1MTODOS RPIDOS PARA ANALISE
MICROBIOLOGICA DE ALIMENTOS
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2- Tcnica de epifluorescncia em filtros;
- Tcnica de filtrao em membranas de grade hidrofbica
-Reidratao de filmes secos
-Mtodo de Redigel
-Mtodo Simplate
-Mtodos fsicos, imunolgicos e qumicos
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3TCNICA DE EPIFLUORESCNCIA DIRETA EM FILTROS (TEDF)
Amostra de alimento diludo - filtra em membrana denylon de 5 m filtrado tratado com Triton X 100 e tripsina(lise de clulas) filtra em membrana de policarbonato de0,6 m o filtro corado c/ laranja de acridina contagemde clulas em microscpio de fluorescncia.
Resultados em 25 a 30 minutos.
Uso: contagem de bactrias gram + e gram no leiteEstimar nmero de microrg em carnes e aves
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4MEMBRANA FILTRANTE COM GRADE HIDROFBICA
-Filtro especial com 1600compartimentos de cera emuma membrana;
-Deteco - mnimo 10 clulas/g;Resultado em NMP
-Resultados em 24 horas ou menos;
-O filtro colocado sobre um gar apropriado;
-Uso especificamente para microg. Indicadores, fungos,Pseudomonas e Salmonelas.
Membranas Isogrid usa o gar SD-39.
Isogrid
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5Membrana Noegrid
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6Procedimento de filtrao
Sistema de filtrao Coloca-se a membrana
Ajuste do filtro Adio do diluente
1) 2)
3)4) 5)
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76)
Adio da amostra
7)
Aplica-se o vcuo
8)
Remove-se a membranaE coloca-se em meio garadequado
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8Bactrias totais
leveduras
Salmonella
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9Sistema Isogrid
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10
PETRIFILME 3M Reidratao de filmes secos
-2 filmes plsticos (polipropileno e polietileno) unidospor um lado, um dos filmes coberto com meio de culturaonde adiciona-se a 1 mL amostra diluda.;
-Aps incubao (24 h) aparecem microcolniasvermelhas Deteco de coliformes totais e E.coli. Contagembactrias aerbias
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11
Coliformes totais e fecais em Petrifilm EC
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12
A faixa de contagem de 15 a 150
Contagem de E.coli = 13Contagem de Coliformes Totais = 28
incontveis
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13
Contagem de Coliformes Totais = 3
Coliformes Totais = 69 (colnias com gs).
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14
Contagem de Aerbios colnias vermelhas
Contagem de coliformes colnias vermelhas com gs
Contagem de E. coli colnias azuis com gs
Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azulesverdeada;
Bolores = colnias grandes , colorao variada.
PETRIFILME 3M - USOS
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15
Silva et al., (2006) Avaliao do padro coliformes a 45C e comparao da eficincia das tcnicas dos tubos mltiplos e Petrifilm EC na deteco de coliformes totais e Escherichia coli em alimentos
Amostras de lingia
Coliformes a 45C
tubos mltiplos (NMP/g) Petrifilm E. coli (UFC/g)
18 9,0.102 1,0.104
42 1,1.103 1,6.104
37 2,8.103 6,0.103
38 7,0.102 1,3.104
45 2,3.103 1,4.104
39 3,0.102 1,2.104
4 Ausente 1,0.105
14 Ausente 2,0.104
15 Ausente 2,0.104
47 Ausente 3,7.104
48 Ausente 2,8.104
25 Ausente 7,3.103
26 Ausente 6,0.103
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REDIGEL
-O meio (no contem gar- pectinato de clcio) misturadocom alimentos diludos ;
- Deixado em repouso por 30 minutos ;
-Incubados por tempo e temperaturas adequados ;
-Atrativo para microrg. psicotrficos - sensvel ao calor
Usado para a contagem de coliformes totais
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MTODO SIMPLATE
- Baseado na atividade de enzimas comuns em microrganismos deorigem alimentar;
- O meio contm substratos que so hidrolisados pelas enzimas;
