UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”
LENISA GERON
Monografia apresentada ao Departamento de
Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para a obtenção do título
de Bacharel em Ciências Biológicas.
Ribeirão Preto - SP 2013
LENISA GERON
“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”
Monografia apresentada ao Departamento de
Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para a obtenção do título
de Bacharel em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Genética
Orientador: Prof. Titular Luiz Gonzaga Tone
Co-orientador: MSc. Kleiton Silva Borges
Ribeirão Preto - SP 2013
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Geron, Lenisa
“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”. Ribeirão Preto, 2013.
49 p. : il. ; 30 cm
Monografia, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Genética.
Orientador: Tone, Luiz Gonzaga.
1. Oncologia Pediátrica. 2. Meduloblastoma. 3. Aurora-quinase. 4. Inibidor de Aurora-quinase. 5. AMG900.
Apoio e Suporte Financeiro Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes instituições:
• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo n° 2011/15645-1).
• Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto –
FFCLRP/USP.
• Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP e Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
FOLHA DE APROVAÇÃO
LENISA GERON
“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de
meduloblastoma pediátrico”
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo, como parte das
exigências para a obtenção do título de Bacharel em
Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Genética
Data da defesa:
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________
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Agradeço primeiramente a Deus pela presença constante em minha vida e por mostrar o
melhor caminho a seguir.
Ao prof. Titular Luiz Gonzaga Tone, meu orientador, pela oportunidade, e acima de tudo
pela confiança que creditou em mim durante esse trabalho.
Ao MSc. Kleiton Silva Borges, meu Co-orientador, pela confiança e pela orientação segura e
competente, sendo sempre atencioso e disponível a ajudar.
Ao MSc. Augusto Andrade Faria, pela paciência, incentivo e dedicação, estando sempre
disposto a transmitir seu conhecimento.
À todos os amigos do laboratório Drª Maria Sol Brassesco Annichini e Drª Vanessa da
Silva Silveira, Drª. Rosane Gomes de Paula Queiroz, Gustavo, Jaqueline, Julia,
Maurício, Mirela, Pamela, Paola, Priscila, Régia e Veridiana, pela amizade e por sempre
me ajudarem, contribuindo para o meu aprendizado.
Às técnicas do laboratório de Citogenética do Departamento de Puericultura e Pediatria Aide
Barbosa, Sônia Scandusi, Maria Luisa Machado e Lucimar Fernandes e à secretária do
Laboratório de Puericultura e Pediatria Evelize Visconte pelo apoio e convivência.
À Fundação de Apoio do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de
Iniciação Científica.
Ao Departamento Financeiro da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP) pelo auxílio financeiro.
À minha mãe, Tânia e ao meu pai, César por terem me proporcionado uma formação humana
realmente digna e por me ensinarem a sempre buscar o conhecimento e nunca desistir dos
meus objetivos como pessoa e pesquisadora; as minhas irmãs, Vanessa e Ana Júlia, por
sempre estarem ao meu lado me apoiando.
A todos os meus familiares que sempre torceram pelo meu sucesso.
As minhas queridas amigas Carolina, Bruna, Laura, Lethícia, Patrícia e Paula, obrigada
pela amizade e pela torcida. E as minhas amigas Gabriela e Lara que sempre me apoiaram
no laboratório e proporcionaram bons momentos na faculdade e durante as participações em
eventos profissionais.
A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização desse trabalho.
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RESUMO
GERON, L. “Efeitos da Inibição de Aurora-quinases em Linhagens Celulares de Meduloblastoma Pediátrico”. 2013, 49f. Monografia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
O meduloblastoma (MB) é o tumor cerebral maligno mais comum na infância. Apesar da
terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma proporção
significativa de MBs tem-se revelado largamente refratária ao tratamento. A família das
Aurora-quinases (A, B e C) têm sido amplamente estudadas em diversos tumores. Essas
proteínas atuam em vários processos do ciclo celular, tais como maturação dos centrossomos,
organização do fuso mitótico, bi-orientação cromossômica e citocinese. Em diferentes tipos
de neoplasias a Aurora-A e a Aurora-B foram encontradas hiperexpressas, quando
comparadas ao tecido normal e a inibição farmacológica destas têm demonstrado resultados
promissores para a terapia do câncer. Assim, o objetivo do presente estudo é avaliar o efeito
do inibidor de Aurora-quinases AMG900 nas linhagens de meduloblastoma pediátrico
UW402 e UW473, por meio do ensaio de proliferação celular XTT®, e dos ensaios
clonogênico e de apoptose. Para o ensaio de proliferação celular, as células foram tratadas
com AMG900 nas concentrações de 5-500 nM e incubadas por 24, 48 e 72 horas. As análises
dos valores de IC50 foram calculados utilizando-se o programa CalcuSyn. Nos ensaios
clonogênico e de apoptose, as células foram tratadas com AMG900 (2,5-50 e 5-1000 nM,
respectivamente), e incubadas por 48 horas. Os experimentos foram realizados em triplicata.
O tratamento com o AMG900 causou uma inibição na proliferação celular, tendo um efeito
mais significativo a partir da dose de 50 nM, onde a partir desta, atingiu-se um platô nas doses
seguintes em ambas as linhagens estudadas (p<0.05). Os valores do IC50 foram de 183,16nM
e 242,16nM para as linhagens celulares UW402 e UW473, respectivamente. O AMG900
também causou uma diminuição da capacidade clonogênica e aumentou o número de células
apoptóticas, de uma maneira dose-dependente nas duas linhagens celulares (p<0,05). Nossos
resultados mostraram que a inibição das Aurora-quinases pelo AMG900 leva a efeitos
antineoplásicos nas linhagens de meduloblastoma pediátrico, sugerindo que a inibição dessas
proteínas pode ser um alvo para o tratamento deste tipo de neoplasia. Outros estudos estão
sendo realizados para confirmar esses resultados.
Palavras chave: Meduloblastoma; Aurora-quinase; AMG900.
