplazada por PfMyoB a través de un mecanismo diferente al del
“glideosoma” tradicional, teniendo en cuenta que ésta no interactúa con MTIP y que de
acuerdo con Yusuf y colaboradores, MyoB utiliza otra cadena liviana (Yusuf et al., 2015).
Adicionalmente, la localización de MTIP no se alteró en parásitos “knock-out” para pfmyo-b,
reforzando la idea que estas dos proteínas no interactúan. Sin embargo, no se descartaría la
posibilidad que PfMyoB pueda reemplazar a PfMyoA, teniendo en cuenta que los resultados
de estudios in sílico e in vitro de Hernández y colaboradores mostraron que PfMyoB puede
unirse a MTIP (Hernández et al., 2017; Hernández et al., 2018).
Con respecto al gen pfmyo-b, tanto el constructo control como el constructo “knock-out” se
integraron en el gen endógeno mediante recombinación homóloga. La integración del
constructo pHH1-BKO en el genoma del parásito fue estable, es decir una vez se detectó se
114 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
mantuvo por periodos tan largos como 12 meses, y a diferencia de la integración del
constructo pHH1-AKO su rastreo se hizo mediante PCR convencional, obteniéndose siempre
bandas intensas. Además, a diferencia de los cultivos MyoA-KO, en los MyoB-KO no se detectó
ADN genómico cuando los cultivos fueron mantenidos con medio adicionado con WR99210,
lo cual sugiere que la población total de parásitos integró el plásmido. Para establecer si
luego de la integración del constructo “knock-out” el gen pfmyo-b endógeno fue silenciado, se
hicieron ensayos RT-PCR para establecer si el gen se transcribe y ensayos WB para
determinar si la proteína se expresa. Ambos ensayos evidenciaron respectivamente que el
gen no se transcribe y que la proteína no se expresa, resultados que permiten afirmar que el
gen pfmyo-b fue silenciado y que se lograron obtener parásitos P. falciparum “knock-out” de
MyoB. Para explorar sobre la función de PfMyoB, cultivos MyoB-KO y MyoB-C se crecieron en
presencia de WR99210 durante 7 días y se observó que en los parásitos MyoB-KO la mayoría
de anillos no logran avanzar al estadio de trofozoíto y que los pocos que avanzaron y llegaron
a esquizonte, aparentemente contienen merozoítos sanos con capacidad para invadir nuevos
glóbulos rojos en un proceso de invasión normal. La ausencia de PfMyoB produjo grandes
efectos en la maduración del parásito causándole la muerte y aunque se evidenció una
reducción significativa de la parasitemia con respecto al cultivo control, no se observó el
mismo efecto que en el caso de MyoA-KO. Estas observaciones sugieren que la miosina B no
está involucrada en el proceso de invasión sino en el desarrollo del parásito, específicamente
en el paso de anillo a trofozoíto. En conjunto estos hallazgos sugieren que PfMyoB puede
estar siendo reemplazada por otra miosina que compensa su función y por lo tanto pfmyo-b
no sería un gen esencial para el parásito.
La transfección de parásitos Plasmodium falciparum solo se ha logrado con la introducción de
ADNp circular no digerido y hasta ahora no se conocen las razones de este requerimiento. En
términos generales, una vez los plásmidos ingresan a la célula blanco y bajo presión de
selección, éstos replican episomalmente como concatámeros que segregan inestablemente,
para posteriormente integrarse en el genoma del parásito por recombinación con las
secuencias blanco. Aunque la replicación de los plásmidos parece ser eficiente, estas formas
no se segregan igualmente entre todos los merozoitos hijos, por lo tanto los plásmidos
episomales se pierden en algunos parásitos, generando parásitos silvestres, cuando el
Métodos, resultados y discusión 115
medicamento se retira (Crabb 2002). En este trabajo los parásitos de los 4 cultivos (A-KO, A-
C, B-KO y B-C) siempre mostraron la presencia de abundantes episomas, aún después de los
diferentes periodos de ausencia de presión con WR99210. O`Donnell y col. (2001) reportaron
que los plásmidos transfectados pueden cambiar a formas replicantes estables (SRF), las
cuales son mantenidas episomalmente en la ausencia de medicamento. Un SRF es un
concatámero grande constituido por al menos 9 plásmidos organizados en un arreglo cabeza
a cola. Aunque los autores sugieren que la formación de estos particulares concatámeros se
presenta especialmente cuando la integración del constructo no se produce, es probable que
los plásmidos de los 4 cultivos hayan adoptado esta nueva conformación y esto explicaría su
presencia abundante y duradera aun en ausencia de medicamento. Aunque la formación de
estas estructuras es posible, es necesario obtener evidencia experimental que nos permita
corroborar la formación de éstas.
Aunque no se mencionó en el texto, previo a los resultados reportados en este trabajo se
realizaron transfecciones mediante electroporación de glóbulos rojos infectados con
parásitos en estadio de anillos. Este procedimiento no funcionó como se corroboró luego de
mantener cultivos post- transfección por alrededor de 50 días, en los cuales nunca
aparecieron parásitos. La introducción de ADN exógeno mediante el método de eritrocitos
precargados fue muy eficiente, como se pudo comprobar en este estudio y como ha sido
reportado por Hasenkamp y col. (2013) y Deitsch y col. (2001), quienes aseguran que el éxito
radica en evitar la aplicación de pulsos eléctricos a los glóbulos rojos parasitados. Con este
método se ha visto que la eficiencia de la transfección mejora alrededor de 180 veces.
4.5 Identificación de potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas informáticas
4.5.1 Métodos
4.5.1.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con modelos ocultos de Markov (HMM)
Se tomaron 57 secuencias de motivos IQ (PFAM: PF00612) de Apicomplexa desde la base de
datos de PFAM, y se construyó el modelo HMM mediante la herramienta bioinformática HMM
3.0. Para refinar el modelo de búsqueda, se incluyeron también 70 secuencias de motivos IQ
116 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
pertenecientes a la base de datos: Calmodulina Target Database
(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/).
4.5.1.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares
A partir del patrón IQ, [FILV]Qxxx[RK]Gxxx[RK], reportado por Rhoads y Friedberg (1997),
se hizo la comparación manual de cada una de las posiciones utilizando como punto de
referencia los cambios observados en los alineamientos de 70 secuencias de motivos IQ de la
base de datos “Calmodulina Target Database”
(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/) y los alineamientos de 84 secuencias
pertenecientes a los 6 motivos IQ de las miosinas clase V de algunos organismos eucariotas
(Terrak et al., 2005).
4.5.2 Resultados
4.5.2.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con HMM
La búsqueda identificó cinco motivos IQ en la miosina C (PfMyoC) y 2 motivos IQ en la
miosina F (PfMyoF). En la tabla 4-3 se muestran las secuencias de los motivos IQ encontrados
con el modelo HMM (desde la posición 915 hasta la posición 1052 en PfMyoC y desde la
posición 1297 hasta la posición 1381 en PfMyoF), así como los señalados por las interfaces
SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) y MyHits (http://myhits.isb-sib.ch/). Se puede
ver que el modelo HMM construido identifica (al igual que las anteriores interfaces de
búsqueda) motivos IQ en dos de las seis miosinas de P. falciparum; sin embargo, encuentra
un motivo IQ adicional en PfMyoC y otro en PfMyoF. Para PfMyoB no se encontró ningún
motivo IQ con esta herramienta.
Métodos, resultados y discusión 117
Miosinas Secuencias IQ identificadas
Con HMM Con SMART y MyHits
PfMyoC
IQKNYKTYTQK
IQSHIRRYLMV
IQATWKAYKEH
IQLKWKSILAR
IQRWFRNRLNI
IQKNYKTYTQK
IQSHIRRYLMV
IQATWKAYKEH
IQLKWKSILAR
PfMyoF IQKNYRTYILR
IQRAFKKYMKK
IQKNYRTYILR
Tabla 4-3. Motivos IQ identificados en las miosinas de Plasmodium falciparum con el modelo
HMM
Secuencias de motivos IQ encontradas en las miosinas C y F con el modelo HMM construido y con las
interfaces de búsqueda de dominios y motivos. En negrilla se indica el motivo IQ adicional encontrado
con el perfil construido.
4.5.2.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares
A partir del patrón IQ, [FILV]Qxxx[RK]Gxxx[RK], reportado por Rhoads y Friedberg (1997),
se hizo la comparación manual de cada una de las posiciones utilizando como punto de
referencia los cambios observados en los alineamientos de 70 secuencias de motivos IQ de la
base de datos de “Calmodulina Target. Database”
(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/) y los alineamientos de 84 secuencias
pertenecientes a los 6 motivos IQ de las miosinas clase V de algunos organismos eucariotas
(Terrak et al., 2005). Inicialmente los cambios de aminoácidos encontrados en las posiciones
1, 6 y 11 de los alineamientos fueron tomados en cuenta para la construcción de la expresión
regular. Adicionalmente, las posiciones 1 y 11 de la expresión regular se complementaron
con algunos aminoácidos variables que el HMM había identificado, y con residuos
pertenecientes a los de motivos IQ de la miosina A de P. falciparum y T. gondii. Finalmente,
con la expresión regular generada se hizo la búsqueda de motivos IQ en las miosinas de P.
falciparum, utilizando ScanProsite desde la interface de PROSITE
(http://prosite.expasy.org/) y desde un entorno no gráfico con un script específico de
búsqueda (scan_for_matches -p patron <Secuencias\mioPlasmodium.txt). Con el fin de
constatar la veracidad del modelo de búsqueda, se utilizó este mismo patrón para identificar
motivos IQ conocidos en las miosinas de T. gondii.