-Libera um composto fluorescente visvel em luz UV;
-- possui 84 ou 198 poos de incubao
-mesfilos totais e Coliformes 35 C/24h
-Bolores e leveduras 25C/72h
-Pode ser usado C. jejuni
-Conta o numero de cavidades positivas-e converte para NMP
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18
MTODO SIMPLATE
C jejuni 48 h 24 h
Microrg. totais, 24 h
Leveduras56 a 72h
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N. de cavidades positivas = NMP/mL ou g
1= 22=43=64=8......50 =150....83 =73884 >738
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MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA
IMPEDNCIA-CONDUTNCIA(impedncia (Ohms) relao entre diferena de potencial (U em Volts) entreos terminais de um determinado Circuito eltrico dividido pela corrente eltrica(amperes)Condutncia inverso da resistncia eltrica
- Baseado na alterao da corrente eltrica do meiodevido a atividade metablica de microrganismos;- Bactometer instrumento que mede mudanas decondutncia;A quantidade de microrganismos presentes definida pela determinao do TEMPO DE DETECO tempo para que a curva de impedncia comece a se elevar- em conc de 106-107 /mL
Ex: detecta coliformes em carnes 103/g em 6,5 h
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BACTOMETER
64 a 512 AMOSTRAS
Mtodo convencional BactometerContagem total 48 hrs. 6-24 hrs.Coliformes 24 hrs. 6-14 hrs.Leveduras e mofos 5 dias 24-48 hrs.Bactrias lcticas 3-5 dias 24-48 hrs.
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22
MICROCALORIMETRIA
- Baseado na gerao DE CALOR durante a multiplicaodos microrganismos;
- O calor produzido proporcional quantidade demicrorganismos presentes na amostra;
- Estimar bactrias em carne moda, estudo dadeteriorao em alimentos enlatados.
-Carne moda com 105 a 108 UFC/g gerao de calorcom 24 hs.-S. aureus em 2 hs com 107 a 108 UFC/g.
MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA
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Aparelho de Calvet
Sensvel a um fluxo de calor De 0,01 cal/h para uma amostra De 10 mL.
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24
Estudos do efeito de agentes antifngicos em
Microrganismos atravs da microcalorimetria
(Montanari et al., 1993)
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25
CITOMETRIA DE FLUXO
MTODOS FSICOS
- Mede componentes e propriedades de clulasindividuais (fluorescncia, absorbncia ou disperso daluz) em uma suspenso lquida.
-Utiliza fontes como argnio, criptnio ou laser ecorantes fluorescentes.
- Deteco de S. typhimurium em ovos e leite em 40 min-sensibilidade de 103/mL.
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26
MTODOS QUMICOS
SUBSTRATOS FLUOROGNICOS
- Substrato adicionado nos meio de placas, NMP e emmtodos de filtrao em membranas;
- O substrato fluorognico libera um compostofluorescente detectado por luz ultravioleta
Substrato MUG (4-metilumbeliferil--D-glucurondeo) porao de B-D glucuronidase libera o compostofluorescente 4-metilumbeliferil;
- Usado para a determinao de E. coli;
-Tempo de deteco varia entre 4-16 horas;
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27
SUBSTRATO CROMOGNICO
- ONPG o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo hidrlise pela -galactosidase- produz cor amarela deteco a 420 nm.
Mnimo de 107 clulas.
Azul E.coli
Transparente - coliformes
Meios cromognicos em placas
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28
Prpura salmonela
Azul - enterobacter
Meio - Salmonella Chromogenic CM1007
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29
Mtodo COLITAG (Hexis cientfica) substrato cromognico ONPG-MUG
deteco de coliformes totais e E.coli em gua
Incubao a 35-37 C por 24 horas.
Mudana de cor- amarelo - + para coliformes totais
365 nm UV se apresenta fluorescncia positivo p/ E. coli ausncia de fluorescncia negativo p/ E.coli
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30
MTODOS IMUNOLGICOS
Baseados em reaes entre antgenos e anticorposespecficos.
