I

UNIVERSIDADE DO PORTO

FACULDADE DE CIÊNCIAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DE ABEL SALAZAR

Relatório de Estágio da Licenciatura em Bioquímica

Preparação de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-

nase para o desenvolvimento de sensores.

Rui Pedro Fernandes Ribeiro

2013

II

Preparação de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-

nase para o desenvolvimento de sensores.

REQUIMTE, Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Uni-

versidade do Porto, 4169-007 Porto, Portugal

Orientadora

Professora Doutora Eulália Pereira

Co-orientadora

Mestre Leonor Soares

Porto, 2013

III

Agradecimentos

À Professora Doutora Eulália Pereira, minha orientadora, gostaria de agradecer a

oportunidade de estagiar no seu grupo de investigação, a confiança e motivação depositada

em mim, bem como os conhecimentos transmitidos e a sua enorme disponibilidade.

A todos os elementos do grupo de investigação agradeço pelo companheirismo e ex-

celente ambiente de trabalho, em especial à Mestre Leonor Soares, minha co-orientadora, e

ao Doutor Pedro Quaresma, pela amizade, simpatia e paciência e pelo constante apoio na

elaboração deste projeto. Quero agradecer-lhes por tudo o que aprendi durante estes largos

meses: as técnicas, as dicas e os conselhos sábios que levo comigo e me ajudarão na minha

carreira científica, mas também os grandes momentos de descontração que se misturaram

com o trabalho.

Aos meus amigos, por toda amizade que aqui é impossível descrever, em especial, à

minha grande amiga Francisca Dias que nos últimos quatro anos me ajudou a descobrir o

verdadeiro gosto pela ciência, pois quando se tem espírito científico não há limites para o

conhecimento.

Aos meus pais deixo aqui o meu sentido agradecimento, e quero dizer-lhes que des-

cobri que tenho mais deles em mim do que imaginava: ao meu pai, com quem partilho a

mesma boa disposição e curiosidade pelo mundo que nos rodeia e à minha mãe, de quem

herdei o espírito de sacrifício, resistência e perfecionismo. Obrigado pelo apoio e força in-

condicionais que me motivam todos os dias a ser mais e melhor.

À minha restante família agradeço por me ter acompanhado todos os dias da minha

vida, em especial à minha prima Ana a quem mais uma vez agradeço por me ter dado mui-

to mais do que me apercebi, e à minha avó Eduarda que, nos últimos dozes anos tem sido

um pilar essencial na minha vida.

A todos vocês, obrigado por terem entrado na minha vida, me terem inspirado e ilu-

minado com a vossa presença!

IV

Abreviaturas

A

AuNPs nanopartículas de ouro

AuNSs nanoestrelas de outro

Ala alanina

Asn asparagina

C

CALNN pentapéptido de carga neutra (Cis- Ala-Leu-Asn-Asn)

Cis cisteína

D

D.L.S. Dispersão dinâmica de luz (Dynamic light scattering)

ou espetroscopia de correlação fotónica

L

Leu leucina

M

M concentração molar

11-MUA ácido 11-mercaptoundecanóico

N

NPs nanopartículas

P

PVP polivinilpirrolidona

S

seeds núcleos de crescimento

V

T

T.E.M. Microscopia de transmissão eletrónica

tips pontas das nanoestrelas

TYR tirosinase

U

UV/vis Ultravioleta/visível

λ comprimento de onda

VI

ÍNDICE

1   Introdução   1  

1.1   Nanotecnologia   1  

1.2   Nanopartículas  de  Ouro   2  

1.2.1   Características  e  propriedades   2  

1.2.2   Técnicas  de  síntese   2  

1.3   Interação  nanopartícula-­‐proteina   4  

1.4   Técnicas  de  caracterização  e  análise  de  nanopartículas  e  da  interação  destas  

com  péptidos  e  proteínas   7  

1.4.1   Espetrofotometria    UV/Vis   7  

1.4.2   Medidas  de  dispersão  dinâmica  de  luz  (D.L.S.)   7  

1.4.3   Medidas  de  potencial  zeta  (Potencial  ζ)   8  

1.4.4   Microscopia  eletrónica  de  transmissão  (T.E.M.)   9  

2   Objetivos   10  

3   Materiais  e  Métodos   11  

3.1   Reagentes  e  Solventes   11  

3.2   Instrumentação   12  

3.3   Procedimentos  laboratoriais   13  

3.3.1   Síntese  de  núcleos  de  crescimento  (seeds)  de  ouro   13  

3.3.2   Funcionalização  de  AuNPs  com  PVP   14  

3.3.3   Síntese  de  AuNSs   15  

3.3.4   Centrifugação  das  AuNSs   16  

3.3.5   Determinação  da  concentração  e  da  área  superficial  das  AuNSs   16  

3.3.6   Funcionalização  de  AuNSs  com  o  péptido  CALNN  e  MUA   17  

3.3.7   Formação  dos  bionanoconjugados  com  tirosinase   17  

3.3.8   Caracterização  das  nanopartículas   18  

3.3.9   Estudo  da  estabilidade  coloidal  das  AuNSs   19  

4   Resultados   20  

4.1   Síntese  e  funcionalização  de  AuNPs  esféricas  pelo  método  da  redução  do  

citrato   20  

4.2   Funcionalização  das  esferas  com  o  PVP   21  

VII

4.3   Síntese  de  núcleos  de  crescimento  de  ouro   22  

4.4   Síntese  de  AuNSs   23  

4.5   Estudo  da  estabilidade  coloidal  das  AuNSs   27  

4.6   Funcionalização  das  AuNSs   27  

4.7   Formação  de  bionanoconjugados  de  tirosinase   31  

5   Considerações  finais   33  

6   Referências  Bibliográficas   34  

VIII

Índice de Figuras

Figura 1-1 Ilustração representativa da escala nano [3]. 1

Figura 1-2 Representação gráfica da concentração atómica em função do tempo

ilustrando os fenómenos de nucleação e crescimento (adaptado de Xia et al. [9]). 3

Figura 1-3 Representação do mecanismo proposto para a reação entre DMF-PVP e

HAuCl4 (adaptado de Kedia et al. [15]). 4

Figura 1-4 Coroa de proteínas na NP. A ligação da proteína à partícula pode levar a uma

série de consequências, nomeadamente alterações conformacionais, que podem levar a

mudanças na atividade biológica, fibrilação, ou estabilização de determinada conformação.

(adaptado de Yang et al. [16]). 5

Figura 1-5 Fórmula de estrutura dos agentes de revestimento utilizados: PVP, 11-MUA e

CALNN. 6

Figura 1-6 Estrutura cristalográfica da tirosinase de Agaricus bisporus (PDB-2Y9W). 7

Figura 1-7 Representação do potencial elétrico em função da distância da superfície de

AuNPs (adaptado de Wikipédia [22]). 8

Figura 4-2 A- espetro de extinção de solução das seeds, em etanol, após sofrerem as

respetivas centrifugações; B - espetro de extinção das AuNSs, em etanol, sintetizadas com

as seeds diferenciais. 22

Figura 4-3 Representação esquemática da uma AuNS de 4 tips no plano 𝚷 e 2 tips no

plano 𝚺, e espetro de extinção de AuNSs com diferentes números de tips. 24

Figura 4-4 Espetro de extinção das amostras do stock de 120 mL de AuNSs em DMF,

etanol e água. 25

Figura 4-5 Imagens de T.E.M. e análise estatística do diâmetro médio das soluções de

AuNSs sintetizadas a partir de seeds com 18 nm de diâmetro. A - 7 mL de AuNSs de rácio

9; B - 7 mL de AuNSs de rácio 11; C - 7 mL de AuNSs de rácio 15; D - 120 mL de AuNSs

de rácio 15. 26

Figura 4-6 Espetros de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs após a variação

com o pH (A) e com a força iónica (B). Imagens de T.E.M. de AuNs sem adição de NaCl