118 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
La búsqueda con la expresión regular [FLIVMAC]-Q-X(3)-[RK]-[GAKMQRSTVLND]-X(3)-
[RKVFQLTSADHI] sobre las miosinas de P. falciparum, identificó 17 motivos IQ, de los cuales
solo cinco habían sido identificados anteriormente por las interfaces de búsqueda de
dominios y motivos. En otras palabras, la búsqueda con la expresión regular generada
identificó motivos IQ que para el momento en que se hizo el análisis no habían sido
reportados para las miosinas del parásito. En la tabla 4-4 aparecen motivos IQ encontrados
con las diferentes metodologías de búsqueda.
Miosinas de P. falciparum
Interfaces de búsqueda
Modelo HMM Expresión regular
PfMyoA - - IQ1: VQAHIRKKMVA
PfMyoB - - IQ1: AQAYFRKYKYI
PfMyoC IQ1: IQKNYKTYTQK
IQ2: IQSHIRRYLMV
IQ3: IQATWKAYKEH
IQ4: IQLKWKSILAR
IQ1: IQKNYKTYTQK
IQ2: IQSHIRRYLMV
IQ3: IQATWKAYKEH
IQ4: IQLKWKSILAR
IQ5: IQRWFRNRLNI
IQ1: IQKNYKTYTQK
IQ2: IQSHIRRYLMV
IQ3: IQATWKAYKEH
IQ4: IQLKWKSILAR
IQ5: IQRWFRNRLNI
IQ6: IQNSNKKNQQI
PfMyoD - - IQ1: IQGDEKKKEIR
IQ2: IQSDEKNVPTT
IQ3: LQNKDKTINKL
PfMyoE - - IQ1: VQKKKKKKKRR
IQ2: AQNKNKKYNIL
PfMyoF IQ1: IQKNYRTYILR
IQ1: IQKNYRTYILR
IQ2: IQRAFKKYMKK
IQ1: IQKNYRTYILR
IQ2: IQRAFKKYMKK
IQ3: IQCVYKYWLHI
IQ4: FQKYFKQRVKA
Tabla 4-4. Motivos IQ encontrados con tres estrategias de búsqueda
En negrilla se muestran los motivos IQ encontrados con el modelo HMM creado y la expresión regular
construida
Métodos, resultados y discusión 119
4.5.3 Discusión
Los motivos IQ generalmente forman una alfa hélice anfipática conformada por 20
aminoácidos que conserva un patrón específico (Rhoads y Friedberg, 1997). Sin embargo, en
las miosinas de P. falciparum ese patrón se restringió a solo tres posiciones: la posición 1 con
un aminoácido hidrofóbico, la posición 2 con una glutamina (Q) y la posición 6 con un
aminoácido básico. Estos resultados son similares a los descritos en los estudios de
cristalografía realizados al complejo de la miosina Myo2p (miosina clase V de Saccharomyces
cerevisiae) y la cadena liviana MLc1p, en donde se señalan cinco posiciones esenciales para
reconocer un motivo IQ: 1, 2, 6, 7 y 11 (Bähler y Rhoads, 2002). A pesar de que la posición 11
es una de las que se considera como criterio para señalar un motivo IQ, nuestros resultados
mostraron que este residuo fue el que presentó mayor variación en todas las potenciales
secuencias IQ de las miosinas de P. falciparum.
Notablemente, uno de los motivos IQ identificados por la expresión regular en PfMyoA,
coincidió con la región que interactúa directamente con MTIP en el complejo PfMyoA-MTIP
descrito por cristalografía (Bosch et al., 2007) y en el modelo de docking reportado en 2017
(Hernández et al., 2017). Para PfMyoB, el motivo IQ identificado por la expresión regular
coincidió con la región que interactúa con MTIP en los ensayos de docking (Hernández et al.,
2017). Estos resultados juntos refuerzan la idea que los motivos encontrados con la
expresión regular, pueden en efecto ser IQs funcionales.
5 Discusión general
Plasmodium falciparum posee tres miosinas que pertenecen a la clase XIV y dentro de éstas,
la miosina A y la miosina B comparten numerosas similitudes como ser las miosinas de
menor tamaño, compartir estructuras similares (Hernández et al., 2017), no poseer dominio
de cola y expresar la proteína en los merozoitos presentes en esquizontes tardíos y en
merozoitos libres (Chaparro et al., 2003). Estas semejanzas entre PfMyoB y PfMyoA, esta
última involucrada en la movilidad “gliding” y en la invasión del eritrocito (Pinder et al.,1998;
Jones et al., 2006), sugieren una potencial intervención de PfMyoB en el proceso de invasión.
Adicionalmente, siendo Plasmodium un organismo intracelular obligado, la invasión de
células hospederas es un proceso vital para el parásito, por lo cual no sería insólito que
Plasmodium tuviera dos miosinas funcionalmente redundantes o complementarias, situación
que ya ha sido descrita en Toxoplasma (Frenal et al., 2014; Graindorge et al., 2016).
En T. gondii además del típico glideosoma conducido por TgMyoA (glideosoma-MyoA), se
identificaron dos glideosomas adicionales conducidos por otras miosinas de la clase XIV, las
cuales exhibieron la misma organización y compartieron algunos componentes comunes del
glideosoma-MyoA, pero su distribución espacial fue distinta y restringida a zonas específicas
del parásito. Así, el glideosoma-TgMyoA se localizó en la periferia del parásito en la parte
central del ICM, el glideosoma-TgMyoC en el polo basal (Frénal et al., 2014) y el glideosoma-
TgMyoH en el polo apical, específicamente en el conoide (Graindorge et al., 2016). El
silenciamiento génico de estas miosinas permitió establecer la redundancia funcional
existente entre estas proteínas durante la invasión, así la deleción de TgMyoA (Andenmatten
et al., 2013) condujo a la relocalización de TgMyoC a lo largo de la película, proporcionando
evidencia que TgMyoC puede parcialmente reemplazar a TgMyoA. La deleción de TgMyoC
produjo una caída importante de la invasión (Frénal et al., 2014) y la deleción simultánea de
TgMyoA/B/C (Egarter et al., 2014) fue letal para T. gondii. Lo anterior demostró que TgMyoA
y TgMyoC pueden complementarse una a otra (Frénal et al., 2014). En cuanto al glideosoma
122 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
conducido por TgMyoH, esta miosina es necesaria para el desplazamiento de la unión móvil
desde el polo apical hasta el polo basal del parásito. TgMyoH se localiza en el extremo apical
de los taquizoitos y es esencial, es decir, la deleción de este gen conlleva a la muerte del
parásito. Esta miosina es responsable de iniciar la locomoción “gliding” en el conoide
(Graindorge et al., 2016). A diferencia de T. gondii, hasta el momento no se ha reportado en P.
falciparum la presencia de glideosomas distintos al glideosoma-PfMyoA. Sin embargo, las tres
miosinas de la clase XIV, es decir las miosinas involucradas en el “gliding”, presentan
localizaciones celulares distintas (Wall et al., 2019). Aunque la inmensa mayoría del
conocimiento generado en torno a la función de las miosinas en Apicomplexas proviene de
los estudios realizados en T. gondii, no necesariamente los hallazgos encontrados en este
parásito pueden ser extrapolados en Plasmodium.
Para explorar la hipótesis de la redundancia funcional o la complementariedad entre PfMyoB
y PfMyoA, se produjeron parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-b. En estos parásitos se
abolió la expresión de PfMyoB, lo cual indicó que esta miosina no es esencial para la
supervivencia del parásito. Este mismo hallazgo fue reportado recientemente por Wall y
colaboradores, quienes lograron recuperar parásitos luego del silenciamiento del gen, los
cuales tuvieron un desarrollo normal (Wall et al., 2019). En nuestro estudio, la ausencia de
esta proteína causó alteraciones en el desarrollo del parásito, las cuales fueron evidentes
durante el paso de anillo a trofozoito. Estos parásitos tuvieron una morfología distinta a los
parásitos control, evidenciándose una reducción significativa en el número de parásitos en
estadio de anillo que logra avanzar a trofozoito. En cuanto al estadio de trofozoitos tardíos y
esquizontes no se observaron cambios morfológicos ni diferencias en el porcentaje de
invasión entre los parásitos control y los “knock-out”. Los hallazgos encontrados sugieren que
PfMyoB no está involucrada en el proceso de invasión al glóbulo rojo, con lo cual esta miosina
no tendría una función similar, complementaria o redundante con PfMyoA.