ABSTRACT
GERON, L. “Effects of Inhibition of Aurora kinases in Pediatric Meduloblastoma Cell Lines”. 2013, 49f. Monograph - School of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
Medulloblastoma (MB) is the most common malignant childhood brain tumor. Despite
aggressive multimodal therapy, a significant proportion of MB have proved largely refractory
to treatment. Aurora kinase family (A, B and C) has been studied in several tumors. These
proteins act in different cell cycle processes such as centrosome maturation, mitotic spindle
assembly, chromosomal bi-orientation and cytokinesis. Aurora-A and Aurora-B have been
found overexpressed in different types of malignancies, including in medulloblastoma, and
the pharmacological activity inhibition of them has shown promising results for cancer
therapy. Hence, the aim of this study was to evaluate the effects of Aurora kinase inhibitor
AMG900 on pediatric medulloblastoma cell lines UW402 e UW473 by XTT® cell
proliferation, clonogenic and apoptosis assays. For cell proliferation assay, cells were treated
with AMG900 at the concentrations of 5-500 mM and incubated for 24, 48 and 72h. IC50
analysis was performed using CalcuSyn software. For clonogenic and apoptosis assays, cells
were treated with AMG900 (2,5-50 and 5-1000 nM, respectively) and incubated for 48 hours.
The experiments were performed in triplicate. The treatment with AMG900 caused an
inhibition of cell proliferation, with a more significant effect at the dose of 50 nM, where it
reached a plateau in the remaining doses in both cell lines (p<0.05). IC50 values were
183,16nM and 242,16nM for UW402 and UW473 cells, respectively. AMG900 also caused
diminution of clonogenic capacity and increased the number of apoptotic cells in a dose-
dependent manner in both cell lines (p<0.05). These results showed that inhibition of Aurora
kinases by AMG900 leads to antineoplastic effects on pediatric medulloblastoma cell lines.
Thereby, these data suggest that Aurora kinase inhibition may be a target for medulloblastoma
treatment. Other functional studies should be conducted to expand these results.
Keywords: Medulloblastoma; Aurora-kinase; AMG900.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química do quimioterápico AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-
yl)pyridin-2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine).......................... 24
Figura 2. Análise da proliferação celular após o tratamento das linhagens UW402 e
UW473 com AMG900, após os tempos de 24, 48 e 72 horas .................................................. 33
Figura 3. Análise da redução de colônias das linhagens UW402 e UW473, após o
tratamento de 48 horas com AMG900, comparado ao controle ............................................... 34
Figura 4. Análise do efeito do AMG900 na indução de apoptose nas linhagens UW402 e
UW473...................................................................................................................................... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Valores de 50% de inibição do crescimento celular (IC50) após tratamento de 48
horas de tratamento com o AMG900 ....................................................................................... 32
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMG900 Inibidor de Aurora-quinase (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-
2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine)
AMB Meduloblastoma Anaplásico
CO2 Dióxido de Carbono
CMB Meduloblastoma Clássico
CPP Complexo de Proteínas Passageiras
DMB Meduloblastoma Demoplásico/Nodular
DMSO Dimetilsulfóxido
FITC Isotiocinato de Fluorescência
HAM F-10 Solução Nutritiva para o Cultivo Celular
HCT-116 Células do Carcinoma de Cólon Humano
Hh Via de Sinalização Hedgehog
IC50 Valores de 50% de Inibição do Crescimento Celular
LCMB Meduloblastoma de Células Grandes
MB Meduloblastoma
MBEN Meduloblastoma Nodular Extenso
Notch Via de Sinalização Notch
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Tampão Salina Fosfato
PNETs Tumores Neuroectodérmicos Primitivos
RNAi Ácido Ribonucléico de Interferência
SBF Soro Fetal Bovino
SHH Via de Sinalização Sonic Hedgehog
SNC Sistema Nervoso Central
UW402 Linhagem Celular de Meduloblastoma 402
UW473 Linhagem Celular de Meduloblastoma 473
Wnt Via de Sinalização Wnt
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC Graus Celsius
L Litros
mg Miligramas
mL Mililitros
mM Milimolar
nM Nanomolar
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
rpm Rotações por minuto
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 17
1.1.Meduloblastoma ................................................................................................................. 17
1.2. Vias Moleculares ............................................................................................................... 19 1.3. A Família das Auroras-quinases ....................................................................................... 20 1.3.1. Aurora-A ......................................................................................................................... 22 1.3.2. Aurora-B ......................................................................................................................... 22 1.3.3. Aurora C ......................................................................................................................... 22
1.4. A Relação das Auroras-quinases com o Câncer ................................................................ 23 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26
2.1. Geral .................................................................................................................................. 26 2.2. Específicos ......................................................................................................................... 26
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 28
3.1. Linhagens Celulares e Condições de Cultura .................................................................... 28 3.2. Preparação das Drogas....................................................................................................... 28
3.3. Ensaios Funcionais ............................................................................................................ 28 3.3.1. Ensaio de Proliferação Celular utilizando o KIT XTT ................................................... 28 3.3.2. Ensaio Clonogênico ........................................................................................................ 29 3.3.3. Ensaio de Apoptose ........................................................................................................ 30 3.4. Análise Estatística.............................................................................................................. 30
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 32
4.1. Efeitos do AMG900 na Proliferação Celular .................................................................... 32
4.2. Capacidade Clonogênica do AMG900 .............................................................................. 34 4.3. Ensaio de Apoptose ........................................................................................................... 35
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 38
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 42
REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 44
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO | 17
1. INTRODUÇÃO
1.1. Meduloblastoma
O meduloblastoma (MB) é o tumor embrionário neuroepitelial mais comum e constitui
uma das formas mais desafiadoras de neoplasias para se tratar de modo eficaz (PACKER,
2011). Considerado como uma variante dos tumores neuroectodérmicos primitivos (PNETs),
os MBs derivam de neurônios imaturos remanescentes da camada granulosa externa,
presentes em uma fase do desenvolvimento do cerebelo, sendo considerados como uma das
neoplasias do sistema nervoso central (SNC) mais frequentes na faixa etária infantil (RIS et
al, 2001). Corresponde a cerca de 20% de todos os tumores intracranianos em crianças, e 40%
de todos os tumores da fossa posterior na infância. Embora haja uma maior incidência de MB
durante a infância, com pico na primeira década, 30% destes ocorrem em adolescentes e
adultos jovens. (POLKINGHORN et al., 2007; ROSSI et al., 2008; PACKER, 2011;).