(C), com 0,5M de NaCl (D) e 3M de NaCl (E). 28

Figura 4-7 A – espetro de extinção de aliquotas de 1,5 mL de AuNSs funcionalizadas

com CALNN e 11-MUA antes e após a diminuição do pH; B – espetro de extinção da

solução stock de 120 mL de AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH;

distribuição do potencial z das AuNSs funcionalizadas com o CALNN logo após a

IX

funcionalização (C e D) e 6 dias depois (E e F), com o 11-MUA (G e H) e da

funcionalização de 10 mL de AuNSs com CALNN (I e J). 29

Figura 4-8 Representação gráfica do potencial z e do diâmetro médio das partículas em

função da quantidade de enzima adicionada. 32

Figura 4-9 Espetro de extinção das AuNSs em função da quantidade de enzima

adicionada. 32

X

Índice de Tabelas

Tabela 3-I Características dos rotores utilizados. 12

Tabela 4-I Comparação do dimâmetro médio das AuNPs antes e após a funcionalização

com PVP obtidos por três técnicas diferentes. 20

Tabela 4-II Descrição das centrifugações diferenciais das AuNPs. 23

Tabela 4-III Comparação do diâmetro calculado com o obtido por T.E.M das AuNSs

sintetizadas com diferentes rácios. 24

Tabela 4-IV Concentração do stock de 120 mL AuNSs antes e após as centrifugações. 25

Tabela 4-V Medições de Potencial z das AuNSs antes e após a funcionalização. 30

Tabela 4-VI Resultados do potencial z e de D.L.S. de soluções de AuNSs com diferentes

concentrações de enzima. 31

XI

Resumo

A combinação de nanomateriais inorgânicos com produtos biológicos permite a cria-

ção de nanomateriais biologicamente ativos com potenciais aplicações na indústria, medi-

cina e até mesmo a nível ambiental, já que a produção destes materiais fundamenta-se hoje

em dia no conceito de Química Verde, que pode ser definida como o uso de metodologias

que visam a redução de reagentes ou produção de produtos que possam ser nocivos ao ho-

mem ou ao ambiente.

O trabalho desenvolvido neste projeto teve como objetivo a preparação de bioconju-

gados com possível aplicação no desenvolvimento de biossensores e em biorremediação.

Este relatório descreve a síntese e funcionalização de núcleos de crescimento e de na-

noestrelas de ouro e utilização destas para a preparação e estudo de bionanoconjugados

com tirosinase.

Os núcleos de crescimento são nanoesferas de ouro sintetizadas pelo método da redu-

ção do citrato e funcionalizadas com PVP. Estes núcleos de crescimento são posteriormen-

te utilizados na síntese de nanoestrelas de ouro.

Para tornar a superfície das nanoestrelas biocompatível com materiais biológicos co-

mo proteínas, estas foram funcionalizadas com o péptido tiolado CALNN, e outro agente

de revestimento também tiolado, 11-MUA, servindo este último apenas como controlo.

Após a funcionalização das nanoestrelas estas são mais aptas à adsorção de biomolé-

culas à superfície, podendo ser utilizadas como biossensores, catalisadores de reações bio-

lógias ou como transportadores de fármacos. Para a formação destes bionanoconjugados

foi utilizada a enzima tirosinase que realiza duas reações de catálise distintas.

Ao longo de todo o trabalho experimental, foram utilizadas diversas técnicas de carac-

terização de nanopartículas como a espetrofotometria UV/vis, a microscopia de transmis-

são eletrónica e medidas de dispersão dinâmica de luz e de potencial zeta.

1

1 Introdução

1.1 Nanotecnologia

Define-se nanociência como o estudo das propriedades da matéria numa escala entre

1 e 100 nm (Figura 1-1) e nanotecnologia como a manipulação de materiais a essa escala, de

forma a produzir materiais que sejam úteis para o desenvolvimento humano. A nanotecno-

logia é um campo bastante multidisciplinar abrangendo áreas como a engenharia de mate-

riais, eletrónica e mecânica, bem como a biologia, física e química.

Uma nova área de estudos que tem sido intensamente explorada pelos cientistas é a

nanomedicina, ou seja a aplicação da nanotecnologia, nanomateriais e nanodispositivos

para o diagnóstico e terapêutica de doenças. Por exemplo, muitos cientistas tentam desen-

volver nanobiossensores, que quando inseridos no corpo humano podem continuadamente

monitorizar níveis de glucose no sangue [1], transportadores de fármacos baseados em na-

nopartículas, ou utilizar as próprias nanopartículas para terapia termal contra o cancro [2].

Portanto, a expansão do conhecimento em nanociência e nanotecnologias é de crucial

importância para o próprio conhecimento científico, mas também para o desenvolvimento

de uma melhor sociedade e qualidade de vida.

Figura 1-1 Ilustração representativa da escala nano [3].

2

1.2 Nanopartículas de Ouro

1.2.1 Características e propriedades

As soluções coloidais de AuNPs possuem geralmente cores intensas, que variam de

acordo com o tamanho e a morfologia das partículas. Por sua vez, o tamanho e a morfolo-

gia das partículas depende do processo de síntese, podendo-se obter partículas isotrópicas

(esferas) ou anisotrópicas (estrelas, triângulos, cubos,etc).

O controlo destes dois parâmetros durante a síntese de NPs, representa hoje em dia

um dos maiores desafios que a nanoquímica enfrenta, uma vez que estes têm uma grande

influência nas propriedades óticas das partículas.

Na origem física de tais propriedades encontra-se o fenómeno de ressonância plas-

mónica de superfície (SPR). Este fenómeno ocorre quando a radiação eletromagnética inte-

rage com os eletrões presentes na banda de condução do metal, promovendo a sua oscila-

ção e induzindo a formação de dipolos na nanopartícula. Assim, metais que possuem

eletrões de condução livres, ou seja, eletrões das orbitais d, como é o caso dos metais no-

bres (ouro e prata), apresentam uma absorção forte na zona do visível do espetro de extin-

ção.[4, 5]

As soluções coloidais de AuNPs isotrópicas (esféricas) com diâmetros de 5-20 nm

apresentam no espetro UV/vis uma única banda plasmónica típica a 520 nm.[6] As nano-

partículas anisotrópicas apresentam normalmente mais do que uma banda plasmónica, por

exemplo, as nanoestrelas de Au (AuNSs), devido á sua anisotropia intrínseca, exibem duas

bandas de absorção. A ressonância plasmónica de AuNSs resulta da hibridação da excita-

ção colectiva dos eletrões do núcleo da partícula e cada ponta (tip) individual da partícula.

Nos espetros experimentais observam-se então duas bandas distintas, uma compreendida

entre os 700 e 800 nm e uma mais fraca compreendida entre os 500 e 600 nm.[7]

1.2.2 Técnicas de síntese

A síntese de nanoestruturas é baseada em duas abordagens: “bottom-up” (de baixo

para cima) e “top-down” (de cima para baixo). Na abordagem “bottom-up” a produção de

nanoestruturas ocorre através da deposição espontânea e ordenada (self-assembly) de áto-

mo a átomo ou molécula a molécula formando estruturas bem definidas. Na abordagem

“top-down” as nanoestruturas são produzidas a partir de uma estrutura macroscópica que

vai sendo desbastada, isto é transformada, até se obter o tamanho e forma desejados.[8]

3

A abordagem utilizada na síntese química de AuNPs é a “bottom-up”, na qual um sal

do metal pretendido, que serve como percursor, é decomposto ou reduzido para gerar áto-

mos metálicos (átomos com numero de oxidação zero) que são a base de construção da

partícula.

Embora o processo de nucleação ainda não seja completamente conhecido, o modelo

mais aceite é o modelo de LaMer, proposto nos anos 50, Figura 1-2. Este modelo propõe que

a concentração dos átomos disponíveis para a nucleação aumenta à medida que o percursor

metálico é decomposto ou reduzido e, assim que a concentração dos átomos atinge a con-

centração de nucleação mínima os átomos começam a agregar em pequenos núcleos que

vão crescendo de forma acelerada até se esgotar o percursor. [9-11]

De forma a controlar o tamanho e a morfologia das partículas, recorre-se frequente-

mente a agentes de revestimento que se ligam à superfície das partículas estabilizando-as e

evitando assim a seu crescimento e a agregação.

Figura 1-2 Representação gráfica da concentração atómica em função do tempo ilustrando os fenómenos de nucleação e crescimento (adaptado de Xia et al. [9]).

1.2.2.1 Síntese de AuNPs esféricas

A síntese de AuNPs esféricas foi efetuada segundo o método da redução do citrato,

inicialmente descrito por Turkevich et al. [12], no qual uma solução do sal ácido tetraclo-

roáurico (III) (percursor metálico) em solução aquosa e de citrato de sódio (agente redutor

e agente de revestimento) é levada à ebulição, sendo o sal de ouro reduzido a ouro metálico

(Au0). Como o citrato de sódio é adicionado em excesso, à medida que este reduz o sal de

4

ouro e fica na sua forma ionizada, vai sendo adsorvido à superfície da AuNP tornando-a

negativa, o que previne a agregação das partículas, devido às repulsões eletrostáticas.

