Profa. Dra. Fernanda de Rezende Pinto
Urina / Soro / LCR
Visualização de espiroquetas – lâmina – microscópio de campo
escuro (objetivas: 10x e 20x)
Espiroqueta x leptospira
Resultado:
Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características por
morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA
Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE ESPIROQUETEMIA NA
AMOSTRA ANALISADA
Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE ESPIROQUETÚRIA
Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos
anticorpos no soro
Negativo Positivo
• Microplaca = 96 poços
• Luvas / jaleco
• Lâmina de vidro
• Micropipetas (mono e multicanal)
• Ponteiras
• Tubos de vidro (tampa) – diluição soro e cultura
• Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256
Cultura de leptospiras (sorovares)
Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos)
Meio de cultura líquido: EMJH
Solução salina fisiológica (0,85%)
Soros a testar
Ex: bateria de cultura
Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8)
Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi(10A); lai (10G)
Controles Positivos e negativos
Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais
de um sorovar
Controle negativo interno (sem soro) – 20µL Ag + 20µL sol.
salina
Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x)
Estufa 30ºC
• Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título)
• Humano e caninos domiciliados: 1/25
• Sinais: 2 a 3 dpi médico
• Dono do cão – visualiza início dos sinais clínicos
• Bovinos: 1/100
• Aborto – ajuda veterinário (tempo maior – produção maior de Acs)
• Janela imunológica – tempo que o sistema imune necessita para produzir Acs em nível suficiente para ser detectado
Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo)
Sorovares locais
Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes
antigênicos comuns reação cruzada entre sorovares
Também pode ocorrer reação cruzada entre sorogrupos
diferentes
Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH)
Olhar contra a luz – contaminação
Densidade (quantidade de leptospiras – densidade)
1 gota lâmina: MCE – contagem (verificar o nº lept. por campo,
se há auto-aglutinação)
Repique semanal: 10% volume para outro tubo
2 a 3 dias (30°C)
Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio
Poços da primeira linha (A) – colocar o controle negativo
interno do teste (antígeno = cultura de leptospira e
solução salina)
20 µL Ag + 20 µL sol.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H
Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em cada poço)
20 µL sol. salina + 20 µL do AgCONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)
Diluição do soro – sempre a metade do ponto de corte da
leitura do resultado
Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à
microplaca: 1: 12,5
Bovino: 1: 50
Quando se adiciona o Ag o volume final no poço da
microplaca dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25
e 1:100)
Primeiro faz a diluição inicial 1:5
100 µL do soro em 400 µL de solução salina
100 µL do soro teste 400 µL salina
Soro diluído 1:5
Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5.
A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste
Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão)
Diluição 1:12,5400 µL do soro diluído 1:5 +
600µL salinaSoro diluído 1:5
Segunda diluição: a partir da diluição 1:5
Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino)
Diluição 1:50200 µL do soro diluído 1:5 +
1800 µL salinaSoro diluído 1:5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H
CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)
Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2
1º: 20µL do soro (diluído 1 / 50 ) do bovino 1
2º: 20µL do Ag (em cada soro a ser testado) 1 / 100 (dobro volume e dilui para 1:100) – O Ag é a cultura de leptospira mantida em tubo de vidro no meio de cultura líquido EMJH.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H
CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)
Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2
• Agitar a placa agitador de placa para homogeneizar
• Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas
Agitar a placa agitador de placas
Estufa 30°C por 1 a duas horas
Diluição do soro, reação (manhã)
Leitura: logo após almoço
Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro –
visualizar se há aglutinação (Ag + Acs – soro)
1ª gota – controle negativo interno (sem soro) = Ag com leptospiras livres
Verificar se não há aglutinação nas leptospiras do antígeno (auto-aglutinação)Comparar o controle negativo interno com os soros a testar
1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 xTempo de leitura não > 1,5 hora
Soros a testar
• Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas (livres)
• Aglutinação em mais de 50% • Redução da densidade do Ag = aglutinação
Negativo Positivo
Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)
Resultado: não é o título final do soro do bovino!
Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é fixo no teste) para um sorovar
Teste de triagem: indica a presença de Acs no soro, mas não necessariamente a presença da doença
Soros reagentes na triagem sorologia / titulação
Testar o soro com sorovares que apresentaram reação positiva (aglutinação) no teste de triagem
Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro teste na sorologia de triagem
Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas)
Indica a titulação real do animal/pessoa
Soro humano (diluições possíveis em uma microplaca)
1:25
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
Soro bovino
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1.600
1:3.200
1:6.400
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600
CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)
Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno
Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag)Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600
CONTROLE NEGATIVO (sem soro)
Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag)
1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina2º: Poço B: 40 µL do soro diluído 1:12,5 (sem salina)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600
Diluição seriada do soro teste:20 µL soro 1:12,5 (B) Poço C (1:25) Poço D (1:50) Poço E (1:100) Poço F (1:200) Poço G (1:400) Poço H (1:800) desprezar 20 µL finais
Adicionar 20 µL do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro dobro o volume contido no poço dobro a diluição alcança o título de leitura do soro
Agitar a placa agitador de placas
Estufa 30°C por 1 a duas horas
Leitura
Microscópio de campo escuro – visualizar se há
aglutinação (Ag + Acs – soro)
1ª gota – controle negativo (sem soro)
Cultura de leptospiras
Se não há aglutinaçãoComparar com os soros a testar
1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 x ou 20XTempo de leitura não > 1,5 hora
Soros a testar
1:25
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título
Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400
Sorovar infectante: título mais alto
2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os
dois títulos (reação cruzada ou infecção pelo 2)
Diluir mais o soro descobrir qual desses 2 sorovares é
infectante (título mais alto)
Ou infecção por um sorovar não existente na bateria
Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou
vacinação
Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo
Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação
Título 1:400
Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares
Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal
Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação
Título 1:400
Tem clínica + epidemiológico
Título alto de sorovar diferente do encontrado na vacina
doença
Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional
Amostra representativa:
Animais que abortaram (3-4 dias após aborto – queda
imunidade – sem Acs) + outras categorias
Títulos altos e baixos
Vaca aborto + > 1:400 infectado (não precisa novo teste)
1:100 (início ou fim infecção0 7-10 dias (PI: 2-14 dias,
média 7 d) nova coleta soroconversão
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