O MB desenvolve-se, em 85% dos casos, abaixo da tenda do cerebelo, que separa a
fossa posterior da fossa média do crânio, na região do 4º ventrículo a partir do vermis
cerebelar, parte mediana do cerebelo, responsável pelo equilíbrio. Podem crescer causando a
obstrução do fluxo liquórico, hidrocefalia e, consequentemente, sintomas de hipertensão
intracraniana (HIC), podendo se disseminar para outras partes do SNC, mas dificilmente
alcançam outras partes do corpo (RIS et al., 2001). Apesar de aparentemente bem delimitado,
o tumor é altamente infiltrativo e apresenta forte tendência à disseminação para o neuro-eixo
do próprio cerebelo e da medula espinhal (POLKINGHORN et al., 2007; PACKER, 2011).
Os MBs estão classificados dentro de um grupo de tumores embrionários de origem
neuroepitelial. A classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de tumores do
sistema nervoso define cinco variantes: meduloblastoma clássico (CMB), meduloblastoma
desmoplásico/nodular (DMB), meduloblastoma nodular extenso (MBEN), meduloblastoma
anaplásico (AMB) e meduloblastoma de células grandes (LCMB) (LOUIS et al., 2007;
GILBERTSON; ELLISON, 2008). Tumores do tipo LCMB e AMB constituem cerca de 2% e
10% dos meduloblastomas, respectivamente, onde ambos apresentam um prognóstico ruim
(GILBERTSON; ELLISON, 2008). O CMB corresponde a 80% dos meduloblastomas,
enquanto que o DMB corresponde a 15%. A forma MBEN é considerada rara, apresentando
um prognóstico mais favorável quando comparada ao meduloblastoma de tipo clássico
(LOUIS et al., 2007).
INTRODUÇÃO | 18
O tratamento atual é baseado na remoção cirúrgica, seguida de radiação local e crânio-
espinhal e/ou quimioterapia. Um desafio clínico em relação aos MBs são as respostas variadas
dos pacientes ao tratamento, onde alguns respondem bem com a remoção do tumor, enquanto
outros apresentam doença progressiva (PACKER et al., 1999; RUTKOWSKI et al., 2010). Os
MBs têm alta tendência à recorrência, que ocorre na maioria das vezes, nos dois primeiros
anos após o tratamento inicial, sendo que a sobrevida dos pacientes após os sintomas de
recorrência é de 4 a 5 meses (TORRES et al., 1994; SAUNDERS et al., 2003).
A cirurgia é o passo mais importante do tratamento de MB, visto que, esse
procedimento tem como finalidade a remoção do tumor, para que, consequentemente, ocorra
alivio do acúmulo de fluido cerebro-espinhal causado pelo edema; confirmar o diagnóstico
por obtenção de uma amostra de tecido; e remover ao o tumor causando o mínimo de danos
neurológicos ao paciente (PACKER, 2011). Porém, alguns MBs não podem ser removidos
completamente Em um terço dos pacientes, o tumor cresce no tronco cerebral, tornando difícil
sua remoção total, visto que esta poderia causar potenciais danos neurológicos ao paciente
(TORRES et al., 1994).
Apesar da terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma
proporção significativa de MBs têm se revelado largamente refratária ao tratamento
(SAUNDERS et al., 2003). Diferentes agentes quimioterápicos são usados para tratar
pacientes com MB, como por exemplo, a vincristina (VCR) e o lomustine (CCNU)
(LEWANDOWICZ et al., 2000). Infelizmente essas drogas têm efeitos colaterais prejudiciais
para os pacientes, e pouco se sabe sobre seus modos de ação e seus efeitos sobre células não
neoplásicas. Ambas as drogas são citotóxicas e desencadeiam a apoptose através da via
mitocondrial em linhagens de MB (SHINWARI et al., 2008).
É reconhecido que, independente do sucesso do tratamento, é necessário o
desenvolvimento de protocolos de tratamento que resultem não apenas em uma alta taxa de
controle da doença, mas também em menos problemas neurocognitivos e sequelas
psicossociais para os pacientes. Para isso, nos últimos anos, muitos avanços têm permitido um
melhor entendimento da biologia tumoral, viabilizando assim a identificação de novos alvos
terapêuticos e, consequentemente, o desenvolvimento de novas drogas antitumorais para
melhorar a qualidade de vida desses pacientes (GULINO, ARCELLAB, GIANGASPEROA
2008).
INTRODUÇÃO | 19
1.2. Vias Moleculares
As vias de sinalização Hedgehog (Hh) (que inclui a via Sonic Heddgehog - Shh); Wnt
e Notch são essenciais para o desenvolvimento cerebral, e desempenham um papel importante
na patogênese dos MBs. As proteínas Hh controlam funções celulares especializadas
importantes para o desenvolvimento do tronco neural. Mutações em determinados genes da
via Hh podem levar a graves malformações do SNC, como holoprosencefalia. Estudos
mostraram que, a interrupção da via Hh, como consequência de várias alterações genéticas e
epigenéticas, é a responsável por, pelo menos, um subconjunto de MB, e que cerca de 30%
desses tumores são derivados de mutações nos genes da via Hh e/ou da ativação inadequada
da sinalização desse mesmo gene (TAYLOR M et al., 2002; CARLOTTI et al., 2008).
A via Wnt é composta por um grupo de aproximadamente 20 proteínas que
desempenham um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, diferenciação
celular e regulação das células-tronco (ELLISON et al., 2011). As proteínas Wnt se ligam a
um complexo formado pelo receptor Frizzled (FRZ), resultando no acúmulo intracelular de β-
catenina, o efetor desta via (TAYLOR R et al., 2005). Mutações que ativam a via Wnt, a
maioria envolvendo o gene da β-Catenina, podem ocorrer em 15% dos casos de MB
(CARLOTTI et al., 2008).
A via Notch está envolvida na diferenciação de várias células e tecidos. Entretanto,
poucos estudos têm sido realizados sobre os genes que fazem parte desta via. Alguns estudos
sugerem que a desregulação dos receptores Notch1 e Notch2 podem desempenhar um papel
importante no desenvolvimento de MBs. O gene Notch1 foi encontrado amplificado em 15%
dos MBs, resultando em níveis mais altos de sua expressão nas células tumorais. Porém, mais
estudos são necessários para elucidar o papel da via Notch na formação do cerebelo e dos
MBs (CARLOTTI et al., 2008).