1.2.2.2 Síntese de AuNSs

A síntese de AuNSs foi efetuada segundo o método descrito por Liz-Marzán [13, 14],

que envolve a adição de AuNPs de 15 nm revestidas com PVP (seeds) a uma solução de

sal ácido tetracloroáurico (III) (percursor metálico) em DMF (agente redutor) na presença

de concentrações de PVP elevadas. Foi proposto um mecanismo de redução do sal de ouro

que se apresenta na Figura 1-3 e que se baseia na formação de um composto de coordenação

instável PVP−  DMF! − AuCl!! .[15]

Figura 1-3 Representação do mecanismo proposto para a reação entre DMF-PVP e HAuCl4 (adaptado de Kedia et al. [15]).

1.3 Interação nanopartícula-proteina

A interação entre nanopartículas e proteínas constitui, atualmente, um desafio da na-

notecnologia, uma vez que estes nanobioconjugados têm comportamentos complexos que

diferem dos comportamentos das proteínas e das partículas não conjugadas. A adsorção da

proteína à superfície da partícula pode ocorrer por interações de van der Waals, pontes de

hidrogénio, interações eletrostáticas, interações hidrofóficas e emparelhamento

5

π−π. Dependendo do tipo de ligação, quando há adsorção de proteína à superfície da nano-

partículas forma-se uma primeira camada de adsorpção, denominada “hard corona” que

pode ser mais ou menos densa, e eventualmente uma camada adicional, mais fracamente

adsorvida, denominada "soft corona" (Figura 1-4). [16]

A interação direta NP-proteína pode alterar a estrutura e conformação da proteína ad-

sorvida perdendo a sua função biológica e podendo-se tornar tóxica.[17] Uma estratégia

para preservar a estrutura e conformação da proteína, é a utilização de agentes de revesti-

mento, p.ex. péptidos, pré-adsorvidos à nanopartículas, tornando a superfície mais bio-

compatível.[16]

Figura 1-4 Coroa de proteínas na NP. A ligação da proteína à partícula pode levar a uma série de conse-quências, nomeadamente alterações conformacionais, que podem levar a mudanças na atividade biológica, fibrilação, ou estabilização de determinada conformação. (adaptado de Yang et al. [16]).

Os agentes de revestimento utilizados, são em regra, moléculas bifuncionais, em que

uma das extremidades da molécula tem a função de ligação à partícula, normalmente ex-

tremidades tioladas (-SH) ou aminadas (-NH2), e a outra extremidade tem a função de re-

conhecimento molecular para outras moléculas específicas. Estes agentes de revestimento

podem ser biomoléculas como péptidos, proteínas ou ácidos nucleicos, conferindo às partí-

culas as suas propriedades biológicas

No presente trabalho foram utilizados como agentes de revestimento o polímero po-

livinilpirrolidona (PVP), o ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA), que é um hidrocar-

boneto linear bifuncional com um grupo tiol numa extremidade e um grupo carboxílico na

6

outra, e um péptido, o CALNN que tem um grupo tiol no resíduo de cisteína da posição N-

terminal e que ficará com o terminal carboxilato dirigido para o exterior (Figura 1-5).

Para a formação de bionanoconjugados foi utilizada a enzima tirosinase (Figura 1-6)

que faz parte de uma família de metaloproteínas de cobre encontradas em fungos, plantas e

mamíferos, que catalisam duas reações distintas: a o-hidroxilação de monofenóis e a oxi-

dação-redução de o-difenóis a o-quinonas. [18]

Figura 1-5 Fórmula de estrutura1 dos agentes de revestimento utilizados: PVP, 11-MUA e CALNN.

1 Ilustrações produzidas recorrendo ao software ChemBioDraw da PerkinElmer Inc.

7

Figura 1-6 Estrutura cristalográfica da tirosinase de Agaricus bisporus (PDB-2Y9W).

1.4 Técnicas de caracterização e análise de nanopartículas e da intera-

ção destas com péptidos e proteínas

1.4.1 Espetrofotometria UV/Vis

A espetrofotometria UV/vis é uma técnica que é utilizada para determinar de um

modo quantitativo a concentração de substâncias em solução que absorvem radiação quan-

do são expostas à luz na gama do visível e ultravioleta, segundo a lei de Lambert-Beer,

equação 1, que relaciona matematicamente a absorvância, A, com a concentração, c, onde

ε representa o coeficiente de extinção molar e 𝑙 o percurso ótico, isto é, a distância que a

luz atravessa na amostra.

𝐴 = 𝜀. 𝑐. 𝑙   (1)

Ao longo de todo o trabalho experimental, as soluções coloidais de nanopartículas

foram sendo caracterizadas por esta técnica, não só para determinação da concentração das

partículas, mas também para verificar a formação de nanopartículas formadas durante das

sínteses e verificação da estabilidade coloidal.

1.4.2 Medidas de dispersão dinâmica de luz (D.L.S.) A técnica de dispersão dinâmica de luz (D.L.S.) é uma técnica, que permite medir o

raio hidrodinâmico de nanopartículas em solução. Nesta técnica a solução de nanopartícu-

las é iluminada por um laser monocromático e a sua intensidade de dispersão é detetada

por um dispositivo detetor de fotões com um ângulo de dispersão fixo ou variável. Devido

8

ao movimento Browniano das partículas a intensidade de dispersão é dependente do tempo

quando observada numa escala temporal de microsegundos. Estas flutuações são medidas

usando um método de autocorrelação em que cada intensidade de dispersão num dado

momento é comparada com a intensidade de dispersão noutro dado momento, um processo

que se vai repetindo ao longo do tempo.

Tais flutuações são relacionadas com o tamanho das partículas pela equação de Sto-

kes-Einstein, equação 2, onde d(H) é o raio hidrodinâmico, D o coeficiente de difusão

translacional, k a constante de Boltzman, T a temperatura absoluta e η a viscosidade. [19,

20]

𝑑   𝐻 =   !"!!"#

  (2)

1.4.3 Medidas de potencial zeta (Potencial ζ)

Numa solução iónica, as nanopartículas com carga tem à sua superfície uma camada

de iões de carga oposta fortemente ligada, formando uma camada denominada camada de

Stern, Figura 1-7. Devido ao movimento Browniano ou a força aplicadas, as partículas mo-

vem-se, e com elas há deslocamento de iões. Estes iões que se movem com as partículas

formam uma camada difusa que se distingue dos restantes iões em solução. O potencial

eletrostático entre estas camadas de iões que se movem com as partículas e os restantes

iões em solução é chamado de potencial ζ, Figura 1-7.[21]

Figura 1-7 Representação do potencial elétrico em função da distância da superfície de AuNPs (adaptado de Wikipédia [22]).

9

A medição de potencial ζ é feita aplicando um campo elétrico á solução coloidal e

medindo a molilidade eletroforética das partículas por D.L.S.. A determinação baseia-se na

aplicação da equação de Henry (equação 3), onde UE é a mobilidade eletroforética, ε a

constante dielétrica, η a viscosidade do solvente, ζ o potencial zeta e f(kR) a função de

Henry.[21]

𝑈! =  !!"!!𝑓(𝑘𝑅)   (3)

São consideradas partículas fortemente catiónicas, partículas com um potencial ζ su-

perior a +30 mV, neutras partículas entre -10 mV e +10 mV, e partículas fortemente anió-

nicas (ouro coloidal) abaixo dos -30 mV.

A medição do potencial ζ pode variar entre medições pois é sensível ao pH, tempera-

tura, força iónica e agente de revestimento. [21]

1.4.4 Microscopia eletrónica de transmissão (T.E.M.)

Na microscopia eletrónica transmissão um feixe de eletrões altamente energético in-

cide numa amostra de espessura fina interagindo e passando através dela. Forma-se uma

imagem quando o feixe transmitido é enviado através de lentes que ampliam e focam a

imagem, que é depois reproduzida num ecrã fluorescente. Esta é uma técnica que permite

analisar a estrutura e composição de materiais de origem não biológica (como nanopartícu-

las) ou biológica.

10

2 Objetivos

O trabalho desenvolvido teve como objetivo principal a preparação de nanopartículas

de ouro com formas anisométricas (estrelas) para preparação de bioconjugados com tirosi-

nase, com possível aplicação no desenvolvimento biossensores e em biorremediação.

