UNIVERSIDADE DE COIMBRA
FACULDADE DE MEDICINA
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE.
VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID.
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de
Coimbra para obtenção de Grau de Mestre em Medicina Legal
Orientador: Mestre João Miguel Gouveia Franco
Co-orientador: Professor Doutor Francisco Corte Real Gonçalves
CARLA MARIA PINTO MONTEIRO
COIMBRA 2012
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
i
RESUMO
O uso de substâncias orgânicas voláteis encontra-se amplamente disseminado nas
sociedades atuais. Desde uma extensa variedade de produtos de utilização
doméstica até muitos componentes de uso industrial têm substâncias voláteis na sua
constituição. A escassa literatura científica sobre os procedimentos analíticos a
seguir nas situações de intoxicação por muitas das substâncias voláteis, bem como a
particularidade da sua fácil evaporação, associada aos fenómenos de redistribuição
post mortem, originam frequentemente dificuldades interpretativas no estudo destes
casos.
O objetivo deste trabalho foi a otimização e validação de procedimentos analíticos
sensíveis e rápidos para a deteção e quantificação de alguns compostos orgânicos
voláteis (acetaldeído, acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, 1-butanol, clorofórmio,
éter, metanol, 2-propanol, tolueno e p-xileno) em diferentes matrizes (sangue, urina
e humor vítreo) utilizando um cromatógrafo de gás Agilent 6890N equipado com
um detetor de ionização de chama e acoplado a um injetor de headspace de volume
fixo (1 mL) Agilent G1888 (HS-GC/FID).
As substâncias em estudo foram divididas e agrupadas de acordo com a sua
solubilidade e gama de trabalho. Assim, as substâncias com elevada solubilidade
em água foram agrupadas numa mesma solução mistura (acetaldeído, acetato de
etilo, acetona, acetonitrilo, 1-butanol, éter, metanol, 2-propanol), enquanto as
restantes, caracterizadas pela sua elevada insolubilidade em água mas apresentando
uma boa solubilidade em metanol, foram divididas de acordo com as respetivas
gamas de trabalho.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
ii
Antes da análise cromatográfica, todas as amostras, incluindo os calibradores,
foram diluídas. Para tal, 100 L de urina, humor vítreo ou sangue foram diluídos
em 1 ml de solução aquosa de n-propanol (100 mg/L), utilizado como padrão
interno. A separação cromatográfica foi realizada utilizando duas colunas capilares
com diferentes polaridades, a fim de garantir o cumprimento dos critérios de
identificação recomendados para este tipo de análise. Todos os compostos
estudados, incluindo o n-propanol (padrão interno), eluíram num intervalo de tempo
de 15 minutos e todos apresentaram uma boa resolução sem interferência de
metabolitos, produtos de degradação ou outras substâncias.
O estudo incidiu sobre todos os parâmetros referidos no procedimento de validação
de métodos quantitativos em vigor no Serviço de Toxicologia Forense da
Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P., o que incluiu o
estudo da seletividade, linearidade, limites de deteção e quantificação, precisão,
robustez, estabilidade e exatidão. Após a análise dos resultados obtidos foi possível
concluir pela adequabilidade do método analítico desenvolvido, tendo sido aplicado
a casos reais.
PALAVRAS-CHAVE
Toxicologia forense; substâncias orgânicas voláteis; cromatografia gasosa;
headspace; validação.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
iii
ABSTRACT
The use of volatile organic substances is widespread in contemporary societies. A
wide variety of products for household use until many components for industrial
use have volatile substances in its constitution. The sparse literature on the
analytical procedures to be followed in cases of poisoning by many of the volatile
substances, as well as the particularity of its easy evaporation, associated with the
phenomena of post mortem redistribution, create interpretive difficulties in the
study of these cases.
The purpose of this work was the optimization and validation of sensitive and rapid
analytical procedures to the detection and quantification of some volatile organic
compounds (acetaldehyde, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, 1-butanol,
chloroform, ether, methanol, 2-propanol, toluene and p-xylene) in different
matrices (blood, urine and vitreous humor) using a gas chromatograph Agilent
6890N, equipped with a flame ionization detector coupled to a headspace injector
of fixed volume (1 mL) Agilent G1888 (HS-GC/FID).
The substances under study were divided and grouped according to their solubility
and working range. For substances with high water solubility it was created a
mixture solution (acetaldehyde, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, 1-butanol, ether,
methanol, 2-propanol), while the others, characterized by high water insolubility
but with good solubility in methanol, were divided according to the respective
working range.
Before the gas chromatography analysis, all specimens, including the calibrators,
were diluted. With this purpose 100 µL of urine, vitreous humor or blood were
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
iv
diluted with 1 mL aqueous solution of n-propanol (100 mg/L), used as internal
standard.
The chromatographic separation was performed using two capillary columns with
different polarities, in order to ensure fulfillment of the identification criteria
recommended for this type of analysis. All compounds studied, including n-
propanol (internal standard), eluted in a run time of 15 minutes and were all well
resolved with no interference of metabolites, degradation products or other
substances.
The study focused on all parameters included in the validation procedure for
quantitative methods, in place at the forensic toxicology laboratory of Centre
Branch – Portuguese National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences,
I.P., which included the study of selectivity, linearity, limits of detection and
quantification, stability, precision, accuracy, robustness. After analyzing the results
we concluded the suitability of the analytical method developed, and used it in real
casework.
KEYWORDS
Forensic toxicology; volatile organic substances; gas chromatography; headspace;
validation.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
v
ÍNDICE GERAL
Resumo i
Abstract iii
Índice de Figuras ix
Índice de Tabelas x
Lista de símbolos, unidades e abreviaturas xii
Parte I – INTRODUÇÃO 1
1.1 Justificação do tema 3
1.2 Objetivos 6
Parte II – REVISÃO DA LITERATURA 7
2.1 Substâncias voláteis em análise 9
2.1.1 Acetaldeído 12
2.1.2 Acetato de etilo 13
2.1.3 Acetona 14
2.1.4 Acetonitrilo 16
2.1.5 1-Butanol 17
2.1.6 Clorofórmio 18
2.1.7 Éter 20
2.1.8 Metanol 22
2.1.9 2-Propanol 23
2.1.10 Tolueno 25
2.1.11 Xileno 27
2.2 Cromatografia gasosa com detetor de ionização de chama e sistema
de injeção de headspace (HS-GC/FID)
29
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
vi
2.2.1 Cromatografia gasosa (GC) 29
2.2.2 Detetor de ionização de chama (FID) 30
2.2.3 Sistema de headspace (HS) 31
2.3 Matrizes biológicas 32
2.4 Validação de métodos analíticos 35
2.4.1 Introdução 35
2.4.2 Definição dos parâmetros de validação 36
2.4.2.1 Seletividade /especificidade 36
2.4.2.2 Modelo de calibração 38
2.4.2.3 Linearidade 39
2.4.2.4 Gama de trabalho 40
2.4.2.5 Precisão 41
2.4.2.6 Exatidão 42
2.4.2.7 Limites de deteção e de quantificação 42
2.4.2.8 Robustez 43
2.4.2.9 Estabilidade 44
Parte III – TRABALHO EXPERIMENTAL 45
3.1 Introdução 47
3.2 Material e métodos 47
3.2.1 Substâncias estudadas 47
3.2.2 Amostras biológicas 48
3.2.3 Padrões, reagentes e material 48
3.2.3.1 Padrões 48
3.2.3.2 Reagentes 49
3.2.3.3 Material 49
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
vii
3.2.4. Equipamentos 49
3.2.3.1 Aparelhos de uso comum 49
3.2.3.2 Pipetas e doseadores 50
3.2.3.3 Instrumentos analíticos 50
3.2.5 Procedimento analítico 50
3.2.5.1 Preparação das soluções 50
3.2.5.2 Preparação das amostras de ensaio 56
3.2.5.3 Preparação das curvas de calibração 56
3.2.5.4 Preparação das amostras de controlo de qualidade
interno
58
3.2.6 Análise instrumental (HS-GC/FID) 60
3.3 Resultados e discussão 61
3.3.1 Desenvolvimento do método analítico 61
3.3.2 Identificação das substâncias 63
3.3.3 Validação do método analítico desenvolvido 63
3.3.3.1Especificidade/seletividade 64
3.3.3.2 Linearidade 70
3.3.3.3Limites de deteção e de quantificação 72
3.3.3.4 Repetibilidade do equipamento 74
3.3.3.5 Precisão intermédia 75
3.3.3.6 Exatidão 78
3.3.3.7 Robustez 81
3.3.3.8 Avaliação dos fenómenos de arrastamento (carryover) 81
3.3.3.9 Teste ao limiar analítico de quantificação 82
3.3.3.10 Estabilidade 84
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
viii
Parte IV – APLICAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO EM AMOSTRAS
REAIS
85
Parte V – CONCLUSÕES 91
Parte VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97
Parte VII – ANEXOS- Resultados do Procedimento de Validação 107
7.1 Experiência efetuada à temperatura do injetor 109
7.2 Linearidade 110
7.3 Limites de deteção e quantificação 125
7.4 Repetibilidade do equipamento 140
7.5 Precisão intermédia 142
7.6 Exatidão 151
7.7 Teste ao limite de quantificação 155
Agradecimentos
159
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
ix
Índice de Figuras
Figura 1 Esquema do sistema de cromatografia gasosa (adaptado de
Moffat et al., 2004).
30
Figura 2 Esquema do detetor FID (adaptado de Moffat et al., 2004). 31
Figura 3 Cromatograma da análise das substâncias a 1000 mg/L. 62
Figura 4 Cromatograma da amostra 8A de urina, não fortificada. 68
Figura 5 Cromatograma da amostra 8B de urina, fortificada. 69
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
x
Índice de Tabelas
Tabela 1 Substâncias voláteis usualmente utilizadas (Esmail et al.,
1993).
9
Tabela 2 Principais características do sistema HS-GC/FID utilizado. 50
Tabela 3 Agrupamento das substâncias por solubilidade e gama de
trabalho.
51
Tabela 4 Preparação da curva de calibração- mistura II. 57
Tabela 5 Preparação da curva de calibração- mistura III. 57
Tabela 6 Preparação da curva de calibração- clorofórmio. 58
Tabela 7 Preparação dos CQI- mistura II. 59
Tabela 8 Preparação dos CQI- mistura III. 59
Tabela 9 Preparação dos CQI- clorofórmio. 59
Tabela 10 Parâmetros de validação em função do tipo de método
utilizado.
64
Tabela 11 Informação sobre as amostras de sangue/urina usadas para
constituir as misturas (pools).
65
Tabela 12 Informação sobre as amostras de humor vítreo usadas para
constituir as misturas (pools).
66
Tabela 13 Resultados obtidos no estudo da especificidade/seletividade. 69
Tabela 14 Resultados obtidos no estudo da linearidade. 71
Tabela 15 Resultados obtidos no estudo dos limiares analíticos. 73
Tabela 16 Resultados obtidos para o controlo baixo (100 e 250 mg/L). 74
Tabela 17 Resultados obtidos para o controlo alto (750, 800 e 1500
mg/L).
75
Tabela 18 Tabela ANOVA (fator único). 76
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
xi
Tabela 19 Cálculo das estimativas da precisão intermédia e da
repetibilidade.
76
Tabela 20 Estudo da repetibilidade e da precisão intermédia do método
analítico.
77
Tabela 21 Resultados obtidos para a exatidão. 79
Tabela 22 Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de
sangue.
82
Tabela 23 Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de urina. 83
Tabela 24 Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de
humor vítreo.
83
Tabela 25 Apresentação dos casos reais analisados. 88
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
xii
Lista de símbolos, unidades e abreviaturas
ADH Álcool Desidrogenase
AE Amostra de ensaio
AP Amostra primária
CQI Controlo de qualidade interno
CV Coeficiente de Variação
DFSA Drug facilitaded sexual assault
DP Desvio padrão
et al. et alii, e outros
e.g. exempli gratia, por exemplo
FID Detetor de ionização em chama
GC Cromatografia gasosa
GC/MS Cromatografia gasosa / espectrometria de massa
HS Headspace
HS-GC/FID Cromatografia gasosa com detetor de ionização de chama e sistema
de injeção de headspace
ICH International Conference on Harmonisation
INML Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P.
ISO International Organization for Standardization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LC/MS Cromatografia líquida / espectrometria de massa
LOD Limite de deteção
LOQ Limite de quantificação
MEFS Micro-extração em fase sólida
MS Espectrometria de massa
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
xiii
PI Padrão interno
RSD Desvio padrão relativo
SOFT Society of Forensic Toxicologists
STF Serviço de toxicologia forense
TRR Tempo de retenção relativo
m metro
μL microlitro
min minuto
mm milímetro
mg/L miligrama por litro
L Litro
ºC graus Celsius
r Coeficiente de correlação
r2 Coeficiente de determinação
< menor que…
> maior que...
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
1
Parte I – INTRODUÇÃO
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
3
1.1 Justificação do tema
A análise de substâncias orgânicas voláteis no âmbito de intoxicações com interesse
forense constitui um importante e, muitas vezes, difícil desafio colocado à
Toxicologia Forense. Além do etanol, cujo procedimento analítico se encontra já
amplamente validado em múltiplos laboratórios e, por isso, não incluído no
presente trabalho, substâncias como a acetona, o tolueno, o xileno, o isopropanol ou
o metanol entre outras, podem surgir envolvidas em situações onde a sua
determinação se revela essencial para o respetivo enquadramento médico-legal.
O isopropanol e o metanol são álcoois amplamente utilizados na indústria: o
isopropanol pode ser encontrado em produtos de limpeza ou na indústria gráfica e o
metanol constitui um ingrediente habitual de muitos solventes, entre outras
aplicações. O acetaldeído é utilizado no fabrico de plásticos, corantes ou resinas. A
acetona é utilizada frequentemente como solvente, em tintas ou vernizes, bem como
em múltiplas áreas industriais. Em resumo, as substâncias orgânicas voláteis são
constituintes de uma grande variedade de produtos de utilização doméstica ou
industrial, estando em contacto frequente com os seres humanos e podendo, por
essa circunstância, originar intoxicações de forma acidental devido a uma
exposição mais ou menos prolongada.
Uma outra forma de intoxicação por substâncias voláteis surge em resultado da sua
utilização abusiva e voluntária, com vista à obtenção de efeitos psicoativos. Esta
prática pode encontrar explicação no facto de se tratar de compostos presentes em
produtos baratos e de fácil acesso. Esta realidade constitui um quadro motivador de
solicitações para a realização de análises toxicológicas por parte dos laboratórios de
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
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toxicologia forense, as quais podem assumir uma grande relevância em alguns
países.
Tais substâncias podem ser analisadas não apenas no contexto de uma investigação
de natureza forense, podendo o seu estudo revelar-se igualmente de grande
utilidade no âmbito clínico. A título de exemplo, a acetona, tal como o acetaldeído,
é um composto volátil cuja deteção e quantificação pode ser usada como
biomarcador de doenças e/ou intoxicações.
Não obstante a sua ampla utilização, os compostos referidos possuem toxicidade
reconhecida que se traduz no aparecimento frequente de situações com interesse
forense.
Contudo, os estudos científicos publicados relativos à validação dos procedimentos
analíticos necessários para a determinação destas substâncias são relativamente
escassos, evidenciando, por vezes, dificuldades interpretativas que importa
considerar. Tais problemas interpretativos resultam, em grande parte, da
complexidade dos procedimentos analíticos subjacentes à determinação de
substâncias que se evaporam com muita facilidade, implicando requisitos
específicos que variam entre alguns destes compostos.
Assim, e tendo em consideração a pesquisa bibliográfica efetuada, o presente
trabalho incluiu o estudo dos procedimentos necessários à determinação de
acetaldeído, acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, 1-butanol, clorofórmio, éter,
metanol, 2-propanol, tolueno e xileno, pelo facto de estas substâncias voláteis
poderem estar facilmente envolvidas em situações de interesse forense e/ou clínico
e, por isso, a sua identificação e quantificação poderem ser requeridas a um
laboratório de toxicologia. A sua disponibilidade para uso comum, a nível
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
5
doméstico, industrial e laboratorial, justificou também a opção pelo estudo destes
compostos.
A escolha das matrizes biológicas utilizadas no presente trabalho teve em
consideração a sua representatividade relativamente às amostras recebidas num
laboratório de toxicologia forense, bem como as suas características específicas: o
sangue constitui a matriz de eleição para a realização de análises toxicológicas
forenses; a acumulação de substâncias tóxicas e respetivos metabolitos a nível da
urina costuma ser um fator facilitador da sua deteção; o humor vítreo está
usualmente menos sujeito a contaminações bacterianas ou fúngicas, possuindo
condições estéreis que facilitam as análises em fases mais avançadas da
decomposição.
A utilização de um cromatógrafo de gases Agilent® 6890N equipado com um
detetor de ionização de chama e acoplado a um injetor headspace Agilent G1888
(HS-GC/FID) teve como justificação a circunstância de ser esta a tecnologia
disponível no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do INML
para a realização de análises de alcoolémia e, também, por ser considerada
adequada para a análise de substâncias voláteis.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
6
1.2 Objetivos
O presente estudo teve como propósito o desenvolvimento de um método analítico
que permitisse a deteção e quantificação de um grupo de substâncias voláteis com
interesse forense, em diversas matrizes biológicas (sangue, urina e humor vítreo).
Para o desenvolvimento do respetivo método pretendeu-se utilizar a tecnologia
disponível no laboratório e considerada adequada para a análise do tipo de
substâncias envolvidas, nomeadamente um cromatógrafo gasoso equipado com um
detetor de ionização de chama, sendo as amostras injetadas no sistema através de
um injetor de headspace.
A confirmação da presença das substâncias de interesse seria baseada, após a
seleção de um padrão interno adequado, na comparação entre os tempos de
retenção relativos obtidos para os picos cromatográficos presentes nas amostras
suspeitas e os de padrões analíticos analisados contemporaneamente e nas mesmas
condições analíticas.
Assim, constituiu objetivo específico a validação do método atrás referido no
equipamento utilizado na rotina do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação
do Centro do INML, um cromatógrafo gasoso Agilent® 6890N, dotado de um
detetor de ionização de chama, acoplado a um injetor de headspace de volume fixo
(loop) Agilent G1888.
Por último, pretendeu-se aplicar o método desenvolvido e validado a casos reais,
nos quais houvesse suspeita da presença de uma ou mais das substâncias envolvidas
neste estudo.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
7
Parte II – REVISÃO DA LITERATURA
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
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2.1 Substâncias voláteis em análise
O uso de substâncias orgânicas voláteis encontra-se amplamente disseminado nas
sociedades atuais. Desde uma extensa variedade de produtos de utilização
doméstica até muitos componentes de uso industrial têm substâncias voláteis na sua
constituição. Diversos produtos de limpeza bem como tintas ou diluentes, colas,
isqueiros, aerossóis, extintores, corretores de escrita, agentes desengordurantes,
cosméticos, combustíveis, entre muitos outros, possuem na sua constituição
produtos voláteis (Tabela 1).
Tabela 1- Substâncias voláteis usualmente utilizadas (Esmail et al., 1993).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
10
Uma forma relativamente comum de intoxicação por substâncias voláteis consiste
na sua inalação voluntária com vista à produção de efeitos sobre o sistema nervoso
central, designadamente sensação de prazer, desinibição, euforia e alucinações
(glue sniffing). O abuso de substâncias voláteis com o objetivo de produzir efeitos
psicoativos pode constituir, por isso, um problema similar ao do uso de drogas
ilícitas. Pelo facto de serem produtos baratos e de fácil acesso, as substâncias
voláteis são frequentemente utilizadas com fins abusivos pelos adolescentes em
diversos países. Dependendo da quantidade inalada, algumas destas substâncias
produzem efeitos depressores no sistema nervoso central semelhantes ao etanol ou
aos barbitúricos, podendo provocar, também, fenómenos de dependência
psicológica. Apesar de esta forma de intoxicação constituir um problema de saúde
pública em diversos países, muitas vezes não se conhece devidamente o alcance
deste fenómeno, pelo que é frequentemente desvalorizado. O problema assume
particular complexidade pela circunstância de não existirem medidas de controlo
aduaneiro para muitas destas substâncias voláteis apesar de terem sido aprovadas
algumas normas relativamente à acetona, ao dietileter ou ao tolueno com vista à
prevenção da sua utilização na síntese ou purificação de drogas ilícitas (Ramsey et
al., 1989; Flanagan et al., 1997; Gaulier et al., 2003; Wu et al., 2006; Baydala et al.,
2010).
A intoxicação pode ocorrer, com maior frequência, de forma acidental por
exposição mais ou menos prolongada a estas substâncias ou na sequência do seu
uso deliberado. Apesar de existirem muito menos intoxicações fatais do que não
fatais, a exposição aguda a substâncias voláteis poderá ter efeitos cardiovasculares e
pulmonares, tais como arritmias, hipotensão ou hipoxemia, entre outros, podendo
originar a morte. As alterações de consciência provocadas poderão também
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
11
favorecer a ocorrência de acidentes. A exposição crónica a algumas destas
substâncias, de forma deliberada ou involuntária, pode provocar um conjunto de
sinais e sintomas relacionados com a sua ação nefasta sobre a mielina e membranas
neuronais. Os efeitos neurológicos poderão incluir diversos tipos de disfunção
cerebral e alterações motoras e sensitivas. Poderá ser observado tremor,
irritabilidade, ataxia, nistagmo, discurso arrastado, diminuição da acuidade visual e
surdez. Poderão ainda ser observadas alterações cardíacas, respiratórias, renais,
hepáticas ou a nível da medula óssea, entre outras (Marjot et al., 1989; Rinsky,
1989; Esmail et al., 1993; Meadows et al., 1996; Garnier, 2000; Brouette et al.,
2001; Baselt, 2002; Rosenberg et al., 2002; Baydala et al., 2010).
Nas intoxicações por este tipo de substâncias é fundamental um cuidadoso exame
do local, pois os achados autópticos são normalmente inespecíficos. Por este
motivo, os exames complementares toxicológicos adquirem igualmente uma
relevância crucial para o conhecimento etiológico da intoxicação, sendo
frequentemente a única forma de comprovar a causa da morte (Steffee et al., 1996).
Refira-se também que é importante efetuar um diagnóstico diferencial com
situações de natureza clínica, dado que algumas destas substâncias constituem
biomarcadores de diversas doenças.
A escassa literatura científica sobre os procedimentos analíticos a seguir nas
situações de intoxicação por muitas das substâncias voláteis, bem como a
particularidade da sua fácil evaporação, associada aos fenómenos de redistribuição
post mortem, originam frequentemente dificuldades interpretativas no estudo destes
casos.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
12
2.1.1 Acetaldeído
O acetaldeído ou etanal possui a fórmula química C2H4O. É um líquido incolor e
volátil utilizado no fabrico de vários produtos sintéticos, incluindo certos plásticos,
corantes e resinas.
Os seres humanos estão, frequentemente, expostos ao acetaldeído, quer pela
simples presença deste no ar quer como contaminante de alimentos e bebidas
alcoólicas (Helena Pontes et al., 2009). O acetaldeído é o principal metabolito do
etanol, apresentando no entanto uma toxicidade superior (Moffat et al., 2004). Os
níveis endógenos de acetaldeído no sangue não apresentam, regra geral, valores
superiores a 0,2 mg/L. Após a ingestão, por parte de voluntários, de doses elevadas
de etanol, verificou-se a produção de concentrações sanguíneas de acetaldeído na
ordem dos 0,9-1,3 mg/L, enquanto para alcoólicos crónicos estes níveis variaram
entre 1,7-2,5 mg/L (Korsten et al., 1975). Em 2002 (Zuba et al., 2002) foi
demonstrada a presença de níveis mensuráveis de acetaldeído, metanol, acetona e
isopropranol em amostras de sangue de alcoólicos crónicos. De acordo com alguns
autores (TIAFT, 2012) são consideradas tóxicas as concentrações de acetaldeído
superiores a 100 mg/L.