Dados referentes a estudos clínicos e modelos animais sugerem uma importante
interação entre essas três vias, sendo que estas podem agir de maneira sinérgica na patogênese
do MB (BARON, 2003). Embora as vias Hh, Wnt e Notch tenham sido alvos constantes de
estratégias terapêuticas, outras vias de sinalização também estão sendo consideradas para
tentar compreender melhor o desenvolvimento desses tumores (BINNING et al., 2008).
Dessa forma, nos últimos anos, muitos avanços têm permitido um melhor
entendimento da biologia tumoral do MB. Um desses avanços foi a concepção de uma nova
classificação desta neoplasia, onde é atualmente classificada em quatro subgrupos, sendo eles
Wnt, Shh, Grupo 3 e Grupo 4 (NORTHCOTT et a.l, 2012; TAYLOR M et al., 2012 ).
INTRODUÇÃO | 20
Estudos recentes mostraram que cada subgrupo origina-se a partir de diferentes tipos
celulares, possuindo características citogenéticas, perfis mutacionais e transcricionais
distintos. Sendo assim, esses subgrupos são bastante divergentes quanto a sua distribuição e
incidência, aspecto clínico, e prognóstico (CARDONA et al., 2012; KOOL, 2012;
NORTHCOTT et al., 2011).
Dentre os quatro subgrupos, o Wnt é o tipo de MB mais raro, tendo atualmente o
melhor prognóstico, onde cerca de 90% dos pacientes sobrevivem. Este subgrupo é
caracterizado por apresentar mutações somáticas no gene CTNNB1 e pela expressão do gene
Wnt e acúmulo da β-catenina no núcleo celular (marcador molecular para a ativação desta
via) (CLIFFORD, 2006; THOMPSON et al., 2006; NORTHCOTT et al., 2012). Já o MB do
tipo Shh representa um subgrupo de prognóstico intermediário, com taxas de sobrevida que
variam entre 60% e 80%. É caracterizado por possuir mutações no gene PTCH1 e se origina a
partir das células precursoras neurais da camada granulosa do cerebelo (SCHULLER et al.,
2008; KOOL, 2012; NORTHCOTT et a.l, 2011).
Pacientes com MB do tipo 3, possuem o pior prognóstico dentre os quatro subgrupos,
devido, talvez, a sua alta capacidade metastática e aos altos níveis de instabilidade genômica
do proto-oncogene MYC (CHO, 2011; NORTHCOTT et al., 2011). E dentre esses subgrupos
o mais comum é o MB do tipo 4, que afeta cerca de dois em cada cinco pacientes com esta
neoplasia, sendo caracterizado pela amplificação dos proto-oncogenes MYC e CDK6 (ciclinas
depende de quinases), apresentando um prognóstico semelhante ao do subgrupo Shh (CHO,
2011; NORTHCOTT et al., 2012).
Com isso, foi possível perceber que o que antes era considerado um único tipo de
tumor, hoje são quatro doenças distintas, cada qual exigindo diferentes abordagens
terapêuticas (NORTHCOTT et al., 2012). Dessa forma, esses achados podem contribuir para
uma possível identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de novas drogas
antitumorais com mecanismos de ação específicos. Todo esse esforço visa melhorar a
qualidade de vida dos pacientes, bem como tentar reduzir as sequelas do tratamento (ROSSI
et al., 2008).
1.3. A família das Auroras-quinases
Para que as cópias idênticas do genoma sejam passadas para suas células filhas, a
progressão através do ciclo celular deve ser minuciosamente e rigorosamente regulada e
INTRODUÇÃO | 21
controlada por eventos sequenciais de síntese, ativação e degradação de proteínas, as quais às
vezes requerem uma série de modificações pós-traducionais (LOPES et al., 2003; SCHMIDT
et al., 2007). Existe uma variedade de proteínas quinases envolvidas na divisão celular, sendo
as mais conhecidas, a CDK1 (ciclina dependente de quinase 1), PLK (polo-like quinase),
Bub1 (budding uninhibited by benzimidazole 1), Nek 2 da família NIMA (never in mitose A)
e as aurora-quinases (SCHMIDT et al., 2007).
A família das aurora-quinases compreende quinases de serina/treonina que atuam em
processos do ciclo celular, tais como duplicação e separação do centrossomo, interação dos
microtúbulos com o cinetócoro das cromátides irmãs, e montagem do fuso mitótico. Além
disso, desempenham funções importantes na condensação dos cromossomos, estabelecimento
do fuso mitótico, orientação dos cromossomos, sendo necessárias também para o processo de
citocinese (CARMENA et al., 2003; MONTEMBAULT et al., 2005; GAUTSCHI et al.,
2008; MOUNTZIOS et al., 2008).
O primeiro homólogo da família das aurora-quinases foi identificado após um estudo
genético que tinha como finalidade, encontrar mutações que induziam aumento de ploidia em
células de leveduras (increase-in-ploidy phenotype - Ipl1) (CHAN et al., 1993). Um
homólogo foi encontrado em Drosophila melanogaster em 1995, após a observação de
mutações em gene chamado aurora. Esta mutação bloqueou o ciclo celular quando os
cromossomos condensados foram recrutados para apenas um pólo do fuso mitótico
(GLOVER et al., 1995). Este nome foi escolhido devido à semelhança entre a morfologia do
fuso mitótico defeituoso com o fenômeno luminoso observado nas regiões polares do Planeta
Terra (MOUNTZIOS et al., 2008).
Em 1998, três homólogos de aurora-quinase foram identificados em humanos, Aurora-
A (AURKA, Aurora-2/BTAK, STK15, STK16, ARK1, AIK), Aurora-B (AURKB, Aurora-1,
Ipl1, STK12, AIM-1, ARK2) e Aurora-C (AURKC, Aurora 3, STK13, AIK, AIE-2),
localizados nas regiões cromossômicas 20q13.2-q13.3, 17p13.1 e 19q13.43, respectivamente
(CARMENA et al., 2003; MONTEMBAULT et al., 2005; SCHMIDT et al., 2007). Estes
genes apresentam grande homologia nas sequências de nucleotídeos, ocupam locais distintos
na célula, são ciclo-dependentes e desempenham diferentes funções no ciclo celular (ADAMS
et al., 2001).
