5/8/2018 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA microbiana do solo - slidepdf.com
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Agropecuária Técnica, v.25, n.1, p.1-12, 2004
Agropecuária Técnica, v. 25, n.1, 2004
ISSN 0100-7467 - Areia, PB, CCA/UFPB
MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSAMICROBIANA DO SOLO
MARINICE O. CARDOSO1
1Doutoranda em Agronomia do CCA/UFPB, Campus II, Areia � PB, CEP: 58397-000
RESUMO
A biomassa microbiana do solo (BMS) é o principal componente do subsistema de decompositores, que regula
a ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade das plantas e dos ecossistemas. Portanto, sua
quantificação é de grande importância para estudos sobre a melhoria ou perda da qualidade do solo. Para quantificação
da BMS muitas e diversificadas técnicas foram criadas. Nos métodos pioneiros contavam-se células microbianas
pela observação direta de lâminas de solo ao microscópio. Foram introduzidas, posteriormente, melhorias como o
uso de corantes vitais e o cálculo da biomassa através do biovolume celular e da densidade média das estruturas
vivas. Outros métodos, baseados na extração e determinação de algum componente celular específico (ácido
murâmico para bactérias, quitina para fungos e ATP para a biomassa total, entre outros) surgiram em grande
número. Entretanto, atualmente, os métodos da respiração induzida pelo substrato, da fumigação-incubação e dafumigação-extração são os mais utilizados para a quantificação da BMS. Nesta revisão, os principais métodos são
apresentados e discutidos quanto à utilidade e confiabilidade.
Palavras-chave: microscopia direta, constituintes celulares, respiração induzida, fumigação-incubação, fumigação-extração
METHODS FOR QUANTIFYING SOIL MICROBIAL BIOMASS
ABSTRACT
Soil microbial biomass (SMB) is the main component of the decomposers subsystem that regulates nutrient
cycling, energy flow, and productivity of plants and ecosystems. Thus, its quantification is of great importance for
studies aiming to improve or to prevent loss of quality of soils. SMB quantification can be performed by many and
diverse techniques. In the early methods, microbial cells were counted through direct observation of soil smear
(soil samples spread on a microscope slide), under optical microscopy. Lately, improvements were introduced by
using vital stains and subsequent calculation of biomass from cell biovolume and average density of living structures
Other methods based on extraction and determination of specific cell constituents (muramic acid of bacteria, chitin
of fungi, and ATP of total biomass, among others), appeared to a large extent. However, the current methods of
substrate-induced respiration, and fumigation-incubation and fumigation-extraction, are the most utilized methods
for quantifying SMB. In the present review, the main methods are presented and discussed with respect to their
usefulness and reliability.
Key words: direct microscopy, cellular constituents, induced respiration, fumigation-incubation, fumigation-extraction
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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2 M. O. CARDOSO
INTRODUÇÃO
A biomassa microbiana do solo (BMS) compreende
a parte viva da matéria orgânica do solo, excluídas as
raízes e organismos maiores do que 5 x 10 3 µm3,
contendo, em média, 2 a 5% do carbono orgânico e 1 a
5% do nitrogênio total do solo (Cerri et al., 1992; De-
Polli e Guerra, 1999). Operacionalmente, a BMS atua
como agente de transformação da matéria orgânica, na
ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia (Wardle e
Giller, 1996; Marchiori Júnior e Melo, 1999). A dupla
função da BMS, de fonte/dreno de nutrientes e de
catalisador pela execução de processos enzimáticos no
solo, é amplamente aceita (Duxbury et al., 1989; Templer
et al., 2003). A BMS compreende uma fonte potencial
de N, P, S e outros nutrientes para as plantas, e os fluxos
através do reservatório microbiano podem ser departicular relevância no solo (De-Polli e Guerra, 1999;
Kouno et al., 2002). Através da rápida imobilização de
nutrientes, que pode reduzir a disponibilidade de
nutrientes para as plantas, a BMS funciona como dreno
competitivo (Duxbury et al., 1989).