El silenciamiento de PfMyoB no produjo cambios en la localización de MTIP y al evaluar
interacción entre estas dos proteínas mediante IP en parásitos silvestres, no se detectó
interacción. Yusuf y colaboradores reportaron que PfMyoB no interactúa con MTIP y en
cambio interactúa con otra cadena liviana denominada MLC-B (Myosin Light Chain-B) (Yusuf
et al., 2015). Aunque nuestros resultados mostraron que PfMyoB no interactúa con MTIP,
Discusión general 123
esta interpretación debe hacerse con cautela ya que es relevante considerar la presencia de
dos motivos IQ en PfMyoB, los cuales le permiten interactuar in vitro con MTIP (Hernández et
al., 2017; Hernández et al., 2018) y la abundancia de PfMyoA respecto a PfMyoB (Yusuf et al.,
2015).
La localización discreta de PfMyoB en el extremo apical de las formas invasivas de P.
falciparum es muy parecida a la localización de TgMyoH en T. gondi y esta similitud llevó a
pensar que PfMyoB podría tener una función similar, es decir ser el motor que provee la
fuerza para conducir el “gliding” en la zona apical del merozoito, mientras que PfMyoA sería
el motor del “glideosoma” presente en la periferia de los merozoitos. Con base en los
resultados obtenidos en este trabajo, PfMyoB no parece estar implicada en el proceso de
invasión y a diferencia de TgMyoH, PfMyoB no es una miosina esencial.
A pesar del cuerpo de evidencia presentado, el cual nos llevó a sugerir que PfMyoB no
participa en la invasión al eritrocito, es de suma importancia generar parásitos MyoA “knock-
out” para comprobar estas interpretaciones. Solo así, se podría establecer claramente el
papel de PfMyoB y su posible redundancia funcional con PfMyoA. En la actualidad, el estado
del arte respecto al efecto del silenciamiento del gen pfmyo-a en Plasmodium ha permitido
establecer que MyoA tiene un papel esencial en la movilidad “gliding” de ooquinetes de P.
berguei (Siden-Kiamos et al., 2011); sin embargo, aun no hay estudios en P. falciparum y no
se sabe cómo la ausencia de MyoA afecta la invasión de eritrocitos. Para ahondar sobre el rol
funcional de PfMyoB se intentó generar parásitos MyoA “knock-out”, usando el mismo
sistema utilizado para PfMyoB, el cual solo permite la generación de parásitos “knock-out” de
genes que al ser silenciados no causen efectos letales al parásito. A pesar de este
condicionamiento, se logró la integración del constructo MyoA “knock-out” en el gen
endógeno pfmyo-a; sin embargo, no fue posible recuperar esta población de parásitos y por
lo tanto no se logró comprobar si efectivamente se interrumpió la transcripción del gen
pfmyo-a y si se abolió la expresión de la proteína. Hasta la fecha no se ha publicado
información relacionada con el uso exitoso en Plasmodium falciparum de sistemas de
silenciamiento génico que permitan generar mutantes “knock-out” condicionales para MyoA,
a partir de los cuales se pueda obtener una línea clonal para análisis fenotípico y así
determinar el papel de PfMyoA durante la invasión y el “gliding”. Esto deja ver las dificultades
técnicas inherentes al trabajo con Plasmodium falciparum, lo cual está muy relacionado con
124 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
las bajas eficiencias de transfección (10-5 - 10-6) y con el periodo de replicación del plásmido
episomal y la recombinación (Meissner et al., 2007).
6 Conclusiones
Se determinaron las condiciones de tiempo, temperatura y sistema bacteriano en las cuales
se obtiene la mayor expresión de las proteínas recombinantes GST-GAP451-204, GST-MTIP1-204,
GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502.
Se produjeron 4 anticuerpos contra las proteínas del “glideosoma”: MyoA, MTIP, GAP45 y
GAP50, a partir de las recombinantes generadas. Estos anticuerpos reconocieron las
proteínas de forma específica y fueron utilizados en diferentes tipos de ensayos como WB, IF
e IP.
MTIP interactúa con MyoA, como ya ha sido previamente reportado, pero evidenció no
interactuar con MyoB, lo cual sugiere que esta miosina no hace parte del “glideosoma” –
MyoA.
El estudio de la proteína MyoB resultó ser un gran desafío. De los múltiples intentos
realizados para producir un anticuerpo anti-MyoB, sólo a partir de un péptido sintético, se
logró obtener el anticuerpo, el cual permitió detectar a la proteína en extractos del parásito y
establecer la localización apical de la misma.
No fue posible identificar proteínas que interactúan con PfMyoB ya que el anticuerpo anti-
MyoB no tuvo la capacidad de inmunoprecipitar PfMyoB, por lo tanto no fue útil en ensayos
de inmunoprecipitación.
El silenciamiento génico (“knock-out”) de PfMyoB no tuvo efecto aparente sobre la invasión
del parásito al eritrocito; sin embargo, el parásito sufrió daños importantes, los cuales se
evidencian en un retraso del crecimiento en el paso del estadio de anillo a trofozoíto y
posiblemente la muerte del parásito. A pesar de la ausencia de PfMyoB, los parásitos logran
sobrevivir aunque en menor proporción respecto a parásitos control y esto parece indicar
que PfMyoB no es un gen esencial para la supervivencia de los estadíos intraeritrocíticos de
P. falciparum y que posiblemente su función esta siendo compensada por otra proteína.
126 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
El silenciamiento génico (“knock-out”) de pfmyo-a afectó de manera importante la
supervivencia de los parásitos “knock-out”, ya que al parecer les causó la muerte. Este
hallazgo lleva a pensar que PfMyoA es esencial para la fisiología del parásito.
Se construyó un modelo HMM y una expresión regular, estrategias que permitieron identificar
motivos IQ que no habían sido encontrados antes por las interfaces de búsqueda de dominios
y motivos en las miosinas de P. falciparum.
7 Anexos
A. Anexo. Secuencias de Iniciadores
Iniciadores usados en capítulo de proteínas recombinantes
Letra de color verde en la secuencia del iniciador, corresponde al sitio de restricción de la enzima
BamHI; letra de color rojo, corresponde al sitio de restricción de la enzima NotI; letra de color fucsia
corresponde al sitio de restricción de la enzima XhoI; S es iniciador sentido; AS es iniciador
antisentido; subrayado en S corresponde al codón de inicio, subrayado en AS corresponde al codón de
parada
128 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Iniciadores usados con los vectores pGEM-T easy, pET15b y pGEX
Iniciadores para generación de constructos “knock-out” y control de pfmyo-a y pfmyo-b
Anexo A. Secuencias de Iniciadores 129
Iniciadores para PCR diagnóstica en el caso de pfmyo-a
Iniciador para PCR diagnóstica: PCR semi-anidada en el caso de pfmyo-a
Iniciador Secuencia 5’-3’ Forma detectada Tamaño esperado
An (S) ATTAACATTACTAACGAAATGCTTC Integración 5’ An y D: 886 pb
Svenja (S) CCAATAGATAAAATTTGTAGAG Integración 3’ Svenja-Z: 1013 pb C y Z: 906 pb
S: iniciador sentido
130 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Iniciadores para PCR diagnóstica en el caso de pfmyo-b
Iniciadores para PCR semi-anidada y RT-PCR en el caso de pfmyo-b
Iniciador Secuencia 5’-3’ Tamaño esperado
H2F (S) GGTGGTAAATCTAATTGTAG H2F y B: 1176 pb
Tail (AS) TTATTCGTGTTCCTTAATAT E y Tail: 1076 pb
H1F (S) ATGGTGAATAAAATCAACGA 1039 pb
H1R (AS) CCAAAAGTAACAACCCTGACA
S: iniciador sentido; AS: iniciador antisentido
B. Anexo. Mapas de vectores
Vector de clonación
Vector Características Resistencia a
antibiótico Casa
comercial
pGEM®- T easy
Este es un vector linealizado que en sus extremos presenta una timidina 3´-terminal. Contiene los promotores T7 y SP6 ARN polimerasa flanqueando la región de clonación múltiple, la cual se ubica dentro de la región codificante del α-péptido de la enzima β-galactosidasa. La inactivación del α-péptido por inserción del fragmento a clonar permite la identificación de colonias recombinantes por tamizaje azul/blanco sobre placas de agar indicadoras.
