FARMACOLOGIA QUANTITATIVA(Eletiva – Farmácia)
Antagonismo
INTERAÇÃO DROGA-RECEPTORAg
RAg. Ant.
Efeito
Conceitos relevantes:1. Interação agonista (droga) receptor2. Agonismo e antagonismo3. Tipos de receptor4. Comunicação/resposta intracelular
4}1 2
3
ANTAGONISMO FARMACOLÓGICOQuímico
Inativação química: agentes quelantes, antiácidos, antioxidantes
Farmacocinético
Afeta absorção, distribuição, metabolização e excreção: fenobarbital
Fisiológico (“não-competitivo”, funcional, indireto)
Envolve ações opostas: noradrenalina vs. nitratos
bloq. de canais de Ca2+ vs. acetilcolina
Bloqueio de receptores
1. Competitivo – reversível ou irreversível
2. Não-competitivo – reversível ou irreversível
Antagonismo:O processo de inibição ou prevenção por uma substância (antagonista) de uma resposta induzida por um agonista
Os antagonistas podem ser definidos pela:a) Cinética
- rápida ou lenta (reflexo do Kd)b) Modo de ligação
- covalente ou não-covalentec) Sítio de ligação no receptor
- mesmo sítio que o agonista (competitivo/ sintópico)
- sítio diferente no receptor (não-competitivo/ alotópico)
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Classificação de acordo com a reversibilidade
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Resposta
Log [Agonista] Log [Agonista]
Reversível/Superável Irreversível/Insuperável
Químico
Competitivo reversível
Competitivo irreversívelFisiológico
Não-competitvo reversível e irreversível
+ Ant. + Ant.
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Antagonismo competitivo sem limite
Antagonismo competitivo com limite
Antagonismo insuperável (não competitivo) sem
deslocamento
Antagonismo insuperável (não competitivo) com
deslocamento
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
Definição: Antagonismo em que a ligação de agonista e antagonista é mutuamente exclusiva
a) Por competição pelo mesmo sítio de ligação
b) Por se ligarem a sítios adjacentes porém sobrepostos
ID
R
L + R LR Efeito
Kd
I
+
IR
KI
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
A + R AR Efeito
B + R AB Sem efeito
1. [A] • [R] = KD • [AR] [A] • PR = KD • PAR
2. [B] • [R] = KB • [BR] [B] • PR = KB • PBR
3. PR + PAR + PBR = 1
4. KD • PAR + PAR + [B] • KD • PAR = 1 [A] KB [A]
5. PAR . KD + 1 + [B] . KD = 1 [A] KB [A]
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
A + R AR Efeito
B + R AB Sem efeito
1. [A] • [R] = KD • [AR] [A] • PR = KD • PAR
2. [B] • [R] = KB • [BR] [B] • PR = KB • PBR
3. PR + PAR + PBR = 1
4. KD • PAR + PAR + [B] • KD • PAR = 1 [A] KB [A]
5. PAR . KD + 1 + [B] . KD = 1 [A] KB [A]
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
6. PAR • 1 + KD • 1 + [B] = 1 [A] KB
7. PAR = 11 + KD • 1 + [B] [A] KB
8. PAR = [A]KD • (1 + [B]/KB) + [A]
Obs: a) Na ausênica de [B], a equação é a do Hill-Langmuirb) O grau de antagonismo é determinado por [B] e KB
Equação de Gaddum
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
Exemplo: O mesmo KB (10 M), mas concentrações variadas de [B]. (Supor [A] = 10 M, KD = 10 M: PAR = 0,5)
[B] (M) [B]/KB (1 + [B]/KB) PAR
1000 100 101 0,0098100 10 11 0,08310 1 2 0,3331 0,1 1,1 0,4760,1 0,01 1,01 0,49750,01 0,001 1,001 0,49980,001 0,0001 1,0001 0,49998
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