Constituindo a maior parte da fração ativa da matéria
orgânica, a BMS pode ser enquadrada como o
compartimento central do ciclo do carbono, sendo mais
sensível que o resultado quantitativo do C orgânico e do
N total para aferir alterações na matéria orgânica do
solo (Gama-Rodrigues, 1999). A relação Cmicrorganismos :C
orgânicototal do solo aumenta e diminui rapidamente
conforme ocorram elevação ou redução da matéria
orgânica do solo num sistema ecológico, e a constância
dessa relação indica o novo equilíbrio desse sistema
(Anderson e Domsch, 1989). O estudo quantitativo da
BMS é de fundamental importância para o estudo da
extensão dos processos no solo em que atua, bem como
para monitoramento e aplicação de modelagens (Leal e
De-Polli, 1999; Turner et al., 2001; Wang et al., 2003).
Como parâmetro ecológico, a avaliação da BMS permite
obter informações rápidas sobre mudanças nas
propriedades orgânicas do solo, detectar mudanças
causadas por cultivos ou por devastação de florestas,
medir regeneração dos solos após a remoção da camada
superficial, e avaliar os efeitos dos poluentes como
metais pesados e pesticidas entre outros (Frighetto,
2000).
Até o início da década de 90, os trabalhos sobre BMS
tratavam, principalmente, de ajustes metodológicos
(Gama-Rodrigues, 1999). Neste sentido, deve-se
distinguir a biomassa de sua atividade (Siqueira et al.,
1994), visto que a BMS não é uma estimativa da
atividade dos microrganismos do solo, mas da massa
microbiana viva total do solo, com base na concentração
de algum elemento ou de alguma substância celular,
considerando-se a população microbiana como umaentidade única (De-Polli e Guerra, 1999). Ressalva-se
que as atividades de algumas enzimas podem ser
relacionadas com a BMS e são auxiliares na
interpretação da condição funcional da BMS total ou de
algum compartimento (Marchiori Júnior e Melo, 1999;
Taylor et al., 2002; Matsuoka et al., 2003).
As possibilidades metodológicas existentes para
avaliação da BMS são várias e contemplam diferentes
abordagens. Alguns métodos bastante utilizados têm sua
confiabilidade questionada, porque sofrem influência das
condições experimentais (Rodrigues et al., 1994;Gonçalves et al., 2002). Neste trabalho, foi realizada
uma revisão de literatura sobre esses métodos, que são
discutidos quanto aos vários aspectos de sua utilidade e
limitações.
Antecedentes
O aumento do interesse em microrganismos de solo
e, paralelamente, a necessidade de isolamento,
identificação e enumeração desses agentes
transformadores da matéria orgânica do solo, resultaram
na criação e diversificação de muitas técnicas.Inicialmente, as investigações em bacteriologia de solo
foram realizadas com métodos desenvolvidos em
bacteriologia médica: amostras de solo eram diluídas com
água esterilizada, disseminadas em placas com gelatina
e, após incubação, determinava-se o número de bactérias
(Grisi, 1984).
Posteriormente, foi introduzido o método de diluição
em placas para contagem de bactérias do solo. Nessa
técnica, diluições da amostra do solo são adicionadas a
tubos contendo meio liquefeito e resfriado, e
posteriormente o conteúdo desses tubos é distribuídoem placas de Petri, e a partir do número de colônias
desenvolvidas na placa, é calculado o número de
organismos vivos por grama de solo (Jackson e Raw,
1975; Pelczar Jr. et al., 1996; Melloni et al., 2001). Em
seguida, por adaptação, foi introduzida a técnica de
plaqueamento para isolamento de fungos de solo
(Jackson e Raw, 1975; Grisi, 1984). O método de
plaqueamento por gotas é recomendado por Jahnel et
al. (1999) para determinação do número mais provável
de fungos e bactérias do solo.
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O desenvolvimento de técnicas microscópicas paraexame de microrganismos provenientes de amostras dosambientes naturais ocorreu no início do século XX. Osprimeiros métodos utilizados consistiam na contagem donúmero de células microbianas pela observação diretade lâminas de solo ao microscópio, sendo introduzidodepois o uso de corantes vitais, bem como o cálculo dabiomassa através da determinação dos volumes celularese da densidade média das estruturas vivas (Grisi, 1984;Grisi e Gray, 1985).
Na impossibilidade da obtenção de uma medidaquantitativa exata da população microbiana total em umecossistema, por métodos culturais ou por meio da
observação microscópica direta, foram desenvolvidas
outras técnicas capazes de avaliar a massa dos
microrganismos, ou seja, a BMS (Pelczar et al., 1980;
Haubensak et al., 2002).