Ampicilina Promega
Mapa del vector pGEM®-T easy y principales características
132 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Vectores de expresión
Vector Características Tag Tamaño del tag
Resistencia a antibiótico
Casa comercial
pGEX-4T2 El gen clonado se inserta corriente abajo del gen GST. Promotor tac, represor lac Iq
GST ~27 kDa Ampicilina GE Healthcare
pET15b
El gen clonado se inserta corriente abajo de 6 codones CAT. Promotor T7, represor lac Iq
6 His ~840 Da Ampicilina Novagen
Mapa del vector pGEX-4T 2 (proteínas de fusión GST) mostrando el marco de lectura y las
principales características
Anexo B. Mapa de vectores 133
Mapa del vector pET15b (proteínas de fusión 6xHis) y principales características
134 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Vector para recombinación homóloga
Vector Características Tipo de
recombinación Resistencia
a antibiótico Cassette de
selección Casa
comercial
pHH1
El gen hdhfr está bajo el control del promotor de la CaM de P. falciparum
Sencilla Ampicilina
Gen humano que codifica para una DHFR mutada
Donado por S. Muller (a partir de A. Cowman)
Mapa del vector pHH1
C. Anexo. Secuencia de las proteínas recombinantes
Las proteínas GAP45 y MTIP fueron expresadas en su totalidad, mientras que para PfMyoA, PfMyoB y
GAP50 se expresó un fragmento de la proteína. Las regiones expresadas de las cinco proteínas se
muestran en letra de color púrpura y negrilla. Al principio de cada secuencia se muestra el número
total de aa de cada proteína y el número total de aa de la recombinante.
PfMyoA 818aa GST-MyoA227-476: 250 aa MAVTNEEIKTASKIVRRVSNVEAFDKSGSVFKGYQIWTDISPTIENDPNIMFVKCVVQQGSKKEKLTVVQIDPPGTGTPY
DIDPTHAWNCNSQVDPMSFGDIGLLNHTNIPCVLDFLKHRYLKNQIYTTAVPLIVAINPYKDLGNTTNEWIRRYRDTADH
TKLPPHVFTCAREALSNLHGVNKSQTIIVSGESGAGKTEATKQIMRYFASSKSGNMDLRIQTAIMAANPVLEAFGNAKTI
RNNNSSRFGRFMQLVISHEGGIRYGSVVAFLLEKSRIITQDDNERSYHIFYQFLKGANSTMKSKFGLKGVTEYKLLNPNS
TEVSGVDDVKDFEEVIESLKNMELSESDIEVIFSIVAGILTLGNVRLIEKQEAGLSDAAAIMDEDMGVFNKACELMYLDP
ELIKREILIKVTVAGGTKIEGRWNKNDAEVLKSSLCKAMYEKLFLWIIRHLNSRIEPEGGFKTFMGMLDIFGFEVFKNNS
LEQLFINITNEMLQKNFVDIVFERESKLYKDEGISTAELKYTSNKEVINVLCEKGKSVLSYLEDQCLAPGGTDEKFVSSC
ATNLKENNKFTPAKVASNKNFIIQHTIGPIQYCAESFLLKNKDVLRGDLVEVIKDSPNPIVQQLFEGQVIEKGKIAKGSL
IGSQFLNQLTSLMNLINSTEPHFIRCIKPNENKKPLEWCEPKILIQLHALSILEALVLRQLGYSYRRTFEEFLYQYKFVD
IAAAEDSSVENQNKCVNILKLSGLSESMYKIGKSMVFLKQEGAKILTKIQREKLVEWENCVSVIEAAILKHKYKQKVNKN
IPSLLRVQAHIRKKMVAQ PfMyoB 801 aa His-MyoB357-502: 146 aa MVNKINELNNYFRINSTFINKSENESENFYVWTYKSPNVDLYPDLVFFKCQVLNINGDNYEVKEISPETNSVYTVKKEHL
FNCNNMVNINSHRLNDMVHQNSAEVLNTLALRYEKNYIYTIAEPMLISVNPYQVIDTDMNEYKNKSTDLLPPHVYTYAKD
AMLDFINTKNSQSIIISGESGSGKTEASKLVIKFYLSGVREDNDISKTLWDSNFILEAFGNAKTVKNNNSSRYGKYIKIQ
LDENQNIVSSSIEIFLLEKIRVVSQEPDERCYHIFYEILKGMNDEMKKKYKIKSEEDYKYISNKSINIPEIDDAKDFENL
MISFDKMKMSDLKDDLFLTLSGLLLLGNIQFNGIEKGGKSNCSELDDENLEVVNEASELLGIDYESLKNSLVITEKSIAN
QKIEIPLSIEESLSICRSISKDIYNKIFEYITKRINNFLNNNKELENFIGILDIFGFEIFVKNSLEQLLINIANEEIHNI
YLFVVYEKESNLYKKEGIIIESVKYTNNESIIDLLRGKTSIISILEDNCLAPGKKDESIVSVYTNKFSKNEHYSVCKKNI
TESFVIKHTVSDVTYSISNFISKNKDILSPNILKLLKVSNNKLIQNLYDDAEVTDSLGRKNLITYKYLENLKKICSYLKS
TNIYFIKCIKPNETKEKNNFNPKKVYPQLFSLSIVETLNIKYFFQYKYTFASFLSYYQYLDIAVSNDSSLDEKTKVTMLL
ERNFDKDSYKVGHTMVFLKKEAVHKIRDIINSNLKCYRNLCCITSALIMKIKKKRIVEENIKNLQLAQAYFRKYKYIKEH
E PfGAP50 396aa GST-GAP5026-175: 150 aa MNYCKTTFHIFFFVLFFITIYEIKCQLRFASLGDWGKDTKGQILNAKYFKQFIKNERVTFIVSPGSNFIDGVKGLNDPAW
KNLYEDVYSEEKGDMYMPFFTVLGTRDWTGNYNAQLLKGQGIYIEKNGETSIEKDADATNYPKWIMPNYWYHYFTHFTVS
SGPSIVKTGHKDLAAAFIFIDTWVLSSNFPYKKIHEKAWNDLKSQLSVAKKIADFIIVVGDQPIYSSGYSRGSSYLAYYL
LPLLKDAEVDLYISGHDNNMEVIEDNDMAHITCGSGSMSQGKSGMKNSKSLFFSSDIGFCVHELSNNGIVTKFVSSKKGE
VIYTHKLNIKKKKTLDKVNALQHFAALPNVELTDVPSSGPMGNKDTFVRVVGTIGILIGSVIVFIGASSFLSKNMK PfGAP45 204 aa GST-GAP451-204: 204 aa MGNKCSRSKVKEPKRKDIDELAERENLKKQSEEIIEEKPEEVVEQVEETHEEPLEQEQELDEQKIEEEEEEPEQVPKEEI
DYATQENKSFEEKHLEDLERSNSDIYSESQKFDNASDKLETGTQLTLSTEATGAVQQITKLSEPAHEESIYFTYRSVTPC
DMNKLDETAKVFSRRCGCDLGERHDENACKICRKIDLSDTPLLS
PfMTIP 204 aa GST-MTIP1-204: 204 aa MKQECNVCYFNLPDPESTLGPYDNELNYFTWGPGFEYEPEPQRKPLSIEESFENSEESEESVADIQQLEEKVDESDVRIY
FNEKSSGGKISIDNASYNARKLGLAPSSIDEKKIKELYGDNLTYEQYLEYLSICVHDKDNVEELIKMFAHFDNNCTGYLT
KSQMKNILTTWGDALTDQEAIDALNAFSSEDNIDYKLFCEDILQ
D. Anexo. Secuenciación de los fragmentos clonados en vector de expresión
Secuenciación del fragmento GAP451-204 clonado en el vector de expresión pGEX 4 T2. ATG
corresponde al codon de inicio de gap45 y TAA corresponde al codón de parada de la traducción. En
letra verde y roja se muestran las secuencias de las enzimas de restricción BamHI y NotI.
