Érica Guilhen Mario
Metabolismo do tecido adiposo epididimal
de camundongos com deleção genética do
receptor MAS.
Tese de mestrado apresentado ao programa de
Pós-graduação em Ciências Biológica – Fisiologia e
Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais como
requisito parcial à obtenção do título de mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Leida Maria Botion.
Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
2007
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Aos meus pais Gilberto e Clélia, meu irmão Everton e ao
querido Alexandre.
ii
Agradecimentos
A Deus, muito obrigada pela dádiva da vida e por estar sempre presente em cada
passo da minha trajetória.
Aos meus pais, Gilberto e Clélia, que tantos sacrifícios dedicaram à minha formação
pessoal e profissional, que muitas vezes renunciaram aos seus sonhos para que eu
pudesse realizar os meus.
Ao meu irmão, Éverton e familiares que são a base de tudo que tenho e sou.
Com grande alegria agradeço à minha família mineira Aline, Adriano, Maria de Paula e
Otávio, que muitas vezes foram à base da minha solidificação em Minas Gerais.
Agradeço ao Alexandre o grande apoio, paciência e amor que foram importantes
durante essa jornada.
A Profª Drª Leida Maria Botion pela sua orientação e profissionalismo, imprescindíveis
na minha formação científica.
Aos colegas do laboratório de metabolismo celular: Adriana, Ana Carolina, Gilbert,
Natália, Jonas.
Agradeço de coração as minhas grandes amigas: Adaliene, Laura e Zélia que tanto
contribuiriam com este trabalho, mas que acima de tudo tornaram-se amigas de
coração.
Ao Prof. Dr. Robson Augusto S Santos por ter me socorrido na hora crucial e ter
confiado no meu trabalho.
iii
Ao Serginho pela ajuda importantíssima na realização do PCR.
Ao Prof. Dr. Cândido Coimbra por disponibilizar a dosagem de AGL sérico.
A Ilma pelo carinho com os animais.
A grande família da pós-graduação do departamento de fisiologia, em especial aos
novos amigos conquistados: Adelaide, Daniel, Éder, Gonzaga, Marcelo, Nívia, Priscila.
A todos vocês meu muito obrigado!!!!
iv
RESUMO
Estudos recentes têm demonstrado que animais com ausência do receptor
MAS, receptor acoplado a proteína G que medeia várias ações da angiotensina-(1-7),
apresentam um quadro de dislipidemia, com aumento plasmático de colesterol total,
HDL (lipoproteína de alta densidade) e triacilgliceróis e menor sensibilidade á ação da
insulina. Esse trabalho teve como finalidade estudar o metabolismo do tecido adiposo
em animais knock-out para receptor MAS. Observamos que animais knock-out (KO)
para o receptor Mas apresentam maior concentração plasmática de ácidos graxos livres
em relação aos animais wild-type (WT). Tanto a atividade lipolítica basal quanto a
estimulada pelo isoproterenol foram semelhante entre os grupos. A insulina reduziu em
41% a atividade lipolítica de adipócitos estimulados pelo isoproterenol no grupo wild
type, enquanto que nenhum efeito da ação da insulina foi observado no grupo KO. A
massa da enzima HSL foi semelhante entre grupos. A atividade da enzima LPL
encontra-se aumentada 2,4 vezes no tecido adiposo dos animais KO em relação ao
tecido adiposo do grupo WT. A atividade lipogênica basal e estimulada pela insulina
encontra-se semelhante entre os grupos, entretanto a expressão do PPARγ está
reduzida em 66% nos animais com deleção genética do receptor MAS. A captação de
glicose em condição basal foi semelhante entre os grupos. No que se refere à captação
de glicose estimulada pela insulina, observou-se um aumento do transporte de glicose
nos dois grupos de animais, todavia, os adipócitos dos animais KO apresentaram uma
redução de 39% da captação de glicose estimulada pela insulina em relação aos
adipócitos dos animais WT. Nossos dados sugerem que a falta da ação da ANG-(1-7)
via receptor MAS parece alterar a resposta dos adipócitos à ação da insulina, levando a
uma resistência insulínica.
v
ABSTRACT
Recent studies have demonstrated that animals with absence of receptor MAS, receptor
G protein-coupled receptor that acts in several actions of angiotensin-(1-7), show a
dylslipemia, with an increasing of total plasmatic cholesterol, HDL ( high density
lipoprotein), triacyglicerol and less sensibility to the insulin actions. The aim of this study
was to investigate the metabolism of adipose tissue in animals knock-out to the receptor
MAS (KO). We observed that animals KO showed a greater concentration of plasmatic
fatty acids in comparison the wild-type animals (WT). The lipolitic activity as basal as
stimulated by isoproterenol was the same in both groups. The insulin decreased in 41%
the lipolitic activities of adipocytes stimulated by isoproterenol in a wild-type group, while
no effect of the insulin action was observed in a KO group. The amount of HSL enzyme
was the same in both groups. The LPL enzyme activity is increased 2.4 times on
adipose tissue of KO animals compared to adipose tissue of WT group. The lipogenic
activity as basal as stimulated by the insulin was the same in both group, however, the
expression of PPARγ is reduced in 66% in animals with absence of MAS receptor. The
glucose uptake in the basal condition was the same in both groups. Regarding to the
glucose uptake stimulated bu insulin, it was observed an increasing of glucose
transportation in both groups, however, the adipocytes of KO animals showed a
decreasing of 39% of glucose uptake stimulated by insulin, compared to adipocytes of
WT animals. Our data suggested that the lack of angiotensina-(1-7) action through MAS
receptor seemed to alter the response of adipocytes of insulin action, leading an insulin
resistance.
vi
Lista de abreviaturas
AC: adenilato ciclase
ACC: acetil-CoA carboxilase
ACS: acil-CoA sintetase
AGL: ácidos graxos livre
AGT: angiotensinogênio
Amp: aminopeptidase
Ang II: angiotensina II
Ang-(1-7): angiotensina-(1-7)
AT1: receptor tipo 1 de angiotensina II
AT2: receptor tipo 2 de angiotensina II
AQP 7: aquaporina 7
βAR: receptor β-adrenérgico
cAMP: adenosina monofosfato cíclico
DNA: ácido desoxiribonucleico
DNAc: DNA complementar
ECA: enzima conversora de angiotensina ECA 2: enzima conversora de angiotensina 2
FATP: proteína transportadora de ácidos graxos
FDE 3B: fosofodiesterase 3B
GLUT 4: transportador de glicose 4
HDL: lipoproteína de alta densidade
HSL: lípase hormônio sensível
IR: receptor de insulina
IRS 1: substrato do receptor de insulina 1
JAK 2: proteína janus kinase
vii
KO: deleção genética de determinad gene (knock-out)
LPL: lípase lipoprotéica
NEP: endopeptidase neutra
PEP: prolil-endopeptidase
PGI 2: prostaglandina 2
PI3K: fosfatidil inositol 3 kinase
PKA: proteína kinase A
PPARγ: receptor ativado pelo proliferador de peroxissomos gamma
RNA: ácido ribonucleíco
RNAm: RNA mensageiro
SNS: sistema nervoso simpático
SRA: sistema renina-angiotensina
TAE: tecido adiposo epidimal
TAG: triacilgliceróis
VLDL: lipoproteína de muita baixa densidade
WT: selvagem/controle (wild type)
viii
Lista de figuras
1 Principais vias metabólicas do tecido adiposo
3
2 Diagrama simplificado da cascata de formação e de degradação
dos principais angiotensinérgicos biologicamente ativos
8
3 Atividade lipolítica de adipócitos isolados da tecido adiposo epidimal
em condições basal e estimulada por isoproterenol
25
4a Autoradiograma representativo de western blot para proteínas HSL
e β-actina
26
4b Análise semi-quantitativa do conteúdo protéico da enzima HSL. 26
5 Atividade da enzima LPL no tecido adiposo epididimal
27
6 Atividade lipogênica in vitro do tecido adiposo epidimal em condição
basal ou estimulada por insulina
28
7a Expressão do RNAm para PPARγ no tecido adiposo epididimal 29
7b Expressão do RNAm para ACC no tecido adiposo epididimal 29
8 Captação de glicose por adipócitos isolados do tecido adiposo
epididimal 30
ix
Sumário
Resumo v
Abstract vi
Lista de figuras vii
Lista de abreviaturas viii
1.0 Introdução 1
1.1 Tecido adiposo 2
1.2 Metabolismo do tecido adiposo 2
1.3 Tecido adiposo e seu dinamismo 6
1.4 Sistema renina-angiotensina 7
1.5 Sistema renina-angiotensina no tecido adiposo 10
2.0 Objetivo 14
2.1 Objetivos específicos 14
3.0 Materiais e métodos 15
3.1 Animais 15
3.2 Metodologias 15
3.2.1 Isolamentos dos adipócitos 15
3.2.2 Lipólise 16
3.2.3 Captação de glicose 16
3.2.4 Lipogênese in vitro 17
3.2.5 Medida da atividade lípase lipoprotéica 18
3.2.6 Análise semi-quantitativa da enzima HSL no tecido adiposo por
Western blot 19
3.2.7 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR RT) 20
3.2.7.1 Extração RNA total 20
3.2.7.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico das amostras 21
3.2.7.3 Quantificação do RNA total 21
x
xi
3.2.7.4 Transcrição reversa 21
3.2.7.5 PCR semi-quantitativo 22
3.2.8 Dosagens bioquímicas 23
3.2.9 Análise dos dados 23
4.0 Resultados 24
4.1 Biometria e dosagens séricas 24
4.2 Atividade lipolítica e western blot para HSL no tecido adiposo 25
4.3 Atividade da enzima LPL em tecido adiposo 27
4.4 Lipogênese in vitro do tecido adiposo 28
4.5 Expressão gênica por real time PCR 29
4.6 Captação de glicose por adipócitos 30
5.0 Discussão 31
6.0 Referências bibliográficas 38
1.0 INTRODUÇÃO
Evidências crescentes sugerem que a distribuição de tecido adiposo é fator
crítico na relação entre obesidade e doenças cardiovasculares, uma vez que o
acúmulo de gordura na região abdominal está associado com o aumento do risco de
desenvolvimento de doença cardiovascular e morbidades correlatas (FOLSOM et al,
1993; BJÖRNTORP et al, 1984). Foi verificado que as células adiposas de origem
abdominal possuem maior atividade lipolítica e resistência ao efeito antilipolítico da
insulina, quando comparada com adipócitos provenientes de outros depósitos
(KISSEBAH et al, 1989a; BOLINDER et al, 1983).
Grassi et al (1995) demonstraram que um aumento expressivo no peso corporal
está associado com maior ativação simpática. Esta possibilidade de ativação do
sistema nervoso simpático (SNS) é indicada pela forte associação entre aumento da
pressão arterial e freqüência cardíaca em pessoas com excesso de peso. O aumento
da atividade do SNS poderia não apenas ser responsável pela elevação da pressão
arterial e da freqüência cardíaca, mas também pelo aumento na mobilização de
ácidos graxos livres (AGL) provenientes do tecido adiposo. A elevação de AGL é um
importante achado na obesidade abdominal (KISSEBAH, 1989b), exercendo efeitos
periféricos no desenvolvimento da resistência insulínica pela inibição da captação de
glicose pelo músculo esquelético (RANDLE et al, 1963). Também foi observado que o
aumento na concentração plasmática de ácidos graxos livres determina um aumento
na resposta vasoconstritora a agonistas α1-adrenérgicos, tanto no que se refere à
pressão sanguínea quanto à distensibilidade venosa (AILHAUD et al, 2000; KIHARA
et al, 1998).
1
1.1 TECIDO ADIPOSO
Para garantir a sobrevivência em condições de escassez de nutrientes no meio
ambiente, os mamíferos desenvolveram a capacidade de estocar, pricipalmente como
lipídios, o excesso das calorias ingeridas, de modo a suprir a demanda energética
durante períodos de escassez alimentar. Além de poderem ser armazenados em
grandes quantidades por não precisarem de água como solvente, outra vantagem de
se estocar energia como lipídios é que a oxidação destes compostos fornece o dobro
de energia por unidade de massa, se comparados aos carboidratos e proteínas.