Mais especificamente pretendeu-se sintetizar nanopartículas metálicas como suspen-

sões coloidais, com posterior funcionalização das mesmas com agentes adequados, adap-

tando métodos publicados ou métodos já desenvolvidos neste grupo de investigação, e

também, estudar a adsorção da tirosinase às nanopartículas funcionalizadas, utilizando me-

dições de potencial ζ.

11

3 Materiais e Métodos

3.1 Reagentes e Solventes

Todo o material de vidro utilizado no decorrer do trabalho experimental foi pré-

lavado com Aqua Régia, uma mistura de ácido clorídrico com ácido nítrico concentrado,

numa proporção de 3:1. Ao longo do trabalho experimental, foi utilizada, para a produção

de soluções e enxaguamento de material, água ultra pura Milli-Q2 (18,2 MΩ.cm). Também

foi utilizado, ao longo de todo o trabalho experimental, etanol (CH3CH2OH) absoluto

(99,5%) da Panreac, previamente filtrado por um filtro para seringa com membrana de po-

li(difluorovinidileno) (PVDF) com uma porosidade de 0,2 µm.

As soluções utilizadas na síntese de AuNPs foram preparadas utilizando ácido te-

tracloroáurico (III) (HAuCl4, solução a 30% (p:p) em HCl, 99,99% puro, Sigma-Aldrich).

Na síntese de AuNPs pelo método da redução do citrato, utilizou-se citrato de sódio di-

hidratado (Na3Cit) da Merck (p.a.). Na síntese de AuNSs pelo método de Liz-Marzán, uti-

lizou-se N,N-dimetilformamida (HCON(CH3)2) da Merck.

No processo de funcionalização de AuNPs e na síntese de AuNSs foi utilizado poli-

vinilpirrolidona (PVP) (10000 MM) da Sigma-Aldrich.

Para a funcionalização das AuNSs foram utilizados dois agentes de revestimento, o

ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA) (grau de pureza de 95%) da Sigma-Aldrich, e

um péptido, o CALNN (ASLO  Laboratory  ApS,  Dinamarca).

Para o estudo da estabilidade coloidal das nanopartículas utilizou-se ácido clorídico

(HCl) da Sigma-Aldrich, hidróxido de sódio (NaOH) da Pronolab (p.a.) e cloreto de potás-

sio (KCl) da Merck (p.a.).

A enzima, utilizada na adsorção às AuNSs foi a tirosinase (TYR) de cogumelo da Si-

gma-Aldrich. A enzima foi mantida em tampão fosfato, 100 mM, isento de cloretos (Cl-)

pH 6,5 a 3 °C.

2 Purificada no Laboratório de Química-Física desta Faculdade

12

3.2 Instrumentação

Na pesagem dos compostos utilizou-se uma balança analítica Kern ABS 120- 4

(±2x10-5 g) e uma balança semi-analítica Kern EMB 600-2 (± 1x10-2 g).

Na medição dos espetros de UV/vis recorreu-se a um espetrofotómetro UV/Vis de

feixe simples Vary Cary 50 Bio, utilizando uma célula de quartzo da Starna com um passo

ótico de 1 cm, no intervalo de 200-1000 nm de comprimento de onda.

As centrifugações das amostras, quando necessário, foram realizadas numa centrífu-

ga SIGMA 2-16K, utilizando dois rotores, um para tubos de falcon e outro para tubos ep-

pendorff, ver Tabela 3-I.

Tabela 3-I Características dos rotores utilizados.

Sempre que foi necessário realizar centrifugações iguais mas em rotores diferentes

ou equipamentos diferentes, analisou-se o tempo de centrifugação requerido para sedimen-

tar o mesmo material, quando a amostra é submetida a uma dada frequência de

rotação.[23] Assim sendo, o cálculo do tempo de sedimentação de uma partícula é calcula-

do integrando a equação 4,

𝜈! =!"!"

(4)

onde t define a velocidade terminal e r é uma coordenada medida sobre a trajetória da par-

tícula ao longo do eixo do tubo. Sabendo que a aceleração radial pode ser calculada por ω2r

e considerando partículas esféricas, obtemos a equação 5, através da qual podemos deter-

minar, por comparação o novo tempo requerido.[23]

Rotor 19776H (SIGMA) Rotor 12154H (SIGMA)

Raiomáx 9,3 cm 8,2 cm

Raiomin 3,1 cm 5,0 cm

Ângulo 25º 45º

RPMmáx 14000 rpm/min 26000 rpm/min

RFCmáx 20379 g 61973 g

13

𝑡 = !!𝜂 !!!(!!!!)!!

𝑙𝑛 !"#$!á!!"#$!"#

  (5)

A medição de potencial ζ, da polidispersão e/ou formação de agregados e do tama-

nho das partículas, foi realizada através do equipamento Zeta Sizer ZS da Malvern Intru-

mentsTM, com um laser de 4 mW de He-Ne (633 nm) com um ângulo de dispersão fixo de

173º. A medição de potencial ζ ou de tamanho hidrodinâmico de cada amostra corresponde

à média de três medições consecutivas com um intervalo de 5 segundos, limitando a volta-

gem do equipamento a 50 mV.

As imagens de microscopia eletrónica (T.E.M.) foram obtidas num microscópio HI-

TACHI H-81003. A análise das imagens obtidas foi realizada através do ImageJ4 e R5.

Para os estudos de estabilidade coloidal das AuNSs foi utilizado o espetrofotómetro

já referido e um potenciómetro Crison pH-meter BASIC 20+ com um elétrodo combinado

de vidro Crison (5208).

3.3 Procedimentos laboratoriais

3.3.1 Síntese de núcleos de crescimento (seeds) de ouro

A síntese de AuNPs (esféricas) foi efetuada segundo o método da redução do citra-

to.[12] Para tal, mediu-se 125 mL de água Milli-Q para um balão de três tubuladuras, à

qual se adicionou 86,4 µL da solução stock de HAuCl4 (1,445 M), e uma barra magnética

para agitação. Colocou-se o balão mergulhado num banho de parafina e procedeu-se à

montagem do dispositivo de refluxo. Ligou-se a placa de aquecimento a aproximadamente

130 °C e esperou-se que a solução entrasse em ebulição. Após a solução se encontrar em

ebulição adicionou-se rapidamente, uma solução aquosa de citrato de sódio (12,5 mL de

H2O + 0,142 g de citrato de sódio). No momento da adição, a mistura das duas soluções

adquiriu uma cor negra passando depois para uma cor vermelha. Deixou-se reagir durante

15 minutos e deixou-se arrefecer à temperatura ambiente.

3 Propriedade do Departamento de Engenharia dos Materiais do Instituto Superior Técnico de Lisboa. 4 Software de Análise e tratamento de imagem (http://rsbweb.nih.gov/ij). 5 Software de estatística computacional e gráfica (http://www.r-project.org).

14

3.3.2 Funcionalização de AuNPs com PVP

A funcionalização de AuNPs foi feita segundo o método de Liz-Marzán [13], no qual

se adiciona uma quantidade de PVP de aproximadamente 60 moléculas do polímero por

nm2 de área superficial de partícula.

Deste modo, calculou-se a área superficial total das nanopartículas de ouro da solu-

ção coloidal. Para tal, foi necessário calcular a área superficial e o volume de cada partícu-

la, bem como a concentração de partículas.

Para calcular a área superficial e o volume de cada partícula recorreu-se às equações

6 e 7. O raio utilizado nestas equações foi calculado através do diâmetro médio das partí-

culas. Este diâmetro foi, por sua vez, obtido atendendo à razão entre a absorvância da ban-

da plasmónica e a absorvância a 450 nm das partículas, equação 8.[24]

𝐴!"#!$% = 4𝜋𝑟! (6)

𝑉!"#!$% =!!𝜋𝑟! (7)

𝑑 = 𝑒

!"#!"#!"#!"!!"

!!,!"#$

!,!!!" (8)

A concentração de AuNPs foi calculada pela razão entre a quantidade total de Au da

solução (que corresponde à quantidade de Au inicial) e a quantidade de Au que existe em

cada partícula, equação 9, onde 𝐴𝑢 ! é calculada pela equação 10. O cálculo de 𝑛!"/!" é

feito pela equação 11, onde 𝑉!" é o volume da partícula (equação 7), 𝜌!" corresponde à

massa específica de Au e 𝑀𝑀!" corresponde à massa molar de Au.

𝐴𝑢𝑁𝑃𝑠 = !" !×!!"#"!"#$!!"/!"