Métodos para quantificação da biomassa
microbiana
Os métodos da microscopia direta, do trifosfato de
adenosina, da respiração induzida pelo substrato, da
fumigação-incubação e da fumigação-extração são os
mais utilizados para quantificação da BMS, destacando-
se os dois últimos. Convém mencionar a técnica de análise
de PLFAs (phospholipid fatty acids) totais extraídos para
estimar a BMS, que tem gerado valores proporcionais
aos obtidos por outros métodos (Fritze et al., 2000; Bailey
et al., 2002; Fierer et al., 2003). Os métodos de extração
dos componentes celulares baseiam-se no fato de que a
célula microbiana quiescente mantém as seguintes
relações, segundo Paul e Clark (1989): ATP: C: N: P: S,
respectivamente, 1: 250: 40: 9: 2,6.
- Microscopia direta
No exame microscópico direto, uma diluição da
amostra do solo é espalhada em camada fina sobre uma
lâmina de vidro, e após fixação e coloração do esfregaço,os microrganismos podem ser contados pelo exame
microscópico (Pelczar Jr. et al., 1996). Como o princípio
básico da metodologia é estimar a biomassa microbiana
através do biovolume dos microrganismos, há
necessidade da estimativa da densidade específica e do
conteúdo de umidade dos microrganismos, para
conversão de biovolume a biomassa (Alexander, 1977;
Grisi e Gray, 1985; De-Polli e Guerra, 1999). Embora
esse método possa ser utilizado para estimar a população
microbiana total, técnicas de colorações especiais são
necessárias para discriminar microrganismos vivos de
mortos, bem como muitas vezes é difícil distinguir
partículas microscópicas do solo de células microbianas
(Casida, 1976; Grisi e Gray, 1985; Scheu e Parkinson
1994). Na microscopia direta, os microrganismos podemser corados por várias formas e observados por
diferentes técnicas ópticas (Casida, 1971). Para solos
bem drenados, este método é freqüentemente utilizado
como padrão, sendo a expectativa geral de que todos os
demais métodos apresentem boa correlação com o
mesmo (Seganfredo, 1999).
- Método do trifosfato de adenosina (ATP)
Este método inclui-se num grupo de métodos que se
baseia, para estimar a BMS, na extração e determinação
de constituintes celulares específicos de microrganismos,como por exemplo, o ácido murâmico, a quitina, a
clorofila, ácidos nucléicos e outros, bem como, no caso
o trifosfato de adenosina (Grisi, 1984). A técnica do ATP
vem sendo utilizada para estimar a BMS (Tate e
Jenkinson, 1982), em razão de algumas características
favoráveis deste constituinte celular: é degradado
rapidamente após a morte das células dos
microrganismos, facilitando a separação entre
microrganismos vivos e mortos, além de não ser
confundido com as moléculas de ATP provenientes de
fragmentos de raízes; está presente nas diferentes célulasmicrobianas (bactérias, fungos, algas e protozoários); e,
a sua concentração nas células é razoavelmente
uniforme em relação à concentração de carbono celular
(De-Polli e Guerra, 1999), apontada como sendo de 1:
250 (Paul e Clark, 1989). O método está fundamentado
no princípio de que o ATP pode ser quantificado através
do sistema enzimático luciferina-luciferase (Oades e
Jenkinson, 1979), tendo sido melhorado por Tate e
Jenkinson (1982). O ATP oriundo das células vivas é
extraído com solução de H2SO
40,3 mol L-1, ou outros
extratores com eficiências de recuperação variáveis, e
a emissão luminosa do material, na presença do sistemaenzimático, é medida através de fotômetros comerciais
disponíveis para esta situação, sendo a quantidade de
luz emitida proporcional à concentração de ATP noextrato (De-Polli e Guerra, 1999).
- Respiração induzida pelo substrato ou fisiologia
da taxa de respiração
Esse método, proposto por Anderson e Domsch
(1978), é baseado no aumento inicial da taxa de
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respiração da população microbiana, até um máximo,
quando uma fonte de carbono, prontamente
decomponível, é adicionada em excesso ao solo. A fonte
usual é a glicose porque a maioria dos microrganismos
pode utilizá-la imediatamente como fonte de carbono(Grisi, 1984; Lin e Brookes, 1999). O aumento da taxa
respiratória (liberação de CO2), antes que o crescimento
microbiano ocorra, é acompanhado por algumas horas,
realizando-se em seguida, a conversão para a biomassa.