Para além de ser um metabolito de várias substâncias o acetaldeído sofre um
metabolismo adicional de oxidação em ácido acético e, eventualmente, em dióxido
de carbono e água.
O interesse forense na determinação de acetaldeído assenta, para além do facto de
ser metabolito do etanol, na sua utilização como marcador de putrefação das
amostras (Feltraco et al., 2009).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
13
Ao longo dos anos têm sido apresentadas diversas técnicas para a determinação do
acetaldeído, tais como a espectrofotometria de ultravioleta, a cromatografia gasosa
por injeção direta de headspace ou ainda a cromatografia líquida após
derivatização, em matrizes como o sangue e a urina (Baselt, 2004). Mais
recentemente foi demonstrada a utilização de técnicas de micro-extração em fase
sólida para a análise desta substância (MEFS) (Feltraco et al., 2009).
2.1.2 Acetato de etilo
O acetato de etilo, um éster simples de etanol e ácido acético, é um composto
orgânico de fórmula CH3COOCH2CH3. À temperatura ambiente apresenta-se como
um líquido incolor com um odor característico doce. No passado foi usado em
medicina como um antiespasmódico. Atualmente é utilizado como solvente para
vernizes, revestimentos, plásticos, lacas e produtos farmacêuticos.
A exposição ao acetato de etilo provoca irritação nos olhos, membranas das
mucosas, gengivas e trato respiratório. Os sintomas de irritação podem também
surgir ao nível da pele. Outros sintomas associados a intoxicações por acetato de
etilo incluem distúrbios gastrointestinais, náuseas, cefaleias e vómitos. A exposição
crónica por inalação pode causar danos nos pulmões e coração, assim como
alterações renais ou hepáticas. A exposição a concentrações elevadas pode causar
sonolência, perda de consciência, narcose e depressão do sistema nervoso central.
Encontram-se descritos alguns casos associados a intoxicações letais por acetato de
etilo. Um deles remonta a 1931, quando um operário foi encontrado morto no
interior de um tanque que possuía uma tinta contendo acetato de etilo entre outros
constituintes. A morte terá resultado de narcose ou anoxia. Um outro caso refere-se
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
14
à morte de um indivíduo de 39 anos de idade, que foi encontrado no interior de um
tanque contendo acetato de etilo (Coopman et al., 2004).
Sob o ponto de vista forense, importa considerar que o acetato de etilo é um
constituinte comum de diluentes, podendo ser encontrado conjuntamente com
outras substâncias, como será o caso do tolueno. O acetato de etilo apresenta
propriedades anestésicas e excitatórias, razão pela qual se tornou um problema
social relacionado com o abuso por inalação intencional em jovens adolescentes.
Os intervalos de referência para a concentração de acetato de etilo no sangue,
considerando situações de exposição normal e tóxica, não se encontram ainda
estabelecidos, de acordo com a bibliografia consultada.
As metodologias analíticas referenciadas na literatura para a determinação de
acetato de etilo incluem a cromatografia gasosa acoplada a diferentes detetores (e.g.
FID, MS) (Moffat et al., 2004; Coopman et al., 2004).
2.1.3 Acetona
A acetona ou 2-propanona, com a fórmula química CH3COCH3, é um composto
orgânico que se apresenta como um líquido incolor de odor característico e que se
evapora facilmente à temperatura ambiente, sendo frequentemente utilizada como
solvente e reagente intermediário na produção química. Além disso, também é
produzida endogenamente no homem ou encontrada como um metabolito do
isopropanol (Baselt, 2004).
Relativamente a outros compostos voláteis, a acetona (endógena) é o que pode ser
encontrado em concentrações mais elevadas nos seres humanos, sendo a sua
presença considerada como normal para valores até 10 mg/L (Baselt, 2004). A sua
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
15
concentração é habitualmente mais elevada no sangue e urina de pessoas diabéticas
estando, no sangue de diabéticos controlados, usualmente presente em
concentrações até 30 mg/L (Jones et al., 1993; Baselt, 2004; TIAFT, 2012). Nas
situações de cetoacidose diabética, ou até mesmo em jejum prolongado, as
concentrações sanguíneas de acetona podem variar entre 100 e 700 mg/L (Baselt,
2004; TIAFT, 2012). A presença de acetona como consequência de cetoacidose
diabética pode originar um quadro clínico semelhante ao da intoxicação alcoólica,
sendo a sua determinação importante para o diagnóstico diferencial (Feltraco et al.,
2009).
Pelo facto de a acetona ser um componente de um elevado número de produtos de
limpeza (e.g. remoção de verniz de unhas) a sua ingestão constitui um elevado risco
para a saúde das crianças (Gamis et al., 1988). No entanto, a acetona é considerada
como uma substância pouco tóxica, quando ingerida. Zetting refere o caso de um
homem que conseguiu sobreviver, após beber 800 mL de acetona e ter apresentado
no soro e urina concentrações de 2000 e 2300 mg/L, respetivamente (Zettting et al.,
1997). Em situações de intoxicação leve os sintomas são caracterizados por
sonolência e discurso incoerente. Nos casos mais graves pode chegar a ocorrer
coma profundo (Ramu et al., 1978).
A acetona é referenciada como podendo ser utilizada de forma abusiva (glue-
sniffing), essencialmente devido à sua fácil obtenção. Esta utilização pode provocar
efeitos tóxicos graves, que têm sido associados a concentrações sanguíneas num
intervalo de 200 a 300 mg/L (Moffat et al., 2004; TIAFT, 2012). Foi descrito um
caso letal que apresentava uma concentração sanguínea de 550 mg/L (Moffat et al.,
2004).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
16
A acetona é metabolizada, por oxidação, em acetato e formiato. Quando presente
no sangue em doses mais elevadas a excreção é feita em grande parte através da
respiração e, em menor grau, pela urina (Baselt, 2004; Moffat et al., 2004).
Widmark descreveu um método de titulação suficientemente sensível para a
medição de acetona em fluidos biológicos (Widmark, 1919). Desde aí têm sido
publicados trabalhos com referência à utilização de diferentes métodos analíticos,
com maior incidência nos que fazem uso de técnicas cromatográficas.
2.1.4 Acetonitrilo
O acetonitrilo é um composto químico com a fórmula molecular CH3CN, sendo um
líquido incolor no seu estado natural. É utilizado como solvente em análise
laboratorial e como intermediário em reações de síntese química. Para além da sua
utilização laboratorial ou industrial o acetonitrilo pode ser encontrado como um
ingrediente de produtos de utilização geral (e.g. produtos para remoção de colas).
Uma parte muito significativa da toxicidade exibida pelo acetonitrilo resulta da sua
bioconversão em cianeto, podendo decorrer várias horas até ao surgimento dos
sintomas, devido ao facto da metabolização em cianeto ser relativamente lenta.
Swanson publicou um artigo em que descreveu um caso letal e um levantamento
bibliográfico com referência a 11 casos relacionados com situações de intoxicação
motivadas por esta substância, cinco deles fatais (Swanson et al., 1994). Um dos
casos referidos foi o de uma criança de 16 meses de idade que ingeriu entre 15-30
mL de acetonitrilo presente num removedor de unhas artificiais. Embora o centro
de apoio ao tratamento de intoxicações tenha sido contactado o produto foi
assumido como sendo essencialmente constituído por acetona e, por isso, dotado de
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
17
relativamente pouca toxicidade. Por esse motivo a criança foi colocada a dormir
sem qualquer tratamento adicional, acabando por falecer passadas algumas horas. A
concentração média de acetonitrilo determinada nas amostras de sangue colhidas
em vítimas de intoxicação fatal, por ingestão acidental ou por inalação prolongada
de vapor, foi de 573 mg/L (num intervalo de 160-800 mg/L) e de 6,2 mg/L (num
intervalo de 2,4-15 mg/L) para o cianeto (Baselt, 2004).
O acetonitrilo, como já anteriormente referido, sofre biotransformação em cianeto
sendo posteriormente metabolizado em tiocianato. Estima-se que pelo menos 12%
de uma dose inalada de acetonitrilo é metabolizada desta maneira, sendo uma
porção substancial eliminada na forma inalterada pela respiração (Swanson et al.,
1994; Baselt, 2004).
A análise do acetonitrilo pode ser realizada em amostras biológicas por
cromatografia gasosa com detetores de ionização de chama ou de espectrometria de
massa. Alguma dificuldade analítica prende-se com a circunstância de alguns
métodos de cromatografia gasosa não serem capazes de distinguir o acetonitrilo do
etanol. Em dois casos fatais provocados por ingestão de acetonitrilo, relatados por
Jones (Jones et al., 1992), o agente da intoxicação foi inicialmente identificado
erroneamente como etanol, devido ao facto de os tempos de retenção destas duas
substâncias serem muito semelhantes e apesar de as respetivas análises terem sido
efetuadas com recurso a duas colunas analíticas de polaridade distinta.
2.1.5 1-Butanol
O butanol (1-butanol, n-butanol), ou álcool butílico, é um álcool primário com a
fórmula molecular C4H9OH. O butanol é largamente utilizado como um solvente
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
18
industrial e também como intermediário químico em reações de síntese industrial.
Alguns relatórios médicos da década de 1950 referem que esta substância chegou a
ser utilizada em vítimas de cancro e pacientes cirúrgicos, através de injeções
intramusculares, para o alívio da dor (Baselt, 2004).
Este álcool pode ser absorvido através da pele, pulmões e trato gastrointestinal.
Estudos efetuados em animais de laboratório revelaram que o n-butanol é
metabolizado de forma extensa no prazo de 24 horas. Após uma dose oral única
cerca de 83% foi convertido em dióxido de carbono, 4% foi excretado na urina e
cerca de 12% da dose permaneceu no organismo (Baselt, 2004).
À semelhança de outros álcoois o butanol é considerado tóxico e mais potente do
que o etanol ou o isopropanol em termos de efeitos depressores do sistema nervoso.
A exposição a concentrações de 50-200 ppm de n-butanol no ar pode causar
irritação nos olhos, nariz e garganta, visão turva, dor de cabeça e tonturas (Baselt,
2004).
Kintz e colaboradores (Kintz et al., 1997) descreveram o caso de uma mulher
encontrada morta em casa, suspeitando-se ter ocorrido a ingestão de n-butanol com
intenção suicida. A respetiva análise ao sangue revelou a presença de 1530 mg/L de
n-butanol.
A determinação desta substância em amostras biológicas é habitualmente feita com
recurso a técnicas de cromatografia em fase gasosa.
2.1.6 Clorofórmio
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
19
O triclorometano, vulgarmente conhecido por clorofórmio e com a fórmula química
CHCl3, é um líquido incolor e volátil tendo sido sintetizado pela primeira vez em
1831. No passado foi largamente utilizado como anestésico por inalação embora
atualmente seja considerada obsoleta a sua utilização com esta finalidade. O
clorofórmio também fazia parte de muitas preparações farmacêuticas mas depois de
vários estudos realizados em animais de laboratório terem demonstrado o seu
potencial carcinogénico a sua utilização em seres humanos ou animais foi proibida
nos Estados Unidos (Baselt, 2004; Gaillard et al., 2006). Atualmente a sua principal
utilização é como solvente podendo ainda ser encontrado na indústria como
intermediário químico.
No homem o clorofórmio sofre uma considerável biotransformação originando a
formação de dióxido de carbono e ácido clorídrico. Fry (Fry et al., 1972) refere que
uma média de 43% (intervalo de 18-67%) de uma dose única é eliminada na sua
forma inalterada através do ar expirado, com menos de 0,01% da dose a ser
encontrada na urina após 8 horas. Esta substância é extremamente lipossolúvel e
tende, por isso, a acumular-se no tecido adiposo (Vogt et al., 1980).
O principal efeito do clorofórmio é a depressão do sistema nervoso central,
podendo uma exposição aguda a este composto resultar em morte devido a
insuficiência respiratória. Este efeito marcadamente depressor do sistema nervoso
central motivou a sua utilização com fins suicidas ou para facilitar a concretização
de assaltos e homicídios (Kim et al., 1996; Risse et al., 2001; Gaillard et al., 2006;
Flanagan et al., 2010). Podem ser encontrados na literatura médica, pelo menos
desde 1848, relatos que referem justamente a ingestão, inalação ou injeção
intencional de clorofórmio com o objetivo de induzir alterações no humor ou
provocar o suicídio. Os relatos da utilização de clorofórmio com fins homicidas são
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
20
menos comuns, existindo, no entanto, referências frequentes da sua utilização para
neutralizar vítimas de assalto (Nashelsky et al., 1995). Gaillard descreve um caso
de um crime sexual facilitado por drogas (DFSA), que levou à morte da jovem
vítima de estupro e depois ao suicídio do estuprador por envenenamento com
clorofórmio (Gaillard et al., 2006).
Alguns autores referem a presença no sangue de concentrações de clorofórmio até
aos 50 mg/L, encontradas em consequência de utilizações terapêuticas ou após
situações de intoxicação (DiMaio et al., 2001; Molina, 2010; TIAFT, 2012). As
concentrações referidas na bibliografia como potencialmente letais são bastante
variadas, referindo a TIAFT, por exemplo, um valor de 390 mg/L.
Em 1951 o clorofórmio foi identificado por Morris em amostras biológicas com
recurso a uma técnica colorimétrica adaptada a partir da reação de Fujiwara (Morris
et al., 1951). Atualmente são utilizadas diversas técnicas de cromatografia gasosa
para detetar e quantificar o clorofórmio (Kim et al., 1996; Risse et al., 2001;
Gaillard et al., 2006; Flanagan et al., 2010).
2.1.7 Éter
O éter (éter dietílico, éter etilico) é um líquido volátil, altamente inflamável e de
odor característico, com a fórmula molecular CH3CH2OCH2CH3. Foi introduzido
como agente anestésico em 1842 por Crawford Williamson Long, a fim de permitir
que as cirurgias pudessem ser realizadas de forma indolor, após o que esta sua
aplicação se alargou a muitos países. Contudo, devido à sua elevada solubilidade
nos fluidos corporais e tecidos, provocava uma indução de anestesia lenta e um
tempo de recuperação longo (Ward et al., 1997; Baselt, 2004; Cox et al., 2006;
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
21
Monticelli et al., 2011). Atualmente o éter dietílico é utilizado sobretudo como
solvente industrial, sendo também encontrado como componente de muitos
produtos comerciais.
A inalação de éter dietílico pode causar irritação do nariz e da garganta e uma
exposição a concentrações elevadas pode mesmo provocar depressão do sistema
nervoso central, surgindo náuseas, respiração irregular e diminuição da temperatura
corporal e da frequência cardíaca. Concentrações sanguíneas compreendidas entre
100 e 500 mg/L podem produzir analgesia mas não são suficientes para provocar
um estado de inconsciência (Foulconer, 1952). A anestesia para fins cirúrgicos,
atrás referida, ocorre para concentrações de éter no sangue na ordem dos 500-1500
mg/L. Cerca de 90% de uma dose de éter é eliminada na sua forma inalterada
através dos pulmões e uma pequena quantidade através da urina. Embora em menor
grau, também ocorre a sua biotransformação em acetaldeído (Moffat et al., 2004;
Baselt, 2004; Cox et al., 2006).
Na literatura científica podem ser encontrados alguns relatos de fatalidades
relacionadas com a utilização de éter. Campbell refere quatro casos fatais
relacionados com a utilização de éter para induzir a anestesia, tendo sido
encontradas concentrações sanguíneas entre 190-3750 mg/L (Campbell, 1960). Um
outro trabalho relatou três casos em que o éter foi utilizado com o propósito de
incapacitar vítimas de homicídio por estrangulamento e afogamento (Ward et al.,
1997). Em dois destes últimos casos as concentrações de éter foram estimadas em
90 e 1700 mg/L, respetivamente. Mais recentemente, Monticelli descreveu um caso
de morte por asfixia com recurso a um saco plástico e utilização simultânea de éter
(Monticelli, 2011).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
22
A cromatografia em fase gasosa, com recurso a detetores FID ou MS, constitui a
técnica mais frequentemente utilizada na análise de éter em amostras biológicas.
Em alguns casos, o éter pode coeluir com a acetona dificultando a sua identificação
(Baselt, 2004).
2.1.8 Metanol
O metanol, também conhecido como álcool metílico, é um composto químico com
a fórmula molecular CH3OH. É largamente utilizado como solvente e
anticongelante em diversos tipos de indústrias mas também se encontra presente em
bebidas alcoólicas como um produto secundário da fermentação (Baselt, 2004).
Depois de ingerido ou inspirado o metanol é rapidamente absorvido para a corrente
sanguínea e metabolizado em formaldeído e em ácido fórmico pelas enzimas álcool
desidrogenase e aldeído desidrogenase, respetivamente. Numa segunda fase, estas
substâncias são biotransformadas em água e dióxido de carbono (Klaassen et al.,
1996).
Os efeitos iniciais do metanol são muito mais suaves do que os efeitos tóxicos do
etanol e geralmente só são visíveis depois de um período de latência de 8 a 36 h.
(Moffat et al., 2004). A maior parte da toxicidade resultante do consumo de
metanol provém da ação dos seus metabolitos, nomeadamente do ácido fórmico, o
qual provoca alguns dos sintomas característicos da intoxicação por metanol: dor
abdominal aguda, distúrbios visuais que resultam muitas vezes em cegueira
permanente, acidose metabólica e coma prolongado que pode culminar na morte
por insuficiência respiratória (Baselt, 2004).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
23
A concentração mínima de metanol no sangue considerada letal está descrita como
sendo próxima de 400 mg/L para indivíduos que não tenham recebido tratamento
médico (DiMaio et al., 2001; Baselt, 2004). No entanto, Bennet relatou que onze
pacientes com concentrações sanguíneas entre 0-3900 mg/L (média de 1300 mg/L)
conseguiram sobreviver e que sete pessoas morreram durante o tratamento,
apresentando concentrações entre 0-4000 mg/L (média de 1600 mg/L) (Bennet et
al., 1953). Harger em 1938 e Wu em 1985 referiram ainda que as concentrações do
metanol encontradas no organismo humano são em muito similares às encontradas
para o etanol (Harger et al., 1938; Wu Chen et al., 1985).
Ao longo dos anos têm sido publicados diversos trabalhos que descrevem diferentes
metodologias para a determinação do metanol e, à semelhança do etanol, incluem
as técnicas enzimáticas e a cromatografia gasosa.
2.1.9 2-Propanol
Álcool isopropílico e isopropanol são outras designações habituais para o 2-
propanol. O isopropanol é um álcool secundário, de fórmula química
CH3CHOHCH3, caracterizado por ser incolor e ter um forte odor à temperatura
ambiente. É um produto químico amplamente utilizado em laboratório mas que
também pode estar disponível comercialmente sob a forma de solução aquosa a
70%.
O isopropanol é rapidamente absorvido no trato gastrointestinal embora a absorção
também possa ocorrer, de forma passiva, através da pele. A sua capacidade
enquanto depressor do sistema nervoso central é superior à do etanol mas inferior à
apresentada pelo metanol ou pelo etileno glicol (Baselt 2004, Silvillotti, 2004). A
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
24
toxicidade do isopropanol fica a dever-se à sua atividade e não, ao contrário de
outros compostos (e.g. metanol), à ação de metabolitos. O isopropanol é em grande
parte metabolizado pela álcool desidrogenase (ADH) em acetona, a qual é
lentamente eliminada através dos pulmões e da urina. A acetona pode ainda ser
metabolizada em dióxido de carbono e formiato de etilo (Moffat et al., 2004).
A deteção simultânea de acetona e isopropanol em amostras biológicas pode
indiciar uma exposição a esta última substância (Davis et al., 1984; Jenkins et al.,
2008). Vários autores têm também sugerido e demonstrado que a conversão de
acetona em isopropanol explica a presença simultânea de ambas as substâncias em
amostras biológicas post mortem, sobretudo no caso de diabéticos ou mortes
originadas por hipotermia ou abuso de álcool (Baily, 1990; Jones et al., 2000;
Collison, 2005; Molina, 2010). Molina, em 2010, após fazer um estudo sobre a
caraterização das fontes de isopropanol e ter investigado exaustivamente as causas
de morte, concluiu que poderiam ser aplicadas algumas regras para ajudar a
explicar a presença de isopropanol. Assim, os casos de intoxicações por
isopropanol tendem a ter concentrações elevadas (> 1000 mg/L) enquanto as
situações de formação de isopropanol apresentarão concentrações mais baixas (<
1000 mg/L). Além disso, a avaliação integrada dos resultados também pode ajudar
a esclarecer a origem do isopropanol: casos em que haja uma exposição ao
isopropanol tendem a ter rácios isopropanol/acetona > 1 e casos de produção de
isopropanol ante mortem tendem a ter rácios isopropanol/acetona < 1.
No entanto, Alexander, num trabalho realizado em 1982, salientou que em 31
mortes atribuídas exclusivamente ao envenenamento por álcool isopropílico as
concentrações sanguíneas post mortem variaram entre 100 e 2500 mg/L, para o
álcool isopropílico, e entre 400 e 3000 mg/L para a acetona. Na literatura são
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
25
descritos vários episódios de intoxicação que acabaram por não ser fatais
principalmente devido ao sucesso do tratamento com recurso à hemodiálise
(Alexander et al., 1982).
O isopropanol e o seu metabolito são habitualmente determinados com recurso a
métodos de cromatografia gasosa.
2.1.10 Tolueno
O tolueno, ou metil benzeno, é um hidrocarboneto aromático amplamente utilizado
como solvente industrial e como reagente intermédio na produção de muitos
produtos químicos tais como combustíveis, diluentes, tintas e colas. É um líquido
incolor e volátil com odor doce característico quando à temperatura ambiente. A
sua fórmula química é C6H5CH3.
Foram realizados diversos estudos para avaliar o tipo e grau de absorção do tolueno
após a sua inalação ou ingestão. Após atingir a corrente sanguínea este
hidrocarboneto é distribuído por todo o organismo, apresentando uma elevada
afinidade para o tecido adiposo e para outros órgãos ricos em lípidos como o
cérebro, fígado e pulmões, a partir dos quais é lentamente libertado. Cerca de 80%
de uma dose inalada é oxidada em ácido benzoico, o qual é conjugado com a
glicina dando origem ao ácido hipúrico. Estes produtos são excretados através da
urina. Cerca de 20% de uma dose é excretada na forma inalterada através do ar
expirado e menos de 0,1% através da urina (Moffat et al., 2004; Baselt, 2004; Argo
et al., 2010).
O tolueno é um depressor do sistema nervoso central e tem efeitos semelhantes aos
provocados por uma intoxicação alcoólica. À excitação inicial segue-se um estado
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
26
caracterizado por cefaleias, tonturas, visão turva, arritmias e depressão respiratória
podendo evoluir para convulsões, coma e morte em casos de intoxicação aguda
(Hobara et al., 2000; Martinez et al., 2006; Argo et al., 2010). Lush refere, num
estudo realizado a 53 jovens abusadores de tolueno, que indivíduos com
concentrações sanguíneas de tolueno inferiores a 1,0 mg/L deram provas da
utilização desta substância apenas pelo odor químico libertado através da sua
respiração; os que apresentavam concentrações compreendidas entre 1,0-2,5 mg/L
já apresentavam alguns sinais de intoxicação e metade dos indivíduos com níveis
situados entre 2,5-10 mg/L foram hospitalizados devido à presença de sintomas
típicos de uma intoxicação grave, como alucinações; por fim, os que apresentaram
concentrações superiores a 10 mg/L ficaram inconscientes ou acabaram por falecer
(Lush et al., 1979). O tolueno é frequentemente utilizado com fins abusivos pelos
adolescentes ou até mesmo por adultos devido aos seus efeitos intoxicantes, através
da inalação dos vapores de tintas e colas.
