Resumo
i
Resumo
O fluoreto é ubiquitário na natureza e possui um papel importante no combate
à cárie dentária. Devido às suas propriedades anticariogénicas tem sido adicionado à água de abastecimento público, a produtos dentários (dentífricos e elixires), géneros alimentícios, suplementos, entre outros.
No entanto, a exposição a todas estas fontes de fluoretos tem aumentado o número de casos de toxicidade por fluoreto, de onde se destacam a fluorose
dentária e esquelética.
O consumo de bebidas processadas, como os refrigerantes, tem vindo a aumentar substancialmente pela população infantil e, principalmente neste grupo etário, esta pode ser uma das principais vias de exposição aos fluoretos.
Com o objectivo de estudar a ocorrência de fluoretos em refrigerantes, sumos,
néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões, optimizou-se e validou-se um método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo a ião fluoreto, o qual foi posteriormente utilizado na análise das amostras. Em
simultâneo procedeu-se à análise de ácido ascórbico, do pH e do potencial redox nestas matrizes alimentares.
O método potenciométrico para a análise de fluoreto foi validado através da aplicação de diversos testes estatísticos que permitiram definir o intervalo de
linearidade, a gama de trabalho, os limiares analíticos, a precisão, a exactidão e o efeito de matriz.
Para avaliar o consumo destes produtos foi aplicado um inquérito de frequência de consumo alimentar em crianças com idades entre os 6 e os 10
anos.
O método espectrofotométrico para a determinação de ácido ascórbico é linear
entre 0,1 – 1,6 mg/100 g produto, preciso (DPR<10%) e exacto (erro<10%), apresentando um LOQ de 0,1 mg/100g de produto.
A concentração média de ácido ascórbico é mais elevada em néctares (1,25 ± 0,45 mg/100 g) e mais baixa em chás (0,22 ± 0,19 mg/100g). As bebidas
designadas vulgarmente como bebidas infantis e os produtos à base de citrinos apresentam teores mais elevados de ácido ascórbico.
Os métodos potenciométricos utilizados na determinação do pH e do potencial redox são precisos e exactos, apresentando valores de erro percentual na
análise de controlos e valores de desvio padrão relativo na análise de duplicados inferiores a 10%.
Todas as matrizes analisadas são ligeiramente ácidas e pouco oxidantes.
O método potenciométrico para a determinação de fluoretos é linear na gama de concentrações entre 0,06 e 10 mg/L. O limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram calculados com base na curva de calibração e em
estudos de repetibilidade. Com base na curva de calibração, o LOD e LOQ são de 0,15 mg/L e 0,50 mg/L, respectivamente, e com base em ensaios de
repetibilidade são de 0,02 mg/L e 0,06 mg/L, respectivamente.
Resumo
ii
O método potenciométrico para a análise de fluoreto é preciso e exacto com desvios padrão relativo inferiores a 10% recuperações entre 83 e 114 % e um
erro percentual inferior a 5%.
O método validado permitiu avaliar o teor de fluoreto em 183 amostras,
incluindo 106 refrigerantes, 23 sumos, 37 néctares, 6 bebidas de sumo, 5 concentrados, 3 chás e 3 infusões.
A concentração média de fluoretos é mais elevada em refrigerantes à base de extratos seguida das bebidas de sumo e dos sumos, apresentando valores
médios de fluoretos de 0,86 ± 0,35 mg/L, 0,40 ± 0,24 mg/L e 0,37 ± 0,11 mg/L, respectivamente.
A concentração de fluoretos mais baixa foi observada em amostras de infusões, com valor médio de 0,12 ± 0,01 mg/L, seguida dos chás e dos
refrigerantes gaseificados com concentração média de fluoretos de 0,16 ± 0,12 mg/L e 0,18 ± 0,07 mg/L, respectivamente.
Os néctares, os concentrados e os refrigerantes à base de sumo possuem teores de fluoretos em gamas de concentração muito próximas, apresentando
valores médios de 0,33 ± 0,16 mg/L, 0,29 ± 0,12 mg/L e 0,25 ± 0,14 mg/L, respectivamente.
As concentrações de fluoretos determinadas nas amostras encontram-se abaixo do valor de dose diária tóxica (DDT=3,5 mg/L), o que indica que os
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões, por si só, não são susceptíveis de induzir toxicidade por fluoreto na população.
A análise dos inquéritos permitiu verificar que as crianças inquiridas consomem preferencialmente refrigerantes, principalmente refrigerantes à
base de extracto, e néctares. As bebidas de sumo integram o tipo de bebida menos consumido pelas crianças na faixa etária estudada.
A ingestão diária média de fluoretos a partir do consumo de bebidas é 0,011 mg/kg de peso corporal, verificando-se que algumas crianças excedem a DDR
de fluoretos (0,05 mg/kg de peso corporal), principalmente devido ao consumo de refrigerantes. A DDI de fluoretos aumenta consideravelmente
quando contabilizada também a deglutição de pasta dentífrica (0,024 mg/kg de peso corporal).
Os resultados analíticos, os dados dos inquéritos e o modelo de regressão binária explicam o risco de toxicidade do fluoreto através da dieta pelo
consumo de refrigerantes à base de extracto.
A área de residência e a escolaridade dos pais discriminam o consumo de
bebidas nas crianças, bem como a ingestão diária de fluoretos por esta fonte alimentar.
Palavras-chave: fluoretos, fluorose, método potenciométrico, validação analítica.
Abstract
iii
Abstract
Fluoride is ubiquitous in nature and has an important role against dental
caries. Due to its anticariogenic properties have been added to public water
supplies, dental products (toothpaste and mouthwash), food supplements,
among others.
However, exposure to all these sources of fluoride has increased the number
of cases of fluoride toxicity, mainly the dental and skeletal fluorosis.
The consumption of processed beverages such as soft drinks, has increased
substantially by the child population, especially in this age group and this may
be one of the main routs of exposure to fluoride.
In order to study the presence of fluorides in soft drinks, juices, nectars, fruit
juice beverages, concentrates and tea infusions it was optimized and validated
a potentiometric method with fluoride combination ion selective electrode,
which was subsequently used for sample analysis. Ascorbic acid, pH and redox
potential were also determined in these food matrices.
The potentiometric method was validated through the application of several
statistical methods, which allow defining the linearity, working range,
analytical limits, repeatability, precison, accuracy and matriz effect.
To evaluate the consumption of these products was applied a food questionary
frequency of food intake in children aged 6 to 10 years.
The spectrophotometric method for the determination of ascorbic acid is linear
from 0.1 to 1.6 mg/100 g product, precise (RSD <10%) and accurate (error
<10%), with a LOQ of 0.1 mg / 100g of product.
The concentration of ascorbic acid is higher in nectars (1.25 ± 0.45 mg/100 g)
and lower in teas (0.22 ± 0.19 mg/100g). The beverages commonly
designated as beverage products infant and citrus based beverages have
higher levels of ascorbic acid.
The pH and oxidation-reduction potential (ORP) methods are precise and
accurate, with relative errors for control solutions and relative standard
deviation for duplicate analysis lower than 10%.
The potentiometric method is linear from 0.06 to 10 mg/L. The limit of
detection (LOD) and quantification (LOQ) were calculated based on the
calibration curve and repeatability studies. Based on the calibration curve, the
LOD and LOQ are 0.15 mg/L and 0.50 mg/L, respectively, and on repeatability
tests are 0.02 mg/L and 0.06 mg/L, respectively.
Abstract
iv
The potentiometric method for the analysis of fluoride is precise and accurate
with a relative standard deviation lower than 10% (repeatability), recoveries
between 83 and 114% and relative errors lower than 5% (control solutions).
The occurrence studies were made in 183 samples, including 106 soft drinks,
23 juices, 37 nectars, 6 juice drinks, 5 concentrates, 3 teas and 3 infusions.
The fluoride concentration is higher in the extracts based soft drinks, juice
drinks and juice, with fluoride values of 0.86 0.35 mg/L, 0.40 0.24 mg/L
and 0.37 0.11 mg/L, respectively.
The lowest concentration of fluoride was observed in infusions samples (0.12
0.01 mg/L), followed by tea and soft drinks with fluoride concentration of 0.16
0.12 mg/L and 0.18 0,07 mg/L, respectively.
The nectars, concentrates and juice-based drinks have higher and similar
fluoride values, 0.33 0.16 mg/L, 0.29 0.12 mg/L and 0.25 0.14 mg/L,
respectively.
The concentrations of fluoride in these samples are below the acceptable daily
intake (ADI= 3.5 mg/l), indicating that individually, are not able to induce
fluoride toxicity in the population.
The analysis of questionnaires has shown that children mainly consume soft
drinks (especially extracts based soft drinks) and nectars.
The juice beverages have a lowest consumption by studied group.
The average daily intake of fluorides from the beverage consumption is 0.011
mg/kg body weight, verifying that some children have a consumption higher
than recommended daily intake (RDI) (0.05 mg/kg body weight), especially
due to the use of soft drinks. RDI fluoride also increases considerably when
calculated swallowing of toothpaste (0.024 mg/kg body weight).
The analytical results, the questionnaires data and binary model regression
explain the risk of toxicity of fluoride through diet by consumption of extract
based soft drinks.
The residential area and parents' education discriminate against the
consumption of beverages on children, as well as the daily intake of fluoride
by this food source.
Key-words: Fluoride, fluorosis, potenciometric method, validation method.