ARNm/Gap45 corresponde a la secuencia teórica y Secuenciación a la secuencia reportada por la
compañia
ARNm/Gap45 -----------------------ATGGGAAATAAATGTTCAAGAAGCAAAGTAAAGGAAC
Secuenciación CGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGGAAATAAATGTTCAAGAAGCAAAGTAAAGGAAC
*************************************
ARNm/Gap45 CCAAACGTAAAGATATTGATGAATTAGCTGAACGTGAAAATTTAAAAAAACAATCTGAAG
Secuenciación CCAAACGTAAAGATATTGATGAATTAGCTGAACGTGAAAATTTAAAAAAACAATCTGAAG
************************************************************
ARNm/Gap45 AAATAATTGAAGAAAAACCAGAAGAAGTTGTTGAGCAAGTAGAAGAAACACATGAAGAAC
Secuenciación AAATAATTGAAGAAAAACCAGAAGAAGTTGTTGAGCAAGTAGAAGAAACACATGAAGAAC
************************************************************
ARNm/Gap45 CTCTTGAACAAGAACAGGAACTGGATGAACAGAAAATAGAAGAAGAAGAAGAAGAACCTG
Secuenciación CTCTTGAACAAGAACAGGAACTGGATGAACAGAAAATAGAAGAAGAAGAAGAAGAACCTG
************************************************************
ARNm/Gap45 AACAAGTACCAAAAGAAGAAATAGATTATGCAACTCAAGAAAATAAATCATTTGAAGAAA
Secuenciación AACAAGTACCAAAAGAAGAAATAGATTATGCAACTCAAGAAAATAAATCATTTGAAGAAA
************************************************************
ARNm/Gap45 AACATTTAGAAGATTTAGAAAGATCTAATTCAGATATTTATTCAGAATCTCAAAAATTTG
Secuenciación AACATTTAGAAGATTTAGAAAGATCTAATTCAGATATTTATTCAGAATCTCAAAAATTTG
************************************************************
ARNm/Gap45 ATAATGCTAGTGATAAATTAGAAACAGGAACTCAATTAACCTTATCTACTGAAGCCACTG
Secuenciación ATAATGCTAGTGATAAATTAGAAACAGGAACTCAATTAACCTTATCTACTGAAGCCACTG
************************************************************
ARNm/Gap45 GTGCCGTACAACAAATAACTAAATTAAGTGAACCCGCCCATGAAGAAAGTATATATTTTA
Secuenciación GTGCCGTACAACAAATAACTAAATTAAGTGAACCCGCCCATGAAGAAAGTATATATTTTA
************************************************************
ARNm/Gap45 CTTATAGATCTGTAACACCTTGTGATATGAATAAACTCGATGAAACCGCTAAAGTTTTTT
Secuenciación CTTATAGATCTGTAACACCTTGTGATATGAATAAACTCGATGAAACCGCTAAAGTTTTTT
************************************************************
ARNm/Gap45 CAAGAAGATGTGGATGTGATCTTGGTGAACGTCATGATGAAAATGCATGTAAAATTTGTA
Secuenciación CAAGAAGATGTGGATGTGATCTTGGTGAACGTCATGATGAAAATGCATGTAAAATTTGTA
************************************************************
ARNm/Gap45 GAAAAATTGATTTATCCGATACACCTTTATTGAGCTAA----------------------
Secuenciación GAAAAATTGATTTATCCGATACACCTTTATTGAGCTAAGCGGCCGCATCGTGACTGACTG
**************************************
E. Anexo. Secuenciación del clon AD y CZ
Alineamiento clon A-D
Secuenciación del producto de PCR obtenido en la PCR diagnóstica para integración 5’ sobre ADNg de
cultivos MyoA-KO. El primer resaltado azul corresponde a la secuencia del iniciador A y el último a la
secuencia del iniciador D. TAA corresponde al codón prematuro que fue insertado en la secuencia del
constructo “knock-out” para MyoA.
140 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Alineamiento clon CZ
Secuenciación del producto de PCR obtenido en la PCR diagnóstica para integración 3’ sobre ADNg de
cultivos MyoA-KO. El primer resaltado verde corresponde a la secuencia del iniciador C y el último a la
secuencia del iniciador Z. AGATCT corresponde a la secuencia del sitio de reconocimiento de la enzima
BglII.
F. Anexo. Ubicación de iniciadores utilizados en RT-PCR (PfMyoB-KO)
G. Anexo. Publicaciones y eventos Publicación No. 1
Guerra ÁP, Calvo EP, Wasserman M, Chaparro-Olaya J. Production of recombinant proteins
from Plasmodium falciparum in Escherichia coli. Biomedica. 2016; 36(0):97-108. doi:
10.7705/biomedica.v36i3.3011
https://www.revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/3011/3063
Publicación No. 2: en proceso
Actualmente se está escribiendo un manuscrito con los resultados del “knock-out” del gen
pfmyo-b.
144 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la
invasión del parásito al glóbulo rojo
Evento científico: Primer congreso colombiano de Bioquímica y Biología Molecular,
2014
8 Bibliografía
Aikawa M, Miller LH, Johnson J, Rabbege J. Erythrocyte entry by malarial parasites. A moving
junction between erythrocyte and parasite. J Cell Biol. 1978. 77(1): 72-82.
Andenmatten N, Egarter S, Jackson AJ, Jullien N, Herman JP, Meissner M. Conditional genome
engineering in Toxoplasma gondii uncovers alternative invasion mechanisms. Nat Methods.
2013.10(2):125-7. doi: 10.1038/nmeth.2301.
Ashley EA, Pyae Phyo A, Woodrow CJ. Malaria. Lancet. 2018. 391:1608-1621. doi:
10.1016/S0140-6736(18)30324-6
Baca AM, Hol WG. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of
Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 2000. 30:
113-8.
Bähler M, Rhoads A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 2002. 513(1):107-13.
Review
Baum J, Maier AG, Good RT, Simpson KM, Cowman AF. Invasion by P. falciparum merozoites
suggests a hierarchy of molecular interactions. PLoS Pathog. 2005.1(4): e37. Review.
Baum J, Papenfuss AT, Baum B, Speed TP, Cowman AF. Regulation of apicomplexan actin-based
motility. Nat Rev Microbiol. 2006b. 4(8):621-8. Review
Baum J, Richard D, Healer J, Rug M, Krnajski Z, Gilberger TW, Green JL, Holder AA, Cowman AF. A
conserved molecular motor drives cell invasion and gliding motility across malaria life cycle
stages and other apicomplexan parasites. J Biol Chem. 2006a: 281(8):5197-208.
Beeson JG, Drew DR, Boyle MJ, Feng G, Fowkes FJ, Richards JS. Merozoite surface proteins in red
blood cell invasion, immunity and vaccines against malaria. FEMS Microbiol Rev. 2016.
40(3):343-72. doi: 10.1093/femsre/fuw001.
146 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Bergman LW, Kaiser K, Fujioka H, Coppens I, Daly TM, Fox S et al. Myosin A tail domain
interacting protein (MTIP) localizes to the inner-membrane complex of Plasmodium
sporozoites. J Cell Sci. 2003. 116: 39–49
Bookwalter CS, Tay CL, McCrorie R, Previs MJ, Lu H, Krementsova EB et al. Reconstitution of the
core of the malaria parasite glideosome with recombinant Plasmodium class XIV myosin A
and Plasmodium actin. J Biol Chem. 2017. 24; 292(47):19290-19303. doi:
10.1074/jbc.M117.813972
Bosch J, Turley S, Daly TM, Bogh SM, Villasmil ML, Roach C et al. Structure of the MTIP-MyoA
complex, a key component of the malaria parasite invasion motor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
2006. 103: 4852– 7
Bosch J, Turley S, Roach CM, Daly TM, Bergman LW and Hol WG. The closed MTIP-myosin A-tail
complex from the malaria parasite invasion machinery. J. Mol. Biol. 2007. 372: 77–88
Botero D, Restrepo M. Parasitosis humanas. En: Ediciones Corporación para Investigaciones
Biológicas-CIB. 5ª edición. Medellín. 2012. p .
Brown EP, Normandin E, Osei-Owusu NY, Mahan AE, Chan YN, Lai JI et al. Microscale purification
of antigen-specific antibodies. J Immunol Methods. 2015. 425:27-36. doi:
10.1016/j.jim.2015.06.005
Bullen HE, Tonkin CJ, O’Donnell RA, Tham WH, Papenfuss AT, Gould S et al. A Novel Family of
Apicomplexan Glideosome-associated Proteins with an Inner Membrane-anchoring Role.
JBChem. 2009. 284:37: 25353–63. DOI 10.1074/jbc.M109.036772
Buscaglia CA, Coppens I, Hol WG, Nussenzweig V. Sites of interaction between aldolase and
thrombospondin-related anonymous protein in Plasmodium. Mol Biol Cell. 2003: 14(12):
4947-57.
Buss F, Spudich G, Kendrick-Jones J. Myosin VI: cellular functions and motor properties. Annu
Rev Cell Dev Biol. 2004: 20: 649-76. Review.
Cao J, Kaneko O, Thongkukiatkul A, Tachibana M, Otsuki H, Gao Q et al. Rhoptry neck protein
RON2 forms a complex with microneme protein AMA1 in Plasmodium falciparum
merozoites. Parasitol Int. 2009. 58(1):29-35. doi: 10.1016/j.parint.2008.09.005.
Bibliografía 147
Carstens P. Use of tRNA-supplemented host strains for expression of heterologous genes in E.
coli. In: Peter E. Vaillancourt, editors. E. coli Gene Expression Protocols. Totowa, NJ: Humana
Press; 2003.p.225-233.
CDC, Centers for Disease Control and Prevention 2017. Malaria.
https://www.cdc.gov/dpdx/malaria/index.htmL
Chaparro-Olaya J, Dluzewski AR, Margos G, Wasserman M, Mitchell GH, Bannister LH, Pinder JC.
The multiple myosins of malaria: the smallest malaria myosin, Plasmodium falciparum
myosins-B (PfmyoB) is expressed in mature schizonts and merozoites. Europ J Protistol.
2003: 39: 423-27.
Chaparro-Olaya J, Margos G, Coles DJ, Dluzewski AR, Mitchell GH, Wasserman MM, Pinder JC.
Plasmodium falciparum myosins: transcription and translation during asexual parasite
development. Cell Motil Cytoskeleton. 2005: 60(4):200-13.
Chen GF, Inouye M. Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene
expression; preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia
coli genes. Nucleic Acids Res. 1990. 18: 1465-73.
Collins CR, Das S, Wong EH, Andenmatten N, Stallmach R, Hackett F et al. Robust inducible Cre
recombinase activity in the human malaria parasite Plasmodium falciparum enables efficient
gene deletion within a single asexual erythrocytic growth cycle. Mol Microbiol. 2013:
88(4):687-701. doi: 10.1111/mmi.12206.