Exemplo: A mesma concentração ([B] = 10 M) de antagonistas com KB diferentes
(Supor [A] = 10 M, KD = 10 M: PAR = 0,5)
Antag. KB (M) [B]/KB (1 + [B]/KB) PAR
A 1000 0,01 1,01 0,498B 100 0,1 1,1 0,476C 10 1 2 0,333D 1 10 11 0,083E 0,1 100 101 0,0098F 0,01 1000 1001 0,000998
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -20.00
0.25
0.50
0.75
1.00
C0
C3C2C1
[Agonista], M
Res
post
a (f
raçã
o)PAR = [A]
[A] + Kd•(1 +[B]/KB)Equação de Gaddum
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
1. Deslocamento paralelo2. Redução na potência (aumento no EC50)3. Emáx mantido
R1 -SHN CH2 CH2 X -OH
R2 =NH -COOH
R1 CH2
N+ + X- R1
R2 CH2
N R2
SHCH2 + H+
CH2
H, VW, iônica, hidrofóbica S
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível
Exemplo: A mesma concentração ([B] = 10 M) de antagonistas com KB diferentes
(Supor [A] = 10 M, KD = 10 M: PAR = 0,5)
Antag. KB (M) [B]/KB (1 + [B]/KB) PAR
A 1000 0,01 1,01 0,498B 100 0,1 1,1 0,476C 10 1 2 0,333D 1 10 11 0,083E 0,1 100 101 0,0098F 0,01 1000 1001 0,000998
Resulta de um Kd muito baixo (altíssima afinidade) com a qual o agonista não tem como competir.
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível
Resulta de uma ligação covalente aos receptores, inativando-os (Exemplo: alquilação dos receptores)
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
A razão de concentrações ou a razão de doses (r ou dr):
Definição: O fator pelo qual a concentração de agonista tem que ser aumentada para produzir a mesma resposta na presença de antagonista.
r = [A´]/[A]
pAx = o logarítmo negativo da concentração de antagonista que produz uma razão de concentração de x
pAx = -log[B]r=x
O valor de x mais comumente usado é pA2 = -log[B]r=2
Exemplo: atropina 1 nM causa um aumento de 2x na concentração de ACh necessária para produzir a mesma resposta:
pA2 = -log 10-9 = 9
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -20.00
0.25
0.50
0.75
1.00
C0
C3C2C1
A B C D
DR1 = EC50 B DR2 = EC50 C DR3 - EC50 D
EC50 A EC50 A EC50 A
[Agonista], M
Resposta
(fr
ação)
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
Qual a relação entre a equação Hill-Langmuir e a do Gaddum?
Supor que a mesma resposta na ausência e presença de antagonista corresponde à mesma ocupação de receptores
1. [A] = r[A] KD + [A] r[A] + KD•(1 +[B]/KB) 2. [A] = [A] KD + [A] [A] + KD• 1 + [B]/KB
r3. 1 + [B]/KB = 1 r
4. r – 1 = [B]/KB
Equação de Schild
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
1. r – 1 = [B]/KB e log (r-1) = log [B]r – log KB
2. Para pA2: log (2-1) = log (1) = 0 = log [B]r=2 – log KB
3. -log [B]r=2 = -log KB
4. pKB = -log KB
Log (dr-1)
0
Log [Antagonista], M
-9 -8 -7 -6
4
2KB
log (r-1) = log [B] – log KB
dr de 2 = pA2
pKB = -log KB
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
Regressão do Schild (1959)
Resp. Resp.Parcial
Parcial +Alquilante
AgonistaAgonista
PlenoPleno + Parcial
[A] [A´]
1. Concentração de antagonista (neste caso, agonista parcial) = [B]
2. Razão das doses (r) = [A´]/[A]
3. Calcular KB (neste caso, = KdPA): r-1= ([B]/KB) = KB = [B]/(r-1)
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo – agonista parcial
Determinação do Kd da pilocarpina pelo método de Furchgott,usando-se aquilação (músculo liso do estômago) (Furchgott & Bursztyn (1967) Ann. N.Y. Acad. Sci. 139, 882).