(9)

  𝐴𝑢 ! =!"#!""!"×!,!×!"!!!

!,! (10)

𝑛!"/!" =!!"×!!"!!!"

(11)

15

Sabendo então a concentração total de AuNPs e a área superficial de cada partícula, a

multiplicação deste dois valores representa a área superficial total de ouro da solução. Nes-

te ponto, calculou-se a quantidade de PVP necessária para a funcionalização das partículas

(60 moléculas de PVP por nm2), equação 12.

𝑛!"! =!!"!#$  !"    !"#$%×!!"!×!"!"#é!"#$%  !"  !"!

!,!""×!"!"×𝑀𝑀!"! (12)

Tendo, então, sido calculada a quantidade de PVP a adicionar à solução coloidal de

AuNPs, procedeu-se à dissolução da quantidade referida de PVP em 5 mL de H2O e adici-

onou-se, gota a gota, a solução preparada à solução coloidal de AuNPs em agitação vigo-

rosa. Após duas horas em agitação vigorosa, deixou-se a funcionalização decorrer durante

a noite em agitação moderada.

3.3.3 Síntese de AuNSs

A síntese de AuNSs foi feita segundo o método de síntese de Liz-Marzán. [13, 14]

Centrifugaram-se diferencialmente AuNPs preparadas como foi descrito na secção

anterior, ressuspendendo o sedimento em 3 mL de etanol absoluto filtrado, de modo a ob-

ter diferentes soluções de AuNPs homogéneas, cada uma com tamanhos médios de partícu-

las diferentes.

Dissolveu-se 1,5 g de PVP em 15 mL de DMF, com ultra-sons. De seguida, em agi-

tação vigorosa, adicionaram-se 82 µL de solução de HAuCl4 50 mM, e esperaram-se 2 a 3

minutos antes de se adicionarem as AuNPs preparadas anteriormente. Após a adição destes

núcleos de crescimento (seeds) deixou-se o sistema em agitação vigorosa até não ocorre-

rem mais mudanças de cor. Deixou-se reagir durante a noite, sem agitação e ao abrigo da

luz.

Caracterizou-se a solução coloidal de AuNSs espetrofotometricamente, tendo-se

usado para a obtenção da linha de base uma solução de DMF/PVP idêntica à da síntese.

A quantidade de seeds adicionada depende do tamanho das estrelas que quisermos

obter, dado que quanto menor o rácio 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙! 𝐴𝑢 !""#!, menor será o tamanho das es-

trelas. O volume de solução de seeds adicionado foi calculado pela equação 13, onde

𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙! !"#$% é calculada tendo em conta o volume de solução de HAuCl4 (50 mM) adi-

cionado e o volume de DMF e 𝐴𝑢 !""#! é calculada segundo a equação 10.

16

𝑉!""#! =!á!"#

!"#$%! !"#$%×!!"#

!" !""#! (13)

3.3.4 Centrifugação das AuNSs

Foram realizadas duas séries de centrifugações das AuNSs, ambas a 10000 rpm du-

rante 20 minutos (a 20 °C) no rotor 19776H. Sempre que foi necessário a utilização de um

equipamento diferente, recorreu-se à equação 5 para calcular o novo tempo requerido.

O sobrenadante da amostra centrifugada, foi desprezado e o sedimento foi ressus-

pendido em etanol absoluto filtrado, na primeira série, e em água Milli-Q na segunda série.

3.3.5 Determinação da concentração e da área superficial das AuNSs

Foi necessário fazer uma estimativa da concentração e da área superficial das AuNSs

para o seu processo de funcionalização. Para tal foi necessário assumir duas premissas:

1. A reação de síntese de AuNSs é completa, isto é, não se formam novas par-

tículas, nem as partículas existentes são destruídas. Assim o número de es-

trelas na solução será igual ao numero de seeds adicionado.

2. O ouro adicionado para a formação das pontas das estrelas (tips) é comple-

tamente reduzido e distribui-se igualmente por todas as partículas.

Deste modo, a concentração de AuNSs em DMF, é igual à concentração de seeds que

são adicionadas durante a síntese. Dado que durante as centrifugações há perda de material,

utilizou-se este pressuposto para calcular o coeficiente de extinção molar a 400 nm das

AuNSs obtidas directamente da síntese e determinou-se a concentração das soluções de

AuNSs após centrifugação medição de absorvância a 400 nm.

Partindo da segunda premissa calculou-se a quantidade de ouro que se deposita em

cada partícula para a formação das tips, dividindo as moles de ouro adicionadas pelas mo-

les de seeds.

Sabendo a quantidade de ouro que cada AuNS tem, dividiu-se essa quantidade pela

quantidade de ouro total existente na solução, que se obtém atendendo à absorvância a 400

nm, ver equação 8. Estes cálculos foram repetidos a cada centrifugação.

Para calcular a área superficial das estrelas assumiu-se, hipoteticamente, que o cres-

cimento é esférico. Este cálculo dá-nos uma aproximação de uma área entre o núcleo da

partícula e a área superficial real da partícula.

17

Assim, recorreu-se à equação 14 [6] para calcular o raio da partícula, onde 𝑟!"#$! é o

volume da partícula, 𝑟!""#! é o volume da seed, 𝑚!" é a massa de ouro adicionada para o

crescimento das tips, 𝜌!" é a massa específica do outro e 𝑛!""#! é a quantidade de seeds

adicionadas. Tendo a aproximação do raio da partícula, através da equação 4, obtemos uma

aproximação da sua área superficial.

𝑟!!"#! = 𝑟!""#! + 3 4!!"

!!!"!!""#! (14)

3.3.6 Funcionalização de AuNSs com o péptido CALNN e MUA

As estrelas foram funcionalizadas com 4 a 6 moléculas de agente de revestimento

por nm2 de área superficial. Após o cálculo da quantidade necessária de agente de revesti-

mento para funcionalizar a solução coloidal de AuNSs, prepararam-se as respetivas solu-

ções dos agentes de revestimento: o CALNN e 11-MUA.

As soluções de CALNN foram preparadas através de diluições de uma solução stock

com uma concentração de 4,68 mM. As soluções de 11-MUA foram também preparadas

através de diluições de uma solução previamente preparada com uma concentração de 10

mM.

Adicionaram-se diferentes volumes das soluções de CALNN e 11-MUA, às partícu-

las e deixaram-se reagir durante a noite. As soluções coloidais de AuNSs resultantes foram

caracterizadas espetrocfotometricamente, e foram feitas medições de potencial ζ. As dife-

rentes concentrações de agentes de revestimento que se adicionaram às partículas encon-

tram-se na secção de resultados.

3.3.7 Formação dos bionanoconjugados com tirosinase

A formação de bionanoconjugados ocorre pela adsorção da enzima à superfície da

partícula após esta ser previamente funcionalizada com péptido. Neste projeto a enzima

que foi utilizada foi a tirosinase (TYR).

Os estudos de adsorção da enzima às partículas foram feitos realizando uma isotér-

mica de Langmuir, na qual se avalia a o ponto de saturação de ligação da enzima à partícu-

la. Foram adicionadas às partículas diferentes concentrações de enzimas acima e abaixo de

uma valor de referência.

18

Esse valor de referência foi estimado dividindo a maior área seccional da enzima pe-

la área superficial da partícula, ou seja, calculando a quantidade máxima de enzima que se

conseguiria adsorver à superfície da partícula.

Preparou-se, então, uma solução de TYR em tampão fosfato (isento de cloreto) a par-

tir da diluição de uma solução stock com uma concentração de 20,8 µM.

Adicionaram-se diferentes volumes da solução de TYR às partículas, deixaram-se

incubar durante a noite à temperatura ambiente. As soluções coloidais resultantes foram

caracterizadas espetrofotometricamente e foram feitas medições de potencial ζ e tamanho

hidrodinâmico. Os detalhes dos volumes e da concentração das soluções estão especifica-

dos na secção de resultados.

3.3.8 Caracterização das nanopartículas

3.3.8.1 Espetrofotometria de UV/Vis

Os ensaios foram realizados em células de quartzo, numa gama de comprimento de

onda entre os 200 nm e os 1000 nm.

3.3.8.2 Medições de potencial ζ

Transferiu-se lentamente para uma célula apropriada para medições ζ (poliestireno

com eléctrodos metálicos, Malvern) 0,7 mL de AuNPs, de forma a garantir que a amostra

não contivesse bolhas de ar e que os elétrodos estivessem completamente imersos. Colo-

cou-se a célula no compartimento do Zeta Sizer Nano ZS, e ajustou-se, para cada medição,

a voltagem (fixada a 50 mV), o número de medições e a temperatura.

