Fernanda Soncini
ESTUDO AUTO-RADIOGRÁFICO E FARMACOLÓGICO SOBRE O
ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCABINÓIDE NA MEMÓRIA EMOCIONAL
DE RATOS PRIVADOS DE SONO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
2
Fernanda Soncini
ESTUDO AUTO-RADIOGRÁFICO E FARMACOLÓGICO SOBRE O
ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCABINÓIDE NA MEMÓRIA EMOCIONAL
DE RATOS PRIVADOS DE SONO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Orientadora: Profª. Drª. Débora Cristina Hipólide
Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Gabriela Menezes de Oliveira
São Paulo
2011
3
SONCINI, Fernanda
Estudo auto-radiográfico e farmacológico sobre o envolvimento do sistema endocabinóide
na memória emocional de ratos privados de sono
Fernanda Soncini - São Paulo, 2011.
128p.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Effects of sleep deprivation on the acquisition and extinction of aversive
memory and upon endocannabinoid system in Wistar rats.
1. privação de sono; 2. extinção de memória; 3. condicionamento de medo ao contexto; 4.
endocanabinóide; 5. autorradiografia.
4
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento de Psicobiologia
Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Prof. Dr. Marco Tulio de Mello
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Fernanda Soncini
ESTUDO AUTO-RADIOGRÁFICO E FARMACOLÓGICO SOBRE O
ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCABINÓIDE NA MEMÓRIA EMOCIONAL
DE RATOS PRIVADOS DE SONO
Banca Examinadora
Prof. Dr. Jorge Alberto Quillfeldt
Profª. Drª. Paula Ayako Tiba
Prof. Dr. Rui Daniel Schroder Prediger
Profª. Drª. Sabine Pompéia (suplente)
6
Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia da Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, com o apoio financeiro da
Associação Fundo de Incentivo a Psicofarmacologia (AFIP) e da Fundação de
Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - processo numero
08/56053-7).
7
AGRADECIMENTOS
________________________________
Tão difícil quanto escrever a dissertação, é agradecer devidamente a todos que
participaram, direta ou indiretamente de todo esse processo... Afinal, desde o estágio
probatório até essa fase final foram muitos e longos anos...
Como sempre, começo agradecendo os “culpados” pela minha existência:
meus pais, Valter e Raquel Soncini, que nunca pouparam esforços para me ajudar a
crescer e a seguir em frente, me acolhendo e respeitando as minhas escolhas...
Agradeço especialmente também, os meus companheiros de república - os efetivos e
os “flutuantes” – por dividirem comigo durante 2 anos, além do espaço físico, a vida!
Aline, Fabrício, Rodolfo, Graziele, Lyvia, Keila.
À minha orientadora, Débora Cristina Hipólide, que sempre me deu liberdade - e
muitos conselhos - para que eu realizasse esse trabalho da melhor forma possível e à
minha co-orientadora, Maria Gabriela Menezes de Oliveira, que me deu a
oportunidade de presenciar uma perspicácia científica invejável. Mulher
demasiadamente humana!
Aos professores que fizeram parte da banca examinadora do meu exame de
suficiência: Tatiana Ferreira, Roberto Frussa Filho e Sabine Pompéia e aos professores
pareceristas desta dissertação: Jorge Quillfeldt, Rui Daniel Prediger e Paula Ayako Tiba.
À querida Cristina, nossa bibliotecária do Departamento de Psicobiologia. Uma
pessoa que tem nos olhos um amor contagiante pelos livros; e que sempre me ajudou
com muita presteza no que foi preciso.
8
Aos técnicos de laboratório e ao pessoal que cuida dos bastidores de toda essa
estrutura, e que tornaram possível o bom andamento de todos os meus experimentos...
Aos bioteristas: Valdegar, Zé, Ivan, Dunga, Ricardinho e Manoéis, que cuidaram dos
meus animais; ao Gilbertinho, da Bioquímica, que me auxiliou no manuseio e diluição
da droga; ao Tomé e ao Vinicius, que me auxiliaram durante os experimentos
farmacológicos; à Diva, da biologia molecular, uma ajuda fundamental no ensaio
auto-radiográfico; ao Léo, da informática, que sempre me deu suporte técnico
quando eu precisei; ao pessoal da secretaria, que nos auxilia a lidar com a burocracia;
à Socorro, Solange, Sandra, Dona Hilda, Adriana e a todas as meninas da limpeza e do
cafezinho, que garantem um ambiente de trabalho sempre limpo e com café
fresquinho, o que torna tudo mais agradável! Ao Nelson, Sr. Sebastião, Manoel... Às
pessoas que cuidam da nossa segurança nas portarias, de segunda a segunda, 24
horas por dia!
Ao apoio financeiro e estrutural da AFIP, Unifesp e Fapesp, que possibilita que
tenhamos material, café, secretaria, biblioteca, equipamentos e toda essa estrutura
que, infelizmente, ainda é raridade no resto do país.
Aos que, em determinado momento, me ajudaram nesse processo, seja
aconselhando, seja colocando a “mão na massa”: Lucila Jardim, Karin Moreira, Maria
Angélica Comis, Aline Soeiro, Carlos Eduardo Girardi, Juliane Borges, Juliana Lanini,
Tharcila Chaves, Fernanda Armani, Francisco Godoi, Francisco Dubiela, Ricardo
Mazzeo, Juliana Carlota... Queria muito falar um pouco sobre como cada um de
vocês, com suas peculiaridades, me inspiraram e me incentivaram a resistir e
continuar... Mas provavelmente isso aumentaria muito o número de páginas desse
9
trabalho, que já não está muito pequeno... O mínimo que posso dizer é que eu os
respeito, os admiro e sou muito grata por cada “mãozinha” e por cada sinapse cedida
a mim, sinceramente!
À todos os meus professores e colegas de pós-graduação, que fazem da
Psicobiologia um ambiente ímpar... É quase irrelevante – porque é óbvio – dizer que é a
carinha e a personalidade de cada um de vocês que faz da Psicobio, a Psicobio!
À equipe do IX, X e XI Curso de Verão em Psicobiologia, e aos quase 90 alunos
que passaram por aqui e me deram a oportunidade de fazer o que enche meu
coração de alegria e satisfação: ensinar.
Aos amigos pesquisadores canábico-psicodélicos, com quem pude aprender e
partilhar meu amor pelo universo das drogas: Renato Filev, Ricardo Fontão, Douglas
Engelke, Fabrício Pampona, Lucas Maia, Eduardo Schemberg, Henrique Carneiro,
Maurício Fiore, Marco Sayão, Angélica Comis, Tharcila Chaves.
Aos meus amigos e colegas que não fazem parte desse mundo
academicamente louco, ou até fazem, em outras áreas, mas que aguentaram meu
mau humor, meus furos, minhas lamentações... E com quem eu ainda quero dividir os
louros da minha vida. São muitos os nomes e por isso é impossível citá-los, mas nessa
lista estão os meus amigos da Biologia: Elver “Presto”, Claudia “Cuca”, Daiane, Cristini.
O pessoal “das Sociais” da Fundação Santo André, os grandes da Escola Livre e suas
grandes iniciativas, o pessoal que faz arte e circo no ABC, Ana Mesquita e Marcelo
Galindo, o pessoal do movimento estudantil desse Brasil afora... obrigada por
contribuírem imensamente na minha formação.
À minha teimosia, que me fez chegar até aqui!!!
10
DEDICATÓRIA
________________________________
“Vamos, meus queridos amigos, logrem! O caminho está aberto para vocês! Os obstáculos
sempre vão haver! Porém, esta é uma nova caminhada! Saibam que estarei com vocês
sempre! [...] Todo sofrimento tem um fim... como tudo... [...] Irmão, sei que às vezes sou-lhe
ausente... Mas sempre estarei contigo! [...] Cuide de mamãe! Siga teu caminho e nunca se
esqueça do que aprendemos e vivemos! Cuide bem deste coração bondoso... Trabalhe pra
valer, meu caro! O tempo é curto e a vida cobra veementemente! Mas não se esqueça de
passar pra somente um 'olá'. [...] Deixe-os pra lá! ou melhor... encare-os! Você é magnífico,
camarada!! [...] Saudades mesmo, meu rico! Até mais adiante (bem adiante...)! Você é um
mu(i)lecão! e sempre rimos juntos... continue assim! Está indo muito bem!... é um orgulho para
todos! Cobra-me, abraça-me, critique-me, beije-me, fale-me, odeie-me, chama-me, ouça-me,
abraçe-me, esqueça-me, sinta-me e vai-te, mas volte, pois te adoro! Teu sorriso é lindo, assim
como vossa pessoa! Tenho saudades de tudo... Hoje vocês estarão por aí? Estarei também... [...]
Deixe o tempo passar, pois ele não leva tudo... ouça sempre as pessoas e as perdoe, como
sempre fez... procure as entender melhor, pois somos muito complexos!... [...] Cuide bem de
todos eles e deste coraçãozão que tens! amanhã tem mais!!”
Por Daniel Galhardo, trabalhador, estudante e amigo.
Daniel se graduou em Letras trabalhando durante o dia, estudando a noite e passando as madrugadas
estudando com os pés submersos na água fria. Não era cientista, mas dominava a técnica de privação
de sono. Infelizmente não pôde esperar que a ciência curasse os seus traumas... E os curou dando fim à
própria vida. Saudades... (2/mar/1984 – 18/jul/2010)
11
"Devemos reconhecer, como me parece, que o
homem, com todas as suas nobres qualidades,
ainda sofre em sua prisão corpórea a indelével
marca de sua humilde origem."
(Charles Darwin)
12
RESUMO
________________________________
Eventos estressantes ou traumáticos são frequentemente seguidos por distúrbios de sono e,
consequentemente, a persistência desses distúrbios de sono podem ser fatores preditivos para o
desenvolvimento de futuros transtornos de ansiedade, como as fobias e o Transtorno de Estresse
Pós-Traumático (TEPT), caracterizado pela persistência das memórias aversivas e a
incapacidade de extinção destas. Uma vez demonstrado que a ativação do sistema
canabinóide facilita a extinção de memórias aversivas, além de modular a indução de sono,
este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da privação de sono sobre os processos de
retenção, evocação e extinção de memórias aversivas, no condicionamento de medo ao
contexto, além de avaliar a densidade de receptores CB1 no encéfalo de ratos privados de
sono e os efeitos de um antagonista canabinóide na evocação da memória emocional. Os
animais foram organizados em dois ou três grupos: Privação de Sono (PS), Rebote de Sono (REB)
e Controle (CTRL). Os resultados mostram que a privação de sono pode ter causado tanto (1)
prejuízo na evocação da memória de medo como (2) na expressão da resposta
comportamental, devido ao aumento de atividade locomotora, entretanto, não prejudicou a
extinção de memória, na tarefa do condicionamento de medo ao contexto. Mostrou também
que a admininstração do AM251 antes do treino não reverteu o prejuízo na retenção da
memória causado pela privação de sono, na mesma tarefa, pois independente da dose de
droga administrada (0,5; 2,5; 5,0 mg/kg), o grupo PS continuou apresentando maior prejuízo na
retenção de memória, em relação ao grupo CTRL e mesmo em relação ao grupo REB, que teve
24 horas de oportunidade de sono após a privação de 96 horas. Além disso, o estudo auto-
radiográfico mostrou uma diminuição na densidade dos receptores canabinoides CB1 no grupo
PS e REB. Concluímos que a privação de sono possa ter aumentado a atividade motora do
13
animal, e também prejudicado a retenção e a evocação da memória no condicionamento de
medo ao contexto. Por outro lado, a privação de sono não prejudicou o processo de extinção
da memória eversiva. Concluímos também que o antagonista canabinóide AM251 não foi
capaz de reverter o prejuízo na retenção de memória dos animais privados de sono e que estes
apresentam uma diminuição na densidade de receptores CB1 nos núcleos amigdaloides
basolateral, central e medial, o que pode diminuir a reação de medo do animal. Nossos
resultados sugerem que o processo de extinção do condicionamento de medo ao contexto
ocorra por mecanismos distintos do aprendizado original dessa tarefa, uma vez que a privação
de sono afeta o aprendizado de tarefas contextuais, mas não a sua extinção.
Palavras-chave: privação de sono; extinção de memória; condicionamento de medo ao
contexto; sistema endocanabinóide; autorradiografia.
14
SUMÁRIO
________________________________
INTRODUÇÃO 20
CONSIDERAÇÕES GERAIS 20
O SONO 22
Estrutura do sono 22
Teorias sobre a função do sono 23
Bases neurais do ciclo vigília-sono 25
A privação de sono como ferramenta de investigação 27
A MEMÓRIA 32
Neuroanatomia da memória 33
Memória explícita 33
Estruturas neuroanatômicas relacionadas com a memória explícita 35
Memória implícita 35
Estruturas Relacionadas com a Memória Implícita 36
Memória em animais 37
Extinção de memórias emocionais 38
Modelos animais para o estudo da memória emocional 41
Esquiva Inibitória 41
Condicionamento Clássico de Medo 42
Condicionamento de Medo ao Contexto 42
EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA MEMÓRIA EMOCIONAL E NOS SISTEMAS DE NEUROTRANSMISSÃO 44
Investigando sistemas de neurotransmissão 47
DA CANNABIS AOS CANABINÓIDES 50
15
O Sistema endocanabinóide 51
Receptores canabinóides 51
Ligantes endocanabinóides 53
Mecanismo de ação e síntese 54
Funções biológicas 56
Potencialidades terapêuticas 57
CANABINÓIDES, SONO E EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL 60
Relação entre canabinóides e sono 60
Relação entre canabinóides e extinção de memória 62
Relação entre sono e extinção de memória 63
OBJETIVOS 66
HIPÓTESES 67
MATERIAIS E MÉTODOS 68
ANIMAIS 68
TÉCNICA DE PRIVAÇÃO DE SONO 69
CÂMARA DE CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO 71
Treino do condicionamento de medo ao contexto 71
Teste de aquisição/consolidação de memória emocional 72
Protocolos de extinção de memória emocional 72
Testes de extinção de memória 73
DILUIÇÃO E ADMINISTRAÇÃO DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251 74
PROCEDIMENTO AUTO-RADIOGRÁFICO GERAL 75
Processamento histológico dos cérebros 75
Incubações 76
Exposição e revelação de filmes 77
16
Análise densitométrica 77
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS 79
EXPERIMENTO 1: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA AQUISIÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO 79
Registro de dados 80
Análise estatística 80
EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA CONSOLIDAÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO 82
Registro de dados 82
Análise estatística 82
EXPERIMENTO 3: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251 NA RETENÇÃO DA MEMÓRIA AVERSIVA DO
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO, EM RATOS PRIVADOS DE SONO 84
Registro de dados 84
Análise estatística 84
EXPERIMENTO 4: ANÁLISE AUTO-RADIOGRÁFICA DE RECEPTORES CANABINÓIDES (CB1) EM RATOS PRIVADOS DE SONO 86
Marcação de receptores CB1 86
Análise estatística: 87
RESULTADOS 88
EXPERIMENTO 1: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA AQUISIÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO 88
EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA CONSOLIDAÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO 93
EXPERIMENTO 3: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251 NA AQUISIÇÃO/CONSOLIDAÇÃO DA MEMÓRIA
AVERSIVA DO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO, EM RATOS PRIVADOS DE SONO 97
EXPERIMENTO 4: ANÁLISE AUTO-RADIOGRÁFICA DE RECEPTORES CANABINÓIDES (CB1) EM RATOS PRIVADOS DE SONO 99
17
DISCUSSÃO 102
CONCLUSÃO 117
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 118
18
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS
________________________________
Fig. 1: Estágios do sono em humanos ............................................................................................... 23
Fig. 2: Tipos de memória .................................................................................................... ................. 32
Fig. 3: Esquema da extinção comportamental .............................................................................. 39
Fig. 4: Breve histórico dos registros de uso da Cannabis em todo o mundo ............................... 50
Fig. 5: Breve histórico dos avanços na investigação sobre os mecanismos de ação dos
canabinóides ....................................................................................................................................... 52
Fig. 6: (A) Mecanismo de ação dos endocanabinóides; (B) Biosíntese e degradação dos
endocanabinóides anandamida e 2-araquidonilglicerol ............................................................. 55
Fig. 7: Desenho experimental 1 .................................................................................................... ..... 80
Fig. 8: Desenho experimental 2 ......................................................................................................... 83
Fig. 9: Desenho experimental 3 .................................................................................................... ..... 85
Fig. 10: Efeitos da PS no tempo de freezing no condicionamento de medo ao contexto no
Teste 1 e no Teste 2 do Experimento 1 ........................................................................................... 90
Fig. 11: Efeitos da privação de sono no número de grooming nos Testes 1 e 2 do
Experimento 1 ............................................................................................................................. ......... 90
Fig.12: Efeitos da privação de sono no número de rearings nos Testes 1 e 2 do Experimento 1
............................................................................................................................. ................................ 90
Fig. 13: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing, grooming e número de rearings
entre os primeiros cinco minutos dos testes 1 e 2, no condicionamento de medo ao
contexto, no Experimento 1 ............................................................................................................... 91
Fig.14: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing no condicionamento de medo ao
contexto no Teste 1 e no Teste 2 do Experimento 2 ................................................................. 94
19
Fig.15: Efeitos da privação de sono no número de grooming nos Testes 1 e 2 do Experimento
2 ............................................................................................................................. .................................. 94
Fig. 16: Efeitos da privação de sono no número de rearings nos Testes 1 e 2 do Experimento 2
............................................................................................................................. ..................................... 95
Fig. 17: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing, grooming e número de rearings
entre os primeiros cinco minutos dos testes 1 e 2 do condicionamento de medo ao
contexto, no Experimento 2 ................................................................................................................ 95
Fig. 18: Tempo de freezing entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com AM251 (vei; 0,5; 2,5;
5,0 mg/kg) à esquerda e; tempo total de freezing entre os grupos, independente da dose
administrada, à direita ......................................................................................................................... 98
Fig. 19: Tempo de grooming entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com AM251 (vei; 0,5;
2,5; 5,0 mg/kg) à esquerda e; tempo de grooming entre os grupos, independente da dose
administrada, à direita ......................................................................................................................... 98
Fig. 20: Número de rearing entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com diferentes doses de
AM251 (vei; 0,5; 2,5; 5,0 mg/kg) à esquerda e; número de rearing entre os grupos,
independente da dose de droga administrada, à direita ............................................................. 98
Tabela 1: Escala de resposta comportamental frente ao estímulo aversivo .............................
Tabela 2: Marcação de [3H]WIN 55212-2 em receptores CB1 .....................................................
72
100
20
INTRODUÇÃO
________________________________
CONSIDERAÇÕES GERAIS
A julgar pela mitologia, documentos, lendas e tradições orais ou escritas, a
origem e a função do sono têm fascinado todos os povos do mundo desde a
Antiguidade. Entretanto, como acontece com a maioria dos temas relevantes, a
primeira abordagem sistemática e com finalidade científica surgiu na Grécia Antiga,
elaborados a partir de observações de Sócrates, Platão e Aristóteles.
