UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
PROGRAMA DE RESIDÊNCIA MULTIPROFISSIONAL EM ÁREA
PROFISSIONAL DE SAÚDE EM MEDICINA VETERINÁRIA
CÁSSIA MARIA PEDROSO DOS SANTOS
Ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em gatos domésticos
(Felis catus)
BELÉM
2018
OCORRÊNCIA DE MICOPLASMAS HEMOTRÓPICOS EM GATOS
DOMÉSTICOS (Felis catus)
Resumo
Micoplasmas hemotrópicos são de grande importância na medicina veterinária, pois são causadores de doenças
infecciosas que podem acometer várias espécies de animais. Objetivou- se detectar a presença de hemoplasmas
em amostras de sangue de gatos clinicamente sadios através da técnica de PCR e correlacionar sexo, idade e
alterações hematológicas. Foram coletadas 100 amostras para realização do hemograma e PCR. Das amostras
analisadas 44% foram positivas para Mycoplasma spp., onde 42% foram machos e 45%fêmeas, sendo a
maioria dos animais positivos a cima de um ano de idade. Nas alterações hematológicas não houve diferenças
estatisticamente significativas quando se comparou os animais positivos e negativos a PCR. A infecção por
hemoplasmas em felinos clinicamente sadios é frequente, não havendo predisposição por sexo e ocorre
principalmente em animais adultos e não há alterações hematológicas significativas em animais infectados,
portanto, o exame molecular é um diagnóstico de extrema importância na rotina clínica veterinária.
Palavras chave: Hemoplasmas, felino, PCR
OCCURRENCE OF HEMOTROPIC MICOPLASMS IN DOMESTIC CATS (Felis catus)
Abstract
Hemotropic mycoplasmas are of great importance in veterinary medicine, as they cause infectious diseases
that can affect several species of animals. The aim of this study was to detect the presence of haemoplasmas
in blood samples from clinically healthy cats through the PCR technique and to correlate sex, age and
hematological alterations. 100 samples were collected for blood counts and PCR. Of the analyzed samples,
44% were positive for Mycoplasma spp., 42% were male and 45% females, with most animals being over one
year old. In hematological alterations, there were no statistically significant differences when comparing
positive and negative animals to PCR. Haemoplasmas infections in clinically healthy felines is frequent, there
is no predisposition by sex and occurs mainly in adult animals and there are no significant hematological
alterations in animals infected, therefore, molecular examination is a diagnosis of extreme importance in
veterinary clinical routine.
Key words: haemoplasmas, feline, PCR
INTRODUÇÃO
As hemoparasitoses são enfermidades de grande importância na clínica médica de animais e
podem acometer os caninos, felinos, equinos e bovinos (MUNDIM et al., 2008). Os gatos são
infectados por três espécies principais: Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma
haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis. Pode atingir animais de qualquer faixa etária
e de ambos os sexos, a morbidade é considerada alta e a mortalidade e letalidade são baixas em
animais imunoconpetentes (SANTOS; GUIMARAES; BIONDO, 2016).
Micoplasmas Hemotrópicos são hemoparasitas causadores de doenças infecciosas que
caracterizam-se pelo parasitismo dos eritrócitos em gatos (SANTOS; GUIMARAES; BIONDO,
2016), que podem variar de assintomáticos até casos com anemia hemolítica grave, tornando um
grande desafio na rotina dos clínicos veterinários (ROURA et al., 2010).
A transmissão de hemoplasmas ocorre principalmente através de vetores hematófagos, tendo
estudos demonstrando que artrópodes infectados podem transmitir experimentalmente o patógeno,
dentre eles destaca-se a pulga (Ctenocephalides felis) e o carrapato marrom do cão (Rhipicephalus
sanguineus) (SENEVIRATNA et al., 1973; WOODS et al., 2005).
A detecção do organismo em esfregaços sanguíneos como meio de diagnóstico dos
hemoplasmas ainda é bastante utilizada no país (VALLE, 2011), no entanto, apresenta uma
sensibilidade baixa, outro método de diagnóstico como a reação em cadeia da polimerase (PCR) é
considerada o método diagnóstico definitivo para detecção e identificação do agente (SANTOS,
2008). A PCR é uma técnica altamente sensível e específica que partindo de sequências alvo –
principalmente do 16S rRNA – promove a amplificação exponencial in vitro de um fragmento de
DNA bacteriano, permitindo o diagnóstico em infecções agudas e crônicas servindo ainda como
método de identificação de animais portadores impedindo assim o uso desses como doadores
sanguíneos (FOLEY; PEDERSEN, 2001; JENSEN et al., 2001; SANTOS, 2008).