Esta substância também foi associada a casos de crimes sexuais facilitados por
drogas (DFSA). Encontra-se descrito o caso de uma jovem de 13 anos, encontrada
pelas autoridades num estado de confusão mental e após ter sido sequestrada por
dois indivíduos que lhe colocaram sobre o rosto um pano embebido em solvente.
Ela referiu ter passado algumas horas numa sala, onde perdeu a consciência, vindo
a acordar seminua na rua e com perda de memória. A análise toxicológica ao
sangue revelou a presença de 7,6 mg/L de benzeno, 24,8 mg/L de tolueno e 0,6
mg/L de xileno (Martinez et al., 2006). O marcante efeito depressor do sistema
nervoso central, associado a uma fácil aquisição, torna este tipo de substâncias
potencialmente atraentes para serem utilizadas como agentes facilitadores de
agressões sexuais ou outras.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
27
No que diz respeito à análise do tolueno em matrizes post mortem têm sido
propostos vários métodos, em particular os que fazem uso da cromatografia gasosa
acoplada a diferentes detetores (e.g. FID, MS).
2.1.11 Xileno
O xileno (dimetilbenzeno) é um hidrocarboneto aromático com múltiplas
aplicações comerciais e industriais, nomeadamente na produção de solventes. Este
composto pode ser encontrado em tintas, diluentes, colas, lacas, agentes de limpeza,
pesticidas, combustíveis e outros produtos suscetíveis de serem utilizados para fins
domésticos.
O xileno, ou xilol como é vulgarmente conhecido, é constituído por três isómeros
de dimetilbenzeno, possuindo a fórmula C6H4(CH3)2. Os isómeros são distinguidos
pelas designações orto- (o-), meta- (m-) e para- (p-), que indicam respetivamente a
que carbonos do anel benzeno se encontram ligados os grupos metilo. Tal como os
isómeros individuais, a mistura resultante é incolor e possui um cheiro adocicado.
Trata-se de um produto altamente inflamável.
O xilol pode ser absorvido através do aparelho gastrointestinal, pele e pulmões. Os
três isómeros são metabolizados numa primeira fase através da oxidação de um
grupo metilo, transformando-se assim no correspondente ácido o-, m- e p-toluico.
Após conjugação com a glicina surge o ácido o-, m- e p- metil-hipúrico. Em média,
cerca de 70% de uma dose absorvida é excretada na urina num intervalo de 18
horas sob a forma destes metabolitos. A hidroxilação dos xilenos nos
correspondentes xilenóis resulta na respetiva excreção, sob a forma de conjugados,
através da urina. Apenas cerca de 5% de uma dose é excretada na forma inalterada
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
28
através da respiração e menos de 0,01% na urina (Moffat et al., 2004; Baselt, 2004;
Argo et al., 2010).
Os indivíduos expostos a baixas concentrações de xilol podem apresentar irritações
da pele e membranas mucosas. Após uma exposição prolongada poderão surgir
distúrbios gastrointestinais consideráveis, náuseas e vómitos. Alguns estudos
realizados em seres humanos e animais mostram que o sistema nervoso central
constitui um dos alvos principais dos xilenos, constatando-se também que os
diferentes isómeros provocam efeitos nocivos equivalentes (Ragheb et al., 1986;
Baselt, 2004; Martinez et al., 2009; Argo et al., 2010). A ingestão de uma dose de
15 mL pode ser suficiente para provocar a morte de um indivíduo. Em 3 casos
fatais devido à ingestão de gasolina ou outros produtos contendo xileno as
concentrações sanguíneas de xileno variaram entre 3-40 mg/L. Num outro caso de
um adulto que ingeriu intencionalmente uma grande quantidade de xileno a análise
revelou uma concentração sanguínea post mortem de 110 mg/L (Ragheb et al.,
1986).
Para além dos diversos casos publicados sobre a associação desta substância a
suicídios (Ragheb et al., 1986; Sevcik et al., 1992; Wiśiewski et al., 2007; Martínez
et al., 2009; Argo et al., 2010) também se constata interesse forense na pesquisa
desta substância devido à sua potencial utilização em crimes de natureza sexual
(DFSA) (Martínez et al., 2006).
Têm sido publicados diversos trabalhos que descrevem diferentes metodologias
para a determinação do xileno, sendo na sua maioria coincidentes com as descritas
para os hidrocarbonetos aromáticos (e.g. tolueno), alternando entre técnicas de
cromatografia gasosa e líquida com diferentes métodos de extração.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
29
2.2 Cromatografia gasosa com detetor de ionização de chama e
sistema de injeção de headspace (HS-GC/FID)
2.2.1 Cromatografia gasosa (GC)
A cromatografia gasosa (GC) é uma das técnicas analíticas com maior
aplicabilidade no campo da toxicologia, uma vez que permite a separação de um
elevado número de substâncias com interesse nesta área. De facto, qualquer
composto cuja volatilidade permita que as suas moléculas fiquem na fase de vapor,
sem se decomporem, até temperaturas de 400 °C, muito provavelmente pode ser
analisado por GC (Dawling, 2008).
A separação cromatográfica das substâncias ocorre numa coluna, designada por
coluna capilar devido ao seu reduzido diâmetro interno (e.g. 0,32 mm), colocada no
interior de um forno de temperatura controlada. O método consiste na introdução da
amostra vaporizada num fluxo de um gás adequado e habitualmente inerte (e.g.
hélio), denominado de fase móvel ou gás de arraste. Este fluxo de gás contendo a
amostra vaporizada atravessa a coluna cromatográfica permitindo a ocorrência de
interações entre os analitos presentes na fase móvel e a fase estacionária,
conseguindo-se, desta forma, a separação cromatográfica entre os compostos. Se a
fase estacionária é constituída por um componente sólido o processo designa-se por
cromatografia gás-sólido. A velocidade a que os compostos se deslocam através da
coluna varia consoante a afinidade destes para com a fase estacionária. Os
componentes que têm a maior interação com a fase estacionária são retidos por
mais tempo e, portanto, atingem mais tarde o respetivo detetor. Por outro lado,
quanto mais volátil for o analito mais se difunde na fase móvel e mais rapidamente
eluirá da coluna. Embora este critério seja aplicável a compostos com grupos
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
30
funcionais similares, não pode ser considerado um princípio universal. Os
compostos sofrem um processo dinâmico de adsorção-desorção com a fase
estacionária, enquanto a fase gasosa apenas serve para conduzir as moléculas de
soluto que não estejam adsorvidas até ao detetor (Dawling, 2008).
À medida que as substâncias eluem da coluna a sua presença pode ser registada em
função de sinais gerados por um detetor sob a forma de um cromatograma, o qual
consiste na representação dos sinais analíticos obtidos ao longo do tempo. Toda
esta informação pode então ser processada com recurso a hardware e software
específicos para o efeito.
Figura 1- Esquema do sistema de cromatografia gasosa (adaptado de Moffat et al., 2004).
2.2.2 Detetor de ionização de chama (FID)
O detetor de ionização de chama (FID) é um dos mais utilizados em cromatografia
gasosa, devido ao facto de responder praticamente a todos os compostos orgânicos
com elevada sensibilidade. De um modo geral não responde às impurezas mais
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
31
comuns presentes no gás de arraste nem a alterações moderadas das condições
analíticas (e.g. fluxo, pressão, temperatura).
O detetor é formado, no essencial, por uma chama gerada por ignição de uma
mistura gasosa constituída por hidrogénio e ar. O efluente da coluna do GC interage
com esta chama formando-se iões ou seja, espécies químicas carregadas
eletricamente. Estas espécies químicas são coletadas por um elétrodo, resultando
daí um acréscimo de corrente elétrica diretamente proporcional à quantidade de
matéria orgânica que tenha estado em contacto com a chama. Pode afirmar-se, desta
forma, que o princípio do funcionamento do detetor se baseia na geração de um
sinal elétrico a partir da combustão da amostra. Uma das limitações deste detetor é
a destruição da amostra que não pode assim ser recuperada para outros fins.
Figura 2- Esquema do detetor FID (adaptado de Moffat et al., 2004).
2.2.3 Sistema de headspace (HS)
A análise de headspace é, para muitos investigadores, a técnica preferida para a
determinação de substâncias voláteis, por oferecer a vantagem de proteger a coluna
cromatográfica da presença dos constituintes não voláteis da amostra. Esta
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
32
característica oferece, por isso, algumas vantagens, entre as quais uma redução nas
atividades de manutenção preventivas (e.g. manutenção do injetor) e uma
significativamente maior vida útil da coluna analítica. Também o facto de a
determinação dos compostos ser feita de forma direta, sem a necessidade de
procedimentos adicionais de purificação, conduz a um aumento da produtividade.
A técnica de injeção de headspace consiste na transferência de uma porção da fase
gasosa, libertada a partir da amostra, para o cromatógrafo. A amostra de headspace
é obtida mantendo a amostra que se pretende analisar (e.g. sangue) fechada num
recipiente de dimensão adequada até que seja atingido um equilíbrio térmico e
gasoso. A temperatura de incubação pode variar consoante as características da
amostra e dos compostos que se pretendem analisar.
A utilização desta técnica para a realização de análises quantitativas torna
necessários alguns cuidados adicionais, no sentido de se eliminar ou atenuar
potenciais efeitos provocados pela matriz. Assim, e como medida preventiva,
poder-se-á diluir a amostra (e.g. 1:10) utilizando a própria solução que contém o
padrão interno (Kugelberg et al., 1997).
2.3 Matrizes biológicas
Existe atualmente uma grande variedade de amostras biológicas que podem ser
utilizadas para efeitos de realização de análises toxicológicas. Conforme se trate de
uma colheita realizada in vivo ou post mortem podemo-nos deparar com diferentes
tipos ou mesmo quantidades de amostras biológicas. Na maioria dos casos post
mortem pode ser colhida uma multiplicidade de amostras para análise toxicológica,
sendo contudo muito importante conhecer quais as mais apropriadas para o tipo de
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
33
pesquisa pretendida bem como efetuar uma adequada interpretação dos resultados
obtidos. No entanto, nem sempre é possível a colheita de todos os tipos de amostra.
Por exemplo, em situações em que os fenómenos de decomposição já estão
instalados e não é possível recolher o sangue, poderá ser viável a recolha de humor
vítreo ou de cabelo. Nos casos de vítimas de traumatismos muito violentos (e.g.
acidentes aeronáuticos, explosões) o toxicologista pode ser confrontado com a
necessidade de analisar amostras ainda mais complexas como músculo ou osso
(Jones et al., 2004; Molina et al., 2010).
Habitualmente, a colheita, o acondicionamento e o transporte das amostras até ao
laboratório não é da responsabilidade deste. Contudo, o laboratório deve fornecer
informação detalhada acerca do tipo e da quantidade de amostra necessária, tendo
em consideração o tipo de análise pretendida, bem como a maneira de identificar
corretamente uma amostra (Society of Forensic Toxicology/American Academy of
Forensic Sciences, 2002). A este propósito, o STF tem recomendações específicas
quanto às normas de colheita e acondicionamento de amostras em toxicologia
forense (NP-INML-009), devendo o perito médico-legal assegurar que a colheita é
feita de modo adequado, de acordo com a análise pretendida, nunca esquecendo que
o envio para análise de amostras inadequadamente colhidas ou mal acondicionadas
pode colocar em causa o valor médico-legal de um resultado analítico.
Seguidamente descrevem-se as principais características das amostras utilizadas
neste trabalho.
Sangue
O sangue, desde que disponível, constitui a amostra de eleição para ser utilizada na
realização de análises toxicológicas forenses. Em situações de colheita in vivo, os
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
34
níveis detetados de uma determinada substância estão diretamente correlacionados
com a sua concentração sanguínea nesse local. Contudo, quando estamos perante
um caso de colheita post mortem, os problemas poderão ser mais complexos, pois
pode haver uma variação de concentração relacionada com os fenómenos de
redistribuição post mortem. Devem assim ser tomadas precauções adicionais na
interpretação de resultados quando uma amostra de sangue, colhida post mortem,
vem identificada apenas como sangue e não a acompanha qualquer informação
sobre o local anatómico da colheita. Outro fator de risco é o da contaminação da
amostra de sangue por outros líquidos biológicos (e.g. conteúdo gástrico). Nestes
casos, a análise de uma amostra de sangue periférico pode ser crucial para avaliar o
impacto que a substância teve na vítima. Recomenda-se, assim, e sempre que
possível, a obtenção de pelo menos duas amostras de sangue colhidas em locais
distintos (NP-INML-009). Infelizmente, em casos de trauma grave ou
decomposição, esta prática pode não ser possível.
Urina
A urina é uma matriz importante tendo em consideração alguns tipos de métodos
analíticos habitualmente utilizados. O facto de conter na sua composição cerca de
99% de água torna-a particularmente adequada para a análise com recurso a
métodos imuno-enzimáticos e também, naturalmente, cromatográficos (Jones et al.,
2008). A urina, quando presente, é uma amostra de fácil colheita durante a autópsia,
pelo que pode ser útil para fornecer informação qualitativa sobre a exposição a uma
determinada substância. A acumulação de substâncias tóxicas e respetivos
metabolitos nesta matriz facilita também a respetiva deteção. No entanto, as
concentrações encontradas para as diversas substâncias na urina não refletem
necessariamente as concentrações sanguíneas correspondentes. De facto, uma
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
35
concentração encontrada na urina pode refletir o uso de determinada substância
durante muitas horas e, por vezes, até dias, antes da sua morte. Desta forma, a urina
pode ser usada como uma segunda amostra para a confirmação da presença de
determinada substância ou, o que acontece com frequência, para orientar a pesquisa
no sangue.
Humor vítreo
Pelo facto de o humor vítreo estar localizado no interior do globo ocular, fica
menos sujeito a contaminações bacterianas ou fúngicas, quando comparado com o
sangue. Mesmo na presença de concentrações elevadas de glucose a fermentação
não ocorre devido às condições estéreis do meio, inclusive em fases mais avançadas
de decomposição. O uso limitado de humor vítreo nas análises prende-se com o
facto de o volume disponível ser reduzido e subsistir alguma dificuldade na
interpretação dos resultados, nomeadamente a correlação com as respetivas
concentrações sanguíneas.
2.4 Validação de métodos analíticos
2.4.1 Introdução
A necessidade de mostrar a qualidade e confiança de determinado método analítico
é, cada vez mais, reconhecida e exigida por toda a comunidade científica. A
fiabilidade dos resultados analíticos é uma questão de grande importância em
toxicologia forense e clínica, uma vez que constitui um pré-requisito para a
interpretação correta dos resultados toxicológicos. Resultados não fiáveis podem
conduzir a decisões incorretas não apenas a nível clínico como, também, a nível
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
36
judicial. No sentido de garantir que um novo método analítico origina, a propósito
de análises realizadas, informações interpretáveis e fiáveis, o mesmo deve ser
submetido a um processo avaliativo usualmente designado por validação.
A validação é a confirmação, através de exame e apresentação de evidência
objetiva, de que os requisitos específicos relativos a uma dada utilização são
satisfeitos. O laboratório deve validar métodos não normalizados, métodos
concebidos ou desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados
utilizados fora do seu âmbito de utilização e extensões ou modificações de métodos
normalizados, com o objetivo de confirmar que os métodos são adequados à
utilização prevista (ISO/IEC 17025, 1999).
Nos últimos anos tem sido amplamente discutida a forma de harmonizar os
parâmetros necessários a uma validação, assim como a definição de critérios de
aceitação dos respetivos resultados. Embora exista algum consenso quanto ao tipo
de estudos a realizar no decorrer de uma validação subsiste uma grande diversidade
de opiniões quanto à forma de os abordar. A seletividade/especificidade, modelo de
calibração, linearidade, estabilidade, precisão (repetibilidade, reprodutibilidade,
precisão intermédia) e exatidão, limites de deteção e quantificação, eficiência de
extração e gama de trabalho são, regra geral, parâmetros a avaliar.
2.4.2 Definição dos parâmetros de validação
2.4.2.1 Seletividade/especificidade
A seletividade pode ser definida como sendo a capacidade que um método analítico
possui para diferenciar e determinar inequivocamente a substância de interesse,
diferenciando-a de componentes da matriz, impurezas, produtos de degradação ou
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
37
metabolitos. Um método seletivo deve garantir que um determinado sinal analítico
é gerado exclusivamente em resposta à presença na amostra do composto de
interesse. Se a seletividade não estiver assegurada, parâmetros como a linearidade,
a exatidão e a precisão ficam, naturalmente, comprometidos (Ribani et al., 2004).
Os termos seletividade e especificidade são utilizados, com alguma frequência,
como conceitos sobreponíveis, o que pode gerar alguma confusão. Um método
analítico capaz de gerar uma resposta em função da presença de uma única
substância de interesse pode ser classificado como específico, enquanto um método
capaz de produzir uma resposta analítica perante a presença de várias substâncias
que partilhem características comuns (e.g. determinados grupos químicos) poderá
ser qualificado como seletivo. Como existem poucos métodos capazes de
identificar uma única substância o termo seletividade talvez seja o mais adequado.
A seletividade deve ser um dos primeiros aspetos a estudar no processo de
validação de um método. Deverá, no entanto, ser reavaliada continuamente, uma
vez que eventos como a degradação das amostras podem gerar novos compostos
não considerados inicialmente e capazes de originar problemas ao nível da
identificação ou quantificação (e.g. coeluição com as substâncias alvo) (Ribani et
al., 2004). Embora seja desejável a total ausência de interferentes na análise este
objetivo é frequentemente difícil de atingir, sobretudo quando se pesquisam
substâncias em amostras biológicas complexas, como o sangue. Na prática, será
necessário considerar o facto de ter de se aceitar a presença de pequenos
interferentes desde que tal não comprometa a identificação e/ou quantificação do
composto alvo (Dadgar et al., 1995; Hartmann et al., 1998).
Existem, naturalmente, diferentes formas de abordar o estudo da seletividade. Uma
delas consiste em evidenciar a ausência de sinais analíticos interferentes, analisando
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
38
um mínimo de 6 amostras brancas diferentes (ICH Q2 B, 1996, Causon, 1997).
Uma alternativa assenta na análise de um número razoável (e.g. 10 a 20) de
amostras brancas, fortificadas com a substância a estudar a uma determinada
concentração. A obtenção de resultados concordantes permite evidenciar a
inexistência de compostos significativamente interferentes.
2.4.2.2 Modelo de calibração
A seleção de um modelo de calibração devidamente ajustado ao desempenho de um
método analítico é um passo essencial do processo de avaliação da respetiva
aptidão para fornecer resultados quantitativos fiáveis. Assim, deve ser
cuidadosamente analisada a relação existente entre a concentração do analito na
amostra e a resposta do detetor, não se devendo, a priori, optar por um determinado
modelo apenas porque é o mais usual (e.g. linear). Para tal, são fortificadas
amostras com concentrações conhecidas da substância que se pretende quantificar
(calibradores) e procede-se à respetiva análise instrumental de acordo com um
procedimento analítico definido. Para cada um destes calibradores o equipamento
irá gerar um sinal proporcional à concentração da substância. A partir destes dados
será então possível elaborar uma representação gráfica, habitualmente designada
por curva da calibração. Para tal, as respostas analíticas são representadas no eixo y
e as correspondentes concentrações no eixo x. Por interpolação será então possível
estimar a concentração da substância de interesse numa amostra desconhecida.
Como referido atrás, a decisão quanto ao modelo de calibração (e.g. reta, curva) a
utilizar, com o objetivo de relacionar respostas analíticas com concentrações do
analito na amostra, requer uma avaliação cuidada, pois a respetiva decisão terá
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
39
repercussões não apenas na estimativa das concentrações mas também nos valores
dos limites de quantificação e deteção do método analítico (Miller, 1991).
2.4.2.3 Linearidade
A linearidade de um método analítico, numa determinada gama de concentrações,
consiste na sua capacidade para fornecer resultados diretamente proporcionais à
concentração da substância a pesquisar (ICH Q2 B, 1996). A ICH recomenda um
mínimo de cinco níveis de concentração para a verificação da linearidade, referindo
também que a utilização de um número diferente deve ser justificada. Para além
desta recomendação particular constata-se que a maioria das diretrizes estabelece
um mínimo de cinco a oito níveis de concentração (EURACHEM, 1998; Lindner et
al., 1998), considerando ainda alguns autores que se deve usar, pelo menos, dois a
seis replicados por nível de concentração (Hartmann et al., 1998).
Os critérios de aceitação da respetiva calibração, independentemente de quais
sejam, devem estar bem definidos. A linearidade é frequentemente testada
utilizando o coeficiente de correlação, r (em que -1 ≤ r ≤ +1). Na hipotética
situação em que r = - 1, todos os pontos do gráfico iriam cair numa linha reta
perfeita, de declive negativo; se r = +1, todos os pontos estariam exatamente numa
linha de declive positivo; no oposto, r = 0 indicaria a ausência de correlação linear
entre x e y. Contudo, verifica-se a ocorrência de situações em que, apesar de os
pontos poderem desenhar uma ligeira curva, é possível obter para │r│ valores
elevados e aproximados de 1 (ou -1). Constata-se desta forma que a magnitude de r,
considerada de forma isolada, pode ser um fraco indicador da linearidade. Por esta
razão, recomenda-se a representação gráfica e o estudo dos resíduos de y, uma
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
40
forma simples de avaliar se uma representação linear dos dados é de facto a mais
adequada (Miller et al., 1991)
Apesar disso, alguns autores consideram que um coeficiente de correlação superior
a 0,999 constitui uma evidência de ajuste ideal (Ribani et al., 2004).
Recomenda-se, igualmente, que a avaliação do valor de r seja acompanhada da
verificação de que a interceção da reta na origem inclui o valor zero, para um grau
de confiança de 95%.
2.4.2.4 Gama de trabalho
Considera-se que a gama de trabalho corresponde ao intervalo entre a concentração
mais baixa da substância a analisar e a concentração mais alta (incluindo estas
concentrações) para a qual seja possível documentar valores de precisão, exatidão e
linearidade aceitáveis (ICH, Q2 R1, 2005).
Na quantificação de uma substância, qualquer tipo de extrapolação deve ser
evitada, no entanto, em análises biológicas é aceitável quer diluir as amostras quer
extrair do dobro do volume para permitir o cálculo de concentrações por
interpolação, desde que fique demonstrado, nestes casos, a ausência de efeito de
matriz (Hartmann et al., 1998; SOFT/AAFS, 2002). Caso não se justifique a
quantificação exata de um analito presente em concentrações baixas, o resultado
deve ser expresso como sendo inferior à concentração do calibrador mais baixo, em
alternativa à expressão “concentração vestigial”.
Deve referir-se que a gama de trabalho não tem de coincidir obrigatoriamente com
a gama de concentrações dos calibradores usados na elaboração da curva de
calibração.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
41
2.4.2.5 Precisão
A precisão do método analítico corresponde ao grau de concordância entre
resultados de medidas independentes em torno de um valor central, efetuadas várias
vezes numa amostra homogénea. A precisão traduz-se na medida do erro aleatório
de determinado método, sendo expressa pelo desvio padrão relativo (RSD) ou pelo
coeficiente de variação em percentagem (CV). Este parâmetro pode ser avaliado
através de três níveis diferentes: repetibilidade, precisão intermédia e
reprodutibilidade (ICH Q2A, 1994).