Sabemos que a qualidade do sono - essa atividade que ocupa cerca de 1/3 de
nossas vidas - influencia diretamente na qualidade de vida e na rotina dos indivíduos.
Uma noite mal dormida pode trazer diversas conseqüências indesejáveis como:
comprometer o desempenho profissional, interferir no humor e nas relações pessoais,
prejudicar a qualidade de vida e até provocar danos físicos e mentais (ver revisões de
Akerstedt, 1998; Van Dongen e Belenkym, 2009; Lee e Douglass, 2010; Gryglewska,
2010).
Desde o advento da luz elétrica, a sociedade vem aumentando seu rítmo de
vida, dormindo cada vez menos e, consequentemente, sofrendo cada vez mais com
as alterações fisiológicas causadas pela perda de sono.
Uma ferramenta bastante utilizada para estudar a função do sono em
humanos e animais é a privação de sono, já que os efeitos causados pela ausência do
21
sono podem elucidar questões sobre os mecanismos e funções desse fenômeno. Uma
série de estudos evidencia a necessidade de uma boa noite de sono para o
funcionamento adequado, entre outros, dos processos cognitivos, como as funções
executivas e a memória (Ambrosini & Giuditta, 2001; Maquet, 2001; Stickgold et al.,
2001; Ficca & Salzarulo, 2004; Walker, 2005).
De fato, muitos estudos têm sido realizados, na tentativa de entender como o
sono, ou a falta dele, influencia os processos de memória. Entretanto, ainda não existe
uma resposta unânime para essa questão, uma vez que ambos os processos de sono e
memória, envolvem complexas etapas e mecanismos de processamento. Os diferentes
resultados gerados a partir dessas pesquisas frequentemente estão associados ao
momento, ao tipo e a intensidade da privação de sono em relação ao processo de
aprendizagem, ao tipo e à complexidade da tarefa de memória utilizada (Walker e
Stickgold, 2006).
Neste trabalho, optamos por destacar os aspectos relacionados aos efeitos da
privação de sono especificamente no processamento da memória emocional.
Entretanto, antes disso, apresentaremos algumas informações básicas sobre sono e
memória para ilustrar a complexidade desses fenômenos.
22
O SONO
O sono, que já foi considerado “o estado intermediário entre a vigília e a morte”,
era visto apenas como um estado inativo do cérebro, resultante da diminuição do
input sensorial. Hoje, sabe-se que o sono é um comportamento dinâmico e que não se
trata apenas da ausência da vigília, mas sim de uma atividade especial do cérebro,
controlada por mecanismos elaborados e precisos (Timo-Iaria, 2008).
ESTRUTURA DO SONO
Os ratos são os animais mais utilizados atualmente nos estudos sobre sono, e
podem servir de modelo para o conhecimento das características deste fenômeno nos
mamíferos. O sono dos ratos é dividido em dois estágios: sono de ondas lentas
(correlato do sono NREM, em humanos) e sono paradoxal (correlato do sono REM, em
humanos). Com relação à vigília, existem dois tipos, a vigília ativa e a vigília relaxada
(Timo-Iaria et al., 1970).
Os ratos também apresentam atonia muscular e movimentos rápidos dos olhos
durante o sono paradoxal, porém, os movimentos do rostro e vibrissas são mais
acentuados (Timo-Iaria et al., 1970).
23
Fig. 2: Estágios do sono em humanos (adaptado de Stickgold, 2005; nova nomenclatura dos estágios do
sono retirado de Iber et al., 2007)
TEORIAS SOBRE A FUNÇÃO DO SONO
O surgimento da perspectiva evolucionista colocou em questão a influência
dominante da teoria restauradora, que afirma que o sono tem a função de restaurar
déficits fisiológicos causados pela vigília. Logo se percebeu que esta teoria não
explicava as grandes variações de quantidade de sono entre as espécies de
mamíferos (Allison e Cicchetti, 1976; Horne, 1988; Zepelin, 2000).
A principal alternativa para a teoria restauradora é teoria da conservação de
energia. Duas versões desta teoria são muitas vezes interpretadas, de maneira errônea,
como fazendo parte de uma única teoria (Claparéde, 1996).
Uma delas, afirma que o sono serve para a redução do gasto energético,
abaixo dos níveis atingíveis apenas pelo descanso. Um excelente exemplo é o koala,
cuja dieta consiste em folhas de eucalipto que possuem baixo valor nutricional. O sono
24
prolongado destes animais parece ser necessário para aliviar a pressão metabólica, e
é consistente com a teoria da conservação de energia.
A segunda versão afirma que a principal contribuição do sono é a indução ao
descanso e o estabelecimento de um limite na atividade e no gasto energético. Um
estudo comparativo entre 53 espécies de mamíferos avaliou a crença de que espécies
que dormem mais vivem mais, devido ao benefício do baixo metabolismo durante o
sono. Porém, observou-se o contrário: espécies que dormem mais tipicamente
possuem uma menor expectativa de vida (Zepelin, 2000). Elas também tendem a ser
menores em tamanho e possuir altas taxas metabólicas basais. Estes dados levaram a
conclusão de que o sono determina um limite no gasto energético em um nível
necessário para o balanco energético da espécie (Berger e Phillips, 1998; Zepelin,
2000).
Dadas as lacunas deixadas por outras teorias, as teorias comportamentais
tomaram frente, expandindo o conceito de que o sono é um estado de “descanso
forçado”. Já foi sugerido, por exemplo, que os animais maiores dormem relativamente
menos porque eles requerem tempo extra para o forrageio.
Outra concepção relacionada é a função da quantidade de sono
proporcionando um estado de irresponsividade, isto é, o sono previne a atividade,
quando esta pode ser perigosa ou ineficiente, não permitindo, desta maneira, reações
danosas que poderiam ocorrer em um animal meramente descansando, porém
atento aos eventos ao seu redor.
25
BASES NEURAIS DO CICLO VIGÍLIA-SONO
A vigília é mantida principalmente pela ação do sistema ativador reticular
ascendente (SARA) do tronco encefálico, do qual fazem parte os núcleos
monoaminérgicos, colinérgicos e células glutamatérgicas que se localizam ao longo
de toda a região. Esses neurônios projetam-se para o tálamo e excitam células que
projetam-se para diversas áreas do córtex cerebral, produzindo a ativação cortical
característica da vigília (Moruzzi e Magoun, 1949).
O sono paradoxal (SP) é basicamente regido pelo sistema colinérgico. Nessa
fase há aumento no disparo das células colinérgicas do tegmento pedúnculo-
pontino/látero-dorsal (PPT/LDT), no tronco cerebral, e também em células colinérgicas
do prosencéfalo basal. Ao contrário da vigília, as células noradrenérgicas, localizadas
principalmente no locus ceruleus (LC), e as serotoninérgicas dos núcleos da rafe
apresentam atividade significativamente reduzida, muitas vezes chegando a
permanecer silentes. (Jones, 2005).
Por meio dos estudos de lesão ou estimulação eletrica, aliados ao registro celular
unitário, foi possível identificar tipos distintos de neurônios envolvidos na gênese do SP.
Os neurônios SP-on, inativos durante a vigília e o sono de ondas lentas, mas ativos
durante o SP, e os SP-off, ativos durante a vigília, mas quase inativos durante o SP
(Luppi, 2004).
Apesar do conhecido papel da dopamina (DA) nos mecanismos de
manutenção da vigília, alguns trabalhos descrevem a participação desse
neurotransmissor no sono paradoxal. Tufik e colaboradores foram os pioneiros em
26
descrever uma supersensibilidade dos receptores dopaminérgicos D2 após um período
de privação de SP (Tufik et al., 1978; Nunes et al., 1994).
Além disso, estudos com animais que sofreram depleção nas concentrações de
DA, com lesão seletiva de vias dopaminérgicas, utilizando antagonistas de receptores
de DA mostram uma supressão do SP após esse tipo de manipulação (Dzirasa et al.,
2006). Tomadas em conjunto, essas evidências indicam que a DA participa não só dos
mecanismos SP-off, como também dos neurotransmissores SP-on.
O mecanismo dos movimentos rápidos dos olhos parece ser dependente dos
núcleos vestibulares que produzem os efeitos óculo-motores por meio de um complexo
circuito neuronal existente ao nível do colículo superior e do tegmento mesencefálico.
Várias evidências indicam que o núcleo do trato solitário (NTS) esteja envolvido na
geração do sono.
O sono sincronizado ou NREM está associado ao aumento da atividade de
células da área ventro-lateral pré-óptica anterior (VLPO). Esta região contém células
gabaérgicas que projetam para o núcleo tubero-mamilar do hipotálamo posterior e
para os núcleos colinérgicos e monoaminérgicos do tronco encefálico, tendo uma
ação inibitória sobre os geradores da vigília e da ativação cortical. Durante o sono
NREM as células gabaérgicas do núcleo reticular do tálamo têm seu modo de disparo
alterado devido a ausência da influencia das monoaminas e da acetilcolina. Esses
neurônios passam a apresentar um ritmo de disparo em rajadas (burst) de potencias de
ação que hiperpolarizam os neurônios tálamo-corticais e geram os fusos registrados nos
estágios 2 e 3 do sono NREM. À medida que o sono se aprofunda, os neurônios tálamo-
corticais tornam-se cada vez mais hiperpolarizados, e neste estado passam a gerar o
27
ritmo delta, sincronizando as células corticais. No estágio mais profundo do sono NREM,
os neurônios corticais passam a gerar seu proprio ritmo espontâneo de ondas lentas,
disparando de maneira altamente sincronizada (Jones, 2005).
Em relação aos neurotransmissores, Jouvet mostrou que lesão no núcleo da rafe,
em gatos, produz insônia e que, lesõoes parciais resultam em diminuição variável do
sono sincronizado, relacionada diretamente com a porcentagem da área atingida e o
grau de depleção de serotonina no prosencéfalo, sugerindo que a serotonina e
importante para o sono. Entretanto, os níveis de serotonina são mais altos durante a
vigília, diminuindo durante o sono NREM e SP. De certo modo, esses dados parecem
sugerir que este neurotransmissor participa da indução e início do NREM, mas não
necessariamente da manutençãodeste estado.
Alem da serotonina, o GABA, um neurotransmissor inibitório clássico, participa do
controle do sono. Tanto que os benzodiazepínicos, que aumentam a ação pós-
sináptica do GABA, são potentes agentes hipnóticos. Neurônios gabaérgicos são
encontrados no tálamo, tronco encefálico, hipotálamo, prosencéfalo basal e córtex,
podendo agir de maneira inibitória sobre os sistemas ativadores da vigília. É sabido que
drogas que promovem o aumento dos níveis de GABA, pela inibição da sua
degradação, aumentam o sono NREM.
A PRIVAÇÃO DE SONO COMO FERRAMENTA DE INVESTIGAÇÃO
Juntamente com as técnicas eletrofisiológicas, a privação de sono é uma das
principais ferramentas de estudo que nos levam à compreensão da fisiologia e dos
mecanismos de regulação do ciclo vigília-sono. A adoção de modelos animais em
28
experimentos de privação de sono tornou-se necessária, permitindo que fossem feitas
também avaliações bioquímicas, farmacológicas, neuronatômicas e
comportamentais, entre outras, associadas à supressão do sono. Dentre as
metodologias instrumentais para a privação de sono em animais temos uma técnica
conhecida como “flower-pot”, técnica do pedestal ou plataforma, que suprime o SP.
Ainda existem outros metodos de privação, como o gentle handling, que
consiste em manusear delicadamente o animal assim que este apresenta indicios de
sono. Um dos primeiros experimentos com esta metodologia foi feito por Crile, em
coelhos, em 1921. Este metodo, pela exigencia da interferencia constante do
experimentador, não permite períodos prolongados de privação de sono.
Rechtschafen e colaboradores desenvolveram o metodo conhecido como método do
disco rotatório, em que o animal e conectado a um poligrafo e colocado sobre um
disco motorizado que, por sua vez, esta sobre um recipiente com agua. Quando o
animal inicia o sono, ou manifesta alguma fase especifica deste, um sistema
automatico aciona um motor que faz o disco girar e, para não ser lancado para fora
dele, o rato desperta e é obrigado a caminhar em sentido contrário ao da rotação do
disco. O animal controle para este metodo também se encontra no mesmo disco, so
que e despertado em fases não determinadas do seu ciclo vigília-sono. Essa
metodologia vem sendo alvo de criticas: a locomoção forcada que o animal e
obrigado a executar, a falta de um controle adequado, uma vez que o animal
controle pode ser também parcialmente privado de sono.
O metodo de privação de sono pela plataforma única, per se, constitui um fator
de estresse para os animais, principalmente pela contenção de movimentos que o
29
metodo induz. Baseados neste fato, Van Hulzen e Coenen propuseram que fossem
adotadas mais seis plataformas, permitindo que o rato se movimentasse durante o
período de privação. Mas tanto no metodo da plataforma única, como no das
plataformas múltiplas, os animais mostram fortes indicios de estresse, como a perda de
peso, atrofia do timo e o aumento do peso das glandulas adrenais. O isolamento social
presente nas metodologias ate entao apresentadas, e outro importante fator de
estresse, levando entao Nunes Jr. e Tufik a proporém o método modificado das
plataformas múltiplas, em que é possivel privar vários animais simultaneamente, sempre
com um número excedente de plataformas, permitindo a movimentação e a
interação social dos ratos durante a privação de sono. Porém, apesar de serem
privados em conjunto e com a possibilidade de movimentação, os niveis plasmaticos
de corticosterona e ACTH (hormônio adrenocorticotrofico), hormonios indicativos de
estresse ainda permanecem mais elevados nestes animais do que nos animais privados
pela tecnica da plataforma única, sugerindo que os animais privados pela tecnica das
plataformas múltiplas modificadas estariam mais estressados do que os animais
privados pela tecnica da plataforma única.
Esses resultados levaram Suchecki e Tufik (2000) a estabelecerem que a
instabilidade social entre os animais seja, em grande parte, responsável por esta
resposta exagerada de estresse. Em animais criados juntos desde o desmame e
privados em conjunto pela técnica da plataforma múltipla modificada, as
concentrações plasmáticas de ACTH e corticosterona mantem-se muito próximas as
dos controles, alojados em suas gaiolas moradia.
30
Recentemente, realizamos um trabalho para comparar a eficiência e a
especificidade das plataformas múltiplas modificadas e da plataforma única, quanto
à privação de sono, pelo monitoramento eletrocorticográfico contínuo do sono destes
animais durante e após o período de privação. Verificamos que ambas as técnicas são
eficientes em produzir a completa eliminação do SP, mas não são especificas, pois
também induzem redução do sono de ondas lentas em cerca de 37% para a
plataforma única e de 33% para a PMM. Isto sugere que parte das alterações
comportamentais e neuroquímicas advindas da privação de sono possa também ser
atribuídas à redução parcial do sono de ondas lentas (Machado et al., 2004).
Estudos de privação de sono sugerem que o sono é regulado por um processo
homeostático, sendo esta regulação relativa em um nível referencial interno. O rebote
de cada uma das fases do sono parece estar diretamente ligado ao tipo e a duração
da privação de sono. A privação total de sono – de 12 à 24 horas - resulta tanto no
aumento do sono de ondas lentas como no de sono paradoxal (Franken et al., 1991),
mas a privação de sono paradoxal por 96 horas induz um aumento muito mais
pronunciado de SP do que 24h de privação total. Períodos menores de privação total
de sono – 3 à 6 horas - resultam apenas no aumento da fração de sono de ondas
lentas, sem afetar o SP.
Alguns estudos sugerem a existência de um sistema neuronal, originário no
núcleo arqueado, cujas projeções para o tronco cerebral participariam ativamente
nos mecanismos responsáveis pela expressão do rebote de sono. A destruição do
núcleo arqueado e da hipófise é capaz de suprimir o rebote de SP induzido pela
privação de sono, embora a destruição isoladamente de apenas uma destas
31
estruturas não seja capaz de bloquear a expressão do efeito rebote (Knutson et al.,,
2007; Obal et al., 1992 ). O DSP-4, uma neurotoxina que induz degeneração em fibras
noradrenérgicas do LC também suprime o rebote de sono induzido pela privação,
indicando que o sistema noradrenérgico possa desempenhar algum papel nos
mecanismos responsáveis pela regulação do efeito rebote (Cirelli et al, 1996;
Mogilnicka et al., 1986).
O rebote de SP também parece ser inibido por períodos de estresse intenso,
sugerindo que a secreção prolongada de glicocorticoides estaria envolvida neste
processo, visto que a administração de glicocorticoides é capaz de reduzir o rebote de
sono (Marinesco et al., 1999; Meerlo et al., 2002 ).
32
A MEMÓRIA
Memória é a capacidade de armazenar, reter e, subsequentemente, recuperar
informações. Tem como função situar e adaptar o indivíduo ao meio, modificando
comportamentos em função de novas aprendizagens e experiências anteriores. Dessa
forma, a memória está longe de ser uma função cognitiva unitária. Os processos de
aquisição, consolidação e evocação da informação aprendida ocorrem em
momentos distintos e dependem de diferentes cascatas bioquímicas e estruturas
neuroanatômicas (Izquierdo, 2002).
Estudos com pacientes amnésicos, modelos animais e investigações com sujeitos
normais sugerem a existência de diferentes tipos de memória (Baddeley, 2004;
Schacter et al, 2000; Squire, 2004; Tulving, 1985). Com relação à memória de longo
prazo, há ainda a distinção entre memória expllícita (ou declarativa) e memória
implícita (ou não-declarativa), que se diferem tanto anatômica quanto
funcionalmente.
Fig. 2: Tipos de memória (adaptado de Stickgold, 2005).
33
NEUROANATOMIA DA MEMÓRIA
Wilder Penfield, na década de 30, foi um dos primeiros a observar que as
funções de memória poderiam estar localizadas em regiões específicas do cérebro,
como as estruturas do lobo temporal medial. Penfield e cols. mapearam diversas áreas
motoras, sensoriais e de linguagem por estimulações elétricas cerebrais realizadas em
pacientes durante o procedimento cirúrgico.
Na década de 50, procedimentos cirúrgicos que tinham como objetivo abolir
crises epilépticas, possibilitaram o entendimento de que algumas estruturas eram, de
fato, importantes para a memória, como no caso do famoso paciente H.M., que foi
submetido a uma ressecção bilateral do lobo temporal medial, incluindo o giro
parahipocampal, córtex entorrinal, amígdala e dois terços anteriores do hipocampo.
Apesar do controle das crises, a cirurgia resultou numa grave e permanente
inabilidade de adquirir novas informações (chamada amnésia anterógrada), assim
como uma amnésia retrógrada, cujo intervalo de tempo era de aproximadamente três
anos antes da cirurgia. No entanto, algumas funções foram preservadas, como: a
memória para eventos remotos, memória de curto prazo e a memória implícita.