3.3.8.3 Medições de tamanho hidrodinâmico

Transferiu-se para uma célula descartável apropriada para medições de tamanho hi-

drodinâmico (plástico, Malvern) 1 mL de AuNPs. Colocou-se a célula no compartimento

do Zeta Sizer Nano ZS, e ajustou-se, para cada medição, o número de medições e a tempe-

ratura.

19

3.3.8.4 Microscopia Eletrónica (T.E.M.)

Na preparação de amostras para T.E.M. depositou-se cerca de 10 µL de AuNPs nu-

ma rede de cobre revestida com carbono/”formvar” de 200 mesh de TAAB, deixando-se

secar ao ar, à temperatura ambiente, tendo sempre o cuidado de proteger a amostra de

quaisquer contaminantes. A observação das amostras no microscópio eletrónico ficou ao

cuidado do Doutor Pedro Quaresma.

3.3.9 Estudo da estabilidade coloidal das AuNSs

Foram feitos estudos de estabilidade coloidal para as AuNSs em função da variação

do pH e da variação da concentração iónica, esta última através da variação da concentra-

ção de cloreto de sódio (NaCl).

Para os estudos da estabilidade em função da variação do pH, prepararam-se várias

alíquotas de 2 mL de AuNSs e adicionaram-se diferentes volumes de HCl e NaOH, sob

agitação magnética, de forma a obter uma gama de pH compreendida entre 3 e 10. Três

minutos após o pH da solução estabilizar, esta foi caracterizada espetrofotometricamente.

Para os estudos da estabilidade em função da variação da concentração de cloreto de

sódio, prepararam-se várias alíquotas de 2 mL de AuNSs , adicionou-se solução de NaCl

para obter diferentes concentrações deste sal e, três minutos após a adição, as soluções fo-

ram caracterizadas espetrofotometricamente. Os detalhes das concentrações de sal adicio-

nadas encontram-se na secção de resultados.

20

4 Resultados

4.1 Síntese e funcionalização de AuNPs esféricas pelo método da redu-

ção do citrato

Foi utilizado o método de Turkevich [12], o método mais simples e vulgar, para sin-

tetizar AuNPs com baixa dispersão de tamanho. Este método consiste na redução do sal de

Au+3 a Au0 (ouro metálico) pelo citrato de sódio, usando água como solvente.

Através da análise espetrofotométrica da amostra da solução de AuNPs que foi sinte-

tizada, Figura 4-1, observamos uma banda plasmónica bem definida a 520 nm, tal como se-

ria de esperar.[6] Além disso, pudemos também verificar que a banda plasmónica é bastan-

te estreita, o que é indicativo que a solução contém uma dispersão de tamanhos bastante

reduzida, isto é, é homogénea e bem estabilizada pelo agente de revestimento.

Estimou-se um diâmetro das AuNPs de 14,3 nm pelo método de Haiss [24], a partir

da razão 𝐴!"#!" 𝐴!"#, ver secção 3.3.2,. A concentração das partículas estimada, tal co-

mo está descrito na mesma secção, foi de 6,2 x 10-9 M.

Pelas imagens de T.E.M da solução, Figura 4-1, verificou-se que as partículas exibem

uma forma esférica e, através do tratamento estatístico das imagens, obteve-se um valor do

diâmetro médio das partículas de 13,7 ± 1,5 nm, que está de acordo com o calculado a par-

tir da razão 𝐴!"#!" 𝐴!"#.

As medições de D.L.S., indicaram que o raio hidrodinâmico das AuNPs é de 16,0 ±

3,6 nm com um potencial ζ de -45 ± 19 mV, um valor concordante com o apresentado na

literatura.[25]

Na Tabela 4-I apresentam-se os resultados da caracterização das AuNPs obtidas

diretamente da síntese e após funcionalização com PVP.

Tabela 4-I Comparação do dimâmetro médio das AuNPs antes e após a funcionalização com PVP obtidos por três técnicas diferentes.

𝐴!"#!" 𝐴!"# T.E.M D.L.S.

AuNPs 14,3 nm 13,7 ± 1,5 nm 16,0 ± 3,6 nm

AuNPs + PVP 19,1 nm - 18,7 ± 1,4 nm

21

4.2 Funcionalização das esferas com o PVP

Após a funcionalização das partículas com PVP, a análise espetrofotométrica revelou

uma pequena diminuição na absorvância, Figura 4-1. Esta diferença está certamente relacio-

nada com a mudança do agente de revestimento, de citrato para PVP, que provoca uma al-

teração do índice de refração. O diâmetro das partículas medido por D.L.S. foi de 18,7 ±

1,4 nm, ver Tabela 4-I. Este aumento do diâmetro da partícula é expectável, já que o PVP é

um polímero de grandes dimensões, relativamente ao citrato. No que diz respeito ao

potencial ζ obteve-se um valor de –37,2 ± 13 mV. Este valor é significativamente menor

do que o obtido para as partículas revestidas com citrato, o que está de acordo com o facto

do agente de revestimento ser neutro.

Figura 4-1 A - espetro de extinção da solução de AuNPs sintetizada pelo método da redução do citrato antes e após a funcionalização com o PVP; B- espetro de extinção das seeds, em etanol, após 1 a 4 centrifugações, normalizado ao máximo de absorção; C - imagem obtida por T.E.M. da solução de AuNPs antes da funcionalização com PVP e respetiva análise estatística do tamanho das partículas.

22

4.3 Síntese de núcleos de crescimento de ouro

Apesar da solução de AuNPs ser bastante homogénea, existem em solução partículas

de diferentes tamanhos, que variam aproximadamente entre os 15 e 20 nm. Para se obte-

rem suspensões de partículas mais homogéneas, foram realizadas séries de centrifugações

diferenciais, com o mesmo tempo de rotação, mas com crescentes forças centrípetas, tal

como está descrito na Tabela 4-II. Os espetros das solução obtidas destas centrifugações en-

contram-se na Figura 4-2. Apresentam-se também, na Tabela 4-II os resultados corresponden-

tes à caracterização de cada uma das soluções coloidais obtidas na centrifugação diferenci-

al. Apresentam-se também os tamanhos pelo método de Haiss [24]. Embora este método

não seja diretamente aplicável a partículas revestidas com PVP, dado que foi desenvolvido

para partículas revestidas de citrato, verificou-se apenas pequenas alterações no espetro das

partículas originais após mudança do agente de revestimento, pelo que é legítimo utilizar a

mesma metodologia para estimar o tamanho das partículas revestidas com PVP, embora

seja de esperar que estes diâmetros estejam afetados de um maior erro.

Figura 4-2 A- espetro de extinção de solução das seeds, em etanol, após sofrerem as respetivas centrifugações; B - espetro de extinção das AuNSs, em etanol, sintetizadas com as seeds diferenciais.

23

Tabela 4-II Descrição das centrifugações diferenciais das AuNPs.

4.4 Síntese de AuNSs

Foram sintetizadas amostras de 7 mL de AuNSs com um rácio 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙! 𝐴𝑢 !""#!

de 9, ver secção 3.3.3, com as AuNPs de diferentes tamanhos obtidas através das

centrifugações diferenciais, descritas na subsecção anterior.

O espetro de UV/vis das amostras de AuNSs representados na Figura 4-2, apresentam

duas bandas típicas de AuNSs: uma próxima dos 550 nm, que corresponde à banda de

absorção do núcleo da partícula, e outra compreendida entre 650 e 700 nm que

corresponde à banda de absorção das tips.

Verificou-se também que as AuNSs sintetizadas com seeds de tamanhos diferentes

apresentam a banda correspondente ao núcleo a comprimentos de onda semelhantes, mas

desvios significativos da banda correspondente às tips.

Rodríguez-Oliveros et al. [2] relacionaram o comprimento de onda da banda

plasmónica com o número de tips das estrelas, Figura 4-3, concluindo que a banda

plasmónica sofre um desvio para comprimentos de onda maiores com o aumento do

número e razão de aspeto das tips. Comparando os seus resultados e a observação do

espetro obtido, Figura 4-2 e das imagens de T.E.M., Figura 4-5, podemos inferir que as

AuNSs sintetizadas tem 5 a 6 tips no plano Π.

Como a amostra sintetizada com as seeds da centrigugação 3, seeds com um

diâmetro aproximado a 18 nm, foi a que apresentou uma melhor separação entre a banda

do núcleo e a banda das tips, a continuação do trabalho experiemental foi baseado na

reprodução dessas seeds.