A repetibilidade, ou precisão intra-ensaio, representa a concordância entre os
resultados obtidos em condições de trabalho idênticas (e.g. mesmo analista, mesmo
equipamento analítico e lotes de reagentes) e num curto intervalo de tempo. A
precisão intermédia corresponde à variação dos resultados observados quando um
ou mais fatores (e.g. dias diferentes, diferentes analistas, equipamentos e lotes de
reagentes) são modificados. Por seu lado, a reprodutibilidade corresponde à
variabilidade obtida quando diferentes laboratórios analisam a mesma amostra (e.g.
ensaios interlaboratoriais). A este propósito refira-se que a IUPAC não aconselha a
que se retirem conclusões a partir de dados obtidos em ensaios interlaboratoriais
com menos de cinco participantes, referindo como indicação a participação mínima
de oito laboratórios (Thompson et al., 2002). No entanto, mais importante que o
número de laboratórios envolvidos é que a reprodutibilidade seja avaliada
comparando-se resultados obtidos em laboratórios cujos métodos analíticos e,
principalmente, o tipo de tecnologia (e.g. LC/MS, GC/MS), sejam similares.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
42
2.4.2.6 Exatidão
A exatidão do método analítico corresponde ao grau de concordância entre os
resultados da concentração medida pelo método e um valor aceite como referência,
sendo afetada pelos componentes do erro sistemático e do erro aleatório. Isto é, a
exatidão indica a capacidade que o método analítico possui de proporcionar
resultados o mais próximo possível do valor verdadeiro. O número de ensaios a
conduzir varia consoante a diretriz adotada e também com as características do
estudo. A ICH, a título de exemplo, recomenda um mínimo de nove ensaios
distribuídos por diferentes níveis de concentrações (ensaios em triplicado e para
três níveis de concentração). Os processos mais frequentemente utilizados para
avaliar a exatidão de um método são o uso de materiais de referência, a participação
em ensaios interlaboratorias, a realização de ensaios de recuperação e a adição de
padrão (Ribani et al., 2004).
2.4.2.7 Limites de deteção e de quantificação
O limite de deteção (LOD) de um método analítico corresponde à menor
concentração do analito numa amostra que pode ser detetada mas não
necessariamente quantificada com razoável certeza estatística. O cálculo deste
limite pode ser feito de diferentes formas. Uma delas baseia-se na estimativa da
razão sinal/ruído (S/R) para os picos de interesse, a qual naturalmente só poderá ser
aplicada a procedimentos analíticos cuja resposta seja apresentada sob a forma de
cromatogramas. O sinal e o ruído podem então ser definidos como a altura do pico
do analito (sinal) e a amplitude entre o ponto mais alto e o mais baixo da linha de
base (ruído) numa área do cromatograma situada ao redor do sinal de análise
(Franco, 2006). A razão sinal-ruído deve ser pelo menos igual a 3. Outra forma de
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
43
calcular este limite é através de dados obtidos de curvas de calibração construídas a
partir da análise de amostras fortificadas no intervalo inferior da gama de trabalho
(ICH Q2B, 1996; Peters et al., 2002). O LOD pode então ser encontrado a partir da
seguinte equação:
b
xSLOD x
y3,3
Em que S e b representam, respetivamente, o desvio padrão residual e o declive da
reta de calibração.
Por seu lado, o limite de quantificação (LOQ) define-se como sendo a menor
concentração do analito na amostra que pode ser determinada e quantificada com
uma precisão e exatidão adequadas ao âmbito de aplicação do respetivo método. O
cálculo do limite de quantificação pode ser obtido seguindo a metodologia aplicada
ao limite de deteção, com as seguintes modificações: a relação sinal-ruído deve ser
pelo menos igual a 10 e, no caso de se optar pela utilização dos dados da calibração,
a fórmula utilizada passa a ter a seguinte representação:
b
xSLOQ x
y10
2.4.2.8 Robustez
A robustez de um método analítico traduz-se na sua capacidade para suportar
ligeiras variações nas respetivas condições analíticas. Assim, a robustez de um
método pode ser avaliada procedendo-se de forma intencional a pequenas
alterações que se considerem plausíveis de ocorrer durante a sua utilização em
condições de rotina. As alterações podem incluir, no caso de métodos que utilizem
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
44
a cromatografia gasosa, o fluxo do gás de arraste e a temperatura da coluna, o
volume de injeção, a composição da fase móvel, entre outras possibilidades. A
validação de um método não tem obrigatoriamente de incluir este parâmetro mas
considera-se que a sua avaliação, por exemplo numa fase de pré-validação, pode ser
bastante útil ao permitir detetar antecipadamente problemas que poderiam afetar
posteriormente o processo de validação ou a própria utilização do método já em
rotina (Peters et al., 2002).
2.4.2.9 Estabilidade
A estabilidade do analito durante as diversas fases do procedimento analítico, sem
descurar a duração e respetivas condições de armazenamento, constitui um pré
requisito para a obtenção de resultados válidos e reprodutíveis. A validação de um
método deve, por isso, incluir experiências que de alguma forma possam evidenciar
que durante este processo não ocorre degradação da substância de interesse. Entre
outros aspetos, e a título de exemplo, pode ser avaliada a influência da temperatura
de conservação (e.g. ciclos de congelação/descongelação) e respetiva duração, as
condições de colheita da toma de amostra, a resistência às temperaturas a que a
substância fica sujeita durante a análise cromatográfica.
No decorrer destes estudos deve estar garantido que as amostras são sujeitas a
condições equivalentes às da rotina.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
45
Parte III – TRABALHO EXPERIMENTAL
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
47
3.1 Introdução
A seleção de um método analítico adequado para a identificação e quantificação de
substâncias em amostras biológicas constitui um passo fundamental para a garantia
de resultados fiáveis e reprodutíveis. Procurou-se, com este trabalho, desenvolver
um método com recurso a cromatografia gasosa com detetor de ionização de chama
e injeção de amostras de headspace (HS-GC/FID), para identificar e quantificar um
grupo de onze substâncias voláteis com interesse forense. Após o respetivo
desenvolvimento procedeu-se à sua validação de acordo com o procedimento em
vigor no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do INML.
3.2 Material e métodos
3.2.1 Substâncias estudadas
A seleção do grupo de substâncias voláteis assentou essencialmente em dois
aspetos: a sua relevâ
ncia no contexto clínico/forense e, naturalmente, a disponibilidade em tempo útil
dos respetivos padrões analíticos.
Assim, no que diz respeito à sua importância do ponto de vista clínico/forense, e
tendo naturalmente em consideração a diversa informação bibliográfica analisada e
já referida em capítulo anterior, foram selecionadas as seguintes substâncias:
acetaldeído, acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, 1-butanol, clorofórmio, éter,
metanol, 2-propanol, tolueno e p-xileno.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
48
3.2.2 Amostras biológicas
As amostras biológicas necessárias à realização deste projeto foram selecionadas de
modo a serem, tanto quanto possível, representativas da realidade do laboratório de
toxicologia forense.
As amostras de sangue e urina utilizadas no estudo foram obtidas a partir de
colheitas efetuadas in vivo e post mortem, durante o ano de 2009. As amostras
obtidas in vivo foram colhidas no âmbito da legislação aplicável à condução
rodoviária (Código da Estrada) ou de exames periciais realizados no serviço de
clínica forense da Delegação do Centro do INML, I.P.. As amostras post mortem
foram colhidas no decorrer de autópsias realizadas no serviço de patologia forense
da referida instituição ou em gabinetes médico-legais da sua área de atuação.
As amostras de humor vítreo foram colhidas no âmbito de autópsias realizadas no
serviço de patologia forense da Delegação do Centro do INML, I.P., no período
compreendido entre o último trimestre de 2011 e o primeiro semestre de 2012.
Até serem analisadas, todas as amostras foram mantidas à temperatura de -20 °C.
3.2.3 Padrões, Reagentes e Material
3.2.3.1 Padrões
Os padrões selecionados para o presente estudo foram adquiridos às marcas
comerciais Merck (acetaldeído, acetona, acetonitrilo, 2-propanol, metanol e p-
xileno), Riedel-de-Haën (acetato de etilo, éter dietílico, clorofórmio e tolueno) e
Aldrich Chemistry (1-butanol) apresentando uma pureza média superior a 99,5%.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
49
O padrão interno utilizado foi o n-propanol, adquirido à firma Merck por este
apresentar propriedades físico-químicas e comportamentos cromatográficos
semelhantes aos das substâncias em estudo.
3.2.3.2 Reagentes
Os solventes utilizados na preparação de soluções foram os seguintes:
Água ultra pura Milli-Q obtida com sistema Millipore (França);
Metanol LiChrosolv® adquirido a Merck (Darmstadt, Germany).
3.2.3.3 Material
Balões volumétricos de 10, 1000 e 5000 mL;
Frascos de vidro âmbar de 12 e 1000 mL;
Pipetas de vidro graduadas de 10, 25 e 50 mL;
Suportes para vials;
Cápsulas de alumínio para vials;
Vials de 10 mL.
3.2.4 Equipamentos
3.2.4.1 Aparelhos de uso comum
Agitador magnético Heidolph REAX 2000;
Bomba de vácuo Millipore e filtros 0,2 m, Schleicher Schuell;
Homogeneizador de amostras;
Hote Kottermann AP 800.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
50
3.2.4.2 Pipetas e Doseadores
Pipeta automática de 100 µL Eppendorf Research 428574;
Pipeta automática de 200 L Gilson Pipetman neo BG68111;
Pipeta automática de 200 – 1000 L Gilson Pipetman SS548501;
Doseador de mão Eppendorf Multipette Plus com combitips de 25 mL.
3.2.4.3 Instrumentos Analíticos
Foi utilizado um sistema cromatográfico HS-GC/FID da marca Agilent® 6890N,
dotado de um detetor de ionização de chama, acoplado a um injetor de headspace
de volume fixo (loop) Agilent G1888.
Tabela 2- Principais características do sistema HS-GC/FID utilizado.
Componente
Principais características
Injetor automático
Injeção de headspace (loop de 1 mL)
Cromatógrafo gasoso
Coluna analítica 1: DB-ALC2 30 m x 0,320 mm x 1,2 µm (Agilent 123-
9234)
Coluna analítica 2: DB-ALC1 30 m x 0,320 mm x 1,8 µm (Agilent 123-
9134)
Detetor Ionização de chama
3.2.5 Procedimento analítico
3.2.5.1 Preparação das soluções
As substâncias em estudo foram divididas e agrupadas de acordo com a sua
solubilidade e gama de trabalho (Tabela 3). Para as substâncias com elevada
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
51
solubilidade em água preparou-se uma mistura designada por mistura II. As
restantes substâncias, cuja solubilidade em água era reduzida mas apresentavam
uma boa solubilidade em metanol, foram divididas de acordo com as gamas de
trabalho. Para a gama de 5 a 1000 mg/L, preparou-se uma mistura III e à substância
clorofórmio corresponde a gama de 50 a 1000 mg/L. Os parâmetros estudados na
validação do método foram analisados individualmente para cada um destes grupos.
Tabela 3- Agrupamento das substâncias por solubilidade e gama de trabalho.
Composto
Solubilidade em água
Gama de trabalho
Nome
Acetaldeído
Solúvel
50-2000 mg/L
Mistura II
Acetato de Etilo
83 g/L
Acetona
Solúvel
Acetonitrilo
Solúvel
1-Butanol
90 g/L
2-Propanol
Solúvel
Éter
60 g/L
Metanol
Solúvel
Tolueno
0,47 g/L
5-1000 mg/L
Mistura III p-Xyleno
Insolúvel
Clorofórmio
8 g/L
50-1000 mg/L
Clorofórmio
3.2.5.1.1 Soluções de armazenamento
3.2.5.1.1.1 Solução contendo 20 000 mg/L (Mistura II)
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
52
Diluir 28 mL de éter, 22 mL de acetato de etilo e 25 mL das soluções acetaldeído,
metanol, 2-propanol, 1-butanol, acetona e acetonitrilo em água milli-Q até perfazer
um volume de 1000 mL.
3.2.5.1.1.2 Solução contendo 10 000 mg/L (Mistura II)
Diluir 14 mL de éter, 11 mL de acetato de etilo e 12.5 mL das soluções acetaldeído,
metanol, 2-propanol, 1-butanol, acetona e acetonitrilo em água milli-Q até perfazer
um volume de 1000 mL.
3.2.5.1.1.3 Solução contendo 10 000 mg/L (Mistura III)
Diluir 116 L de tolueno e p-xileno em metanol até perfazer um volume de 10 mL.
3.2.5.1.1.4 Solução contendo 14 700 mg/L de clorofórmio
Diluir 100 L de clorofórmio em metanol até perfazer um volume de 10 mL.
A solução deve ser medida com o clorofórmio refrigerado (2-8 ºC), devido à sua
elevada volatilidade.
3.2.5.1.1.5 Solução contendo 10 000 mg/L de n-propanol
Diluir 12,5 mL de n-propanol em água milli-Q até perfazer um volume de 1000
mL.
3.2.5.1.2 Soluções de trabalho de padrões de referência (calibradores, controlos
e solução de trabalho de PI)
3.2.5.1.2.1 Soluções das substâncias voláteis da mistura II
a. Solução contendo 2 000 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
53
Diluir em água milli-Q 1000 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.1 até perfazer um
volume de 10 mL.
b. Solução contendo 1 500 mg/L
Diluir em água milli-Q 750 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.1 até perfazer um
volume de 10 mL.
c. Solução contendo 1 000 mg/L
Diluir em água milli-Q 1000 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.2 até perfazer um
volume de 10 mL.
d. Solução contendo 500 mg/L
Diluir em água milli-Q 500 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.2 até perfazer um
volume de 10 mL.
e. Solução contendo 250 mg/L
Diluir em água milli-Q 250 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.2 até perfazer um
volume de 10 mL
f. Solução contendo 50 mg/L
Diluir em água milli-Q 50 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.2 até perfazer um
volume de 10 mL.
3.2.5.1.2.2 Soluções das substâncias voláteis da mistura III
a. Solução contendo 1 000 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
54
Diluir em metanol 1000 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
b. Solução contendo 800 mg/L
Diluir em metanol 800 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
c. Solução contendo 750 mg/L
Diluir em metanol 750 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
d. Solução contendo 500 mg/L
Diluir em metanol 500 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
e. Solução contendo 250 mg/L
Diluir em metanol 250 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
f. Solução contendo 100 mg/L
Diluir em metanol 100 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.3 até perfazer um
volume de 10 mL.
g. Solução contendo 5 mg/L
Diluir em metanol 50 L da solução descrita em 3.2.5.1.2.2 a. até perfazer um
volume de 10 mL.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
55
3.2.5.1.2.3 Soluções da substância clorofórmio
a. Solução contendo 1 000 mg/L
Diluir em metanol 680 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.4 até perfazer um
volume de 10 mL.
b. Solução contendo 750 mg/L
Diluir em metanol 510 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.4 até perfazer um
volume de 10 mL.
c. Solução contendo 500 mg/L
Diluir em metanol 340 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.4 até perfazer um
volume de 10 mL.
d. Solução contendo 250 mg/L
Diluir em metanol 170 L da solução descrita em 3.2.5.1.1.4 até perfazer um
volume de 10 mL.
e. Solução contendo 100 mg/L
Diluir em metanol 1000 L da solução descrita em 3.2.5.1.2.3 a. até perfazer um
volume de 10 mL.
f. Solução contendo 50 mg/L
Diluir em metanol 500 L da solução descrita em 3.2.5.1.2.3 a. até perfazer um
volume de 10 mL.
3.2.5.1.2.4 Solução contendo 100 mg/L de n-propanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
56
Diluir em água milli-Q 50 mL da solução descrita em 3.2.5.1.1.5 até perfazer um
volume de 5000 mL.
3.2.5.2 Preparação das amostras de ensaio
As amostras laboratoriais foram tratadas de acordo com o procedimento em vigor
no STF, tendo sido descongeladas e homogeneizadas através de agitação suave
durante pelo menos 10 minutos, até atingirem a temperatura ambiente. Em cada vial
foi inscrita de forma bem legível a identificação da toma de ensaio (e.g. código
interno da amostra).
A preparação das amostras foi efetuada misturando, em vials de 10 mL, 1 mL de
padrão interno e 100 L da amostra.
Tendo em consideração as caraterísticas das substâncias estudadas, em particular a
sua volatilidade, os vials foram fechados logo após a preparação da amostra a
ensaiar de modo a impedir a perda de material. Sempre que não foi possível
proceder de imediato à análise os vials foram mantidos refrigerados a uma
temperatura compreendida entre 2 e 8 °C.
3.2.5.3 Preparação das curvas de calibração
Os calibradores foram preparados tal como descritos no ponto 3.2.5.2, substituindo
o volume de amostra por um volume equivalente da respetiva solução de trabalho
de acordo com as tabelas 4, 5 e 6.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
57
Tabela 4- Preparação da curva de calibração- mistura II
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Calibrador 1 (2000 mg/L)
3.2.5.1.2.1 a.
1 mL
Calibrador 2 (1500 mg/L)
3.2.5.1.2.1 b.
1 mL
Calibrador 3 (1000 mg/L)
3.2.5.1.2.1 c.
1 mL
Calibrador 4 (500 mg/L)
3.2.5.1.2.1 d.
1 mL
Calibrador 5 (50 mg/L)
3.2.5.1.2.1 f.
1 mL
Tabela 5- Preparação da curva de calibração- mistura III
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Calibrador 1 (1000 mg/L)
3.2.5.1.2.2 a.
1 mL
Calibrador 2 (750 mg/L)
3.2.5.1.2.2 c.
1 mL
Calibrador 3 (500 mg/L)
3.2.5.1.2.2 d.
1 mL
Calibrador 4 (250 mg/L)
3.2.5.1.2.2 e.
1 mL
Calibrador 5 (5 mg/L)
3.2.5.1.2.2 g.
1 mL
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
58
Tabela 6- Preparação da curva de calibração- clorofórmio
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Calibrador 1 (1000 mg/L)
3.2.5.1.2.3 a.
1 mL
Calibrador 2 (750 mg/L)
3.2.5.1.2.3 b.
1 mL
Calibrador 3 (500 mg/L)
3.2.5.1.2.3 c.
1 mL
Calibrador 4 (250 mg/L)
3.2.5.1.2.3 d.
1 mL
Calibrador 5 (50 mg/L)
3.2.5.1.2.3 f.
1 mL
3.2.5.4 Preparação das amostras de controlo de qualidade interno
O controlo de qualidade interno foi constituído por uma amostra branca (controlo
negativo) e dois controlos positivos. A análise das amostras controlo positivas
serve para estabelecer os intervalos de tempo de retenção relativo (TRR) das
substâncias voláteis e avaliar, em cada série analítica, a exatidão do método de
ensaio. A amostra controlo negativa permite avaliar, em cada sequência
analítica, o efeito de matriz ou a presença de substâncias interferentes
inesperadas (e.g. provenientes de contaminações das soluções utilizadas).
Estas amostras devem ser preparadas e analisadas em simultâneo com as
amostras de rotina.
Para tal foram utilizadas duas amostras contendo 100 L da solução de
trabalho de padrões de referência e uma terceira na qual a amostra foi
substituída por uma porção equivalente de água milli-Q (amostra branca), de
acordo com as tabelas 7, 8 e 9.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
59
Tabela 7- Preparação dos CQI- mistura II.
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Controlo positivo (1500 mg/L) 3.2.5.1.2.1 b. 1 mL
Controlo positivo (250 mg/L) 3.2.5.1.2.1 e. 1 mL
Branco de Reagentes ― 1 mL
Tabela 8- Preparação dos CQI- mistura III
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Controlo positivo (800 mg/L)
3.2.5.1.2.2 b.
1 mL
Controlo positivo (100 mg/L)
3.2.5.1.2.1 f.
1 mL
Branco de Reagentes
―
1 mL
Tabela 9- Preparação dos CQI- clorofórmio
Solução de trabalho de padrões de referência
Solução 100 g/L n-propanol (PI)
Controlo positivo (750 mg/L)
3.2.5.1.2.3 b.
1 mL
Controlo positivo (100 mg/L) 3.2.5.1.2.3 e.
1 mL
Branco de Reagentes
―
1 mL
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
60
3.2.6 Análise Instrumental (HS-GC/FID)
As amostras foram analisadas no equipamento descrito em 3.2.4.3. A separação
cromatográfica foi realizada com recurso a duas colunas capilares de polaridades
distintas, com o objetivo de garantir o cumprimento dos critérios de identificação
recomendados para este tipo de análises. A coluna DB-ALC2 adquirida a Agilent
(Santa Clara, Califórnia), com as dimensões 30 m x 0,320 mm x 1,2 µm, foi
utilizada para identificar e quantificar as substâncias voláteis. A utilização de uma
segunda coluna Agilent, DB-ALC1, com as dimensões 30 m x 0,320 mm x 1,8 µm,
teve por objetivo confirmar a presença das respetivas substâncias.
As condições analíticas do ponto de vista cromatográfico foram as seguintes: uma
temperatura inicial do forno de 40 °C, mantida durante 5 min, seguindo-se uma
subida até aos 130 °C com um gradiente de 10 °C/min. No fim de cada corrida foi
retomada a temperatura inicial, mantida durante 3 min. A temperatura do injetor foi
mantida a 150 °C e utilizada uma razão de split de 4:1. Os detetores foram
mantidos a 250 °C. Os fluxos utilizados para os gases foram os seguintes:
hidrogénio — 40,0 mL/min, ar — 450,0 mL/min e nitrogénio — 45,0 mL/min. O
fluxo de hélio foi mantido constante (2,7 mL/min) e o volume de injeção foi de
1mL.
A temperatura do forno do injetor automático de headspace foi mantida a 80 °C, o
respetivo loop a 85 °C e a linha de transferência a 90 °C. Antes da injeção da
amostra de headspace os vials foram incubados durante 20,0 min. No total, cada
ciclo analítico teve uma duração de 18,2 min.
O processamento dos dados analíticos foi feito com recurso a software específico
(Agilent ChemStation Rev B.03.01 [317]).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
61
3.3 Resultados e discussão
3.3.1 Desenvolvimento do método analítico
O desenvolvimento do método analítico baseou-se, numa fase inicial, na consulta
de bibliografia (incluindo manuais técnicos) e na experiência adquirida resultante
da utilização de métodos analíticos entretanto desenvolvidos para a determinação
da alcoolemia. Uma vez que um dos objetivos consistia no desenvolvimento de um
método para aplicação na rotina do laboratório, todo o desenvolvimento do projeto
teve por base a utilização do equipamento analítico, incluindo as respetivas colunas
analíticas, disponível no serviço de toxicologia forense.
A significativa amplitude de características físico-químicas das onze substâncias
estudadas — pesos moleculares entre 32,04 g/mol (metanol) e 119,38 g/mol
(clorofórmio) e temperaturas de ebulição entre 20,2 °C (acetaldeído) e 138,5 °C (p-
xileno) — tornou necessário o desenvolvimento de um método analítico
cromatográfico mais complexo e a introdução de um gradiente térmico com o
objetivo de melhorar os resultados obtidos. Neste sentido, o desenvolvimento do
método foi iniciado com uma série de injeções das substâncias estudadas a uma
concentração de 1000 mg/L. Tendo em consideração que o critério de identificação
seria baseado nos valores de TRR o método foi considerado otimizado quando se
alcançou uma adequada separação cromatográfica sem que tal se traduzisse num
tempo de análise demasiado elevado (Figura 3).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
62
Figura 3- Cromatograma da análise das substâncias a 1000 mg/L.
Tendo sido introduzido, como já anteriormente referido, um gradiente térmico (10
°C/min até aos 130 °C) após uma primeira fase isotérmica (5 min a 40 °C) foi
necessário introduzir um post-run de 3 min após serem retomadas as condições
iniciais de temperatura. Caso contrário, constata-se que os tempos de retenção não
se mantêm reprodutíveis em análises sequenciais devido ao tempo insuficiente para
o reequilíbrio das condições iniciais de análise.
Para a otimização da temperatura do forno do injetor de headspace preparou-se
uma mistura contendo as substâncias a estudar numa concentração de 1000, 100, 50
e 10 mg/L. Estas amostras foram injetadas variando-se a respetiva temperatura
entre 40 e 80 °C, com incrementos de 10 °C. Como esperado, o incremento da
temperatura de incubação da amostra traduziu-se num aumento da resposta
analítica, fruto do enriquecimento do headspace relativamente às substâncias de
interesse. De facto, e para as concentrações mais baixas, algumas substâncias não
eram detetadas (e.g. 2-propanol) quando o forno do injetor era mantido a
temperatura mais baixa (40 °C).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
63
Os dados pormenorizados que suportam os efeitos obtidos são apresentados sob a
forma de anexo, na parte final desta dissertação (Anexo 7.1).