Entretanto, há necessidade de calibração, com um
método padrão, para a determinação da biomassa
(Anderson e Domsch, 1978). Originalmente, o flush de
CO2, gerado durante um período de incubação
predeterminado, foi correlacionado com a BMS, mas a
equação obtida é válida somente nas condições de
proposição, isto é, mineralização entre 0,35 e 6,5 ml de
CO2
100 g de solo-1 h-1 e temperatura de 22 ± 0,5oC(Anderson e Domsch, 1978). Alternativamente à
proposta original, o uso da glicose sólida foi substituído
por solução de glicose e o analisador de gás para medir
o CO2
respirado por cromatógrafo a gás (Sparling e
West, 1988; Lin e Brookes, 1999) ou respirômetro
automatizado a partir de microcompensação de O2
eletrolítico (Tiunov e Scheu, 2000). Este método facilita
de modo particular a avaliação do quociente metabólico
ou taxa de respiração específica, que permite verificar
o estado de equilíbrio do solo (Wardle, 1994; Mercante,
2001). O quociente metabólico microbiano (qCO2) écalculado como a razão da respiração microbiana em
relação à biomassa, ou seja, como a quantidade de C-
CO2produzido por unidade de C da biomassa microbiana
(Thirukkumaran e Parkinson, 2000; Tiunov e Scheu,
2000; Mercante, 2001).
De acordo com Wardle (1994) é esperado que
apenas os microrganismos ativos respondam à adição
de glicose, que é justamente o componente de maior
interesse para os microbiologistas do solo, pois é esse
componente que está reciclando ativamente os nutrientes
e é responsável pela decomposição dos restos culturais.Por esta razão, esse método pode ser extremamente
útil como medida relativa da biomassa microbiana. A
quantidade de glicose requerida para ativar a máxima
taxa respiratória inicial varia grandemente, dependendo
das propriedades físicas e químicas dos solos, devendo
ser determinada para cada tipo de solo (Lin e Brookes,
1999; Fisk et al., 2003). Um grave erro técnico quanto a
este método é a realização de medidas de taxas derespiração após o crescimento microbiano, devendo-se
atentar para o fato de que há variações na resposta à
adição da glicose em diferentes solos, visto que em alguns
ocorre um aumento rápido na respiração, enquanto em
outros verifica-se inicialmente uma queda e depois uma
elevação da respiração (Anderson e Domsch, 1978; Lin
e Brookes, 1999).
- Fumigação-incubação
O método de fumigação-incubação se fundamenta
na ocorrência dos seguintes eventos: interrupção da
atividade microbiana de uma dada amostra de solo pela
fumigação com clorofórmio (CHCl3), livre de álcool, que
provoca o rompimento da célula, seguido por um pico
de CO2, devido à decomposição dos organismos mortos
pelos sobreviventes à fumigação, ou pelas novas
populações a partir de um inóculo de solo fresco
introduzido na amostra fumigada (Jenkinson, 1966).Os procedimentos envolvem a medida da emanação
de CO2
devido à decomposição da população microbiana
na amostra fumigada, e em uma amostra testemunha,
não-fumigada (Rodrigues et al., 1994). A biomassa,
representada pelo carbono microbiano, pode ser
estimada pela relação B = CI
/ kCI
, onde CI
= C-CO2
liberado do solo fumigado no período de 10 dias de
incubação menos o C-CO2liberado do solo testemunha
(Pfenning et al., 1992; Wang et al., 2003). Este termo
(kC1
) corresponde ao fator de mineralização do C, isto
é, à proporção de carbono microbiano liberado na formade CO2
nos 10 dias de incubação, e é de 0,41 à
temperatura de 22oC e 0,45 a 25oC (Anderson e Domsch,
1978; Siqueira et al., 1994).