O tecido adiposo é o principal reservatório energético do organismo. Os
adipócitos são as únicas células especializadas no armazenamento de lipídeos na
forma de triacilglicerol (TAG) em seu citoplasma, sem que isto seja nocivo à sua
integridade funcional. O tecido adiposo tem papel crítico no balanço energético, pois
possui toda a maquinaria necessária para sintetizar ácidos graxos (lipogênese) e
estocá-los na forma de TAG em períodos onde a oferta de energia é abundante, e
para mobilizá-los (lipólise) quando há déficit calórico. A regulação desses processos
ocorre por meio de sinais nutricionais, neurais e humorais (AHIMA e FLIER, 2000).
1.2 METABOLISMO DO TECIDO ADIPOSO.
O conteúdo de gordura corporal é dependente do balanço entre a deposição de
gordura e sua mobilização. O processo de deposição de lipídios no tecido adiposo
depende da disponibilidade de ácidos graxos para esterificação a triacilgliceróis (TAG)
e posterior armazenamento na gotícula de gordura intracitoplasmática. A
disponibilidade de ácidos graxos, por sua vez, depende da síntese in situ (lipogênese)
e da captação dos ácidos graxos contidos nos triacilgliceróis presentes nas
lipoproteínas circulantes por ação da enzima lípase lipoprotéica (figura 1).
2
Acil-Coa
Glicose
Glicerol
Quilomicrons VLDL
AGL
Figura 1 Principais vias metabólicas do tecido adiposo. VLDL: lipoproteína de muita
baixa densidade; LPL: lipase lipoprotéica; CD36: transportador de AGL; ACS: acil-CoA
sintetase; IR: receptor de insulina; FDE 3B: fosdiesterase 3B; βAR: receptor β adrenérgico;
AC: adenilato ciclase; cAMP: adenosina monofosfato cíclico; PKA: proteína quinase A.
(Adaptado de SETHI, 2007)
O receptor nuclear ativado pelos proliferadores de peroxissomos gama (PPARγ)
pertence a grande família dos receptores nucleares, está fortemente expresso no
tecido adiposo. O PPARγ promove diferenciação dos adipócitos resultando em
aumento no número de células pequenas mais sensíveis a ação da insulina (OKUNO
et al,1998), em adipócitos maduros tem papel importante na homeostase da glicose e
lipídios através de efeitos coordenados sobre a transcrição gênica (SPIELGEMAN,
Glicose
Acetil-Coa AGL
Glicerol 3P
Lipogênese
TAG
FDE 3B
Glicerol
Lipólise AGL
AGL
3
1998; WALCZAK, 2002). Os receptores nucleares regulam a transcrição de genes
alvo, através da heterodimerização com o receptor retinóico X, esse complexo se liga
em sítios específicos do DNA, chamados elementos responsivos, uma vez ativados
esse complexo pode estimular ou inibir a expressão de genes alvo (GEARING et al,
1993). O PPARγ está envolvido na deposição de gordura nos adipócitos por regular
genes responsáveis pelo armazenamento de gordura como LPL, Acil-CoA sintetase,
ácido graxo translocase (CD 36), proteína transportadora de ácidos graxos (FATP)
(KERSTEN, 2002) e na proteína diretamente envolvida na captação de glicose como
o transportador de glicose dependente de insulina, GLUT 4 ( WU et al, 1998) . O
PPARγ regula positivamente a expressão da adiponectina (IWAKI et al, 2003), uma
adipocina secretada exclusivamente pelo tecido adiposo o qual está envolvida no
aumento da sensibilidade às ações da insulina (FASSHAUER et al, 2004).
A lipoproteína lipase é sintetizada nas células parenquimais dos tecidos adiposo,
muscular esquelético e cardíaco, e exportada para o sítio de ação nos capilares, onde
se liga às cadeias de proteoglicanas na superfície luminal do endotélio vascular
(KARPE et al, 1998). A enzima promove a hidrólise de TAG plasmáticos contidos em
lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) provenientes da secreção hepática ou
dos quilomicra oriundos da dieta, produzindo AGL e glicerol (KARPE et al, 1998;
LADU et al, 1991). Os ácidos graxos atravessam a membrana plasmática através de
translocases de ácidos graxos (ABMURAD et al,1993), e uma vez no interior dos
adipócitos estes são esterificados com glicerol-3-fosfato e estocados como
triacilglicerol (FRAYN, 2002). A insulina é o principal hormônio envolvido na regulação
da deposição de gordura. Este hormônio, além de aumentar a expressão da LPL no
tecido adiposo (FRAYN, 2002), também aumenta a captação de glicose nas células
adiposas por aumento da translocação dos transportadores de glicose (GLUT4) para
a membrana celular além de ativar enzimas lipogênicas e glicolíticas (KERSTEN,
2001). Estudos de BOTION, 2001 demonstraram que a atividade de LPL
encontraram-se diminuída no tecido adiposo após jejum de 24h em ratos Wistar
enquanto que no estado absortivo a atividade da enzima esta aumentada em 36%,
4
demonstrando que a regulação da atividade da LPL também esta relacionada com o
estado nutricional do animal.
A mobilização lipídica (figura 1) refere-se às ações que resultam em hidrólise dos
TAG armazenados e na liberação dos ácidos graxos não esterificados (AGL) e do
glicerol, sendo a lipase hormônio sensível (HSL) a principal enzima de regulação
dessa via. Os produtos lipolíticos podem ser utilizados em outros tecidos como fonte
de energia durante o jejum ou em condições de grande demanda energética, como no
exercício físico. A ativação da lipólise ocorre através da ativação de receptores β-
adrenérgicos, que culmina em hidrólise dos triacilgliceróis enquanto que a ativação de
receptores α-adrenérgicos tem ação antilipolítica (LaFONTAN e BERLAN,1993). Em
humanos a adrenalina e noradrenalina (agonistas adrenérgicos) estimulam a lipólise
(maior razão entre receptores β/α) no tecido adiposo visceral, entretanto no tecido
adiposo subcutâneo a adrenalina inibe a lipólise (menor razão entre receptores β/ α)
(RICHELSEN et al, 1991).
O mecanismo lipolítico mais conhecido ocorre através de aumento da
concentração intracelular de AMPc. Neste mecanismo, os receptores são acoplados a
proteínas G estimulatória (GS), que quando ativada estimula a subunidade α (Gαs) a
qual ativa a adenilato ciclase que cataliza a síntese de AMPc a partir de ATP. O
resultado do aumento intracelular de AMPc leva a ativação de uma proteína kinase
dependente de cAMP (PKA) que por sua vez fosforila a HSL em resíduos de serina
tornando-a ativa (EGAN et al, 1992). A PKA também fosforila as perilipinas, proteínas
que envolvem a gota lipídica impedindo a hidrólise dos TAG. Uma vez fosforiladas, as
perilipinas se deslocam da superfície da gotícula de óleo, se dispersam no citosol e
abrem espaço para o acesso da LHS ao seu substrato (GREENBERG, 1990). A
insulina é um potente inibidor da lipólise do tecido adiposo devido a sua ação na
ativação da fosfodiesterase 3B. Uma vez ativa, essa enzima degrada o AMPc
diminuindo sua concentração intracelular e consequentemente impede a fosforilação
da HSL (DEGERMAN et al, 1997).
5
1.3 TECIDO ADIPOSO E SUA DINÂMICA
O tecido adiposo além da sua capacidade de armazenar e liberar energia
apresenta função mais abrangente. Por constituírem depósitos localizados em
diversas regiões do organismo envolvendo ou mesmo se infiltrando em órgãos e
estruturas internas, o tecido adiposo branco oferece proteção mecânica, permite
adequado deslizamento entre vísceras e feixes musculares, sem comprometer a
integridade e funcionalidade dos mesmos. Além disso, pela distribuição mais
abrangente, incluindo derme e tecido subcutâneo, e por ser um importante isolante
térmico, tem papel importante na manutenção da temperatura corporal. Estudos mais
recentes demonstram que o tecido adiposo é capaz de secretar substâncias com
efeitos biológicos importantes. Com a descoberta de uma ampla gama de proteínas
secretadas pelo tecido adiposo e denominadas adipocinas, um novo conceito sobre a
função biológica deste tecido vem surgindo, consolidando a idéia de este tecido não
ser apenas um armazenador e fornecedor de energia, mas sim, um órgão dinâmico
envolvido em uma variedade de processos metabólicos e fisiológicos.
As adipocinas agem como sinais endócrinos para regular a homeostase
energética, incluindo a autoregulação do crescimento e desenvolvimento do adipócito,
assim como a homeostasia do corpo todo. As adipocinas identificadas até o
momento, são altamente variadas e compreende proteínas relacionadas ao sistema
imune, como as citocinas clássicas - o fator de necrose tumoral-α (TNF- α) e
interleucina-6 (IL-6), fatores de crescimento (fator transformador do crescimento β –
TGF-β). Outras adipocinas estão envolvidas na angiogênese (fator de crescimento
endotelial vascular – VEGF), homeostase glicêmica (adiponectina, leptina),
homeostase vascular (inibidor do ativador de plasminogênio 1 – PAI-1) e na regulação
da pressão sangüínea (angiotensinogênio) (FRUHBECK et al, 2001)
6
1.4 SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA Estudos recentes apontam o sistema renina-angiotensina (SRA) não apenas
como um controlador da pressão arterial e homeostasia cardiovascular, mas também
como um complexo sistema hormonal envolvido em diversas funções fisiológicas.
Os principais componentes do SRA são o angitensinogênio (globulina secretada
pelo fígado), a renina (enzima liberada pelo aparelho justaglomerular renal), a enzima
conversora de angiotensina (ECA) e a angiotensina II (ang II). Na visão clássica, o
sistema renina-angiotensina age endocrinamente, sendo que a renina cliva o
angiotensinogênio (AGT) em angiotensina I (um decapeptídeo inativo) a qual é
clivada em ang-II pela ECA (figura 2). Esta enzima está presente na superfície
vascular e tem como sua principal localização anatomorfofuncional o leito vascular
pulmonar (PEACH, 1977).
As ações da Ang II resultam da sua ligação aos receptores específicos AT1 e
AT2, usualmente mediando efeitos opostos (ERNSBERGER e KOLETSKY, 2006). O
receptor AT1 é expresso por todos os sistemas orgânicos que têm papel central no
controle da homeostasia da pressão sanguínea, incluindo sistema circulatório,
sistema nervoso e rins (SHANMUGAN e SANDBERG, 1996).
A ativação do receptor AT1 no sistema circulatório leva a uma potente
vasoconstricção (TIMMERMANS et al, 1993). Na zona glomerulosa da glândula
adrenal a ativação do AT1 promove liberação de aldosterona (AGUILERA, 1992) que
age no néfron promovendo a reabsorção de sódio (MASILAMANI et al, 1999). Os
receptores AT1 no cérebro estão ligados a regulação do apetite de sal, sede e no
controle da liberação de vasopressina (DAVISSON et al, 2000; MORRIS et al, 2002).
Nos rins a ativação do AT1 leva a vasoconstricção renal e aumento na reabsorção
tubular de sódio (ICHIKAWA e BRENNER, 1980; PETI-PETERDI et al, 2002).