No decorrer desta fase do estudo também foi possível constatar que determinadas
substâncias (e.g. tolueno) não exibiam um comportamento reprodutível. Para
avaliar as causas analisaram-se cinco amostras de cada uma das substâncias, em
condições de repetibilidade (concentração e preparação idênticas). Da análise dos
resultados foi possível concluir que as substâncias tolueno, p-xileno e clorofórmio
não apresentavam estabilidade em termos de resposta analítica. Este facto poderia
resultar da pouca ou praticamente nenhuma solubilidade em água, tendo-se optado
por alterar o procedimento de preparação das respetivas soluções escolhendo-se um
solvente adequado às características de solubilidade das substâncias afetadas.
3.3.2 Identificação das substâncias
Com o objetivo de definir os critérios de identificação, baseados como já referido
na comparação de TRR, cada uma das substâncias foi injetada e analisada de
acordo com as condições entretanto otimizadas. Preparou-se também uma mistura
(II), com todas as substâncias, em concentrações de 10 e 1000 mg/L, as quais foram
analisadas conjuntamente com o padrão interno (100 mg/L). Desta forma foi
possível conhecer os tempos de retenção associados a cada uma das substâncias.
Este estudo foi realizado de forma idêntica para a mistura III e para o clorofórmio.
3.3.3 Validação do método analítico desenvolvido
A tabela 10 descreve os parâmetros de validação estudados no âmbito do
desenvolvimento do método analítico.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
64
Tabela 10- Parâmetros de validação em função do tipo de método utilizado.
Parâmetro Qualitativo Quantitativo
Especificidade/seletividade
Limite de deteção
Limite de quantificação
Linearidade
Repetibilidade
Precisão intermédia
Exatidão
Robustez
Carryover
Estabilidade
Descrevem-se, de seguida, os resultados obtidos para cada um dos parâmetros
avaliados.
3.3.3.1 Especificidade/seletividade
Para o estudo da seletividade / especificidade utilizaram-se 40 amostras (urina,
sangue e humor vítreo), a partir de um conjunto de processos selecionados para este
estudo. Estas 40 amostras foram separadas, de forma aleatória, em grupos de
quatro, originando pools de volume adequado ao pretendido para o estudo (Tabela
11 para o sangue e urina e Tabela 12 para o humor vítreo). Após homogeneização
prepararam-se duas amostras de cada pool. A primeira foi preparada através da
adição de 100 L de sangue/urina/humor vítreo e 1 mL de padrão interno. A
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
65
segunda amostra foi adicionalmente fortificada com as substâncias em estudo numa
concentração de 50 mg/L.
Tabela 11- Informação sobre as amostras de sangue/urina usadas para constituir as
misturas (pools)
Caso
Idade
Sexo
Informação disponível
Análises solicitadas
1 49 M Suicídio (Arma de fogo) A/DA/MD
2 78 M Lesões traumáticas A/DA
3 19 M Afogamento A/DA
4 49 M Causa desconhecida A/DA/MD
5 79 M -- A/DA
6 68 M -- A/DA/MD/P
7 87 F Causa desconhecida A/DA/MD/P
8 66 M Causa desconhecida A/DA/MD/P
9 24 M Asfixia mecânica A/DA/MD
10 79 F Causa desconhecida A/DA/MD/P
11 50 M Causa desconhecida A/DA/MD
12 69 F Asfixia mecânica A/MD
13 64 M Asfixia mecânica A/MD
14 64 M Causa desconhecida A/MD
15 81 F Acidente Doméstico (Queda) A/MD
16 75 M Asfixia mecânica A
17 28 M Acidente viação A/DA
18 62 M Suicídio (Asfixia mecânica) A/DA/MD
19 -- M Acidente Doméstico (Queda) A/DA/MD/P
20 78 M Morte natural A/DA/MD
21 44 M Morte natural A/DA/MD
22 66 F Causa desconhecida A/DA/MD/P
23 41 M Morte natural A/DA/MD/P
24 18 M Acidente viação A/DA/MD
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
66
(continuação da Tabela 11)
Caso
Idade
Sexo
Informação disponível
Análises solicitadas
25 46 M Causa desconhecida A/DA/MD/P
26 80 M Suicídio (Asfixia mecânica) A/MD
27 90 M Asfixia mecânica A
28 17 F Suicídio (Asfixia mecânica) A/DA
29 87 M Causa desconhecida A/MD
30 73 M Causa desconhecida A/MD/P
31 58 M Acidente Trabalho A/DA/MD
32 49 M Causa desconhecida A/DA/MD/P
33 35 F Causa desconhecida A/DA/MD
34 32 M Vítima de violação A/DA
35 16 M Avaliação Toxicodependente A/DA
36 28 M Avaliação Toxicodependente DA
37 39 M Avaliação Toxicodependente DA
38 28 M Avaliação Toxicodependente DA
39 44 M Avaliação Toxicodependente DA
40 34 M Avaliação Toxicodependente DA
Abreviaturas utilizadas nesta tabela: M (Masculino); F (Feminino); A (Alcoolemia); DA (Drogas de
Abuso); MD (Medicamentos); P (Pesticidas); -- (Informação não disponível).
Tabela 12- Informação sobre as amostras de humor vítreo usadas para constituir as
misturas (pools)
Caso
Idade
Sexo
Informação disponível
Observações
1 44 M Acidente Viação SAT
2 71 M Acidente Trabalho A
3 50 M Causa desconhecida SAT
4 73 M Causa desconhecida SAT
5 72 M -- A/MD
6 77 F Suicídio MD
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
67
(continuação da Tabela 12)
Caso
Idade
Sexo
Informação disponível
Observações
7 23 M Acidente de Viação A/DA
8 78 M Suicídio A/M/P
9 61 F Causa desconhecida SAT
10 59 M Suicídio A/DA/MD/P
11 57 M Causa desconhecida A/DA/MD/P
12 97 F Causa desconhecida SAT
13 77 F -- SAT
14 72 M Causa desconhecida SAT
15 48 M Afogamento SAT
16 94 F Causa desconhecida SAT
17 67 F Causa desconhecida SAT
18 39 M Causa desconhecida A/DA/MD/P
19 45 M Causa desconhecida SAT
20 74 M Tiro SAT
21 45 M Causa desconhecida A/MD/P
22 68 M Causa desconhecida SAT
23 47 M -- SAT
24 71 M -- A/MD/P
25 46 F -- A/DA/MD
26 58 M Causa desconhecida SAT
27 88 M Enforcamento SAT
28 74 F Acidente de Viação A/DA
29 73 F Causa desconhecida SAT
30 61 M Causa desconhecida SAT
31 83 M Causa desconhecida A/MD/P
32 53 M -- SAT
33 47 F Enforcamento SAT
34 87 F Causa desconhecida SAT
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
68
(continuação da Tabela 12)
Caso
Idade
Sexo
Informação disponível
Observações
35 47 M Suicídio A/DA/MD/P
36 62 F -- A/DA/MD/P
37 68 F Causa desconhecida A/MD/P
38 68 M Causa desconhecida A/MD/P
39 35 M Acidente de Viação A/DA
40 56 M Suicídio A/MD/P
Abreviaturas utilizadas nesta tabela: M (Masculino); F (Feminino); A (Alcoolemia); DA (Drogas de
Abuso); MD (Medicamentos); -- (Informação não disponível). SAT (Sem análises toxicológicas).
Na avaliação dos resultados obtidos na análise das referidas amostras de sangue,
urina e humor vítreo não foram observados quaisquer sinais analíticos capazes de
interferir na correta identificação e quantificação das substâncias estudadas (Figuras
4 e 5). Assim, todas as amostras de sangue, urina e humor vítreo às quais não foram
adicionadas as substâncias em estudo apresentaram resultados negativos. Por seu
lado, todas as amostras às quais se adicionaram tais substâncias foram consideradas
positivas. A percentagem de falsos positivos e de falsos negativos foi assim de 0%,
cumprindo-se claramente o critério de aceitação em vigor (inferior a 10%).
Figura 4- Cromatograma da amostra 8A de urina, não fortificada.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
69
Figura 5- Cromatograma da amostra 8B de urina, fortificada.
Tabela 13- Resultados obtidos no estudo da especificidade/seletividade.
Parte I – Análise das amostras negativas
Código da amostra Resultados Observações
Pool 1 – A1
Negativo
-----
Pool 2 – B1
Negativo
-----
Pool 3 – C1
Negativo
-----
Pool 4 – D1
Negativo
-----
Pool 5 – E1
Negativo
-----
Pool 6 – F1
Negativo
-----
Pool 7 – G1
Negativo
-----
Pool 8 – H1
Negativo
-----
Pool 9 – I1
Negativo
-----
Pool 10 – J1
Negativo
-----
Percentagem de falsos positivos 0%
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
70
(continuação da Tabela 13)
Parte II – Análise das amostras positivas
Código da amostra Resultados Observações
Pool 1 – A2
Positivo
-----
Pool 2 – B2
Positivo
-----
Pool 3 – C2
Positivo
-----
Pool 4 – D2
Positivo
-----
Pool 5 – E2
Positivo
-----
Pool 6 – F2
Positivo
-----
Pool 7 – G2
Positivo
-----
Pool 8 – H2
Positivo
-----
Pool 9 – I2
Positivo
-----
Pool 10 – J2
Positivo
-----
Percentagem de falsos negativos 0%
3.3.3.2 Linearidade
A linearidade foi estudada através da análise, de acordo com o procedimento já
descrito, de 10 amostras com concentrações distribuídas de maneira uniforme e
preparadas a partir das soluções descritas no ponto 3.2.5.2 Assim, os calibradores
estavam distribuídos entre 50 e 2000 mg/L, no caso da mistura II, entre 5 e 1000
mg/L para a mistura III, e entre 50 e 1000 mg/L para o clorofórmio.
A análise da linearidade foi avaliada através do estudo da regressão da curva de
calibração obtida, tendo em consideração os seguintes critérios de aceitação:
Coeficiente de determinação (r2 > 0,99);
Resíduos (análise visual da sua distribuição);
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
71
Interceção da reta na origem, analisando-se a inclusão do valor zero tendo
em consideração um grau de confiança de 95%.
A tabela 14 resume os resultados obtidos no decorrer do estudo da linearidade.
Tabela 14- Resultados obtidos no estudo da linearidade.
Composto
TR
Equações das retas
R2
Intercetar a ordenada na
origem
95%inf 95%sup
Acetaldeído
1.945
0,0018 0,0473
0,9962
- 0,0561
+ 0,1508
Acetato de
Etilo
2.117
0,0039 0,0759
0,9974
- 0,1087
+ 0,2604
Acetona
2.952
0,0016 0,0275
0,9985
- 0,0297
+ 0,0847
Acetonitrilo
3.617
0,0008 0,0022
0,9989
- 0,0255
+ 0,0211
1-Butanol
8.00
0,0015 0,0376
0,9997
- 0,0608
- 0,0143
2-Propanol
3.127
0,001 0,0087
0,9993
- 0,0149
+ 0,0324
Éter
2.336
0,0095 0,0672
0,9977
- 0,5216
+ 0,3872
Metanol
2.096
0,0003 0,0028
0,9986
- 0,0069
+ 0,0124
Tolueno
9.275
0,0176 0,0424
0,9967
- 0,4510
+0,3661
p-Xileno
11.976
0,0187 0,0942
0,9971
-0,4987
+ 0,3103
Clorofórmio
5.613
0,0016 0.0279
0,9982
-0,0569
+ 0,0011
Para todas as substâncias voláteis estudadas, e dentro da respetiva gama de
trabalho, foi obtida linearidade, encontrando-se sempre um coeficiente de
determinação superior a 0,99. Verificou-se assim o cumprimento dos critérios de
aceitação com exceção do 1-Butanol. Para esta substância não foi possível, mesmo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
72
após repetição das análises, o cumprimento do critério de inclusão do valor zero na
interseção da reta na origem.
Em anexo (Anexo 7.2) apresentam-se os dados obtidos e o respetivo tratamento
estatístico.
3.3.3.3 Limites de deteção e de quantificação
A determinação dos limites de deteção e de quantificação foi efetuada através do
estudo da curva de calibração. Para isso prepararam-se curvas de calibração
utilizando amostras fortificadas com concentrações próximas do limite de deteção
esperado e distribuídas uniformemente. Para a mistura II foram preparadas soluções
de trabalho com concentrações entre 10 e 200 mg/L. O clorofórmio foi estudado
numa curva de calibração entre 25 e 220 mg/L e a mistura III entre 0,7 e 30 mg/L.
Cada uma das amostras foi preparada de acordo com o procedimento já descrito.
Uma vez obtidas as curvas de calibração após o respetivo processamento dos dados
(Microsoft Office Excel 2007), para cada uma das substâncias, os limites de
deteção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram calculados através das equações 1 e
2.
Equação 1: b
xSLOD x
y3,3
Equação 2: b
xSLOQ x
y10
onde representa o desvio padrão da curva de calibração e b o declive da reta.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
73
Na tabela 15 apresentam-se os resultados obtidos para o limite de deteção (LOD) e
quantificação (LOQ) de todas as substâncias, bem como os dados mais relevantes
das curvas de calibração.
Tabela 15- Resultados obtidos no estudo dos limiares analíticos.
Substância
Equação da reta
r2
LOD (mg/L)
LOQ (mg/L)
Acetaldeído (10-170 mg/L)
0,0021 0,0061
0,9999
0,0010
2
5
Acetato de Etilo (10-170 mg/L)
0,0042 0,0205
0,9998
0,0033
3
8
Acetona (10-170 mg/L)
0,0017 0,0018
0,9999
0,0009
2
5
Acetonitrilo (20-150 mg/L)
0,0008 0,0021
0,9993
0,0020
8
25
1-Butanol (15-200 mg/L)
0,0014 0,0068
0,9994
0,0022
5
16
2-Propanol (15-200 mg/L)
0,001 0,0034
0,9998
0,0010
3
10
Éter (10-170 mg/L)
0,0011 0,0861
0,9984
0,0230
7
21
Metanol (20-170 mg/L)
0,0003 0,0058
0,9984
0,0006
7
22
Tolueno (0,8-30 mg/L)
0,0159 0,0016
0,9993
0,0044
1
3
p-Xileno (0,7-30 mg/L)
0,0172 0,0024
0,9995
0,0040
1
2
Clorofórmio (25-220 mg/L)
0,0015 0,0032
0,9982
0,0047
10
31
Em anexo (Anexo 7.3) apresentam-se os dados obtidos, as representações gráficas
das curvas de calibração utlizadas no estudo dos limiares analíticos e o respetivo
tratamento estatístico.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
74
3.3.3.4 Repetibilidade do equipamento
A repetibilidade foi analisada conjuntamente com a precisão intermédia. Para tal,
prepararam-se 5 replicados independentes fortificados nos níveis baixo e alto das
gamas de concentração, para cada uma das misturas (250 e 1500 mg/L para a
mistura II, 100 e 800 mg/mL para a mistura III e 100 e 750 mg/L para o
clorofórmio).
Após a análise, e obtidas as áreas e os TRR para cada substância e para cada
replicado, calculou-se a média das razões área da substância/área do PI, os desvios
padrão e os coeficientes de variação.
As tabelas 16 e 17 resumem os resultados obtidos na avaliação deste parâmetro e
para os dois níveis de concentração considerados. Em anexo apresentam-se os
restantes dados e cálculos efetuados (anexo 7.4).
Tabela 16- Resultados obtidos para o controlo baixo (100 e 250 mg/L).
Substância
TRR Controlo
(mg/L) Média Desvio Padrão CV%
Acetaldeído
0,414
250
0,466
0,006
1,3
Acetato de
Etilo
1,045
250
0,972
0,014
1,4
Acetona
0,631
250
0,388
0,003
0,8
Acetonitrilo
0,772
250
0,178
0,001
0,6
1-Butanol
1,708
250
0,338
0,003
0,9
2-Propanol
0,672
250
0,228
0,002
0,8
Éter
0,498
250
2,264
0,053
2,4
Metanol
0,451
250
0,072
0,001
1,3
Tolueno
1,992
100
1,773
0,112
6,3
p-Xileno
2,579
100
1,805
0,116
6,4
Clorofórmio
1,197
100
0,142
0,006
4,1
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
75
Tabela 17- Resultados obtidos para o controlo alto (750, 800 e 1500 mg/L).
Substância
TRR Controlo Média Desvio Padrão CV%
Acetaldeído
0,414
1500
2,709
0,040
1,5
Acetato de
Etilo
1,045
1500
5,924
0,112
1,9
Acetona
0,631
1500
2,361
0,026
1,1
Acetonitrilo
0,771
1500
1,102
0,003
0,2
1-Butanol
1,707
1500
2,155
0,011
0,5
2-Propanol
0,672
1500
1,395
0,009
0,6
Éter
0,498
1500
14,887
0,360
2,4
Metanol
0,451
1500
0,424
0,004
0,9
Tolueno
1,994
800
14,806
0,742
5
p-Xileno
2,581
800
15,426
0,773
5
Clorofórmio
1,197
750
1,171
0,051
4,3
Constatou-se que os valores de coeficientes de variação cumpriam, em todos os
casos, o critério de aceitação utilizado (CV <10%).
3.3.3.5 Precisão intermédia
A avaliação da precisão intermédia foi determinada recorrendo a um número
limitado de experiências. Para isso, procedeu-se à realização dos ensaios durante
cinco dias diferentes, de forma a avaliar o impacto das alterações que são
expectáveis que ocorram durante o normal funcionamento do laboratório (e.g.
diferentes dias, calibrações, materiais e operadores).
Prepararam-se então distintas curvas de calibração ao longo de cinco dias e,
simultaneamente, dois controlos com concentrações diferentes, consoante as
substâncias em estudo (ver ponto 3.2.5.3 e 3.2.5.4).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
76
Os dados obtidos para a precisão intermédia e repetibilidade do método analítico
foram analisadas através da aplicação ANOVA (fator único), utilizando as
equações abaixo representadas.
Tabela 18- Tabela ANOVA (fator único).
Fonte
Média quadrática (MQ)
Graus de Liberdade
Entre Grupos
1
1
2
p
xxn
MS
p
ii
r
1p
Dentro de grupos
1
1 1
2
np
xx
MS
p
i
n
jiij
r
1np
Total
1pn
Tabela 19- Cálculo das estimativas da precisão intermédia e de repetibilidade.
Precisão
Expressão
Repetibilidade (Sr) rr MSS
Between-run precision (Srun) n
MSMSS rrunrun
Precisão intermédia (S1)
221 runr SSS
Onde:
p é o número de sequências de análise para cada nível de concentração;
n é o número de replicados em cada sequência;
xij representa a concentração (replicado j) obtido na sequência i;
x representa a média da concentração de n replicados obtidos na sequência i;
xé a média das médias de p sequências.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
77
Se os CV forem aproximadamente constantes ao longo da gama de trabalho, aplica-
se a fórmula abaixo para calcular um CV ponderado.
...11
...11
21
222
211
nn
CVnCVnCVpool
Na tabela 20 apresentam-se os resultados obtidos relativamente à repetibilidade e
precisão intermédia, ao longo dos 5 dias e para os dois níveis de concentração
considerados.
Tabela 20- Estudo da repetibilidade e de precisão intermédia do método analítico.
Substância
Concentração (mg/L)
Repetibilidade (Sr)
Precisão intermédia
CV%
Acetaldeído
250
1500
4,0
16,2
8,7
37,5
3,3
2,6
Acetato de Etilo
250
1500
4,5
25,6
10,4
39,4
3,9
2,3
Acetona
250
1500
2,3
20,5
5,8
29,7
2,3
1,8
Acetonitrilo
250
1500
1,2
14,7
5,0
16,1
2,0
0,8
1-Butanol
250
1500
3,5
20,0
11,9
55,7
4,4
3,5
2-Propanol
250
1500
1,5
18,2
5,9
20,7
2,3
1,0
Éter
250
1500
7,1
30,4
14,0
52,6
4,9
3,2
Metanol
250
1500
2,8
18,9
7,7
26,8
2,9
1,5
Tolueno
100
800
4,9
37,8
7,6
38,9
6,9
3,8
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
78
(continuação da Tabela 20)
Substância
Concentração (mg/L)
Repetibilidade (Sr)
Precisão intermédia
CV%
p-Xileno
100
800
7,1
34,3
8,6
37,4
7,0
4,5
Clorofórmio
100
750
3,0
18,7
4,9
26,7
5,4
4,6
A avaliação deste parâmetro é feita com base no cálculo do coeficiente de variação
(CV). Obtiveram-se valores que variam entre 0,8 % para o acetonitrilo (1500 mg/L)
e 7,0 % para o p-xileno (100 mg/L) (tabela 20), valores esses muito inferiores ao
critério de aceitação de 20 % recomendado na literatura.
Em anexo apresentam-se as tabelas resultantes dos cálculos efetuados para cada
substância (Anexo 7.5).
3.3.3.6 Exatidão
A exatidão de um método analítico traduz a aproximação entre o resultado da
medição, efetuada pelo método, e o valor verdadeiro da mensuranda.
Para avaliar este parâmetro estudou-se a recuperação do método (i.e. a razão entre o
valor observado e o valor esperado), com o intuito de detetar a existência de erros
sistemáticos, definir fatores de correlação e, se relevante, estimar a incerteza
associada à recuperação do método R
U como dado de entrada do procedimento de
cálculo de incertezas. A partir dos resultados obtidos para o cálculo da precisão
intermédia, e das equações a seguir apresentadas, pode proceder-se ao cálculo do
RU .
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
79
Fortf
Obsij
C
CR
P
R
R
P
ii
1 R
ExpU
Rt
%
1
P
SU Obs
R
% R
UU R
R
%
R
K
RU
UR
R
2
2
%
1
Onde ,
ObsS é o desvio padrão de p valores de Rj obtidos em condições de precisão
intermédia;
Rj é a recuperação média de n replicados obtidos em condições de repetibilidade;
Para cada nível de concentração foi aplicado um teste estatístico de forma a
averiguar se a recuperação média era significativamente diferente de 100%: se
crittt exp , então R não é significativamente diferente de 100% e R
U é calculado
com base na equação mais simples, em que crítt é o valor crítico bi-caudal para
1p graus de liberdade num intervalo de confiança de 95%.
Na tabela seguinte apresentam-se os resultados da exatidão do método.
Tabela 21- Resultados obtidos para a exatidão.
Substância
Concentração (mg/L)
Exatidão %
Acetaldeído
250
1500
99,2
90,1
Acetato de Etilo
250
1500
101,9
96,3
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
80
(continuação da Tabela 21)
Substância
Concentração (mg/L)
Exatidão %
Acetona
250
1500
98,1
93,7
Acetonitrilo
250
1500
99,6
96,2
1-Butanol
250
1500
103,8
100,0
2-Propanol
250
1500
100,9
96,5
Éter
250
1500
104,9
96,6
Metanol
250
1500
103,2
96,6
Tolueno
100
800
106,0
95,8
p-Xileno
100
800
106,3
97,6
Clorofórmio
100
750
96,7
95,9
A exatidão do método em percentagem apresenta valores para o controlo baixo
entre 96,7% (clorofórmio) e 106,3% (p-xileno) e para o controlo alto valores entre
90,1% (acetaldeído) e 100,0% (1-butanol).
As tabelas relativamente aos restantes cálculos associados ao parâmetro de exatidão
encontram-se em anexo (Anexo 7.6).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
81
3.3.3.7 Robustez
Para avaliar a robustez do método consideraram-se as seguintes alterações,
representativas da sua utilização em condições de rotina:
Substituição do tipo de liner;
Execução por outro técnico;
Substituição de coluna cromatográfica;
Substituição da pré-coluna;
Uso de pipetas diferentes.