No método de fumigação-incubação, o fator kC1
não
é precisamente o mesmo para todos os solos (Stevenson
e Elliott, 1989), e no caso de solos muito diferentes
daqueles utilizados na determinação dos valores de kC1
tradicionalmente usados, ele deverá ser determinado para
cada tipo de solo (Wardle, 1994). Entretanto, um fator
médio de 0,41 foi proposto para amostras de alguns solos
no Brasil, visto que o mesmo tende a ser mais baixo em
solos ácidos e de textura argilosa das zonas tropicais
(Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra, 1999). A
respeito do fator de correção, Voroney e Paul (1984)
estudaram sua determinação �in situ� para calibração
desse método. Os procedimentos sobre o método de
fumigação-incubação encontram-se descritos
detalhadamente em De-Polli e Guerra (1999) e
Matsuoka et al. (2003).
Brookes et al. (1985) e Stevenson e Elliott (1989)
explicam a determinação do N da BMS pelo método de
M. O. CARDOSO
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fumigação-incubação e afirmam que o maior problema
para sua estimativa é a desnitrificação ou imobilização
poder alterar as quantidades de N calculadas para as
formas solúveis após a incubação. Portanto, é mais
conveniente mensurar o N da BMS pela fumigação-extração 24 horas após a fumigação (Brookes et al.,
1985).
- Fumigação-extração
� Carbono da biomassa microbiana
Como alternativa promissora à técnica de fumigação-
incubação, Vance et al. (1987a) propuseram a
substituição da incubação por uma extração do carbono
da biomassa, que é igualmente liberado pela ação do
agente fumigante clorofórmio. Segundo esses autores,a biomassa microbiana é proporcional ao aumento de
carbono orgânico que se torna extraível do solo após
uma fumigação. Convém ressaltar que a correção da
umidade do solo para 40% da sua capacidade de
saturação é parte do procedimento metodológico, quando
da preparação das amostras de solo para fumigação
(Grisi, 1997), o que é adotado também no método de
fumigação-incubação, antes comentado. A fumigação
do solo com o clorofórmio, além de matar, rompe as
células microbianas liberando o constituinte microbiano
para o solo e permitindo assim sua extração (Frighetto,
2000). O carbono representa cerca de 47% do peso
seco da célula microbiana.
Em termos de procedimento, a amostra é dividida
em subamostras que sofrerão extração imediata (o
controle, sem fumigação) ou fumigação seguida de
extração. O extrato da amostra não-fumigada contém
somente a matéria orgânica extracelular e o extrato
fumigado contém ambos, matéria orgânica intracelular
(biomassa) e matéria orgânica extracelular (Hofman e
Dusek, 2003). O material celular liberado pelo
rompimento das células microbianas é recuperado com
um extrator fraco como o K2SO
40,5 M (Tate et al.,
1988) logo após a fumigação, eliminando-se os dez dias
de incubação do método anterior; e a determinação do
carbono nos extratos fumigado e não-fumigado é feita
por dicromatometria a partir da retirada de uma alíquota
do extrato (Vance et al., 1987a; De-Polli e Guerra, 1999).
Numa modificação do procedimento de fumigação-
extração originalmente proposto, o analisador de carbono
Dohrman DC-180 é utilizado para quantificação do C
extraído (Wu et al., 1990; Aoyama et al., 2000;
Hargreaves et al., 2003), ou o analisador de C solúve
Shimadzu TOC-5000A (Bailey et al., 2002; Zimmermann
e Frey, 2002).
A biomassa, representada pelo carbono microbiano
pode ser estimada pela relação B = CE x 2,64 ouB = C
E / 0,38, onde C
Erepresenta o carbono extraído
do solo fumigado menos o carbono extraído do solo
controle (Pfenning et al., 1992), sendo 2,64 ou 0,38, o
fator kCE
para conversão do carbono extraído em
biomassa microbiana (Vance et al., 1987b). Este último
valor de kCE
encontra-se no intervalo proposto (0,33 ±
0,08) por Sparling e West (1988) para solos minerais
com baixo pH e menos de 10% de carbono orgânico
recomendação correntemente utilizada (Tate et al.
1988), inclusive em solos do Brasil para os quais o fator
kCE não foi determinado (De-Polli e Guerra, 1999).Os procedimentos para execução da técnica de
fumigação-extração foram explicados detalhadamente
por De-Polli e Guerra (1999) e Frighetto (2000). Naetapa de fumigação, Ferreira et al. (1999) utilizaram airradiação do forno de microondas em substituição aoclorofórmio, e concluíram que a irradiação durante doisminutos foi suficiente para estimar o C, e também o Npresente na biomassa microbiana nos procedimentos de
incubação e extração. Na fase de pré-condicionamentopara estimar o C e o N da BMS, Roy e Sing (2003)deixaram as amostras de solo com a umidade do campo
em um recipiente fechado com 100% de umidade, ecom o CO
2removido, por sete dias em temperatura
ambiente, sendo o mesmo aberto diariamente por alguns
minutos para aeração.