Agradecimentos
v
Agradecimentos
A concretização deste trabalho só foi possível graças à colaboração de um
conjunto de pessoas, que de forma directa ou indirecta intervieram na sua definição, preparação e realização.
Começo por agradecer às minhas duas orientadoras, Profª. Doutora Cristina Almeida e Profª. Doutora Maria Eduardo Figueira que, com enorme dedicação, disponibilidade, inesgotável paciência, simpatia e boa disposição cooperaram
com afinco para a elaboração desta tese de mestrado. Demonstraram um enorme apoio, não só durante a fase de planeamento do trabalho
experimental e aplicação dos inquéritos de frequência alimentar, como também na elaboração da tese. Agradeço também a objectividade na
transmissão de conhecimentos, todas as críticas construtivas e sugestões que permitiram enriquecer o trabalho e o apoio demonstrado no tratamento e organização dos resultados, bem como na sua correccão. O seu auxílio e
orientação foram fundamentais para a conclusão desta tese.
Gostaria de agradecer ao Prof. Doutor Afonso Cavaco que, embora não
estando directamente envolvido no âmbito deste trabalho, prestou um apoio incondicional no tratamento estatístico dos resultados dos questionários de
frequência alimentar e uma ajuda preciosa na utilização do programa estatístico SPSS. Agradeço a disponibilidade, a paciência incansável e toda a simpatia demonstradas e que tornaram a análise estatística mais entusiasta.
Refiro-me de forma especial e reconhecida aos Órgãos de Gestão e respetivos
Docentes dos Estabelecimentos de Ensino Básico, público e privado, nomeadamente à Escola Básica de Alcanena, ao Colégio João de Deus, à Escola Básica Fernando Pessoa e à Escola Lar da Criança, que de forma
entusiasta e voluntária, aceitaram participar no estudo, permitindo a realização deste trabalho. A todos eles agradeço a disponibilidade e simpatia
demonstradas.
Quero agradecer à Dra. Lucília Vales que, com toda a dedicação e
disponibilidade, prestou um apoiou extraordinário na fase final do trabalho experimental, nomeadamente na análise das amostras.
Á Inês Martins e à Isabel Barroso agradeço a perseverança e disponibilidade na lavagem e arrumo de material, entre análise de amostras de sumos,
refrigerantes, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. Às duas agradeço ainda a boa disposição, simpatia e as palavras de incentivo à
conclusão do trabalho experimental.
Agradeço à minha colega Graça Costa que acompanhou e colaborou de forma
extremamente empenhada na organização e codificação das amostras e na realização do trabalho laboratorial, principalmente na análise de amostras. A
ela agradeço a companhia e a boa disposição durante a análise de tantas bebidas.
Agradecimentos
vi
À Profª Doutora Matilde Castro, coordenadora do mestrado em Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, agradeço a organização de mais uma
edição do referido mestrado. Agradeço de forma muito sincera aos meus patrões e amigos, Paula Silva e
Michael Lopes, todo o apoio, perseverança e amizade demonstrados ao longo da realização deste trabalho. Gostaria também de agradecer à Graciete Gomes
a simpatia e o apoio prestados. Aos três agradeço ainda a disponibilidade, incentivo e compreensão por todos os dias que me ausentei do meu local de trabalho e que permitiram alcançar os meus objectivos e terminar o presente
trabalho.
Ao Duarte Duarte agradeço de forma especial a energia e o positivismo que, nas horas mais difíceis, me deram força e ânimo para a conclusão desta tese, com afinco e determinação. Agradeço ainda todo o apoio prestado na
informatização dos resultados dos questionários e a enorme paciência e compreensão pelos fins-de-semana, datas festivas, dias e noites que passei
em frente ao computador.
Quero agradecer à minha amiga Verónica Paiva o apoio incondicional na
compilação da informação recolhida nos questionários de frequência alimentar, a paciência demonstrada nas tantas horas que me ouviu falar de bebidas
consumidas por crianças, inquéritos e fluoretos e pelo exemplo de determinação que me inspirou e incentivou a alcançar as minhas metas.
Fundamental tem sido o grande apoio e dedicação da minha mãe no meu percurso académico. O maior e mais sentido agradecimento vai para ela, pelo exemplo de determinação e coragem que me inspira e faz sonhar e acreditar
que poderei ir mais além. Agradeço ainda a compreensão e paciência pelos longos dias em que me dediquei, quase exclusivamente, à escrita deste
trabalho.
Aos restantes familiares e amigos que, embora não tenham contribuído
directamente para a realização deste trabalho, agradeço as palavras amigas de incentivo e coragem para ultrapassar os momentos mais difíceis.
Índice
vii
Índice
Resumo ....................................................................................................................... i
Abstract ......................................................................................................................iii
Agradecimentos........................................................................................................ v
Índice ........................................................................................................................vii
Índice de tabelas .................................................................................................... xiii
Índice de figuras .................................................................................................... xvi
Símbolos e abreviaturas ....................................................................................... xix
Introdução ................................................................................................................. 1
Capítulo I – Fluoretos .............................................................................................. 7
1. Generalidades ....................................................................................... 7
2. Metabolismo do flúor .............................................................................. 8
3. Mecanismo de acção do flúor ..................................................................11
4. Via de exposição aos fluoretos pela dieta .................................................13
5. Toxicidade dos fluoretos ........................................................................17
5.1 Fluorose dentária ..................................................................................18
5.2 Fluorose esquelética ..............................................................................20
5.3 Outros efeitos tóxicos ............................................................................21
5.3.1 Citotoxicidade ...............................................................................21
5.3.2 Toxicidade no tracto gastrointestinal ................................................22
5.3.3 Nefrotoxicidade e hepatotoxicidade ..................................................22
5.3.4 Teratogenecidade ..........................................................................23
5.3.5 Neurotoxicidade ............................................................................23
5.3.6 Indução do stresse oxidativo ..........................................................23
5.3.7 Toxicidade do sistema reprodutor ....................................................24
5.3.8 Aumento da toxicidade de metais ....................................................24
5.3.9 Desregulação endócrina .................................................................25
6. Avaliação do risco .................................................................................25
6.1 Relação risco vs benefício ......................................................................27
Capítulo II – Aspectos legais ................................................................................29
Capítulo III – Avaliação do consumo alimentar ................................................31
1. Métodos de avaliação do consumo alimentar ............................................31
1.1 Diário alimentar ....................................................................................32
1.2 Recordatório alimentar de 24h ...............................................................33
1.3 História alimentar .................................................................................33
Índice
viii
1.4 Questionário de frequência alimentar ...................................................... 34
Capítulo IV - Metodologia analítica ..................................................................... 39
1. Generalidades ...................................................................................... 39
2. Métodos de análise de fluoretos em alimentos .......................................... 39
2.1 Métodos colorimétricos .......................................................................... 40
2.2 Métodos potenciométricos ..................................................................... 41
3. Análise do pH, do potencial redox e do ácido ascórbico .............................. 43
4. Validação de métodos analíticos ............................................................. 45
4.1 Selectividade/Especificidade ................................................................... 47
4.2 Linearidade .......................................................................................... 47
4.3 Gama de trabalho ................................................................................. 48
4.4 Limiares analíticos ................................................................................ 48
4.4.1 Limite de detecção (LOD) ............................................................... 48
4.4.2 Limite de quantificação (LOQ) ......................................................... 49
4.5 Sensibilidade ........................................................................................ 50
4.6 Precisão .............................................................................................. 50
4.6.1 Repetibilidade ............................................................................... 51
4.6.2 Precisão intermédia ....................................................................... 52
4.6.3 Reprodutibilidade .......................................................................... 53
4.7 Exactidão ............................................................................................ 54
4.8 Descrição de métodos analíticos ............................................................. 55
5. Questionário de frequência alimentar ...................................................... 56
5.1 Selecção dos géneros alimentícios .......................................................... 56
5.2 Elaboração de um questionário de frequência alimentar............................. 56
5.2.1 Elaboração de uma lista dos géneros alimentícios .............................. 57
5.2.2 Definição de porções e da frequência de consumo ............................. 58
5.2.3 Aplicação do questionário de frequência alimentar ............................. 58
5.3 Análise estatística dos dados .................................................................. 59
Capítulo V – Parte experimental .......................................................................... 61
1. Equipamento e material......................................................................... 61
1.1 Equipamento ........................................................................................ 61
1.2 Material ............................................................................................... 61
2. Reagentes ........................................................................................... 62
2.1 Análise de fluoretos .............................................................................. 62
2.1.1 Reagentes gerais .......................................................................... 62
2.1.2 Padrões ....................................................................................... 62
Índice
ix
2.1.3 Controlos .....................................................................................62
2.2 Análise de ácido ascórbico .....................................................................62