A hiperexpressão de algumas das aurora-quinases leva ao aumento da ploidia,
principalmente devido à amplificação do centrossomo e/ou desregulação dos pontos de
checagem da divisão mitótica, podendo favorecer a formação de tumores (FU et al., 2007;
GAUTSCHI et al., 2008; MOUNTZIOS et al., 2008).
INTRODUÇÃO | 22
1.3.1. Aurora-A
A Aurora-A, está localizada no centrossomo, mas pode ser encontrada também
associada aos microtúbulos no pólo metafásico durante a mitose (KIMURA et al., 1997). A
atividade de fosforilação está envolvida na separação e maturação do centrossomo, bem como
na montagem e estabilidade do fuso mitótico (GLOVER et al., 1995). A hiperexpressão ou
inibição da expressão do aurora-A causa diversas anormalidades no fuso celular (BISCHOFF
et al., 1998; ZHOU et al., 1998).
1.3.2. Aurora-B
A proteína Aurora-B faz parte do Complexo de Proteínas Passageiras (CPP), que se
movem do centrômero para o fuso mitótico durante a divisão celular, monitorando a
separação dos cromossomos (ADAMS et al., 2001). Além disso, está associada ao cinetócoro
do cromossomo durante a passagem da prófase para a metáfase, apresentando níveis elevados
também na zona equatorial da célula em anáfase, e no anel contrátil da membrana celular
durante a telófase (CARMENA et al., 2003).
Dentre outras funções, a Aurora-B regula a interação do cinetócoro com os
microtúbulos durante a metáfase, garantindo que a célula prossiga pela metáfase somente
quando todos os cromossomos tenham adquirido uma conexão bipolar com os microtúbulos
que procedem de cada centrossomo (conexão anfitélica). De fato, a Aurora-B pode prevenir
conexões sintélicas ou monotélicas. Portanto, caso sejam identificadas conexões incorretas,
como estas, os mecanismos de correção são ativados para garantir a montagem adequada do
fuso celular (DUCAT et al., 2004; MERALDI et al., 2004).
Embora a Aurora-B não induza a transformação celular, células com a expressão
elevada do gene Aurora-B promoveram a formação de tumores agressivos quando injetadas
em camundongos imunodeficientes (OTA et al., 2002).
1.3.3. Aurora-C
A proteína Aurora-C não está muito bem caracterizado. Embora tenha sido encontrada
hiperexpressa em algumas células tumorais, provavelmente está envolvida apenas na
INTRODUÇÃO | 23
espermatogênese (KIMURA et al., 1999). Inicialmente relatada como uma proteína
centrossômica somente da anáfase para a citocinese (KIMURA et al, 1999), a Aurora-C foi
descrita recentemente como uma proteína que também faz parte do CPP (LI X et al., 2004;
SASAI et al., 2004).
1.4. A relação das Aurora-quinases com o câncer
A aneuploidia é a alteração genômica mais prevalente nos tumores sólidos humanos
(JALLEPALLI et al., 2001). Defeitos nos centrossomos (quantidade, organização e
comportamento) têm sido encontrados em diversos tipos de câncer afetando a segregação
normal dos cromossomos e consequentemente produzindo células aneuplóides (SAUNDERS
et al., 2000; SATO et al., 2001). Todos estes defeitos contribuem para a aquisição de uma
instabilidade genética tipicamente observada em células cancerosas (BOVERI, 1914).
Aneuploidia e anormalidades do centrossomo são também detectadas após a
hiperexpressão ou inibição dos genes da família Aurora-quinase, caracterizando estas como
moléculas que possivelmente possuem uma importante função no surgimento e na progressão
do câncer (FU et al., 2007; GAUTSCHI et al., 2008). A hiperexpressão das Aurora-quinases
foi observada em muitas neoplasias, incluindo carcinomas colorretais (BISCHOFF et al.,
1998; TATSUKA et al., 1998; OTA et al., 2002), mama (ZHOU et al., 1998; TANAKA,
1999), ovário, pâncreas (TANNER et al., 2000; GRITSKO et al., 2003), hepatocarcinomas
(JENG et al., 2004), meduloblastomas (NEBEN et al., 2004) e gliomas (SCRIDELI et al.,
2008), e estudos de diferentes tecidos têm mostrado que anormalidades cromossômicas são
frequentes em regiões contendo estes genes (TANNER et al., 1995; COURJAL et al., 1996;
REZNIKOFF et al., 1996; BISCHOFF et al., 1998).
Como o Aurora-A e o Aurora-B foram encontrados hiperexpressos em diversas neoplasias
em comparação com os respectivos tecidos não neoplásicos, vários trabalhos buscaram
investigar estes genes como marcadores de prognóstico/diagnóstico e/ou como potenciais
alvos terapêuticos. Desta forma, verificou-se na literatura inúmeros relatos da associação da
hiperexpressão destes genes com um prognóstico desfavorável ou com o aumento do grau do
tumor (BOSS et al., 2009; LOK et al., 2010; BORGES et al., 2012). Além disso, diferentes
estudos mostraram os efeitos da inibição farmacológica, por RNA de interferência (RNAi),
dos dois principais membros da família das aurora-quinases, e resultados interessantes foram
alcançados em diversas neoplasias (BOSS et al., 2009; PEREZ FIDALGO et al., 2009).
INTRODUÇÃO | 24
Devido ao fato dessas proteínas desempenharem papéis importantes na divisão celular
normal, surge o questionamento se é seguro desenvolver inibidores de Auroras-quinases para
a terapia anticâncer. Acredita-se, porém, que além de estarem hiperexpressas somente em
células tumorais, os efeitos causados pelos inibidores de Aurora-quinase são mais nocivos em
células transformadas e em intensa proliferação do que em células não neoplásicas. Desta
forma, as Aurora-quinases constituem alvos terapêuticos que devem ser investigados
(MATTHEWS et al., 2006; MONTEMBAULT et al., 2007; GAUTSCHI et al., 2008;
MOUNTZIONS et al., 2008).