7
Angiotensinogênio
Angiotensina I
Angiotensina-(1-9) Angiotensina II
Angiotensina-(1-7)
Angiotensina III
Angiotensina IV
Angiotensina-(1-5) Angiotensina-(1-4)
renina
ECA 2
ECA 2 NEP, PEP
ECA
ECA
ECA
ECA 2
NEP
Amp
Amp
Figura 2. Diagrama simplificado da cascata de formação e de degradação das
principais angiotensinas. Amp aminopeptidase; ECA enzima conversaora de angitensina;
ECA 2 enzima conversora de angiotensina 2; NEP endopeptidase neutra; PEP prolil-
endopeptidase. (adaptado de TIKELLIS, 2006)
8
Fisiologicamente, parece que o receptor AT2 age como um modulador de
programas biológicos complexos como desenvolvimento embrionário, diferenciação
celular, apoptose, regulação da função renal e pressão sangüínea (CAREY et al,
2000; UNGER, 1999). Um dos maiores efeitos da ativação do AT2 é ter ação de
proteção contra a estimulação acentuada do AT1, por exemplo, a regressão da
fibrose cardíaca e remodelação vascular evocado pelo AT2 se opõe aos efeitos
fibróticos da Ang II mediados pelo AT1 (WU et al, 2001; WU et al, 2002). Tem sido
relatado que os efeitos vasodilatadores da Ang II via AT2 se opõe ao efeito
vasoconstrictor da Ang II via AT1 (CAREY et al, 2000), a ativação do AT2 parece ter
efeito natriurético opondo-se ao efeito antinatriurético da ativação do AT1 (SIRAGY e
CAREY, 1999). Além disso, estudos de Munzenmaier e Greene (1996) demonstraram
que Ang II induz angiogênese através do AT1 e este efeito é tamponado pela ativação
do AT2.
Na última década muitos estudos têm contribuído para a mudança da visão
clássica do SRA, onde há apenas um único produto final ativo. De acordo com estes
estudos a Ang I, uma vez formada, pode ser processada gerando diversos produtos
biologicamente ativos (SANTOS et al, 2000). O processamento da Ang I ou Ang II por
endopeptidases forma o heptapeptídeo Ang-(1-7) (YAMAMOTO et al, 1992; TAN et al,
1993), sendo esse peptídeo um metabólito com ação biológica (FERRARIO e IYER,
1998).
Estudos de Santos (2003) identificaram que a Ang-(1-7) é um agonista
endógeno do receptor Mas acoplado à proteína G. O receptor Mas parece agir como
antagonista funcional do receptor AT1 e que a sinalização via receptor AT1 pode ser
regulada de maneira tecido-específico pelos níveis de expressão do Mas (KOSTENIS
et al, 2005). A Ang-(1-7) é capaz de ativar a óxido nítrico sintetase e assim
apresentam um efeito vasodilatador através da liberação de óxido nítrico (HEITSCH
et al, 2001) além de potencializar o efeito hipotensivo da bradicinina (ABBAS et
al,1997; PAULA et al, 1995). A infusão renal de Ang-(1-7) produz diurese e natriurese
9
em rins isolados (DELLIPIZZI et al, 1994) e intactos de ratos Wistar (HANDA et al,
1996) e em contraste a potente ação da Ang II, a Ang-(1-7) aumenta a taxa de
filtração glomerular (HANDA et al, 1996). No sistema nervoso central a Ang-(1-7)
modula a liberação de vasopressina (SCHIAVONE et al, 1988; SANTOS et al, 1996),
aldosterona, sem inibir o barorreflexo (CAMPAGNOLE-SANTOS et al, 1992). Estudos
de Roks (1999) demonstraram que a Ang-(1-7) é um antagonista das respostas
vasculares da Ang II em artérias humanas e um inibidor da ECA no plasma humano,
tecido caríaco e tecido vascular. Esses resultados ratificam o efeito antihipertensivo
da Ang-(1-7).
1.5 SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA NO METABOLISMO O SRA tem papel importante no controle metabólico uma vez que seus
componentes podem ser encontrados em muitos tecidos entre eles tecido adiposo e
pâncreas.
O pâncreas endócrino apresenta imunoreatividade para os receptores AT1 e
AT2, embora a distribuição dentro das ilhotas pancreáticas sejam diferentes,
enquanto que o receptor AT1 é encontrado em células que estão no centro das
ilhotas e são co-localizadas com as células β, o receptor AT2 é expresso nas células
que produzem somatostatina, que estão localizadas na periferia das ilhotas de
Langerhans (TIKELLIS et al, 2006). A regulação da perfusão das ilhotas é importante
na disponibilidade de glicose e subsequentemente regulando a secreção de insulina
bem como outros hormônios pancreáticos (JANSSON, 1994). Estudos de Carlsson
(1998) verificaram que animais expostos agudamente a Ang II têm uma menor
perfusão das ilhotas e apresentam uma menor liberação de insulina em resposta a
glicose.
A Ang II também tem papel importante na regulação da glicose plasmática uma
vez que este peptídeo é capaz de promover hiperglicemia de maneira dose-
10
dependente (MACHADO et al, 1995). O efeito hiperglicêmico da Ang II é mediado via
receptor AT1 (MACHADO et al, 1998) pode ser atribuído a uma ação direta na
produção hepática de glicose, pois estudos de Coimbra et al (1999) demonstraram
que a infusão de Ang II resulta na ativação rápida da gliconeogênese hepática
contribuindo para o aumento da glicose plasmática.
O acúmulo de gordura na região abdominal é o maior fator de risco no
desenvolvimento de doenças crônicas, tais como diabetes mellitus tipo 2 e doenças
cardiovasculares (SHARMA, 2006). Existem evidências que os componentes do
sistema renina-angiotensina estão aumentados na circulação de pessoas obesas
(UMEMURA et al, 1997) e que a perda de peso leva a uma redução da atividade
sistêmica do SRA (ENGELI et al, 2005). Estes dados indicam que a obesidade é
responsável pelo aumento da atividade sistêmica do SRA e sugere que componentes
do sistema renina-angiotensina que são expressos no tecido adiposo podem também
ser secretados para a circulação e exercer efeitos endócrinos (GOOSSENS et al,
2007).
Apesar de o fígado ser considerado o principal produtor de AGT (LYNCH e
PEACH, 1991), outros estudos mostram que adipócitos maduros expressam todos os
componentes do sistema renina-angiotensina, incluindo AGT, renina, ECA, Ang II,
receptores AT1 e AT2 (ENGELI et al, 2000; CAMPBELL e HABENER, 1987; CASSIS
et al, 1988). As linhagens clonais de preadipócitos 3T3-L1 e 3T3-F442A sintetizam e
secretam angiotensinogênio e esta produção encontra-se aumentada durante a
diferenciação de preadipócitos para adipócitos (SAYE et al, 1989; SAYE et al, 1990).
Estudos de Massiera (2001) realizados em camundongos transgênicos, que
superexpressam AGT, apresentam aumento de duas vezes na massa adiposa, de
22% no AGT plasmático e de 16% na pressão sistólica quando comparado ao
camundongo wild-tipe.
11
Aumento da expressão de angiotensinogênio na obesidade tem sido relatado em
alguns estudos. Adipócitos de ratos Zucker obesos (fa/fa) mostram um aumento no
conteúdo e secreção de angiotensinogênio durante o desenvolvimento da obesidade
(HAINAULT, 2002) A expressão de angiotensinogênio é maior no tecido adiposo
visceral humano quando comparado ao tecido adiposo subcutâneo (DUSSERRE et
al, 2000; GIACCHETTI et al, 2002). Strazzullo e Galletti (2004) sugerem que o tecido
adiposo, particularmente o tecido adiposo visceral, seja o responsável pelo aumento
de AGT circulante em indivíduos obesos. E esse aumento de angiotensinogênio
plasmático associado a maior atividade da renina e ECA plasmática tem grande
contribuição para a elevação da pressão arterial em indivíduos obesos
(STRAZZULLO e GALLETTI, 2004). A expressão específica pelos adipócitos, em
camundongos transgênicos, do gene AGT foi acompanhado por hipertrofia e
hiperplasia destas células (MASSIERA et al, 2001) sugerindo que a Ang II é um fator
trófico para os adipócitos.
Já está bem estabelecido que a angiotensina II (Ang II) age como fator de
crescimento em uma variedade de tecidos e células (SIL e SEM, 1997; MEFFERT et
al, 1996), e alguns estudos têm demonstrado a importância da Ang II no crescimento
e na diferenciação dos adipócitos (DARIMONT et al, 1994a). Na diferenciação de
preadipócitos, a prostaglandina I2 (PGI2) é uma potente e específica efetora da
diferenciação adipogênica (NEGREL et al, 1989). A secreção de PGI2 é induzida
quando adipócitos Ob 1771 são expostos à Ang II tanto in vitro (DARIMONT et al,
1994a; AXELROD et al, 1985) quanto in vivo no fluido intersticial de tecido adiposo de
ratos (DARIMONT et al, 1994b), O efeito adipogênico da PGI2 induzido pela Ang II foi
suprimido pela inibição da síntese da prostaglandina (DARIMONT et al, 1994a). Foi
verificado que a Ang II reduz o acúmulo de lipídios induzido pela insulina em
preadipócitos humanos (SCHLING and LÖFFLER, 2001) e aumenta a proliferação de
preadipócitos pela aceleração da fase G1 do ciclo celular (CRANDALL et al, 1999).
Estudos de JANKE (2002) demonstraram que a Ang II inibiu a diferenciação
adipogênica em cultura primária de preadipócitos humanos, e o bloqueio do receptor
12
AT1 aumentou marcadamente o acúmulo de lipídios e a diferenciação dessas células.
Resultados controversos na ação da Ang II na diferenciação e proliferação dos
adipócitos podem ser devido a diferenças de espécies e/ou diferenças entre as
linhagens celulares.
Poucos estudos têm relacionado o papel da Ang-(1-7) como contraregulador das
ações da Ang II no metabolismo do tecido adiposo. Estudos de Santos e
colaboradores (2007) demonstraram que camundongos knock-out para o receptor
Mas apresentam um aumento do tecido adiposo epididimal e retroperitoneal, menor
sensibilidade à insulina além de um quadro de dislipidemia, com aumento plasmático
de colesterol total, HDL (lipoproteína de alta densidade) e triacilgliceróis. Esses dados
sugerem que o eixo Ang-(1-7)/Mas possui um papel importante no controle do
metabolismo do tecido adiposo.
13
2.0 OBJETIVO
Tendo em vista a importância do sistema renina-angiotensina no metabolismo e
os poucos estudos disponíveis sobre a participação do eixo Ang-(1-7)/MAS neste
processo, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da deleção genética do
receptor Mas sobre o metabolismo do tecido adiposo.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar no tecido adiposo a captação de glicose, atividade da enzima lipase
lipoprotéica, atividade lipogênica, e expressão genética do PPARγ e Acetil CoA
carboxilase .
- Quantificar as concentrações plasmáticas de triacilgliceróis, ácidos graxos e
glicerol.
- Avaliar a lipomobilização em adipócitos isolados, medir a massa da proteína
lipase hormônio sensível.
.
14
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Animais
Foram utilizados camundongos wild type FVB/N (WT) e camundongos FVB/N
knock-out para o receptor Mas (KO) (Walther et al, 1998), cujas matrizes foram
produzidas no Max-Delbrück-center for Molecular Medicine (Berlin-Buch, Germany).
Os animais tinham aproximadamente entre 8 e 10 semanas de idade. Os animais
foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais por gaiola) em ambiente com
controle de luz (12 horas de luz, das 7:00 às 19:00 h) e temperatura (25±2°C) com
livre acesso à água e ração.
Na noite anterior aos experimentos os animais foram mantidos em jejum de
12h, sendo que os experimentos foram realizados na parte da manhã. Os
camundongos sofreram eutanásia por exangüinação pela aorta abdominal após
anestesia intraperitoneal com quetamina/xilasina (70 e 5 mg/kg, respectivamente).
Após a eutanásia o tecido adiposo epididimal foi removido e utilizado imediatamente
ou congelado em nitrogênio líquido e conservado em freezer -80 °C até o momento
do uso. O sangue foi coletado em microtubos para obtenção de soro e armazenado
à -20°C para dosagens posteriores.
3.2. Metodologias 3.2.1 Isolamento dos adipócitos Após o sacrifício dos animais o tecido adiposo epididimal foi removido, picado
e incubado com colagenase por 45 minutos a 37°C, sob agitação contínua,
conforme descrito por Rodbell (1964). Ao término do período de incubação, as
células foram filtradas através de tela de nylon, lavadas três vezes com tampão
HEPES (pH 7,4) contendo 1% de albumina bovina livre de ácidos graxos. Os
15
adipócitos isolados foram ressuspensos em volume de 20 mL de tampão/grama de
tecido.