2.2.1 Reagentes gerais ...........................................................................62
2.3 Determinação do pH .............................................................................63
2.3.1 Padrões de calibração ....................................................................63
2.3.2 Controlos .....................................................................................63
2.4 Determinação do potencial redox ............................................................63
2.4.1 Padrões de calibração ....................................................................63
2.4.2 Controlos .....................................................................................63
3. Soluções ..............................................................................................63
3.1 Análise de fluoretos ...............................................................................63
3.1.1 Soluções gerais .............................................................................63
3.1.2 Soluções de calibração ...................................................................64
3.1.3 Soluções padrão de controlo ...........................................................64
3.1.4 Soluções de controlo instrumental ...................................................65
3.2 Análise de ácido ascórbico .....................................................................65
3.2.1 Soluções gerais .............................................................................65
3.2.2 Soluções de calibração ...................................................................66
3.2.3 Soluções padrão de controlo ...........................................................66
4. Implementação e validação dos métodos de ensaio ...................................67
4.1 Análise de fluoretos ...............................................................................67
4.1.1 Técnica ........................................................................................67
4.1.2 Controlo instrumental ....................................................................68
4.1.3 Estudo da linearidade.....................................................................68
4.1.4 Gama de trabalho ..........................................................................69
4.1.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ......................................................69
4.1.6 Precisão .......................................................................................70
4.1.6.1 Repetibilidade ...............................................................................70
4.1.6.2 Precisão intermédia .......................................................................70
4.1.7 Exactidão .....................................................................................70
4.1.8 Limite de determinação do método (LD) ...........................................70
4.1.9 Efeito do pH ..................................................................................71
4.1.10 Análise das amostras .....................................................................72
4.2 Análise de ácido ascórbico .....................................................................72
4.2.1 Verificação da pureza do xileno .......................................................73
4.2.2 Aferição da solução corante ............................................................73
4.2.3 Estudo da linearidade.....................................................................73
4.2.4 Gama de trabalho ..........................................................................74
Índice
x
4.2.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ...................................................... 74
4.2.6 Análise das amostras ..................................................................... 74
4.2.6.1 Preparação da amostra .................................................................. 74
4.2.6.2 Calibração do método analítico ....................................................... 75
4.2.6.3 Análise do ácido ascórbico .............................................................. 75
4.3 Determinação do pH ............................................................................. 76
4.4 Determinação do potencial redox ............................................................ 76
5. Selecção das amostras .......................................................................... 77
Capítulo VI – Resultados e discussão ................................................................. 79
1. Análise de fluoretos .............................................................................. 79
1.1 Controlo instrumental ........................................................................... 79
1.2 Estudo da linearidade ............................................................................ 80
1.3 Gama de trabalho ................................................................................. 83
1.4 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ............................................................. 83
1.5 Precisão .............................................................................................. 83
1.6 Exactidão ............................................................................................ 84
1.7 Limite de determinação do método (LD) .................................................. 86
1.7.1 Efeito do pH ................................................................................. 87
1.8 Controlo de qualidade interno (CQI) ........................................................ 88
1.9 Análise de amostras .............................................................................. 91
2. Análise de ácido ascórbico ..................................................................... 93
2.1 Estudo da linearidade ............................................................................ 93
2.2 Gama de trabalho ................................................................................. 95
2.3 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ............................................................. 95
2.4 Precisão .............................................................................................. 96
2.5 Exactidão ............................................................................................ 96
2.6 Controlo de qualidade interno (CQI) ........................................................ 98
2.7 Análise de amostras ............................................................................ 100
3. Determinação do pH ........................................................................... 101
3.1 Controlo de qualidade interno (CQI) ...................................................... 101
3.2 Análise de amostras ............................................................................ 103
4. Determinação do potencial redox .......................................................... 104
4.1 Controlo de qualidade interno (CQI) ...................................................... 104
4.2 Análise de amostras ............................................................................ 105
5. Questionários de frequência alimentar ................................................... 106
5.1 Caracterização da amostra ................................................................... 107
5.1.1 Distribuição das crianças por idade e género................................... 107
Índice
xi
5.1.2 Distribuição das crianças por peso e altura ..................................... 108
5.1.3 Distribuição das crianças por escola e ano de escolaridade ............... 108
5.1.4 Distribuição das crianças por região ............................................... 110
5.1.5 Distribuição das crianças por nível de escolaridade dos pais .............. 111
5.2 Resultados dos questionários de frequência alimentar ............................. 112
5.2.1 Estimativa da ingestão diária de fluoretos ....................................... 112
5.2.2 Regressão binária para avaliar o risco de toxicidade por fluoretos ...... 115
5.2.3 Relações entre o consumo e variáveis de interesse .......................... 119
5.2.3.1 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o género e idade .......... 119
5.2.3.2 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a região ...................... 121
5.2.3.3 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a escolaridade dos pais . 122
5.2.3.4 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o tipo de escola ............ 122
6. Relação entre os dados analíticos e a avaliação de consumo alimentar ..... 123
Capítulo VII - Conclusões .................................................................................... 125
Bibliografia e referências bibliográficas ........................................................... 131
Anexos ..................................................................................................................... 143
Anexo 1 – Características das amostras analisadas............................................... 144
Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas .............................................................. 167
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados ............................................................ 169
Anexo 4 – Teste dos valores normalizados ............................................................ 173
Anexo 5 – Análise de resíduos ................................................................................ 174
Anexo 6 – Teste de Mandel..................................................................................... 175
Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias ................................................ 177
Anexo 8 – Convite às escolas ................................................................................. 179
Anexo 9 – Questionário de frequência alimentar ................................................... 181
Índice de tabelas
xiii
Índice de tabelas
Tabela 1 Dose Diária Recomendada (DDR) para uma eficaz proteção da
cárie dentária e Dose Diária Tóxica (DDT) com risco de fluorose
26
Tabela 2 Aspectos comparativos entre os métodos de avaliação do
consumo alimentar
37
Tabela 3 Interferências mais comuns referentes ao método
potenciométrico para o doseamento de fluoretos
43
Tabela 4 Caracterização do tipo de bebidas incluídas no questionário de
frequência alimentar
57
Tabela 5 Distribuição dos participantes por escola e distrito 59
Tabela 6 Critérios de aceitação para a definição do intervalo de linearidade 69
Tabela 7 Parâmetros da primeira curva de calibração dos fluoretos para a
avaliação da linearidade do método potenciométrico
81
Tabela 8 Limiares analíticos do método potenciométrico com base nos
parâmetros da curva de calibração e em condições de
repetibilidade
83
Tabela 9 Repetibilidade e precisão intermédia do método potenciométrico 84
Tabela 10 Estudos de recuperação dos fluoretos em várias matrizes
alimentares em condições de repetibilidade
84
Tabela 11 Limite de determinação do método potenciométrico para a
análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas
de sumo, concentrados, chás e infusões
86
Tabela 12 Parâmetros do controlo de qualidade interno relativo à análise de
fluoretos pelo método potenciométrico
90
Tabela 13 Concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,
bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados
em Portugal continental
91
Tabela 14 Avaliação da linearidade do método espetrofotométrico para a
análise de ácido ascórbico
94
Tabela 15 Limares analíticos do método espetrofotométrico com base na
curva de calibração e em condições de repetibilidade
95
Tabela 16 Repetibilidade e precisão intermédia do método
espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do
ácido ascórbico
96
Tabela 17 Parâmetros do controlo de qualidade interno relativo à análise de
ácido ascórbico pelo método espetrofotométrico do 2,6-
99
Índice de tabelas
xiv
diclorofenolindofenol
Tabela 18 Teor médio de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos,
néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões
comercializados em Portugal continental
100
Tabela 19 Valores médios do pH de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas
de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em
Portugal continental
103
Tabela 20 Potencial redox médio de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas
de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em
Portugal continental
106
Tabela 21 Ingestão diária de fluoreto (mg/kg de peso corporal) dos
inquiridos pelo consumo de bebidas e deglutição de pasta
dentífrica
113
Tabela 22 Ingestão diária de fluoreto (mg/kg peso corporal) pelo consumo
de bebidas e deglutição de pasta dentífrica
114
Tabela 23 Estatísticas de validação do modelo de regressão logística 115
Tabela 24 Teste de Hosmer e Lemeshow 116
Tabela 25 Classificação do modelo final de regressão binária logística 116
Tabela 26 Coeficientes (B) e razão de chance (Exp(B)) da regressão binária
para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos
117
Tabela 27 Valores médios da dose diária ingerida de fluoreto por género 119
Tabela 28 Valores médios de ingestão diária de fluoretos, por região 120
Tabela 29 Características das amostras de refrigerantes 144
Tabela 30 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 145
Tabela 31 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 146
Tabela 32 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 147
Tabela 33 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 148
Tabela 34 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 149
Tabela 35 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 150
Tabela 36 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 151
Tabela 37 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 152
Tabela 38 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 153
Tabela 39 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 154
Índice de tabelas
xv
Tabela 40 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 155
Tabela 41 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 156
Tabela 42 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 157
Tabela 43 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 158
Tabela 44 Características das amostras de sumo 159
Tabela 45 Características das amostras de sumo (continuação) 160
Tabela 46 Características das amostras de néctares 161
Tabela 47 Características das amostras de néctares (continuação) 162
Tabela 48 Características das amostras de néctares (continuação) 163
Tabela 49 Características das amostras de bebidas de sumo 164
Tabela 50 Características das amostras de concentrados 165
Tabela 51 Características das amostras de chá 165
Tabela 52 Características das amostras de infusões 166
Índice de figuras
xvi
Índice de figuras
Figura 1 Metabolismo do flúor (absorção, distribuição e excreção do flúor
pelo organismo) em sobreposição com uma curva de
concentração de flúor no plasma
11
Figura 2 Lesões no esmalte dentário induzidas pela exposição crónica (A) e
aguda (B) ao fluoreto. E: esmalte e D: dentina
19
Figura 3 Opacidade e pigmentação do esmalte em formas severas de
fluorose dentária
19
Figura 4 Radiografia do antebraço com calcificação do periósteo
(membrana de revestimento ósseo) (A) e deformações ósseas de
Genuvalgum numa criança com fluorose esquelética (B)
21
Figura 5 Natureza cíclica da estratégia a ser seguida na validação de um
método analítico
45
Figura 6 Sequência do trabalho experimental para o controlo instrumental,
optimização, validação e análise potenciométrica de fluoretos em
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados,
chás e infusões
67
Figura 7 Sequência do trabalho experimental para a optimização, validação
e análise de ácido ascórbico por espetrofotometria de absorção
molecular em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo,
concentrados, chás e infusões
72
Figura 8 Diferença dos potenciais do elétrodo (LS – Limite Superior e LI –
Limite Inferior)
80
Figura 9 Testes estatísticos para o estudo da linearidade. (a) Curva de
calibração e bandas de incerteza (superior e inferior), (b) análise
de resíduos, (c) valores normalizados e (d) teste de Mandel
82
Figura 10 Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 0,06
mg/L (n=10)
85
Figura 11 Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 10
mg/L (n=10)
86
Figura 12 Efeito do pH nas recuperações de amostras ácidas 87
Figura 13 Análise de soluções controlo de ácido ascórbico, n=10 97
Figura 14 Erro relativo da análise de padrões de controlo de pH=6,00,1
(n=15)
102
Figura 15 Erro relativo da análise de padrões de controlo de pH=6,8±0,1
(n= 15)
102
Índice de figuras
xvii
Figura 16 Análise dos padrões de controlo de potencial redox, n=15 104
Figura 17 Número de participantes distribuídos por idade e género, n=217 107
Figura 18 Descrição dos participantes por altura e peso em função da idade 108
Figura 19 Distribuição dos participantes por escola e ano de escolaridade 109
Figura 20 Número de participantes por região 110
Figura 21 Nível de escolaridade dos pais e/ou encarregados de educação
dos participantes
111
Figura 22 Distribuição do consumo por tipo de bebida 113
Símbolos e abreviaturas
xix
Símbolos e abreviaturas
a Ordenada na origem (equação da recta, y = a + bx)
ADP Adenosina-Difosfato
ALP Fosfatase Alcalina
ALT Alanina Transaminase
AMP Adenosina-Monofosfato
AOAC “Association of Official Analytical Chemists”, Associação Oficial de
Químicos Analíticos
AST Aspartato Transaminase
ATP Adenosina-Trifosfato
b Declive da recta (equação da recta y = a + bx)
CA Concentração de analito na amostra
CAT Catalase
CCA Comissão do Codex Alimentarius
CCAH Comissão Científica da Alimentação Humana
CDTA “1,2-cyclohexylenedi nitrilo-tetraacetic acid”, ácido1,2-ciclo-
hexilenodiaminotetraacético
CE Comissão Europeia
CP Concentração de analito no padrão
CR Concentração de analito no recuperado
CV Coeficiente de variação (o mesmo que desvio padrão relativo)
CVm Coeficiente de variação do método
CVr Coeficiente de variação de repetibilidade
CVRL Coeficiente de variação de reprodutibilidade
DDI Dose Diária Ingerida
DDR Dose Diária Recomendada
DDT Dose Diária Tóxica
DD Diferença de duplicados
DFI “Dean Dental Fluorosis Index”, Índice de Fluorose Dentária de
Dean
DP Desvio padrão (igual a S)
DPR Desvio padrão relativo
DPRr Desvio padrão relativo da repetibilidade
DPRRL Desvio padrão relativo da reprodutibilidade
Símbolos e abreviaturas
xx
DS2 Diferença de variâncias (estudo de funções lineares)
EFSA “European Food Safety Authority”, Autoridade Europeia para a
Segurança Alimentar
EPA “Environmental Protection Agency”, Agência de Protecção
Ambiental
Er Erro relativo
EUA Estados Unidos da América
F Valor tabelado da distribuição F de Snedecor/Fisher
FD Fluorose Dentária
GDP Guanosina-Difosfato
GPx Glutationo Peroxidase
GSH Glutationo
GTP Guanosina-Trifosfato
HPLC “High Performance Liquid Chromatography”, cromatografia líquida de alta eficiência
IUPAC “International Union of Pure and Applied Chemistry”, União
Internacional de Química Pura e Aplicada
ISO “International Standard Organization”, Organização Internacional
de Normalização
LOAEL “Lowest-Observed-Adverse-Effect-Level”, nível mais baixo de efeitos adversos observáveis
LD “Limit of Determination”, limite de determinação
LOD “Limit of Detection”, limite de detecção
LOQ “Limit of Quantification”, limite de quantificação
MRC Materiais de Referência Certificados
m0 Massa, em miligramas, de ácido ascórbico, equivalente a 1,0 mL
da solução corante
m1 Massa, em gramas, contida na alíquota da amostra utilizada na
redução do corante
n Número de ensaios, número de amostras analisadas ou número
de inquiridos
N Número de pontos experimentais da recta de calibração
N.A. Não Aplicável
NOAEL “No-Observed-Adverse-Effect-Level”, nível de ausência de efeitos adversos ou nível de efeitos adversos não observados
NOEL “No-Observed-Effect-Level”, nível de ausência de efeitos ou nível de efeitos não observados
NP Norma Portuguesa
OMS Organização Mundial de Saúde
Símbolos e abreviaturas
xxi
ORP Potencial de oxidação-redução, “oxidation reduction potential”
PVC “Polyvinyl Chloride”, Cloreto de polivinilo
QFA Questionário de Frequência Alimentar
QI Quociente de Inteligência
r Limite de repetibilidade
R Coeficiente de correlação da recta
R2 Coeficiente de determinação da recta
Rec (%) Percentagem de recuperação
RI Limite de precisão intermédia
RL Limite de reprodutibilidade
S Unidade de desvio ou desvio padrão (igual a DP)
SMEWW “Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater”, Métodos Padrão para a Análise de Água potável e Águas residuais
SNC Sistema Nervoso Central
SOD Superóxido Dismutase
SPSS “Statistical Package for Social Sciences”
S2 Variância
Sa Desvio padrão da ordenada na origem(a)
Sb Desvio padrão do declive da recta (b)
Sm Desvio padrão do método
Sr Desvio padrão calculado a partir dos resultados obtidos em
condições de repetibilidade
SRL Desvio padrão calculado a partir dos resultados obtidos em
condições de reprodutibilidade
Desvio padrão residual de uma função não linear
So Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da
solução com a concentração mais baixa da gama de trabalho
Sy/x Desvio padrão residual de uma função linear
t Valor da variável de Student
TFI “Thylstrup-Fejerskov Index”, Índice de Fluorose Dentária de Thylstrup-Fejerskov
TISAB “Total Ionic Strength Adjustment Buffer, ”solução tampão e de ajustamento da força iónica,
UE União Europeia
VA Volume de amostra
Símbolos e abreviaturas
xxii
Vest Valor de diferença de potencial estimado a uma determinada
concentração
Vexp Valor da diferença de potencial obtida experimentalmente a uma
determinada concentração
VP Volume de padrão
VR Volume de recuperado
VT Valor teste
V1 Volume, em mL, da solução corante adicionado à amostra para
análise
V2 Volume, em mL, da solução corante em excesso, correspondente
à absorvência lida da amostra, determinado na curva de calibração
V100 Diferença de potencial correspondente ao ponto experimental
com melhor correlação
Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão
Valor experimental
Valor aceite como verdadeiro (material de referência interno ou
material de referência certificado)
Valores individuais do sinal instrumental
У-GT Gama-Glutamiltranspeptidase
∆L Variação do sinal instrumental
∆C Variação da concentração em relação à variação do sinal instrumental
Média dos valores de x (concentração de analito)
Média dos valores de y (sinal instrumental)
Introdução
1
Introdução
O flúor é um elemento químico abundante na crosta terrestre. No grupo dos halogénios é o elemento mais electronegativo e reactivo. Na natureza, o flúor está presente sob a forma de fluoretos, os quais, podem ser encontrados em
pequenas quantidades, na água, ar, solo, plantas e animais. A concentração de fluoretos na água e no solo depende de vários factores, tais como pH,
sólidos dissolvidos totais, alcalinidade, porosidade e acidez do solo, temperatura e profundidade. A actividade vulcânica e a utilização de muitos dos fertilizantes fosfatados também são responsáveis pelo aumento do teor de
fluoretos a nível ambiental (1-3).
Os fluoretos não são essenciais para o crescimento e desenvolvimento humano, encontrando-se no corpo humano em pequenas concentrações (2,6 mg num adulto), essencialmente nos dentes e ossos (99 %). No entanto, a
ingestão de fluoretos, em doses moderadas (3-4 mg/dia para adultos), é benéfica na prevenção da cárie dentária e na manutenção da estrutura óssea,
principalmente nas crianças. Os fluoretos fortalecem e favorecem a reparação (remineralização) do esmalte e dentina, não só porque reduzem a solubilidade destes compostos em meio ácido, mas também, porque reduzem a capacidade
bacteriana de produzir ácidos. Os fluoretos também têm sido utilizados no tratamento da osteoporose (2, 4, 5).
De acordo com os relatórios da Organização Mundial de Saúde (OMS) as cáries dentárias constituem um importante problema de saúde pública nos países
mais desenvolvidos, onde afectam cerca de 60-90% das crianças em idade escolar e um número representativo da população adulta. Para combater este
problema, e uma vez que os fluoretos são reconhecidos como a medida mais eficaz na prevenção da cárie dentária, a OMS recomenda que este elemento seja adicionado à água, ao leite ou ao sal, de modo a permitir o acesso de
toda a população aos fluoretos, sem no entanto, alterar os seus hábitos alimentares (6).