Objetivou-se com esse estudo detectar a presença de hemoplasmas em amostras de sangue de
gatos clinicamente sadios, através da técnica de PCR e correlacionar sexo, idade e alterações
hematológicas.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletadas 100 amostras de sangue de gatos domésticos clinicamente sadios,
independente de raça, sexo ou idade oriunda de um programa de castração da Universidade Federal
Rural da Amazônia (UFRA) em Belém-PA, do período de novembro a dezembro de 2017. Esta
pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da UFRA com protocolo nº 048/2017.
As amostras de sangue foram coletadas por venopunção da jugular, de forma asséptica para
armazenamento de 1-2 mL de sangue total em tubo estéril contendo anticoagulante EDTA (Ácido
Etilenodiamino Tetra-Acético) para imediata realização do hemograma e posteriormente armazenada
em ultra freezer -80 ºC até o momento da análise molecular.
Com relação a faixa etária, as diferentes idades foram agrupadas em intervalos, das amostras
coletadas 64% (64/100) encontravam-se no intervalo de 6 meses de idade até 1 ano de idade, 26%
(26/100) eram maiores de 1 ano de idade até 2 anos de idade e 10% (10/100) eram maiores de 2anos
de idade até 4 anos de idade.
As análises de eritrograma (hemácias e índices hematimétricos), leucograma (contagem de
leucócitos) e plaquetometria (contagem de plaquetas) foram determinadas por um analisador de
hematologia compacto automático (BC-2800), com configuração para a espécie felina. Os valores de
referência utilizados no presente trabalho foram: hemácias (5,0- 10,0 106 céls/mm3); hemoglobina (8-
15 g/dL); leucócitos totais (5.500-19.500); linfócitos (1.500-7.000 céls/mm3); plaquetas (300.000-
800.000 106 céls/mm3) (WEISS; WARDROP, 2010).
A extração de DNA foi realizada através da utilização de um kit comercial (Pure Link ®
Genomic DNA Mini Kit) de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA foi eluído em 50µl
de tampão de eluição que acompanha o kit e foi armazenado no ultra freezer -80ºC.
Para a avaliação da diversidade de microrganismo do gênero Mycoplasma foi realizado a
amplificação de fragmento do gene 16S rRNA utilizando os iniciadores universais MycoLF (5’-
AGCAATRCCATGTGAACGATGAA-3’), MycoLR1 (5’-TGGCACATAGTTTGCTG TCACTT-
3’) e MycoLR2 (5’-GCTGGCACATAGTTAGCTGTCACT-3’), previamente descritos e
estabelecidos (WILLI et al., 2009).
As reações foram realizadas em um volume total de 25 µL contendo 10 – 20 ng de DNA
molde, 1,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de cada um dos dNTPs, 5 mM de cada iniciador e 1,25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®) e água purificada para completar o volume final da
reação. O perfil de amplificação consistiu de uma desnaturação inicial de 10 min a 94°C, 40 ciclos
de 30 seg a 95°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C, seguidos de uma extensão final de 10 min a 72°C.
Como controle positivo foi utilizado em cada uma das reações uma amostra previamente
identificada como positiva para mycoplasmas específico e como controle negativo foi utilizado água
bidestilada estéril.
O produto resultante da PCR foi adicionado e analisado em 3% de gel de agarose, submetido
à eletroforese a 100V durante 50 minutos. Depois foi realizada a leitura em um transluminador de luz
ultravioleta. O tamanho do fragmento amplificado (151bp) foi estimado comparando-se com os
marcadores de peso molecular 100 pb e/ou 1 Kb (DNA ladder Invitrogen®).
Os dados foram tabelados e tratados estatisticamente por percentual simples e as diferenças
entre os percentuais foram comparados entre si pelo teste do qui-quadrado admitindo-se significância
estatística para p<0,05 e para valores menores que 5 o teste G, implementados nos programas
Microsoft Excel e BioEstat 5.3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A realização dessa pesquisa permitiu avaliar a ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em
uma população de gatos domésticos clinicamente sadios, em que 44% (44/100) foram positivos para
Mycoplasma spp. Até o momento, os hemoplasmas já foram relatados em diferentes poluções de
gatos em várias regiões do Brasil. Santis et al., (2014) no estado de Mato Grosso do Sul, observaram
uma positividade de 36.4% (55/151), corroborando com os resultados encontrados neste estudo.