As observações de outros pacientes amnésicos, juntamente com estudos em
animais, permitiram verificar a existência de relações entre determinadas estruturas do
cérebro e os diferentes tipos de memória.
MEMÓRIA EXPLÍCITA
A memória explícita pode ser definida como aquela que nos permite lembrar
fatos e acontecimentos. Chama-se também de memória declarativa, visto que a
34
recordação pode ser relatada verbalmente, por meio da linguagem (no caso dos
humanos), ou por meio de uma imagem trazida à mente, sendo então um
conhecimento ou uma lembrança da qual podemos ter acesso conscientemente.
Esse subsistema de memória ainda abarca outras duas diferenciações: a
memória episódica e a memória semântica, como proposto por Tulving em 1983. A
memória episódica refere-se ao armazenamento e recordação de acontecimentos,
vivências pessoais do indivíduo, o que lhe constitui um reconhecido caráter como
“memória autobiográfica”, pois permite a pessoa se lembrar de situações das quais
participou (onde e quando). O conceito abarca três ideias principais: self, consciencia
autonoética e tempo subjetivo de tempo. Por isso mesmo, este tipo de memória é
bastante suscetível de alterações e perdas de informações, sendo também muito
influenciado pelo contexto emocional da situação.
Já a memória semântica refere-se aos fatos gerais sobre o mundo,
conhecimentos sobre fatos não pessoais, mas de importância. É a memória essencial
para a linguagem, sendo considerada por Tulving (1983), como o „thesaurus‟ mental.
Assim, envolve o conhecimento organizado que uma pessoa possui a respeito de
palavras e outros símbolos verbais, seu significado e associações a outras palavras,
com outros significados, o que forma a chamada “redes semânticas”, pressupondo
que todas as palavras e seus significados formam uma rede, na qual a ativação de
uma palavra ativa automaticamente conceitos a ela relacionados.
35
ESTRUTURAS NEUROANATÔMICAS RELACIONADAS COM A MEMÓRIA EXPLÍCITA
Qualquer condição que cause lesão ao lobo temporal medial pode causar um
prejuízo grave e seletivo da memória explícita. Um quadro clínico conhecido como
amnésia. Lesões em algumas estruturas do diencéfalo, como os corpos mamilares e os
núcleos anteriores e dorsomediais do tálamo (áreas anatomicamente relacionadas ao
lobo temporal) também ocasionam prejuízos de memória muito semelhantes aos da
amnésia do lobo temporal medial.
Em animais de laboratório, assim como em humanos, lesões da formação
hipocampal determinam prejuízos seletivos em tarefas de memória. Somente algumas
tarefas são prejudicadas, como a esquiva passiva (Kimble, 1963; Kimura, 1958; Snyder e
Isaacson 1965; O’Keefe e Nadel 1978), o condicionamento de medo ao contexto (Kim
e Fanselow, 1992; Phillips e LeDoux, 1992) e a discriminação sucessiva no labirinto em T
ou em Y, enquanto que em outras não há prejuízo de desempenho, como na esquiva
ativa de duas vias, a discriminação simultânea e o condicionamento clássico de medo
ao som (Kim e Fanselow, 1992; Phillips e LeDoux, 1992).
MEMÓRIA IMPLÍCITA
A memória implícita refere-se a memórias aprendidas gradualmente, por meio
de repetições, e envolve habilidades percepto-motoras ou cognitivas (Schacter, 1987;
Schacter et al., 1993). É denomidada implícita, pois só pode ser aferida pelo
desempenho. Um exemplo clássico é andar de bicicleta, uma habilidade adquirida
aos poucos, depois de seguidas tentativas. Além disso, uma pessoa só pode aferir que
outra sabe andar de bicicleta, pela demonstração factual (eu posso dizer que “sei”
36
andar de bicicleta, mas apenas diante de uma bicicleta que posso comprovar meu
conhecimento). Dentre os tipos de memória implícita estão: o condicionamento
clássico, o condicionamento operante, a pré-ativação e a aprendizagem não
associativa.
ESTRUTURAS RELACIONADAS COM A MEMÓRIA IMPLÍCITA
Com relação à memória implícita ou não-declarativa, são várias as estruturas
cerebrais envolvidas. Essas estruturas abarcam regiões muito extensas do sistema
nervoso e ainda não foram totalmente identificadas. Estudos com pacientes amnésicos
e animais de laboratório sugerem que diferentes formas de memória implícita
dependam de diferentes regiões encenfálicas.
Basicamente, a memória para habilidades e hábitos requer a participação do
estriado (Squire, 1992; Squire et al.,1993; Mc Donalds e Norman, 1993), o
condicionamento clássico está relacionado a amígdala nas respostas emocionais
(McDonalds e White, 1993) e ao cerebelo nas respostas da musculatura esquelética
(Mcdonalds e White, 1993) e a aprendizagem não-associativa está relacionada as vias
reflexas (McDonalds e Whie, 1993; Squire et al., 1993).
O estriado, em especial o núcleo caudado, parece ter um papel importante no
estabelecimento de um tipo de aprendizagem implícita conhecida como hábito. As
conexões anatômicas do estriado sugerem que essa estrutura seria apropriada para
promover uma ligação entre estímulos e respostas (necessária para a formação de
hábitos), pois recebe projeções de várias áreas do córtex, incluindo as áreas sensoriais,
37
e as envia para estruturas subcorticais que fazem parte do sistema de controle dos
movimentos (Joel e Weiner, 2000).
Algumas evidências diretas do envolvimento do estriado com a memória
implícita vêm de estudos com pacientes portadores do mal de Huntington e da
doença de Parkinson – patologias relacionadas a disfunções dos núcleos da base.
Estes pacientes apresentam alguns prejuízos que são seletivos para tarefas que
requerem o uso da memória de procedimento (Bernheimer et al., 1973).
O papel do cerebelo no condicionamento clássico de respostas motoras, como
por exemplo, piscar o olho, foi estabelecido claramente por Thompson e cols.,
trabalhando com coelhos. Em seres humanos, o cerebelo parece desempenhar papel
semelhante neste tipo de tarefa (Leiner et al., 1993).
A amígdala está relacionada à memória emocional, ou ao aprendizado
emocional (Cahill et al., 1995), um tipo de memória implícita particularmente relevante
para os clínicos, pois algumas teorias que envolvem a amígdala e os medos
aprendidos, sugerem que essa região cerebral está envolvida em diversos transtornos
psiquiatricos, incluindo os trantornos de ansiedade, como os ataques de pânico, as
fobias específicas e o Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) (Hull, 2002; Villarreal e
King, 2001).
MEMÓRIA EM ANIMAIS
Em animais, a memória é classificada de acordo com as regiões cerebrais
recrutadas em cada tipo de aprendizagem (McDonald et al., 2004; Squire, 2004). Assim,
classificamos os diferentes tipos de memória em modelos animais, principalmente
38
como hipocampo dependente (referente à memória explícita) e hipocampo
independente (referente à memória implícita).
O hipocampo e suas estruturas relacionadas exercem um papel importante
para o processamento de informações relacionadas ao ambiente ou ao contexto; o
estriado está relacionado à memória de hábitos e ao condionamento clássico (Ferreira
et al., 2008; 2003); a amígdala à formação e armazenagem de memórias emocionais e
o córtex a processos visuais complexos da memória (Xavier, 1999).
EXTINÇÃO DE MEMÓRIAS EMOCIONAIS
O aprendizado emocional é extremamente necessário para a sobrevivência
do indivíduo. Contudo, uma vez adquiridas, as associações emocionais nem sempre
são manifestadas. Elas permanecem latentes e não são evocadas, a menos que
ocorra uma circunstância especial para isso (apresentação intensa de um o estímulo
utilizado para adquiri-las ou um quadro emocional que imite o quadro em que elas
foram originalmente adquiridas). Esta regulação das respostas emocionais sob
diferentes condições ambientais é essencial para a saúde mental, e a forma mais
simples de regulação destas respostas é a extinção, cujo início é desencadeado pela
omissão do estímulo incondicionado - em animais, por exemplo, retira-se o alimento
(reforçador) ou o choque (aversivo) da tarefa e observa-se diminuição da expressão
da resposta condicionada (Izquierdo, 2002).
Vale lembrar que memórias extintas não são memórias esquecidas, mas sim um
novo aprendizado. Por exemplo, se um indivíduo sofreu um seqüestro relâmpago na
saída de um banco, ele pode aprender que aquela agência bancária representa
39
perigo. Entretanto, ao voltar ao banco outras vezes e não sofrer um seqüestro, o
indivíduo aprende que nem sempre aquele local oferece perigo. Nesse caso, a
agência bancária é o estímulo condicionado e o seqüestrador, o estímulo
incondicionado. O pareamento entre estímulos gera a resposta condicionada do
indivíduo (medo de ir ao banco). Entretanto, repetidas ou prolongadas apresentações
do estímulo condicionado (ir ao banco), na ausência do estímulo incondicionado (não
ser sequestrado) promove a diminuição da resposta condicionada (diminuição do
medo). Essa nova aprendizagem é conhecida como extinção (Izquierdo, 2002). O
modelo animal de extinção de uma resposta comportamental está ilustrada na Fig.6.
TREINO TESTES
Estímulo condicionado (EC) + Estímulo incondicionado (EI) = EXTINÇÃO COMPORTAMENTAL__________
Fig. 3: Esquema da extinção comportamental. Nesse modelo animal, a câmara de condicionamento (EC)
é pareada aos choques nas patas (EI), o que faz com que a reexposição do animal ao contexto elicie a
resposta comportamental de medo no animal, o freezing ou congelamento. Repetidas ou prolongadas
reexposição do animal ao mesmo contexto, na ausência dos choques faz com que diminua o tempo de
freezing do animal diante da caixa, uma vez que ele aprendeu que aquele ambiente nem sempre
oferece perigo (LeDoux, 1993).
Há certos momentos em que este mecanismo de extinção pode não ocorrer
de forma satisfatória e as respostas emocionais podem se tornar exageradas ou serem
40
desencadeadas em situações inapropriadas, caracterizando um distúrbio de
ansiedade (Quirk e Mueller, 2008) ou de medo, como os distúrbios relacionados à
recordação de eventos traumáticos, como fobias específicas e o transtorno do estresse
pós-traumático – TEPT (Marsicano et al., 2002; Chhatwal et al., 2005; Pamplona et al.,
2006; Niyuhire et al., 2007), uma psicopatologia intrinsicamente relacionada com a
incapacidade do indivíduo de extinguir memórias aversivas, emocionalmente
motivadas e, portanto, um dos alvos de interesse desse estudo.
Considerando-se que o TEPT é um transtorno relacionado à exposição a
eventos traumáticos possivelmente com risco de vida, certamente acompanha a
humanidade ao longo de sua história. Contudo, pouco se encontra nos textos antigos.
Isso porque, até o final do seculo XX, foi considerado como manifestação de covardia
frente a guerra, ou seja, uma característica dos indivíduos fracos. Somente em 1980 o
DSM incluiu o TEPT e seus sintomas em uma categoria diagnóstica.
Ao longo da história moderna, o TEPT teve diversos nomes. Durante a Guerra
Civil Americana, foi chamado de “Coração Irritável” ou “Coração do Soldado”. Na I
Guerra Mundial, foi chamado de “Fadiga de Guerra”, “Choque Pós-Guerra” ou
“Histeria de Guerra”. Na II Guerra Mundial foi chamado de “Reação ao Estresse
Grave”.
A terminologia atual, Estresse Pós-Traumático, surgiu após a Guerra do Vietnã,
após a publicação de trabalhos realizados por pesquisadores que trabalhavam em
hospitais de veteranos de guerra americanos. Tal terminologia avança no sentido de
desvincular o transtorno de um quadro de fraquezas de caráter moral.
41
Além disso, e não raro esse transtorno pode se desenvolver não apenas em
veteranos de guerra, mas também em vítimas de violência como seqüestro, estupro,
roubo, perda de um ente querido e toda forma de violência física, psicológica ou de
atentado à vida que o indivíduo esteja sujeito. De qualquer forma, agentes
farmacológicos que promovessem a facilitação da extinção destas memórias
traumáticas poderiam ser úteis se somados a terapias cognitivo-comportamentais
(Quirk e Mueller, 2008; Masci C & Range B, 2001).
O sistema endocanabinóide tem sido alvo de diversas pesquisas nesse sentido.
Tem sido demonstrado que agonistas canabinóides parecem facilitar o processo de
extinção de memória, o que será discutido mais adiante.
MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DA MEMÓRIA EMOCIONAL
Os modelos animais utilizados em estudos de aprendizagem e memória
baseiam-se em teorias da Psicologia Experimental. São muitos os paradigmas utilizados.
Aqui, optamos por descrever os principais paradigmas utilizados no estudo da memória
emocional em animais.
ESQUIVA INIBITÓRIA
Durante a fase de treino da tarefa de esquiva inibitória, um animal e punido por
uma resposta, como, por exemplo, passar do compartimento claro para o
compartimento escuro de um aparelho de esquiva, procedimento conhecido como
step-through; ou descer de uma plataforma, procedimento conhecido com step-
down; e, dessa maneira, aprende a inibir esse comportamento. Na fase de teste, o
42
tempo (latência) que o animal demora a passar com as quatro patas ao
compartimento escuro, ou descer da plataforma ao piso de grades e registrado e
oaprendizado e aferido em função dessa latência.
CONDICIONAMENTO CLÁSSICO DE MEDO
Nessa tarefa um animal é colocado em um determinado ambiente (tipicamente
uma caixa de condicionamento) e, após poucos minutos, um estímulo condicionado
(CS), como um som ou uma luz, e pareado com um estímulo incondicionado (US)
aversivo, como por exemplo, um choque nas patas. Após esta experiência, ambos,
som e contexto (ambiente), adquirem capacidade de eliciar respostas características
de medo, como por exemplo, aumento da pressão arterial, da frequência cardiaca e
uma completa imobilidade do animal (comportamento conhecido como
congelamento ou “freezing”). Como essas respostas não são observadas após a
apresentação do CS sem ter sido páreado previamente com o US, essas respostas
podem ser interpretadas como respostas aprendidas e são muito utilizadas para
estudar a neurobiologia da aprendizagem e memória associada a eventos
emocionais.
CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO
Uma variação do condicionamento clássico de medo é o condicionamento de
medo ao contexto. Nesse paradigma, o choque nas patas é páreado com o próprio
ambiente (caixa de condicionamento), e não a outras pistas, como um som ou uma
luz. A associação do estímulo aversivo com o ambiente envolve um componente
43
espacial, sendo assim, mais utilizado na investigação me memórias dependentes de
hipocampo. O condicionamento de medo ao contexto, portanto, pode ser
considerada uma tarefa que avalia tanto memória emocional quanto a memória
espacial (Xavier, 1999).
44
EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA MEMÓRIA EMOCIONAL E NOS SISTEMAS DE
NEUROTRANSMISSÃO
Até o momento, nenhum estudo definitivamente provou a hipótese de que o
sono participa nos processos de formação de memórias, porém, um grande número
de evidencias sustenta esta ideia. Uma delas e a alteração da arquitetura do sono que
ocorre após o treino de uma tarefa de memória.
Em humanos, após uma tarefa de memória, observa-se aumento do sono REM
(De Koninck et al., 1989), e do mesmo modo, em animais (principalmente roedores), o
treino de várias tarefas é seguido por aumento do sono paradoxal (Lucero, 1970). O
aumento de sono paradoxal parece estar estritamente relacionado ao processo de
aprendizado: o sono retorna ao normal à medida que os animais resolvem a tarefa, e
não há aumento de sono paradoxal se não há aprendizado (Smith et al., 1980).
Observa-se também que a atividade neuronal que ocorre durante o período de
vigília parece ser reativada durante o sono. Sugere-se que estas reativações permitem
o fortalecimento de conexoes intercelulares entre elementos da rede neuronal, e a
incorporação da nova experiência à memória de longo prazo (Maquet, 2001). Já foi
demonstrado em ratos que os padrões espaço-temporais de disparos neuronais que
ocorrem no hipocampo durante a exploração de um novo ambiente, ou em uma
simples tarefa espacial, são reativados na mesma ordem durante o sono de ondas
lentas (Wilson & McNaughton, 1994). Resultados similares também foram observados
em humanos através de estudos de neuroimagem (Peigneux et al., 2001).
45
O processo de consolidação também envolve o fortalecimento de sinapses
(Dudai, 2004). Dados indicam que o fenômeno da potenciação de longa duração
(long-term potentiation, LTP) é o principal mecanismo envolvido na consolidação
sináptica, que ocorre preferencialmente durante o sono REM (Diekelmann & Born,
2010).
Entre os paradígmas utilizados para o estudo da relação entre sono e memória,
existe ainda a privação de sono. Já foi demonstrado que a privação de sono prejudica
o desempenho de humanos e animais em diversas tarefas de memória (Stickgold,
2005).
Em humanos, um grande corpo de evidências mostra que a privação de sono
antes da aprendizagem de novas informações prejudica a aquisição da memória
declarativa (Eichenbaum 2000) e não-declarativa, especialmente em tarefas motoras
e de procedimento (Karni e col, 1994; Smith, 2001; Walker & Stickgold, 2004).
Em animais também há um volume considerável de trabalhos evidenciando os
efeitos da perda de sono na aprendizagem de uma nova tarefa (Pearlman, 1979;
Smith, 1995; Bueno et al., 1994, 2000; Dametto et al., 2002; Moreira et al., 2003; Dubiela
et al., 2005; Walker & Stickgold, 2006).
Trabalhos com modelos animais conduzem a importância do sono
principalmente para a aquisição e consolidação de memórias dependentes da
função hipocampal.
Animais privados de sono apresentam prejuízo na versão espacial da tarefa do
labirinto aquático de Morris (Smith e Rose, 1996; Youngblood et al. 1997; Youngblood et
al. 1999), mas não na versão não-espacial desta mesma tarefa - não-dependente de
46
hipocampo (Smith e Rose, 1996).
Muitos estudos – inclusive, em nosso laboratório existe um grupo de estudo
bastante consolidado nesta área – têm se dedicado em investigar os efeitos da
privação de sono na memória emocional.
Observou-se que animais privados de sono apresentam acentuado prejuízo
neste tipo de tarefa. Principalmente naquelas que envolvem, além do conteúdo
emocional, o conteúdo espacial, como a esquiva inibitória (Bueno et al., 1994; Moreira
et al., 2003) e o condicionamento de medo ao contexto (Dametto et al., 2002;
McDermott et al., 2003; Ruskin et al., 2004).