3.2.2 Lipólise Após o isolamentos as células adiposas foram incubadas por 1h em condições
basal (sem estímulo) ou estimulada com 0,1 mM isoproterenol (agonista β-
adrenérgico). O efeito antilipolítico da insulina foi determinado na presença de 25
ng/mL desse hormônio. A liberação de glicerol para o meio de incubação foi
utilizada como índice lipolítico. Ao término do período de incubação, uma alíquota
do infranadante foi removida, aquecida a 700 C para inativação de qualquer enzima
liberada pelas células e o teor de glicerol medido por kit enzimático KATAL (Belo
Horizonte, MG).
3.2.3 Captação de glicose Após isolamento, as células adiposas foram lavadas com tampão HEPES e
incubadas por 45 min em tubos contendo ou não insulina (50 ng/mL). Um tubo
contendo floretina foi adicionado ao teste, pois essa substância inibe a captação da
2-deoxi-[3H]glicose e permite a quantificação aproximada de background. A
captação da 2-deoxi-[3H]glicose foi utilizada para determinar a sensibilidade
insulínica sobre o processo de transporte de glicose (Botion, 1999). Para isso foi
adicionado aos tubos 50 µL de 2-deoxi-[3H] glicose (0,2 µCi) e as células incubadas
por mais 3 min. A 2-deoxi-[3H]glicose é transportada para dentro da célula através
dos mesmos transportadores da glicose (Hom, 1984; Kraegen, 1985), entretanto, a
sua metabolização não é completa. O transporte da glicose foi interrompido por
transferência de 300 µL da mistura de reação que foram adicionados a um
microtubo contendo 70-80 µL de óleo de silicone (d= 0,98). Os tubos foram
centrifugados imediatamente, por 60 segundos, e as células foram separadas do
meio de incubação pela camada oleosa. O tubo foi então cortado na fase
16
intermediária do óleo de silicone, e a parte do tubo contendo a camada de células
foi transferida para um frasco de cintilação contendo líquido de cintilação
(Biodegradable counting scintillant, Amersham, USA) para a contagem da
radioatividade captada pelos adipócitos. O cálculo do índice de captação de glicose
in vitro foi feito considerando-se a radioatividade da 2-deoxi-[3H]glicose nas células
e a concentração desse composto no meio de incubação.
3.2.4 Lipogênese in vitro
A atividade lipogênica do tecido adiposo foi quantificada utilizando a água
tritiada como marcador radioisótopo. A água tritiada é o marcador radioisótopo de
preferência para o estudo da atividade lipogênica. O trítio é incorporado durante o
processo de síntese de ácidos graxos em ligações estáveis C-H por meio da troca
do 3H com nucleotídeos de pirimidina reduzidos (NADPH), formados na via das
pentoses ou pela enzima málica.
Fragmentos de tecido adiposo epididimal (100 mg) foram incubados por 2
horas em tampão contendo água tritiada 3H2O. Ao término do período de incubação,
os tecidos foram homogeneizados em uma mistura de clorofórmio-metanol 2:1,
segundo o método de Folch e colaboradores (1957). Alíquotas da fase inferior
clorofórmica foram utilizadas para a medida da radioatividade incorporada em
lipídios totais através de espectroscopia de cintilação líquida (Beckman LS 7600).
A velocidade de síntese de ácidos graxos in vitro no tecido adiposo epididimal
foi calculada segundo as premissas de Windmuller e Spaeth, 1966. A formula é a
seguinte:
μmol de AG/2h = dpm de 3H incorporados em AG no TA x 109 x 1
dpm de 3H /átomo-g de H no meio x 13,3 x t2-t1
17
3.2.5 Medida da atividade da lípase lipoprotéica A lipase lipoprotéica (LPL) é uma glicoproteína, cujas características funcionais
mais importantes são: possuir um pH ótimo de ação alcalino (8,0 – 8,5), ser inibida
por NaCl 1M e requerer um cofator específico para manifestar sua atividade, a
apolipoproteína C-II. O ensaio da atividade enzimática da LPL baseia-se no método
de Nilsson-Ehle e Schotz (1976) e fundamenta-se na reação:
TAG (glicerol tri-3H- oleato) glicerol + 3H- oleato L PL
Os ácidos graxos liberados (3H- oleato) foram separados pela utilização de um
sistema de partição líquido-líquido e uma alíquota dos AGL situados na fase
superior polar, é removida para a determinação da radioatividade correspondente. O
índice de hidrólise é diretamente proporcional à atividade da enzima.
Para a medida da atividade da LPL, fragmentos do tecido adiposo epididimal
foram homogeneizados em tampão Tris-HCL (pH 8,3) contendo detergentes,
centrifugados a 2500 rpm por 15 minutos e a camada intermediária, abaixo da
camada gordurosa, foi utilizada para a medida da atividade enzimática.
A emulsão-substrato foi preparada com trioleína fria e [9,10-3H]trioleato e
estabilizada com lecitina. Os lipídios foram sonicados com glicerol a 4 0C durante 5
min. Esta emulsão é estável por cerca 2 meses no escuro.
No dia do experimento foi preparada a mistura de reação, contendo 2 partes de
tampão LPL (Tris 0,2M, pH 8,3; contendo 6 % de albumina bovina livre de ácidos
graxos e cloreto de sódio 0,15M), 2 partes de emulsão-substrato e 1 parte de soro
de rato em jejum por 24 horas como fonte de Apo-CII. A mistura de reação foi
agitada em vortex e 100 μL adicionados em todos os tubos. A reação iniciou-se pela
adição de 10 μL do homogenado que foi então incubado sob agitação por 45
18
minutos a 37oC. Ao final do período de incubação adicionou-se inicialmente 3,25 mL
da mistura de extração clorofórmio-heptana-metanol, 1,25:1,1:1,41 (BELFRAGE &
VAUGHAN, 1969) e em seguida 1,05 ml de tampão carbonato-borato 0,1M pH 10,5,
sob agitação em vortex. Os tubos de ensaio foram centrifugados à temperatura
ambiente por 10 minutos e uma alíquota de 1,0 mL da fase aquosa superior foi
colocada em 4 ml de coquetel de cintilação (tolueno-triton-PPO-POPOP) e a
radioatividade quantificada por espectroscopia de cintilação líquida (Beckman LS
7600).
3.2.6 Análise semi-quantitativa da enzima lípase hormônio sensível no
tecido adiposo por Western Blot Fragmentos de tecido adiposo foram homogeneizados em tampão de lise
contendo inibidores de proteases e posteriormente centrifugados (2500 rpm, 20 min,
4°C) para remoção do infranadante. As proteínas contidas no infranadante foram
quantificadas através do método de Bradford (1976).
A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS) foi
realizada de acordo com método de Laemmli (1970). As amostras (30 µg de
proteína) foram aquecidas a 95°C por 5 min antes de serem aplicadas em gel de
poliacrilamida 8%. Na lateral do gel foi aplicado um padrão de peso molecular (20-
200 kDa), sendo que a HSL tem um peso molecular de, aproximadamente, 84 kDa.
A eletroforese foi realizada numa cuba de acrílico, contendo tampão de corrida
(Tris-HCl 25mM, SDS 0,1%), sob a voltagem de 100 Volts, por 2h. As proteínas
foram transferidas eletroforeticamente para as membranas de nitrocelulose sob
voltagem de 100 volts, por 1,5 h. Em seguida as membranas foram bloqueadas para
as ligações inespecíficas com tampão contendo leite desnatado a 5% em TBS-T 1x
e 0.05% TWEEN por 1 hora. Após, as membranas foram incubadas com anticorpo
primário para a enzima HSL durante a noite. As membranas foram lavadas
novamente e incubadas com anticorpo secundário por 1 hora. Posteriormente foi
19
realizada a revelação por quimiluminescência utilizando ECL plus (Amersham).
Após a identificação das bandas referentes à proteína HSL, foi feito, na mesma
membrana, a identificação das bandas referentes a β-actina, que foi utilizada como
controle endógeno. Para isso, foi feito o “stripping” da membrana que consiste na
retirada dos anticorpos da superfície da mesma e a incubação por 1h com anticorpo
primário para a proteína β-actina. As membranas foram então lavadas com TBS-T
1x e incubadas com anticorpo secundário (anti-mice) por 1h e após, lavadas
novamente. Posteriormente, foi realizada a revelação quimioluminescente utilizando
ECL plus (Amersham).
As bandas imuno-reativas foram quantificadas por densitrometria no programa
Image J quant, da National Institute of Health, USA. Os resultados foram expressos
a partir da relação HSL/β-actina em unidades de densidade relativas.
3.2.7 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR RT) 3.2.7.1 Extração do RNA total A extração do RNA total foi realizada utilizando o método “guanidino-
isotiocianato-fenol-clorafórmio” Os fragmentos de tecido adiposo foram
homogeneizados em tubos plásticos contendo o reagente TRIzol ® (0,1 g de
tecido/1,0 mL do reagente TRIzol ®; Invitrogen laboratories, USA). Os recipientes de
plástico contendo o homogenato foram incubados a temperatura ambiente por 10
minutos, em seguida adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio. Os tubos foram
vigorosamente agitados e deixados em repouso por 5 minutos a 4 °C, sendo, em
seguida, centrifugados a 12.000 rpm durante 15 minutos. A fase aquosa foi
transferida para microtubos, com subseqüente adição de 0,5 mL de isopropanol. A
mistura foi levemente agitada e mantida em repouso a 4°C por 10 minutos. Nova
precipitação foi realizada a 12.000rpm/10min/ 4°C. O sobrenadante foi descartado e
20
o pellet resultante foi ressuspendido em 1 mL de etanol gelado 70 % (solução
manufaturada em água tratada com dietil-pirocarbonato – DEPC), agitando-se
novamente. O sobrenadante foi vertido e os tubos com as amostras foram mantidos
a temperatura ambiente até a secagem das mesmas. O RNA foi novamente
ressuspendido em 0,05 mL de água DEPC.
3.2.7.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico de amostra de RNA total.
Para eliminação de uma possível contaminação com DNA genômico nas
amostras de RNA total, utilizou-se a enzima desoxiribonuclease I (GibcoBRL®). O
tratamento foi feito de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.
3.2.7.3 Quantificação do RNA total
As amostras de RNA total foram diluídas 50X e a concentração de RNA total
foram determinadas pela leitura da densidade óptica em comprimento de onda de
260nm (HITACHI ® UV 160 A). A concentração do nucleotídeo foi expressa em
µg/mL dada através da equação:
[ RNA total ] = Absorbância x 40 x Fator de diluição
3.2.7.4 Transcrição reversa
O RNA total foi utilizado para a síntese de DNA complementar (DNAc).
Resumidamente, a 1 µg de RNA total foram adicionados: 0,2 µg de
hexadeodinucleotídeos e tampão para RT (Tris-HCl 45mM pH 8,5; MgCl2 50mM;
DTT 15mM; dNTPs 1,8 mM e 150 UI de transcriptase reversa – reagente
provenientes da empresa Promega® Corporation, USA). O DNAc foi sintetizado em
21
termociclizador durante um período de 60 minutos de incubação a 37°C. A reação
foi interrompida pelo aquecimento a 90 °C por 5 minutos. O DNAc foi armazenado à
– 20°C.
3.2.7.5 PCR Semi – Quantitativo As reações de PCR quantitativo foram feitas utilizando primers (tabela 1)
específicos para o DNAc dos genes de interesse. A análise dos pares de base foi
executada através do programa BLASTN e sintetizada pela Invitrogen® . Os primers
do gne utilizado para controle endógeno foram de HPRT.