Em 2005, aproximadamente 317 milhões de pessoas em 39 países beneficiavam de água fluoretada artificialmente. Outros 40 milhões de pessoas
consumiam água naturalmente fluoretada (5).
A fluoretação da água é realizada em países como os Estados Unidos da América, Espanha, Suíça, Canadá, o Reino Unido, Israel, Singapura e Nova
Zelândia (5). Em Portugal a água de abastecimento público não é artificialmente fluoretada (7), uma vez que este ião ocorre naturalmente nas águas (< 1 mg/L) e a legislação nacional (8) apresenta um valor paramétrico
de 1,5 mg/L de fluoretos na água para consumo humano.
No entanto, para além da fluoretação da água (adição de flúor na forma de fluoreto de sódio à água potável), este ião está presente numa vasta gama de produtos, tais como pastas dentífricas (0,1% de flúor na forma de NaF, SnF2 e
Na2PO3F), elixires orais, suplementos, bebidas, alimentos e produtos odontológicos para uso profissional (2, 9, 10).
Introdução
2
A exposição ao flúor a partir destas fontes provocou uma melhoria significativa na saúde oral e na manutenção da estrutura óssea da população (9), embora
tenham de ser tomadas algumas medidas preventivas, de forma a evitar excessos.
Os fluoretos são facilmente absorvidos pelo trato gastrointestinal na ausência de elementos interferentes, tais como o cálcio, iodo e alumínio (11). O fluoreto
pode bioacumular-se no organismo, uma vez que apenas 50% da dose diária ingerida é excretada através dos rins; o restante acumula-se nos ossos, na
hipófise e outros tecidos, podendo tornar-se tóxico (10, 12).
Nos adultos a dose letal é de 0,20-0,35 g de fluoreto por quilograma de peso corporal, sendo que a diferença entre a necessidade de flúor para a
manutenção da saúde oral e óssea e uma dose nociva para o ser humano é muito pequena (2, 10).
As populações particularmente susceptíveis a efeitos adversos do fluoreto são as crianças, diabéticos, doentes renais, indivíduos com osteoporose, grávidas
ou mulheres que estão a amamentar e indivíduos com deficiência de micronutrientes específicos como o cálcio, o magnésio, o iodo e o selénio (13).
Os teores elevados de fluoretos podem desencadear fenómenos de
neurotoxicidade, diminuir as capacidades cognitivas, conduzir a distúrbios comportamentais em crianças, promover alterações da função do sistema
nervoso central, reduzir a mielina das fibras nervosas, aumentar a apoptose neuronal, alterar os níveis proteicos e de neurotransmissores e modificar a actividade de algumas enzimas cerebrais (10, 12). Verifica-se ainda o
aumento da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular nos eritrócitos, nos osteoblastos e nos túbulos proximais. Deste modo, o aumento da
concentração de cálcio pode ser considerado um indicador da toxicidade dos fluoretos manifestada pela indução de apoptose e/ou necrose celular (1).
Desde o início da fluoretação da água que tem havido numerosas alegações de lesões decorrentes da ingestão de água fluoretada, como, reacções alérgicas,
cancro, defeitos congénitos e doenças genéticas (5). A água fluoretada está associada principalmente ao aumento da prevalência de fluorose dentária ou
esquelética e tem sido considerada como a responsável pelo aumento de 40% dos casos, os restantes 60% são atribuídos às restantes fontes de fluoretos (9). Não é possível controlar a quantidade de água que cada pessoa vai
consumir e, portanto, pode estar a fomentar-se ingestões desajustadas de fluoretos. A fluorose dentária é um distúrbio de formação dentária provocada
pela ingestão prolongada de fluoretos durante o desenvolvimento dentário, tendo como consequência, uma opacidade do esmalte (2, 9, 12).
A fluorose dentária pode ser moderada ou severa caracterizando-se por
alterações estéticas com aparecimento de pigmentação branca no esmalte dentário no primeiro caso e pigmentos castanhos no segundo, com perda de esmalte (14). O período crítico para o desenvolvimento de fluorose dentária é
dos 4 meses aos 4 anos de idade (15) e, como tal, a severidade da fluorose depende da dose, idade e a frequência da ingestão de fluoretos (16).
A ingestão de elevadas concentrações de fluoreto (concentrações superiores a 3,5 mg/L) também pode desencadear a fluorose esquelética com alterações
esqueléticas, articulares, nefrológicas e neurológicas (2, 9, 14). Nas crianças
Introdução
3
até aos 4 anos de idade, as primeiras manifestações clínicas de toxicidade por fluoreto surgem para concentrações superiores a 0,7 mg/L.
As crianças podem ser as principais lesadas com ingestões de quantidades excessivas de fluoretos através da ingestão em simultâneo da água para
consumo humano, de alguns alimentos, das pastas dentífricas (que acabam por engolir em grande quantidade) e ainda pela suplementação que lhes é
feita nas escolas. Além do mais, as crianças constituem um grupo populacional vulnerável, em virtude da maior ingestão de alimentos face ao seu peso corporal.
Nas últimas décadas ocorreram mudanças significativas nos hábitos alimentares das crianças, aumentando o consumo de bebidas processadas
industrialmente, como os sumos e refrigerantes, que podem conter teores elevados de fluoretos, devido à presença deste elemento nos frutos, nos
vegetais e na água (9, 17).
Em geral, uma alimentação equilibrada, com o fornecimento adequado de alimentos, é suficiente para suprir as necessidades de minerais. Deste modo,
os odontologistas e os médicos dentistas devem ser cautelosos na prescrição de suplementos de flúor na dieta de crianças que consomem quantidades substanciais de sumos, néctares e refrigerantes (9, 17).
Devido ao aumento do consumo de sumos e refrigerantes, a avaliação da
exposição total de fluoretos deve incluir a quantidade consumida das diferentes bebidas e o seu conteúdo em fluoretos (15).
De forma a avaliar a contribuição dos sumos, néctares e refrigerantes na
ingestão diária de fluoretos pretende-se optimizar e validar um método analítico adequado para o estudo da ocorrência de fluoretos nestas amostras,
que podem ser um dos veículos maioritários de fluoretos, principalmente nas crianças.
O aumento do consumo dos produtos alimentares processados, nomeadamente as bebidas, incentivou a fortificação dos alimentos com
vitamina C. Esta vitamina é geralmente, adicionada aos géneros alimentícios como ácido ascórbico, embora a forma natural e sintética sejam quimicamente
idênticas e não apresentem diferenças na sua atividade biológica ou biodisponibilidade (18).
Assim, a utilização de ácido ascórbico como aditivo alimentar tem por
objectivo aumentar o valor nutricional do produto alimentar, bem como permitir a manutenção do sabor, cor e estabilidade (18, 19). Devido às propriedades antioxidantes que detém, o ácido ascórbico prolonga a validade
do alimento ao qual é adicionado pois contribui para o equlíbrio redox (20, 21), muitas vezes perturbado por alguns compostos como os fluoretos.
No entanto, o ácido ascórbico é facilmente oxidado podendo degradar-se
durante o armazenamento de alimentos e bebidas (22). A baixa estabilidade deste antioxidante, em meio aquoso, exige o controlo do seu teor nos géneros alimentícios (20), razão pela qual representa um bom indicador de qualidade
alimentar (23).
Com a crescente preocupação inerente aos efeitos tóxicos das espécies reactivas de oxigénio e restantes radicais livres, os géneros alimentícios que
Introdução
4
apresentam na sua constituição antioxidantes, naturais ou sintéticos, são cada vez mais solicitados pelos consumidores. Neste sentido, a determinação do
potencial redox é uma forma rápida, precisa e económica de estimar a capacidade antioxidante global dos agentes redutores presentes numa matriz alimentar (24).
O pH da maioria dos refrigerantes e sumos de fruta é inferior a 4 (25) como
consequência da adição de conservantes e aromatizantes como o ácido ascórbico, cítrico, tartárico, málico e fosfórico (26). O impacte dos acidificantes na conservação, sabor e acção antimicrobiana está dependente do pH. A pH
baixo há um aumento do efeito da pasteurização e da preservação dos ácidos fracos, o que impede o crescimento microbiano (25).
Contudo, o consumo frequente de bebidas ácidas favorece a diminuição do pH da saliva, diminuindo a sua capacidade tampão, responsável pela protecção
dos dentes da desmineralização do esmalte, pelo que é importante a monitorização do pH em géneros alimentícios susceptíveis de serem
consumidos por crianças durante o desenvolvimento dentário (26, 27).
O estabelecimento de relações entre a ingestão de alguns nutrientes e o
desenvolvimento de doenças nos seres humanos, suscitou a necessidade de desenvolvimento de metodologias de avaliação do perfil de consumo alimentar da população (28).
O Questionário de Frequência Alimentar (QFA) tornou-se o método mais utilizado em estudos epidemiológicos para avaliação da dieta habitual de grandes grupos populacionais, com aplicação simples, rápida e sem grande
esforço económico. Comparado a outros instrumentos, substitui a medição da ingestão alimentar de um ou vários dias pela informação global da ingestão de
um período amplo de tempo (28, 29). Este tipo de questionário visa assim avaliar a frequência com que os alimentos ou grupos de alimentos são consumidos durante um período de tempo pré-definido, podendo ter vertente
semi-quantitativa se incluir a porção ou quantidade consumida do respectivo alimento (28, 29).