Entretanto, com relação às tarefas que não dependem do hipocampo, como
o condicionamento de medo ao som, os resultados ainda são conflitantes. Há
trabalhos em que foram observados prejuízos nessa tarefa após privação de sono
(Dametto et al., 2002) e outros trabalhos que não observaram tais prejuízos (Bueno et
al., 1994; McDermott et al., 2003; Ruskin et al., 2004). Graves e colaboradores (2003),
observaram, em camundongos privados de sono, prejuízo de memória na tarefa de
condicionamento de medo ao contexto (dependente de hipocampo, mas não no
condicionamento de medo ao som (não-dependente de hipocampo).
Até o momento, os mecanismos envolvidos neste prejuízo de memória ainda
não foram esclarecidos, porém, muitas hipoteses já foram propostas e investigadas.
Algumas evidências indicam que a liberação de glicocorticoides resultante do
estresse, fator inerente a privação de sono, poderia ser a origem do prejuízo de
memória, já que concentrações elevados de corticosterona prejudicam o processo de
consolidação. Porém, Tiba e colaboradores (2008) demonstraram que o aumento de
47
corticosterona nos animais privados de sono não é responsavel pelo prejuízo de
memória, já que o tratamento com metirapona (inibidor da sintese de corticosterona)
não preveniu o déficit cognitivo. O mesmo resultado foi observado por Ruskin e
colaboradores (2004), com adrenalectomia. A retirada das adrenais, que imepede a
liberação de corticosterona em resposta ao estresse, não impede o prejuízo após
privação de sono. Isso não exclui a participação do estresse, mas sim desse hormônio
em particular.
A literatura científica tem mostrado que pacientes com o TEPT apresentam
diversas formas de distúrbios do sono REM, além de muitos pesadelos. No entanto,
diferenças metodológicas e a grande variabilidade entre os indivíduos tornam os
resultados ainda inconclusivos. É difícil afirmar se pacientes com predisposição para
distúrbios do REM são mais suscetíveis ao TEPT ou se os distúrbios do REM são apenas
uma conseqüência do TEPT. De qualquer forma, a relação entre o sono REM e o TEPT
parece evidente (ver revisões Spoormaker e Montgomery, 2008; Singareddy et al.,
2002).
INVESTIGANDO SISTEMAS DE NEUROTRANSMISSÃO
A auto-radiografia permite uma análise quantitativa de receptores em
pequenas estruturas encefálicas. É uma técnica mais precisa, em termos de
quantificação de receptores em determinadas estruturas encefálicas, em relação a
técnicas que utilizam fragmentos teciduais homogeneizados, como por exemplo, o
Western Blot. Isso porque a auto-radiografia permite relacionar os receptores
quantificados diretamente com as pequenas áreas encefálicas onde os receptores se
48
encontram.
Buscando entender como as alterações nos sistemas de neurotransmissão
causadas pela privação de sono influenciam os processos de memória (mais
especificamentea memória emocional), estudos de nosso laboratório têm investigado,
através da técnica de auto-radiografia, tais alterações.
Bueno e colaboradores (2000) mostraram que o prejuízo observado na tarefa
da esquiva inibitória em animais privados de sono pode ser revertido com o tratamento
crônico de pilocarpina, um agonista colinérgico. Esse resultado motivou a busca por
mecanismos (sistemas de neurotransmissão) associados ao prejuízo no desempenho
em tarefas de aprendizagem e memória após a privação de sono. Decidiu-se
investigar os efeitos da privação de sono na marcação de receptores muscarínicos M1
(Moreira et al., 2003), através da técnica de auto-radiografia. A ausência de efeitos
nesses receptores levou à investigação de outros sítios que modulariam o
funcionamento do sistema colinérgico. A partir de então, foi iniciada em nosso
departamento, uma série de investigações neuroquímicas e farmacológicas, a fim de
avaliar os efeitos da privação de sono em sistemas de neurotransmissão que
sabidamente modulam os processos de aprendizagem e memória.
Avaliou-se a modulação do sistema colinérgico pelos receptores gabaérgicos
(GABA). Isso porque o uso de benzodiazepínicos (BDZ- modulador GABAérgico)
provoca prejuízo de memória em humanos e em outros animais (Roth et al., 1984;
Curran, 1991 e porque o papel mnemônico do sistema GABA-BDZ parece estar
relacionado à associação deste sistema a neurônios colinérgicos da via septo-
hipocampal (Roth et al., 1984; Curran, 1991). Entretanto, os estudos com ensaio auto-
49
radiográfico e análise densitométrica não mostraram relação entre o complexo do
receptor GABA tipo A e os déficits de memória associados à privação de sono (Dubiela
et al., 2005).
No presente trabalho, investigamos os efeitos da privação de sono sobre os
receptores canabinóides do tipo 1 (Cb1). O sistema de neurotransmissão
endocanabinóide é um sistema modulatório, que atua em todo o sistema nervoso
central. Os receptores Cb1 encontram-se distribuídos amplamente por todo o cérebro,
sendo considerados os receptores acoplados à proteína G de maior abundância no
sistema nervoso central (SNC) (Howlett et al., 2002). Por sua ampla atuação e
modulação de diversos sistemas de neurotransmissão, como o GABA e o Glutamato, é
considerado um sistema de grande relevância tanto para o sono quanto para a
memória, entre outras funções. Saber se a privação de sono modifica o funcionamento
desse sistema, através do aumento ou diminuição de densidade dos receptores CB1
em determinadas áreas cerebrais pode ser importante na busca pelos mecanismos
que levam ao prejuízo de memória causados pela privação de sono.
50
DA CANNABIS AOS CANABINÓIDES
A Cannabis sativa possivelmente é a primeira planta não alimentícia cultivada
pelo homem. Achados arqueológicos datam de mais de 10.000 anos, quando a planta
era utilizada para a obtenção de fibras. Por volta de 2700 a.C. apareceram os
primeiros registros de uso terapêutico, descritos por Shen Nung1. Na Índia, o uso religioso
foi descrito por volta de 2000 a.C., quando se acreditava que a planta era um
presente dos deuses aos homens, capaz de provê-los de prazer e coragem; a planta
era dada às mulheres na noite de núpcias. No Oriente Médio o uso da Cannabis ainda
é aceito e considerado sagrado (Mechoulan, 1986; ver revisão de Abel, 1980).
Fig. 4: Breve histórico dos registros de uso da Cannabis em todo o mundo (modificado de Childers e
Breivogel, 1998 e gentilmente cedida por Bittencourt, RM, UFSC).
1 Considerado o “pai” da medicina chinesa.
51
No mundo, a Cannabis é a droga ilícita mais consumida desde 1960. No Brasil,
5,9% dos estudantes da rede pública de ensino já utilizaram maconha (CEBRID, 2004).
Ainda assim, foi apenas em 1964 que o seu principal composto ativo, o Δ9-tetra-
hidrocanabinol (THC), foi isolado e sua estrutura química caracterizada (Gaoni &
Mechoulan, 1964).
O SISTEMA ENDOCANABINÓIDE
O sistema endocanabinóide é constituído por receptores canabinóides,
neurotransmissores canabinóides (endocanabinóides) e as enzimas que catalisam sua
biossíntese e degradação.
RECEPTORES CANABINÓIDES
O sistema endocanabinóide foi descoberto em 1984, quando Howlett e Fleming
demonstraram que canabinóides naturais inibem a produção de adenosina
monofosfato cíclico (AMPc), um mensageiro secundário intracelular, sugerindo um
sistema de transdução de sinais mediado pela ativação de proteínas G. Essa
descoberta foi seguida pela identificação de um sítio de ligação para o Δ9-
tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) no cérebro de ratos (Devane et al., 1988), que culminou,
dois anos depois, na localização, clonagem e seqüenciamento do primeiro receptor
canabinóide, denominado CB1 (Herkenham et al., 1990) .
Atualmente, são conhecidos dois tipos de receptores canabinóides: os
receptores CB1 e CB2; embora existam evidências de pelo menos mais um tipo de
receptor canabinóide (Howlett et al., 2002). Esses receptores, ditos metabotrópicos, são
52
acoplados à proteína Gi/o e exercem seus efeitos fisiológicos pela inibição da
atividade da enzima adenilato ciclase, com conseqüente diminuição dos níveis
intracelulares de AMPc (Felder et al., 1993).
Fig. 5: Breve histórico dos avanços na investigação sobre os mecanismos de ação dos canabinóides
(modificado de Childers e Breivogel, 1998 e gentilmente cedida por Bittencourt, RM, UFSC).
Os receptores canabinóides estão distribuídos predominantemente no sistema
nervoso central, mas também são encontrados no sistema nervoso periférico em fibras
axonais, especialmente em botões terminais de neurônios pré-sinápticos (Katona et al.,
2000).
Altas concentrações de receptores CB1 foram encontradas nos gânglios da
base (substância negra, estriado e globo pálido), cerebelo, córtex, amígdala e
hipocampo (Herkenham et al., 1990). Níveis mais baixos de receptores CB1 foram
encontrados no hipotálamo e na medula espinhal, sendo praticamente ausentes nos
53
centros respiratórios do tronco cerebral (Robson, 2001).
Os receptores CB2, por sua vez, estão intimamente ligados às funções do
sistema imunológico, onde regulam a liberação de citocinas e a migração de células
imunológicas, podendo ser encontrados em diversos tecidos linfóides dentro ou fora do
SNC (Pertwee, 2005). Esses receptores foram encontrados em abundância no fígado,
timo, tonsilas palatinas, medula óssea e pâncreas; assim como em macrófagos,
monócitos e em uma ampla variedade de células imunológicas (Lynn e Herkenham,
1994), embora trabalhos recentes utilizando técnicas de neuroimagem tenham
detectado receptores CB2 no cerebelo, hipocampo e tronco cerebral. No entanto, as
funções desses receptores no SNC precisam ser mais estudadas (Onaivi et al., 2008).
LIGANTES ENDOCANABINÓIDES
Os primeiros ligantes endógenos dos receptores canabinóides foram isolados em
1992 (Devane et al., 1992). A anandamida2 (N-araquidonoil etanolamina) e o 2-
araquidonoil glicerol (2-AG) foram os primeiros endocanabinóides a serem descobertos
e são hoje os mais estudados, embora a busca por novos receptores e ligantes
endógenos do sistema endocanabinóide continue.
Mais recentemente identificou-se o 2-araquidonilglicerol eter (noladin eter), um
agonista seletivo dos receptores CB1; o O-araquidonil-etanolamina (virodamina), um
agonista parcial dos receptores CB2 e antagonista dos receptores CB1; e a N-
araquidonil-dopamina, um agonista seletivo dos receptores CB1 e potente agonista
dos receptores vanilóides (Bisogno et al., 2000). Embora diversos endocanabinóides
2 O termo “ananda” significa, do Sânscrito, felicidade serena ou bem-aventurança.
54
venham sendo identificados, pouco se sabe ainda sobre a função fisiológica dessas
moléculas. Portanto, a anandamida e o 2-AG continuam sendo considerados os
endocanabinóides protótipos (Bisogno et al., 2005).
MECANISMO DE AÇÃO E SÍNTESE
Conceitos clássicos que definem um neurotransmissor postulam que esses são
sintetizados em neurônios pré-sinápticos, armazenados em vesículas e liberados após a
ocorrência de uma despolarização. Porém, os endocanabinóides contrariam tais
conceitos, pois são sintetizados em neurônios pós-sinápticos, sendo o aumento de
cálcio intracelular o fator desencadeante. Uma vez sintetizados, os endocanabinóides
não são armazenados em vesículas, mas imediatamente liberados pelos neurônios pós-
sinápticos. Após a liberação, difundem-se para o neurônio pré-sináptico e agem nos
receptores canabinóides como mensageiros retrógrados (Di Marzo et al., 1998). Este
processo, denominado neurotransmissão retrógrada, muitas vezes diminui a
probabilidade de liberação de outros neurotransmissores, por interferirem em uma
etapa dependente de cálcio na liberação de vesículas sinápticas (Figura 6A).
Portanto, os endocanabinóides atuam sob demanda, modulando a atividade dos
neurônios pré-sinápticos após a ativação pós-sináptica, em situações fisiológicas ou
patológicas (Hoffman e Lupica, 2000).
De maneira geral, a síntese dos endocanabinóides ocorre a partir de fosfolipídios
de membrana que são hidrolisados por fosfolipases às respectivas formas finais dos
neurotransmissores (Figura 6B). A formação da anandamida, por exemplo, é realizada
pela hidrólise de uma N-acil-fosfatidiletanolamina por uma fosfolipase D específica. Já
55
o 2-AG é formado pela hidrólise de um acilglicerol contendo o araquidonato na
posição 2, catalisado por uma hidrolase de diacilgliceróis. Pouco se sabe a respeito
das vias de síntese específicas para os outros endocanabinóides (Bisogno et al., 2005).
Fig. 6: (A) Mecanismo de ação dos endocanabinóides – neurotransmissão retrógrada. iR: receptor
ionotrópico; mR: receptor metabotrópico; NT: neurotransmissor; T: carreador protéico (recaptação); Et:
etanolamina; AA: ácido araquidônico. Adaptado de Guzmán (2003). (B) Biosíntese e degradação dos
endocanabinóides anandamida e 2-araquidonilglicerol. Adaptado de Di Marzo et al. (2004).
A inativação dos endocanabinóides ocorre por dois processos cooperativos: a
recaptação e a degradação (Figura 6B). A etapa de recaptação pode ocorrer por
difusão simples e/ou por um processo facilitado por carreadores protéicos (Di Marzo et
al., 1994; Hillard e Campbell, 1997). Depois de recaptados, os endocanabinóides são
A B
56
metabolisados por enzimas de degradação específicas para cada um desses ligantes
endógenos. O metabolismo da anandamida ocorre nos neurônios pós-sinápticos por
uma hidrolase de amidas de ácidos graxos (Fatty Acid Amide Hydrolase - FAAH)
(Cravatt et al., 1996; Goparaju et al., 1999).
FUNÇÕES BIOLÓGICAS
Estudos clínicos e pré-clínicos têm demonstrado que os endocanabinóides e a
ativação concomitante de seus receptores causam uma pletora de efeitos, dentre os
quais pode-se destacar:
efeitos ansiolíticos, por meio de ações sobre o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
(Navarro et al., 1997);
modulação da resposta imune e inflamatória;
aumento da freqüência cardíaca; vasodilatação; e broncodilatação
(Calignano et al., 2000);
inibição da secreção de prolactina e hormônio de crescimento; e aumento na
secreção do ACTH (Pagotto et al., 2001);
inibição da secreção de testosterona; anovulação; e relaxamento uterino
(Wenger et al., 2001);
neuroproteção diante de situações de trauma e hipóxia (Panikashvili, 2001);
envolvimento na antinociceptividade (diminuição da sensibilidade a estímulos
dolorosos); controle do movimento; e inibição da memória de curto prazo (Lutz,
2002);
atividade antitumoral (Bifulco e Di Marzo, 2002);
57
modulação da ingestão de alimentos, devido àos seus efeitos sobre a liberação
de peptídeos e hormônios hipotalâmicos e à regulação dos mesmos pelos
esteróides (Di Marzo et al., 2004);
regulação do sono (Murillo-Rodríguez, 2008).
Todos esses efeitos pleiotrópicos foram concisamente resumidos por Di Marzo et
al. (1998) em uma única frase: “O sistema endocanabinóide reduz a sensação de dor,
controla o movimento, a memória, o sono, o apetite e ainda protege”.
POTENCIALIDADES TERAPÊUTICAS
O sistema endocanabinóide, definido como o conjunto de receptores
canabinóides, e seus respectivos ligantes endógenos, juntamente com as enzimas e
transportadores necessários ao seu funcionamento, constitui um alvo promissor no
desenvolvimento de novos fármacos. Partindo dos estudos iniciais dos efeitos da
Cannabis sativa em seres humanos, diversas pesquisas têm avaliado o potencial
terapêutico do sistema endocanabinóide.
Relatos na literatura demonstram a eficácia dos canabinóides em diversos
aspectos, como no controle da dor e alívio dos sintomas da esclerose múltipla,
atuando positivamente sobre os espasmos dolorosos e a rigidez muscular que
acompanham essa doença (Consroe et al., 1997).
A regulação do apetite é outra função já bem estabelecida, relacionada ao
sistema endocanabinóide. O Δ9-THC se mostrou eficaz em aumentar o apetite de
pacientes com anorexia associada à síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS),
levando a uma consequente melhora no estado nutricional geral desses pacientes
58
(Struwe et al., 1993). Por outro lado, o bloqueio dos receptores canabinóides CB1 por
antagonistas seletivos desses receptores causa uma redução do peso, tanto em
animais quanto em humanos (Colombo et al., 1998; Despres et al., 2005).
A ativação dos receptores canabinóides também mostra-se eficaz no combate
aos efeitos indesejáveis decorrentes da utilização de quimioterápicos para o
tratamento do câncer, tais como náuseas e ânsias de vômito (Carlini, 2004), além de
aumentar o apetite desses pacientes, melhorando sua condição clínica.
Devido à ação neuroprotetora exercida por substâncias canabinóides agindo
sobre os receptores CB, o sistema endocanabinóide possui um potencial terapêutico
promissor no controle da isquemia cerebral, epilepsia, doença de Parkinson e outras
doenças neurodegenerativas (Carlini, 2004; Makriyannis et al., 2005). Além disso,
evidências demonstram que os endocanabinóides podem vir a ser utilizados como
alvo farmacológico para a prevenção de prejuízos cognitivos geralmente associados
ao envelhecimento (Bilkei-Gorzo et al., 2005) ou de portadores da doença de
Alzheimer (Mazzola et al., 2003).
Ainda, outros estudos sugerem um importante papel do sistema
endocanabinóide na modulação de processos de aprendizado e memória (Lichtman,
2000; Takahashi et al., 2005; Pamplona et al., 2008). Dessa forma, a manipulação
farmacológica deste sistema pode contribuir na busca de uma terapêutica para
patologias com sintomas de ordem cognitivo-emocional, como a depressão (Hill e
Gorzalka, 2005a; 2005b) e os distúrbios de ansiedade relacionados à recordação de
eventos traumáticos, como fobias específicas ou o Transtorno de Estresse Pós-
Traumático (TEPT) (Marsicano et al., 2002; Chhatwal et al., 2005).
59
Estudos mais detalhados mostram que os receptores CB1 são amplamente
encontrados na região da amígdala, principalmente em terminais pré-sinápticos de
neurônios GABAérgicos. Por estarem ligados a proteína Gi (inibitória), os receptores
canabinóides, quando ativados, atuam inibindo a neurotransmissão nesta região
(Marsicano e Lutz, 1999; Azad et al., 2003). Os receptores CB1 encontrados nesta região
parecem estar crucialmente envolvidos no controle de diversos estados emocionais
como na extinção de memórias aversivas (Marsicano et al., 2002).