Em outros estados brasileiros essa taxa de infecção foi inferior ao resultado encontrado neste
estudo como pode ser observado por Macieira et al.,(2008) no Rio de Janeiro 11,7% (18/149), Braga
et al., (2012) no Maranhão 12% (29/200), Bortoli et al., (2012) em São Paulo 6,5% (3/46), Miceli et
al., (2013) no Mato Grosso 8,4% (15/178), Aragão de Sousa et al., (2013) em Belém 19,9%
(40/201), Santis et al., (2014) no Mato Grosso do Sul 36,4% (55/151) e Petry (2016) no Rio Grande
do Sul 14,60%. Segundo Greene (2015) a prevalência dos micoplasmas hemotrópicos é problemática
quando se faz a comparação com diferentes estudos, pois a população estudada é bastante diferente,
em algumas pesquisas a amostragem é constituída de gatos anêmicos, outras com afecções clínicas
ou ate mesmo independente do seu estado de saúde. Além disso, outros fatores que podem influenciar,
como o clima e a geografia de diferentes regiões, assim como a frequência de exposição a
ectoparasitas (WILLI et al., 2006).
Com relação ao sexo dos 44% (44/100) positivos, 42% (14/33) foram machos e 45% (30/67)
fêmeas não havendo diferença significativa entre machos e fêmeas, esse resultado corrobora com a
pesquisa de Vicente (2015), no entanto, Marques (2013) Montaño (2014), Aquino (2015) e Petry
(2016) verificaram que os machos foram mais afetados pelos hemoplasmas do que as fêmeas, ainda
segundo Aquino (2015) essa maior frequência de infecção em machos pode estar ligada aos padrões
de comportamento como brigas, mordidas e acesso a rua. Algumas espécies de hemoplasmas já foram
identificados, através de técnicas moleculares na saliva e glândulas salivares de gatos infectados
experimentalmente, o que sugere que lambeduras ou até mesmo a ocorrência de brigas entre animais
pode facilitar a transmissão da doença, porém, como a carga bacteriana na saliva é baixa, a interação
entre os animais deve ser agressiva para permitir a infecção (WILLI et al., 2007; DEAN et al., 2008).
Quanto à idade 39% (25/64) foram positivos na PCR e tinham de 6 meses de idade até 1 ano
de idade, 50% (13/26) foram positivos e eram maiores de 1 ano de idade até 2 anos de idade e 60%
(6/10) foram positivos e eram maiores de 2 anos de idade até 4 anos de idade, a maioria dos animais
positivos neste estudo eram adultos, o que corrobora com Bauer et al., (2008) e Santos et al. (2014)
onde descrevem uma maior relação em animais mais velhos, onde estes permanecem como estado
portador por vários anos, porém esse resultado difere do observado na pesquisa de Marques (2013),
Aquino (2015) e Petry (2016), onde houve maior predisposição a infecção em felinos jovens.
Diferente do resultado desta pesquisa, Vicente (2015) não obteve uma diferença significativa com
relação à idade, quando observado na faixa etária abaixo ou maior que sete anos.
Na análise hematológica, a anemia não esteve presente em nenhuma das amostras analisadas.
Segundo Tasker (2010) os gatos podem ser acometidos por diferentes espécies de mycoplasmas, que
podem causar diferentes graus de anemia. Por outro lado, Duarte et al. (2014) e Santos et al., (2014)
explicam que a ausência de anemia pode estar ligada a portadores crônicos onde a relação parasita
hospedeiro atinge um equilíbrio e a replicação do agente se torna estável pela fagocitose e eliminação
do organismo, diminuindo assim a carga parasitária.
Em 40% das amostras não houve nenhuma alteração hematológica, as demais 60 (60%)
amostras apresentaram alterações, sendo 23 com alteração linfocitária (linfocitose e linfopenia), 43
com trombocitopenia e 9 com leucocitose, sendo a trombocitopenia a alteração mais prevalente (Qui-
quadrado 5.063, p=0.0244), os desdobramentos e sobreposições de alterações podem ser observados
na figura abaixo (Figura 1). Das amostras examinadas 56 (56%) resultaram negativas e 44 (44%)
positivas, não havendo diferença estatística (Qui-quadrado 1.44, p=0.2301).
Figura 1: Diagrama de Venn demonstrando as alterações hematológicas e seus cruzamentos, entre
amostras positivas e negativas pela PCR
Legenda: (A) Alterações hematológicas pelo total de amostras examinadas. (B) Alterações
hematológicas pelo total de amostras positivas. (C) Alterações hematológicas pelo total de amostras
negativas.