Muitos inibidores de Aurora-quinases já foram descritos, alguns dos quais estão sendo
utilizados em estudos clínicos e pré-clínicos (GAUTSCHI et al., 2008; MOUNTZIOS et al.,
2008). Dentre estes está o AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-2-
yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine) (Figura 1), um
inibidor/competitivo de trifosfato de adenosina, altamente potente e seletivo para as auroras
A, B e C, e que está atualmente na fase I de ensaios clínicos (PAYTON et al., 2010; HUANG
et al., 2011). O AMG900 tem a capacidade de inibir a autofosforilação das aurora-quinases A
e B, bem como a fosforilação da histona H3. Ele também foi capaz de inibir a proliferação de
26 linhagens celulares tumorais em concentrações nanomolares muitos baixas, exibindo
favoráveis perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos com toxicidade mínima (PAYTON et
al., 2010).
Figura 1. Estrutura química do quimioterápico AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine).
OBJETIVOS
OBJETIVOS | 26
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Investigar os efeitos da inibição das Aurora-quinases em linhagens celulares de
meduloblastoma pediátrico.
2.2. Específico
Investigar os efeitos in vitro da inibição das Aurora-quinases com a droga AMG900, em
linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico nos processos de proliferação celular,
capacidade clonogênica e apoptose.
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOS | 28
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura
Foram utilizadas as linhagens UW402 e UW473 de meduloblastoma pediátrico,
gentilmente cedidas pelo prof. Dr. Michael S. Bobola (Department of Neurological Surgery,
University of Washington, Seattle, WA). As células foram mantidas em meio HAM F10
(Gibco BRL, Life Technologies®, Carlsbad, CA, USA) suplementado com 10% de SBF,
100U/mL, penicilina e 100µg/mL estreptomicina, em atmosfera úmida contendo 5% CO2 a
37ºC. Na realização dos experimentos, a contagem e o teste de viabilidade celular foram
determinadas utilizando o teste de exclusão do azul de Trypan.
3.2. Preparação da droga
Uma solução estoque de 10mM do inibidor de Aurora-quinase AMG900
(Selleckchem, USA) foi preparada em DMSO e estocada em alíquotas a -80ºC. As drogas
foram adicionadas em meio de cultura imediatamente antes de serem aplicadas nas células.
Todas as doses utilizadas estavam com a mesma quantidade de DMSO, 0,1%, a qual não
causa danos celulares.
3.3. Ensaios Funcionais
3.3.1. Ensaio de Proliferação Celular utilizando o KIT XTT
O ensaio com o kit-XTT é um método de determinação colorimétrico in vitro do número
de células metabolicamente ativas, medindo a proliferação e a viabilidade celular. A clivagem do
sal amarelo tetrazolium XTT pelas células metabolicamente ativas produz o corante formazan de
coloração alaranjada. Um aumento no número de células resulta no aumento da atividade global
de desidrogenases mitocondriais na amostra, que é diretamente correlacionado com a quantidade
de formazan produzido e com diferenças na absorbância da solução.
MATERIAIS E MÉTODOS | 29
Para o ensaio de proliferação, as células foram semeadas em densidades iniciais de
2x103 em placas de 96 poços e mantidas em condições de cultura por 24 horas. Após este
período, as células foram tratadas com diferentes concentrações da droga AMG900 (5-
500nM), e incubadas. Após 48 horas de tratamento, as células foram lavadas com PBS, e
meio completo sem droga foi adicionado à cultura. A partir deste ponto, considerado o tempo
zero, a proliferação celular foi avaliada nos tempos de 24, 48 e 72 horas. A cada intervalo de
tratamento, a remoção do meio de cultura dos poços foi realizada e em seguida foram
adicionados 100µL de meio de cultura com 10µL de XTT preparado conforme
recomendações do fabricante. As placas foram então incubadas por 4 horas em atmosfera
úmida contendo 5% CO2 a 37ºC. A leitura da absorbância de 450nM com onda de referência
de 650nM foi realizada utilizando o aparelho iMark Microplate Absorbance reader (BioRad
Laboratories, Inc, CA, EUA). Os experimentos foram realizados em triplicata em três
momentos diferentes.
3.3.2. Ensaio Clonogênico
Este ensaio foi realizado conforme Franken et al. (2006). Desta forma, 500 células
foram semeadas, para serem tratadas com diferentes concentrações do AMG900 (2,5-50nM),
em placas de cultura de seis poços. Após 24 horas, foram administrados os tratamentos e as
culturas foram incubadas por 48 horas em atmosfera úmida contendo 5% CO2 a 37ºC.
Posteriormente ao tratamento, o meio de cultura foi removido, as células foram lavadas com
PBS e foi adicionado meio de cultivo completo sem drogas. As culturas foram incubadas em
estufa a 37°C por 7-15 dias, até que as colônias se tornassem visíveis, mas não confluentes.
Para a visualização das colônias o meio de cultura foi retirado, as células foram lavadas com
PBS, fixadas com metanol absoluto por 15 minutos, e coradas com Giemsa a 1%. As colônias
foram contadas com microscópio estereoscópico (magnificação 40x), sendo consideradas
somente aquelas com pelo menos 50 células. Os experimentos foram realizados em triplicata.
3.3.3. Ensaio de Apoptose
O ensaio para detecção de morte celular foi realizado através da marcação de células
apoptóticas com Anexina V - Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Biosciences
MATERIAIS E MÉTODOS | 30
Pharmigen, USA) e células necróticas com iodeto de propídio. Anexina V é uma molécula
que apresenta alta afinidade pela fosfatidilserina, se ligando a esta especificamente. A
fosfatidilserina é um fosfolipídio presente na face interna da membrana das células. Sua
externalização ocorre durante o processo de apoptose e serve como um sinal para as células
serem removidas. A marcação positiva com iodeto de propídio indica que as células perderam
a integridade da membrana.
Para apoptose, as células foram semeadas em densidades iniciais de 2x103, em placas
de 6 poços e mantidas em condições de cultura por 24 horas. Após este período, as células
foram tratadas com o inibidor de Aurora-quinases AMG900 (5-1000nM) e incubadas com os
diferentes tratamentos. Após 48 horas de tratamento, as células foram lavadas com PBS e
meio completo sem droga foi adicionado à cultura. Ao completar mais 48 horas com o meio
sem droga, os procedimentos para mensurar a apoptose foram iniciados. Após o tratamento,
1x105 células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000 rpm por 5 min a 4°C, lavadas com
PBS gelado e depois ressuspendidas em 300uL de tampão de ligação 1X (BD Biosciences
Pharmigen, USA). As células foram então coradas com 5µL de anexina e 50µL de uma
solução de iodeto de propídio (PI) e incubadas, protegidas da luz, em temperatura ambiente.