O passo seguinte foi, com as seeds da centrifugação 3, sintetizar amostras de AuNSs

com rácios 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙! 𝐴𝑢 !""#! de 11 e 15 e compará-las com a amostra de rácio 9. A

caracterização espetrofotométrica e de T.E.M. destas amostras encontra-se na Figura 4-2 e 4-

5 respetivamente.

Centrifugação 1 2 3 4

RPM 5000 7000 10000 12000

Tempo / min 20 20 20 20

Banda Plasmónica 526,0 524,0 522,9 524,0

Diâmetro médio / nm 19,3 18,9 17,9 15,9

24

Figura 4-3 Representação esquemática da uma AuNS de 4 tips no plano 𝚷 e 2 tips no plano 𝚺, e espetro de

extinção de AuNSs com diferentes números de tips.

Pelas imagens de T.E.M. observou-se que as diferentes suspensões tem uma boa

dispersão de tamanho e que o diâmetro médio das partículas corresponde ao calculado

através da equação 11 descrita na secção 3.3.5, Tabela 4-III.

Tabela 4-III Comparação do diâmetro calculado com o obtido por T.E.M das AuNSs sintetizadas com diferentes rácios.

Comparando estas amostras, selecionaram-se as AuNSs de rácio 15, dado que apre-

sentam uma maior separação entre a banda do núcleo e a banda das tips (Figura 4‑2-B),

para continuar o trabalho experimental. Deste modo, procedeu-se à síntese de um stock de

AuNSs. Após a síntese de 120 mL de AuNSs de rácio 15, voltou-se a caracterizar a solu-

ção coloidal espetrofotometricamente e por T.E.M., Figura 4‑4 e 4-5-D respetivamente.

O diâmetro médio esperado para as particulas foi de 45,3 nm, um tamanho que não

difere muito do tamanho obtido por análise de imagens de T.E.M. que foi de 50,2 ± 8,5 nm.

A funcionalização das AuNSs em solução aquosa implica a lavagem do DMF, ver

secção 3.3.4. Após cada lavagem, caracterizou-se espetrofotometricamente a solução para

determinar a sua concentração de partículas, ver secção 3.3.5.

Fig. 1. (a) Schematic representation of a 4-fold nanostar, with two relevant symmetryplanes: the plane ! where the number of tips is varied and the polarization plane ". (b)Absorption cross sections for Au nanostars with different number of tips from S1 to S6,along with that for the equivalent Au nanosphere.

electromagnetic field distribution on the surface of the nanostars at the LSPRs, from which theabsorption cross section is worked out, as needed to determine the steady-state temperature ofa metallic NP.

2. LSPRs of gold nanostars

Let us consider a NS whose geometrical shape is described as a deformable parametric surfacecalled Supershape [20], which depends on certain parameters that basically modify the sphereformula in spherical coordinates. Particularly, we fix a configuration of parameters that allowus to change the number of tips in a star-like volume, preserving its shape. In order not tointroduce too much complexity in the system under study, we only vary the number of tips inthe plane ! (see Fig. 1(a)) from n = 1 to n = 6. In the perpendicular plane ", the symmetryof the number of star tips is kept constant in such a way that two opposing tips, one pointingupwards and the other one downwards. We will refer to the nanostar with n tips in the plane !as Sn. Such star-like shapes indeed closely resemble those of fabricated colloidal NSs [13].In Fig. 1(b) the absorption cross section is plotted for NSs made of gold described by the

dielectric constant reported in reference [21]. The incident field is a plane wave impingingfrom the bottom, its plane of incidence being the plane ", Fig. 1(a). NSs have arms 40 nm long,and increasing number of tips. The LSPRs for Au-NSs are red-shifted when the number of tipsin the plane! increases from S1 to S6: #LSP (nm)=521, 548, 560, 587, 628, 688, respectively. InFig. 2(a-f) we have plotted the norm of the surface electric field (SF) of the NSs in logarithmicscale. As a general result, the SF is accumulated on the vertex of the NSs, thereby providinglarge field enhancements, about |E|2 ! 104. Incidentally, these values make nanostars suitablefor SERS applications [11, 13]. Essentially, such SF patterns results from the dipolar characteron the plane ! of the corresponding lowest-energy LSPR. In addition, SF enhancements at theLSPR grow for increasing number of tips from S1 to S6, in agreement also with the absorptioncross section in Fig. 1(b), that shows the same trend from S1 to S6; except for S2, which hasan absorption cross section and SF slightly larger than expected, presumably due to its 2-tipsymmetry along the polarization axis, specially suited to match the dipolar LSPR pattern. Inthis regard, the NS asymmetry on the plane " along the polarization axis reduces its quality asdipole-like resonant cavity.

3. Temperature profile of optically heated gold nanostars

From the point of view of the applicability for thermal therapy, such large absorption crosssections make Au NSs good candidates to be used as heat sources.

�����������������86' 5HFHLYHG����6HS�������UHYLVHG���'HF�������DFFHSWHG���'HF�������SXEOLVKHG����'HF�����(C) 2012 OSA 2 January 2012 / Vol. 20, No. 1 / OPTICS EXPRESS 623

AuNSs Calculado T.E.M

Rácio 9 38,8 nm 36,1 ± 6,05 nm

Rácio 11 41,2 nm 39,7 ± 5,30 nm

Rácio 15 45,3 nm 47,6 ± 9,09 nm

25

Pela observação do espetro da Figura 4‑4, calculou-se que houve uma perda de partí-

culas, cerca de 14%, durante a lavagem de DMF para etanol, e uma perca de cerca de 16 %

durante a lavagem de etanol para água. Observa-se pela figura que para diferentes solven-

tes há desvios da banda plasmónica, facto que se poderá dever ao diferentes índice de re-

fração para cada solvente. As concentrações das soluções após cada lavagem, apresentam-

se na Tabela 4-IV.

Tabela 4-IV Concentração do stock de 120 mL AuNSs antes e após as centrifugações.

Figura 4-4 Espetro de extinção das amostras do stock de 120 mL de AuNSs em DMF, etanol e água.

400 500 600 700 800 900 1000" (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs

AuNSs (DMF)AuNSs (Etanol)AuNSs (Água)

395 400 405 410

0.235

0.24

0.245

0.25

1ª centrifugação 2ª centrifugação

Solvente DMF Etanol H2O milli-Q

[AuNP’s] / nM 8,33x10-2 7,15x10-2 6,97x10-2

26

Figura 4-5 Imagens de T.E.M. e análise estatística do diâmetro médio das soluções de AuNSs sintetizadas a partir de seeds com 18 nm de diâmetro. A - 7 mL de AuNSs de rácio 9; B - 7 mL de AuNSs de rácio 11; C - 7 mL de AuNSs de rácio 15; D - 120 mL de AuNSs de rácio 15.

27

4.5 Estudo da estabilidade coloidal das AuNSs

O propósito do estudo da estabilidade coloidal de AuNSs foi de perceber quais os li-

mites de pH e concentração de NaCl aos quais as AuNSs são estáveis em solução. Por ou-

tro lado, as partículas funcionalizadas são mais sensíveis a variações de pH e de força ióni-

ca, e portanto a alteração destes parâmetros, na gama em que as partículas sem funcionali-

zação são estáveis, permite de uma forma qualitativa avaliar se a funcionalização ocorreu.

No estudo do efeito do pH na solução de AuNSs, para uma gama de pH entre 3 e 10

verificou-se por espetrofotometria de UV/vis, Figura 4-6-A, que as alterações da banda

plasmónica não são significativas, podendo-se inferir que dentro desta gama de pH as

AuNSs são muito estáveis. As pequenas diferenças no deslocamentos das bandas poderá

ser efeito da alteração do índice de refração, à medida que se altera o pH da solução.

No estudo do efeito da variação da concentração iónica seria de esperar que, com o

aumento da concentração de NaCl, o estado de agregação aumentasse, mas tal não foi veri-

ficado. Pela observação dos espetros, Figura 4-6-B, deparamo-nos com resultados anómalos.

Estudos simultâneos feitos pela Mestre Leonor Soares indicam que o aumento da concen-

tração de NaCl promove uma destruição das tips das AuNSs. As imagens T.E.M., realiza-

das pela própria, revelam partículas com formas mais arredondadas à medida que se adici-

ona sal às AuNSs.