Tendo em vista as várias ações exercidas pelos canabinóides exógenos no
cérebro e as recentes descobertas da relevância dos eCB em uma série de funções
fisiológicas, existe um interesse emergente no papel dos canabinóides como
moduladores dos estados emocionais e de memória (Kathuria et al., 2003; Viveros et al.,
2005). Alguns estudos demonstram que a administração de drogas agonistas do
sistema canabinóide prejudicam a aquisição e consolidação de memórias aversivas
(Ferrari et al., 1999; Mishima et al., 2001; Varvel et al., 2001; Pamplona & Takahashi,
2006a), enquanto que antagonistas dos receptores CB1 freqüentemente melhoram
estes processos.
60
CANABINÓIDES, SONO E EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL
RELAÇÃO ENTRE CANABINÓIDES E SONO
Embora haja poucos estudos que investigaram a influência de substâncias
canabinóides no sono, é possível observar que existe uma modulação do fenômeno,
mediada pelo sistema canabinóide.
Em animais, um estudo mostrou que ratos privados de sono apresentavam
comportamento mais agressivo após administração de THC, o que não acontecia com
ratos não privados de sono (Tufik et al., 1977). A explicação para tal fenômeno parece
estar no fato do THC modular – aumentando - a liberação dopaminérgica. Isso,
somado a supersensibilidade nos neurônios dopaminérgicos D2, causada pela
privação de sono, poderia causar o comportamento agressivo dos animais. De
qualquer forma, o resultado deste trabalho não determinou exatamente o papel dos
canabinóides no sono dos animais.
Por outro lado, estudos utilizando técnicas em Biologia Molecular também vêm
investigando as funções do sistema endocanabinóide, inclusive, no sono. Técnicas de
PCR possibilitaram detectar, por exemplo, que os endocanabinóides parecem
participar do rebote de sono. Isso porque a privação de sono não modificou a
expressão do mRNA para o receptor CB1, mas o rebote de sono provocou uma
pequena elevação nestes níveis (Navarro et al, 2003). Em outro estudo, utilizando a
mesma técnica, os autores avaliaram a expressão do mRNA para receptor CB1 a cada
dia de privação de sono, até um total de 5 dias de privação de sono. Eles
encontraram (assim como ocorre com os efeitos farmacológicos de drogas
61
canabinóides) um efeito “dose-resposta” no fenômeno: 1 dia de privação de sono
aumentou significativamente a expresão do mRNA de receptor CB1; 3 dias de
privação de sono diminuiu a expressão do mRNA abaixo dos níveis normais e; em 5 dias
de privação de sono, a expressão do mRNA voltou a aumentar, mas ficou em um
estágio intermediário (maior que os níveis normais, menor do que no primeiro dia de
privação de sono) (Jiang et al., 2006).
Em humanos, um estudo avaliou o sono de indivíduos saudáveis e concluiu que
a administração aguda de maconha leva a um decréscimo na porcentagem,
duração e densidade de sono REM e aumenta a quantidade de sono de ondas lentas.
Já, na administração crônica, os efeitos da maconha sobre o sono REM persistem
(decréscimo na porcentagem, duração e densidade), mas ocorre tolerância dos
efeitos para o sono de ondas lentas, que vai gradualmente retornando aos níveis
basais, mesmo com a administração crônica da droga (Gillin et al., 2005).
É fato que a descoberta desse sistema de neurotransmissão é bastante recente
e que, provavelmente, há muito a ser descoberto ainda (como, por exemplo, outros
neurotransmissores desta família). Entretanto, o que se tem até agora já nos dá uma
idéia da complexidade do papel desse sistema no sistema nervoso central. É
necessário que se realize ainda uma série de estudos para que se possa elucidar todos
os mecanismos deste sistema, mas até aqui, cabe salientar que a ativação do
receptor CB1, seja por exo ou endocanabinóides, é capaz de modular o sono REM, por
vezes diminuindo, por vezes aumentando, graças a um efeito “dose-resposta” (Murillo-
Rodriguez, 2008).
62
RELAÇÃO ENTRE CANABINÓIDES E EXTINÇÃO DE MEMÓRIA
A relização de pesquisas envolvendo o uso medicinal da Cannabis deixou de
ser realizada durante quase duas décadas, devido à questões legais, que levavam à
dificuldade para obtenção da droga e das autorizações necessárias para a realização
de tais estudos. Assim, desde o final da década de 70 até o início dos anos 2000,
praticamente não se encontram trabalhos nessa área de investigação. Nesse sentido,
o desenvolvimento de drogas canabinóides sintéticas ou de animais knock-out para
receptores canabinóides tornaram-se ferramentas poderosas que podem facilitar o
estudo do sistema canabinóide sem que o pesquisador tenha que enfrentar uma
verdadeira batalha jurídica, devido a ilegalidade da Cannabis.
Foi a partir da utilização de uma espécie de camundongo knock-out que
Marsicano e colaboradores (2002) demonstraram que camundongos deficientes de
receptores CB1 apresentavam forte prejuízo na extinção de memória no teste de
condicionamento de medo ao som, sem, no entanto, afetar a aquisição e a
consolidação da memória. Ainda neste trabalho, os autores demonstraram que
apenas a apresentação do som durante as sessões de extinção já foram suficientes
para elevar os níveis de endocanabinóides no complexo basolateral da amígdala,
região relacionada à memória emocional.
Já, em um estudo farmacológico, Pamplona e colaboradores (2006),
observaram que o agonista canabinóide WIN 55-212-2 facilitou a extinção da memória
de medo contextual tanto 24 horas quanto 30 dias após o condicionamento. Este
agonista facilitou também a extinção das memórias de medo condicionado ao som e
espacial (labirinto aquático). No entanto, o agonista canabinóide não influenciou a
63
evocação da memória nem o sistema sensoriomotor. Em 2008, Pamplona e
colaboradores, estenderam estes achados, observando que drogas agonistas
facilitaram a extinção de curto prazo (30 minutos de reexposição no contexto, 24 horas
após o condicionamento) e a extinção de longo prazo (7 dias depois, teste livre de
drogas). Os autores também testaram animais que, 24 horas após o condicionamento,
foram igualmente tratados com drogas, mas reexpostos apenas por 3 minutos. Neste
caso, não houve diferença entre os grupos e nem entre as sessões de teste, indicando
que mesmo sob efeito da droga facilitadora, os animais não extinguem o medo
condicionado se não forem reexpostos ao ambiente por tempo suficiente para
dissociar o contexto do estímulo incondicionado.
RELAÇÃO ENTRE SONO E EXTINÇÃO DE MEMÓRIA
Trabalhos que estudam especificamente a relação entre o sono e a extinção
de memória ainda são bastante escassos na literatura.
Em animais, existem poucos estudos referentes à investigação dos efeitos da
privação de sono na extinção de memórias. Pearlman (1973), relatou que a privação
de sono REM imediatamente após a experiência de pré-extinção bloqueou a
facilitação da extinção latente, em ratos, na tarefa de condicionamento operante.
Entretanto, no que se refere à memória emocional aversiva, trabalhos começaram a
surgir, assim como os estudos com canabinóides, a partir da década de 2000.
Silvestri (2005), observou que apenas 6h de privação de sono prejudicou a
extinção de memória de medo à luz, mas não afetou o condicionamento de medo
contextual. Em 2008, Silvestri & Root observaram que a administração de um agonista
64
de receptores NMDA após o treino, prejudicou a extinção apenas em animais privados
de sono. Já a mesma administração antes do teste facilitou a extinção, mas também,
apenas em animais privados, indicando uma interação entre a condição “privado-não
privado” e os efeitos da droga.
Fu e colaboradores (2007) investigaram os efeitos da privação de sono
especificamente sobre o processo de consolidação de extinção de memórias. Estes
autores observaram que 6 horas de privação de sono imediatamente após a primeira
reexposição ao contexto previamente pareado com os choques não prejudicou a
consolidação da extinção.
Investigar os efeitos da privação de sono sobre o processo de extinção de
memórias aversivas em animais é fundamental para elucidar os mecanismos
envolvidos em psicopatologias relacionadas ao medo.
Em humanos, estudos têm mostrado que, além de eventos estressantes ou
traumáticos levarem ao desenvolvimento de distúrbios de sono (Lavie, 2001), a
persistência desses distúrbios pode ser um fator preditivo para o desenvolvimento de
futuras psicopatologias relacionadas ao medo (Lavie, 2001; Koren et al., 2002), como as
fobias específicas e o Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT), um transtorno de
ansiedade caracterizado pela incapacidade de adquirir e consolidar o aprendizado
da extinção (Milad et al., 2009).
Apesar de ser uma discussão recente e ainda escassa de literatura, a relação
entre memória emocional, sono e sistema canabinóide, se faz cada vez mais evidente.
A importância em aprimorar os conhecimentos sobre os mecanismos de ação destes
processos biológicos através de investigações comportamentais e farmacológicas
65
extrapola o âmbito da pesquisa básica, contribuindo com o crescente avanço no
estudo de diversos transtornos de ansiedade (principalmente no TEPT) e distúrbios de
sono REM, para que possam ser estabelecidos diagnósticos e tratamentos cada vez
mais eficazes.
66
OBJETIVOS
________________________________
1. Avaliar os efeitos da privação de sono sobre a aquisição e a consolidação da
extinção de memória emocional, no condicionamento de medo ao contexto;
2. Avaliar os efeitos do antagonista canabinóide AM251 na retenção da memória
emocional, no condicionamento de medo ao contexto, após privação de sono;
3. Avaliar a densidade de receptores CB1 no encéfalo de ratos Wistar, após 96
horas de privação de sono.
67
HIPÓTESES
________________________________
A nossa hipótese foi que a privação de sono prejudicasse os processos de
extinção do condicionamento de medo ao contexto, uma vez que a extinção refere-
se a um novo aprendizado e que a literatura científica demonstra que a privação de
sono prejudica o aprendizado desta tarefa.
Além disso, esperávamos que, de alguma forma, o sistema canabinóide fosse
alterado pela privação de sono, devido a sua ampla distribuição por todo o Sistema
Nervoso Central e seu papel modulatório em sistemas de neurotransmissão
sabidamente envolvidos com o ciclo sono-vigília, como os sistemas dopaminérgico,
gabaérgico, glutamatérgico e serotoninérgico. Sendo assim, poderíamos observar tal
relação por meio da marcação de receptores CB1 após a privação de sono, ou por
meio da administração de uma droga canabinóide que pudesse reverter o prejuízo de
memória causado pela privação de sono.
68
MATERIAIS E MÉTODOS
________________________________
ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar macho, pesando entre 250 e 350g, provenientes do
Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade
Federal de São Paulo (UNIFESP). Cada gaiola-moradia continha 5 animais, dispostos no
mesmo grupo desde o desmame. O mesmo grupo social era transferido para as
gaiolas-moradia do biotério do Departamento de Psicobiologia da UNIFESP ao menos
10 (dez) dias antes do início de cada experimento, para aclimatação ao novo
ambiente. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura
(23°C ± 2°C) e luminosidade (ciclo claro-escuro de 12 horas, com as luzes acesas às
7:00). Ração e água foram disponibilizadas ad libitum nas gaiolas-moradia. Todos os
experimentos foram realizados entre 12:00 e 16:00 horas. Todos os procedimentos foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UNIFESP (processo nº 1545/08).
Os animais foram individualmente manipulados pelo experimentador por 5
minutos, durante 5 dias, para habituação. No sexto dia, os animais foram identificados
individualmente, por meio de marcações com ácido pícrico.
69
TÉCNICA DE PRIVAÇÃO DE SONO
A privação de sono foi realizada pelo método modificado das plataformas
múltiplas (Suchecki e Tufik, 2000). Esse método consiste em manter em cada tanque de
privação de sono os sujeitos provenientes da mesma gaiola-moradia, além de
disponibilizar um número maior de plataformas do que de sujeitos, evitando assim o
estresse da imobilização, do isolamento social e da intrusão de sujeitos estranhos ao
grupo.
O aparato de privação de sono é constituído por um largo tanque de aço inox
(123 x 44 x 44 cm), contendo 10 plataformas feitas em tubos de PVC e preenchidas
com cimento (6 cm diâmetro x 10 cm altura). O tanque é preenchido com 9 cm de
altura de água, ou sejá, até 1 cm abaixo da altura das plataformas. Durante os
eventos de atonia muscular, característicos do sono paradoxal, o animal posicionado
acima da plataforma circular, inclina-se ou cai na água e, conseqüentemente,
desperta.
Um dia após a identificação dos sujeitos foi realizada a habituação destes ao
tanque de privação de sono e às plataformas. Os animais eram mantidos no tanque
com água por 45 minutos ao dia, durante 3 dias, inclusive para os animais do grupo
Controle (que não seriam privados de sono). Aliás, esse procedimento se estendeu ao
grupo Controle (CTRL) durante o período de privação de sono do grupo experimental
(PS – privação de sono), porém por 30 minutos, ao longo de 4 dias. Objetivamos assim,
diminuir as diferenças causadas pelo estresse da água e do novo ambiente, para que
os resultados obtidos com o grupo experimental fossem puramente decorrentes do
70
efeito da privação de sono, per se. Os tanques eram limpos diariamente, assim como
era feita a troca da água dos bebedouros e da ração, para evitar fungos. A ração e a
água foram disponibilizadas ad libitum durante todo o período.
71
CÂMARA DE CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO
A câmara de condicionamento aversivo foi utilizada para avaliar memória
emocional nos experimentos 1, 2 e 3. Essa câmara consiste em uma caixa acrílica de
paredes pretas, medindo 30 x 30 x 30 cm. O assoalho é composto por barras metálicas
arredondadas, (0,4 cm de diâmetro) posicionadas paralelamente, a 1,2 cm de
distância entre elas e conectadas a um gerador de choques elétricos (AVS Projetos
Especiais, Brasil). A tampa da câmara é feita em acrílico transparente, o que permite a
filmagem dos procedimentos.
TREINO DO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO
No dia da sessão de treino, cada animal foi exposto ao contexto por 2 minutos
para exploração do ambiente. Foram então, disparados 5 choques nas patas (0,8 mA,
1 s) com 29 s de intervalo entre cada choque. Após o último choque, o animal foi
deixado na caixa por mais 1 minuto, antes de ser recolocado em sua gaiola-moradia.
O tempo de freezing (congelamento), grooming (auto-limpeza) e o número de rearings
(levantares) foram avaliados nos dois primeiros minutos antes da liberação dos
choques, para a obtenção da resposta basal dos animais; e no minuto adicional que o
animal permanece no contexto após a liberação do último choque. Nesta etapa,
utilizamos a escala a seguir, para classificar a resposta do animal frente ao estímulo
aversivo:
72
Tabela 1: Escala de resposta comportamental frente ao estímulo aversivo
Escala Resposta ao choque
0 Não há resposta ao choque
1 Movimento das patas (“sapateado”)
2 Vocalização
3 Salto
TESTE DE AQUISIÇÃO/CONSOLIDAÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL
O teste de aquisição/consolidação de memória (Teste 1) foi realizado 24 horas
após o treino do condicionamento, quando os animais foram reexpostos ao contexto
durante 5 minutos, sem a apresentação dos choques. Foram mensurados o tempo de
freezing, tempo de grooming e número de rearings durante a reexposição.
PROTOCOLOS DE EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL
Nos experimentos em que foi avaliada a extinção de memória
aversiva/emocional em ratos privados de sono, foram realizadas uma sessão de treino
e duas sessões de teste (reexposição), com intervalos de 7 dias entre cada sessão. Essa
tarefa permite que o animal associe um estímulo aversivo ao contexto onde ele está
inserido, ou sejá, à câmara de condicionamento, ou contexto, como será denominada
daqui em diante.
73
TESTES DE EXTINÇÃO DE MEMÓRIA
A primeira sessão de reexposição ao contexto (Teste 1) foi realizada sete (7) dias
após o treino do condicionamento. Cada animal foi reexposto individualmente ao
contexto durante 30 minutos, sem a apresentação do estímulo aversivo (choques nas
patas). A segunda sessão de reexposição ao contexto (Teste 2) foi realizada sete (7)
dias após o Teste 1, utilizando-se os mesmos procedimentos deste.
O período prolongado de reexposição parece ser apropriado para avaliar a
extinção de memória, uma vez que nos permite avaliar a diminuição gradual da
resposta comportamental de medo dos animais (freezing) durante a mesma sessão
(Suzuki et al., 2004, Pamplona et al., 2008). Além disso, como a extinção é um novo
aprendizado, o tempo de reexposição parece ser suficiente para que o animal
aprenda que aquele ambiente não é mais aversivo, diferente do que aconteceria se
utilizássemos sessões de reexposição por tempos menores (ex: 5 minutos), em que
poderia haver a reconsolidação do medo nos animais (De Oliveira Alvares, 2008)
Os testes foram computados e representados graficamente em 6 intervalos de 5
minutos. O tempo de freezing, tempo de grooming e o número de rearings foram
computados em ambos os testes.
74
DILUIÇÃO E ADMINISTRAÇÃO DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251
O AM251 é uma droga que interage nos receptores canabinóides CB1 como
antagonista deste sistema, embora estudos recentes apontem essa substância como
um agonista inverso do sistema endocanabinóide (Sink et al., 2010).
Essa droga foi diluída em DMSO, Tween80 e salina (1:1:8 ratio) e administrada a
um volume de 1 ml/kg. Foi realizada uma curva dose-resposta nas doses de 0,5mg/kg,
2,5mg/kg, 5,0mg/kg ou veículo.
As doses foram baseadas em estudos prévios de Arenos et al., 2006, Chambers
et al., 2006, Rodgers et al., 2005 e Sink et al., 2010.
Em um dos estudos, ratos Sprague-Dawley apresentaram aumento na
retenção da memória emocional, no condicionamento de medo ao contexto, com a
dose de 4,0 mg/kg de AM251, admininistrado via i.p., 30 minutos antes do treino (Sink et
al., 2010).
75
PROCEDIMENTO AUTO-RADIOGRÁFICO GERAL
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO DOS CÉREBROS
Os animais foram eutanasiados por decapitação e os cérebros foram
rapidamente removidos (entre 2 e 3 minutos), congelados em gelo seco e mantidos a -
80ºC. Para o processamento histológico, os cérebros foram seccionados em criostato (-
18ºC) da região do bulbo olfatório até o bulbo caudal, em secções de 20 m de
espessura. Como a marcação de receptores in vitro inclui uma série de lavagens, existe
um grande risco de as secções de tecido cerebral serem removidas das lâminas. A fim
de evitar esse problema, as secções cerebrais foram colocadas sobre lâminas
revestidas com gelatina.
Iniciando pelo bulbo olfatório, foram recolhidas duas secções para as lâminas
histológicas (a primeira secção era aderida a uma lâmina, que pertence a um
conjunto denominado de Ligante 1 e a segunda secção era aderida em outra lâmina
pertencente a um conjunto denominado de Ligante 2) e eram descartadas 25
secções. Este procedimento foi repetido até atingir a região do bulbo caudal.
Utilizamos neste estudo, o conjunto de lâminas do Ligante 1 para fazer a marcação de
recceptores canabinóides CB1; e deixamos o conjunto de lâminas do Ligante 2
congelados para estudos futuros, em que podemos fazer a marcação para outro
receptor, por exemplo, o CB2, ou outro receptor de nossa escolha.
