Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos
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Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos
Instituto Superior Técnico / Campus Tecnológico e Nuclear
Ciência Viva no Laboratório - Ocupação Científica de Jovens nas Férias
Formadora: Mestre Telma Silva
Ana Raquel Saramago
Ana Teresa Ferreira
Sara Isabel Gomes
Agosto de 2013
Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos
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Índice
I. Objetivos .................................................................................................. 3
II. Introdução teórica ..................................................................................... 4
III. Desenvolvimento Experimental ................................................................ 6
DIA 1 – 22 de julho de 2013 ............................................................................ 6
»Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico com Tween ....... 6
»Preparação do meio de cultura .................................................................. 6
DIA 2 – 23 de julho de 2013 ............................................................................ 8
»Validação do técnico de microbiologia ....................................................... 8
DIA 3 – 24 de julho de 2013 ............................................................................ 9
»Preparação das amostras para irradiação ................................................. 9
»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes ... 11
DIA 4 – 25 de julho de 2013 .......................................................................... 13
»Leitura dos dosímetros ............................................................................ 13
»Teste sensorial ........................................................................................ 13
DIA 5 – 26 de julho de 2013 .......................................................................... 13
»Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween ................................. 13
DIA 6 – 29 de julho de 2013 .......................................................................... 14
»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes ... 14
»Preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material .............. 14
DIA 7 – 30 de julho de 2013 .......................................................................... 14
»Caracterização de microrganismos a nível macroscópico ....................... 14
DIA 8 – 31 de julho de 2013 .......................................................................... 15
»Isolamento dos microrganismos para caracterização a nível microscópico
................................................................................................................... 15
DIA 9 – 01 de agosto de 2013 ...................................................................... 16
»Caracterização dos microrganismos a nível microscópico ...................... 16
IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise ..................................... 19
V. Conclusão .............................................................................................. 23
VI. Bibliografia .............................................................................................. 24
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I. Objetivos
Este estágio tem como objetivos dar a conhecer o modo de trabalho em condi-
ções de assepsia, avaliar a inativação da flora microbiana presente em moran-
gos frescos, após o seu tratamento a doses sub-letais de radiação gama (fonte
de cobalto-60) bem como o aumento do seu tempo de prateleira e estudar tra-
tamentos alternativos à lavagem (simples ou com desinfetantes) que garantam
a segurança e qualidade dos alimentos antes da sua comercialização, pois este
método apresenta pouca eficácia na eliminação de microrganismos de deterio-
ração e patogénicos, responsáveis por surtos de toxinfeções bacterianas e/ou
virais.
Figura 1 – Embalagem com morangos utilizados neste trabalho experimental
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II. Introdução teórica
Foi estudado o efeito da radiação gama na inativação dos microrganismos pre-
sentes nos morangos frescos.
Os morangos são uma fonte de vitaminas, minerais e antioxidantes naturais
necessários ao bom funcionamento do organismo humano, mas devido à ele-
vada atividade microbiana e respiratória o seu tempo de prateleira é reduzido.
O tratamento com radiação gama é considerado um meio de aumentar a vida-
de prateleira dos mais variados alimentos, pois a excitação e ionização das
moléculas gera radicais livres, que provocam reações químicas que afetam as
funções estruturais e metabólicas das células, podendo retardar o abrolhamen-
to e amadurecimento, inativar microrganismos e destruir parasitas e pragas,
reduzindo o número de microrganismos de deterioração e patogénicos neles
presentes.
A radiação é a propagação da energia proveniente de uma fonte natural ou arti-
ficial através de ondas eletromagnéticas (campos elétricos e magnéticos osci-
lantes, perpendiculares entre si e à direção de propagação) e que têm a capa-
cidade de penetrar em diversos materiais e em diferentes escalas. Embora a
maioria dos elementos que ocorrem naturalmente sejam isótopos estáveis (ou
seja, não se decompõem espontaneamente num nuclídeo), há também alguns
núcleos que são radioativos, o que quer dizer que emitem espontaneamente
pequenas partículas e radiação eletromagnética de energia elevada, originando
núcleos mais estáveis, fenómeno ao qual chamamos radioatividade.