Em microbiologia de alimentos:
Imunocaptura;
Imunoenzimtico;
Imunofluorescncia.
Sondas de DNA Mtodo molecular
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31
TCNICA DE IMUNOCAPTURA OU IMUNOSSEPARAOMAGNTICA isolamento de um microrganismo especfico
- Baseia-se na capacidade do microrganismo aderir superfcie de partculas metlicas magnticas revestidas deanticorpos especficos.
-As partculas so colocadas em suporte que contm um m;
-O material concentrado pode ser usado para plaqueamento;
-Aplicao : Listeria monocytogenes, Salmonella spp., toxinado Clostridium perfringens.
-Incubao at 24 horas.
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32
TCNICA IMUNOENZIMTICA
-Baseado na reao entre um antgeno (PATGENOPROCURADO) com um anticorpo especfico, sendo um delesmarcado com uma enzima.
- O antgeno ou anticorpo esto aderidos superfcie de umamatriz slida (poliestireno)- A quantidade de enzima presente identificada por reaocolorimtrica com o substrato da enzima;
-Amplamente usada para detectar e quantificarmicrorganismos em alimentos
-Usados para Salmonella, Listeria, aflatoxinas, enterotoxinasde S. Aureus
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33
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) um teste imunoenzimticoque permite a deteco de anticorpos especficos
Microplacas para teste ELISA
Contendo anticorposAnti-bactria - Os anticorpos possuem Enzimas que reagem com substratos
Produzindo compostos fluorescentes que sero visualizados no leitor dePlacas ELISA
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34
Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA
substrato (incolor)
Ac marcados com Enzimas + + = COR
Microrg
Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase
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35
Leitora de placas ELISA
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36
- A presena do PATGENO detectada pela ligao umanticorpo marcado com um composto flourescente;
TCNICA DE IMUNOFLUORESCNCIA
- Observao em microscpio de fluorescncia
- Usado amplamente para a deteco presuntiva deSalmonellas;
-Resultados falso positivos devido a reaes com outrasbactrias.
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37
SONDAS DE DNA
1) Os microrganismos so fixados em um suporte slido(membrana de celulose, nitrocelulose ou acetato decelulose) ou em soluo lquida;
-segmentos de DNA de fita simples DO PATGENO DEINTERESSE, capazes de reconhecer e formar hbridos comfitas complementares de DNA OU RNA.
-As sondas so marcadas radioativamente ou colorimtricas.
2) Os microrganismos so tratados para expor seu DNA eseparar em duas fitas simples;
MTODOS GENTICOS
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38
3) O suporte colocado na soluo que contm a sondagentica;
4) Aps a lavagem, os filtros so revelados por auto-radiografia ou tcnicas colorimtricas;
Identificao de patognicos com Listeria, Salmonella,S aureus, E. coli enterotoxignica)
Limite de deteco 106 a 107 clulas.
C/ 108 clulas resultado em 10 a 12 horas.
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39
REAO DE POLIMERASE EM CADEIA (PCR) identificaode microrganismos em alimentosPermite a multiplicao de um fragmento
de DNA em milhes de cpias em poucashoras atravs da ao da enzima DNA polimerase;
MTODOS GENTICOS
ETAPAS
-Desnaturao do DNA em fita simples a 95 C por 1 min;
-Ligao dos oligonucleotdeos iniciadores a 37 C por 2 min;
-Polimerizao com formao de fita complementar a 72 C por3 min;
-Permite 105 a 106 cpias de cada fragmento do DNA original
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40
A amplificao do nmero de cpias de DNA do microgpermite que os testes de hibridizao sejam feitos com maioreficincia;
Vrios microg. Importantes em alimentos tem sido estudadospor esta tcnica.