Deste modo, este trabalho tem como objectivos:
Implementar e validar um método potenciométrico, usando um
eléctrodo combinado seletivo ao ião fluoreto, para a determinação de
fluoretos em amostras alimentares;
Dosear os teores de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,
bebidas de sumo, concentrados de fruta, chás e infusões
comercializados em Portugal Continental que são utilizados na dieta
infantil;
Caracterizar as mesmas amostras em vitamina C, pH e potencial redox;
Elaborar um questionário de frequência alimentar dirigido a consumo de
bebidas, contendo fluoretos, utilizadas na alimentação infantil;
Fazer um estudo prévio da ingestão diária dos produtos alimentares
analisados por crianças dos 6 a 10 anos através das respostas dadas ao
questionário de frequência alimentar;
Introdução
5
Determinar a dose diária ingerida de fluoretos pelas crianças
relacionando os resultados do inquérito com os teores determinados nas
bebidas.
O presente trabalho foi organizado em capítulos, onde se descrevem os fundamentos teóricos, as metodologias, o desenvolvimento experimental, os
resultados e respectiva discussão e as principais conclusões do trabalho desenvolvido.
O capítulo I apresenta de forma resumida, as características, o metabolismo, as vias de exposição, a ocorrência e a toxicidade do fluoreto.
O capítulo II expõe os aspectos legislativos relevantes na pesquisa de fluoretos em géneros alimentícios.
O capítulo III descreve, sumariamente, o tipo de inquéritos que podem ser elaborados e aplicados para estimar o perfil de consumo alimentar de uma população.
O capítulo IV apresenta os fundamentos teóricos dos métodos analíticos para a
análise de fluoretos em géneros alimentícios e os parâmetros de qualidade utilizados na validação de métodos de ensaio. Refere ainda a metodologia utilizada para a implementação de um inquérito de frequência de consumo
alimentar.
No capítulo V é descrita a metodologia seguida ao longo do trabalho experimental, incluindo equipamento, material, reagentes e preparação de soluções. Inclui, também, as metodologias utilizadas na optimização e
validação dos métodos potenciométrico e espectrofotométrico para posterior análise de fluoretos e de ácido ascórbico, respectivamente, em refrigerantes,
sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. Neste capítulo referem-se, ainda, as metodologias utilizadas na determinação do potencial redox e do pH das amostras em estudo.
O capítulo VI apresenta e discute os resultados obtidos nos ensaios de
validação dos métodos de ensaio e de análise das amostras, assim como, os resultados dos questionários de frequência de consumo alimentar, aplicados a crianças do 1º ciclo de escolaridade, com idades compreendidas entre os 6 e
os 10 anos.
O capítulo VII apresenta as principais conclusões do trabalho realizado.
Capítulo I- Fluoretos
7
Capítulo I – Fluoretos
1. Generalidades
O flúor é o elemento mais leve do grupo 17 da tabela periódica, ocorre como
molécula diatómica na sua forma elementar, tem apenas um isótopo estável e forma sempre iões mononegativos. No grupo dos halogénios é o elemento mais electronegativo e reactivo.
Estima-se que o flúor seja o 13º elemento mais abundante no nosso planeta
(11). Na natureza é ubiquitário e está presente sob a forma de fluoretos (na forma iónica ou associado a outros elementos como o silício, cálcio, sódio, alumínio, enxofre devido às suas propriedades litofílicas (7), os quais podem
ser encontrados, em pequenas quantidades, na água, ar, solo, plantas e animais (13).
O fluoreto está presente nas rochas e no solo, facto pelo qual é muitas vezes associado à actividade vulcânica (3, 30). No solo, o fluoreto ocorre numa
variedade de minerais, como a fluorite (CaF2), a criolite (Na3AlF6) e a chiolite
(Na5Al3F14), formando complexos com o alumínio, ferro, sódio e cálcio. A
mobilidade do fluoreto no solo está dependente do pH, da adsorção de catiões e da concentração de cálcio, ferro, alumínio e fósforo. Em solos ácidos,
predominam complexos de alumínio e fluorsilicatos e em solos alcalinos, o fluoreto de cálcio. A disponibilidade destes complexos solúveis aumenta com a diminuição do pH, pelo que, a elevada solubilidade de fluoreto no solo sob
condições acídicas (pH < 6) é devida à presença de complexos de AlF2+. Assim, a retenção de flúor em solos alcalinos depende em grande parte do
teor de alumínio no solo (2).
A principal fonte natural de fluoreto para os seres humanos é a ingestão de
água subterrânea contaminada por fontes geológicas, principalmente em regiões com actividade vulcânica (concentrações máximas de 30-50 mg/L)
(30, 31). Este tipo de reserva natural de água é seguro a nível bacteriano, no entanto a concentração elevada de determinadas substâncias químicas, como o fluoreto, pode aumentar o risco de toxicidade nas populações (32). Por
exemplo, alguns países da Ásia (Índia, o Sri Lanka e a China), África, América (México), Europa (Espanha, Holanda, Itália e Estónia) e do Médio Oriente
possuem reservas naturais de água com concentrações elevadas de fluoreto (1, 3, 11, 32).
Na água, o fluoreto forma complexos com o cálcio, o magnésio e o alumínio. A concentração de fluoretos na água depende de vários factores, tais como o pH, sólidos dissolvidos totais, alcalinidade, temperatura e profundidade. A pH
inferior a 5, o fluoreto é complexado quase na totalidade com o alumínio. Quando o pH aumenta, aumenta também a formação de hidróxidos,
nomeadamente hidróxido de alumínio, aumentando a concentração de iões fluoreto no meio (1, 3). Por outro lado, a solubilidade do CaF2 aumenta com o
aumento da alcalinidade (presença de carbonatos e bicarbonatos) na água
Capítulo I- Fluoretos
8
(11, 30). Um elevado teor de sólidos dissolvidos totais melhora a força iónica, levando a um aumento da solubilidade do CaF2 nas águas subterrâneas (11).
Normalmente, as amostras de água naturalmente fluoretada (0,4 – 1 mg/L) apresentam valores ligeiramente mais elevados de alguns dos parâmetros de
qualidade da água como a alcalinidade, a dureza e o pH, o que pode afectar a qualidade destas águas tornando-as impróprias para consumo (11).
Na atmosfera, o flúor encontra-se na forma de fluoreto de hidrogénio, o qual é absorvido pelas gotículas de água atmosférica formando um aerossol de ácido
fluorídrico, atingindo posteriormente o solo através do ciclo da água (32). Por lixiviação dos solos, pode penetrar em lençóis freáticos e/ou acumular-se nas plantas. A retenção de fluoreto nos organismos aquáticos pode potenciar a sua
bioacumulação ao longo da cadeia alimentar.
Outras fontes de exposição humana ao fluoreto são a poluição atmosférica das indústrias de alumínio e aço, a combustão de carvão e a utilização de compostos organofluorados (1, 10). Os compostos organofluorados são cada
vez mais utilizados, principalmente em produtos agroquímicos (pesticidas e fertilizantes), produtos farmacêuticos (Prozac), agentes tensioactivos, agentes
de extinção de incêndio, fibras, sprays e em materiais isolantes (Teflon e Gore-Tex). Cerca de 20% dos produtos farmacêuticos e 30-40% dos agrotóxicos são organofluorados (30). Estes compostos possuem um grande
impacte ambiental e na saúde humana e animal porque são contaminantes ambientais persistentes (1, 3, 30).
Uma vez que, o fluoreto está amplamente distribuído no ambiente e as fontes de exposição humana a este ião são muito variadas, tem ocorrido um
aumento muito acentuado da sua acumulação a nível endógeno (10).
2. Metabolismo do flúor
O metabolismo e cinética do fluoreto dependem, principalmente, da
concentração de fluoreto ingerida. Após ingestão de fluoreto, uma parte é retida na boca e incorporada nos dentes por troca iónica, outra entra
directamente na corrente sanguínea através da mucosa oral, mas a maior parte é absorvida no estômago e intestino (33, 34).
Na forma de fluoreto de sódio, composto solúvel presente na água de consumo público, a biodisponibilidade do fluoreto é próxima de 100% sendo
absorvido quase na totalidade no trato gastrointestinal (na ausência de interferentes como o cálcio, magnésio, iodo e alumínio) (11). Porém, se a ingestão é feita a partir do leite ou outras fontes alimentares (ricas em cálcio e
magnésio) a taxa de absorção é reduzida (50-80%), devido à formação de complexos de fluoreto menos solúveis (fluoreto de cálcio, de magnésio e de
alumínio). No entanto, se no momento da ingestão o estômago estiver vazio, a absorção poderá ser total (33, 35).
Capítulo I- Fluoretos
9
O fluoreto é muito electronegativo, o que significa que tem uma forte tendência para formar aniões em solução. Em meio ácido, como ocorre no
estômago (pH=2), o fluoreto é convertido em ácido fluorídrico (HF) (30). Cerca de 40% do fluoreto ingerido é absorvido no estômago na forma de HF (HF, pKa=3,4) (34, 36).
O transporte de fluoreto nas membranas biológicas ocorre principalmente por
difusão simples de HF, uma vez que este composto apresenta um coeficiente
de permeabilidade semelhante ao da água. O HF atravessa as membranas
celulares muito mais facilmente que o ião fluoreto, sendo a permeabilidade da
membrana ao HF 5-7 vezes superior à do fluoreto (30). Na mucosa intestinal,
menos ácida, o HF dissocia-se, libertando os iões fluoreto (11).