O DNAc obtido da etapa de RT (2 µl ) foi utilizado como fita molde para a
amplificação por PCR. As reações de PCR tiveram volume final de 20 µl e foram
feitas em duplicatas, utilizando 19 µl do Master mix de SYBR Green (Apllied
Biosystem), e 2 µl de cada primer (senso e anti-senso) na concentração de 1 nm/µl
e 2 µl de DNAc. O aparelho para reação foi o ABI Prism 7000 (Apllied Biosystem,
USA), sendo realizados 40 ciclos em temperatura de anelameto de 60 °C
Tabela 1. Primers para o DNAc dos genes de interesse
Primers Seqüência
ACC for CGG CTT GCA CCT AGT AAA AC
ACC rev AAT CCA CTC GAA GAC CAC TG
PPARγ for AGA TCA TCT ACA CCA TGC TGG CCT
PPARγ rev AGG AAC TCC CTG GTC ATG AAT CCT
HPRT for GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT
HPRT rev GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C
22
A análise da expressão dos genes foi semi-quantitativa (método delta delta CT)
segundo modelo matemático desenvolvido por Ptaffl, 2001. O valor de CT (threshold
cycle) representa o momento da reação de PCR em que a florescência de
determinada amostra é detectada acima do ruído de fundo (background). O resultado
foi expresso em unidades arbitrárias. O modelo matemático utilizado para obtenção
das unidades arbitrárias para essa análise foi:
1- Subtração do valor de CT dos genes estudados pelo CT do HPRT (ΔCT);
2 - média do ΔCT das amostras;
3 - ΔCT de cada amostra – a média do ΔCT (ΔΔCT);
4 - elevação negativa do ΔΔCT na base 2 = 2- ΔΔCT .
3.2.8 DOSAGENS BIOQUÍMICAS A concentração de ácidos graxos plasmáticos foi quantificada por método
enzimático utilizando kit comercial da WAKO (Pure Chemical Industries, Japan). O
glicerol e o triacilglicerol plasmático foram quantificados através do kit enzimático
KATAL (Belo Horizonte, MG).
3.2.9 ANÁLISE DOS DADOS Para análise dos dados foi utilizado o teste estatístico ANOVA one way
seguida de Newman-Keuls. Para comparação entre dois grupos foi utilizado teste “t
de Student”. O nível de significância adotado foi de p<0,05. Os cálculos e análises
estatísticas foram realizados utilizando-se o programa Graph Pad Prism 4.0 (San
Diego, CA, USA)
23
4.0 RESULTADOS
4.1 Biometria e Dosagens séricas Os resultados apresentados na tabela 2 mostram que os animais com deleção
do receptor MAS produziu um ligeiro aumento do peso corporal e do tecido adiposo
epidimal (TAE) quando comparado ao grupo controle WT. Os dados também mostram
um aumento 39 % e de 66% nas concentrações séricas de ácidos graxos e de
triacilglicerol, respectivamente. Não foram observadas diferenças nas concentrações
séricas de glicerol.
Tabela 2. Pesos corporal e do tecido adiposo epididimal e parâmetros
plasmáticos de camundongos com deleção do receptor MAS.
WT KO
Peso corporal (g) 24±0,40 (23) 25±0,47 (23)
TAE (g/ 100g de PC) 1,39±0,09 (23) 1,89±0,08 (23) *
AGL (mmol/L) 1,12±0,05 (5) 1,56±0,15 (5)*
Glicerol (mmol/L) 0,34±0,03 (5) 0,31±0,03 (5)
TAG (mmol/L) 1,05±0,15 (4) 1,75±0,14 (4)*
Os valores apresentam a média ± erro padrão. O número de animais utilizados
encontra-se entre parênteses. *p<0,05 vs WT.
24
4.2 Atividade lipolítica e western blot para HSL do tecido adiposo epididimal
A figura 3 mostra a atividade lipolítica do tecido adiposo epidimal, e conforme
pode ser observado, a lipólise basal foi semelhante entre os dois grupos de animais
(0,61±0,09 mM WTb vs 0,58±0,07 mM KOb). No que se refere à lipólise estimulada
com isoproterenol (agonista β-adrenérgico não específico), o efeito desse agonista foi
semelhante nos dois grupos (2,10 ±0,14 mM WTiso vs 1,77±0,10 mM KOiso).
A insulina reduziu em 41% a atividade lipolítica de adipócitos estimulados pelo
isoproterenol no grupo wild type (2,10 ±0,14 mM WTiso vs 1,23±0,17 mM WT
iso+ins), enquanto que nenhum efeito antilopolítico da insulina foi observado no grupo
KO (1,77±0,10 mM KOiso vs 1,70±0,10 mM KOins).
WTb WTiso WTins KOb KOiso KOins0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 **
**
Glic
erol
(mM
)
Figura 3 Atividade lipolítica de adipócitos isolados do tecido adiposo epidimal em
condições basal (b) e estimulada por 0,1 μM isoproterenol (iso), e efeito antilipolítico
de 25 ng/mL de insulina (ins). As barras representam à média ± erro padrão, n = 6,
*p<0,05 vs respectivo basal; **p<0,05 vs WTiso.
25
A massa da enzima HSL foi semelhante nos grupos (0,98±0,05 unidade de
densidade relativa WT vs 1,09±0,04 unidade de densidade relativa KO), conforme
pode ser observado na figura 4.
A
WILD-TYPE KNOCK-OUT
HSL
β-actina
B
WT KO
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
HSL
/ β-a
ctin
a (u
nida
des
de d
ensi
dade
rel
ativ
a)
Figura 4 (A) Autoradiograma representativo de western blot para proteínas HSL e β-actina.
(B) Análise semi-quantitativa do conteúdo protéico da enzima HSL. Os resultados foram
expressos, a partir da relação HSL/β-actina, em unidades de densidde relativa. As barras
representam à média ± erro padrão, n = 3-4
26
4.3 Atividade da enzima lipase lipoprotéica em tecido adiposo A lipase lipoprotéica no tecido adiposo é responsável pela hidrólise de
triacilgliceróis presente nas lipoproteínas circulantes, e os ácidos graxos resultantes
dessa hidrólise são captados e armazenados nesse tecido. Os dados obtidos em
nosso experimento (figura 5) mostraram que a atividade dessa enzima encontra-se
aumentada 2,4 vezes no tecido adiposo dos animais KO em relação ao tecido
adiposo do grupo WT (0,07±0,01 mU WT vs 0,17±0,02 mU KO, p<0,05).
WT KO0.0
0.1
0.2 *
mU
Figura 5 Atividade da enzima LPL (mU) no tecido adiposo epidimal. As barras representam à
média ± erro padrão, n = 4-5.*p<0,05.
27
4.4 Lipogênese in vitro do tecido adiposo epidimal A atividade lipogênica refere-se à síntese de novo de ácidos graxos, para
posterior armazenamento como TAG dentro do adipócito. A figura 6 monstra que a
lipogênese basal (9,64±1,00 µmolAG/g TAE/2h WTb vs 12,25±2,08 µmolAG/g TAE/2h
KOb) foi igual entre os grupos. A insulina aumentou a atividade lipogênica tanto no
grupo WT quanto no KO, entretanto esse aumento não foi diferente (20,19±2,08 µmol
AG/g TAE/2h WTins vs 22,5±2,02 µmol AG/g TAE/2h KOins).
μ mol
AG /g
TAE
/2h
WT b WT ins KO b KO ins0
5
10
15
20
25 * *
Figura 6 Atividade lipogênica in vitro do tecido adiposo epidimal em condições basal (b) ou
estimulada por 100 ng/mL de insulina (ins). As barras representam à média ± erro padrão, n =
7. *p<0,001.
28
4.5 Expressão gênica por Real Time PCR. Foi avaliado a expressão do RNAm para o receptor nuclear ativado pelos
proliferadores de peroxissomos gama (PPARγ), que esta diretamente envolvido no
processo de deposição lipídica. Também foi avaliado a expressão RNAm para as
enzimas: Acetil-CoA carboxilase (ACC), enzima envolvida na formação de ácidos
graxos.
A figura 7A demonstra que a expressão do PPARγ no tecido adiposo está
reduzida em 66% nos animais KO em relação aos animais WT (1,80±0,08 UA WT vs
0,60±0,03 UA KO, p<0,05). A expressão para a enzima ACC (1,00± 0,17 UA WT vs
0,87±0,14 UA KO) não foi diferente entre os dois grupos como mostra a figura 7B.
WT KO 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
A
Uni
dade
s ar
bitr
ária
s
WT KO0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 B
Uni
dade
s ar
bitr
ária
s
Figura 7 Expressão do RNAm para PPARγ (A) e ACC (B) no tecido adiposo epidimal. As
barras representam à média ± erro padrão, n = 3, *p<0,05.
29
4.6. Captação de glicose por adipócitos do tecido adiposo epidimal.
Conforme demonstrado na figura 8, a captação de glicose no estado basal (sem
estímulo) foi igual nos dois grupos de animais (0,26±0,02 mmol/3min WTb vs
0,20±0,03 mmol/3min KOb). No que se refere à captação estimulada pela insulina,
observou-se um aumento do transporte de glicose nos dois grupos de animais.
Entretanto, os adipócitos dos animais KO apresentaram uma captação de glicose
estimulada pela insulina 39% menor em relação aos adipócitos dos animais WT
(0,46±0,06 mmol/3min KOin vs 0,75±0,07 mmol/3min WTin, p<0,05).
WTb WTin KOb KOin0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9 **
***
capt
ação
de
2-de
oxig
licos
e(m
mol
/3m
im)
Figura 8 Captação de glicose por adipócitos isolados do tecido adiposo epididimal As barras
representam à média ± erro padrão, n=5. b basal: in insulina (50ng/mL). ** p <0,05 in vs b, *
p< 0,05 vs WTin.
30
5.0 DISCUSSÃO Estudos recentes sugerem que o aumento da massa adiposa visceral está
intimamente relacionado com a hipertensão e diabetes, e enfatizam que os fatores
derivados dos adipócitos podem contribuir para o desenvolvimento dessas doenças
(CASSIS, 2000). Tem sido relatado na literatura que o sistema renina-angiotensina
está presente no tecido adiposo e parece ter um papel importante no
desenvolvimento da hipertensão e resistência insulínica associada à obesidade.
Em nosso estudo foi demonstrado que os animais knock-out para o receptor
MAS apresentam um pequeno aumento de peso corporal e de massa adiposa
epididimal, os quais não podem ser atribuídos ao aumento da ingestão alimentar, uma
vez que os estudos de Santos e colaboradores (2007) mostraram que esses animais
apresentam ingestão alimentar semelhante à do grupo controle (wild type), sugerindo,
portanto,que o aumento da massa do tecido adiposo deve-se, provavelmente, a um
desequilíbrio metabólico.Os estudos de CASSIS (1998) demonstram que a infusão
crônica de Ang II em ratos Sprague-Dawley promove perda de peso e redução na
massa de tecido adiposo branco. Por outro lado, estudos realizados em ratos e em
humanos têm relacionado à perda de peso com a administração de inibidores da
enzima conversora de angiotensina (McGRATH et al, 1990; CAMPBELL et al, 1995).
Estudos de ENGELI et al, (2005) demonstram, em humanos, que a perda de peso foi
acompanhada pela diminuição da atividade do SRA, sugerindo que o aumento do
tecido adiposo é responsável pelo aumento da atividade sistêmica do sistema renina-
angiotensina.
O presente estudo demonstrou que animais com deleção genética para o
receptor MAS (KO) apresentam um aumento na concentração sérica de ácidos
graxos livres (AGLs), embora a concentração de glicerol tenha sido semelhante nos
dois grupos. O aumento de AGLs pode levar a um distúrbio no metabolismo de
31
glicose e insulina no fígado, músculo e tecido adiposo podendo contribuir para a
resistência à insulina (SALEH et al, 1999). A elevação na concentração plasmática
de AGLs é principalmente decorrente : 1) de uma atividade lipolítica aumentada; 2)
menor re-esterificação dos AGLS em TAG; 3) redução da utilização periférica e/ou
oxidação.