O método analítico evidenciou sempre capacidade para produzir resultados fiáveis e
reprodutíveis mesmo após a introdução das modificações acima referidas.
3.3.3.8 Avaliação dos fenómenos de arrastamento (carryover)
A avaliação de fenómenos de arrastamento foi feita em conjunto com a precisão
intermédia. Para isso prepararam-se três amostras brancas que foram injetadas entre
as amostras de concentração mais elevada, analisadas a propósito da avaliação da
precisão intermédia.
Analisaram-se os cromatogramas obtidos na análise das amostras brancas a fim de
pesquisar a presença de eventuais contaminações. Constatou-se a presença de um
ligeiro sinal para a substância p-xileno embora não significativa e, por isso, sem
impacto no resultado da análise da amostra seguinte. Esta conclusão resultou do
facto de, durante o estudo da precisão intermédia, ter-se analisado uma amostra
controlo com 100 mg/mL imediatamente a seguir ao último calibrador (1000
mg/L), sem que se tenham observado diferenças significativas no respetivo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
82
resultado ao longo dos cinco dias do estudo. Na análise dos restantes resultados não
se evidenciou a ocorrência de fenómenos de arrastamento.
3.3.3.9 Teste ao limiar analítico de quantificação
Tendo em conta a gama de valores obtidos para o limite de quantificação das
substâncias em estudo decidiu-se testar o limite de quantificação a 25 mg/L para a
mistura II, a 5 mg/L para a mistura III e a 35 mg/L para o clorofórmio. Para tal,
prepararam-se 5 replicados independentes para sangue, urina e humor vítreo, a estas
concentrações. Em simultâneo, preparou-se uma curva de calibração com 5 pontos
para cada substância de acordo com o procedimento já descrito anteriormente para
a determinação dos limites de deteção e quantificação.
Uma vez aplicado o procedimento de ensaio determinou-se o coeficiente de
variação (CV%) e o erro em relação ao valor teórico dos replicados, para cada uma
das amostras biológicas (Tabela 22, 23, 24).
Tabela 22- Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de sangue
Substância
LOQ
Concentração
(mg/L)
Média
CV (%)
Erro (%)
Acetaldeído
12
25
23,1
4,8
7,7
Acetato de Etilo
14
25
22,0
7,8
12,0
Acetona
23
25
26,1
4,7
4,6
Acetonitrilo
15
25
26,2
7,1
5,0
1-Butanol
3
25
28,0
6,2
11,8
2-Propanol
10
25
21,9
8,5
12,6
Éter
25
25
20,2
6,2
19,1
Metanol
15
25
24,4
4,8
2,5
Tolueno
3
5
4,1
2,8
18,9
p-Xileno
2
5
4,0
2,4
19,5
Clorofórmio
31
35
27,0
8,7
22,8
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
83
Tabela 23- Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de urina
Substância
LOQ
Concentração
(mg/L)
Média
CV (%)
Erro (%)
Acetaldeído
12
25
22,2
2,9
11,1
Acetato de Etilo
14
25
20,1
2,5
19,5
Acetona
23
25
25,9
2,5
3,6
Acetonitrilo
15
25
23,3
2,0
6,8
1-Butanol
3
25
20,1
2,5
19,5
2-Propanol
10
25
24,6
1,9
1,6
Éter
25
25
20,7
2,8
17,3
Metanol
15
25
27,7
5,2
10,7
Tolueno
3
5
5,4
7,9
7,9
p-Xileno
2
5
5,3
8,0
5,5
Clorofórmio
31
35
33,3
3,9
4,7
Tabela 24- Resultados obtidos para o teste ao LOQ em amostras de humor vítreo
Substância
LOQ
Concentração
(mg/L)
Média
CV (%)
Erro (%)
Acetaldeído
12
25
24,8
1,7
0,9
Acetato de Etilo
14
25
20,5
0,8
18,0
Acetona
23
25
24,9
1,7
0,5
Acetonitrilo
15
25
23,3
2,8
6,7
1-Butanol
3
25
28,7
0,9
14,6
2-Propanol
10
25
24,7
1,1
1,2
Éter
25
25
20,7
2,1
17,3
Metanol
15
25
27,4
2,8
9,5
Tolueno
3
5
5,4
6,1
8,8
p-Xileno
2
5
5,5
6,7
9,2
Clorofórmio
31
35
28,9
3,5
17,4
Verificou-se que foram cumpridos os requisitos previstos para o teste efetuado ao
LOQ para todas as substâncias estudadas, obtendo-se coeficientes de variação
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
84
inferiores a 20% com a exceção do clorofórmio, que apresentou um erro de cerca
de 23% nas determinações efetuadas na amostra de sangue. Apesar disso, o
respetivo coeficiente de variação manteve-se próximo de 9%.
Em anexo (Anexo 7.7), apresenta-se sob a forma de tabelas os resultados obtidos
para cada uma das substâncias.
3.3.3.10 Estabilidade
A fim de verificar a estabilidade das substâncias em estudo procedeu-se, numa
primeira fase, à avaliação das retas de calibração preparadas com os padrões à
temperatura de trabalho do laboratório e com estes refrigerados, tendo-se
constatado que para a substância clorofórmio apenas se cumpriam os critérios de
aceitação quando as análises eram efetuadas com recurso à utilização de padrões
refrigerados.
A estabilidade das amostras a ciclos de congelação/descongelação também foi
avaliada para dois níveis de concentração (250 e 1500 mg/L para a mistura II, 100 e
800 mg/mL para a mistura III e 100 e 750 mg/L para o clorofórmio). Para tal,
adicionaram-se os respetivos padrões das substâncias em estudo às amostras a
analisar (sangue, urina e humor vítreo). Posteriormente foram congeladas e
descongeladas ao fim de um e oito dias, respetivamente. As amostras foram
analisadas de acordo com o procedimento descrito em 3.2.5.2 e os resultados
obtidos foram comparados com os resultados das amostras preparadas e analisadas
no mesmo dia. Não se verificaram diferenças significativas entre os resultados
obtidos.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
85
Parte IV – APLICAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO EM
AMOSTRAS REAIS
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
87
Em capítulos anteriores apresentamos o desenvolvimento e validação de um
método analítico por HS-GC/FID destinado a determinar, com exatidão, precisão e
sensibilidade adequadas, onze substâncias voláteis. É de salientar o facto de este
método utilizar apenas 100 L de amostra e de se mostrar sensível na quantificação
destas substâncias para valores que variam entre 2 mg/L para o p-xileno e 31 mg/L
para o clorofórmio.
Constituía um dos objetivos deste trabalho aplicar o método desenvolvido e
validado a casos reais, nos quais tivesse sido solicitada a pesquisa de uma ou mais
das substâncias envolvidas neste estudo.
Assim sendo, após a sua validação, o método foi aplicado a todos os casos reais em
que houve suspeita da presença de substâncias voláteis, relativos ao Serviço de
Toxicologia Forense da Delegação do Centro do INML, durante o período
correspondente ao ano letivo 2011/2012 (Tabela 25). Em seis dos treze casos
analisados tinha sido solicitada a pesquisa de substâncias voláteis. Nos restantes
casos, apesar de não ter sido solicitado este tipo de análise mas tendo-se constatado,
após a realização da determinação de alcoolémia, a presença de picos
desconhecidos, decidiu-se aplicar este ensaio. É ainda de salientar que, dos seis
casos, cinco foram analisados de imediato por GC-HS/FID; no outro aplicou-se a
metodologia GC-MS, com recurso à qual foi possível detetar a presença de tolueno
em sangue. A posteriori, e no âmbito deste trabalho, procedeu-se à quantificação
deste composto por GC-HS/FID.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
88
Tabela 25- Apresentação dos casos reais analisados.
Caso S I Inf.
Análises Solicitadas
Resultados Voláteis
(mg/L) Sangue Urina Humor vítreo
1
F
80
MN
A/MD/P/V
Acetona_Negativa
Acetona <50*
S/Amostra
2
M
73
AV
A/DA/MD/V
Negativo**
Negativo**
S/Amostra
3
M
53
S
DA/MD/V
Tolueno = 41
S/Amostra
S/Amostra
4
F
--
AS
A/MD/P/V
Éter_Negativo
Éter_Negativo
S/Amostra
5
M
19
D
A/DA/MD/P
Acetona=553
Isopropanol=67
Acetona=558
Isopropanol=50
Acetona=433
Isopropanol<50+
6
M
62
D
A/DA/MD/P
Acetona=160
Acetona = 595
S/Amostra
7
F
53
D
A/MD/V
Negativo**
Negativo**
Negativo**
8
M
69
D
A/MD/V
Acetona <50 *
Acetaldeído <50 *
Metanol <50 *
Acetona <50 *
Acetaldeído<50*
Metanol = 60
S/Amostra
9
M
84
D
A/MD
Acetona = 148
Isopropanol <50 *
Acetaldeído <50 *
Acetona = 152
Isopropanol< 50
Acetaldeído<50*
S/Amostra
10
M
46
MN
A/MD
Acetona=470
S/Amostra
S/Amostra
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
89
(continuação da Tabela 25)
Caso S I Inf.
Análises Solicitadas
Resultados Voláteis
(mg/L) Sangue Urina Humor vítreo
11
M
59
D
A/DA/MD/P
Acetona=394
Isopropanol <50 *
Acetaldeído <50 *
Metanol <50 *
Acetona = 352
Isopropanol<50*
Metanol <50 *
S/Amostra
12
M
56
D
A/MD
Acetona=245
Isopropanol=152
Acetaldeído=71
Acetona=373
Isopropanol=82
Acetaldeído<50*
S/Amostra
13
M
64
MN
A/AD/MD
S/Amostra
Acetona <50 *
Acetaldeído<50*
S/Amostra
Abreviaturas utilizadas nesta tabela: M (Masculino); F (Feminino); MN (Morte Natural); S (Suicídio); D
(Causa desconhecida); AS (Abuso Sexual); AV (Acidente de Viação); A (Alcoolemia); DA (Drogas de Abuso);
MD (Medicamentos); P (Pesticidas); V (Voláteis); -- (Informação não disponível); S/ Amostra (Sem Amostra).
* <1º Calibrador
** Negativo para as substâncias pesquisadas
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
91
Parte V – CONCLUSÕES
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
93
A deteção, identificação e quantificação de substâncias voláteis é de grande
relevância quer no âmbito clínico quer no âmbito forense. Com esse objetivo,
desenvolveu-se um procedimento com recurso à tecnologia HS-GC/FID, a qual
possibilitou uma maior abrangência no número de substâncias voláteis detetadas e
quantificadas.
Os resultados obtidos na determinação e validação do método permitem concluir o
seguinte:
O método desenvolvido e validado com recurso a um cromatógrafo de
gases, equipado com um detetor de ionização de chama e acoplado a um
injetor de headspace, para a deteção, identificação, confirmação e
quantificação de onze substâncias voláteis (acetaldeído, acetato de etilo,
acetona, acetonitrilo, 1-butanol, clorofórmio, éter, metanol, 2-propanol,
tolueno e p-xileno), em diferentes amostras biológicas (sangue, urina e
humor vítreo), provou ser específico e sensível, com valores adequados de
precisão e exatidão. Os resultados obtidos para os limites de deteção e
quantificação também se revelaram apropriados, apresentando respostas
analíticas lineares para as gamas de trabalho estudadas.
Esta metodologia provou ser pouco morosa, comparativamente à maioria
das técnicas utilizadas na determinação de um elevado número de
substâncias, uma vez que todos os compostos estudados, incluindo o n-
propanol (padrão interno), eluíram num intervalo de tempo de 15 minutos.
É de salientar que o método provou ser seletivo e sensível para um reduzido
volume de amostra (100 L), o que constitui uma vantagem evidente. Esta
questão é de extrema importância em toxicologia forense dada a vulgar
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
94
escassez de amostra face às solicitações de diferentes tipos de análise no
âmbito de um só processo forense. Acresce ainda o facto de não ser
necessário aplicar qualquer procedimento extrativo por se tratar de uma
técnica de headspace.
É ainda de referir, que ao longo deste trabalho foram constatados e
ultrapassados alguns desafios técnicos, podendo as soluções encontradas
revelar-se importantes em futuros desenvolvimentos quer deste quer de
outros trabalhos similares, tais como:
Constatou-se que em algumas soluções as perdas dos compostos de
interesse eram significativas, originando problemas ao nível da
precisão ou exatidão dos resultados. Por esse motivo, verificou-se a
necessidade de utilizar soluções devidamente refrigeradas, uma vez
que só assim se cumpriam os critérios de aceitação utilizados na
avaliação das curvas de calibração;
Tendo em consideração a elevada diversidade das características
físico-químicas das onze substâncias estudadas tornou-se necessário
desenvolver condições cromatográficas específicas, nomeadamente a
introdução de um gradiente térmico com o objetivo de melhorar a
separação cromatográfica. Além disso, otimizaram-se outros aspetos
como foi o caso da introdução de um intervalo de tempo, após cada
análise cromatográfica (post-run time) de 3 min, com o objetivo de
garantir a reprodutibilidade, em análises sequenciais, dos tempos de
retenção de cada uma das substâncias, o que não se revela necessário
nas condições habituais de utilização do equipamento (análises
realizadas em condições isotérmicas).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
95
Alguns compostos (e.g. tolueno) não exibiam um comportamento
reprodutível, do ponto de vista cromatográfico, quando se utilizava a
água como solvente na preparação das soluções. Este facto resultava
da sua pouca ou praticamente nenhuma solubilidade em água, tendo-
se optado por alterar o procedimento de preparação das respetivas
soluções escolhendo-se um solvente adequado às características de
solubilidade das substâncias afetadas.
No futuro, e com vista ao desenvolvimento deste trabalho, seria pertinente incluir
outras substâncias voláteis, metabolitos ou até isómeros das já estudadas (e.g. o- e
m-xileno). Também se poderá considerar a sua aplicação a outras amostras
biológicas (e.g. órgãos).
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
97
Parte VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
107
Parte VII – ANEXOS – Resultados do Procedimento de
Validação
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
109
7.1 Experiência efetuada à temperatura do injetor
Acetaldeído Método Área _FID1A Acetaldeído Método Área _FID1A Acetaldeído Método Área _FID1A Acetaldeído Método Área _FID1A
1000mg/L 40 31,09769 100mg/L 40º HS 2,97471 50mg/L 40º HS 1,46736 10mg/L 40º HS 0,3014
50 46,70485 50º HS 4,58726 50º HS 2,27756 50º HS 0,483749
60 60,32219 60º HS 5,86698 60º HS 2,77291 60º HS 0,355636
70 73,14662 70º HS 6,71929 70º HS 3,42637 70º HS 0,420899
80 125,82977 80º HS 12,03294 80º HS 4,22437 80º HS 0,417908
Metanol Método Área _FID1A Metanol Método Área _FID1A Metanol Método Área _FID1A Metanol Método Área _FID1A
1000mg/L 40 9,06601 100mg/L 40º HS 0,859112 50mg/L 40º HS 0,478691 10mg/L 40º HS xxxx
50 15,19067 50º HS 1,2966 50º HS 0,667092 50º HS xxxx
60 20,55196 60º HS 2,49352 60º HS 1,3482 60º HS 0,392729
70 35,0751 70º HS 3,24216 70º HS 1,8985 70º HS 0,511932
80 87,34496 80º HS 8,07791 80º HS 3,26401 80º HS 0,990439
Éter Método Área _FID1A Éter Método Área _FID1A Éter Método Área _FID1A Éter Método Área _FID1A
1000mg/L 40 1071,24255 100mg/L 40º HS 103,7712 50mg/L 40º HS 52,57134 10mg/L 40º HS 9,50698
50 1371,75378 50º HS 132,9458 50º HS 67,5153 50º HS 12,82764
60 1320,1344 60º HS 128,85683 60º HS 67,57715 60º HS 12,45409
70 1329,34851 70º HS 132,45795 70º HS 66,82823 70º HS 11,43387
80 1270,55505 80º HS 155,06479 80º HS 76,5518 80º HS 15,34659
Acetona Método Área _FID1A Acetona Método Área _FID1A Acetona Método Área _FID1A Acetona Método Área _FID1A
1000mg/L 40 61,90128 100mg/L 40º HS 5,7507 50mg/L 40º HS 2,84106 10mg/L 40º HS 0,635931
50 95,98767 50º HS 8,9613 50º HS 4,41685 50º HS 0,977358
60 126,97543 60º HS 12,4101 60º HS 6,23765 60º HS 1,36873
70 164,84381 70º HS 15,19069 70º HS 8,1334 70º HS 1,74482
80 322,36426 80º HS 30,21066 80º HS 11,63836 80º HS 2,74102
Isopropanol Método Área _FID1A Isopropanol Método Área _FID1A Isopropanol Método Área _FID1A Isopropanol Método Área _FID1A
1000mg/L 40 xxxx 100mg/L 40º HS xxxx 50mg/L 40º HS xxxx 10mg/L 40º HS xxxx
50 xxxx 50º HS xxxx 50º HS xxxx 50º HS xxxx
60 150,57 60º HS 11,24634 60º HS 4,422147 60º HS xxxx
70 198,23 70º HS 13,14208 70º HS 5,37684 70º HS 0,7879
80 203,69063 80º HS 18,36272 80º HS 6,74977 80º HS 1,311918
Acetonitrilo Método Área _FID1A Acetonitrilo Método Área _FID1A Acetonitrilo Método Área _FID1A Acetonitrilo Método Área _FID1A
1000mg/L 40 82,79455 100mg/L 40º HS 8,51235 50mg/L 40º HS 4,12528 10mg/L 40º HS 0,835158
50 66,28735 50º HS 5,86327 50º HS 2,87086 50º HS 0,616491
60 82,79455 60º HS 8,51235 60º HS 4,12528 60º HS 0,835158
70 111,69108 70º HS 9,89263 70º HS 5,29722 70º HS 0,996634
80 229,34871 80º HS 20,49721 80º HS 7,58176 80º HS 1,60881
PI (100mg/L) Método Área _FID1A PI (100mg/L) Método Área _FID1A PI (100mg/L) Método Área _FID1A PI (100mg/L) Método Área _FID1A
1000mg/L 40 26,04694 100mg/L 40º HS 23,47878 50mg/L 40º HS 24,71245 10mg/L 40º HS 26,84203
50 47,28735 50º HS 42,636 50º HS 42,09731 50º HS 46,24963
60 69,54808 60º HS 77,32649 60º HS 78,06692 60º HS 78,68858
70 114,40451 70º HS 104,60761 70º HS 114,76569 70º HS 113,86193
80 163,36372 80º HS 173,35902 80º HS 186,63794 80º HS 205,61606
Acetato de Etilo Método Área _FID1A Acetato de Etilo Método Área _FID1A Acetato de Etilo Método Área _FID1A Acetato de Etilo Método Área _FID1A
1000mg/L 40 631,94 100mg/L 40º HS 64,64146 50mg/L 40º HS 27,32533 10mg/L 40º HS 6,42105
50 418,32214 50º HS 40,39594 50º HS 21,700951 50º HS 4,6987
60 363,7442 60º HS 35,87497 60º HS 17,89516 60º HS 3,111113
70 418,32214 70º HS 40,39594 70º HS 21,700951 70º HS 4,6987
80 631,94 80º HS 64,64146 80º HS 27,32533 80º HS 6,42105
Clorofórmio Método Área _FID1A Clorofórmio Método Área _FID1A Clorofórmio Método Área _FID1A Clorofórmio Método Área _FID1A
1000mg/L 40 275,33255 100mg/L 40º HS 30,70061 50mg/L 40º HS 19,41358 10mg/L 40º HS 2,25575
50 313,30429 50º HS 33,47229 50º HS 20,86997 50º HS 2,66854
60 217,38129 60º HS 27,11684 60º HS 17,72216 60º HS 2,1542
70 214,92467 70º HS 26,98169 70º HS 15,3439 70º HS 1,649
80 171,80991 80º HS 28,76725 80º HS 17,63909 80º HS 2,34197
Butanol Método Área _FID1A Butanol Método Área _FID1A Butanol Método Área _FID1A Butanol Método Área _FID1A
1000mg/L 40 24,85935 100mg/L 40º HS 2,40299 50mg/L 40º HS 1,12774 10mg/L 40º HS xxxx
50 53,5108 50º HS 4,28613 50º HS 2,00799 50º HS xxxx
60 82,75484 60º HS 8,61701 60º HS 3,98797 60º HS xxxx
70 131,96504 70º HS 11,70664 70º HS 6,23535 70º HS 1,03479
80 309,28296 80º HS 27,88156 80º HS 10,37658 80º HS 2,06778
Tolueno Método Área _FID1A Tolueno Método Área _FID1A Tolueno Método Área _FID1A Tolueno Método Área _FID1A
1000mg/L 40 1272,79785 100mg/L 40º HS 151,68477 50mg/L 40º HS 113,65427 10mg/L 40º HS 10,3542
50 1367,44702 50º HS 161,09837 50º HS 118,65142 50º HS 12,04722
60 669,40234 60º HS 124,67354 60º HS 96,89741 60º HS 9,28688
70 736,67169 70º HS 123,94995 70º HS 82,18822 70º HS 6,93805
80 608,85443 80º HS 130,18561 80º HS 94,58639 80º HS 9,89922
Xilol Método Área _FID1A Xilol Método Área _FID1A Xilol Método Área _FID1A Xilol Método Área _FID1A
1000mg/L 40 1351,14221 100mg/L 40º HS 109,63641 50mg/L 40º HS 103,93574 10mg/L 40º HS 10,33803
50 1380,96484 50º HS 116,18526 50º HS 108,29437 50º HS 11,91711
60 528,35443 60º HS 89,37055 60º HS 88,07693 60º HS 9,19544
70 689,94153 70º HS 88,99673 70º HS 75,98064 70º HS 7,06659
80 612,04138 80º HS 93,70593 80º HS 86,57546 80º HS 9,839511
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
110
7.2 Linearidade
Tabela de cálculo para o estudo da linearidade das substâncias voláteis
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Acetaldeído
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
1 950 1000L 10
1 755 900L 10
1 462 750L 10
1 170 600 L 10
975 1000 L 10
731 750 L 10
488 500 L 10
288 250 L 10
98 100 L 10
50 50 L 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Acetato de Etilo
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 9 900 (mL)
1 980 1000 µL 101 782 900 µL 101 485 750 µL 101 188 600 µL 10990 1000 µL 10
742,5 750 µL 10495 500 µL 10
247,5 250 µL 1099 100 µL 10
49,5 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Acetona
Calibradores Solução Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 750 mg/L 9 875mg/L (mL)
1 975 1000 µL 101 778 900 µL 101 481 750 µL 101 185 600 µL 10988 1000 µL 10741 750 µL 10494 500 µL 10247 250 µL 1098 100 µL 1049 50 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
111
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Acetonitrilo
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
1 950 1000 µL 101 755 900 µL 101 462 750 µL 101 170 600 µL 10975 1000 µL 10731 750 µL 10488 500 µL 10288 250 µL 1098 100 µL 1050 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Butanol
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 20 250 10 125 (mL)