Assim, quanto mais baixo for o pH, maior e mais rápida será a absorção, e,
consequentemente, maior será o pico de concentração de fluoretos nos fluidos biológicos (34, 37). Em contrapartida, a absorção de fluoreto inorgânico e
orgânico pouco solúvel é mais difícil, o que diminui consideravelmente a concentração de fluoreto absorvido (11). Deste modo, grande parte das
características fisiológicas dos fluoretos são atribuídas à difusão do HF.
A absorção de fluoreto nas crianças é semelhante à dos adultos, no entanto
não ocorre uma diminuição significativa da absorção de fluoreto na presença de uma dieta rica em cálcio (33).
A absorção intestinal de fluoreto é menos sensível ao pH que a absorção estomacal e pode ocorrer por difusão simples e facilitada (30). A concentração
plasmática de fluoreto apresenta normalmente um pico aos 30-60 minutos após a ingestão e normaliza ao fim de 3-11 horas, dependendo da concentração de fluoreto ingerida (33).
Como o ião fluoreto não estabelece ligação com as proteínas plasmáticas, as
concentrações de fluoreto no plasma e nos fluidos intersticiais são idênticas, o que permite a utilização da concentração plasmática de fluoreto como referência para estimar a concentração extracelular de fluoreto (34).
Quando aproximadamente 50% da concentração ingerida de fluoreto for
absorvida, a concentração plasmática começa a diminuir rapidamente devido à excreção renal de fluoreto e à sua incorporação nos tecidos mineralizados (10, 38).
O fluoreto é distribuído para os tecidos moles (rim, fígado, eritrócitos e coração) e mineralizados (ossos e dentes). Do fluoreto retido nos tecidos,
aproximadamente 97-99% fica retido nos tecidos calcificados. No entanto, a ligação do fluoreto aos tecidos calcificados é reversível. Se a ingestão de
fluoreto diminuir consideravelmente durante um longo período de tempo, a concentração de fluoreto nos ossos diminui bastante devido à mobilização do
fluoreto por troca iónica. Nos tecidos moles, estabelece-se um estado de equilíbrio na concentração de fluoreto intra e extracelular (11, 33, 39)
A absorção de fluoreto pelos tecidos ósseos é maior nas crianças e diminui
com a idade, podendo ser nula a partir dos 55 anos (11). Nos bebés, cerca de
80-90% do fluoreto absorvido é absorvido pelos tecidos, mas nos adultos
apenas 60% é bioacumulado (30).
Capítulo I- Fluoretos
10
O teor de fluoreto no osso é influenciado por vários fatores, incluindo a idade, o tipo de exposição ao flúor e a taxa de renovação óssea. A concentração de
fluoreto no esmalte reflete o nível de exposição durante o período de formação dos dentes, enquanto a concentração de fluoreto presente na dentina e nos ossos está associada a uma exposição crónica ao fluoreto. O aumento da
retenção de fluoreto pelo esqueleto em desenvolvimento deve-se ao baixo fluxo sanguíneo e a uma maior área superficial dos cristalitos ósseos, que são
menores, mais desorganizados e mais numerosos, que no osso maduro (40).
Assim, aproximadamente 50% do fluoreto absorvido é bioacumulado nos
tecidos mineralizados e os restantes 50% são excretados pela urina (35, 39).
A principal via de excreção de fluoreto é através da urina, seguida das fezes,
leite materno, suor e saliva. Estima-se que, apenas, 1% do fluoreto ingerido é excretado na saliva, uma vez que esta é engolida. O fluoreto encontrado nas
fezes corresponde àquele que não foi absorvido e representa cerca de 10% da ingestão diária total de fluoreto em crianças e adultos (33, 41).
O ião fluoreto é filtrado da corrente sanguínea à medida que atravessa os capilares glomerulares, sendo reabsorvido a nível tubular (33).
Vários fatores podem influenciar a excreção renal de fluoreto, como o pH, o fluxo urinário e a taxa de filtração glomerular. O pH da urina é o factor
determinante para a reabsorção de fluoreto nos túbulos renais. A pH ácido, o fluoreto mantem-se na forma de ácido fluorídrico, difundindo mais facilmente
para o fluido intersticial através do epitélio tubular. No fluido intersticial, a pH neutro, o HF seria rapidamente dissociado e os iões fluoreto entrariam de novo na circulação sistémica. Deste modo, quanto mais alcalina for a urina maior
será a excreção deste composto (34).
A dieta pode afetar o pH da urina e, assim, alterar a excreção e bioacumulação de fluoreto (30). Uma dieta vegetariana promove uma urina mais alcalina, o que conduz a um aumento da excreção urinária de fluoreto. Um estudo
realizado na população da Tanzânia confirmou que os indivíduos não-vegetarianos possuem um risco de desenvolvimento de fluorose dentária 7
vezes superior aos indivíduos vegetarianos (41).
Um elevado fluxo nos túbulos renais aumenta a excreção de substâncias com
reabsorção lenta. Da mesma forma, uma diminuição da taxa de filtração glomerular diminui a excreção de fluoreto pela urina. Por exemplo, nos idosos
há uma diminuição significativa da excreção renal de fluoreto como consequência da diminuição da taxa de filtração glomerular (40).
A figura 1 (40) relaciona o metabolismo do flúor com a concentração de flúor no pasma.
Capítulo I- Fluoretos
11
Figura 1. Metabolismo do flúor (absorção, distribuição e excreção do flúor
pelo organismo) em sobreposição com uma curva de concentração de flúor no
plasma.
3. Mecanismo de acção do flúor
O fluoreto é um oligoelemento essencial benéfico para o crescimento ósseo e dentário e para a redução de fracturas ósseas (37).
São várias as características fisiológicas que distinguem o flúor dos restantes halogéneos. O fluoreto combina-se reversivelmente com os protões (H+) para formar um ácido fraco (HF), é um potente inibidor enzimático, possui excreção
mais rápida que os restantes elementos do mesmo grupo, possui grande afinidade com os tecidos calcificados, estimula a formação de tecido ósseo e,
ainda, inibe e reverte o processo de formação da cárie dentária (42).
O fluoreto promove a remineralização e diminui a desmineralização do
esmalte, tornando o dente mais resistente à cárie dentária. Assim, a redução da solubilidade do esmalte não é o único factor envolvido na acção cariostática
do fluoreto (5, 43).
O fluoreto também possui efeitos antibacterianos uma vez que inibe o
processo pelo qual as bactérias cariogénicas (Streptococcus mutans e Streptococcus lactobacillus) metabolizam os hidratos de carbono em ácidos
(por exemplo, acético, butírico, fórmico, láctico), o que resulta num ataque ácido aos tecidos mineralizados provocando a desmineralização e cavitação do dente (5, 44). Na presença de concentrações baixas de fluoretos, há uma
diminuição da produção de ácidos pelas bactérias (5). Assim, o fluoreto tem uma potente acção cariostática (45).
Capítulo I- Fluoretos
12
Por muito tempo prevaleceu o conceito de que seria necessário o uso sistemático (pré-eruptivo) de flúor, e que a acção anticariogénica resultava da
incorporação do fluoreto no esmalte, pela substituição do ião hidroxilo da hidroxiapatita pelo ião fluoreto conduzindo à formação de fluorapatita durante a fase de mineralização dentária, o que deixaria o esmalte mais resistente à
desmineralização (34). Porém, estudos posteriores observaram uma redução da cárie dentária em dentes bastante danificados após o início da fluoretação
da água (5, 33).
O efeito protector do fluoreto em relação à cárie dentária tem uma acção
dupla, actuando na fase pré-eruptiva do dente (sistémica) e pós-eruptiva do dente (tópica) (46).
Na fase pré-eruptiva do desenvolvimento dentário, o fluoreto é incorporado na estrutura mineralizada dos dentes, diminuindo a solubilidade da hidroxiapatita
do esmalte, o que aumenta a resistência à desmineralização ácida. Após a erupção do dente, o fluoreto ingerido é dissolvido na saliva contribuindo para a
resistência tópica do dente devido à sua acção directa na mineralização do esmalte (33, 35).
A saliva contém água, proteínas, cálcio, fosfatos, fluoreto, bicarbonatos e imunoglobulinas, pelo que é importante para a remineralização do esmalte e diluição e neutralização dos ácidos (47).
O mecanismo de acção do fluoreto é, principalmente, tópico mas nos sistemas
de abastecimento de água apresenta uma função sistémica quando absorvido e incorporado nos dentes em desenvolvimento. Assim, o fluoreto traz benefícios na redução da cárie dentária, não só durante o período de
desenvolvimento do esmalte, mas também ao longo de toda a vida do indivíduo uma vez que o ciclo de desmineralização e remineralização do
esmalte dentário é contínuo em todas as faixas etárias (5).
Porém, por si só o fluoreto apenas reduz a perda de minerais, sendo
importante a associação do fluoreto com outras medidas preventivas, como a lavagem dos dentes com dentífricos fluoretados (34).
Nos ossos, por troca iónica, os iões fluoreto formam hidroxifluorapatita, alterando assim a estrutura mineral óssea. Ao contrário dos iões hidroxilo, os
iões fluoreto complexam depois os iões cálcio, formando estruturas electrostaticamente mais estáveis. Ocorre assim uma alteração no perfil de
mineralização, contribuindo para uma densidade e dureza óssea mais elevadas (13, 44).