� Nitrogênio, fósforo e enxofre da biomassa
microbiana do solo
Os métodos de quantificação da BMS geralmentebaseiam-se na estimativa do C microbiano, pela maiorfacilidade na quantificação devido ao seu teor ser maiselevado na célula. O N, P e S microbianos também
podem ser determinados por fumigação-extração nomesmo extrato de solo (Brookes et al., 1985; De-Polli eGuerra, 1999; Roy e Sing, 2003). De acordo com Turneret al. (2001), a técnica de absorvância ultravioleta (UV)em 280 nm de extratos de K
2SO
4 0,5 M de solos
fumigados e não-fumigados, para estimar a concentração
de C, N e P da biomassa microbiana, revelou-se rápidasimples, precisa e relativamente barata para estimar aBMS, visto que os resultados foram fortementecorrelacionados com aqueles determinados pelosmétodos convencionais.
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Na metodologia convencional, o N da biomassa é
avaliado à maneira do C da biomassa, mas usando o
fator kEN
, que tem dois valores amplamente utilizados,
0,45 e 0,54 (Wardle, 1994), sendo 0,54 o do método
original. O conteúdo de N microbiano é quantificadoem extrato de K2SO
40,5 M (relação solo:extrator de
1:4, extração por 30 minutos e análise após digestão de
Kjeldahl) a partir do fluxo de N solúvel total de amostras
fumigadas e não-fumigadas, e o cálculo é dado pela
seguinte fórmula: Nmic
(mg kg-1) = FNt
/ k N
, sendo Nmic
-
nitrogênio microbiano do solo; FNt
- fluxo obtido da
diferença entre a quantidade de N total recuperado no
extrato da amostra fumigada e o recuperado na amostra
não fumigada; e k N
-
fator de correção (0,54), que
expressa a fração do N da biomassa microbiana do solo
recuperada após os processos de fumigação-extração
(Brookes et al., 1985; Joergensen e Mueller, 1996). Aoxidação de persulfato alcalino para determinação
automática do N total em extratos da biomassa
microbiana, através do autoanalisador Scalar-UV, é
também utilizada (Cabrera e Beare, 1993; Friedel e
Scheller, 2002).
Procedimentos similares de fumigação-extração,
acima mencionados, têm sido usados para determinação
do P e S da BMS. Para o P da biomassa, o método
prevê a extração do P inorgânico disponível com resina,
antes do processo de fumigação com clorofórmio e
extração com NaHCO3
0,5 M em pH=8,5; e, fator de
correção kp=0,4, para compensar a incompleta liberação
do P microbiano pela fumigação com clorofórmio e a
incompleta extração do P microbiano liberado pelo
extrator, que é somente de 40%; bem como requer o
ajuste na capacidade de adsorção de P pelo solo
(Stevenson e Elliott, 1989; Guerra et al., 1995; Morel et
al., 1996; Rheinheimer et al., 2000; Conte et al., 2002).
Uma proposição adaptada para medida do P da BMS,
para solos com alta capacidade de fixação de P, foi a da
membrana de troca de ânions (Kuono et al., 1995). E,
dois extratores têm sido utilizados para determinar o Sda biomassa, NaHCO
30,1 M e CaCl
20,01 M, com
valores de ksde 0,41 e 0,35, respectivamente (Saggar
et al., 1981; Stevenson e Elliott, 1989).
Limitações associadas aos métodos
Muito se discute ainda sobre a confiabilidade dos
atuais métodos, principalmente quando se deseja estimar
a biomassa dos microrganismos �in situ�, de maneira
mais próxima da realidade, ou seja, estimando-se seu
valor absoluto, em diferentes condições edafoecológicas.