Apesar da atividade lipolítica in vitro basal e estimulada pelo isoproterenol ser
semelhantes nos dois grupos, o efeito antilipolítico da insulina foi menor no grupo KO,
o que poderia contribuir para o aumento da concentração sérica de AG nestes
animais. Os estudos de Santos e cols (2007), mostram que os animais com deleção
genética para o receptor MAS possuem menor sensibilidade insulínica quando
comparados aos controles, o que está de acordo com os resultados apresentados no
presente estudo. EGAN e colaboradores (1996) relataram que o estado de resistência
à insulina na obesidade é tipicamente caracterizado pelo reduzido efeito antilipolítico
da insulina, particularmente em pessoas com obesidade visceral (LARGE & ARNER,
1998).
Estudos de English and Cassis (1999) mostram que a Ang II estimula a liberação
de noradrenalina dos terminais neuronais simpáticos, esse efeito poderia estar
exacerbado nos animais KO, pois não há atividade contrarreguladora da ANG- (1-7),
e com isso aumentar a taxa lipolítica nesses animais. Estudos recentes têm
demonstrado que a Ang II tem ação no metabolismo do tecido adiposo. Boschmann e
colaboradores (2001) demonstraram que a perfusão do tecido adiposo branco com
Ang II mais isoproterenol potencializava a lipólise. Estudos de Ferreira (2004)
demonstrou que a infusão de Ang II promove um aumento de AGL plasmático e que o
bloqueador β-adrenérgico propanolol bloqueou a mobilização de AG promovido pela
Ang II. Entretanto estudos de TOWSEND (2001) mostram que infusão de
angiotensina II e que tratamento com enalapril (inibidor da enzima conversora de
angiotensina) não altera a taxa lipolítica basal em humanos.
32
No que se refere ao conteúdo da proteína HSL, não foram observadas
diferenças entre os grupos. Diante disso, nos parece razoável supor que a redução da
sensibilidade insulínica dos adipócitos poderia estar comprometendo a fosforilação da
enzima. Este comprometimento acarreta em uma menor translocação da enzima para
a gota lipídica levando a uma inibição da hidrólise dos TAG armazenados nos
adipócitos.
A lipase lipoprotéica (LPL) tem papel fundamental no clearance plasmático de
lipídios, uma vez que age como passo limitante na hidrólise de TAG presentes nos
quilomicra e VLDL circulante. A atividade da LPL está cronicamente aumentada no
tecido adiposo de humanos obesos (ECKEL, 1989) e de modelos de obesidade
animal, como ratos Zucker (LOPEZ-SORIANO et al, 1991), enquanto que a LPL no
músculo está inalterada ou diminuída em resposta a moduladores como a insulina
(HARTMAN, 1981; YOST et al, 1995). Alterações na atividade tecido-específico da
LPL pode constituir adaptações metabólicas canalizando lipídios para
armazenamento em detrimento da oxidação.
No presente estudo verificamos que a atividade da LPL está aumentada no
grupo que apresenta ausência do receptor Mas, disponibilizando AGLs para ser
captados pelo tecido adiposo. Os animais knock-out para o receptor MAS apresentam
disfunções metabólicas semelhantes aos animais Zucker obesos estudados por
Boivin and Deshaies (2000), que apresentam uma maior atividade da LPL no tecido
adiposo branco durante o jejum, além de aumento na concentração triacilglicerol,
AGLs e insulina, pois estudos de Santos e colaboradores (2007) demonstraram que
os animais com deficiência para o receptor MAS apresentam maior nível plasmático
de insulina.
O maior fornecimento de AGLs, via LPL, favorece uma captação aumentada
pelo tecido adiposo, facilitando assim o armazenamento de TAG. Entretanto em
nosso estudo observamos que apesar de uma maior atividade da LPL com
33
subseqüente disponibilidade da AGLs, tanto a lipogênese basal quanto a estimulada
pela insulina foram semelhante entre os grupos. A expressão da acetil-CoA
carboxilase, enzima responsável pela formação de malonil-CoA, primeiro composto
da formação da cadeia de ácidos graxos, também não apresenta diferença entre os
grupos.
O desenvolvimento celular associado com o crescimento do tecido adiposo
envolve hipertrofia celular (aumento no tamanho celular) e/ou hiperplasia. Hipertrofia
é resultado do excesso de acúmulo de TAG nos adipócitos resultante de um balanço
energético positivo (a energia ingerida é maior que o dispêndio energético). A
hiperplasia, também chamada de adipogênese, é resultado do recrutamento de novos
adipócitos a partir de precursores celulares existentes no tecido adiposo. O maior
processo envolvido na adipogênese é a proliferação de uma população de células
tronco e sua diferenciação em adipócitos maduros. Apesar dos animais knock-out
apresentarem um aumento na massa do tecido adiposo epididimal, esse fato não se
deve ao maior acúmulo de TAG nos adipócitos já que a lipogênese foi semelhante
nos dois grupos, e nos estudos de SANTOS e colaboradores (2007) não foi
evidenciada hipertrofia nos adipócitos dos animais knock-out para o receptor MAS.
Entretanto, podemos sugerir que pode haver uma falha na captação dos AGLs para o
interior dos adipócitos ou falta de glicerol para a re-esterificação dos AGLs em
triacilglicerol.
A entrada de ácidos graxos para o interior da célula adiposa é dependente de
translocases de ácidos graxos (CD36), que são encontradas em abundância nos
tecidos periféricos responsáveis pela metabolização de ácidos graxos livres, como
tecido adiposo, músculo esquelético e músculo cardíaco (ABMURAD et al, 1993).
Yang (2007) demonstrou que a expressão de CD36 aumenta durante a diferenciação
de adipócitos e que a insulina aumenta de maneira dose-dependente a expressão do
RNAm de CD36 o que consequentemente leva a um aumento na captação de AGLs
pelos tecidos insulino-dependentes. A maior atividade enzimática da LPL com
34
aumento na disponibilidade de AGLSs, sem alteração na lipogênese nos leva a
sugerir que pode haver uma deficiência na captação desses ácidos graxos pelo
adipócitos talvez por uma menor ação da insulina na expressão de CD36 nos
adipócitos dos animais knock-out.
Conforme já referido na INTRODUÇÃO, o receptor nuclear gama ativado pelos
proliferadores de peroxissomos (PPARγ) pertence à grande família dos receptores
nucleares, e é expresso predominantemente no tecido adiposo. No presente estudo
os animais com ausência do receptor MAS apresentaram uma redução na expressão
do RNAm para o PPARγ do tecido adiposo epididimal, o que pode estar relacionado a
uma menor expressão da CD36 e com isso uma menor captação de AGLs pelos
adipócitos contribuindo para o aumento de ácidos graxos plasmáticos. Estudos de
BARROSO et al (1999) relataram que pacientes com mutação no gene do PPARγ
padecem de severa resistência insulínica sugerindo que expressão do PPARγ pode
estar diminuída no estado de resistência à insulina. A menor expressão do PPARγ
contribui para a menor expressão de adiponectina encontrado nos animais knock-out
(SANTOS et al, 2007) levando a uma menor sensibilidade à insulina nos adipócitos.
Todos os componentes do sistema renina-angiotensina são expressos no tecido
adiposo e estão implicados na formação de novas células adiposas por mecanismos
parácrinos/autócrinos (DARIMONT et al, 1994a). Estudos de SAFANOVA (1997)
demonstram que tratamento de preadipócitos com ácidos graxos induz a expressão
de angiotensinogênio durante a diferenciação e essa indução é dependente da
continua presença de ácidos graxos. Em nosso estudo foi demonstrado que houve
um aumento na massa do tecido adiposo que pode ser decorrente de uma maior
diferenciação celular. O aumento da disponibilidade de AGL, através do efeito
antilipolítico da insulina e da maior atividade da LPL, nos animais KO, pode levar a
um aumento na expressão de angiotensinogênio e consequentemente um aumento
na síntese de angiotensina II que em pré adipócitos estimula a expressão e atividade
35
de marcadores da formação de adipócitos (glicerol 3 fosfato dehidrogenase e ácido
graxo sintetase) (SAINT-MARC et al, 2001).
O passo limitante na captação e metabolismo de glicose mediado pela insulina é
o transporte de glicose para o interior das células-alvo. Esse transporte no músculo e
tecido adiposo é mediado por transportadores específicos de glicose, a isoforma
GLUT-4. Em nosso estudo a captação de glicose nos adipócitos foi semelhante entre
os grupos KO e WT na condição basal, mas a captação de glicose máxima em
resposta á insulina foi menor no grupo KO. Dados de Santos e colaboradores (2007)
verificaram que quantidade de GLUT 4 esta menor nos animais com deleção genética
no receptor MAS o que certifica a menor captação de glicose pelos adipócitos nesses
animais.
Tem sido relatado que ANG II está envolvida no desenvolvimento de hipertensão
e resistência insulínica, sugerindo haver um crosstalk entre a sinalização de insulina e
angiotensina II. Estudos de VELLOSO e colaboradores (1996) demonstraram que a
angiotensina II (Ang II) diminui a fosforilação do substrato do receptor de insulina 1
(IRS-1) e diminui sua ancoragem com fosfatidil inositol 3 (PI-3) kinase em músculo
liso vascular. A Ang II aumenta a fosforilação de resíduos de serina do receptor de
insulina, IRS-1, PI-3 kinase (FOLLI et al, 1997), juntos, estes resultados demonstram
que a Ang II diminui a sinalização do receptor de insulina, se isso for verdadeiro para
células adiposas podemos explicar a menor ação da insulina observada em nossos
resultados. Por outro lado, estudos de GIANI et al (2007) verificaram que a
angiotensina-(1-7) estimula a fosforilação da JAK 2 e IRS-1 em coração de ratos e
esse efeito foi bloqueado na presença de losartan (antagonista do receptor AT1). Em
contraste à ANG II, a ANG-(1-7) estimula a fosforilação da Akt cardíaca e esta
estimulação foi diminuída na presença do antagonista do receptor MAS, A-779. Se
esses dados também forem verdadeiros para a célula adiposa podemos concluir que
a ANG-(1-7) pode ser um modulador positivo da à ação da insulina e que o balanço
36
entre a ANG II e ANG-(1-7) pode ser relevante no desenvolvimento da resistência
insulínica.
Considerando o papel oposto da angiotensina-(1-7) dentro do sistema renina-
angiotensina, a ausência do eixo Ang-(1-7)/MAS parece ter papel importante no
metabolismo do tecido adiposo, uma vez que o tecido adiposo desses animais
apresentam uma menor sensibilidade a ações da insulina. Essa menor ação da
insulina pode ser devido a uma exacerbação da ação da Ang II pela falta da
contrarregulação da angiotensina-(1-7), via receptor MAS, no tecido adiposo
epididimal.
37
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS A, GORELIK G, CARBINI LA, SCICLI AG. 1997 Angiotensin-(1-7) induces bradykinin-mediated hypotensive responses in anesthetized rats. Hipertension 30:217-21. ABUMRAD NA, EL-MAGHRABI MR, AMRI, EZ, LOPEZ E, GRIMALDI PA. 1993 Cloning of a rat adipocyte membrane protein implicated or transport of long-chain fatty acids that is induced during preadipocyte differentiation. Homology with human CD36. J. Biol. Chem. 268: 17665-17668. AGUILERA G. 1992 role of angiotensina II stimulates sutypes an the regulation of aldosterone secretion in the adrenal glomerulosa zone in the rat. Mol Cell Endocrinol. 106:52-60. AILHUAD G, FUKAMIZU A, MASSIERA F, NEGREL R, SAINT-MARC P, TEBOUL M. 2000 Angiotensinogen, angiotensin II and adipose tissue development. Int J Obes Relat Metab Disord. 24 Suppl 4:S33-5 AXELROD L, MINNICH AK, RYAN CA. 1985 Stimulation of prostacyclin production in isolated rat adipocytes by ang II, vasopressin and bradykinin: evidence for 2 separate mechanisms of proataglandin synthesis. Endocrinology 116:2548-2553. BARROSO I, GURNELL M, CROWLEY VE, et al. 1999 Dominant negative mutations in human PPARgamma associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension. Nature 402:880-883. BELFRAGE P, VAUGHAN M. Simple liquid-liquid partition system for isolation of labeled oleic acid from mixtures with glycerides. J Lipid Res. 1969;10:341-344. BJÖRNTORP P. 1984 Hazards in subgroups in human obesity. Eur J Invest 14:239-241. BOIVIN A, DESHAIES Y. 2000 Contribution of hyperinsulinemia to modulation of lipoprotein lipase activity in the obese Zucker rat. Metabolism 49(1) 134-140. BOLINDER J, KAGER L, ÖSTMAN J, ARNER P. 1983 Differences at the receptor and postreceptor levels between human omental and subcutaneous adipose tissue in the action of insulin on lipolysis. Diabetes 32: 117-123. BOSCHMANN M, RINGEL J, KLAUS S, SHARMA AM. 2001 Metabolic and hemodynamic response of adipose tissue to angiotensin II. Obes. Res. 9:486-491.