Os três tipos de emissão mais conhecidos são as partículas alfa (núcleos de
hélio), as partículas beta (eletrões de elevada energia) e os raios gama (forma
de radiação eletromagnética de elevada energia e frequência, baixo compri-
mento de onda e grande poder de penetração).
A radiação classifica-se em ionizante e não ionizante. A radiação ionizante é
aquela que tem a capacidade de ionizar a matéria que atinge, sendo a não io-
nizante aquela que não possui essa capacidade. A radiação ionizante, provém
de átomos instáveis que para atingirem a estabilidade libertam a energia em
excesso sob a forma de radiação. Existem 3 fontes de radiação ionizante, os
raios X, os feixes de eletrões e as fontes radioativas (cobalto-60 ou césio-37).
Em vários países utiliza-se a irradiação de alimentos como meio de inativar os
microrganismos neles presentes, uma vez que o objetivo é semelhante ao tra-
tamento por temperatura, como a pasteurização. Esta técnica consiste na ex-
posição do alimento a uma determinada dose de radiação, tornando-o mais
seguro para consumo e até mesmo para a saúde pública. O seu valor nutricio-
nal é muito pouco afetado não sofrendo alterações significativas. Geralmente
para este processo são utilizadas fontes radioativas de cobalto-60, pois como
não são radioativas não ativam a amostra em estudo, pelo que os alimentos
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não ficam radioativos e não produzem nenhum efeito adverso para o ser hu-
mano. A avaliação dos aspetos toxicológicos e genéticos não demonstrou ne-
nhuma evidência direta de atividade cancerígena ou toxicidade a nível genéti-
co.
A interação da radiação com o alimento tem como objetivo inativar a população
microbiana presente, através da interrupção da divisão celular. Deste modo
aquando da absorção da radiação, os microrganismos sofrem danos biológicos
que podem ser devidos a dois tipos de efeitos, diretos ou indiretos. Estes efei-
tos distinguem-se pelo local onde é depositada a radiação. Os efeitos diretos
são caracterizados pela interação direta da radiação com a estrutura do ADN
(ácido desoxirribonucleico) da célula, enquanto os efeitos indiretos estão rela-
cionados com a formação de radicais livres resultantes da radiólise da água.
Esses radicais, quando entram em contacto com as estruturas biológicas cau-
sam danos irreversíveis pois são altamente radioativos.
Dependendo das suas estruturas químicas e físicas, da radiossensibilidade das
células e da sua capacidade de reparar os danos causados, os microrganismos
apresentam diferentes níveis de resistência à radiação. Pode descrever-se este
fator pelo valor que corresponde à dose necessária a aplicar num produto para
inativar cerca de 90% da população microbiana aí presente, sendo por isso a
dose de radiação aplicada variável consoante o tipo de alimento e o resultado
final que se pretende atingir.
Há vários processos de tratamento de alimentos através de radiação e conso-
ante a dose aplicada e o objetivo final estes são denominados radurização
(quando o objetivo é a desinfestação de insetos, a inativação de parasitas e o
retardamento da maturação, sendo a dose aplicada inferior a 1 kGy), radiciação
(quando o objetivo é a redução do número de microrganismos responsáveis
pela deterioração dos alimentos e a inativação dos microrganismos potencial-
mente patogénicos, sendo a dose aplicada de 1 a 10 kGy) e radapertização,
(quando o objetivo é a redução do número total de microrganismos para garan-
tir a esterilização, sendo a dose aplicada superior a 10 kGy).
A irradiação de alimentos é um processo que já é aplicado a nível comercial em
mais de 60 países devido às suas inúmeras vantagens, de entre as quais sali-
entamos que os alimentos podem ser irradiados já na sua embalagem final,
pelo que o risco de recontaminação é baixo; este processo permite ainda au-
mentar a validade ou tempo de vida útil de certos alimentos bem como torná-
los mais seguros sem induzir radioatividade no alimento; o valor nutricional, tal
como anteriormente se referiu, não sofre alterações significativas; verifica-se
um decréscimo no desperdício de alimentos; o elevado poder de penetração da
radiação permite irradiar vários tamanhos e formas bem como alcançar não só
os organismos na superfície mas em toda a amostra, garantindo total eficácia
do processo; é um tratamento seguro, limpo, eficiente e de baixo custo que
preserva o alimento não produzindo nenhum efeito adverso para o ser humano.
