Isolamento de ácidos nucléicos
de células e tecidos
Extração de ácidos nucléicos
Obtenção do material:
• Vírus
• Bactérias; fungos
• Célula vegetal / célula animal
Extração de ácidos nucléicos
Requerimento essencial: • quantidade (rendimento)• pureza• integridade
Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:• Lise física ou bioquímica das paredes celulares
e membranas• Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação /
inativação de proteínas celulares• Precipitação
Extração de ácidos nucléicos
1. Rompendo membranas celulares
Lise das células liberação dos componentes
citoplasmáticos e/ou nucleares
Estratégia: de acordo com o tipo de célula
envolvida: (deve ser o mais “gentil” possível)
- bactérias (parede glicoproteica) tratamento
inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução
hipotônica); outras soluções alternativas:
temperatura elevada; sonificação
Extração de ácidos nucléicos
Células de plantas ou animais presentes em tecidos:
• Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização
• Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.
Extração de ácidos nucléicos
Células sem cobertura externa ou em solução:
Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas
solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3
2. Desnaturando proteínas celulares:
Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas:
- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.- Fragmentos de membrana lipídica- Proteínas intracelulares: enzimas nucleases
degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos
Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: - Extração em baixas temperaturas- Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes
de proteínas- Agentes que retardam atividade das nucleases:
Extração de ácidos nucléicos
Agentes que retardam atividade das nucleases: - tampões de extração com agentes quelantes
(EDTA – ácido etileno diaminotetracético)- Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico
desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração
- RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )
Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas
Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação
Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas
(emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol)
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos)
interface: proteínas
camada do fenol
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico)
3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA)
interface: proteínas
camada do fenol
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
pH
pH neutro
ou básico
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de RNA (fenol com pH ácido)
3 fases: aquosa (RNA)
interface: proteínas
camada do fenol (DNA)
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
pH
pH ácido
Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool
DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC -20º C
DNA precipitado
Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool
RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) –
incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC
RNA precipitado
Extração de ácidos nucléicos com fenol DNA RNA
Camada aquosa (RNA)Interface (proteínas)Camada de fenol (DNA)
Fenol pH neutro/alc. Fenol pH ácido
DNA pptado RNA pptado
Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total
Extração de ácidos nucléicos
Extração de ácidos nucléicos
Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico
M 1 2 3
M - Marcador
1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico
Extração de ácidos nucléicos
• Soluções utilizadas• tampão de extração• solução de lise• solução desnaturante de proteínas• fenol• clorofórmio• Etanol• Proteinase K
Extração de ácidos nucleicos
Função dos reagentes • Tampão: proporciona um pH ideal para
manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético).
• Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate.
• Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.
Extração de ácidos nucléicos
Função dos reagentes • Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a
eficiência da extração de ácidos nucléicos.
• Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA)
DEPC – dietil pirocarbonato).
• Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio).
• Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K
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