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo – agonista parcial
Resposta
Log [Agonista]
Log (dr-1)
Log [Antagonista]
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
1. PAR = [A] Equação de GaddumKD . (1 + [B]/KB) + [A]
2. r - 1 = [B]/KB Equação de Schild
3. pAx = logarítmo negativo da concentração molar de antagonista que produz uma razão de dose x.
Resposta
Log [Agonista]
A A + B (antagonista)
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo
1. PAR = [A] Equação de GaddumKD . (1 + [B]/KB) + [A]
2. PAR = [A]n1 KD . (1 + [B]n2/KB) + [A]n1
3. log (rn1-1) = n2 . log [B] - log KB
y = m . x + b
Portanto:1. Com uma regressão linear com inclinação de 1,0 o intercepto corresponde a -log KB
2. pKB sempre corresponde a pA2, porém pA2 nem sempre corresponde ao pKB (somente com linearidade e inclin. = 1).
ANTAGONISMO
r-1 = [B]/KB : log (r-1) = log [B] - log KB
pA2 : log (2-1) = log (1) = 0 = log [B]r=2 - log KB
: -log [B]r=2 (=pA2) = - log KB
Ou seja: quando [B] = KB, então pela equação isso = pA2
log
(r-1
)
Log [Antagonista]
pA2
Então:pA2 = Log (r-1) – log[B]Por isso:pKB sempre é igual a pA2
Mas nem sempre pA2 = pKB
- somente quando o gráfico de Schild é linear com inclinação de 1,0
ANTAGONISMOSérie de ‘quaternários’
Composto pD2 pA2
Metil 3,0 1 ----Butil 5,2 1 ----Pentil 5,4 1 ----Hexil 5,0 0,9 ----Heptil 4,6 0,1 ----Octil ---- 0 5,0Nonil ---- 0 5,0Decil ---- 0 5,9Dodecil ---- 0 6,0
ANTAGONISMO
Série de ‘colinas’
Composto pD2 pA2
Acetilcolina 7,0 1 ----Propionilcolina 5,3 1 ----Formilcolina 5,2 1 ----Butirilcolina 5,1 0,5 ----Valerilcolina ---- 0 4,7Laurilcolina ---- 0 5,4Benzililcolina ---- 0 8,3
ANTAGONISMO
Agonistas parciais - série de ‘adrenérgicos’em tecidos diferentes
Composto Átrio de cobaia (1) Traquéia (2)
pD2 pA2 pD2 pA2
Isoprenalina 8,15 1,00 ---- 7,12 1,00 ----Soterenol 7,26 0,33 6,48 6,82 0,77 6,02Salbutamol 5,90 0,51 5,40 6,52 0,98 5,64Terbutalina 5,11 0,66 6,22 6,77 0,92 4,81
ANTAGONISMO
Os principais passos para a análise de Schild
1. Obter curvas CR
2. Analisar as curvas CR
3. Gerar e analisar o gráfico de Schild
4. Ajustar a regressão para obter inclinação de 1,0 se for o caso
Antagonismo da ação do carbacol pela escopolamina em traquéia de rato
pKB = 9,26 (9,1-9,4)Inclinação: 1,09 (0,66-1,5)
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de Schild:
Pergunta crucial: Será que as curvas provêm de uma mesma população?
1. Curvas dose-resposta paralelas, com inclinações semelhantes
- comparar o “fit” das curvas quando são usados parâmetros
individuais (Emax, n, EC50) de cada curva versus valores médios de n e Emax.
- se não houver diferença significativa entre as duas opções,
então deve usar a segunda (valores médios)- se houver diferença significativa, então deve considerar
que os critérios não são preenchidos e portanto pode não ser mais inibição competitiva simples
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de Schild:
Pergunta crucial: Será que estas curvas provêm de uma mesma população?