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III. Desenvolvimento Experimental
DIA 1 – 22 de julho de 2013
»Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico (0,9%) com Tween 80
(0,1%)
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Espátula
Gobelé
Proveta 2000mL
3 Frascos
Pipeta graduada de escoamen-
to total de 1mL
Cloreto de sódio
Água Milli-Q
Tween 80
Agitador magnético
Balança digital
Placa de aquecimento com agi-
tação
Pipetador automático
Procedimento Experimental:
1. Pesou-se 9g de cloreto de sódio num gobelé, com a balança digital, previ-
amente tarada.
2. Dissolveu-se os 9g de cloreto de sódio em 1000mL de água Milli-Q.
3. Transferiu-se a solução preparada para um frasco.
4. Repetiu-se o processo anterior (pontos 1 a 3) duas vezes.
5. Em dois dos frascos adicionou-se 1mL de Tween 80 com recurso a uma
pipeta volumétrica de 1mL e um pipetador automático.
6. As soluções foram esterilizadas em autoclave 121 °C durante 15 minutos
»Preparação do meio de cultura
Materiais e Reagentes: Equipamento:
2 Erlenmeyer
Funil
Frascos de vidro
Placas de Petri (descartáveis)
Tryptic Soy Agar – TSA
Água Milli-Q esterilizada
Fita indicadora de calor húmido
Balança digital
Placa de aquecimento com agi-
tação
Autoclave
Bico de Bunsen
Câmara de fluxo laminar
Procedimento Experimental:
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1. Verteu-se, com o auxílio de um funil, 1000mL de água Milli-Q, para cada
Erlenmeyer.
2. Os Erlenmeyer foram submetidos a um aumento progressivo de temperatu-
ra com homogeneização, numa placa de aquecimento com agitador.
3. Assim que a água começou a ferver, dissolveram-se 80 gramas de TSA,
em cada Erlenmeyer.
4. Adicionou-se de seguida outros 1000mL de água Milli-Q a cada Er-
lenmeyer, perfazendo um total de 2000mL.
5. Deixou-se a mistura em aquecimento e agitação constante até se tornar
translúcida.
6. Uma vez atingida uma solução homogénea, esta foi distribuída por vários
recipientes (respetivamente: cinco frascos de 400mL, quatro frascos de
200mL e um frasco de 900mL).
7. Os recipientes com TSA foram identificados e colocou-se também um pe-
daço de fita indicadora em cada um deles.
8. Fechou-se os frascos deixando as tampas ligeiramente soltas, para que as
pressões e temperaturas elevadas existentes no interior do Autoclave não
destruam as preparações.
9. Os frascos de TSA, de soro fisiológico e de soro fisiológico com Tween que
tinham sido preparados anteriormente foram levados a esterilizar no Au-
toclave no modo de “Exaustão Lenta” (121°C durante 15 minutos).
10. Depois de terminada a esterilização no Autoclave, fechou-se de imediato
as tampas para evitar possíveis contaminações.
11. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar com álcool a 70% por este
ter um período de evaporação mais lento e por isso ser mais eficaz na des-
contaminação microbiológica.
12. Dentro da câmara, abriu-se e distribuiu-se as placas (do canto esquerdo ao
fundo para o canto direito à frente de modo a não contaminar as placas)
para de seguida ser possível verter o conteúdo dos frascos de TSA para
cada uma delas.
13. Verteu-se sensivelmente 20mL para cada placa.
14. Antes do meio de cultura solidificar eliminaram-se todas as bolhas tocando-
lhes com a ponta de uma agulha esterilizada no Bico de Bunsen.
15. Assim que o meio de cultura solidificou, fecharam-se as placas ainda den-
tro da câmara de fluxo laminar.
16. Repetiu-se os pontos 12 a 15 até se consumir todo o volume de TSA, ob-
tendo-se assim 184 placas de meio de cultura.