Dessa forma, é mais conveniente, sempre que possível,
a utilização de mais de um método para estudos sobre a
biomassa microbiana (Gama-Rodrigues, 1999). Os
métodos extrativos não apresentam os problemasdaqueles que dependem do crescimento microbiano, mas
estão muitas vezes sujeitos à variabilidade da eficiência
de extração e rompimento das células (Frighetto e
Schneider, 2000). Entre pares de métodos, as
correlações através de diferentes amostras de solos, ou
tipos de solos, são altamente variáveis, sendo razoável
esperar que equações de calibração derivadas a partir
de ampla faixa de valores abrangendo maior área
geográfica sejam mais consistentes do que na faixa
estreita de pequena área geográfica (Wardle e Ghani,
1985). Smolander et al. (1994) e Fierer et al. (2003)
discutem em suas pesquisas as razões de estimativasdistintas da BMS com os métodos que utilizaram:
respiração induzida pelo substrato, fumigação-extração
e PLFAs totais.
Algumas críticas específicas sobre esses métodos
são apresentadas abaixo:
Microscopia direta. Este método pioneiro é raramente
utilizado em amostras naturais de solo porque apresenta
enorme dificuldade operacional e maior tempo de
execução dos procedimentos. Entretanto, é útil quando
se comparam diferentes metodologias para aferição dabiomassa (Martens, 1995; De-Polli e Guerra, 1999). A
dificuldade para discriminação entre microrganismos
vivos e mortos se torna uma limitação, visto que na
estimativa da biomassa microbiana do solo deve ser
considerada a massa viva de microrganismos, além de
ser difícil diferenciar partículas microscópicas do solo
de células microbianas (Casida, 1976; Pelczar Jr. et al.,
1996).
Método do trifosfato de adenosina (ATP). Apesar da
variação entre o conteúdo do ATP e o do C da BMS,
tem possibilitado resultados válidos quando sua execução
é cuidadosa. Algumas dificuldades estão a ele associadas
como a extração incompleta de ATP das células, a
decomposição enzimática, ou a hidrólise química do ATP
durante o processo de extração, bem como a adsorção
dessa molécula pelos colóides inorgânicos do solo
(Martens, 1995). Também, Brookes e Jenkinson (1989)
consideram que os valores de ATP podem não ser
indicadores fiéis do estado metabólico de um organismo
ou de uma população, visto que apenas uma parte da
população poderá estar em crescimento, e admitem como
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melhor indicador a carga energética de adenilato, dadapor [(ATP) + 0,5 (ADP)] / [(ATP) + (ADP) + (AMP)].Seu valor, a partir de dados de vários autores é na faixade 0,8 a 0,95 (Grisi, 1996).
Respiração induzida pelo substrato. É consideradoum método prático e rápido para estimar a quantidadede microrganismos vivos do solo. A principaldesvantagem deste método está relacionada com o fatorde conversão, que pode variar sensivelmente emdiferentes tipos de solo (Grisi, 1984). Por outro lado,quantifica preferencialmente o rápido crescimentomicrobiano, ou seja, a porção zimógena da comunidademicrobiana, visto que é aceito ser a BMS proporcionalà taxa de respiração de curto prazo, medida após a adiçãode um substrato lábil, como a glicose, ao solo (Fierer etal., 2003). Também, o seu emprego requer adisponibilidade de equipamento que possa determinaracuradamente o CO
2respirado (Wardle, 1994). Sobre
isto, Hashimoto (2002) descreveu um método simplespara medição de um volume pequeno do gás CO
2 usando
um analisador de gás infravermelho, tanto paralaboratório como para condições de campo.