2. A inclinação da reta do gráfico de Schild é 1,0 ou pelo menos não significativamente diferente de 1,0?
- usar análise de regressão para calcular a inclinação e determinar os limites de confiança de 95% (IC95%)
- se a inclinação de 1,0 estiver dentro do IC95%, então pode
se concluir que há antagonismo competitivo simples - neste caso, refazer a análise “obrigando” a inclinação a ser 1,0
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de Schild
Análise de Schild para antagonismo de receptores M1 por pirenzepina (0,3, 1, 3 e 10 M)
- no painel B: inclinação = 1,1+0,2, com IC95% de 0,9 a 1,15- linha tracejada no painel B é a original e a sólida é a ajustada
para dar inclinação de 1,0- pKB (intersecção no eixo X): 6,92
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de Schild
E se a inclinação da regressão não for 1,0, ou se a regressão não for linear?
Neste caso, não pode usar o conjunto completo de dados para determinar a potência do antagonista
- Ou o antagonismo não é competitivo ou há alguma interferência
A opção então é: determinar apenas uma estimativa da potência usando a menor razão de doses possível para calcular pA2
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de Schild
Recomendações:
1. Usar uma concentração inicial de antagonista que dá um valor de log(r-1) bastante próximo ao zero, ou seja, deslocamento de 2 a 5 vezes
- isso facilitará o calculo do pKB ou pA2
2. Usar uma faixa de concentrações de 30 a 100 vezes- com faixas menores os valores de IC95% são elevados,
diminuindo a confiabilidade dos resultados.
3. Atentar para desvios na linearidade do gráfico
ANTAGONISMOCritérios para o uso
adequado da análise de Schild
ANTAGONISMO
Critérios para o uso adequado da análise de SchildImportância do tempo de equilíbrio
ANTAGONISMO
Precauções no uso da análise de Schild
Uma regressão linear com inclinação de 1,0 não é garantia de antagonismo competitivo simples
Importância do tempo de equilíbrio
Antagonismo fisiológico onde ativação muscarínica produz contração e ativação -AR produz relaxamento em músculo de traquéia
Inclinação = 1,02+0,02
ANTAGONISMOUsos da regressão do Schild
1. Para avaliar o antagonismo competitivo e determinar KB (ou pKB)
2. Para comparar potências de antagonistas- baseado em estudos de estrutura-atividade
3. Como indicador de estados anômalos:a) não-equilíbriob) heterogeneidade de populações de receptoresc) mecanismos endógenos que afetam a disposição
de drogasd) propriedades múltiplas de drogase) antagonismo não-competitivo
ANTAGONISMOUsos da regressão do Schild
4. Para caracterização e classificação de receptoresex. Precisa ter um antagonista já caracterizado
Atropina = pKB 9 (não seletivo)Pirenzepina = pKB 7,9 – 8,5 (M1 seletivo)Himbacina = pKB 7-7,2, então é subtipo M1
5. Classificação de agonistas- comparar a razão de doses de um agonista desconhecido
com um conhecido
ANTAGONISMO Uso na classificação
Agonista EC50 (átrio cobaia) pKB Buramida (H2)
Histamina 1,1 M 7,8 M
4-Metilhistamina 3,1 M 7,2 M
2-Metilhistamina 19,8 M 6,9 M
Tecido Agonista ns pKB Buramida (H2)
Átrio (cob.) (H2) Histamina 0,98 7,8 uM
Útero (rato) (H2) Histamina 0,96 6,6 uM
Íleo (cob.) (H1) Histamina 1,32 288 uM
Íleo (cob.) (M) Carbacol 1,44 174 uM
ANTAGONISMO Uso na classificação
ANTAGONISMORegressão de Schild
Anomalias nas regressões de Schild
Intercepto
>1 1 <1 1 (pKB anômalo)
Log [B]
Log (r-1)
ANTAGONISMORegressão de Schild: inclinação < 1
Influência da concentração de agonista
Histamina no relaxamamento de traquéia de coelho(pré-contraída com betanecol) via receptores H2
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Mecanismos que removem agonista
Resultado: potência do agonista subestimadaNa ausência de um inibidor específico da remoção,pode usar a regressão de Schild para avaliar isso
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Mecanismos que removem agonista
Membrana nictitante de olho de gato
Com bloqueador de captação
Sem bloqueador de captação
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Mecanismos que removem agonista
Antagonismo por propranolol da ação de noradrenalina e isoprenalina na atividade contrátil de átrio isolado de
cobaia
Noradrenalina
Isoprenalina
Noradrenalina + cocaína
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Mecanismos que removem agonista
Considerações:1. O deslocamento em paralelo não revela a não linearidade2. As potências de NE e Fentolamina estariam erradas3. Útil para determinar a concentração ideal de inibidor.