As células foram analisadas com um citômetro de fluxo BD FACSCalibur™ (BD
Biosciences, San Jose, CA, USA).
3.4. Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o auxílio dos softwares (Graph Prism 5.0
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, USA). Foi
realizada One Way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni para analisar as diferenças entre
os tratamentos. O software Calcusyn (CHOU; TALALAY, 1984) foi utilizado para avaliar as
combinações de droga.
RESULTADOS
RESULTADOS | 32
4. RESULTADOS
4.1.Efeitos do AMG900 na Proliferação Celular
Os efeitos do AMG900 na proliferação celular, das linhagens UW402 e UW473, após
diferentes doses de tratamentos (5-500nM) e tempos de incubação (24, 48 e 72 horas), estão
representados na Figura 2. Pode-se observar que ambas as linhagens apresentaram um efeito
dose dependente. Não houve um efeito significativo na dose de 5nM, porém foi possível
perceber que na dose de 50nM houve uma diminuição significativa da proliferação celular,
atingindo um platô nas doses seguintes (100-500nM) em ambas as linhagens.
A determinação dos valores que levaram a 50% de inibição do crescimento celular
(IC50), de acordo com o software CalcuSyn, mostrou que a linhagem UW402 é mais sensível
aos efeitos da AMG900 quando comparada com a UW473. Os valores do IC50, após 48 horas
de tratamento estão representados na tabela 1, para ambas as linhagens.
Tabela I: Valores de 50% de inibição do crescimento celular (IC50) após tratamento de 48 horas com a droga AMG900.
Linhagens AMG900 - IC50 (nM) UW402 183,16 UW473 242,16
RESULTADOS | 33
B
Figura 2. Análise da proliferação celular após o tratamento das linhagens UW402 (A) e UW473 (B) com AMG900, após os tempos de 24, 48 e 72 horas. *(p<0.05).
A
RESULTADOS | 34
4.2.Capacidade Clonogênica do AMG900
Com o intuito de analisarmos a capacidade de formação de colônias após a
administração do AMG900, foi realizado o ensaio clonogênico. Dessa forma, foi possível
observar uma redução do número de colônias após 48 horas de tratamento, principalmente
com a dose de 50nM de AMG900, atingindo cerca de 90% de inibição para a UW402 e cerca
de 95% para a UW473. Ambas as linhagens responderam de forma semelhante ao tratamento
com a droga (Figura 3).
Figura 3. Análise da redução de colônias nas linhagens UW402 e UW473 após o tratamento de 48 horas com AMG900 (* p<0.05) comparado ao controle.
RESULTADOS | 35
4.3.Apoptose
Com o objetivo de avaliar se os efeitos citotóxicos encontrados não representavam
apenas uma diminuição da proliferação celular como também morte celular, foi avaliada a
porcentagem de células apoptóticas após a marcação com anexina-V e PI, nas linhagens de
meduloblastoma pediátrico, através das análises de citometria de fluxo.
Como mostrado na figura 4, o AMG900 causou apoptose de modo dose-dependente
em ambas as linhagens. Porém, somente a partir da dose de 50nM, é que foi possível observar
que as células tratadas com o AMG900 (5-1000nM) apresentaram uma porcentagem
significativamente maior (p<0.05) de células apoptóticas quando comparadas ao controle.
Após 48 horas de incubação, foi possível observar, com a maior concentração testada
(1000nM), um aumento de aproximadamente 60% no número de células apoptóticas
(anexina-V positivas) na linhagem UW402, quando comparadas ao controle (Figura 4). Já na
linhagem UW473, este efeito foi observado na dose de 500nM, apresentando,
aproximadamente, 70% de células apoptóticas, quando comparadas ao controle (Figura 4),
havendo uma queda, não significativa, na dose de 1000nM.
RESULTADOS | 36
Figura 4. Análise do efeito do AMG900 na indução de apoptose nas
linhagens UW402 (A) e UW473(B).*p<0.05.
A
B
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO | 38
5. DISCUSSÃO
O MB é uma das neoplasias do SNC mais frequentes na faixa etária infantil e apesar da
terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma proporção
significativa de MBs não respondem bem aos tratamentos atualmente disponíveis. Dessa
forma, faz-se necessário um melhor entendimento da biologia tumoral desta neoplasia,
visando à identificação de novos alvos terapêuticos para que, consequentemente, novas drogas
antitumorais sejam desenvolvidas (POLKINGHORN et al., 2007; GULINO et al., 2008;
PACKER, 2011; ROSSI et al., 2011).
As proteínas da família Aurora-quinase (A, B e C) têm sido amplamente estudadas em
diversos tumores, uma vez que dois de seus membros, a Aurora-A e a Aurora-B foram
encontrados hiperexpressos em diferentes tipos de neoplasias. A inibição farmacológica das
atividades dessas proteínas têm mostrado resultados promissores para a terapia do câncer
(BOSS et al., 2009; LOK et al., 2010). Entre os inibidores de Aurora-quinases já descritos, o
AMG900 (Figura 1), um inibidor/competitivo de trifosfato de adenosina, está atualmente na
fase I de ensaios clínicos. Essa droga é altamente potente e seletiva para as auroras A, B, e C,
e possui a capacidade de inibir, também, a fosforilação da histona H3, apresentando efeitos
similares a outros inibidores de Aurora-quinases (PAYTON et al., 2010; HUANG et al.,
2011).
No presente estudo, verificou-se que o AMG900 inibiu significativamente os níveis de
proliferação celular em ambas as linhagens de MB pediátrico estudadas, de maneira dose
dependente. Consistente com o que foi observado por Payton et al. (2010), onde o AMG900
induziu um decréscimo significativo na capacidade proliferativa de 26 linhagens celulares
diferentes, como o câncer de mama, colón, pele, fígado, incluindo as linhagens celulares
resistentes a paclitaxel, um quimiterápico comumente utilizado para o tratamento do câncer, e
resistentes a AZD1152, MK-0457, e PHA-739358, outros inibidores de Aurora-quinases.