Cowman AF, Crabb BS. Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell. 2006: 124(4):755-
66. Review
Cowman AF, Tonkin CJ, Tham WH, Duraisingh MT. The Molecular Basis of Erythrocyte Invasion
by Malaria Parasites. Cell Host Microbe. 2017. 22(2):232-245. doi:
10.1016/j.chom.2017.07.003.
Cowper B, Matthews S, TomLey F. The molecular basis for the distinct host and tissue tropisms
of coccidian parasites. Mol Biochem Parasitol. 2012. 186(1):1-10. doi:
10.1016/j.molbiopara.2012.08.007.
Crabb BS, Cowman AF. Characterization of promoters and stable transfection by homologous
and nonhomologous recombination in Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA. 1996.
93(14):7289-94.
148 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Crabb BS. Transfection technology and the study of drug resistance in the malaria parasite
Plasmodium falciparum. Drug Resist Updat. 2002. 5(3-4):126-30. Review.
Cui L, Su XZ. Discovery, mechanisms of action and combination therapy of artemisinin. Expert
Rev Anti Infect Ther. 2009. 7(8): 999-1013. Review. doi: 10.1586/eri.09.68.
Daher W, Soldati-Favre D. Mechanisms controlling glideosome function in apicomplexans. Curr
Opin Microbiol. 2009: 12(4):408-14.
Deitsch K, Driskill C, Wellems T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake
and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 2001.29(3):850-3.
Dobrowolski JM, Niesman IR, Sibley LD. Actin in the parasite Toxoplasma gondii is encoded by a
single copy gene, ACT1 and exists primarily in a globular form. Cell Motil Cytoskeleton. 1997:
37(3): 253-62.
Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. Optimizing inducer and culture conditions for expression
of foreign proteins under the control of the lac promoter. J Ind Microbiol. 1996. 16: 145-54.
http://dx.doi.org/10.1007/BF01569997
Dowse T, Soldati D. Host cell invasion by the apicomplexans: the significance of microneme
protein proteolysis. Curr Opin Microbiol. 2004: 7(4):388-96. Review.
Egarter S, Andenmatten N, Jackson AJ, Whitelaw JA, Pall G, Black JA et al. The toxoplasma Acto-
MyoA motor complex is important but not essential for gliding motility and host cell invasion.
PLoS One. 2014. 9(3): e91819. doi: 10.1371/journal.pone.0091819
Field SJ, Pinder JC, Clough B, Dluzewski AR, Wilson RJ, Gratzer WB. Actin in the merozoite of the
malaria parasite, Plasmodium falciparum. Cell Motil Cytoskeleton. 1993: 25(1): 43-8.
Foth BJ, Goedecke MC, Soldati D. New insights into myosin evolution and classification. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2006: 103(10):3681-6.
Frénal K, Marq JB, Jacot D, Polonais V, Soldati-Favre D. Plasticity between MyoC- and MyoA-
glideosomes: an example of functional compensation in Toxoplasma gondii invasion. PLoS
Pathog. 2014.10(10):e1004504. doi: 10.1371/journal.ppat.1004504.
Bibliografía 149
Frénal K, Polonais V, Marq JB, Stratmann R, Limenitakis J, Soldati-Favre D. Functional dissection
of the apicomplexan glideosome molecular architecture. Cell Host Microbe. 2010. 8(4):343-
57. doi: 10.1016/j.chom.2010.09.002.
Frénal K, Soldati-Favre D. The glideosome, a unique machinery that assists the Apicomplexa in
gliding into host cells. Med Sci (Paris). 2013. 29:515-22. doi: 10.1051/medsci/2013295015.
Gardiner DL, Skinner-Adams TS, Spielmann T, Trenholme KR. Malaria transfection and
transfection vectors. Trends Parasitol. 2003.19(9):381-3. Review.
Gaskins E, Gilk S, DeVore N, Mann T, Ward G, Beckers C. Identification of the membrane receptor
of a class XIV myosin in Toxoplasma gondii. J Cell Biol. 2004: 165(3): 383-93.
Gilk SD, Gaskins E, Ward GE, Beckers CJ. GAP45 phosphorylation controls assembly of the
Toxoplasma myosin XIV complex. Eukaryot Cell. 2009: 8(2):190-6.
Goldman E, Rosenberg AH, Zubay G, Studier FW. Consecutive low-usage leucine codons block
translation only when near the 5' end of a message in Escherichia coli. J Mol Biol. 1995. 245:
467-73.
Gonzalez V, Combe A, David V, Malmquist NA, Delorme V, Leroy C et al. Host cell entry by
apicomplexa parasites requires actin polymerization in the host cell. Cell Host Microbe. 2009.
5(3):259-72. doi: 10.1016/j.chom.2009.01.011.
Graindorge A, Frénal K, Jacot D, Salamun J, Marq JB, Soldati-Favre D. The Conoid Associated
Motor MyoH Is Indispensable for Toxoplasma gondii Entry and Exit from Host Cells. PLoS
Pathog. 2016. 2(1):e1005388. doi: 10.1371/journal.ppat.1005388.
Green JL, Martin SR, Fielden J, Ksagoni A, Grainger M, Yim Lim BY et al. The MTIP-myosin A
complex in blood stage malaria parasites. J Mol Biol. 2006. 355(5):933-41.
Green JL, Rees-Channer RR, Howell SA, Martin SR, Knuepfer E, Taylor HM, Grainger M, Holder
AA. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent
protein kinase. J Biol Chem. 2008: 283(45):30980-9.
Green JL, Wall RJ, Vahokoski J, Yusuf NA, Ridzuan MAM, Stanway RR et al. Compositional and
expression analyses of the glideosome during the Plasmodium life cycle reveal an additional
myosin light chain required for maximum motility. J Biol Chem. 2017. 27; 292(43):17857-
17875. doi: 10.1074/jbc.M117.802769
150 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Harlow E, Lane D. Antibodies. A laboratory manual. First edition. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press; 1988. p.67, 92-120.
Hartman MA, Finan D, Sivaramakrishnan S, Spudich JA. Principles of unconventional Myosin
function and targeting. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011. 27:133-55.
Hasenkamp S, Merrick CJ, Horrocks P. A quantitative analysis of Plasmodium falciparum
transfection using DNA-loaded erythrocytes. Mol Biochem Parasitol. 2013.187(2):117-20. doi:
10.1016/j.molbiopara.2013.01.001.
Heintzelman MB, Schwartzman JD. A novel class of unconventional myosins from Toxoplasma
gondii. J Mol Biol. 1997: 271(1):139-46.
Heintzelman MB. Gliding motility in apicomplexan parasites. Semin Cell Dev Biol. 2015. 46:135-
42. doi:10.1016/j.semcdb.2015.09.020
Hernández PC, Wasserman M, Chaparro-Olaya J. In vitro interaction between Plasmodium
falciparum myosin B (PfMyoB) and myosin A tail interacting protein (MTIP). Parasitol res.
2018. 117(11): 3437-3446. doi: 10.1007/s00436-018-6039-8.
Hernández PC, Morales L, Castellanos IC, Wasserman M, Chaparro-Olaya J. Myosin B of
Plasmodium falciparum (PfMyoB): in silico prediction of its three-dimensional structure and
its possible interaction with MTIP. Parasitol Res. 2017. 116(4):1373-1382. doi:
10.1007/s00436-017-5417-y.
Holmes KC. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. Curr Biol. 1997. 7(2):
R112–R118. doi:10.1016/S0960-9822(06)00051-0
Houdusse A, Kalabokis VN, Himmel D, Szent-Györgyi AG, Cohen C. Atomic structure of scallop
myosin subfragment S1 complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head.
Cell. 1999. 97(4):459-70.
INS, Instituto Nacional de Salud. Boletín Epidemiológico Semanal-BES 2018. Semana
epidemiológica 52. 2018.
INS, Instituto Nacional de Salud. Informe del evento malaria, Colombia, 2017.
Jewett TJ, Sibley LD. Aldolase forms a bridge between cell surface adhesins and the actin
cytoskeleton in apicomplexan parasites. Mol Cell. 2003: 11(4): 885-94.
Bibliografía 151
Johnson TM, Rajfur Z, Jacobson K, Beckers CJ. Immobilization of the type XIV myosin complex in
Toxoplasma gondii. Mol Biol Cell. 2007: 18(8): 3039-46.
Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren PA, Ståhl S. Genetic design for facilitated production and
recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 2002. 35: 91-
105. http://dx.doi.org/10.1042/BA20010099
Jones ML, Collins MO, Goulding D, Choudhary JS, Rayner JC. Analysis of protein palmitoylation
reveals a pervasive role in Plasmodium development and pathogenesis. Cell Host Microbe.
2012.12(2):246-58. doi: 10.1016/j.chom.2012.06.005.
Jones ML, Kitson EL, Rayner JC. Plasmodium falciparum erythrocyte invasion: a conserved
myosin associated complex. Mol Biochem Parasitol. 2006. 147(1):74-84.
Kappe S, Bruderer T, Gantt S, Fujioka H, Nussenzweig V, Ménard R. Conservation of a gliding
motility and cell invasion machinery in Apicomplexan parasites. J Cell Biol. 1999: 147(5):937-
44.