Outra medida adotada para evitar a remoção das secções das lâminas era
deixá-las secando depois de prontas, em temperatura ambiente, por 10 minutos,
aproximadamente. Após essa preparação, as lâminas permaneceram à temperatura
76
de -80ºC até o dia da marcação radioativa.
INCUBAÇÕES
No dia da dosagem radioativa, as lâminas foram retiradas do freezer e mantidas
em temperatura ambiente. Antes da fase de incubação com o radioligante (que será
descrito mais adiante, na sessão “Marcação de receptores CB1), as lâminas foram
imersas na solução tampão apropriada. Esta etapa do procedimento, denominada de
pré-incubação, elimina o ligante endógeno do tecido, evitando assim, que ocorra
uma competição com a substância radioativa. No entanto, é possível omitir a pré-
incubação, caso o neurotransmissor endógeno em questão seja facilmente
degradado pelas enzimas presentes no tecido ou caso a afinidade da substância
radioativa com o receptor seja maior que a da substância endógena.
A fase de incubação resumiu-se à colocação das lâminas na solução tampão
apropriada contendo o radioligante, cuja concentração foi previamente determinada
pelos trabalhos de Breivogel et al. (1997). As lâminas com as secções de tecidos para a
ligação inespecífica devem ser incubadas ao mesmo tempo, nas mesmas condições,
adicionando-se a elas uma grande concentração de uma droga deslocadora ou
droga fria. Essa droga fria é um ligante específico para o receptor em questão, que
competirá na ocupação do receptor com o radioligante para determinar a ligação
inespecífica.
A fase subseqüente, denominada de lavagem, consiste em remover o excesso
de ligante radioativo em solução tampão. Em seguida, as lâminas passam por uma
imersão em água destilada a 4ºC, destinada a remover o excesso de sais da solução
77
tampão, e são secas em temperatura ambiente.
EXPOSIÇÃO E REVELAÇÃO DE FILMES
Depois de marcadas radioativamente com o ligante de interesse e secas, as
lâminas foram organizadas de forma que em um mesmo cassete contenha as secções
cerebrais de um animal controle e de um animal experimental. Essas lâminas são
colocadas dessa forma em um mesmo cassete, em conjunto com o padrão calibrado
(Amersham Canadá, Oakville, ON).
Em uma sala escura, os filmes sensíveis ao trítio ([³H] – Hyperfilm, Amersham
Canada, Oakville, ON), foram colocados sobre as lâminas e mantidos à temperatura
de 4ºC, por 6 semanas, até o dia da revelação. Após o período de exposição, os filmes
foram revelados com revelador Kodak D-19 e fixador Kodak Rapid Fixer, de acordo
com as instruções do fabricante.
ANÁLISE DENSITOMÉTRICA
Após a revelação, os filmes foram codificados para evitar o reconhecimento dos
grupos a serem analisados. A quantificação dos receptores foi feita por análise
computadorizada de imagem (MCID System, Imaging Research Inc., St. Catharines,
ON). Inicialmente, o sistema de análise calcula a média dos valores de densidade
óptica para cada região cerebral delimitada dentro de cada secção. Em seguida, a
média dos valores dessa mesma região é quantificada para todas as secções dentro
de cada cérebro. O valor final em Ci/g de tecido é a média da região cerebral de
todos os animais dentro de cada grupo.
78
As regiões anatômicas foram definidas de acordo com o atlas de Paxinos &
Watson (1998).
79
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
________________________________
EXPERIMENTO 1: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA AQUISIÇÃO DA
EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO
O objetivo desse experimento foi avaliar se a privação de sono antes da
primeira reexposição ao contexto pareado com os choques prejudicaria a aquisição
da extinção de memória aversiva, condicionada ao contexto.
Todos os animais foram previamente habituados à manipulação do
experimentador e ao método de privação de sono, de acordo com o que está
descrito na sessão “Materiais e Métodos”.
No dia experimental 1 (d1), foi realizado o treino do condicionamento de medo
ao contexto. Após o treino, os animais permaneceram em suas gaiolas-moradia até o
dia experimental 4 (d4), quando foi iniciada a privação de sono do grupo PS. O grupo
CTRL permaneceu em suas gaiolas-moradia a maior parte de todo o período
experimental, exceto durante os 30 minutos, no período da tarde, em que eram
colocados no tanque de privação de sono. Imediatamente após o término de 96 horas
de privação de sono os animais eram retirados do tanque de privação de sono e
colocados em uma gaiola com maravaha seca por 20 minutos antes de serem
reexpostos ao contexto (Teste 1), no dia experimental 7 (d7).
80
O Teste 1 avaliou, além da evocação da memória do condicionamento, a
aquisição da extinção desta memória, uma vez que o tempo de exposição permitiu
observar este fenômeno. Após sete dias (d14) foi realizado o Teste 2, que avaliou a
consolidação da extinção e o fenômeno de recuperação espontânea.
TREINO
(5 x 0,8 mA, 1s)
TESTE 1(30 min)
TESTE 2(30 min)
7 dias 7 diasCTRL
3 dias 7 diasPS PS
4 dias
Fig. 7: Desenho experimental 1. Avaliação dos efeitos da privação de sono na aquisição da extinção de
memória emocional no condicionamento de medo ao contexto. Grupo “privação de sono” (PS, n = 12) e
grupo “controle” (CTRL, n = 12).
REGISTRO DE DADOS
O experimento foi gravado em câmera Sony Handycam DCR-SR42 e os
comportamentos de congelamento (freezing), auto-limpeza (grooming) e levantares
(rearing) foram avaliados posteriormente pelo experimentador.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
O tempo de freezing, de grooming e o número de rearings foram avaliados por
81
Análise de Variância (ANOVA) de medidas repetidas, utilizando CTRL x PS como fator
grupo e os intervalos da sessão de extinção como fator tempo, considerando
significativo o p < 0,05. O teste a posteriori de Tukey foi utilizado quando necessário.
82
EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA
CONSOLIDAÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO CONDICIONAMENTO DE
MEDO AO CONTEXTO
O objetivo deste experimento foi avaliar se a privação de sono após a primeira
reexposição ao contexto páreado com os choques prejudicaria a consolidação da
extinção de memória aversiva, condicionada ao contexto.
Neste experimento, a privação de sono foi realizada imediatamente após a
primeira reexposição (Teste 1). O Teste 2 foi realizado 3 dias após o término da privação
de sono, ou sejá, 7 dias após o Teste 1 (Fig. 1B). Os procedimentos de habituação,
condicionamento, privação de sono, testes e comportamentos avaliados foram os
mesmos descritos para o experimento 1.
REGISTRO DE DADOS
O experimento foi gravado em câmera Sony Handycam DCR-SR42 e os
comportamentos de congelamento (freezing), auto-limpeza (grooming) e levantares
(rearing) foram avaliados posteriormente pelo experimentador.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
O tempo de freezing, de grooming e o número de rearings foram avaliados por
Análise de Variância (ANOVA) de medidas repetidas, utilizando CTRL x PS como fator
grupo e os intervalos da sessão de extinção como fator tempo, considerando
83
significativo o p < 0,05. O teste a posteriori de Tukey foi utilizado quando necessário.
TREINO
(5 x 0,8 mA, 1s)
TESTE 1(30 min)
TESTE 2(30 min)
7 dias 7 diasCTRL
3 dias7 diasPS PS
4 dias
Fig. 8: Desenho experimental 2. Avaliação dos efeitos da privação de sono na consolidação da extinção
de memória emocional no condicionamento de medo ao contexto. Grupo “privação de sono” (PS, n =
12); Grupo “controle” (CTRL, n = 10).
84
EXPERIMENTO 3: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251
NA RETENÇÃO DA MEMÓRIA AVERSIVA DO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO
CONTEXTO, EM RATOS PRIVADOS DE SONO
O objetivo desse experimento foi avaliar se o antagonista canabinóide AM251
seria capaz de prevenir o prejuízo de memória causado pela privação de sono, na
retenção do condicionamento de medo ao contexto.
Neste experimento, a privação de sono foi realizada antes do treino da tarefa. A
privação de sono no grupo REB começou 1 dia antes para quer, antes do treino, os
animais tivessem 24 horas de oportunidade de sono.
A droga AM251 foi administrada via i.p. 30 minutos antes do treino.
O treino da tarefa ocorreu como os experimentos anteriores. O teste de
aquisição/consolidação da memória ocorreu 24 horas após o treino, em um teste de
reexposição de 5 minutos.
REGISTRO DE DADOS
O experimento foi gravado em câmera Sony Handycam DCR-SR42 e os
comportamentos de congelamento (freezing), auto-limpeza (grooming) e levantares
(rearing) foram avaliados posteriormente pelo experimentador.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
O tempo de freezing, de grooming e o número de rearings foram avaliados por
85
Análise de Variância (ANOVA) Fatorial, considerando significativo o p < 0,05. O teste a
posteriori de Tukey foi utilizado quando necessário.
1 dia1 dia
TREINO
(5x 0,8mA, 1s)
TESTE 1(30 min)
1 diaPS4 dias
REB
PS
AM251 (adm. i.p. 30 min pré-treino)
1 dia
5 diasCTRL
PS4 dias
Fig. 9: Desenho experimental 3. Avaliação dos efeitos do antagonista canabinóide AM251 na retenção da
memória aversiva do condicionamento de medo ao contexto, em ratos privados de sono. Grupo
“privação de sono” (PS, n = 9); Grupo “rebote/recuperação de sono” 24h (REB, n = 9); Grupo “controle”
(CTRL, n = 9).
86
EXPERIMENTO 4: ANÁLISE AUTO-RADIOGRÁFICA DE RECEPTORES CANABINÓIDES (CB1)
EM RATOS PRIVADOS DE SONO
Foi realizado o mapeamento e quantificação da marcação de receptores
endocanabinóides CB1 em estruturas anatômicas do cérebro de ratos, após privação
ou recuperação de sono, com o objetivo de avaliar os efeitos da privação de sono per
se na transmissão endocanabinóide.
Os animais foram habituados ao experimentador e ao método de privação de
sono, como descrito anteriormente.
A privação de sono foi realizada como descrito no Experimento 1.
Após 96 horas de privação de sono do grupo PS e oportunidade de
recuperação do sono por 24 horas no grupo REB (d6), todos os animais foram
eutanasiados por decaptação e os encéfalos foram retirados e congelados a -80ºC.
Os procedimentos de processamento histológico estão descritos na seção anterior.
MARCAÇÃO DE RECEPTORES CB1
A marcação de receptores CB1 seguiu a descrição de Breivogel et al. (1997). As
lâminas contendo as secções cerebrais foram pré-incubadas (o que permite a retirada
dos endocanabinóides que estariam ligados aos receptores CB1) por um período de 20
minutos em solução tampão (20 mM HEPES com 0.5% (w/v) BSA e 1 mM MgCl2; pH 7,0;
à 30ºC). Em seguida, foram incubadas na mesma solução tampão durante 80 minutos
a 30°C contendo 1 nM [3H]WIN 55212-2 (agonista total canabinóide, marcado
radioativamente com trício). Após o período de incubação, as lâminas foram lavadas
87
4 x 10 minutos em solução tampão à 25ºC, seguida por um rápido banho em água
deionizada, de 0 à 4ºC.
Os procedimentos de revelação dos filmes e análise estão também descritos
detalhadamente na seção anterior.
ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Os dados para os receptores canabinóides foram analisados por meio de
Análise de Variância de uma via (ANOVA), para cada área cerebral analisada,
seguidos de teste à posteriori de Duncan, quando necessário.
88
RESULTADOS
________________________________
EXPERIMENTO 1: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA AQUISIÇÃO DA
EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO CONTEXTO
No teste 1, a ANOVA de medidas repetidas mostrou efeito no fator grupo [F1,20 =
31,56; p < 0,001], efeito no fator tempo [F5,100 = 24,952; p < 0,001] e também, interação
entre os fatores tempo e grupo [F5,100 = 19,47; p < 0,001]. O teste a posteriori de Tukey
revelou que o grupo PS permaneceu menos tempo em freezing do que o grupo CTRL
nos primeiros 5 minutos do teste 1 (p = 0,002), indicando prejuízo na evocação da
memória do condicionamento ou no desempenho comportamental.
No grupo CTRL, o tempo de freezing diminuiu gradualmente ao longo dos 30
minutos de sessão, indicando a ocorrência do processo de aquisição da extinção de
memória. Não foram observadas diferenças no tempo de freezing, ao longo do tempo,
no grupo PS (Fig. 10).
No teste 2, a ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito grupo [F1,20 =
3,39; p = 0,080], mas revelou efeito no fator tempo [F5,100 = 2,98; p = 0,014] e interação
entre os fatores tempo e grupo [F5,100 = 2,63; p = 0,028]. O teste a posteriori de Tukey
revelou que no grupo CTRL, o tempo de freezing nos primeiros cinco minutos de
reexposição foi significativamente maior do que nos minutos [20-25] (p=0,002) e [25-30]
89
(p=0,017). No entanto, no grupo PS, não houve diferença no tempo de freezing
durante a sessão, nem entre grupos.
Com relação ao grooming no Teste 1, a ANOVA de medidas repetidas mostrou
que houve um efeito no fator grupo [F1,20 = 31,56; p < 0,001] e no fator tempo [F5,100 =
24,952; p < 0,001], mas não houve interação entre os fatores. [p < 0,001]. Entretanto, o
teste a posteriori de Tukey feito separadamente para os fatores grupo e tempo mostrou
que o grooming no grupo PS é significativamente maior que no grupo CTRL a partir do
terceiro intervalo [15-20] da sessão, até o final.
No teste 2, a ANOVA de medidas repetidas encontrou efeito grupo [F1,20 = 8,53; p
= 0,008] e efeito no fator tempo [F5,100 = 8,84; p < 0,001], mas não na interação entre os
fatores tempo e grupo [p = 0,789] (Fig. 11)
Com relação ao número de rearing no teste 1, a ANOVA de medidas repetidas
mostrou efeito no fator grupo [F1,20 = 4,34; p = 0,05], efeito no fator tempo [F5,100 = 10,86;
p < 0,001] e interação entre os fatores tempo e grupo [F5,100 = 19,45; p < 0,001]. O teste a
posteriori de Tukey revelou que o grupo PS fez mais rearing do que o grupo CTRL nos
primeiros 5 minutos do teste 1 (p = 0,012), indicando aumento no comportamento
exploratório e/ou ambulação vertical desses animais.
No teste 2, a ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito grupo [p =
0,669], mas revelou efeito no fator tempo [F5,100 = 12,28; p < 0,001] e interação entre os
fatores tempo e grupo [F5,100 = 3,30; p = 0,008]. O teste a posteriori de Tukey revelou que
o número de rearing no grupo PS foi significativamente menor nos intervalos [20-25] (p <
0,001) e [25-30] (p < 0,001) do que nos intervalos anteriores, em relação a ele mesmo,
mas não teve diferença do grupo CTRL (Fig. 12).
90
Fig. 10: Efeitos da PS no tempo de freezing no condicionamento de medo ao contexto no Teste 1 e no
Teste 2 do Experimento 1. Os dados representam média + SEM. (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo).
#diferença entre grupos; * diferença entre sessões; p<0.05.
Fig. 11: Efeitos da privação de sono no número de grooming nos Testes 1 e 2 do Experimento 1. Os dados
representam a média e + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). *diferença entre grupos; #diferença
entre sessões. p<0.05.
Fig.12: Efeitos da privação de sono no número de rearings nos Testes 1 e 2 do Experimento 1. Os dados
representam a média e + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). # diferença entre grupos; *
diferença entre sessões. p<0.05.
91
Comparando o tempo de freezing nos primeiros cinco minutos, entre os testes 1
e 2, a ANOVA de medidas repetidas encontrou efeito no fator grupo [F1,20 = 22,86; p <
0,001], no fator teste [F1,20 = 20,01; p < 0,001] e na interação entre os fatores teste e
grupo [F1,20 = 29,83; p < 0,001]. O teste a posteriori de Tukey revelou o tempo de freezing
no primeiro intervalo do Teste 1 foi significativamente maior do que no Teste 2, no grupo
CTRL (p < 0,001). (Fig. 13).
Comparando o tempo de grooming nos primeiros cinco minutos, entre os testes
1 e 2, a ANOVA de medidas repetidas encontrou efeito no fator grupo [F1,20 = 15,47; p <
0,001], mas não encontrou efeito no fator teste [F1,20 = 2,44; p = 0,134], nem na
interação entre os fatores teste e grupo [F1,20 = 1,54; p = 0,229].
Fig. 13: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing, grooming e número de rearings entre os primeiros
cinco minutos dos testes 1 e 2, no condicionamento de medo ao contexto, no Experimento 1. Os dados
representam média + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). # diferença entre grupos; + diferença entre
sessões; p<0.05.
Comparando o número de rearings nos primeiros cinco minutos, entre os testes 1
e 2, a ANOVA de medidas repetidas encontrou efeito no fator grupo [F1,20 = 21,04; p <
0,001], mas não no fator teste [F5,100 = 10,86; p = 0,263). Houve interação entre os fatores
92
teste e grupo [F1,20 = 11,04; p=0,003]. O teste a posteriori de Tukey revelou que os
animais do grupo PS apresentaram mais comportamento de rearing, em relação ao
grupo CTRL, no teste 1 (p < 0,001). No teste 2, não houve diferença no comportamento
de rearing, entre os grupos (p = 0,612). Entre o grupo CTRL, o rearing foi
significativamente maior no teste 2, em relação ao teste 1 (p = 0,031). Não houve
diferença no rearing entre o grupo PS, nos testes 1 e 2 (p = 0,396) (Fig. 13).
93
EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO NA
CONSOLIDAÇÃO DA EXTINÇÃO DE MEMÓRIA EMOCIONAL NO CONDICIONAMENTO DE
MEDO AO CONTEXTO
No teste 1, a ANOVA de medidas repetidas não mostrou efeito significativo no
fator grupo [F1,16 = 0,77; p =0,392], mas encontrou efeito no fator tempo [F5,80 = 38,31; p <
0,001]. Também não houve interação entre os fatores tempo e grupo [F5,80 = 0,06; p =
0,998]. Ambos os grupos diminuíram o tempo de freezing ao longo da sessão,
indicando a aquisição do processo de extinção do medo condicionado. No teste 2, a
ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito no fator grupo [F1,16 = 0,17; p =
0,686], mas encontrou efeito no fator tempo [F5,80 = 32,48; p < 0,001]. Não houve
interação entre os fatores tempo e grupo [F5,80 = 0,25; p = 0,935] (Fig. 14).