17. Identificou-se o lote do meio (TSA 33/13) nas placas.
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DIA 2 – 23 de julho de 2013
»Validação do técnico de microbiologia
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Placas de TSA
Kitasato
Pinças estéreis
Vedantes
Medalhões
Membranas estéreis (Ø poro 0,45 µm)
Funis de filtração
Pipetas de 1 e 25 mL
Pipetador
Água Milli-Q esterilizada
Água Milli-Q não esterilizada
Câmara de fluxo laminar
Rampa de filtração
Bomba de vácuo
Bico de Bunsen
Procedimento Experimental:
1. Marcou-se as placas de TSA (amostra, réplica, data, técnico).
2. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar.
3. Montou-se o sistema de filtração (como descrito na imagem 1).
4. Colocou-se o bico de Bunsen dentro da câmara de fluxo laminar.
5. Abriu-se as 3 placas de controlo do fluxo laminar (esquerda, centro e direi-
ta) dispostas ao fundo da câmara.
6. Esterilizou-se as pinças à chama.
7. Colocou-se o vedante com a pinça (como descrito na imagem 2).
8. Colocou-se o medalhão com a pinça (como descrito na imagem 2).
9. Colocou-se a membrana de filtração com a pinça (como descrito na ima-
gem 2).
10. Instalou-se o funil de filtração (como descrito na imagem 2).
11. Esterilizou-se o bocal do frasco de água estéril à chama.
12. Pipetou-se 50mL de água esterilizada sobre a membrana.
13. Abriu-se a válvula para iniciar a filtração.
14. Retirou-se o funil de filtração.
15. Colocou-se a membrana retirada no centro da placa de TSA com a pinça
(réplica 1).
16. Repetiu-se os passos de 7 a 15 mais 2 vezes (réplicas 2 e 3).
17. Fechou-se as placas de controlo do fluxo laminar.
18. Desmontou-se o sistema de filtração.
19. Limpou-se a câmara.
20. Desligou-se a câmara de fluxo laminar.
21. Incubou-se as placas de TSA a 30°C durante 3 dias.
22. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório.
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Legenda:
A - Rampa de filtração, no interior da
câmara de fluxo laminar
B - Kitasato, reservatório de água, fora
da câmara de fluxo laminar
C - Bomba de vácuo, fora da câmara
de fluxo laminar
Legenda:
A - Vedante, peça plás-
tica
B - Medalhão, peça
metálica
C - Membrana estéril
(Ø poro 0,45 µm)
D - Funil de filtração,
peça metálica
DIA 3 – 24 de julho de 2013
»Preparação das amostras para irradiação
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Morangos ≈1 kg
Pinças estéreis
Caixas de morangos
Balança digital
6 Dosímetros Amber Prespex
Fonte experimental de cobalto-60 (Precisa22)
Imagem 1: Esquema do sistema de filtração
Imagem 2: Pormenor da montagem da rampa de filtração
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Procedimento Experimental:
1. Pesou-se a quantidade de morangos necessária por dose e guardou-se em
caixas separadas (como indicado na tabela 1).
2. Identificaram-se os dosímetros Amber Perspex por dose (dose, ci-
ma/baixo).
3. Colocaram-se dois dosímetros por caixa para monitorizar as doses absor-
vidas.
4. Irradiaram-se os morangos, uma dose de cada vez (primeiro a de 1,5kGy,
seguida pela de 3kGy e por fim a de 0,5kGy), na Precisa22, no nível 2, nas
posições A, B e C de 1 a 3 (figura 2), durante os períodos de tempo indica-
dos na tabela 2.
Figura 2 – Representação do suporte metálico com os respectivos níveis e posições de irradiação.
Dose (kGy) Tempo de irradiação (hh:mm)
0 00:00
0,5 00:30
1,5 01:20
3 02:40
0kGy - 300g 0,5kGy - 150g 1,5kGy - 150g 300kGy - 300g
Massa da caixa sem
tampa 23,98g 10,96g 10,83g 10,76g
Massa da caixa com
tampa 39,04g 22,23g 21,71g 22,52g
Massa de morangos
302,71g 150,97g 163,89g 309,42g
Tabela 1: Massa de morangos por dose de radiação
Tabela 2: Tempo de irradiação por dose de radiação
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»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=0)
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Morangos ≈1 kg
Soro fisiológico 0,9%
Soro fisiológico 0,9% com 0,1% de Tween 80
12 sacos de stomacher estereis
Pipetas volumétricas de 1, 10 e 25mL
Pipetador
84 placas de TSA
Pinças estéreis
9 Tubos de ensaio estéreis
Câmara de fluxo laminar
Balança digital
Stomacher
Agitador (vórtex)
Bico de Bunsen
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Procedimento experimental:
1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar.