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41
Equipamento para PCR
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42
Amplificao de DNA
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43
Cada ciclo envolve as seguintes etapas:
- Desnaturao do DNA e separao da fita simples, feita a 95 C por 1 min;
-Ligao dos primers a 37 C por 2 min;
-Polimerizao com formao de fita complementar feita a 72 C por 2min;
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44
Visualizao de bandas de DNA marcadas com sondasRadioativas em gel de agarose
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Anlise comparativa entre microbiologia convencional,ELISA e PCR para deteco de Salmonella enteritidis,S. typhimurium, S. gallinarum e S. pullorum emcarne de frango contaminada artificialmente
Elci Lotar Dickel, Laura Beatriz Rodrigues,Luciana Ruschel dos Santos, Stella de Faria Valle, Fernando Pilotto,CarlaRodembush, Vera Beatriz Wald,Cludio Wageck Canal, Vladimir Pinheiro do Nascimento. R. bras. Ci. Vet., v. 12, n. 1/3, p. 5-10, jan./dez. 2005
foram coletadas 30 carcaas de frango em matadourode Inspeo Federal. As carcaas foram analisadas - negativas para Salmonella
Contaminao artificial dos microrganismos
A metodologia utilizada para o isolamento de Salmonella sp.foi baseada na Portaria no 08 de 23/1/1995 mtodo convencional
A tcnica de ensaio imunoenzimtico (ELISA) foi realizadaconforme a indicao do fabricante do kit (SalmonellaImunoensaio Visual (SALVIA)- TECRA).
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46
Para a realizao da PCR, o DNA foi extradoatravs do protocolo de tratamento trmicoOs ciclos constaram de uma desnaturao inicial de 94C por 1 minuto, seguida por 30 ciclos de desnaturao (93C/1 minuto), anelamento (50C/ 30 segundos) e extenso (72C/1 minuto), com uma extenso final de 72C por cinco minutos.
As amostras de DNA foram visualizadas por eletroforese sobre luz ultravioleta.
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47
Tabela 1 Resultados obtidos na recuperao de Salmonella, atravs da Microbiologia Convencional (MC), ELISA e PCR, em carnes de frango contaminadas artificialmente. De 300 amostras
Parmetros MC ELISA PCRPositivos 170a 213b 225bPorcentagem (%) 56,6 71 75
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Tabela 2 Resultados obtidos na deteco de Salmonellatyphimurium (ST), S. enteritidis (SE), S. gallinarum (SG) e S. pullorum (SP), pelo microbiolgico convencional (MC), ELISA e PCR, em amostras de carne de frango contaminada artificialmente.
Tcnicas ST SE SP SG(n=75) (n=75) (n=75) (n=75)
(MC 64 53 19 34ELISA 72 71 24 46PCR 71 66 39 49
O mtodo PCR foi mais eficaz
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49
Exemplos de Aplicaes da tcnica PCR:
-Pode detectar de 1 a 5 colnias de E. coli em 100 mL de gua;
-Deteco de 1 a 10 colnias de L. monocytogenes;
-Deteco de Vibrio vulnificus em ostras, em 24 horas, quantidades Inferiores a 102 UFC/g
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50
CONSIDERAES FINAIS
A Escolha da metodologia a ser adotada depende :
Preciso pretendida;
Custo/tempo da anlise;
Simplicidade;
Treinamento do analista;
Disponibilidade de meios e reagentes;
Assistncia tcnica do fabricante
PR REQUISITO: MICROBIOLOGISTA TREINADO SEMPRE!
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51
Temas de cada aluno
- Tcnica de filtrao em membranas de grade hidrofbica- Beatriz
-Reidratao de filmes secos- Bianca
-Mtodo Simplate- laila
-Mtodos fsico CITOMETRIA DE FLUXO- erick
-Mtodo cromognico- fernanda
-Mtodo fluorognico- lary
-- Imunocaptura- alane
-Imunoenzimtico Elisa- yara
-- PCR - manuela
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Microbiologia aplicada ao desenvolvimento de produto novo de
interesse para a indstria de alimentos
Ou aplicao de microbiologia preditiva
PROJETO TERICO PRTICO GRUPO 3 ALUNOS
-INTRODUO-OBJETIVO-METODOLOGIA-PRODUTO ESPERADO-REFERNCIAS
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