Com relação ao grooming no Teste 1, a ANOVA de medidas repetidas mostrou
que não houve efeito no fator grupo [p = 0,787], mas houve efeito no fator tempo [F5,80
= 7,33; p < 0,001], mas não houve interação entre os fatores [p = 0,136]. No teste 2, a
ANOVA de medidas repetidas encontrou efeito grupo [F1,16 = 5,05; p < 0,001] e efeito no
fator tempo [F5,80 = 3,84; p = 0,004], mas não na interação entre os fatores tempo e
grupo [p = 0,064] (Fig. 15).
Com relação ao rearing no Teste 1, a ANOVA de medidas repetidas mostrou
que não houve efeito no fator grupo [p = 0,569], mas houve efeito no fator tempo [F5,80
= 6,04; p < 0,001], mas não houve interação entre os fatores [p = 0,999]. No teste 2, a
ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito grupo [p = 0,164] e efeito no fator
94
tempo [F5,80 = 8,61; p < 0,001], mas não houve interação entre os fatores tempo e grupo
[p = 0,802] (Fig. 16).
Fig.14: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing no condicionamento de medo ao contexto no
Teste 1 e no Teste 2 do Experimento 2. Os dados representam média + SEM. (CTRL, n=10/grupo) ou (PS,
n=12/grupo). * diferença entre sessões; p<0.05.
Fig.15: Efeitos da privação de sono no número de grooming nos Testes 1 e 2 do Experimento 2. Os dados
representam a média e + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). *diferença entre grupos; #diferença
entre sessões. p<0.05.
95
Fig. 16: Efeitos da privação de sono no número de rearings nos Testes 1 e 2 do Experimento 2. Os dados
representam a média e + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). *diferença entre grupos;
#diferença entre sessões. p<0.05.
Comparando o tempo de freezing nos primeiros cinco minutos, entre os testes 1
e 2, a ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito no fator grupo [p = 0,766],
mas encontrou efeito no fator teste [F1,16 = 43,41; p < 0,001]. Não houve interação entre
os fatores teste e grupo [p = 0,234]. Ambos os grupos fizeram significativamente menos
freezing no Teste 2, em relação ao Teste 1 (Fig. 17).
Fig. 17: Efeitos da privação de sono no tempo de freezing, grooming e número de rearings entre os primeiros
cinco minutos dos testes 1 e 2 do condicionamento de medo ao contexto, no Experimento 2. Os dados
representam média + SEM (CTRL, n=10/grupo) ou (PS, n=12/grupo). * diferença entre sessões; p<0.05.
96
Comparando o grooming nos primeiros cinco minutos, entre os testes 1 e 2, a
ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito no fator grupo [F1,16 = 0,003; p =
0,952], mas encontrou efeito no fator teste [F1,16 = 14,07; p = 0,002]. Não houve
interação entre os fatores teste e grupo [F1,16 = 0,38; p = 0,544].
Comparando o rearing nos primeiros cinco minutos, entre os testes 1 e 2, a
ANOVA de medidas repetidas não encontrou efeito no fator grupo [F1,16 = 0,62; p =
0,441], mas encontrou efeito no fator teste [F1,16 = 13,16; p=0,002]. Não houve interação
entre os fatores teste e grupo [F1,16 = 1,46; p = 0,244] (Fig. 17).
97
EXPERIMENTO 3: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTAGONISTA CANABINÓIDE AM251
NA RETENÇÃO DA MEMÓRIA AVERSIVA DO CONDICIONAMENTO DE MEDO AO
CONTEXTO, EM RATOS PRIVADOS DE SONO
No teste de retenção realizado no experimento 3, a ANOVA Fatorial mostrou que
houve efeito no fator condição de sono [F2,95 = 16,32; p < 0,001], mas não houve efeito
dose [p = 0,300], nem interação entre os fatores [p = 0,758]. O teste à posteriori de
Tukey para o fator grupo demonstrou que todos os grupos são significativamente
diferentes entre si. Independente da dose de droga administrada, o grupo REB fez
significativamente menos freezing que o grupo CTRL (p = 0,021); e o grupo PS fez
significativamente menos freezing que os grupos REB (p = 0,011) e CTRL (p < 0,001) (Fig.
18).
Com relação ao grooming, a ANOVA Fatorial mostrou efeito no fator condição
de sono [F2,95 = 29,06; p < 0,001], mas não houve efeito dose [p = 0,332], nem interação
entre os fatores [p = 0,920]. O teste à posteriori de Tukey para o fator grupo demonstrou
que, independente da dose de droga administrada, o grupo PS fez significativamente
mais grooming que o grupo REB (p < 0,001) e que o grupo CTRL (p < 0,001) (Fig. 19).
Com relação ao rearing, a ANOVA Fatorial mostrou efeito no fator condição de
sono [F2,95 = 5,33; p = 0,006], mas não houve efeito dose [p = 0,813], nem interação
entre os fatores [p = 0,386]. O teste à posteriori de Tukey para o fator grupo demonstrou
que, independente da dose de droga administrada, o grupo PS fez significativamente
mais rearing que o grupo REB (p = 0,015) e que o grupo CTRL (p = 0,017) (Fig. 20).
98
*
*
#
*
Fig. 18: Tempo de freezing entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com AM251 (vei; 0,5; 2,5; 5,0 mg/kg) à
esquerda e; tempo total de freezing entre os grupos, independente da dose administrada, à direita. Os
dados representam média + SEM; * diferença em relação ao CTRL; # diferença em relação ao REB. (n =
9/grupo); p< 0,05.
0
50
100
150
200
250
Ctrl Reb PS
groo
mig
(s)
Ctrl Reb PS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
vei 0,5 2,5 5,0
groo
min
g (s
)
Ctrl Reb PS
*
** *
Fig. 19: Tempo de grooming entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com AM251 (vei; 0,5; 2,5; 5,0 mg/kg) à
esquerda e; tempo de grooming entre os grupos, independente da dose administrada, à direita. Os dados
representam média + SEM; * diferença em relação ao CTRL. (n = 9/grupo); p< 0,05.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ctrl Reb PS
rear
ing
(s)
Ctrl Reb PS
0
2
4
6
8
10
12
vei 0,5 2,5 5,0
rear
ing
(s)
Ctrl Reb PS
*
Fig. 20: Número de rearing entre os grupos CTRL, REB e PS, tratados com diferentes doses de AM251 (vei;
0,5; 2,5; 5,0 mg/kg) à esquerda e; número de rearing entre os grupos, independente da dose de droga
administrada, à direita. Os dados representam média + SEM; * diferença em relação ao CTRL. (n =
9/grupo); p< 0,05.
99
EXPERIMENTO 4: ANÁLISE AUTO-RADIOGRÁFICA DE RECEPTORES CANABINÓIDES (CB1)
EM RATOS PRIVADOS DE SONO
A ANOVA de uma via feita para cada estrutura analisada mostrou diferença
significativa nos núcleos amígdalóides analisados: o núcleo basolateral (BLA), núcleo
amígdalóide central (CeA) e núcleo basomedial (BMA). Nas demais estruturas, a
análise estatística mostrou que a privação de sono não alterou a marcação de
receptores CB1.
O teste a posteriori de Duncan mostrou que nos três núcleos amígdalóides
analisados, o grupo REB possui maior densidade, em relação ao grupo PS e o grupo
CTRL. O grupo PS, entretanto, apresentou densidade mediana, em relação aos dois
outros grupos.
Com relação à densidade de receptores CB1 no BLA, o grupo PS foi
significativamente maior que o grupo REB (p = 0,012); e o grupo REB foi
significativamente menor que o grupo CTRL (p < 0,001).
Com relação à densidade de receptores CB1 no CeA, o grupo PS foi
significativamente maior que o grupo REB (p = 0,049) e menor que grupo CTRL (p <
0,001); e o grupo REB foi significativamente menor que o grupo CTRL (p < 0,001).
Com relação à densidade de receptores CB1 no BMA, o grupo PS foi
significativamente maior que o grupo REB (p = 0,004); e o grupo REB foi
significativamente menor que o grupo CTRL (p < 0,001).
100
Tabela 2 – Marcação de [3H]WIN 55212-2 em receptores CB1
Controle Rebote
Privação de
Sono
(n= 10 ) (n= 10) (n= 10)
Estrutura analisada Sigla média ± S.E. média ± S.E. média ± S.E.
Córtex Frontal de Associação FrA 0,56 ± 0,04 0,53 ± 0,03 0,62 ± 0,03
Córtex Motor Primário M1 0,62 ± 0,03 0,58 ± 0,02 0,60 ± 0,04
Córtex Motor Secundário M2 0,63 ± 0,05 0,59 ± 0,03 0,59 ± 0,04
Córtex Cingulado Área 1 Cg1 0,62 ± 0,03 0,58 ± 0,03 0,60 ± 0,03
Córtex Cingulado Área 2 Cg2 0,61 ± 0,04 0,62 ± 0,04 0,61 ± 0,04
Córtex Sensorial CtxS 0,58 ± 0,04 0,59 ± 0,03 0,55 ± 0,03
Córtex Pré-Límbico PrL 0,63 ± 0,04 0,58 ± 0,04 0,58 ± 0,03
Córtex Infralímbico IL 0,61 ± 0,03 0,54 ± 0,04 0,55 ± 0,03
Córtex Entorrinal Lateral LEnt 0,38 ± 0,03 0,43 ± 0,02 0,46 ± 0,03
Córtex Entorrinal Medial MEnt 0,43 ± 0,05 0,49 ± 0,03 0,49 ± 0,05
Córtex Occipital CtxO 0,47 ± 0,05 0,51 ± 0,02 0,56 ± 0,03
Núcleo Accumbens Core AcbC 0,54 ± 0,03 0,58 ± 0,04 0,53 ± 0,05
Núcleo Accumbens Shell AcbS 0,53 ± 0,03 0,59 ± 0,04 0,55 ± 0,04
Caudado Putamen Dorso Medial CPuDM 0,54 ± 0,04 0,52 ± 0,03 0,54 ± 0,04
Caudado Putamen Dorso Lateral CPuDL 0,58 ± 0,04 0,57 ± 0,04 0,54 ± 0,04
Caudado Putamen Ventro Lateral CPuVL 0,59 ± 0,05 0,59 ± 0,04 0,54 ± 0,04
Globo Pálido GP 0,53 ± 0,05 0,50 ± 0,02 0,49 ± 0,02
Substância Negra - Parte Reticular SNR 0,73 ± 0,05 0,69 ± 0,03 0,70 ± 0,04
Hipotálamo Anterior HA 0,46 ± 0,04 0,43 ± 0,02 0,45 ± 0,03
Hipotálamo Central HC 0,42 ± 0,05 0,43 ± 0,03 0,43 ± 0,05
Hipotálamo Posterior HP 0,48 ± 0,03 0,48 ± 0,02 0,50 ± 0,03
101
Camada externa plexiforme do bulbo olfatório EPI 0,51 ± 0,03 0,59 ± 0,03 0,62 ± 0,03
Camada interna plexiforme do bulbo olfatório IPI 0,33 ± 0,05 0,41 ± 0,03 0,41 ± 0,02
Núcleo anterior olfatório - parte lateral AOL 0,71 ± 0,04 0,57 ± 0,05 0,67 ± 0,05
Núcleo anterior olfatório - parte medial AOM 0,64 ± 0,05 0,53 ± 0,04 0,62 ± 0,05
Núcleo anterior olfatório - parte ventral AOV 0,65 ± 0,05 0,54 ± 0,05 0,64 ± 0,05
Núcleo anterior olfatório - parte dorsal AOD 0,60 ± 0,06 0,52 ± 0,04 0,62 ± 0,05
Formação hipocampal - CA1 CA1 0,55 ± 0,03 0,49 ± 0,03 0,57 ± 0,03
Formação hipocampal - CA3 CA3 0,56 ± 0,04 0,46 ± 0,03 0,54 ± 0,03
Formação hipocampal - giro denteado DG 0,60 ± 0,03 0,50 ± 0,04 0,57 ± 0,03
Amígdala - porção basolateral BLA 0,68 ± 0,04 0,42 ± 0,03* 0,57 ± 0,04#
Amígdala - porção central CeA 0,65 ± 0,05 0,34 ± 0,04* 0,48 ± 0,04*#
Amígdala - porção basomedial BMA 0,68 ± 0,03 0,40 ± 0,04* 0,57 ± 0,03#
Tronco encefálico - parte dorsal dos núcleos da
rafe DRD 0,53 ± 0,06 0,49 ± 0,03 0,60 ± 0,04
Tronco encefálico - parte ventral dos núcleos da
rafe DRV 0,55 ± 0,06 0,50 ± 0,03 0,63 ± 0,05
Tronco encefálico - parte ventrolateral dos
núcleos da rafe DRVL 0,51 ± 0,07 0,48 ± 0,03 0,60 ± 0,04
Marcação inespecífica NS 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
* diferença em relação ao CTRL; # diferença em relação ao REB.
102
DISCUSSÃO
_______________________________
No experimento 1 do presente estudo, foi possível observar que o tempo de
freezing do grupo CTRL diminuiu ao longo do tempo de reexposição, no Teste 1.
Entretanto, o grupo PS apresentou pouco tempo de freezing durante todo o período
(“efeito-chão”). No Teste 2, o grupo CTRL iniciou a sessão de reexposição com tempo
de freezing maior do que o apresentado no último intervalo de tempo do teste anterior
(Teste 1 [25-30]), porém, menor do que o apresentado no primeiro intervalo desse
mesmo teste [0-5]. A comparação entre o primeiro intervalo [0-5] dos Testes 1 e 2
mostrou que houve extinção de memória inter-sessões no grupo CTRL, como já era
esperado.
Em relação ao grupo PS, antes de discutirmos o processo de extinção, cabe
salientar que o pouco tempo de freezing apresentado por este grupo no Teste 1 pode
indicar tanto um prejuízo na evocação da memória, quanto um prejuízo no
desempenho dos animais, para expressar a resposta de medo (freezing), devido a um
aumento na atividade locomotora, causada pela privação de sono. De uma forma ou
de outra, a privação de sono prejudicou a resposta comportamental de medo frente
ao contexto, no Teste 1. No teste 2, no entanto, o grupo PS continuou apresentando
baixo tempo de freezing, similar ao grupo CTRL, ainda que o teste tenha sido realizado
7 (sete) dias após o término da privação de sono, tempo suficiente para que os
animais não estivessem mais sob um possível efeito de aumento da atividade
103
locomotora. Dessa forma, podemos admitir que a privação de sono não prejudicou a
aquisição da extinção de memória, uma vez que, se isso houvesse ocorrido, os animais
do grupo PS apresentariam maior tempo de freezing no Teste 2 (como se para esse
grupo, fosse o Teste 1).
Os resultados do experimento 1 corroboram, em parte, o estudo de Silvestri
(2005), que demonstrou que 6 horas de privação de sono imediatamente após o treino
não prejudicou a aquisição da extinção de memória no condicionamento de medo
ao contexto. O desenho experimental deste trabalho avaliou os efeitos da privação de
sono na consolidação de memória no treino do condicionamento e, posteriormente,
os efeitos dessa interferência na extinção de memória. Entretanto, até o momento não
foram encontrados estudos sobre os efeitos da privação de sono especificamente
sobre a aquisição da extinção de memória.
O pouco tempo de freezing do grupo PS, como já dito anteriormente, pode ter
ocorrido tanto por um (1) prejuízo na evocação da memória de medo causada pela
privação ou mesmo por um (2) prejuízo na expressão da resposta comportamental,
devido ao aumento de atividade locomotora, também causada pela privação de
sono.
No experimento 1 pudemos observar o aumento de comportamentos que
possivelmente competem com o freezing, como o rearing e o grooming (Blanchahard
and Blanchahard, 1969).
O rearing (levantamentos) e o grooming (limpeza) são comportamentos normais
nos animais, entretanto, quando exagerados, podem estar relacionados a
104
hiperatividade motora, sendo portanto, comportamentos antagônicos ao freezing,
cuja expressão se dá a partir de um comportamento de imobilidade.
Estudos relacionados à variabilidade individual no comportamento exploratório
mostram que os animais podem ser separados em grupos que expressam alto ou baixo
número de rearings, classificados como High Rearings (HR) ou Low Rearing (LR),
respectivamente (Thiel et al., 1998).
O rearing é uma categoria comportamental relacionada à defesa e à
sobrevivência por meio da exploração do ambiente. É um comportamento útil na
formação de mapas cognitivos (Pawlak and Schwarting, 2002). Em uma tarefa de
labirinto radial, animais do subgrupo HR utilizam mais a estratégia de referência, (ou
egocêntrica) para realizar a tarefa do que os LR (Gorisch and Schwarting, 2006).
Quando exacerbado, o comportamento de rearing pode indicar um estado ansioso
(Gray and McNaughton, 2000, Borta and Schwarting, 2005). O estudo de Borta e
colaboradores mostrou que os animais HR permanecem menos tempo nos braços
abertos do labirinto em cruz elevada (LCE) do que os animais LR (Borta and Schwarting,
2005).
Trabalhos que avaliaram diferenças relacionadas com aprendizagem e
emocionalidade nas respostas comportamentais dos animais selecionados em
subgrupos HR e LR mostraram que esses animais aprendem da mesma forma no treino
da tarefa de esquiva inibitória (Borta and Schwarting, 2005). Quando a esquiva é
realizada com choques mais altos do que o habitual, os animais do subgrupo LR
apresentam escores mais altos na retenção da tarefa, sugerindo melhor consolidação
da memória, visto que não diferem na responsividade à dor frente ao choque utilizado.
105
Os animais do subgrupo LR exibem latências maiores no teste e retestes da esquiva
inibitória mesmo quando o treino é realizado com choque de intensidade
extremamente baixa (0.15mA) (Borta and Schwarting, 2005). Esses dados sugerem que
os animais do subgrupo LR apresentam melhor consolidação e déficit de extinção
frente a tarefas aversivamente motivadas.
A alta frequência de rearing entre o grupo PS, desencadeada seja pelo
aumento da hiperatividade do animal, seja por um estado comportamental ansioso,
poderia ter prejudicado a expressão da resposta de medo do animal, por ser um
comportamento antagônico ao freezing. Por outro lado, pode indicar também um
déficit no processo de evocação da memória, uma vez que não evocando o medo
condicionado, faria sentido que o animal explorasse o ambiente.
Levando em consideração que a partir do terceiro intervalo da sessão de
reexposição [10-15], a frequência de rearing já havia diminuído pela metade,
podemos pensar que o animal poderia expressar mais freezing no contexto, a partir
desse momento. Diferente disso, houve o aumento do comportamento de grooming
no grupo PS.
O grooming é uma medida comportamental que pode ser referente
simplesmente à auto-limpeza, mas também pode representar um mecanismo de
defesa (pela eliminação de odores) e, quando exacerbado, esse comportamento
pode indicar um comportamento de estereotipia, observado em modelos animais de
Transtorno Obsessivo-Compulsivo (TOC), ou de mania, observado em modelos animais
de Transtorno Bipolar (Spruijt et al., 1992, Feusner et al., 2009). Tanto que um dos
métodos de indução de estado maníaco, em modelos animais de Transtorno Bipolar é
106
a privação de sono paradoxal (Gessa et al., 1995). Isso porque a privação de sono
parece aumentar a sensibilidade dos receptores D2, levando ao aumento
generalizado na atividade locomotora (Tufik et al., 1978, Nunes Junior et al., 1994).