2. Identificou-se os sacos de stomacher (dose, aluno, data).
3. Pesou-se na câmara de fluxo laminar cerca de 25 g de morangos para um
saco de stomacher estéril (1 saco por dose e por aluno).
4. Adicionou-se com auxílio de uma pipeta volumétrica 100mL de SF + TW80
a cada saco.
5. Fecharam-se os sacos.
6. Macerou-se manual e cuidadosamente os morangos.
7. Colocou-se os sacos no stomacher durante 15 minutos a homogeneizar.
8. Deixou-se repousar cerca de 1 minuto.
9. Abriu-se as placas de controlo da câmara (esquerda, centro e direita) e co-
locou-se no fundo da câmara.
10. Efectuou-se o controlo microbiológico das soluções utilizadas através do
espalhamento de 0,1mL de cada solução (SF e SF+TW) em 3 placas de
TSA. AS placas foram incubadas a 30ºC durante 7 dias.
11. Colocou-se 9mL de soro fisiológico em cada um dos tubos de ensaio, pas-
sando sempre o bocal à chama depois de abrir o tubo e antes de o fechar.
12. Efetuaram-se as diluições necessárias adicionando 1mL da solução inicial
(10-1) e 1mL da diluição anterior (10-2) aos tubos de ensaio.
13. Homogeneizou-se os tubos de ensaio no vórtex.
14. Inocularam-se vários volumes para cada dose em estudo.
a. 0kGy: identificaram-se os tubos (10-1 e 10-2). Posteriormente, usando
um pipetador automático e uma pipeta de 1mL inoculou-se um volume
de 0,1mL de cada solução, em três placas (3 réplicas por dose e por di-
luição) de TSA. De seguida fez-se o espalhamento.
b. 0,5kGy: Colocou-se 9mL de soro fisiológico num tubo e adicionou-se
1mL da solução do saco, identificado para esta dose, para fazer a dilui-
ção 10-1. Seguidamente inoculou-se um volume de 0,1mL da diluição
anterior em três placas de TSA. Pipetou-se diretamente um volume de
0,1mL da solução do saco para as outras três placas. De seguida fez-
se o espalhamento.
c. 1,5kGy: Inoculou-se volumes de 1mL e 0,1mL em cada uma das três
placas de TSA a partir da solução do saco identificado para esta dose.
De seguida fez-se o espalhamento e deixou-se secar as placas inocu-
ladas com 1mL dentro da câmara.
d. 3,0kGy: Repetiu-se o procedimento realizado para a dose de 1,5kGy.
15. Uma vez secas, as placas foram fechadas ainda no interior da câmara.
16. No final do trabalho fecharam-se as placas de controlo e foram incubadas a
30ºC durante 7 dias.
17. Limpou-se a câmara de fluxo laminar.
18. Incubaram-se as placas de TSA a 30ºC durante 7 dias.
19. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório.
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DIA 4 – 25 de julho de 2013
»Leitura dos dosímetros
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Tesoura
Pinça
Dosímetros
Espectrofotómetro
Micrómetro
Procedimento experimental:
1. Abriu-se a embalagem dos dosímetros com uma tesoura.
2. Retirou-se os dosímetros do interior das embalagens com uma pinça.
3. Leu-se a absorvância dos dosímetros no espectrofotómetro.
4. Mediu-se a espessura do dosímetro com um micrómetro.
5. Registou-se todos os valores obtidos por dosímetro e por dose.
6. Efetuou-se o cálculo da dose real absorvida.
»Análise sensorial
Uma vez irradiados os morangos, iniciou-se uma nova etapa – a análise senso-
rial – que tem como principal objetivo manifestar as diferenças no paladar, con-
sistência, rigidez e aroma entre os morangos irradiados e os morangos não
irradiados.
1. Para isso foi confecionado gelado de morango utilizando os das doses de
0kGy e 3kGy com recurso a azoto líquido (-160°C), um processo eficaz e
muito utilizado na indústria alimentar.