Ex. Fentolamina tem pKB conhecido (8,5).
DMI: desmetilimipramina
ANTAGONISMORegressão de Schild
Detecção de processos de remoção de agonista
1. Regressão de Schild com inclinação < 1 2. Inibição do processo de captação aumenta a inclinação
3. Conc. de inibidor que produz uma regressão linear com o pKB correto é a concentração adequada para inibição
Receptores heterogêneos
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Receptores heterogêneos
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação < 1
Estudos de binding Estudos funcionais
Agonista afinidade seletiva afinidade seletiva efic. intrins. selet.
Antagonista afinidade seletiva afinidade seletiva
Receptores densidade relativa densidade relativa acoplamento eficiência de trans.
ANTAGONISMORegressão de Schild
Detecção de receptores heterogêneos
1. Regressões de Schild diferentes são obtidas no mesmo tecido com o mesmo antagonista mas com agonistas diferentes
2. Regressões não-lineares e com inclinações <1.
Ag1 Ag2Ant Ag1 Ag2Ant
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação > 1
Remoção saturável de antagonista
Betanecol em íleo de coelho: efeito de atropinase: bloquear com 4-metilbutirato (substrato alternativo)
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Importância do tempo de equilíbrio
Fatores importantes:
1. Concentração do antagonista
2. KB (constante de dissociação do antagonista)
3. Tempo de incubação com agonista (re-equilíbrio)
Se o tempo de re-equilíbrio for insuficiente, na presença de um antagonista com alta afinidade concentrações altas de agonista não atingirão a proporção de receptores definida pela lei de ação de massas: haverá “depressão” da resposta máxima
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Importância do tempo de equilíbrio
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação > 1
Tempo de equilíbrio inadequado: quando a interação droga-receptor, e não a difusão, é limitante
Antagonismo do efeito do carbacol por escopolamina em íleo de cobaia: influência do tempo
(E = 90 min em A e >240 min em B)
Exemplo:
2 x KB : 120 min
200 x KB : 15 min
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação = 1
Tempo de equilíbrio inadequado: quando a difusão, e não a interação droga-receptor, é limitante
Log (r-1)
Log [B]
>240 min60 min
30 min5 min
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação = 1
Ações múltiplas de drogas: seletividade para afetar mais que uma atividade
DMI: bloqueador seletivo da captação neuronal de NEAmitriptilina: bloqueia captação neuronal e -adrenoceptores
1. Fentol + DMI
2. Fentol
3. Fentol + Amitrip
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação = 1Ações múltiplas de drogas: seletividade para afetar
mais que uma atividade
Ambenônio:
Antimuscarínico: pKB 6,1Anticolinesterásico: pKI 6,4
Sem efeito sobre betanecol
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação = 1Ações múltiplas de drogas: seletividade para afetar
mais que uma atividade
Traquéia de cobaia na presença de concentrações crescentes de ambenônio (50 nM, 0,3 uM, e 3 uM):
Resposta sem ambenônio