4.6 Funcionalização das AuNSs

De forma a averiguar se as AuNSs são passíveis de serem funcionalizadas com agen-

tes de revestimento tiolados, foram conduzidos testes nos quais se funcionalizaram AuNSs

com dois agentes de revestimento diferentes: o péptico CALNN e o polímero 11-MUA.

Sabendo de antemão a concentração, volume e área superficial das partículas, e adi-

cionando cerca de 6 ligandos por nm2 de área superficial, a concentração de agente de re-

vestimento numa amostra de 1,5 mL de partículas é 4,0 nM, ver secção 3.3.6.

O potencial ζ das amostras antes, após e 6 dias depois da funcionalização com os

agentes de revestimento encontram-se na Tabela 4-V e na Figura 4-7, onde também se encon-

tra o espetro UV/vis das amostras.

28

Figura 4-6 Espetros de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs após a variação com o pH (A) e com a força iónica (B). Imagens de T.E.M.6 de AuNs sem adição de NaCl (C), com 0,5M de NaCl (D) e 3M de NaCl (E).

6 Imagens T.E.M. cedidas gentilmente pela Mestre Leonor Soares.

29

Figura 4-7 A – espetro de extinção de aliquotas de 1,5 mL de AuNSs funcionalizadas com CALNN e 11-MUA antes e após a diminuição do pH; B – espetro de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH; distribuição do potencial ζ das AuNSs funcionalizadas com o CALNN logo após a funcionalização (C e D) e 6 dias depois (E e F), com o 11-MUA (G e H) e da funcionalização de 10 mL de AuNSs com CALNN (I e J).

30

Tabela 4-V Medições de Potencial ζ das AuNSs antes e após a funcionalização.

Para além de se verificar que houve funcionalização através da alteração do potencial

ζ, já que este sofreu um aumento, diminuiu-se o pH das amostras e caracterizaram-se espe-

trofotometricamente. Ao diminuir o pH ocorre uma protonação do agente de revestimento

que leva à agregação das partículas, Figura 4-7(A). A agregação de AuNSs é visível no espe-

tro UV/Vis quando há um aumento da absorvância a comprimentos de onda superiores ao

comprimento de onda da banda correspondente às tips, um fenómeno que é devido ao aco-

plamento das plasmónicas de superfície. Assim, pudemos confirmar que houve funcionali-

zação.

A fase que se seguiu no trabalho experimental, foi a reprodução da funcionalização

das AuNSs numa escala maior, isto é, procedeu-se à funcionalização de 10 mL de AuNSs.

A caracterização espetrofotométrica e de potencial ζ encontra-se na Figura 4-7(I-J) e na Tabe-

la 4-V. Relativamente ao potencial ζ verificou-se que este se alterou (aumentou), mas rela-

tivamente ao espetro de absorção após a dimimuição do pH não se verifica grandes altera-

ções, apenas um pequeno desvio. Estes resultados não invalidam que ocorra funcionaliza-

ção, mas poderão querer dizer que o processo de agregação não segue uma padrão linear à

medida que se aumenta a escala de funcionalização, ou que durante o processo de funcio-

nalização a homogeneidade do péptido na solução de AuNSs seja menor a uma escala

maior.

CALNN 1 CALNN 2 MUA 1 MUA 2

Potencial ζ inicial / mV - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0

Potencial ζ após / mV - 33,03 ± 24,9 - 19,87 ± 29,6 - 9,00 ± 10 - 10,93 ± 10,7

Potencial ζ (6 dias) / mV - 15,67 ± 12,2 - 21,97 ± 21,8 - -

Potencial ζ 10 mL / mV - 33,47 ± 26,8 - 29,13 ± 30,4 - -

31

4.7 Formação de bionanoconjugados de tirosinase

Para a formação dos bionanoconjugados com tirosinase, calculou-se, como descrito

na secção 3.3.7, uma aproximação do valor máximo de enzima que se liga a cada partícula:

194 unidades enzimáticas por AuNSs, ou seja, aproximadamente 1,6 ng de enzima por ml

de solução de AuNSs. Como também está descrito nessa mesma secção, foram preparadas

várias alíquotas de AuNSs em que se adicionaram concentrações de enzima acima e abaixo

do valor calculado, Tabela 4-VI. Os resultados das medições de potencial ζ e de D.L.S. en-

contram-se também descritos na Tabela 4-VI e no gráfico da Figura 4-8. A caracterização es-

petrofotométrica também foi realizada, e os seus resultados encontra-se na Figura 4-9.

Os resultados obtidos não foram os resultados esperados. Esperava-se que o potenci-

al ζ fosse aumentando com o aumento da concentração de enzima até atingir um ponto de

saturação de ligação à partícula.

Relativamente às medições de D.L.S., os resultados também não foram os esperados,

já que era esperado um aumento do raio hidrodinâmico da partícula à medida que mais en-

zima se liga à partícula. Destes resultados pode-se presumir que há ocorrência de alguma

agregação, pois a amostra 1, sem adição de enzima, revela um diâmetro médio aproxima-

damente o dobro do diâmetro médio das AuNSs.

No que diz respeito ao resultados espetrofotométricos, embora revelem ligeiras alte-

rações, sem ocorrer agregação das partículas, estes parecer ser também inconclusivos.

Tabela 4-VI Resultados do potencial ζ e de D.L.S. de soluções de AuNSs com diferentes concentrações de enzima.

1 2 3 4 5 6 7 8

AuNPs / mL 1 1 1 1 1 1 1 1

VTYR / µL 0 13 33 44 65 131 327 600

Vtampão / µL 400 400 400 400 400 400 400 400

𝑉!!!/ µL 600 587 567 556 535 469 273 0

overnight

Potencial ζ / mV - 21,3 ±

25

- 12 ±

14,9

- 10,2 ±

19,6

- 14,6 ±

20,3

- 15,5 ±

17,5

- 15,8 ±

16,9

- 15,7 ±

21,8

- 18,6 ±

21,2

Diâmetro / nm 86,3 ±

0,51

37, 1 ±

0,51

67,5 ±

0,51

37,5 ±

0,51

34,2 ±

0,58

81,91 ±

0,47

66,2 ±

0,60

88,6 ±

0,44

32

Figura 4-8 Representação gráfica do potencial ζ e do diâmetro médio das partículas em função da quantida-de de enzima adicionada.

Figura 4-9 Espetro de extinção das AuNSs em função da quantidade de enzima adicionada.

0 100 200 300 400 500 600

TYR (µL)

-25

-20

-15

-10

-5

0

Pote

ncia

l % (m

V)

20

40

60

80

100

Diâ

met

ro m

édio

(nm

)

Potencial %D.L.S.

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

Abs

01234567

33

5 Considerações finais

Os métodos de síntese de AuNPs e de AuNS já se encontram muito bem optimizados,

contudo, ao longo da realização do trabalho experimental, verificou-se que a centrifugação

diferencial de AuNPs com PVP permite obter soluções de seeds mais homogéneas relati-

vamente ao tamanho. Isto torna-se muito relevante durante a síntese de AuNSs, pois permi-

te um maior controlo do tamanho e forma final das AuNSs, bem como uma maior reprodu-

tibilidade.

No que se refere à estabilidade coloidal das AuNSs verificou-se que estas são muito

estáveis numa gama de pH entre 3 e 10, o que permite de uma forma rápida validar a fun-

cionalização das partículas através da agregação destas quando se diminui o pH.

A uma pequena escala (alíquotas de 1,5 mL) verifica-se que as AuNSs são passíveis

de serem funcionalizadas, mas tal não se verificou quando se aumentou a escala para 10

mL. Para se ter a certeza de que a funcionalização ocorreu seria imprescindível a utilização

de outras técnicas mais sensíveis como a espetroscopia fotoeletrónica de raios-X (XPS).

Já relativamente aos estudos de estabilidade coloidal de AuNSs com a variação da

força iónica é necessário realizar estudos mais profundos para perceber a forma como o sal

(NaCl) destrói as tips.

Quanto à formação de bionanoconjugados, os resultados revelaram-se inconclusivos,

sendo necessário estudos mais aprofundados para perceber se ocorre realmente adsorção da

enzima à superfície das partículas e como é que estes bionanoconjugados se comportam.

Assim, em estudos futuros, seria interessante repetir a preparação dos bionanoconjugados a

concentrações menores de tampão fosfato e com concentrações menor de enzima, pois é

presumível que à gama de concentrações utilizadas a enzima já se encontre no seu ponto de

saturação de ligação à partícula.

34

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