DIA 5 – 26 de julho de 2013
»Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween
À semelhança do dia 1 (22-07-13) preparou-se mais soro fisiológico a 0,9%
com Tween80 (0,1%), mas desta vez um volume total de 1400mL.
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DIA 6 – 29 de julho de 2013
»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=5)
À semelhança do dia 3 (24-07-13) refez-se todo processo de determinação da
contaminação inicial e do número de sobreviventes nos morangos, 5 dias após
a irradiação dos mesmos que foram armazenados em condições de refrigera-
ção, com o objectivo de avaliar se existiam diferenças ao nível da contamina-
ção microbiológica e assim inferir sobre o tempo de parteleira de morangos
irradiados.
»Preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material
Materiais e Reagentes:
Proveta de 1000mL
Etanol
Água Milli-Q
Procedimento experimental:
1. Numa proveta mediram-se 700mL de etanol.
2. Nessa mesma proveta adicionou-se 300mL de água Milli-Q, perfazendo um
total de 1000mL de solução de etanol a 70%.
DIA 7 – 30 de julho de 2013
»Caracterização morfológica dos microrganismos isolados – observação ma-
croscópica
Identificou-se e fez-se a caracterização morfológica das colónias existentes a
nível macroscópico (pigmentação, textura, opacidade, forma, elevação e mar-
gem).
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DIA 8 – 31 de julho de 2013
»Isolamento dos microrganismos para caracterização morfológica – observa-
ção microscópica
Materiais e Reagentes: Equipamento:
Placas de TSA
Ansas de inoculação
Câmara de fluxo laminar
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Procedimento experimental:
1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar.
2. As colónias identificadas foram isoladas em TSA pela técnica do riscado:
a. Após ter retirado a massa de microrganismos a isolar, procedeu-
se ao riscado com a ansa de inoculação (nota: é necessário ter
atenção na força aplicada com a ansa de modo a não perfurar o
meio de cultura).
b. De seguida, mudou-se a direção da placa de modo a ser possível
espalhar os microrganismos por toda a placa, até ser possível
atingir uma colónia isolada.
3. Quando terminado este processo incubou-se as placas a 30°C durante 24
horas.
DIA 9 – 01 de agosto de 2013
»Caracterização morfológica - preparação a fresco, coloração Gram e ensaios
bioquímicos
Materiais e Reagentes:
Cristal Violeta Lugol Safranina
Descolorante (álcool + acetona)
Óleo de Imersão
Equipamento:
Câmara de fluxo laminar
Microscópio
Bico de Bunsen
Placas de petri
Lâminas
Fita-cola
Papel de filtro
Ansas de inoculação
Lamelas
Pinça
Pipetas de Pasteur
Papel absorvente
Água
Reagente de oxidase
Reagente de catalase
Procedimento experimental:
1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar.
2. Identificaram-se as lâminas segundo a codificação atribuída aos microrga-
nismos isolados da amostra inicial.
3. Começou-se por utilizar a técnica da fita-cola nos fungos, que consiste em,
levemente, colar um pedaço de fita-cola no fungo.Feita a recolha colou-se
o pedaço de fita-cola na lâmina, onde se colocou previamente uma gota de
água.
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4. Observaram-se as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e
óleo de imersão, fotografando cada uma delas.
5. Seguidamente fizeram-se as preparações a fresco, os testes bioquímicos
(oxidase e catalase) e as preparações para a coloração de Gram.
a. Preparações a fresco: com o auxílio da ansa de inoculação remo-
veu-se uma pequena quantidade de colónia, depositou-se e espa-
lhou-se a amostra numa lâmina com uma gota de água, colocando-
se de seguida uma lamela. Por fim observaram-se e fotografaram-se
as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e óleo de
imersão.
b. Oxidase: recortou-se uma folha de papel de filtro de modo a que
"encaixasse" no fundo de uma placa de petri. Humedeceu-se o filtro
com o reagente de oxidase (0,1g de N,N,N,N-tetrametil-1-4-diclorido
de fenil diamónio + 10mL H2O). Com recurso a uma ansa de inocu-
lação colocaram-se uma massa da colónia a caracterizar em cima
do papel esfregando-as. Esperou-se cerca de um minuto para ver o
resultado. Caso esteja presente a enzima citocromo oxidase então o
teste dará positivo assumindo a cor violeta escuro ou azul forte (oxi-
dase positiva).