38
BOTION, LM. 2001 The influence of fasting/ refeeding on the lipoprotein lipase activity of adipose tissue and muscle. Braz J Med Biol Res 34 (11): 1411-1414. BOTION, L.M., GREEN, A.1999 Long-term regulation of lipolysis and hormone sensitive lipase by insulin and glucose. Diabetes 48: 1691-1697. BRADFORD, M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254. CAMPBELL DJ, HABENER J. 1987 Cellular localization of angiotensinogen gene expression in brown adipose tissue and mesentery: quantification of messenger ribonucleic acid abundance using hybridization in situ Endocrinology 121:1616-1626. CAMPBELL DJ, DUNCAN AM, KLAIDS A, HARRAP SB.1995 Converting enzyme inhibition and its withdrawal in spontaneously hypertensive rats. J Cardiovasc Pharmacol 26:426-436 CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, HERINGER SB, BATISTA EN, KHOSLA MC, SANTOS RAS. 1992 Differential baroreceptor reflex modulation by centrally infused angiotensin peptides. Am J Physiol 263:R89-94. CAREY RM, WANG ZQ, SIRAGY HM. 2000 Role of the angiotensin II type 2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function. Hypertension 35: 155-63. CARLSSON PO. 1998 Angiotensin II and the endocrine pancreas: Effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia 41:127-133. CASSIS LA, SAYE JA, PEACH MJ. 1988 Location and regulation of rat angiotensinogen messenger RNA. Hypertension 11:591-596. CASSIS LA, MARCHALL DE, FETTINGER MJ, et al. 1998 Mechanism contributing to angiotensin II regulation of body weight. Am J Physiol 274: E867-876. CASSIS LA. 2000 Fat cell metabolism; insulin, fatty acids and rennin. Current Hypertens Rep 2: 132-138. COIMBRA CC, GAROFALO MAR, FOSCOLO DRC, XAVIER AR, MIGLIORINI RH. 1999 Gluconeogenese activation after intravenosus angiotensin II in freely moving rats. Peptides 20: 823-827. CRANDALL DL, ARMELLINO DC, BUSLER DE, McHENDRY-RINDLEB, KRAL JG. 1999 Ang II receptors in human preadipocytes: role in cell cycle regulation. Endocrinology 140:154-158.
39
DARIMONT C, VASSAUX G, AILHAUD G, NEGREL R. 1994a Differentiation of preadipose cells: paracrine role of prostacyclin upon stimulation of adipose cells by angiotensin-II. Endocrinology 135:2030-2036. DARIMONT C, VASSAUX G, GAILLARD D, AILHAUD G, NEGREL R. 1994b In situ microdialysis of proatagladins in adipose tissue: stimulation prostacyclin release by angiotensina II. Int J Obes Relat Metab Disord. 18:783-788. DAVISSON RL, OLIVERIO MI, COFFMAN TM et al 2000 Divergent function of angiotensin II receptor isoformas in the brain. J Clin Invest. 106:103-106 DEGERMAN E, BELFRAGE P, MANGANIELLO VC. 1997 Structure, localization and regulation of cGMP-inhibited phosphodiesterase (PDE3). J Biol Chem 272:6823-6826. DELLIPIZZI A, HILCHEY SD, BELL-QUILLEY CP. 1994 Natriuretic actions of angiotensin-(1-7). Br J Pharmacol 111:1-3. DUSSERRE F, MOULIN P, VIDAL H. 2000 Differences in mRNA expression of the adipose tissues. Biochem Biophys Acta 1500:88-96. ECKEL RH. . 1989 Lipoprotein lipase. A multifunctional enzyme relevant to common metabolic diseases. New Engl. J. Med 320:1060-1068 EGAN JJ, GREENBERG AS, GHANG MK, WEK MC, MOOS JR, LONDOS C. 1992 Mechanism of hormone-stimuled lipoysis in adipocytes: Traslocation of hormone sensitive lipase to the lipid storage droplet. Proc Natl Acad Sci USA 89: 8537-8541. EGAN BM, HENNES MMI, STEPNIAKOWSKI KT, O’SHAUGHNESSY IM, KISSEBAH AH, GOODFRIEND TL. 1996 Obesity hypertension is related more to insulin’s fatty acid than glucose action. Hypertension 27: 723-728. ENGELI S, NEGREL R, SHARMA AM. 2000 Physiology and pathophysiology of the adipose tissue renin-angiotensin-system. Hypertension 35:1270-1277. ENGELI S, BOHNKE J, GORZELNIAK K, JANKE J, SCHLING P, BADER M, LUFT FC, SHARMA AM. 2005 Weight loss and renin-angiotensin-aldosterone system. Hypertension 45:356-362 ENGLISH V, CASSIS L. 1999 Facilitation of sympathetic neurotransmission contributes to angiotensina regulation of body weight. J Neural Transm 106:631-644.
40
ERNSBERGER P, KOLESTSKY RJ. 2006 Metabolic effects of antihypertensive agents: role of sympathoadrenal and rennin-angiotensin systems. N-S Arch Pharmacol 373:245- 258. FERRARIO CM, IYER SN. 1998 Angiotensin-(1-7): a bioactive fragment of the renin-angiotensin system. Regulatory Peptides 78(1-3):13-18. FERREIRA ML. 2004 Efeito da angiotensina II na lipogênese e lipólise, in vivo, em ratos aclimatados ao frio (5 0C) e a temperatura ambiente (25 0C). Tese de doutorado, departamento de fisiologia e biofísica, UFMG. FASSHAUER M, PASCHKE R, STUMVOLL M. 2004. Adiponectin, obesity, and cardiovascular disease. Biochimie 86: 779-784. FOLCH, J., LEES, M., STANLEY, G.A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; 226: 497-509. FOLLI F, KAHN CR, HANSEN H, BOUCHIE JL, FEENER EP. 1997 Angiotensin II inhibits insulin signaling in aortic smooth muscle cells at multiple levels. A potential role of serine phosphorylation in insulin/angiotensin II crosstalk. J Clin Invest 100: 2158-69. FOLSOM AR, KAYE SA, SELLERS TA, HONG CP, CERHAN JR, POTTER JD, PRINEAS RJ. 1993 Body fat distribution and 5-year risk of death in older women. JAMA 269: 483-487. FRAYN KN. 2002 Adipose tissue as a buffer for daily lipid flux. Diabetologia 45: 1201-1210. FRUHBECK G, COMEZ-AMBROSI J, MURUZABAL FJ, BURREL MA. 2001 The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation. Am J Physiol Endocrinol Metab 280:E827-47. GEARING KL, GOTTLICHER M, TEBOUL M, WIDMARK E, GUSTAFASSON JA. 1993 Interaction of the peroxissome-proliferator-activated receptor and retinoid X receptor. Proc Natl Acad Sci USA 90:1440-1444. GIACCHETTI G, FALOIA E, MARINIELLO B, et al.2002 Overexpression of the renin-angiotensin system in human visceral adipose tissue in normal and overweight subjects. Am J Hypertens 15:381-388. GIANI JF, GIRONACCI MM, MUNOZ MC, PENA C, TURYN D, DOMINICI FP. 2007 Angiotensin-(1-7) stimulates the phosphorylation of JAK 2, IRS-1 and Akt in rat heart in vivo: role of the AT1 and MAS receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293(2): H1154-63.
41
GRASSI G, SERAVELLE G, CATTANEO GM, BOLLA GB, LANFRANCHIA, COLOMBO M. 1995 Sympatic activation in obese normotensive subjects. Hypertension 25: 560-3. GREENBERG AS. 1990 Perilipin, a major hormonally regulated adipocyte-specifc phosphoprotein associated with the periphery of lipid storage droplets. J. Biol. Chem. 266: 18769-18775. GOOSSENS GH, JOCKEN JWE, BLAAK EE, SCHIFFERS PM, SARIS WHM, van BAAK MA. 2007 Endocrine role of the renin-angiotensin system in human adipose tissue and muscle: Effect of β-adrenergic stimulation. Hypertension 49:542-547. HAINAULT I, NEBOUT G, TURBAN S et al. 2002 Adipose tissue-specific increase in angiotensinogen expression and secretion in the obese (fa/fa) Zucker rat. Am J Physiol Endocrinol Metab.282:E59-E66. HANDA RK, FERRARIO CM, STRANDHOY JW. 1996 Renal actions of Angiotensin-(1-7): in vivo and in vitro studies. Am J Physiol 270:F141-F147. HARTMAN AD. 1981 Lipoprotein lipase activities in adipose tissue and muscle in the obese Zucker rat. Am J Physiol 241:E108-E115. HEITSCH H, BROVKOVYCH S, MALINSKI T, WIEMER G. 2001 Angiotensin-(1-7)-stimulated nitric oxide and superoxide release from endothelial cells. Hypertension 37:72-76. HOM FG, GOODNER CJ. 1984 Insulin-dose response characteristic among individual muscle and adipose tissue measured in rat in vivo using 2-deoxy-glucose.Diabetes 33:153-159. ICHIKAWA I, BRENNER BM. 1980 Importance of efferent arteriolar vascular tone in regulation of proximal tubule fluid reabsorption an glomerulo tubular balance in rats. J Clin Invest 65: 1992-1201. IWAKI M, MATSUDA M, MAEDA N, FUNAHASHI T, MATSUZAWA Y, MAKISHIMA M, SHIMOMURA I. 2003 induction of adiponectin, a fat-derived antidiabetic and antiatherogenic factor, by receptor nuclear. Diabetes 52: 1655-1663. JANKE J, ENGELI S, GORZELNIAK K, LUFT FC, SHARMA AM. 2002 Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors. Diabetes 51:1699-1707. JANSSON L. 1994 The regulation of pancreatic islet blood flow . Diab Metab Rev 10: 407-416.
42
KRAEGEN EW, JAMES DE, JENKINS AB, CHISOLM DJ. 1985 Dose-respose curves for in vivo sensitivity in individuals tissues in rats. Am J Physiol 248:353-362. KARPE F, OLIVERCRONA T, OLIVERCRONA G, SAMRA JS, SUMMERS L.K.M., HUMPHREYS SM, FRAYN KN. 1998 Lipoprotein lipase transport in plasma: role of muscle and adipose tissue in regulation of plasma lipoprotein lipase concentration. J Lipid Res 39:2387-2393.
