Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012
Métodos Físicos de Análise - ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA / VISÍVEL
Prof. Dr. Leonardo LucchettiMestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ
Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – FiocruzDocente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FiocruzDocente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz
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Diagrama de Energia : a radiação compreendida no UV-vis está entre 200 – 800nm. Abaixo de 200nm praticamente todas as moléculas orgânicas absorvem.
raios cósmicos raios γ
raios X UVno vácuo
UV próximo
Visível IV próximo
IV Microondas
1019 Hz 1015 Hz 1013 Hz
0,1nm 200-400 nm 400-800 nm 2-50 µm
Frequência
λ
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Espectrofotometria deAbsor ção Molecular
Região do visível/UV e IVAbsorbânciaTransmitânciaAbsortividadeAbsortividade molar
Espectro de absorção
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Espectrofotometria deAbsor ção Molecular
• Aquisição de espectros e/ou quantificação fotométrica– curva-padrão (curva de calibração)– comparação com absorção de solução-padrão
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Vantagens e desvantagens
Devido à “pobreza” de informações, espectros de absorção UV-vis tem uso limitado na identificação positiva de substâncias
Escolha do solvente (crítico no UV)
Indicativo de grupos funcionais (proteínas, DNA, substâncias aromáticas, carbonilas etc.)
Grande ferramenta se acoplada à cromatografia
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Análise quantitativa
Ampla aplicação em sistemas orgânicos e inorgânicosGrande disponibilidade instrumental e acessível a vários
laboratóriosSensibilidade típica em torno de 10-5 mol/l, podendo atingir até
10-7 mol/lSeletividade relativamente altaBoa exatidão: ~ 1 – 3%Facilidade na obtenção, tratamento e armazenamento dos
dados
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Determina ção da concentra ção
Curva de calibra ção– Observação da lei de Beer
– Determinação experimental do ε
Escolha e preparo do branco (referência) é fundamental– Composição da amostra: teor e qualidade dos concomitantes– Presença de equilíbrios secundários
Em casos extremos, a reprodu ção da amostra é praticamente invi ável– A amostra passa a ser usada como referência! � método da
adição de padrão (analito)
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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A) Banda única de intensidade m édia - baixa ( ε = 100–10.000 M-1cm -1) a λ < 220nm
É geralmente indicativa de uma transição n → σ∗. Aminas, alcoóis, éteres e tióis contam-se entre as estruturas possíveis, desde que os eletrons não ligantes não façam parte de um sistema conjugado. Neste caso, será boa prática procurar bandas N-H, O-H, C-O e S-H no espectro de IV.
Exceção: A transição n → π∗ em grupos –CN aparece nesta região. No entanto, é fraca (ε < 100) e o grupo –CN identifica-se facilmente no IV.
B) Banda única de fraca intensidade ( ε = 10–100 M-1 cm -1) a 250 < λ < 360nm, sem absor ção significativa a λ menor (200 –250nm)
É geralmente indicativa de uma transição n → π∗. Como não há absorção a comprimentos de onda superiores trata-se de um cromóforo simples, tipicamente não conjugado, em geral contendo um átomo de O, N, ou S. Exemplos: C=O, C=N, N=N, -NO2, -CO2R, -CO2H, CONH2. O IV e o RMN são também neste caso excelentes meios de diagnóstico definitivo.
Guia simplificado para an álise de espectros UV
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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C) Duas bandas de intensidade m édia (ε = 1.000–10.000 M-1 cm -1), ambas com λmax > 200 nm
Esta situação é geralmente indicativa da presença de um sistema aromático. Sefor esse o caso, poderá ser observada uma estrutura mais fina na banda de maiorcomprimento de onda em solventes não polares. Quando os anéis aromáticos sãosubstituídos, a absortividade molar é superior a 10.000, sobretudo se o substituinte aumentar a extensão do sistema conjugado.Nos compostos aromáticos polinucleares (PAHs) e heterocíclicos aparece umaterceira banda a cerca de 200nm.
D) Bandas de intensidade elevada ( ε = 10.000–20.000 M-1cm -1) a λmax > 210nm
Podem corresponder a cetonas α,β-insaturadas, dienos ou polienos. Quanto maisextenso for o sistema conjugado, maior é o comprimento de onda do máximo deabsorção.
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Guia simplificado para an álise de espectros UV
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E) Cetonas, ácidos, ésteres, amidas e outros compostos simples contendo sistemas π e eletrons não ligantes
Surgem duas bandas de absorção: n → π∗ (λmax > 300nm, intensidade baixa) e π → π∗ (λmax < 250nm, intensidade elevada). Em sistemas conjugados (ex.enonas) a banda π → π∗ sofre um desvio batocrômico e aumenta de intensidade, podendo obscurecer a banda n → π∗.
F) Compostos fortemente corados (i.e., com absor ção no vis ível)
Nestes casos poderá existir um sistema conjugado longo ou um cromóforo policíclico aromático. Os compostos benzenoides podem ser corados se tiverem substituintes com conjugação ao sistema aromático. Os compostos não aromáticos requerem em geral pelo menos 4–5 cromóforos conjugados para ocorrer absorção na zona do visível. No entanto, alguns compostos simples com grupos nitro, azo, nitroso, α-diceto, polibromo e poliiodo podem ser corados.