Outro inibidor de Aurora-quinase, o ZM447439, atuou de maneira semelhante em
diferentes linhagens de tumor, incluindo as linhagens celulares de leucemia mielóide
(WALSBAY et al., 2008), mesotelioma (CRISPI et al., 2010), linhagens celulares de tumor
neuroendócrino gastroenteropancreático (GEORGIEVA et al., 2010), melanoma (PIRKER et
al., 2010), células de câncer cervical (ZHANG L, ZHANG S, 2011) e em linhagens celulares
de glioblastoma (BORGES et al., 2012), confirmando o importante efeito dos inibidores de
Aurora-quinases em células tumorais.
DISCUSSÃO | 39
Algumas das linhagens estudadas por Payton et al. (2010), como as células tumorais
de pulmão, apresentaram um platô na diminuição celular, consistente com que foi encontrado
nas linhagens UW402 e UW473 no presente estudo, onde a partir da segunda menor
concentração da droga (50nM), os efeitos passam a não ser significativos. Este padrão de
resposta não tem uma razão clara, mas é possível que estejam associados com vias
moleculares semelhantes nestas linhagens.
Os resultados mostraram que o AMG900 inibiu a proliferação celular, com valores de
IC50 de 183,16nM para a UW402 e de 242,16nM para a UW473, indicando que a linhagem
UW402 é mais sensível aos efeitos da AMG900 quando comparada com a UW473. Payton et
al. (2010) relataram que o IC50 das 26 linhagens tumorais tiveram uma variação entre 0,7-5,3
nmol/L, porém eles utilizaram a técnica de ensaio clonogênico para calcular o IC50, fato que
explicaria as diferenças de sensibilidade a droga. Esta diferença também pode ser devido à
resistência das linhagens de meduloblastoma pediátrico utilizadas nesse estudo.
No ensaio clonogênico, as linhagens celulares tratadas com AMG900 mostraram uma
redução na capacidade de formar colônias, quando comparadas ao controle, sendo esta
diminuição dose dependente. Esses resultados, coincidem com os encontrados por Walsbay et
al. (2008) em células de leucemia mielóide, e por Pirker et al. (2010) em células de
melanoma, porém utilizando o inibidor ZM447439, que também inibe a atividade das
proteínas Aurora-quinases.
Em ambas as linhagens celulares estudadas, o efeito mais significativo no ensaio
clonogênico foi observado na concentração de 50nM. Embora as doses necessárias para se
alcançar um efeito significativo sejam bem menores no ensaio clonogênico do que na
proliferação celular, os dados obtidos neste trabalho estão um pouco diferentes dos
encontrados por Payton et al. (2010). Isso porque, no trabalho de Payton et al (2010), o
AMG900 inibiu a formação de colônias em linhagens de células HCT-116 (células de
carcinoma de cólon humano) e em outras linhagens, como as NCI-H460 (câncer de pulmão) e
as MDA-MB231 (carcinoma de mama humano), com as doses de 5 nM ou menos. Os
mesmos resultados foram encontrados por Pirker et al. (2010) em células de melanoma, onde
ocorreu a inibição na formação de colônias também em baixas concentrações do inibidor de
Aurora-quinase ZM447439.
É importante ressaltar que no presente trabalho foi utilizado um ensaio de formação de
colônias de modo que fosse possível a visualização e contagem das mesmas. Essa
característica não foi observada no trabalho de Payton et al. (2010), pois neste os autores não
utilizaram um ensaio onde fosse encontrada a formação de colônias distintas. Tais diferenças
DISCUSSÃO | 40
podem influenciar na comparação dos ensaios clonogênicos realizados neste trabalho com os
apresentados por Payton et al. (2010).
Neste trabalho, encontramos diferentes respostas das linhagens nos diferentes ensaios
utilizados. Esta diferença, segundo Northcott et al. (2012), seria devido ao fato de o MB,
assim como muitos tumores sólidos, ser altamente heterogêneo. Além disso, segundo Castro-
Gamero et al. (2012), as linhagens apresentam diferenças na ploidia, alterações numéricas e
rearranjos estruturais. Tais características têm sido associadas às modificações no
comportamento biológico dessas células, bem como sua resposta aos quimioterápicos. Este
trabalho também relata que as linhagens possivelmente poderiam ser classificadas como
Grupo 3 ou 4, o que reforça os dados aqui encontrados, já que se trata dos grupos de pior
prognóstico.
Na apoptose, processo altamente controlado de morte celular e que tem um importante
papel no desenvolvimento e na prevenção do câncer (COTTER, 2009), foi encontrado um
grande número de células que sofreram morte celular programada após o tratamento com
AMG900, chegando a atingir uma média de 60% de células apoptóticas. A droga causou
apoptose de modo dose dependente em ambas as linhagens, sendo que a porcentagem de
apoptose aumentou significativamente após a dose de 50 nM na linhagem UW402 e após a
dose de 500 nM na linhagem UW473. Esses resultados vão de encontro aos observados por
Payton et.al (2010), onde o AMG900 também induziu um aumento dose dependente da
apoptose em células HCT-116 e em outras linhagens celulares, como a Jurkat (PAYTON et
al., 2010).
Todos os dados apresentados no presente trabalho confirmam que a inibição das Auroras-
quinases pode ser um tratamento bastante eficaz e que o AMG900 pode ser um agente
promissor para o tratamento do meduloblastoma pediátrico. Entretanto, outros estudos devem
ser realizados para que possamos ampliar os dados aqui discutidos.
CONCLUSÕES
CONCLUSÕES | 42
6. CONCLUSÕES
- A inibição das Aurora-quinases pelo AMG900 leva a efeitos antineoplásicos em ambas as
linhagens de meduloblastoma pediátrico;
- O AMG900 reduziu a capacidade das células em formar colônias.
- O AMG900 induziu apoptose em ambas as linhagens;
- Todos os dados encontrados no presente trabalho sugerem que o AMG900 pode ser um
agente promissor para o tratamento do MB pediátrico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1
1 De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas. NBR 6023.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS | 44
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