2 025 1000 µL 101 822,5 900 µL 101 518,8 750 µL 101 215 600 µL 101012,5 1000 µL 10759,4 750 µL 10506,2 500 µL 10253,1 250 µL 10101,2 100 µL 1050,6 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do 2-propanol
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 650 9 825 (mL)
1 965 1000 µL 101 768 900 µL 101 474 750 µL 101 179 600 µL 10982 1000 µL 10737 750 µL 10491 500 µL 10245 250 µL 1098 100 µL 1049 50 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
112
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Éter
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 964 9 982 (mL)
1 996,4 1000 µL 101 796,8 900 µL 101 497,3 750 µL 101 197,8 600 µL 10998,2 1000 µL 10748,6 750 µL 10499,1 500 µL 10249,5 250 µL 10109,8 110 µL 104,96 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Metanol
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 mg/L 9 900mg/L (mL)
1 980 1000L 10
1 782 900L 10
1 485 750L 10
1 180 600 L 10
990 1000 L 10
742 750 L 10
495 500 L 10
248 250 L 10
99 100 L 10
50 50 mL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do clorofórmio
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 14 700 1470 (mL)
999,6 680 µL 10
852,6 580 µL 10
646,8 440 µL 10
514,5 350 µL 10
382,2 260 µL 10
220,5 150 µL 10
102,9 70 µL 10
80,8 550 µL 10
61,7 500 µL 10
51,4 350 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
113
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do Tolueno
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 10 022 1 020 100,2 (mL)
1 020 1000 µL 10801,8 800 µL 10601,3 600 µL 10501,1 500 µL 10370,8 370 µL 10180,4 180 µL 10100,2 100 µL 1075,2 75 µL 1020,4 200 µL 1010,2 100 µL 10
1 100 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Linearidade do p-Xyleno
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final
(mg/L) 9 988 998 99,9 (mL)
998 1000 µL 10799 800 µL 10799 800 µL 10
599,3 600 µL 10499,4 500 µL 10374,5 375 µL 10179,8 180 µL 1099,9 100 µL 1074,9 75 µL 1019,96 200 µL 10
9,98 100 µL 10
1 100 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
114
Estudo da linearidade do acetaldeído
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
115
Estudo da linearidade do acetato de etilo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
116
Estudo da linearidade da acetona
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
117
Estudo da linearidade do acetonitrilo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
118
Estudo da linearidade do 1-butanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
119
Estudo da linearidade do 2-propanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
120
Estudo da linearidade do éter
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
121
Estudo da linearidade do metanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
122
Estudo da linearidade do clorofórmio
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
123
Estudo da linearidade do tolueno
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
124
Estudo da linearidade do p-xileno
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
125
7.3 Limites de deteção e quantificação
Tabela de cálculo para o estudo dos LOD e LOQ das substâncias voláteis
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Acetaldeído
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
165,8 170 µL 10107,2 110 µL 1087,8 90 µL 1073,1 75 µL 1058,5 60 µL 1048,8 50 µL 1034,1 35 µL 1024,4 25 µL 1014,6 15 µL 109,8 10 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Acetato de Etilo
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 9 900 (mL)
168,3 170 µL 10108,9 110 µL 1089,1 90 µL 1074,3 75 µL 1059,4 60 µL 1049,5 50 µL 1034,6 35 µL 1024,8 25 µL 1014,8 15 µL 109,9 10 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Acetona
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 750 mg/L 9 875mg/L (mL)
167,9 170 µL 10108,6 110 µL 1088,9 90 µL 1074,1 75 µL 1059,2 60 µL 1049,4 50 µL 1034,6 35 µL 1024,7 25 µL 1014,8 15 µL 109,9 10 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
126
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Acetonitrilo
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
146,2 150 µL 10131,6 135 µL 10117 120 µL 10
102,4 105 µL 1087,8 90 µL 1073,1 75 µL 1058,5 60 µL 1034,1 35 µL 1024,4 25 µL 1019,5 20 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Butanol
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 20 250 10 125 (mL)
202,5 200 µL 10172,1 170 µL 10111,4 110 µL 1091,1 90 µL 1075,9 75 µL 1060,8 60 µL 1050,6 50 µL 1035,4 35 µL 1025,3 25 µL 1015,2 15 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do 2-propanol
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 650 9 825 (mL)
196,5 200 µL 10167 170 µL 10
108,1 110 µL 1088,4 90 µL 1073,7 75 µL 1058,9 60 µL 1049,1 50 µL 1034,4 35 µL 1024,6 25 µL 1014,7 15 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
127
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Éter
Calibradores Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 9 982 (mL)
169,7 170 µL 10109,8 110 µL 1089,8 90 µL 1074,9 75 µL 1059,9 60 µL 1049,6 50 µL 1035 35 µL 1025 25 µL 1015 15 µL 1010 10 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do Metanol
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 9 900 (mL)
168,3 170 µL 10148,5 150 µL 10133,6 135 µL 10104 105 µL 1088,9 90 µL 1074,1 75 µL 1059,2 60 µL 1049,4 50 µL 1024,7 25 µL 1019,8 20 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Limites do clorofórmio
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 14 700 1470 (mL)
220,5 150 µL 10205,8 140 µL 10147 100 µL 10
102,9 700 µL 1091,1 620 µL 1080,8 550 µL 1061,7 500 µL 1051,4 350 µL 1039,7 270 µL 1025,7 175 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
128
Preparação da curva de calibração referente ao estudo dos Limites do Tolueno
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 10 022 1 020 100,2 (mL)
30,6 300µL 1020,4 200µL 1010,2 100µL 105,5 550µL 104,5 450µL 103,5 350µL 101,5 150µL 101 100µL 10
0,9 90µL 100,8 80µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo dos Limites do p-Xyleno
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 9 988 998 99,9 (mL)
29,9 300µL 1020 200µL 1010 100µL 105,5 550µL 104,5 450µL 103,5 350µL 101,5 150µL 101 100µL 10
0,9 90µL 100,7 70µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
129
Estudo dos LOD e LOQ do acetaldeído
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
130
Estudo dos LOD e LOQ do acetato de etilo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
131
Estudo dos LOD e LOQ da acetona
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
132
Estudo dos LOD e LOQ do acetonitrilo
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
133
Estudo dos LOD e LOQ do 1-butanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
134
Estudo dos LOD e LOQ do 2-propanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
135
Estudo dos LOD e LOQ do éter
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
136
Estudo dos LOD e LOQ do metanol
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
137
Estudo dos LOD e LOQ do clorofórmio
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
138
Estudo dos LOD e LOQ do tolueno
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
139
Estudo dos LOD e LOQ do p-xileno
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
140
7.4 Repetibilidade do equipamento
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
1,942 4,688 0,414 83 180 0,460 3,618 4,688 0,772 32 180 0,178
1,942 4,69 0,414 83 175 0,473 3,619 4,69 0,772 31 175 0,177
1,942 4,69 0,414 83 179 0,462 3,619 4,69 0,772 32 179 0,177
1,942 4,689 0,414 83 179 0,463 3,618 4,689 0,772 32 179 0,177
1,943 4,692 0,414 82 174 0,471 3,62 4,692 0,772 31 174 0,179
Média 0,414 Média 0,466 Média 0,772 Média 0,178
0,000 0,006 0,000 0,001
CV (%) 0,0 CV (%) 1,3 CV (%) 0,0 CV (%) 0,6
1,942 4,692 0,414 480 179 2,687 3,617 4,692 0,771 197 179 1,100
1,945 4,696 0,414 488 184 2,656 3,621 4,696 0,771 202 184 1,100
1,947 4,694 0,415 491 179 2,739 3,62 4,694 0,771 198 179 1,103
1,944 4,695 0,414 490 178 2,754 3,62 4,695 0,771 197 178 1,106
1,944 4,696 0,414 496 183 2,710 3,62 4,696 0,771 202 183 1,103
Média 0,414 Média 2,709 Média 0,771 Média 1,102
0,000 0,040 0,000 0,003
CV (%) 0,1 CV (%) 1,5 CV (%) 0,0 CV (%) 0,2
ACETATO DE ETILO 1-BUTANOL
Repetib_TRR Repetib_Áreas Repetib_TRR Repetib_Áreas
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
250 mg/L 4,898 4,688 1,045 173 180 0,958 250 mg/L 8,011 4,688 1,709 62 180 0,342
4,899 4,69 1,045 174 175 0,994 8,012 4,69 1,708 59 175 0,337
4,898 4,69 1,044 172 179 0,964 8,012 4,69 1,708 60 179 0,335
4,899 4,689 1,045 174 179 0,970 8,011 4,689 1,708 60 179 0,336
4,901 4,692 1,045 170 174 0,975 8,013 4,692 1,708 59 174 0,341
Média 1,045 Média 0,972 Média 1,708 Média 0,338
Desv. pad. (s) 0,000 esv. pad. (s) 0,014 Desv. pad. (s) 0,000 0,003
CV (%) 0,0 CV (%) 1,4 CV (%) 0,0 CV (%) 0,9
1500 mg/L 4,901 4,692 1,045 1048 179 5,866 1500 mg/L 8,012 4,692 1,708 383 179 2,142
4,906 4,696 1,045 1059 184 5,767 8,015 4,696 1,707 393 184 2,143
4,904 4,694 1,045 1076 179 6,001 8,012 4,694 1,707 388 179 2,163
4,905 4,695 1,045 1077 178 6,051 8,014 4,695 1,707 385 178 2,164
4,905 4,696 1,045 1086 183 5,934 8,013 4,696 1,706 396 183 2,163
Média 1,045 Média 5,924 Média 1,707 Média 2,155
Desv. pad. (s) 0,000 0,112 Desv. pad. (s) 0,000 0,011
CV (%) 0,0 CV (%) 1,9 CV (%) 0,0 CV (%) 0,5
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
2,96 4,688 0,631 69 180 0,384 3,15 4,688 0,672 41 180 0,228
2,961 4,69 0,631 68 175 0,390 3,151 4,69 0,672 40 175 0,227
2,96 4,69 0,631 69 179 0,386 3,151 4,69 0,672 40 179 0,226
2,96 4,689 0,631 69 179 0,386 3,151 4,689 0,672 41 179 0,227
2,962 4,692 0,631 68 174 0,392 3,153 4,692 0,672 40 174 0,231
Média 0,631 Média 0,388 Média 0,672 Média 0,228
0,000 0,003 0,000 0,002
CV (%) 0,0 CV (%) 0,8 CV (%) 0,0 CV (%) 0,8
2,96 4,692 0,631 419 179 2,343 3,151 4,692 0,672 248 179 1,388
2,963 4,696 0,631 427 184 2,327 3,154 4,696 0,672 254 184 1,385
2,963 4,694 0,631 427 179 2,378 3,154 4,694 0,672 251 179 1,398
2,962 4,695 0,631 425 178 2,391 3,154 4,695 0,672 250 178 1,404
2,962 4,696 0,631 433 183 2,364 3,154 4,696 0,672 257 183 1,403
Média 0,631 Média 2,361 Média 0,672 Média 1,395
0,000 0,026 0,000 0,009
CV (%) 0,0 CV (%) 1,1 CV (%) 0,0 CV (%) 0,6
250 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
2-PROPANOL
Repetib_TRR Repetib_Áreas
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
ACETONITRILO
Repetib_TRR Repetib_Áreas
250 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s)
Repetib_TRR Repetib_Áreas
250 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
ACETONA
ACETALDEÍDO
Repetib_TRR Repetib_Áreas
250 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
141
TOLUENO
Repetib_TRR Repetib_Áreas
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
2,337 4,688 0,499 396 180 2,200 100 mg/L 9,254 4,645 1,992 354 186 1,906
2,338 4,69 0,499 410 175 2,339 9,251 4,64 1,994 340 181 1,877
2,337 4,69 0,498 401 179 2,239 9,255 4,649 1,991 313 185 1,696
2,337 4,689 0,498 403 179 2,248 9,255 4,646 1,992 327 188 1,738
2,339 4,692 0,499 400 174 2,293 9,253 4,647 1,991 312 189 1,650
Média 0,498 Média 2,264 Média 1,992 Média 1,773
0,000 0,053 Desv. pad. (s) 0,001 0,112
CV (%) 0,0 CV (%) 2,4 CV (%) 0,1 CV (%) 6,3
2,337 4,692 0,498 2638 179 14,761 800 mg/L 9,258 4,641 1,995 3025 192 15,724
2,34 4,696 0,498 2641 184 14,384 9,258 4,643 1,994 2750 190 14,480
2,341 4,694 0,499 2705 179 15,084 9,262 4,649 1,992 2755 189 14,549
2,339 4,695 0,498 2730 178 15,345 9,261 4,648 1,992 2702 195 13,887
2,339 4,696 0,498 2719 183 14,861 9,259 4,642 1,995 2952 192 15,391
Média 0,498 Média 14,887 Média 1,994 Média 14,806
0,000 0,360 Desv. pad. (s) 0,001 0,742
CV (%) 0,1 CV (%) 2,4 CV (%) 0,1 CV (%) 5,0
p-XYLENO
Repetib_TRR Repetib_Áreas
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
2,115 4,688 0,451 13 180 0,072 100 ng/mL 11,98 4,645 2,579 361 186 1,944
2,116 4,69 0,451 12 175 0,070 11,98 4,64 2,582 346 181 1,909
2,116 4,69 0,451 13 179 0,072 11,981 4,649 2,577 319 185 1,726
2,115 4,689 0,451 13 179 0,071 11,98 4,646 2,579 333 188 1,767
2,117 4,692 0,451 13 174 0,073 11,979 4,647 2,578 318 189 1,680
Média 0,451 Média 0,072 Média 2,579 Média 1,805
0,000 0,001 Desv. pad. (s) 0,002 0,116
CV (%) 0,0 CV (%) 1,3 CV (%) 0,1 CV (%) 6,4
2,116 4,692 0,451 76 179 0,426 800 mg/L 11,986 4,641 2,583 3155 192 16,399
2,117 4,696 0,451 79 184 0,428 11,986 4,643 2,582 2870 190 15,113
2,118 4,694 0,451 75 179 0,420 11,987 4,649 2,578 2870 189 15,157
2,117 4,695 0,451 75 178 0,420 11,987 4,648 2,579 2813 195 14,458
2,118 4,696 0,451 78 183 0,426 11,986 4,642 2,582 3070 192 16,005
Média 0,451 Média 0,424 Média 2,581 Média 15,426
0,000 0,004 Desv. pad. (s) 0,002 0,773
CV (%) 0,0 CV (%) 0,9 CV (%) 0,1 CV (%) 5,0
CLOROFÓRMIO
Repetib_TRR Repetib_Áreas
TR (min) TR pi (min) TRR Área Área pi A/Api
100 mg/L 5,564 4,651 1,196 27 189 0,142
5,564 4,651 1,196 29 194 0,147
5,564 4,65 1,197 28 192 0,145
5,563 4,649 1,197 28 197 0,141
5,563 4,648 1,197 26 198 0,132
Média 1,197 Média 0,142
Desv. pad. (s) 0,000 0,006
CV (%) 0,0 CV (%) 4,1
750 mg/L 5,563 4,648 1,197 210 193 1,090
5,564 4,65 1,197 236 195 1,207
5,564 4,650 1,197 232 197 1,180
5,564 4,65 1,197 227 196 1,159
5,564 4,649 1,197 235 193 1,219
Média 1,197 Média 1,171
Desv. pad. (s) 0,000 0,051
CV (%) 0,0 CV (%) 4,3
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
Desv. pad. (s)
250 ng/mL
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
1500 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
METANOL
Repetib_TRR Repetib_Áreas
ÉTER
Repetib_TRR Repetib_Áreas
250 mg/L
Desv. pad. (s) Desv. pad. (s)
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
142
7.5 Precisão intermédia
Tabela de cálculo para o estudo da precisão intermédia das substâncias voláteis
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Acetaldeído
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
1 950 1000 µL 101 462 750 µL 10975 1000 µL 10488 500 µL 1050 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Acetato de Etilo
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 9 900 (mL)
1 980 1000 µL 101 485 750 µL 10990 1000 µL 10495 500 µL 1049,5 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia da Acetona
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 750 mg/L 9 875mg/L (mL)
1 975 1000 µL 101 481 750 µL 10988 1000 µL 10494 500 µL 1049 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Acetonitrilo
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 500 mg/L 9 750mg/L (mL)
1 950 1000 µL 101 462 750 µL 10975 1000 µL 10488 500 µL 1050 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Butanol
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 20 250 10 125 (mL)
2 025 1000 µL 101 518,8 750 µL 101012,5 1000 µL 10506,2 500 µL 1050,6 50 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
143
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do 2-propanol
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 650 9 825 (mL)
1 965 1000 µL 101 474 750 µL 10982 1000 µL 10491 500 µL 1049 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Éter
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 964 9 982 (mL)
1 996,4 1000 µL 101 497,3 750 µL 10998,2 1000 µL 10499,1 500 µL 104,96 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do Metanol
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 19 800 mg/L 9 900mg/L (mL)
1 980 1000 µL 101 485 750 µL 10990 1000 µL 10495 500 µL 1050 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão Intermédia do Clorofórmio
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 14 700 1 470 (mL)
999,6 680 µL 10749,7 510 µL 10499,8 340 µL 10249,9 170 µL 1051,4 350 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
144
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão Intermédia do Tolueno
Calibradores Solução Trabalho Solução Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 10 022 1 020 (mL)
1020 1000 µL 10751,6 750 µL 10501,1 500 µL 10250,5 250 µL 105,1 50 µL 10
Preparação da curva de calibração referente ao estudo da Precisão intermédia do p-xyleno
Calibradores Sol. Trabalho Sol. Trabalho Volume da solução Final(mg/L) 9 988 998 (mL)
998 1000 µL 10749,1 750 µL 10499,4 500 µL 10249,7 250 µL 104,99 50 µL 10
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
145
Estudo da precisão intermédia do acetaldeído e acetato de etilo
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9991 0,9997 0,9995 0,9986 0,9994
Declive 0,0021 0,0021 0,0021 0,0021 0,0020
Y0 -0,051 -0,040 -0,040 -0,054 -0,053
Replicado 1 260,6 244,5 240,0 240,2 256,4
Replicado 2 249,0 248,7 241,9 247,8 263,0
Replicado 3 257,9 243,6 236,9 243,1 257,4
Média 255,9 245,6 239,6 243,7 258,9
Recuperação 104,9 100,7 98,2 99,9 106,1
Concenc. Média 248,7
Recuperação Média 101,9
Repetibilidade (Sr) 4,0
Between Run (Srun) 7,7
Prec isão intermédia 8,7
C.V (%) 3,3
Replicado 1 1379,9 1349,2 1302,1 1306,2 1370,2
Replicado 2 1378,9 1313,7 1306,7 1306,2 1354,6
Replicado 3 1345,6 1319,8 1291,9 1291,7 1396,1
Média 1368,1 1327,6 1300,2 1301,4 1373,6
Recuperação 93,6 90,8 88,9 89,0 94,0
Concenc. Média 1334,2
Recuperação Média 91,3
Repetibilidade (Sr) 16,2
Between Run (Srun) 33,8
Prec isão intermédia 37,5
C.V (%) 2,6
C.Vpool 4,5
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9991 0,9998 0,9992 0,9992 0,9994
Declive 0,0043 0,0044 0,0042 0,0043 0,0042
Y0 -0,118 -0,082 -0,094 -0,076 -0,117
Replicado 1 269,9 245,3 255,3 235,4 256,1
Replicado 2 260,4 249,7 257,3 245,7 264,7
Replicado 3 262,4 242,7 249,9 239,9 257,4
Média 264,2 245,9 254,2 240,3 259,4
Recuperação 106,5 99,2 102,5 96,9 104,6
Concenc. Média 252,8
Recuperação Média 101,9
Repetibilidade (Sr) 4,5
Between Run (Srun) 9,4
Prec isão intermédia 10,4
C.V (%) 3,9
Replicado 1 1489,6 1422,5 1430,8 1390,7 1424,6
Replicado 2 1482,8 1375,0 1436,5 1352,8 1400,9
Replicado 3 1445,1 1387,3 1418,1 1422,7 1456,7
Média 1472,5 1395,0 1428,5 1388,7 1427,4
Recuperação 99,2 93,9 96,2 93,5 96,1
Concenc. Média 1422,4
Recuperação Média 95,8
Repetibilidade (Sr) 25,6
Between Run (Srun) 29,9
Prec isão intermédia 39,4
C.V (%) 2,3
C.Vpool 4,7
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
146
Estudo da precisão intermédia da acetona e do acetonitrilo
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9995 0,9997 0,9995 0,9997 0,9995
Declive 0,0018 0,0018 0,0017 0,0017 0,0017
Y0 -0,036 -0,031 -0,032 -0,023 -0,039
Replicado 1 246,6 236,1 245,4 236,1 248,7
Replicado 2 239,9 238,5 247,5 240,9 252,1
Replicado 3 245,5 235,3 244,4 238,6 249,5
Média 244,0 236,6 245,8 238,5 250,1
Recuperação 98,8 95,8 99,5 96,6 101,2
Concenc. Média 243,0
Recuperação Média 98,4
Repetibilidade (Sr) 2,3
Between Run (Srun) 5,3
Prec isão intermédia 5,8
C.V (%) 2,3
Replicado 1 1379,9 1360,9 1397,5 1395,3 1400,6
Replicado 2 1389,4 1333,8 1399,9 1357,6 1391,5
Replicado 3 1357,8 1335,2 1392,1 1431,0 1421,6
Média 1375,7 1343,3 1396,5 1394,6 1404,6
Recuperação 92,9 90,7 94,3 94,2 94,8
Concenc. Média 1383,0
Recuperação Média 93,4
Repetibilidade (Sr) 20,5
Between Run (Srun) 21,5
Prec isão intermédia 29,7
C.V (%) 1,8
C.Vpool 3,2
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9996 0,9996 0,9993 0,9982 0,9996
Declive 0,0008 0,0008 0,0008 0,0008 0,0008
Y0 -0,016 -0,018 -0,021 -0,022 -0,018
Replicado 1 249,3 248,4 247,9 235,5 245,3
Replicado 2 247,0 248,5 248,5 237,5 243,6
Replicado 3 250,8 248,4 247,2 238,8 243,8
Média 249,1 248,4 247,8 237,3 244,2
Recuperação 102,1 101,8 101,6 97,2 100,1
Concenc. Média 245,4
Recuperação Média 100,6
Repetibilidade (Sr) 1,2
Between Run (Srun) 4,8
Prec isão intermédia 5,0
C.V (%) 2,0
Replicado 1 1415,8 1423,6 1398,7 1415,0 1397,3
Replicado 2 1437,4 1418,3 1399,0 1369,6 1397,9