KERSTEN S. 2001 Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis. EMBO Reports 21 (41): 282-286. KERSTEN S. 2002 Peroxissome proliferator activated receptor and obesity. European Journal of Pharmacology 440:223-234. KIHARA M, UMEMURA S, SUMIDA Y, YOKOYAMA N, YABANA M, NYUI N, TAMURA K, MURAKAMI K, FUKAMIZU A, ISHII M 1998 Genetic deficiency of angiotensinogen produces an impaired urine concentrating ability in mice. Kidney Int 53: 548-555 KISSEBACH AH, FREEDMAN DS, PERIS AN. 1989a Helt risks of obesity. Med Clin North Am 73:111-138. KISSEBACH AH, PERIS AN. 1989b Biology of regional body distribution relationship to non-insulin-dependent diabetes mellitus. Diabet Metab Rev 5:83-109. KOSTEINS E, MILLIGAN G, CHRISTOPOULOS A, SANCHEZ-FERRER CF, HERINGER-WALTHER S, SEXTON PM, GEMBARDT F, KELLETT E, MARTINI L, VANDERHEYDEN P, SCHULTHEISS HP, WALTHER T. 2005 Gprotein-coupled receptor Mas is a physiological antagonist of the angiotensina II type 1 receptor. Circulation 111:1806-1813. LADU MJ, HAPSAS H, PALMER WK. 1991 Regulation of lipoprotein lipase in adipose tissue and muscle tissue during fasting. Am J of Physiology 260: 953-959. LAEMMLI UK. 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. LAFONTAN M, BERLAN M. 1993 Fat cell and the control of white and brown fat cell function. J Lipid Res 34: 1057-1091. LARGE V, ARNER P. 1998 Regulation of lipolysis in human. Pathophysiological modulation in obesity, diabetes and hyperlipidaemia. Diabetes Metab 24:409-418.
43
LOPEZ-SORIANO FJ, CARBO N, ARGILES JM. 1991 Lipid metabolism inthe obese Zucker rat: Disposal of na oral [14C]triolein load and lipoprotein lípase activity. Biochem J 274:651-656. LYNCH KR, PEACH MJ. 1991 Molecular biology of angiotensinogen Hypertension 17: 263-269S MACHADO LJC, MIHESSEN-NETO I, MARUBAYASHI U, REIS AM, COIMBRA CC. 1995 Hyperglicemic action of angiotensin II in freely moving rats. Peptides 16:479-483. MACHADO LJC, MARUBAYASHI U, REIS AM, COIMBRA CC. 1998 The hyperglicemia induced by angiotensin II in rats is mediated by AT1 receptors. Bras J Med Res 31:1349-1352. MASILAMANI S, KIM GH, MITCHELL C et al. 1999 Aldosterone-mediated regulation of ENaC alpha, beta and gamma subunit proteins in rat kidney. JJ Clin Invest 104: R19-R23. MASSIÉRA F, BLOCH-FAURE M, CEILER D, MURAKAMI K, FUKAMIZU A, GASC JM, QUIGNARD-BOULANGÉ A, NEGREL R, AILHAUD G, SEYDOUX J, MENETON P, TEBOUL M. 2001 Adipose angiotensinogen is involved in adipose tissue grwth and blood pressure regulation. FASEB 15:2727-2729 MEFFERT S, STOLL M, STECKELINGS UM, BOTTARI SP, UNGER T. 1996 The angiotensina II AT2 receptor inhibits proliferation and promotes differentiation in PC12W cells. Mol Cell Endocrinol 122:59-67. McGRATH BP, MATTHEWS PG, LOUIS W et al. 1990 Double-blind study of dilevalol and captopril, both in combination with hydrochlorothiazide, in patients with moderate to severe hypertension. J Cardiovasc Pharmacol 16:831-838. MORRIS MJ, WILSON WL, STRBUCK EM et al . 2002 Forebrain circumventricular organs mediate salt appetite induced by intravenous angiotensina II in rats. Brain Res 949: 42-50. MUZENMAIER DH, GREENE AS. 1996 Opposing action of angiotensi II on microvascular growth and arterial blood pressure. Hypertension 27:760-5. NEGRELR, GAILLARD D, AILHAUD G. 1989 Prostacyclin as a potent effector of adipose cell differentiation. Biochem J 257:399-405. NILSSON-EHLE P.E; SCHOTZ M.C. A stable radioactive substrate emulsion for assay of lipoprotein lipase. J. Lipid Res 1976; 17: 536-41.
44
OKUNO A, TAMEMOTO H, TOBE K, et al. 1998 Troglitazone increases the number of small adipocytes without the change of white adiose mass in obese Zucker rats. J Clin Invest 101:1354-1361. PAULA RD, LIMA CV, KLOSLA MC, SANTOS RAS. 1995 Angiotensin-(1-7) potentiates the hypotensive effect of bradykinin in conscious rats. Hypertension 26:1154-9. PEACH M.1977.Renin–angiotensin system: biochemistry and mechanism involved. of action. Physiol Rev. 57:313–70. PETI –PETERDI J, WARNOCK DG, BELL PD 2002 Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical colleting duct via AT(1) receptors. J Am Soc Nephrol 13:1131-1135. PTAFFL MW. 2001 A new mathematical model for relative quantification im real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29(9):e45. RANDLE P, GARLANDP, HALES N, NEWSHOLEME E. 1963 The glucose fatty acid: its role insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet I: 785. RICHELSEN B, PEDERSEN SB, MOLLER-PEDERSEN T, BAK JF. 1991 Regional differences in triglyceride breakdown in human tissue: effects of catecholamines, insulin and prostaglandin E2. Metabolism 40: 990-996. RODBELL, M.1964 Metabolism of isolated fat cells. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis. J. Biol. Chem 239: 375-380. ROKS AJM, van GEEL PP, PINTO YM, BUIKEMA H, HENNING RH, ZEEUW D, van GLIST WH. 1999 Angiotensin-(1-7) is a modulator of the human renin-angiotensin system. Hypertension 34:296-301. SAFANOVA I, AUBERT J, NEGREL R, AIHAUD G. 1997 Regualtion by fatty acids of angiotensinogen gene expression in preadipose cells. Biochem J 322:235-239. SAINT-MARC P, KOZAK LP, AILHAUD G, et al 2001 Angiotensin IIas a trofic factor of white adipose tissue: stimulation of cell formation. Endocrinology 142:487-492. SALEH J, SNIDERMAN AD, CIANFLONE K. 1999 Regulation of plasma fatty acid metabolism. Clin Chim Acta 286: 163-180. SANTOS RAS, SILVA ACS, MAGALDI AJ, KHOSLA MC, CESAR KR, PASSAGLIO KT, et al. 1996 Evidence for physiological role of angiotensin-(1-7) in the control of hydroelectrolyte balance. Hypertension 27:875-84.
45
SANTOS RAS, CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, ANDRADE SP.2000 Angiotensin-(1-7): an update. Regul Pept 28:91(1-3): 45-62. SANTOS RA, SIMÕES E SILVA AC, MARIO C, SILVA DM, MACHADO RO, DE BUHR I, HERINGER-WLTHER S, PINHEIRO SV, LOPES MT, BADER M, MENDES EP, LEMOS VS, CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, SCHULTHEISS HP, SPETH R, WALTHER T. 2003 Angiotensin-(1-7) is na endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci USA 100(14):8258-8263. SANTOS SHS, FERNANDES LR, MARIO EG, ALVAREZ-LEITE JI, FERREIRA AVM, PÔRTO LCJ, BOTION LM, BADER M, ALENINA N, SANTOS RAS. MAS deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism. Diabetes 57:340-347. SAYE JA, CASSIS LA, STURGILL TW, LYNCH KR and PEACH MJ. 1989 Angiotensinogen gene expression in 3T3-L1 cells. Am J Physiol 256:C448-C451 SAYE JA, LYNCH KR and PEACH MJ. 1990 Changes in angiotensinogen messenger RNA in differentiating 3T3-F442 adipocytes. Hypertension 15:867-871. SCHIAVONE MT, SANTOS RAS, BROSNIHAN KB, KHOSLA MC, FERRARIO CM. 1988 Release of vasopressin from the rat hypothalamo- neurohypophysial system by angiotensin-(1-7) heptapeptide. Proc Natl Acad Sci USA 85:4095-8. SCHLING P, MALLOW H, TRINDL A, LÖFFLER G. 1999 Evidence for a local renin angiotnsin system in priamry cultured human adipocytes. Inter J Obes Relat Metab Disord 23:336-341. SETHI JK, VIDAL-PUIG AJ. 2007 Thematic reviews series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res 48(6):1253-62. SHANMUGAM S, SANDBERG K. 1996 Ontogeny of angiotensin II receptors. Cell Biol Int 20: 169-176. SHARMA AM. 2006 The obese patient with diabetes mellitus: from research targets to treatment options. Am J Med 119: S17-S23. SIL P, SEN S. 1997 Ang II and myocyte growth. Hypertension 30:209-216. SIRAGY HM, CAREY RM. 1999 Protective role of angiotensin AT2 receptor in a renal wrap hypertension model. Hypertension 169: 997-1006. SPIEGELMAN BM. 1998 PPARγ: adipogênico regulator and thiazolidionedione receptor. Diabetes 47:507-514.
46
STRAZZULLO P and GALLETTI F. 2004 Impact of the renin-angiotensin system om lipid and carbohydrate metabolism. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:325-332. TAN F, MORRIS PW, SKIDGEL RA, ERDOS EG. 1993 Sequencing and cloning of human prolycarboxipeptidase (angiotensinase C): similarity to both serine caboxypeptidase and prolyendopeptidase families. J Biol Chem 268: 16631-8. TIKELLIS C, COOPER ME, THOMAS MC. 2006 Role of the rennin-angiotensin in the endocrine pancreas: implications for the development of diabetes. Inter J Biochem Cell Biol 38: 737-751. TIMMERMANS PB, WONG PC, CHIU AT et al. 1993 Angiotensin II receptors and angiotensina II receptor antagonists. Pharmacol Rev 45: 205-251. TOWNSEND RR. 2001 The effects of angiotensina-II on lipolysis in human. Metabolism 50(4): 468-472. UMEMURA S, NYUI N, TAMURA K, YAMAGUCHI S, NAKAMARU M, ISHIGAMI T, YABANA M, KIHARA M, INOUE S, ISHII M. 1997 Plasma angiotensinogen concentrations in obese patients. Am J Hypertens 10:629-633. UNGER T. 1999 The angiotensin type II receptor: variations on an enigmatic theme. J Hypertens 17:1775-86. VELLOSO LA, FOLLI F, SUN XJ, WHITE MF, SAAD MJ, KAHN CR. 1996 Cross-talk between the insulin and angiotensin signaling systems. Proc Natl Acad Sci USA 93:12490-5. WALCZAK R and TONTONOZ P. 2002 PPARadigms and PPARadoxes. Expanding roles for PPARγ in the control of lipid metabolism. J Lipid Res 43:177-186. WALTHER T, BALSCHUN D, VOIGT JP, FINK H, ZUSCHRATTER W, BIRCHMEIER C, GANTEN D, BADER M. 1998 Sustained long term potentiation and anxiety in mice lacking the Mas protooncogene. J Biol Chem 273:11867-11873. WU L, IWAI M, NAKAGAMI H, CHEN R, SUZUKI J, AKISHITA M et al. 2002 Effect of angiotensin II type 1 receptor blockade on cardiac remodeling in angiotensin II type 2 receptor null mice. Arterioscler Thrmb Vasc Biol 22:49-54. WU L, IWAI M, NAKAGAMI H, LI Z, CHEN R, SUZUKI J, et al. 2001 Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation associated with selective angiotensina II type 1 receptor blockade with valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury. Circulation 104:2716-21.
47
48
WU Z, XIE Y, MORRISON RF, BUCHER NL, FARMER SR. 1998 PPARgamma induces the insulin-dependent glucose transporter GLUT4 in the absence of C/EBPalpha during the conversion of 3T3 fibroblast into adipocytes. J Clin Invest 101:22-32. YAMAMOTO K, CHAPPELL K, BROSNIHAN KB, FERRARIO CM 1992 In vivio metabolism of angiotensina I by neutral endopeptidase (EC3.4.24.11) in spontaneously hypertensive rats. Hypetension 19:1201-11. YANG Y, CHEN M, LOUX TJ, HARMON CM. 2007 Regulation of FAT/CD36 mRNA gene expression by long chain fatty acids in the differentiated 3T3-L1 cells. Pediatr Surg Int 23(7):675-83. YOST TJ, FROYD KK, JENSEN DR et al. 1995 Change in skeletal muscle lipoprotein lipase activity in response to insulin/glucose in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism 44:786-790.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
Top Related