c. Catalase: colocaram-se várias gotas de reagente de catalase (3 %
de H2O2 em H2O) na tampa de uma caixa de petri e com o auxílio de
uma ansa de inoculação colocaram-se uma massa das colónias em
cima de uma gota esfregando. Verificou-se a existência de bolhas de
gás como indicador de atividade catalásica por parte dos microrga-
nismos.
d. Coloração de Gram: preparou-se o esfregaço, deixou-se secar e fi-
xou-se, passando-se à chama três vezes. Coloriu-se, com muito cui-
dado para não tingir a área circundante, com Cristal Violeta. Aguar-
dou-se um minuto e de seguida lavaram-se as lâminas com água
corrente, apenas durante alguns segundos, tendo o cuidado de evi-
tar que a água atinja diretamente a massa de microrganismos. Re-
petiu-se o processo de coloração dos isolados desta vez com Lugol.
Lavaram-se as lâminas com um descolorante (solução de álcool a
96% e acetona) três vezes e de seguida com água corrente. Repe-
tiu-se o processo de coloração já efetuado com com Safranina. Por
fim, lavaram-se as lâminas em água corrente e secaram-se com pa-
pel absorvente. Observaram-se ao microscópio (ampliação 100x e
óleo de imersão), fotografando cada uma e registando o resultado da
coloração de Gram (positivo-azul/violeta, negativo-rosa).
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Esquema 1: Tipificação de microrganismos
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IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise
Para avaliar a inativação da população microbiana ao longo do tempo (t=0 dias
e t=5 dias após a irradiação) foram determinadas as unidades formadoras de
colónias por aproximadamente 25g de morangos para três subamostras de mo-
rangos frescos (antes da irradiação - contaminação inicial 0kGy e após irradia-
ção a três doses 0,5; 1,5 e 3kGy) através de contagens realizadas às 24h, 48h,
72h, 5º dia e 7º dia.
Aquando da irradiação foram colocados dois dosímetros por dose. Posterior-
mente efetuou-se a leitura dos dosímetros obtendo-se os seguintes resultados:
Após os sete dias de incubação a 30ºC cada aluno determinou através das
contagens efetuadas o valor de unidades formadoras de colónias por g de mo-
rango analisadas (ufc/g de morango) e com base nos resultados obtidos cons-
truíram-se duas curvas de sobrevivência (logaritmo de ufc/g de morango em
função da dose absorvida em kGy), uma para cada tempo após a irradiação em
estudo (t=0 e t=5)
Dose real (kGy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Confiança
Decréscimo relativo (%)
0 4,41 0,32 0,15 0
0,68 3,91 0,21 0,10 72
1,77 3,42 0,39 0,20 88
3,72 2,75 0,55 0,26 97
Amostra Tempo de irradiação
Nível Posição Absorvância Espessura
(mm)
Dose Absorvida
(kGy)
Dose média (kGy)
Débito dose
(kGy/h) 603 nm 651 nm
0,5 kGy
frente A
00h30
2
A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3
0,086 0,049 0,313
0,800
0,68
1,36
B 0,085 0,049 0,793
baixo A 0,101 0,06
0,379 0,782
B 0,094 0,055 0,742
1,5 kGy
frente A
01h20
0,304 0,182 0,316
2,327
1,77 B 0,291 0,175 2,232
baixo A 0,189 0,114
0,385 1,268
B 0,186 0,111 1,251
3 kGy
frente A
02h40
0,428 0,254 0,327
3,139
3,72 B 0,432 0,26 3,168
baixo A 0,556 0,336
0,306 4,379
B 0,534 0,323 4,200
Tabela 4: Dados recolhidos t=0 dias
Tabela 3: Resultados obtidos pela leitura dos dosímetros
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Após o tempo de incubação efectuou-se a caracterização morfológica dos mi-
crorganismos isolados para o t=0, bem como a determinação da frequência
relativa de cada tipo identificado. A representação gráfica apresentada no Grá-
fico 2 ilustra a frequência relativa dos tipos morfológicos por dose analisada.