Replicado 3 1394,5 1404,4 1395,9 1394,1 1400,6
Média 1415,9 1415,5 1397,9 1392,9 1398,6
Recuperação 96,8 96,8 95,6 95,3 95,7
Concenc. Média 1404,1
Recuperação Média 96,0
Repetibilidade (Sr) 14,7
Between Run (Srun) 6,6
Prec isão intermédia 16,1
C.V (%) 0,8
C.Vpool 2,6
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
147
Estudo da precisão intermédia do 1-butanol e do 2-propanol
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9995 0,9996 0,9994 0,9996 0,9995
Declive 0,0015 0,0015 0,0014 0,0015 0,0014
Y0 -0,042 -0,041 -0,045 -0,033 -0,045
Replicado 1 265,0 264,0 276,6 249,8 276,2
Replicado 2 254,2 257,9 273,4 246,1 272,8
Replicado 3 258,8 256,7 273,7 243,8 271,2
Média 259,4 259,5 274,6 246,6 273,4
Recuperação 102,5 102,6 108,5 97,5 108,1
Concenc. Média 262,7
Recuperação Média 103,8
Repetibilidade (Sr) 3,5
Between Run (Srun) 11,4
Prec isão intermédia 11,9
C.V (%) 4,4
Replicado 1 1487,4 1497,0 1566,2 1459,3 1561,8
Replicado 2 1506,5 1480,7 1577,5 1410,6 1562,3
Replicado 3 1480,0 1482,9 1578,7 1490,4 1576,7
Média 1491,3 1486,9 1574,1 1453,4 1567,0
Recuperação 98,2 97,9 103,6 95,7 103,2
Concenc. Média 1514,5
Recuperação Média 99,7
Repetibilidade (Sr) 20,0
Between Run (Srun) 52,0
Prec isão intermédia 55,7
C.V (%) 3,5
C.Vpool 5,8
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9996 0,9997 0,9995 0,9997 0,9996
Declive 0,0010 0,0010 0,0010 0,0010 0,0010
Y0 -0,020 -0,020 -0,022 -0,012 -0,021
Replicado 1 256,3 252,0 250,0 239,4 249,1
Replicado 2 251,5 251,2 248,8 239,2 247,7
Replicado 3 256,0 250,7 247,1 238,8 246,9
Média 254,6 251,3 248,6 239,1 247,9
Recuperação 103,5 102,2 101,1 97,2 100,8
Concenc. Média 248,3
Recuperação Média 100,9
Repetibilidade (Sr) 1,5
Between Run (Srun) 5,7
Prec isão intermédia 5,9
C.V (%) 2,3
Replicado 1 1435,6 1434,7 1411,1 1408,2 1408,5
Replicado 2 1456,4 1423,4 1412,7 1369,9 1405,9
Replicado 3 1434,8 1419,1 1412,2 1444,5 1418,5
Média 1442,3 1425,7 1412,0 1407,5 1411,0
Recuperação 97,8 96,7 95,8 95,5 95,7
Concenc. Média 1419,7
Recuperação Média 96,3
Repetibilidade (Sr) 18,2
Between Run (Srun) 9,9
Prec isão intermédia 20,7
C.V (%) 1,0
C.Vpool 2,9
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
148
Estudo da precisão intermédia do éter e do metanol
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9973 0,9989 0,9962 0,9973 0,9983
Declive 0,0111 0,0113 0,0108 0,0112 0,0109
Y0 -0,572 -0,464 -0,592 -0,503 -0,543
Replicado 1 287,6 249,9 273,2 238,3 251,7
Replicado 2 271,2 255,6 272,9 253,1 264,4
Replicado 3 267,1 247,0 265,8 245,8 255,3
Média 275,3 250,8 270,7 245,7 257,1
Recuperação 110,1 100,3 108,3 98,3 102,9
Concenc. Média 259,9
Recuperação Média 104,0
Repetibilidade (Sr) 7,1
Between Run (Srun) 12,0
Prec isão intermédia 14,0
C.V (%) 4,9
Replicado 1 1537,7 1487,9 1482,1 1407,5 1404,1
Replicado 2 1506,3 1408,2 1484,5 1369,3 1369,5
Replicado 3 1472,1 1430,8 1458,9 1415,8 1433,7
Média 1505,4 1442,3 1475,2 1397,5 1402,4
Recuperação 100,5 96,3 98,5 93,3 93,6
Concenc. Média 1444,6
Recuperação Média 96,4
Repetibilidade (Sr) 30,4
Between Run (Srun) 43,0
Prec isão intermédia 52,6
C.V (%) 3,2
C.Vpool 6,0
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
R20,9989 0,9988 0,9987 0,9987 0,9995
Declive 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003
Y0 -0,003 -0,006 -0,009 -0,003 -0,005
Replicado 1 246,9 259,5 266,6 252,9 256,6
Replicado 2 250,9 255,2 268,0 246,1 249,8
Replicado 3 251,9 260,6 266,4 248,7 254,6
Média 249,9 258,4 267,0 249,2 253,6
Recuperação 100,8 104,2 107,7 100,5 528,4
Concenc. Média 255,6
Recuperação Média 103,1
Repetibilidade (Sr) 2,8
Between Run (Srun) 7,1
Prec isão intermédia 7,7
C.V (%) 2,9
Replicado 1 1382,3 1435,2 1457,8 1446,5 1437,3
Replicado 2 1424,6 1458,0 1449,9 1416,4 1441,9
Replicado 3 1386,3 1444,9 1447,0 1475,6 1415,6
Média 1397,7 1446,0 1451,6 1446,2 1431,6
Recuperação 94,1 97,4 97,7 97,4 96,4
Concenc. Média 1434,6
Recuperação Média 96,6
Repetibilidade (Sr) 18,9
Between Run (Srun) 19,0
Prec isão intermédia 26,8
C.V (%) 1,5
C.Vpool 3,5
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
149
Estudo da precisão intermédia do tolueno e do p-xileno
Data 1º DIA () 2º DIA () 3º DIA () 5º DIA () 7º DIA ()
R20,9966 0,9979 0,9994 0,9952 0,993
Declive 0,0177 0,0191 0,0183 0,0190 0,0194
Y0 0,040 -0,291 -0,228 -0,521 -0,261
Replicado 1 97,9 106,1 110,6 114,1 111,7
Replicado 2 99,1 105,0 106,8 115,1 110,2
Replicado 3 87,8 100,3 109,4 115,2 100,9
Média 94,9 103,8 108,9 114,8 107,6
Recuperação 94,9 103,8 108,9 114,8 107,6
Concenc. Média 106,0
Recuperação Média 106,0
Repetibilidade (Sr) 4,9
Between Run (Srun) 5,8
Prec isão intermédia 7,6
C.V (%) 6,9
Replicado 1 789,2 787,1 869,7 803,0 823,9
Replicado 2 773,7 717,6 791,5 737,2 765,7
Replicado 3 683,5 737,5 794,7 812,8 763,4
Média 748,8 747,4 818,6 784,3 784,3
Recuperação 93,4 93,2 102,1 97,8 97,8
Concenc. Média 776,7
Recuperação Média 96,8
Repetibilidade (Sr) 37,8
Between Run (Srun) 9,1
Prec isão intermédia 38,9
C.V (%) 3,8
C.Vpool 8,0
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Alta 800 mg/L
Data 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA 7º DIA
R20,9966 0,9988 0,9924 0,9943 0,9905
Declive 0,0207 0,0198 0,0191 0,0200 0,0203
Y0 -0,294 -0,225 -0,068 -0,527 -0,335
Replicado 1 104,0 108,4 97,0 114,6 112,2
Replicado 2 102,9 104,6 104,6 115,8 110,5
Replicado 3 98,0 107,2 84,9 115,5 101,5
Média 101,6 106,7 95,5 115,3 108,1
Recuperação 101,6 106,7 95,5 115,3 108,1
Concenc. Média 105,4
Recuperação Média 105,4
Repetibilidade (Sr) 7,1
Between Run (Srun) 4,8
Prec isão intermédia 8,6
C.V (%) 7,0
Replicado 1 768,4 851,0 743,2 808,2 824,3
Replicado 2 700,3 773,4 762,1 743,3 766,8
Replicado 3 719,8 776,8 656,3 731,3 763,1
Média 729,5 800,4 720,6 761,0 784,8
Recuperação 91,3 100,2 90,2 95,2 98,2
Concenc. Média 759,2
Recuperação Média 95,0
Repetibilidade (Sr) 34,3
Between Run (Srun) 15,0
Prec isão intermédia 37,4
C.V (%) 4,5
C.Vpool 8,5
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Alta 800 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
150
Estudo da precisão intermédia do clorofórmio
Data 1º DIA () 2º DIA () 3º DIA () 4º DIA () 5º DIA ()
R20,9986 0,9988 0,9989 0,998 0,9995
Declive 0,0017 0,0019 0,0018 0,0017 0,0019
Y0 -0,023 -0,048 -0,019 -0,007 -0,025
Replicado 1 97,1 108,2 97,1 91,3 93,9
Replicado 2 100,0 103,4 96,3 96,3 93,0
Replicado 3 98,9 101,5 91,4 95,4 85,2
Média 98,7 104,3 94,9 94,3 90,7
Recuperação 98,7 104,3 94,9 94,3 90,7
Concenc. Média 96,6
Recuperação Média 96,6
Repetibilidade (Sr) 3,0
Between Run (Srun) 3,8
Prec isão intermédia 4,9
C.V (%) 5,4
Replicado 1 695,2 731,0 745,3 783,0 655,7
Replicado 2 723,6 738,8 734,0 741,0 654,0
Replicado 3 707,5 702,8 697,1 730,4 675,5
Média 708,8 724,2 725,5 751,5 661,7
Recuperação 94,5 96,6 96,7 100,2 88,2
Concenc. Média 714,3
Recuperação Média 95,2
Repetibilidade (Sr) 18,7
Between Run (Srun) 19,1
Prec isão intermédia 26,7
C.V (%) 4,6
C.Vpool 7,2
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Alta 750 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
151
7.6 Exatidão
Estudo da exatidão do acetaldeído e do acetato de etilo
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0021x - 0.0505 y = 0.0021x - 0.040 y = 0.0021x - 0.0398 y = 0.0021x - 0.0541 y = 0.0021x - 0.0053
Média 256,4 245,8 240,0 243,7 223,8
Recuperação 105,1 100,7 98,3 99,9 91,7
Média 99,2
Desvio padrão 4,85
C.V (%) 4,9
N 5
Texp 0,39
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,2
Incerteza padrão rel. 0,022
Média 1368,1 1327,8 1300,2 1305,7 1285,4
Recuperação 93,6 90,8 88,9 89,3 87,9
Concenc. Média 90,1
Desvio padrão 2,20
C.V (%) 2,4
N 5
Texp 10,05
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,0
Incerteza padrão rel. 0,010
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0043x - 0.118 y = 0.0044x - 0.082 y = 0.0042x - 0.094 y = 0.0043x - 0.076 y = 0.0042x - 0.117
Média 264,1 245,9 254,2 240,3 259,3
Recuperação 106,5 99,2 102,5 96,9 104,6
Média 101,9
Desvio padrão 3,91
C.V (%) 3,8
N 5
Texp 1,10
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,7
Incerteza padrão rel. 0,017
Média 1472,4 1395,0 1464,2 1388,7 1427,4
Recuperação 99,2 93,9 98,6 93,5 96,1
Concenc. Média 96,3
Desvio padrão 2,59
C.V (%) 2,7
N 5
Texp 3,23
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,2
Incerteza padrão rel. 0,012
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
152
Estudo da exatidão da acetona e do acetonitrilo
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0018x - 0.036 y = 0.0018x - 0.031 y = 0.0017x - 0.032 y = 0.0017x - 0.0223 y = 0.0017x - 0.0385
Média 240,5 236,6 245,8 238,1 250,1
Recuperação 97,4 95,8 99,5 96,4 101,2
Média 98,1
Desvio padrão 2,27
C.V (%) 2,3
N 5
Texp 1,91
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,0
Incerteza padrão rel. 0,010
Média 1375,7 1343,3 1422,9 1394,2 1404,6
Recuperação 92,9 90,7 96,1 94,1 94,8
Concenc. Média 93,7
Desvio padrão 2,05
C.V (%) 2,2
N 5
Texp 6,84
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 0,9
Incerteza padrão rel. 0,009
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0008x - 0.016 y = 0.0008x - 0.018 y = 0.0008x - 0.021 y = 0.0008x - 0.02 y = 0.0008x - 0.018
Média 249,4 248,4 247,8 234,8 235,2
Recuperação 102,2 101,8 101,6 96,2 96,4
Média 99,6
Desvio padrão 3,06
C.V (%) 3,1
N 5
Texp 0,26
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,4
Incerteza padrão rel. 0,014
Média 1416,3 1415,5 1419,2 1390,4 1389,6
Recuperação 96,9 96,8 97,1 95,1 95,0
Concenc. Média 96,2
Desvio padrão 1,02
C.V (%) 1,1
N 5
Texp 8,41
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 0,5
Incerteza padrão rel. 0,005
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
153
Estudo da exatidão do 1-butanol e do 2-propanol
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0015x - 0.042 y = 0.0015x - 0.041 y = 0.0014x - 0.045 y = 0.0015x - 0.033 y = 0.0014x - 0.045
Média 259,4 259,4 274,5 246,7 273,7
Recuperação 102,5 102,5 108,5 97,5 108,2
Média 103,8
Desvio padrão 4,58
C.V (%) 4,4
N 5
Texp 1,88
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,0
Incerteza padrão rel. 0,020
Média 1491,3 1486,8 1595,8 1453,6 1567,2
Recuperação 98,2 97,9 105,1 95,7 103,2
Concenc. Média 100,0
Desvio padrão 3,94
C.V (%) 3,9
N 5
Texp 0,00
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,8
Incerteza padrão rel. 0,018
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.001x - 0.0196 y = 0.001x - 0.0196 y = 0.001x - 0.0217 y = 0.001x - 0.0122 y = 0.001x - 0.0208
Média 254,6 251,3 248,6 239,1 247,9
Recuperação 103,5 102,2 101,1 97,2 100,8
Média 100,9
Desvio padrão 2,34
C.V (%) 2,3
N 5
Texp 0,90
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,0
Incerteza padrão rel. 0,010
Média 1442,3 1425,7 1427,8 1407,5 1411,0
Recuperação 97,8 96,7 96,9 95,5 95,7
Concenc. Média 96,5
Desvio padrão 0,95
C.V (%) 1,0
N 5
Texp 8,15
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 0,4
Incerteza padrão rel. 0,004
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
154
Estudo da exatidão do éter e do metanol
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0111x - 0.572 y = 0.0113x - 0.464 y = 0.0108x - 0.592 y = 0.0112x - 0.503 y = 0.0109x - 0.543
Média 275,3 250,9 270,7 257,4 257,1
Recuperação 110,1 100,3 108,3 102,9 102,8
Média 104,9
Desvio padrão 4,11
C.V (%) 3,9
N 5
Texp 2,67
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,8
Incerteza padrão rel. 0,018
Média 1519,1 1442,3 1476,0 1397,5 1402,4
Recuperação 101,4 96,3 98,5 93,3 93,6
Concenc. Média 96,6
Desvio padrão 3,42
C.V (%) 3,5
N 5
Texp 2,21
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,5
Incerteza padrão rel. 0,015
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
Data 1º DIA (22/05/112) 2º DIA (23/05/12) 3º DIA (24/05/12) 4º DIA (25/05/12) 5º DIA (26/05/12)
Equação y = 0.0003x - 0.003 y = 0.0003x - 0.006 y = 0.0003x - 0.009 y = 0.0003x - 0.003 y = 0.0003x - 0.005
Média 249,2 258,8 267,7 249,2 254,3
Recuperação 100,5 104,3 107,9 100,5 102,5
Média 103,2
Desvio padrão 3,11
C.V (%) 3,0
N 5
Texp 2,27
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,4
Incerteza padrão rel. 0,013
Média 1397,1 1446,4 1452,2 1446,2 1432,3
Recuperação 94,1 97,4 97,8 97,4 96,4
Concenc. Média 96,6
Desvio padrão 1,50
C.V (%) 1,6
N 5
Texp 5,02
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 0,7
Incerteza padrão rel. 0,007
Gama Baixa 250 mg/L
Gama Média/Alta 1500 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
155
Estudo da exatidão do tolueno e do p-xileno
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0177x + 0.040 y = 0.0191x - 0.2908 y = 0.0183x - 0.2278 y = 0.0190x - 0.521 y = 0.0194x - 0.2607
Média 94,9 103,8 108,9 114,8 107,6
Recuperação 94,9 103,8 108,9 114,8 107,6
Média 106,0
Desvio padrão 7,35
C.V (%) 6,9
N 5
Texp 1,83
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 3,3
Incerteza padrão rel. 0,031
Média 748,8 747,4 776,6 784,4 784,3
Recuperação 93,4 93,2 96,8 97,8 97,8
Concenc. Média 95,8
Desvio padrão 2,34
C.V (%) 2,4
N 5
Texp 4,02
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 1,0
Incerteza padrão rel. 0,010
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Média/Alta 800 mg/L
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0207x - 0.2943 y = 0.0198x - 0.2251 y = 0.0191x - 0.068 y = 0.0200x - 0.527 y = 0.0203x - 0.3347
Média 101,6 106,7 99,7 115,3 108,1
Recuperação 101,6 106,7 99,7 115,3 108,1
Média 106,3
Desvio padrão 6,14
C.V (%) 5,8
N 5
Texp 2,29
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,7
Incerteza padrão rel. 0,026
Média 729,5 800,4 821,5 761,0 784,8
Recuperação 91,3 100,2 102,8 95,2 98,2
Concenc. Média 97,6
Desvio padrão 4,46
C.V (%) 4,6
N 5
Texp 1,23
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,0
Incerteza padrão rel. 0,020
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Média/Alta 800 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
156
Estudo da exatidão do clorofórmio
Data 1º DIA 2º DIA 3º DIA 4º DIA 5º DIA
Equação y = 0.0017x - 0.023 y = 0.0019x - 0.0477 y = 0.0018x - 0.019 y = 0.0017x - 0.0072 y = 0.019x - 0.0254
Média 98,8 104,3 95,2 94,3 90,7
Recuperação 98,8 104,3 95,2 94,3 90,7
Média 96,7
Desvio padrão 5,18
C.V (%) 5,4
N 5
Texp 1,44
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,3
Incerteza padrão rel. 0,024
Média 708,9 724,2 748,5 751,5 661,7
Recuperação 94,5 96,6 99,8 100,2 88,2
Concenc. Média 95,9
Desvio padrão 4,87
C.V (%) 5,1
N 5
Texp 1,90
Tcrit 2,78
Incerteza de R% 2,2
Incerteza padrão rel. 0,022
Gama Baixa 100 mg/L
Gama Média/Alta 750 mg/L
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
157
7.7 Teste ao limite de quantificação
LQ teste LQ teste
sangue Urina H vítreo sangue Urina H vítreo
25 mg/L 25 mg/L
22,32 21,31 24,40 25,05 24,91 24,66
23,19 22,31 25,45 26,25 26,11 25,19
24,94 22,42 24,50 28,17 25,87 24,69
22,70 23,08 24,82 25,97 26,68 25,02
22,28 22,04 24,67 25,25 25,98 24,83
Média (ng/mL) 23,09 22,23 24,77 Média (ng/mL) 26,14 25,91 24,88
Desvio padrão (s) 1,10 0,64 0,41 Desvio padrão (s) 1,24 0,64 0,23
CV (%) 4,8 2,9 1,7 CV (%) 4,7 2,5 1,7
Erro (%) 7,66 11,07 0,93 Erro (%) 4,55 3,64 0,49
25
LQ teste LQ teste
sangue Urina H vítreo sangue Urina H vítreo
25 mg/L 25 mg/L
23,21 26,13 27,62 23,48 23,78 24,53
24,43 28,56 28,29 22,48 24,94 25,11
23,35 29,23 27,76 23,43 24,90 24,69
24,87 26,14 26,56 20,63 24,66 24,78
26,03 28,28 26,62 19,26 24,67 24,43
Média (ng/mL) 24,38 27,67 27,37 Média (ng/mL) 21,86 24,59 24,71
Desvio padrão (s) 1,16 1,44 0,75 Desvio padrão (s) 1,85 0,47 0,26
CV (%) 4,8 5,2 2,8 CV (%) 8,5 1,9 1,1
Erro (%) 2,49 10,67 9,48 Erro (%) 12,58 1,64 1,17
LQ teste LQ teste
sangue Urina H vítreo sangue Urina H vítreo
25 mg/L 25 mg/L
21,14 19,94 21,09 27,15 22,56 23,68
20,62 20,89 19,99 27,22 23,82 24,01
21,35 20,25 20,78 28,34 23,66 23,00
19,74 21,43 20,54 24,88 23,21 23,52
18,28 20,87 20,97 23,61 23,28 22,36
Média (ng/mL) 20,23 20,68 20,67 Média (ng/mL) 26,24 23,31 23,31
Desvio padrão (s) 1,25 0,59 0,44 Desvio padrão (s) 1,85 0,47 0,65
CV (%) 6,2 2,8 2,1 CV (%) 7,1 2,0 2,8
Erro (%) 19,10 17,30 17,30 Erro (%) 4,96 6,78 6,74
LQ teste LQ teste
sangue Urina H vítreo sangue Urina H vítreo
25 mg/L 25 mg/L
23,86 20,07 20,74 29,63 20,07 28,26
22,85 20,68 20,40 29,10 20,68 28,92
24,41 20,33 20,39 30,26 20,33 28,58
21,77 21,34 20,55 27,04 21,34 28,89
20,14 20,18 20,38 26,27 20,18 28,64
Média (ng/mL) 22,00 20,13 20,49 Média (ng/mL) 27,95 20,13 28,66
Desvio padrão (s) 1,71 0,51 0,16 Desvio padrão (s) 1,72 0,51 0,27
CV (%) 7,8 2,5 0,8 CV (%) 6,2 2,5 0,9
Erro (%) 12,00 19,50 18,03 Erro (%) 11,80 19,50 14,63
Acetato de Etilo
Acetona
Isopropanol
Acetonitrilo
Acetaldeído
Metanol
Éter
1-Butanol
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158
LQ teste LQ teste
sangue Urina H vítreo sangue Urina H vítreo
5 mg/L 5 mg/L
3,98 5,23 5,78 3,95 5,25 5,78
3,92 4,51 5,49 3,99 4,50 5,49
4,15 5,40 5,67 4,12 5,48 5,68
3,92 5,51 5,32 3,89 5,56 4,92
4,13 5,56 4,93 4,10 5,30 5,14
Média (ng/mL) 4,06 5,40 5,44 Média (ng/mL) 4,03 5,28 5,46
Desvio padrão (s) 0,11 0,43 0,33 Desvio padrão (s) 0,10 0,42 0,36
CV (%) 2,8 7,9 6,1 CV (%) 2,4 8,0 6,7
Erro (%) 18,90 7,9 8,76 Erro (%) 19,50 5,5 9,20
5LQ teste
sangue Urina H vítreo
35 mg/L
30,16 33,27 30,38
28,28 31,00 28,73
28,28 32,00 27,64
26,86 30,52 29,30
23,86 33,41 28,56
Média (ng/mL) 27,01 33,34 28,92
Desvio padrão (s) 2,34 1,30 1,01
CV (%) 8,7 3,9 3,5
Erro (%) 22,83 4,74 17,37
Clorofórmio
Tolueno p-Xyleno
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
159
AGRADECIMENTOS
Ao Senhor Professor Doutor Duarte Nuno Vieira por ter dado oportunidade de
realizar este mestrado e de trabalhar num serviço que possui capacidades técnicas e
científicas que permitiram a realização da minha formação e deste trabalho.
Ao Senhor Professor Doutor Francisco Corte Real agradeço o apoio incondicional
que prestou ao longo deste mestrado, bem como o cuidado e rigor que colocou nas
sugestões apresentadas.
Ao Mestre João Miguel Franco o meu reconhecimento pela forma como me apoiou
desde o momento que decidi realizar este mestrado, bem como todo o
conhecimento, rigor e confiança transmitido ao longo destes anos de trabalho em
conjunto.
Aos colegas do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do INML,
em particular aqueles que me são mais próximos, por estarem comigo nos bons
momentos da realização deste trabalho, mas essencialmente nos mais difíceis de
ultrapassar. O meu muito obrigado.
Ao Dr. António Ajenjo do Serviço de Toxicologia do Sul, pela forma como sempre
se mostrou disponível para ensinar e transmitir os seus conhecimentos e a
inestimável colaboração na análise dos resultados deste trabalho.
Ao Senhor Engenheiro Álvaro queria agradecer todo o apoio técnico-científico que
sempre disponibilizou ao longo deste trabalho.
À Dra. Cristina Cordeiro pela disponibilidade em me ceder as amostras de humor
vítreo utilizadas na realização deste estudo, bem como todo o incentivo e confiança.
ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS COM INTERESSE FORENSE. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO POR GC-FID
160
Agradeço ao Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da
Universidade de Coimbra pelo suporte científico prestado no estudo de algumas
substâncias em análise na pessoa de Dra. Mariana Marques.
À Dra. Manuela Marques pelo auxílio na obtenção da bibliografia, especialmente
pela rapidez e disponibilidade manifestadas.
À minha amiga Cristina Teixeira queria agradecer a sua disponibilidade no auxílio
nas traduções, bem como o suporte constante na realização deste trabalho.
Quero agradecer à minha família, por todo o apoio incondicional prestado durante a
realização deste trabalho, essencialmente ao Rui, Zé e Manel pela compreensão da
minha ausência ao longo destes dois anos. O meu eterno obrigada.
À minha Avó…
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