Certamente que esse aumento generalizado da atividade locomotora pode
influenciar também em ambos os comportamentos de rearing e grooming (Spruijt et
al., 1992).
Como proposto por Bueno e colaboradores (Bueno et al., 2000), a administração
de drogas que aumentam a atividade locomotora antes da reexposição ao contexto
pareado com os choques, pode prejudicar a evocação da resposta comportamental
de medo do animal, mas isso depende da duração e intensidade do estímulo aversivo
apresentado no treino. Verificamos no presente trabalho, que o tempo de freezing
apresentado pelo grupo PS permaneceu muito baixo até o final da sessão, diferente
do rearing e do grooming.
Apesar disso, e levando em consideração os resultados do Teste 2, do
Experimento 1, parece que a privação de sono não impediu a aquisição da extinção
da memória aversiva, pois, se esse fosse o caso, os animais teriam apresentado um
tempo de freezing significativamente maior que o grupo CTRL no teste 2.
No experimento 2, foi demonstrado que 96 horas de privação de sono
imediatamente após a primeira reexposição ao contexto previamente pareado com
os choques (Teste 1), não prejudicou a consolidação da extinção do medo
condicionado.
107
No Teste 1 do experimento 2, ambos os grupos apresentaram diminuição no
tempo de freezing, ao longo dos 30 minutos de reexposição, indicando a aquisição da
extinção de memória. Observamos que 96 horas de privação de sono paradoxal
imediatamente após este momento não prejudicou a consolidação da extinção,
observada em ambos os grupos, CTRL e PS.
Esse resultado corrobora o estudo de Fu e colaboradores, que demonstraram
que 6 horas de privação de sono, imediatamente após a primeira reexposição, não
prejudica a consolidação da extinção do condicionamento de medo ao contexto (Fu
et al., 2007), embora o presente estudo tenha realizado 96 horas de privação de sono.
Interessante observar que tanto Silvestri (2005) quanto Fu e colaboradores (2007)
observaram que a privação de sono prejudicou o processo de extinção do
condicionamento de medo a estímulos discretos, mas não do condicionamento de
medo ao contexto. Entretanto, grande parte dos estudos demonstra que a privação
de sono paradoxal prejudica a aprendizagem de tarefas contextuais (Dametto et al.,
2002, McDermott et al., 2003, Moreira et al., 2003, Ruskin et al., 2004), mas não prejudica
a aprendizagem de tarefas de medo condicionado a estímulos (Bueno et al., 1994,
Dametto et al., 2002).
A aprendizagem de ambas as formas de condicionamento envolvem a
amígdala, responsável pelo processamento de conteúdos emocionais e pela
associação do EC com o EI (LeDoux, 1993b). Entretanto, o condicionamento de medo
ao contexto é uma tarefa que avalia uma memória também dependente de
hipocampo (Graves et al., 2001, Graves et al., 2003). Para que ocorra a aprendizagem
de uma tarefa desse tipo, é necessária a formação de um mapa cognitivo para o
108
reconhecimento do ambiente (Rudy et al., 2004). Por outro lado, o condicionamento
de medo a um estímulo discreto (como um som ou uma luz), avalia uma estratégia de
memória que independe do hipocampo (Bast et al., 2003).
Sabe-se que a privação de sono altera o funcionamento de estruturas como o
hipocampo, o córtex pré-frontal e a amígdala (Peigneux et al., 2001, Walker and
Stickgold, 2006, Dang-Vu et al., 2008).
Ainda que os mecanismos pelos quais ocorra a extinção de memória não
estejam totalmente esclarecidos, sabe-se até então, que o córtex pré-frontal e a
amígdala são estruturas fortemente relacionadas à extinção de memórias de medo
(Barad, 2006, Quirk and Beer, 2006).
Assim como os resultados de Silvestri (Silvestri, 2005) e Fu e colaboradores (Fu et
al., 2007), essa parte de nosso estudo (Experimentos 1 e 2) também mostrou que a
privação de sono não interfere na extinção de memória do condicionamento de medo
ao contexto. No entanto esses mesmos autores observaram prejuízo na extinção do
condicionamento a um estímulo discreto.
Por outro lado, quando se trata do processo de aquisição de uma memória,
observou-se que animais privados de sono apresentam acentuado prejuízo em tarefas
que envolvem, além do conteúdo emocional, o conteúdo espacial, como a esquiva
inibitória (Bueno et al., 1994; Moreira et al., 2003) e o condicionamento de medo ao
contexto (Dametto et al., 2002; McDermott et al., 2003; Ruskin et al., 2004). Entretanto,
em relação às tarefas que não dependem do hipocampo, como o condicionamento
de medo ao som ou à luz, os resultados ainda são conflitantes. Dametto e
109
colaboradores (2002) observaram prejuízo nesse tipo de tarefa após privação de sono,
porém, uma gama considerável de trabalhos não observou tais prejuízos (Bueno et al.,
1994; McDermott et al., 2003; Ruskin et al., 2004).
Isso nos leva a sugerir que o processo de extinção do condicionamento de
medo ao contexto possa ocorrer por vias distintas do aprendizado original dessa tarefa,
possivelmente envolvendo estruturas neocorticais (Anagnostaras et al., 2001). Essa seria
uma possível explicação para o fato da privação de sono afetar o aprendizado
original de tarefas contextuais, mas não a sua extinção.
Vale lembrar que, em humanos, a incapacidade de adquirir e consolidar o
aprendizado da extinção, pode acarretar no desenvolvimento de transtornos de
ansiedade como o Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) (Milad et al., 2009)e
fobias específicas.
Estudos em humanos demonstram que: (1) eventos estressantes ou traumáticos
são frequentemente seguidos por distúrbios de sono (Lavie, 2001), e (2) a persistência
desses distúrbios pode ser um fator preditivo para o desenvolvimento de futuras
patologias psiquiátricas e físicas após o trauma (Lavie, 2001, Koren et al., 2002); o que
sugere uma relação bi-direcional e ainda não esclarecida sobre a função do sono no
processamento da extinção de memórias aversivas. Estudos longitudinais observaram
uma associação entre distúrbios de sono e o desenvolvimento de transtornos como
depressão e ansiedade (Ford and Kamerow, 1989, Breslau et al., 1996, Johnson and
Roth, 2006), em adultos. Sabe-se também que distúrbios de sono em crianças e
adolescentes são frequentemente um fator preditivo para o
diagnóstico/desenvolvimento de transtornos psiquiátricos (Gregory et al., 2005).
110
Até aqui, os dados do presente estudo corroboram com outros autores que não
observaram efeitos da privação de sono na extinção de memória, na tarefa de
condicionamento de medo ao contexto (Silvestri, 2005, Fu et al., 2007).
Dessa forma, o experimento farmacológico foi desenvolvido de forma a tentar
reverter/prevenir o prejuízo provocado pela privação de sono na retenção da
memória condicionada ao contexto.
O experimento 3 demonstrou que a admininstração do antagonista
canabinóide AM251 antes do treino, na tarefa de condicionamento de medo ao
contexto, não preveniu o prejuízo na retenção da memória, causado pela privação de
sono. Foi possível observar neste experimento que houve efeito da manipulação
comportamental, mas não houve efeito da droga. Independente da dose de droga
administrada (0,5; 2,5; 5,0 mg/kg), o grupo PS continuou apresentando maior prejuízo
na retenção de memória, em relação ao grupo CTRL e mesmo em relação ao grupo
REB, que teve 24 horas de oportunidade de sono após a privação de 96 horas.
O resultado da manipulação comportamental corrobora com diversos estudos
que mostram que a privação de sono antes do treino, prejudica a aprendizagem,
especialmente no que diz respeito às tarefas de memória espacial (Smith et al., 1998;
Palchykova et al., 2006; Ward et al., 2009) e de conteúdo emocional (Bueno et al.,
2000; Dametto et al., 2002; Moreira et al., 2003; Silva et al., 2004; Dubiela et al., 2005;
Alvarenga et al., 2008; Tiba et al., 2008).
Por outro lado, os resultados dos estudos sobre os efeitos de drogas
canabinóides na memória ainda são conflitantes na literatura, e dependem da
111
linhagem do animal, da droga utilizada, da dose administrada e da tarefa de memória
empregada no estudo. No presente estudo, optamos pela utilização do AM251,
substância conhecida por ser um antagonista dos receptores canabinóides CB1.
Assim como o Rimonabant (SR141716A), o AM251 possui relativamente alta
afinidade com receptores canabinóides CB1, e ambos têm um modesto grau de
seletividade ao CB1. Conhecidos como antagonistas desse sistema, estudos recentes
sugerem que tais substâncias podem agir como agonistas inversos do sistema
canabinóide, e exercem suas ações nos mecanismos de transdução de sinais quando
administrados na ausência de estimulação do receptor CB1 (a substância inibiria a
GTPγS, aumentando a produção de AMPc (Landsman et al., 1997; Mato et al., 2002;
McLaughlin et al., 2006). De acordo com Sink e colaboradores (2010), essa ainda é
uma questão sem conclusão. O fato é que muitos trabalhos tem sido realizados,
objetivando o uso do SR141716A e do AM251 no tratamento da obesidade, visto que
essas substâncias têm demonstrado diminuir a ingestão calórica em humanos (Despress
et al., 2005; Curioni and Andre, 2006; Addy et al., 2008) e animais (Arnone et al. 1997;
Colombo et al. 1998; Williams and Kirkham 1999; Wiley et al. 2005; McLaughlin et al.
2003, 2005; Gardner and Mallet 2006; Salamone et al. 2007). Entretanto, os efeitos
dessas substâncias na aprendizagem permanecem sem esclarecimento, uma vez que
os resultados apresentados até então são conflitantes.
No estudo de Sink e colaboradores (2010), ratos Sprague-Dawley que
receberam 4,0 e 8,0 mg/kg de AM251, admininistrado via i.p., 30 minutos antes do
treino do condicionamento de medo ao contexto, aumentaram o tempo de freezing
no teste de reexposição ao contexto previamente aversivo, indicando um aumento na
112
retenção da memória emocional. Por outro lado, o AM251 prococou diminuição do
freezing no teste do condicionamento de medo à pistas, na dose de 4,0 mg/kg (Sink et
al., 2008).
Ambos os estudos foram realizados sob as mesmas condições. Em ambos os
estudos, o intervalo entre o treino e o teste de reexposição foi de duas semanas, pois,
segundo Annau and Kamin (1961), as associações mais fortes, principalmente as
emocionalmente motivadas, demoram mais tempo para serem esquecidas, assim, o
teste não sofreria interferência de outros viézes menos relevantes.
O AM251 produziu efeitos diferentes na tarefa de condicionamento de medo ao
contexto e com pistas, indicando, segundo o autor que o sistema endocanabinóide
pode ter efeitos diferenciados em sistemas cerebrais que mediam essas duas formas de
aprendizagem emocional (Sink et al., 2010).
Outra consideração importante é a diferença de efeitos do AM251, de acordo
com a espécie de animal utilizada. Haller e colaboradores (2007) observaram que os
ligantes canabinóides tem efeitos opostos na ansiedade de ratos e camundongos. Em
camundongos, a administração do agonista WIN55212-2 produziu efeitos ansiolíticos no
labirinto em cruz elevado, que foram abolidos com a administração do AM251. Em
ratos, por outro lado, o agonista produziu efeitos ansiogênicos que não foram alterados
pelo AM251.
Uma hipótese para os mecanismos opostos de ação de drogas canabinóides
em ratos e camundongos foi formulada por Haler e colaboradores (2007). Com base
em diversos estudos (Marscicano et al., 1999; Hájos et al., 2001; Hájos e Freund, 2002;
Piomelli, 2003; Katona et al., 2006), Haler e colaboradores sugerem que ratos e
113
camundongos possuem diferentes sensibilidades na modulação glutamatérgica e
gabaérgica, o que fariam as duas espécies reagirem de maneiras diferentes frente a
situações ansiogênicas, sob efeito de drogas canabinóides.
No presente estudo foi observado que o AM251 não só não preveniu o prejuízo
na retenção da memória contextual, causado pela privação de sono, como
apresentou uma tendência a prejudicar a retenção de memória do grupo CTRL (p =
0,06).
Diversos autores mostram que antagonistas canabinóides prejudicam a extinção
de memórias emocionais, enquanto os agonistas têm um efeito facilitador da extinção
(Marscicano et al., 2002; Pamplona et al., 2008). Levando em consideração de que a
extinção se trata de um novo aprendizado (Izquierdo, 2002; LeDoux, 2002), os dados do
presente estudo estariam de acordo com os trabalhos citados aqui. Entretanto, e
apesar da extinção ser um novo aprendizado, precisamos também lembrar que o
resultado obtido no presente estudo avaliou os efeitos do AM251 na retenção da
memória original do condicionamento de medo ao contexto, e quando nos referimos
aos efeitos do AM251 no aprendizado contextual original, vimos que os resultados dos
estudos são mais conflitantes e inconclusivos.
Tomados em conjunto, os dados do presente estudo sugerem que o
aprendizado original e a extinção de memória ocorra por vias neuroanatômicas
diferentes.
De fato, embora a formação hipocampal seja muito importante para a
aprendizagem de tarefas espaciais e contextuais, a amígdala possui papel
fundamental na aprendizagem de memórias emocionalmente motivadas, sendo
114
importante tanto para a aprendizagem do condicionamento de medo ao contexto,
quanto para o condicionamento de medo com pistas. Tanto que, lesões na amígdala
podem provocar prejuízo em ambas as tarefas (Phillips and LeDoux, 1992). Entretanto,
as estruturas em comum, envolvidas em ambas as tarefas torna difícil explicar como os
canabinóides podem produzir esse modelo particular de efeitos.
Os receptores CB1 são os mais amplamente distribuídos e com mais alta
densidade no cérebro de mamíferos (Herkenham et al., 1991; Jansen et al., 1992). Não
é difícil também relacionar os efeitos da cannabis sativa e seus derivados na memória,
na temperatura corporal ou na função motora (Dewey, 1986) com estruturas cerebrais
onde esses receptores estão abundantemente localizados, como o hipocampo, o
hipotálamo, amígdala e os gânglios basais (Herkenham et al., 1991; Jansen et al., 1992).
Por outro lado, os mecanismos de transdução de sinal que medeiam essas ações
biológicas ainda não estão totalmente esclarecidos.
A técnica de auto-radiografia permite localizar microscopicamente os
receptores ligados à membrana (Palácios et al., 1988). No presente estudo, o binding
de uma droga canabinóide marcada radioativamente com trício [3H]WIN-55212-2
(experimento 4), mostrou que a privação de sono por 96 horas provocou uma
alteração nos receptores canabinóides CB1 em todos os núcleos amígdalóides
analisados: núcleo basolateral (BLA), núcleo central (CeA) e núcleo basomedial (BMA)
da amígdala.
O grupo CTRL apresentou a maior densidade de receptores em relação ao
grupo REB e ao grupo PS. O grupo PS apresentou densidade mediana, e o grupo REB
115
apresentou a menor densidade de receptores nos três núcleos amígdalóides
analisados.
É importante salientar que ratos mutantes que não possuem expressão de
receptores CB1 exibem uma pletora de alterações comportamentais que se assemelha
à psicopatologia relacionada ao estresse (Hill et al., 2005b).
No caso do presente estudo, foi observada uma diminuição na densidade dos
receptores canabinóides em núcleos amígdalóides: estruturas intrinsicamente ligadas
ao processamento emocional e ao condicionamento clássico, embora nenhuma
estrutura trabalhe sozinha no sistema nervoso central (LeDoux, 1992).
A amígdala está localizada na região antero-inferior do lobo temporal, se
interconecta com o hipocampo, os núcleos septais, a área pré-frontal e o núcleo
dorso-medial do tálamo (LeDoux, 1992). Essas conexões garantem seu importante
desempenho na mediação e controle das atividades emocionais principalmente, nos
estados de medo e na agressividade. A amigdala é exerce uma função fundamental
para a auto-preservação, por ser o centro identificador do perigo, gerando medo e
ansiedade e colocando o animal em situação de alerta, aprontando-se para se evadir
ou lutar (Esperidião-Antonio et al., 2007).
A lesão bilateral das amígdalas faz com que o animal se torne dócil,
sexualmente indiscriminativo, afetivamente descaracterizado e indiferente às situações
de risco (Pape and Pare, 2010). Por outro lado, o estímulo elétrico dessas estruturas
provoca crises de violenta agressividade. Em humanos, a lesão da amígdala faz, entre
outras coisas, com que o indivíduo perca o sentido afetivo da percepção de uma
116
informação vinda de fora, como a visão de uma pessoa conhecida. (Goleman, 1995;
(Pape and Pare, 2010).
O sistema canabinóide atua como modulador inibitório de diversos sistemas de
neurotransmissão, dependendo de onde o receptor pré-sináptico está localizado.
Pode modular a liberação de transmissores dopaminérgicos, serotoninérgicos,
glutamatérgicos, gabaérgicos e outros, que ainda estão em estudo. Entretanto, a
distribuição de receptores CB1 na amígdala é especialmente importante na
modulação da transmissão gabaérgica, uma vez que atua como um modulador
inibitório (Katona et al., 2001).
Sugerimos que a privação de sono possa prejudicar, além do desempenho
motor do animal, devido ao aumento de atividade locomotora, também, o processo
de retenção da memória devido a alterações na funcionalidade do sistema
endocanabinóide na amígdala (pelo menos no que se refere ao presente estudo),
uma vez que essa estrutura é importante na associação do estímulo aversivo ao
contexto onde o animal é exposto. Vale lembrar também que após determinado
tempo, a aprendizagem de determinada tarefa ocupa regiões neocorticais e,
portanto, as alterações na amígdala podem não interferir no aprendizado da
extinção.
117
CONCLUSÃO
________________________________
Concluímos que a privação de sono possa ter aumentado a atividade motora
do animal, e também prejudicado a retenção e a evocação da memória no
condicionamento de medo ao contexto. Por outro lado, a privação de sono não
prejudicou o processo de extinção da memória eversiva.
Concluímos também que o antagonista canabinóide AM251 não foi capaz de
reverter o prejuízo na retenção de memória dos animais privados de sono e que estes
apresentam uma diminuição na densidade de receptores CB1 nos núcleos
amigdaloides basolateral, central e medial, o que pode diminuir a reação de medo do
animal.
Nossos resultados sugerem que o processo de extinção do condicionamento de
medo ao contexto ocorra por mecanismos distintos do aprendizado original dessa
tarefa, uma vez que a privação de sono afeta o aprendizado de tarefas contextuais,
mas não a sua extinção.
118
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