ANTAGONISMO Regressão de Schild: inclinação = 1Ações múltiplas de drogas: seletividade para afetar
mais que uma atividade
Espécie Tecido pKB
ACh Betanecol
Cobaia Íleo 6,0 6,1Traquéia 4,89 6,2Tenia cecum 5,2 6,0
Rato Músculo anococc. 4,87 6,0
ANTAGONISMORegressão de Schild: resumo
ANTAGONISMOCritérios para o uso adequado da análise de Schild
Ação tóxica do agonista
ou antagonista
Modulação alostérica negativa
Saturação de sistema
de captação ou adsorção
ANTAGONISMO
Precauções no uso da análise de SchildSituações em que não é possível usar esta análise, mas em que
eventualmente seja possível obter uma estimativa de pA2
Importância do tempo de equilíbrio
Antagonismo não-competitivo
Modulação alostérica negativa
Hemi-equilíbrio
Ação tóxica ou
inespecífica
ANTAGONISMORegressão de Schild
Regressão de Schild para agonistas parciais
Agonista parcial: dobutamina;Tecido: músculo anococcígeode rato
B
A
ANTAGONISMOAgonistas parciais como antagonistas
Determinação da afinidade de um agonista parcial pelo método de Stephenson
Cloropractolol (agonista parcial -AR): 0,01, 0,1, 1 e 10 M (átria de rato)
Painel B: KP = ([P] • inclinação)/(1-inclinação) • (1 – (P/A)) [OU: (1-(eP/eA))]
Inclinação: 0,95KP = 16,5 nM
Inclinação: 0,96KP = 16,5 nM
Cloropractolol: 0,1 M
Baseado na idéia de concentrações equiativas na ausência e presença de agonista parcial
ANTAGONISMOAgonistas parciais como antagonistas
Determinação da afinidade de um agonista parcial pelo método de Kaumann e Marano
Cloropractolol (agonista parcial -AR): 0,01, 0,1, 1 e 10 M
Painel E: log (1/inclinação -1) = log [P] – log KP
Inclinação: 0,95KP = 16,5 nM
ANTAGONISMOAntagonismo clássico
Antagonismo competitivo sem limite
Antagonismo competitivo com limite
Antagonismo insuperável (não competitivo) sem
deslocamento
Antagonismo insuperável (não competitivo) com
deslocamento
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível:
antagonismo “não-competitivo”Definição:-Antagonista que se liga ao receptor, tornando-o funcionalmente inativo, sem possibilidade de reversão com concentrações maiores de agonista
-Bloqueio pseudo-irreversível
-Resulta de uma velocidade de dissociação bem acima do período de incubação com agonista (tempo <<<< k2)
-Efeito imediato depende da reserva de receptor- devido a isso antagonistas “não-competitivos” terão efeitos diferentes sobre a resposta máxima dependendo do sistema estudado, frente ao mesmo agonista
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível:
antagonismo “não-competitivo”Determinação da afinidade de um antagonista “não-competitivo”Método de Gaddum
1. Obter curva para agonista na ausência e presença de antagonista NC
2. Determinar concentrações equiativas
3. Plotar 1/[A] versus 1/[A´]
1/[A] = 1/[A´] • ([B]/KB + 1) + [B]/(KBKA)
KB = [B]/(Inclinação – 1)
[A´]/[A] = [A´]•([B]/(KBKA) + [B]/KB + 1
KB = [B]/(Intercepto – 1)
Inclinação = 32,1[B] = 1 MKB = 33 M
ANTAGONISMOAntagonismo competitivo irreversível:
antagonismo “não-competitivo”
Determinação do pA2 de um antagonista “não-competitivo” baseada no deslocamento à direita
ANTAGONISMORegressão de Schild
Antagonismo de um agonista indireto