Gráfico 1: Curva de sobrevivência t=0 dias
Gráfico 2: Frequência relativa de microrganismos consoante o tipo (esquema 1) e a
dose absorvida
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Como se pode observar no Gráfico 2, os grupos X (fungos filamentosos) e XI
(leveduras) apresentam maior frequência relativa como seria expectável, visto
que estão descritos como sendo os principais tipos de microrganismos em mo-
rangos frescos, além de que apresentam uma maior resistência aos efeitos ne-
fastos da radiação ionizante. Este facto é notório quando verificamos que a po-
pulação resitente a doses mais elevadas (3 kGy) de radiação gama é maiorita-
riamente constituída por fungos filamentosos e leveduras (tipo X – 67%, tipo XI
– 32,5%).
Dose real (kGy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Confiança
Decréscimo relativo (%)
0 4,93 0,19 0,09 0
0,68 4,65 0,46 0,21 25
1,77 3,66 0,65 0,37 87
3,72 3,37 0,45 0,23 96
Tabela 5: Dados recolhidos t=5 dias
Gráfico 3: Curva de sobrevivência t=5 dias
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Relativamente ao teste sensorial verificou-se que a diferença entre os moran-
gos irradiados e os não irradiados é notória, sendo que os irradiados são me-
nos rijos, com menor consistência, mais doces e com um aroma mais ativo.
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V. Conclusão
O aumento progressivo do número de indivíduos da população mundial gera
constantes desafios à sociedade. Segundo a ONU, estima-se que em 2050 a
população mundial atingirá os 9,6 biliões de pessoas. Surgem então necessi-
dades fundamentais, como a alimentação e cuidados de saúde para este nú-
mero de seres humanos.
Quanto menos contaminados os alimentos chegarem às prateleiras, menor se-
rá o número significativo de microrganismos neles presentes e assim maior
será o seu período de consumo em segurança, o que aumentará a quantidade
de alimento disponível.
Neste estudo foi explorada a técnica de inativação microbiana através de radi-
ação gama proveniente de uma fonte de Cobalto-60. Foi usada uma amostra
de aproximadamente 1kg de morangos, dos quais cerca de 600g foram irradia-
dos a diferentes doses.
Através dos resultados obtidos, concluiu-se que a taxa de sobrevivência de
microrganismos é menor quanto maior for a dose de radiação gama aplicada e
que o grande pico de crescimento dos microrganismos se dá às 72 horas.
Verificou-se, também, que nas doses de 1,5kGy e 3kGy existia um número su-
perior de fungos do que de bactérias. Este número chegava por vezes a ser
superior ao número de fungos presentes nas doses de 0kGy e 0,5kGy. Isto de-
ve-se ao facto de os fungos possuírem uma maior resistência a condições ad-
versas e a agentes letais como por exemplo os raios gama. A radiação ionizan-
te, consoante a dose e o tempo aplicado, inibe ou retarda a divisão celular nas
bactérias, mas nos fungos pode não surtir qualquer efeito na sua reprodução,
já que estes apresentam uma forma esporulada com elevada resistência a
condições inóspitas.
Tal como acima referido, comprovou-se com a análise sensorial que os moran-
gos irradiados passavam a apresentar menos rigidez, menor consistência, um
sabor mais doce e um aroma mais ativo, possivelmente devido ao facto de as
fibras, que garantem a consistência, textura e rigidez estarem associadas a
cadeias de polissacarídeos que são decompostos por ação da radiação dando
origem a polissacarídeos mais simples
Tendo em consideração todos estes aspetos pensamos ter atingido todos os
objetivos a que nos propusemos.
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VI. Bibliografia
http://www.cbesa.com.br/files/Revista_Controle_de_Contaminacao_162.pdf
(visitado em 28.07.2013)
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-
20611999000300018&nrm=iso&tlng=pt (visitado em 28.07.2013)
http://www.e-escola.pt/ftema.asp?tema=71&canal=5 (visitado em 30.07.2013)
AGRADECIMENTOS
Este trabalho é financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacio-
nal Factores de Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através
da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto RE-
CI/AAG-TEC/0400/2012
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