Kappe SH, Buscaglia CA, Bergman LW, Coppens I, Nussenzweig V. Apicomplexan gliding motility
and host cell invasion: overhauling the motor model. Trends Parasitol. 2004: 20(1):13-6.
Review.
Karmodiya K, Srivastav RK, Surolia N. Production and purification of refolded recombinant
Plasmodium falciparum beta-ketoacyl-ACP reductase from inclusion bodies. Protein Expr
Purif. 2005. 42: 131-6
Keeley A, Soldati D. The glideosome: a molecular machine powering motility and host-cell
invasion by Apicomplexa. Trends Cell Biol. 2004: 14(10):528-32. Review.
King, C.A. Cell motility of sporozoan protozoa. Parasitol. Today. 1988: 4: 315–319.
Koch M, Baum J. The mechanics of malaria parasite invasion of the human erythrocyte – towards
a reassessment of the host cell contribution. Cell Microbiol. 2016. 18(3): 319–329. doi:
10.1111/cmi.12557
Korn ED. Coevolution of head, neck, and tail domains of myosin heavy chains. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2000. 97(23):12559-64.
Krendel M, Mooseker MS. Myosins: tails (and heads) of functional diversity. Physiology
(Bethesda). 2005. 20:239-51.
152 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Kublin JG, Mikolajczak SA, Sack BK, Fishbaugher ME, Seilie A, Shelton L et al. Complete
attenuation of genetically engineered Plasmodium falciparum sporozoites in human subjects.
Sci Transl Med. 2017.4; 9(371). pii: eaad9099. doi: 10.1126/scitranslmed. aad9099.
Kumpula EP y Kursula I. Towards a molecular understanding of the apicomplexan actin motor:
on a road to novel targets for malaria remedies? Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 2015.
71(Pt 5):500-13. doi: 10.1107/S2053230X1500391X
Kusakabe T, Motoki K, Hori K. Mode of interactions of human aldolase isozymes with
cytoskeletons. Arch Biochem Biophys. 1997: 344(1): 184-93.
Lambros C, Vanderberg JP. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in
culture. J Parasitol. 1979: 65(3): 418-20.
Lin CS, Uboldi AD, Marapana D, Czabotar PE, Epp C, Bujard H et al. The merozoite surface
protein 1 complex is a platform for binding to human erythrocytes by Plasmodium
falciparum. J Biol Chem. 2014. 289: 25655–25669.
Linder ME1, Deschenes RJ. Palmitoylation: policing protein stability and traffic. Nat Rev Mol Cell
Biol. 2007.8(1):74-84.
Lol JC, Castellanos ME, Liebman KA, Lenhart A, Pennington PM, Padilla NR. Molecular evidence
for historical presence of knock-down resistance in Anopheles albimanus, a key malaria
vector in Latin America. Parasit Vectors. 2013. 6:268. doi: 10.1186/1756-3305-6-268.
Lu Q, Li J, Zhang M. Cargo recognition and cargo-mediated regulation of unconventional
myosins. Acc Chem Res. 2014. 47(10):3061-70. doi: 10.1021/ar500216z.
Margos G, Bannister LH, Dluzewski AR, Hopkins J, Williams IT, Mitchell GH. Correlation of
structural development and differential expression of invasion-related molecules in
schizonts of Plasmodium falciparum. Parasitology. 2004.129(Pt 3):273-87.
Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Myosins: Domain Organisation, Motor Properties,
Physiological Roles and Cellular Functions. Handb Exp Pharmacol. 2017. 235:77-122. doi:
10.1007/164_2016_29.
Mazerik JN, Kraft LJ, Kenworthy AK, Tyska MJ. Motor and tail homology 1 (Th1) domains
antagonistically control myosin-1 dynamics. Biophys J. 2014. 106(3):649-58. doi:
10.1016/j.bpj.2013.12.038.
Bibliografía 153
Mehlin C, Boni E, Buckner FS, Engel L, Feist T, Gelb MH, et al. Heterologous expression of
proteins from Plasmodium falciparum: results from 1000 genes. Mol Biochem Parasitol. 2006.
148: 144-160.
Meissner M, Breinich MS, Gilson PR, Crabb BS. Molecular genetic tools in Toxoplasma and
Plasmodium: achievements and future needs. Curr Opin Microbiol. 2007;10(4):349-56.
Review
Meissner M, Schlüter D, Soldati D. Role of Toxoplasma gondii myosin A in powering parasite
gliding and host cell invasion. Science. 2002. 298(5594):837-40.
Ménard R. Gliding motility and cell invasion by Apicomplexa: insights from the Plasmodium
sporozoite. Cell Microbiol. 2001: 3(2): 63-73. Review.
Millar SB, Cox-Singh J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clin
Microbiol Infect. 2015. 21(7):640-8. doi: 10.1016/j.cmi.2015.03.017
Miller LH, Aikawa M, Johnson JG, Shiroishi T. Interaction between cytochalasin B-treated
malarial parasites and erythrocytes. Attachment and junction formation. J Exp Med. 1979:
149(1): 172-84.
Mooseker MS, Cheney RE. Unconventional myosins. Annu Rev Cell Dev Biol. 1996: 11: 633-675.
Morales L, Hernández P, Chaparro-Olaya J. Systematic Comparison of Strategies to Achieve
Soluble Expression of Plasmodium falciparum Recombinant Proteins in E. coli. Mol
Biotechnol. 2018. 60(12):887-900. doi: 10.1007/s12033-018-0125-0
Morrissette NS, Sibley LD. Cytoskeleton of apicomplexan parasites. Microbiol Mol Biol Rev. 2002:
66(1):21-38. Review.
O'Donnell RA, Preiser PR, Williamson DH, Moore PW, Cowman AF, Crabb BS. An alteration in
concatameric structure is associated with efficient segregation of plasmids in transfected
Plasmodium falciparum parasites. Nucleic Acids Res. 2001.29(3):716-24
OMS, Organización Mundial de la Salud 2018. Paludismo: Datos y cifras. Consultado febrero
2019. Disponible en: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/malaria
OMS, Organización Mundial de la Salud. 2017a. Informe Mundial sobre el Paludismo 2017.
Consultado febrero 2019. Disponible en: https://www.who.int/malaria/media/world-
malaria-report-2017/es/
154 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
OMS, Organización Mundial de la Salud. 2017b. Marco para la Eliminación de la Malaria.
Disponible en:
http://iris.paho.org/xmLui/bitstream/handle/123456789/34172/9789275319659-
spa.pdf?ua=1
Opitz C, Soldati D. The glideosome: a dynamic complex powering gliding motion and host cell
invasion by Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 2002: 45(3): 597-604. Review.
OPS, Organización Panamericana de la Salud. 2016. Plan de acción para la eliminación de la
malaria 2016-2020. Consultado febrero de 2019. Disponible en:
https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/CD55-13-s.pdf?ua=1
Otto TD, Wilinski D, Assefa S, Keane TM, Sarry LR, Böhme U et al. New insights into the blood-
stage transcriptome of Plasmodium falciparum using RNA-Seq. Mol Microbiol. 2010.
76(1):12-24. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.07026.x.
Pinder J, Fowler R, Bannister L, Dluzewski A, Mitchell GH. Motile systems in malaria merozoites:
how is the red blood cell invaded? Parasitol Today. 2000: 16(6):240-5. Review.
Pinder JC, Fowler RE, Dluzewski AR, Bannister LH, Lavin FM, Mitchell GH, Wilson RJ, Gratzer WB.
Actomyosin motor in the merozoite of the malaria parasite, Plasmodium falciparum:
implications for red cell invasion. J Cell Sci. 1998: 111 ( Pt 13):1831-9.
PlasmoDB: https://plasmodb.org/plasmo/
Pomel S, Luk FC, Beckers CJ. Host cell egress and invasion induce marked relocations of
glycolytic enzymes in Toxoplasma gondii tachyzoites. PLoS Pathog. 2008: 4(10): e1000188.
Rees-Channer RR, Martín SR, Green JL, Bowyer PW, Grainger M, Molloy JE, Holder AA. Dual
acylation of the 45 kDa gliding-associated protein (GAP45) in Plasmodium falciparum
merozoites. Mol Biochem parasitol. 2006: 149: 113-116-
Regules JA, Cicatelli SB, Bennett JW, Paolino KM, Twomey PS, Moon JE et al. Fractional Third and
Fourth Dose of RTS,S/AS01 Malaria Candidate Vaccine: A Phase 2a Controlled Human
Malaria Parasite Infection and Immunogenicity Study. J Infect Dis. 2016. 214(5): 762-71. doi:
10.1093/infdis/jiw237.
Rhoads AR, Friedberg F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB J. 1997. 11:331-40.
Bibliografía 155
Rivadeneira EM, Wasserman M, Espinal CT. Separation and concentration of schizonts of
Plasmodium falciparum by Percoll gradients. J Protozool. 1983.30(2):367-70.