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Guia simplificado para an álise de espectros UV
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Procedimento pr ático
Seleção do comprimento de onda– máximo do pico � máxima sensibilidade
– mínimo desvio da lei de Beer � ε ~ constante
Variáveis que influenciam a absorbância– solvente– pH da solução– temperatura– força iônica– presença de interferentes
Manuseio das cubetas (c élulas)– par casado de cubetas (calibração)– limpeza com tecido embebido em metanol grau espectroscópico
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Terminologia
Deslocamento batocrômico : para maior λ (influência de solventes ou de um grupo cromóforo ou auxócromo que se junta ou retira à molécula de referência
Deslocamento hipsocrômico : para menor λ
Deslocamento hipercrômico : para maior absorção (função de concentração e espessura da solução)
Deslocamento hipocrômico : para menor absorção (função de concentração e espessura da solução)
Grupos crom óforos : Grupos funcionais que absorvem radiação na faixa de trabalho do UV-VIS.
Grupos aux ócromos : Grupos saturados que, quando ligados a um cromóforo, modificam o comprimento de onda e a intensidade da absorção
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (carbonilas conjugadas)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (cabonilas conjugadas)
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Espectrofotometria UV
Produto da interação de matéria e energia
Relação direta e proporcional com a concentração
Estrutura molecular define a frequência de maior absorção
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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Energia incidente será sempre mais intensa que a emergente, e a atenuação pode ser atribuída a:
- reflexões da interface entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da cubeta- dispersão por partículas presentes na solução- absorção da energia pelo meio
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria UV
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Absortividade (a): quociente entre absorbância (A) e o produto entre concentração (c), expressa em g/l e caminho ótico (b), expresso em cm
Absortividade molar (E): quociente entre absorbância (A) e produto entre concentração (c), expressa em mol/l e caminho ótico (b), expresso em cm
Extin ção espec ífica (E1%): quociente entre absorbância e produto entre concentração (c), expressa em g/100ml e caminho ótico (b), expresso em cm
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria UV
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Lei de Lambert: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relação ao aumento da espessura atravessada
Lei de Beer: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentração da solução
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Leis da Fotometria
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Um pouquinho de f órmulas...
log I o / I = a . b
A = a . c
Io = intensidade da luz incidenteI = intensidade da luz transmitidaa = constante característica da soluçãob = espessura (cm) da camada atravessada pela luz
A = absorbânciaa = constante característica da soluçãoc = concentração da solução atravessada pela luz
A = a . c. l
LAMBERT
BEER
l = caminho ótico LAMBERT-BEER
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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- Soluções diluídas: 0,4mg/mL ou menos, dependendo do εmáx no λmáx
- Solventes devem ser “transparentes” na faixa de comprimento de onda a ser analisada: não se pode obter o “espectro de diferença” de um solvente que absorve muito pois, nestas condições, a quantidade de luz que atravessa a amostra é mínima
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Requisitos para an álises : amostragem
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1- Como técnica acoplada ao CLAE (detecção);
2- Análise de tintas, corantes, explosivos, alimentos, bebidas etc;
3- Peritagens e análises in loco;
5- Análise de marcadores biológicos.
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Aplica ções do UV/vis em an álises forenses
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns crom óforos comuns: carbonilas conjugadas
Exemplos de espectros de absor ção
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Fatores que afetam as propriedades de absor ção de um crom óforo
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pHO pH do solvente determina o estado de ionização de cromóforos ionizáveis (protonação e desprotonação pelo H+)
Polaridade (depende da estrutura do cromóforo e do tipo de transição)Para cromóforos polares, é frequente (especialmente se a molécula contém O, N, ou S) que λmáx ocorra para um comprimento de onda menor em solventes polares hidroxílicos (H2O, álcoois) que em solventes não polares.
Efeitos da orienta çãoCaracterísticas geométricas (simetria, organização) frequentemente têm fortes efeitos sobre εmáx. O melhor exemplo é o hipocromismo de ácidos nucléicos.
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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5- Com relação à espectroscopia de absorção no ultravioleta (UV), assinale as alternativas abaixo como CERTO ou ERRADO. (Perito Criminal/ PC/ ES – 2007).
a) A eficiência de absorção de energia da luz para cada cromóforo está relacionada com seu peso molecular.b) Ligações peptídicas absorvem no UV de 300 a 400 nm.c) Os métodos de espectroscopia em UV podem ser empregados na avaliação da estrutura de proteínas.d) A absorção molar de um substrato cromóforo raramente se altera na ligação com a proteína.e) O sistema éxciton está relacionado com a estabilidade de elétrons.
(PERITO CRIMINAL – ENG.QUÍMICA – SSP - 2003
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PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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A espectrometria na região do visível é uma técnica bastante utilizada para análise quantitativa de diversos compostos orgânicos de interesse na área de toxicologia. Indique dentre as alternativas abaixo a que NÃO se refere a essa técnica:a) a espectrometria baseia-se na absorção da radiação pela amostra, absorção esta que é proporcional à concentração; b) para quantificação escolhemos a faixa linear, segundo a lei de Lambert-Beer;c) comprimento de onda selecionado entre 200 e 400nm;d) o comprimento de onda selecionado entre 400 e 750nm;e) no espectrofotômetro a leitura pode ser obtida sob a forma de transmitância ou absorbância.
(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)
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