Fumigação-incubação. Diferentes autores fazemreferência à marcante influência dos fatores ambientaisneste método. Ele não é recomendado para solos ácidoscom elevado teor de Al (Siqueira et al., 1994), ou soloscom recente adição de matéria orgânica, que provocauma subestimativa da biomassa microbiana do solo(Jenkinson, 1966; Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra,1999), bem como aqueles da rizosfera de pastagempermanente e solos sob encharcamento ou seca (Tateet al., 1988). Em solos muito secos, a fumigação afetapouco os microrganismos (Frighetto, 2000), e em solosencharcados a água poderá proteger os microrganismos,que não são destruídos pelo clorofórmio (Siqueira et al.,1994). Neste sentido, Stevenson e Elliott (1989) afirmamque o mesmo é inadequado para análises de solos secosao ar. Por outro lado, quando uma grande proporção de
massa microbiana do solo foi morta pela seca, antes daamostragem, ocorrerá um fluxo de CO2
no período dezero a 10 dias (estabelecido no método), devido àdecomposição dos microrganismos mortos, sendoessencial uma testemunha não-fumigada (Wardle, 1994).Igualmente, em solos com alto teor de argila aliado àumidade foram encontradas dificuldades paradeterminação da biomassa microbiana com o uso dessatécnica, onde, provavelmente, as aludidas condições dossolos tenham interferido na homogeneidade dafumigação e na capacidade de reconstituição da
população microbiana (Pfenning et al., 1992; Messiaset al., 1999). O alto teor de argila protege a matériaorgânica da decomposição e torna os microrganismosmenos ativos pelo confinamento em pequenos poros
(Wang et al., 2003), o que pode interferir nareconstituição da população microbiana. Também foisugerido que as populações microbianas inoculadas nasamostras fumigadas não são capazes de metabolizarmatéria orgânica não-microbiana tão rapidamentequanto as nativas do solo não-fumigado, o que leva àsubestimação da biomassa microbiana (Siqueira et al.1994). Esse método, na sua forma padrão, não éadequado para solos alagados, porém Inubushi et al(1984) sugeriram algumas adaptações para solos sobestas condições.
Fumigação-extração. Neste método, pelo fato dafumigação ser seguida, de imediato, pela extração docarbono das amostras, são evitados os fatores químicose/ou biológicos que interferem na reconstituição dapopulação microbiana, responsável pelo aumento daliberação de CO
2das amostras fumigadas, como ocorre
na fumigação-incubação; os resultados são, portantoobtidos mais rapidamente e com menores variações entreas repetições, o que se reflete em coeficientes de
variação baixos (Pfenning et al., 1992). Os valores dofator de correção do carbono extraído (k
CE)
não foram
exatamente determinados para solos tropicais (Pfenning
et al., 1992; De-Polli e Guerra, 1999). Esse método éparticularmente útil em solos ácidos e orgânicos deflorestas e em solos secos reidratados, onde o métodode fumigação-incubação mostra limitações (Wardle,1994). O método encontra-se bem padronizado em seuprotocolo laboratorial por diferentes usuários (Frighetto2000; Gonçalves et al., 2002). Contudo, Haubensak etal. (2002) concluíram pela necessidade de mais estudosquanto ao tempo de exposição ao clorofórmio, emdiferentes condições de umidade, para soloscontrastantes de florestas, pois o tempo de exposiçãoafeta a extração de C e N de distintos compartimentos
da matéria orgânica do solo. Em relação à condição detransporte, armazenagem e pré-condicionamento daamostra anteriormente à fumigação, as regras não estãobem definidas (Gonçalves et al., 2002). Por exemplo, osefeitos da secagem ao ar sobre bactérias e fungosdependem dos materiais do solo (Scheu e Parkinson,1994). E o pré-condicionamento de curta duração deamostras, como terra fina secada ao ar (TFSA), teveresultados promissores somente quando níveis e períodosadequados de reumedecimento foram adotados(Gonçalves et al., 2002).
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Embora as possibilidades metodológicas existentes,
para avaliação da BMS, sejam várias e com diferentes
abordagens, ainda não são técnicas de fácil manipulação.Os métodos mais recentes, da fumigação-incubação e
fumigação-extração, têm sido preferidos por serem, de
certa forma, de uso mais fácil e de possibilitarem o
acesso às quantidades dos elementos contidos dentro
da BMS. No entanto, não deve ser esperado que esses
métodos apresentem a precisão e exatidão dos métodos
de análises químicas. As informações sobre calibração
desses métodos para solos tropicais ainda são
insuficientes, e em muitos trabalhos de pesquisa
continuam sendo utilizados fatores de correção dos
métodos originais, gerados em condições temperadas.Comumente são identificadas dificuldades técnicas dos
métodos mais utilizados para quantificação da BMS que
necessitam ser superadas. Portanto, ainda existem
lacunas que devem ser preenchidas no tocante à
melhoria das metodologias para determinação da BMS.
Existe uma expectativa de que, posteriormente, as
informações quantitativas fornecidas por esses métodos
sejam complementadas por aquelas de natureza
qualitativa referentes à diversidade e funcionamento da
BMS, com o aperfeiçoamento das técnicas de biologia
molecular aplicadas ao solo.
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