Romero S, Le Clainche C, Didry D, Egile C, Pantaloni D, Carlier MF. Formin is a processive motor
that requires profilin to accelerate actin assembly and associated ATP hydrolysis. Cell. 2004:
119(3): 419-29.
Rosano GL, Ceccarelli EA. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a
codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microb Cell Fact. 2009. 8: 41.
Ross JL, Ali MY, Warshaw DM. Cargo transport: molecular motors navigate a complex
cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol. 2008. 20(1):41–47. doi:10.1016/j.ceb.2007.11.006
Sablin EP, Dawson JF, VanLoock MS, Spudich JA, Egelman EH, Fletterick RJ. How does ATP
hydrolysis control actin's associations? Proc Natl Acad Sci U S A. 2002: 99(17): 10945-7.
Sahoo N, Beatty W, Heuser J, Sept D, Sibley LD. Unusual kinetic and structural properties control
rapid assembly and turnover of actin in the parasite Toxoplasma gondii. Mol Biol Cell. 2006:
17(2): 895-906.
Sambrook J, Russell D. Molecular cloning. A laboratory manual. Third edition. New York. Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
Santos JM, Lebrun M, Daher W, Soldati D, Dubremetz JF. Apicomplexan cytoskeleton and motors:
key regulators in morphogenesis, cell division, transport and motility. Int J Parasitol. 2009.
39:153-62. doi: 10.1016/j.ijpara.2008.10.007.
Sattarzadeh A, Schmelzer E, Hanson MR. Analysis of Organelle Targeting by DIL Domains of the
Arabidopsis Myosin XI Family. Front Plant Sci. 2011. 2: 72. doi: 10.3389/fpls.2011.00072.
Scheer JM, Ryan CA. A method for the quantitative recovery of proteins from polyacrylamide
gels. Anal Biochem. 2001. 298(1):130-2.
Schmitz S, Grainger M, Howell S, Calder LJ, Gaeb M, Pinder JC et al. Malaria parasite actin
filaments are very short. J Mol Biol. 2005. 349(1): 113–25.
Schumann W, Ferreira LC. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genet Mol Biol.
200. 27: 442-453.
156 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Sebé-Pedrós A, Grau-Bové X, Richards TA, Ruiz-Trillo I. Evolution and classification of myosins, a
paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biol Evol. 2014. 6(2):290-305. doi:
10.1093/gbe/evu013.
Sellers JR, Goodson HV, Wang F. A myosin family reunion. J Muscle Res Cell Motil. 1996: 17: 7-22.
Sellers JR. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 2000: 1496(1):3-22. Review.
Sharma P, Chitnis CE. Key molecular events during host cell invasion by Apicomplexan
pathogens. Curr Opin Microbiol. 2013. 16(4):432-7. doi: 10.1016/j.mib.2013.07.004
Shaw MK, Tilney LG. Induction of an acrosomal process in Toxoplasma gondii: visualization of
actin filaments in a protozoan parasite. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999: 96(16): 9095-9
Short EE, Caminade C, Thomas BN. Climate Change Contribution to the Emergence or Re-
Emergence of Parasitic Diseases. Infect Dis (Auckl). 2017. 10: 1178633617732296. doi:
10.1177/1178633617732296.
Sibley LD. Intracellular parasite invasion strategies. Science. 2004: 304(5668):248-53. Review.
Siden-Kiamos I, Ganter M, Kunze A, Hliscs M, Steinbüchel M, Mendoza J et al. Stage-specific
depletion of myosin A supports an essential role in motility of malarial ookinetes. Cell
Microbiol. 2011. 13(12):1996-2006. doi: 10.1111/j.1462-5822.2011.01686.x.
Soldati D, Foth BJ, Cowman AF. Molecular and functional aspects of parasite invasion. Trends
Parasitol. 2004: 20(12):567-74. Review.
Soldati D, Meissner M. Toxoplasma as a novel system for motility. Curr Opin Cell Biol. 2004:
16(1):32-40. Review
Sørensen HP, Mortensen KK. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of
Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2005. 4:1. http://dx.doi.org/10.1186/1475-2859-4-1
Terrak M, Rebowski G, Lu RC, Grabarek Z, Dominguez R. Structure of the light chain-binding
domain of myosin V. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. 102(36):12718-23.
Thomas JC, Green JL, Howson RI, Simpson P, Moss DK, Martin SR, Holder AA, Cota E, Tate EW.
Interaction and dynamics of the Plasmodium falciparum MTIP–MyoA complex, a key
component of the invasion motor in the malaria parasite. Mol. BioSyst. 2010: 6: 494–8
Bibliografía 157
Titus MA. Motor proteins: myosin V--the multi-purpose transport motor. Curr Biol. 1997:
7(5):R301-4. Review.
Tonkin CJ, van Dooren GG, Spurck TP, Struck NS, Good RT, Handman E et al. Localization of
organellar proteins in Plasmodium falciparum using a novel set of transfection vectors and a
new immunofluorescence fixation method. Mol Biochem Parasitol. 2004.137(1):13-21.
Trager W, Jensen JB. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 1976: 193: 673-5.
Trieu EP, Targoff IN. Immunoprecipitation: Western blot for proteins of low abundance. Methods
Mol Biol. 2015. 1312:327-42.
Urban S, Freeman M. Substrate specificity of rhomboid intramembrane proteases is governed by
helix-breaking residues in the substrate transmembrane domain. Mol Cell. 2003: 11(6):
1425-34.
Vahokoski J, Bhargav SP, Desfosses A, Andreadaki M, Kumpula E-P, Martinez SM et al. Structural
Differences Explain Diverse Functions of Plasmodium Actins. PLoS Pathog. 2014. 10(4):
e1004091. doi.org/10.1371/journal.ppat.1004091
Vaid A, Thomas DC, Sharma P. Role of Ca2+/calmodulin-PfPKB signaling pathway in erythrocyte
invasion by Plasmodium falciparum. J Biol Chem. 2008: 283(9): 5589-97.
Van Troys M, Huyck L, Leyman S, Dhaese S, Vandekerkhove J, Ampe C. Ins and outs of
ADF/cofilin activity and regulation. Eur J Cell Biol. 2008: 87(8-9): 649-67. Review.
Wall JG, Plückthun A. Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of
heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 1995. 6: 507-516.
Wall RJ, Zeeshan M, Katris NJ, Limenitakis R, Rea E, Stock J et al. Systematic analysis of
Plasmodium myosins reveals differential expression, localization and function in invasive
and proliferative parasite stages. Cell Microbiol. 2019.e13082. doi: 10.1111/cmi.13082.
Weiss GE, Crabb BS, Gilson PR. Overlaying Molecular and Temporal Aspects of Malaria Parasite
Invasion. Trends Parasitol. 2016. 32(4):284-295. doi: 10.1016/j.pt.2015.12.007.
Weiss GE, Gilson PR, Taechalertpaisarn T, Tham WH, de Jong NW, Harvey KL et al. Revealing the
sequence and resulting cellular morphology of receptor-ligand interactions during
Plasmodium falciparum invasion of erythrocytes. PLoS Pathog. 2015. 11(2):e1004670. doi:
10.1371/journal.ppat.1004670.
158 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión
del parásito al glóbulo rojo
Wesseling JG, Smits MA, Schoenmakers JG. Extremely diverged actin proteins in Plasmodium
falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1988. 30(2):143-53
Wesseling JG, Snijders PJ, van Someren P, Jansen J, Smits MA, Schoenmakers JG. Stage-specific
expression and genomic organization of the actin genes of the malaria parasite Plasmodium
falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1989. 35(2):167-76
Wetzel DM, Håkansson S, Hu K, Roos D, Sibley LD. Actin filament polymerization regulates
gliding motility by apicomplexan parasites. Mol Biol Cell. 2003: 14(2): 396-406.
WHO, World Health Organization 2017. Artemisinin and artemisinin-based combination therapy
resistance. Global Malaria Programme. 2017. Disponible en:
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/255213/WHO-HTM-GMP-2017.9-
eng.pdf?sequence=1
WHO, World Health Organization 2018, World Malaria Report 2018.
https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2018/report/en/
Wiersma HI, Galuska SE, TomLey FM, Sibley LD, Liberator PA, Donald RG. A role for coccidian
cGMP-dependent protein kinase in motility and invasion. Int J Parasitol. 2004: 34(3): 369-80.
Wu X, Jung G, Hammer JA 3rd. Functions of unconventional myosins. Curr Opin Cell Biol. 2000.
12(1):42-51. Review.
Xiao Q, Hu X, Wei Z, Tam KY. Cytoskeleton Molecular Motors: Structures and Their
Functions in Neuron. Int J Biol Sci. 2016. 12 (9):1083-92. doi: 10.7150/ijbs.15633.
Yusuf NA, Green JL, Wall RJ, Knuepfer E, Moon RW, Schulte-Huxel C et al. The Plasmodium Class
XIV Myosin, MyoB, Has a Distinct Subcellular Location in Invasive and Motile Stages of the
Malaria Parasite and an Unusual Light Chain. J Biol Chem. 2015. 290(19):12147-64. doi:
10.1074/jbc.M1 15.637694
Top Related