Ao avaliar separadamente as plaquetas, foi observado que 43 felinos apresentaram alteração
plaquetária com trombocitopenia, destes 49% (21/43) resultaram positivos pela PCR e 51% (22/43)
foram negativos, porém, 57 felinos não apresentaram alterações de números de plaquetas, dos quais
Trombocitopenia 31
Leucocitose
6
Alteração linfocitária
12
8
1
2
Trombocitopenia 16
Leucocitose
4
Alteração linfocitária
3
41
Trombocitopenia 17
Leucocitose
2
Alteração linfocitária
9
41
1
N=100
Positivos(44)
Negativos(56)
A
B C
40% (23/57) resultaram positivos pela PCR. Com relação aos linfócitos, foi observado que apenas 23
felinos apresentaram alteração linfocitária, no qual 35% (8/23) foram positivos na PCR e 65% (15/23)
foram negativos, no entanto, 77 felinos apresentaram a série linfocitária normal, dos quais 47%
(36/77) resultaram positivos pela PCR. Já os leucócitos foram observados que apenas 9 felinos
apresentaram alteração, leucocitose, destes 56% (5/9) resultaram positivos pela PCR e 44% (4/9)
negativos; os demais 91 felinos não apresentaram alterações de números de leucócitos, dos quais 43%
(39/91) foram positivos pela PCR.
As alterações hematológicas dos gatos analisados quando relacionado ao resultado da PCR
não tiveram uma diferença significativa, o mesmo pode ser observado na pesquisa de Aquino (2015).
Segundo Messick e Harvey (2012) o hematócrito em gatos assintomáticos pode variar ao longo do
tempo de normal ou de leve a moderadamente diminuído, assim como o percentual de leucócitos é
muito variável e de pouco auxilio no diagnóstico, na contagem de plaquetas os valores geralmente
estão entre os valores de referência.
Segundo Firmino (2008) quando analisado o leucograma, este não apresenta alterações
significativas, assim como não a uma correlação entre a fase da doença e o percentual de neutrófilos
e linfócitos. Neste estudo pode se observar que apesar das alterações leucocitárias e linfocitárias, estas
não tiveram valores significativos quando comparado aos resultados da PCR.
CONCLUSÃO
A infecção por hemoplasmas em felinos clinicamente sadios está presente principalmente em
animais adultos, independentes do gênero e muitas vezes pode não estar associada a anemia, outras
alterações hematológicas quando correlacionadas com os animais positivos e negativos na PCR não
tiveram uma diferença significativa entre elas, o que torna essencial o uso da PCR como ferramenta
de diagnóstico para clínico veterinário na detecção de Mycoplasma spp. Além disso, Gatos saudáveis
podem ser portadores assintomáticos de hemoparasitas o que requer uma maior cautela ao submeter
esses animais a qualquer tipo de procedimento que possa causar algum tipo de imossupressão, pois a
reativação da infecção pode levar a doença clínica.
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(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16008224)
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
____________________________________________________________ COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS – CEUA
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA – UFRA Av. Tancredo Neves, no 2501, Bairro Montese, Belém – PA. CEP: 66.077-901
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CERTIFICADO
Certificamos que o Projeto de Pesquisa, intitulado “Ocorrência de Micoplasmas
hemotrópicos em felinos domésticos (Felis catus)”, protocolo nº 048/2017 (CEUA) e
23084.016900/2017-48 (UFRA), sob a responsabilidade do Prof. Dr. Alexandre do
Rosário Casseb – que envolve a produção, manutenção e/ou utilização de animais
pertencentes ao Filo Chordata, Subfilo Vertebrata (exceto o homem), para fins de
PESQUISA – encontra-se de acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 8 de outubro
de 2008, do Decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo
Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovado
pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS da Universidade Federal Rural da
Amazônia, na reunião de 13/11/2017.
Vigência do projeto 13 de novembro de 2017 a 13 de novembro de 2019
Espécie/linhagem Felis catus (gato) / SRD
Número de animais 400 (quatrocentos) animais
Peso/Idade Aprox. 2kg / acima de 6 meses
Sexo 200 Machos e 200 Fêmeas
Origem Clínicas e hospitais veterinários da Região Metropolitana
de Belém
Belém, 11 de dezembro de 2017.
____________________________ Profa. Maria Cristina Manno
Coordenadora CEUA/UFRA
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