O fluoreto pode estimular a proliferação das células ósseas (osteoblastos) e aumentar a deposição mineral nos ossos. A incorporação óssea de fluoreto aumenta o tamanho dos cristais (apatita) e, portanto, diminui a solubilidade
dos mesmos. Cristais maiores são mais resistentes ao ataque osteoclástico (osteoclastos são células envolvidas na reabsorção óssea) (47).
Alguns estudos sugerem que a dimensão do cristal é inversamente proporcional à resistência de flexão do fémur. Assim, embora ocorra um
aumento na dureza e massa óssea, a mineralização do osso é alterada e a resistência mecânica do osso diminui. A força dos ossos resulta da interface
entre o colagénio e a fracção mineral, logo alterações na mineralização óssea
Capítulo I- Fluoretos
13
irão afectar a força do mesmo. Os cristais formados após a exposição ao fluoreto não estão associados às fibrilas de colagénio e, portanto, não
contribuem para a resistência mecânica do osso. Como consequência da diminuição da resistência de flexão ocorre um aumento do risco de fracturas não vertebrais (13, 46, 48).
A nível celular, baixas concentrações de fluoreto promovem a proliferação de
osteoblastos, estimulando a formação óssea in vitro e in vivo. A actividade proliferativa do fluoreto nos osteoblastos e também nos ameloblastos é bifásica, sendo mitótica (promove a síntese e actividade de osteoblastos e
ameloblastos) em concentrações na ordem dos micromolares mas inibitória da mitose (inibe a síntese e actividade de osteoblastos e ameloblastos) na ordem
dos milimolares (46).
Por outro lado, elevadas concentrações de fluoreto preveniram a anemia e
infertilidade em ratos provocada pela deficiência de alguns iões, diminuíram a nefrocalcinose induzida pelo fósforo da dieta e a calcificação dos tecidos moles
provocada pela deficiência em magnésio (35).
A dose diária recomendada de fluoreto, para "reduzir a ocorrência de cárie
dentária numa população sem provocar efeitos indesejáveis, como a fluorose dentária", é de 0,05 mg/Kg/dia nas crianças (13, 42, 44).
4. Via de exposição aos fluoretos pela dieta
O fluoreto é utilizado no controlo da cárie dentária há mais de cinco décadas. Desde o início da fluoretação da água, em 1970, este ião ficou disponível para
a população na água de abastecimento público e, desde então, as fontes de exposição ao fluoreto pela dieta aumentaram consideravelmente, o que
aumentou a exposição das crianças ao fluoreto (49)
A água de abastecimento público é, normalmente, a principal fonte de água da
população e, como tal, recorre-se à fluoretação desta para ajudar a prevenir a cárie dentária (32).
Os alimentos e bebidas processadas, a água de consumo público, pastas dentífricas, elixires, suplementos, produtos odontológicos para uso
profissional, pastilhas elásticas e medicamentos são, actualmente, considerados como as maiores fontes de ingestão de fluoreto nas crianças com mais de 12 meses de idade (2, 9, 10, 13). Nos seres humanos, a
biodisponibilidade de fluoreto nos géneros alimentícios é bastante variada, 2-79%. Parâmetros como o pH e o conteúdo mineral dos alimentos podem
alterar a biodisponibilidade do fluoreto nos alimentos (37).
Em algumas regiões, a fluoretação artificial da água inclui a adição à água de
compostos silicofluoretados (silicofluoreto de sódio e ácido fluorsilícico) e fluoreto de sódio (NaF). A pH neutro, o silicofluoreto é dissociado a ácido
sílico, ião fluoreto e fluoreto de hidrogénio (HF) (30). No entanto, este procedimento tem sido alvo de críticas pois algumas águas já apresentam
Capítulo I- Fluoretos
14
naturalmente fluoreto, podendo ser responsáveis pelo aparecimento de fenómenos de toxicidade nas populações. Por outro lado, não é possível
controlar a quantidade de água que cada pessoa vai consumir e, portanto, pode estar a fomentar-se ingestões desajustadas de fluoretos (50).
A nível mundial, a concentração de fluoreto adicionado à água não é igual porque a concentração de fluoreto nas águas não é igual e porque os vários
factores que influenciam a exposição a este ião também são diferentes. Uma concentração de fluoreto de 0,7-1 mg/L na água é considerada óptima na Áustria, contudo é exageradamente elevada no Sudão, onde a fluorose tem
sido observada para uma concentração de 0,5 mg/L de fluoreto na água. Por exemplo, no Senegal é recomendado um teor de fluoreto na água de consumo
público de 0,6 mg/L (11). Nas zonas temperadas do globo, a concentração de fluoreto adicionado à água de consumo público é 1 mg/L, a qual é definida globalmente como a ''concentração ótima" de fluoreto, com um nível máximo
de proteção da cárie dentária e um risco mínimo de fluorose dentária (36).
As crianças até aos 6 meses bebem cerca de 250 mL de água por dia, não só pela ingestão directa de água mas também através da reconstituição do leite em pó, papas e outros produtos desidratados, o que representa,
aproximadamente, 42-45% da ingestão total de fluoreto. Da mesma forma, as crianças dos 6 aos 12 meses ingerem 27-35% de fluoreto através da dieta,
onde 30-42% do fluoreto ingerido está presente na água de consumo público e em géneros alimentícios processados (37).
Deste modo, ao considerar-se os alimentos processados, a água fluoretada tem, indirectamente, um grande impacte na toxicidade do fluoreto quando é usada no processamento de leites, alimentos e bebidas (49).
Os alimentos transformados e alimentos para bebés destinados a lactentes e
crianças jovens são uma grande fonte de fluoreto para as crianças devido à biodisponibilidade quase total do fluoreto, contribuindo para uma maior ingestão diária de fluoreto nas crianças, independentemente da água utilizada
para a reconstituição do produto (37). Em 1979, por causa do interesse sobre a ingestão de fluoreto por crianças, os fabricantes de fórmulas infantis (nos
EUA) concordaram voluntariamente em diminuir a concentração de fluoreto (36).
Os sumos preparados com água fluoretada contêm 0,9-1,3 mg/L de fluoreto, enquanto sumos preparados com água com uma reduzida concentração de
fluoreto (< 0,2 mg/L) contêm 0,2-0,5 mg F/L (2). Em contrapartida, Heilman et al. analisaram a água usada durante o processo de fabrico em refrigerantes e verificaram que a concentração de fluoreto nos mesmos era 11 % mais
baixa que a concentração de fluoreto na água. Isto pode ser justificado pelo facto de a água sofrer um pré-tratamento que promova a diminuição da
concentração de fluoreto (17). Por exemplo, durante a fervura da água a concentração de fluoreto aumenta proporcionalmente à perda de volume, pelo que a concentração de fluoreto na água é aproximadamente o dobro após
ebulição (11, 37).
Nos primeiros meses de vida de uma criança, para além da água, o leite materno pode ser considerado como uma fonte de exposição ao fluoreto. Contudo, mesmo que a mãe esteja muito exposta ao fluoreto pela dieta (>20
Capítulo I- Fluoretos
15
mg/dia), a concentração de fluoreto no leite materno representa apenas 0,2% da concentração total ingerida pela mãe (36, 37).
Isto pode estar relacionado com a biodisponibilidade do fluoreto pois o leite interfere com a taxa de absorção deste anião. O leite e os produtos lácteos
diminuem a disponibilidade de fluoreto em 20-50% no trato gastrointestinal humano devido à presença de elevadas concentrações de cálcio. O leite
também é rico em gorduras, que aumentam o tempo de permanência dos alimentos e bebidas no estômago (37, 51).
O leite de vaca é uma alternativa ao leite materno pois apresenta baixo teor de fluoreto (0,07 a 0,1 mg/L (37), porém a exposição destes animais a elevadas concentrações de fluoreto na água, solo e alimentos pode aumentar
a concentração de fluoreto no leite (36).
Em muitas regiões do mundo os produtos agrícolas (batatas, feijões, tomate, pepinos, melancia, etc.) são grandes fontes de exposição ao fluoreto, sendo que as colheitas são regadas com água de pequenos poços contendo elevadas
concentrações de fluoreto (3, 36) e também porque são utilizados fertilizantes e alguns pesticidas que o contêm.
A maioria dos alimentos tem teores de fluoreto inferiores a 0,5 mg/kg, com excepção dos peixes e mariscos (2,12 mg/kg) devido à inclusão deste ião nos
ossos, escamas e conchas (9). O frango pode conter elevadas concentrações de fluoreto, quando os animais são alimentados com farelos de ossos (0,6-
10,5 mg F/L) (49, 52).
O consumo de água mineral engarrafada faz com que estas se tornem
importantes fontes de ingestão crónica de fluoreto (49), podendo conter concentrações de fluoreto superiores a 1 mg/L (0,1 a 9 mg/L) (2, 53). Deste
modo, considerando que a dose diária recomendada de fluoreto nos adultos é de 0,1 mg/kg, o consumo diário de águas engarrafadas durante três meses poderia facilmente ultrapassar este limite (54, 55).
Na Alemanha, por exemplo, foi avaliado o conteúdo de fluoreto em várias
águas comercializadas, verificando-se que a concentração de fluoreto nas mesmas é muito variada (0,007-4,1 mg/L). No Brasil, um estudo semelhante concluiu que apenas 25% das àguas engarrafadas comercializadas apresentam
menção no rótulo sobre o teor de fluoreto (43).
Por outro lado, os sumos e refrigerantes também podem ser uma fonte de
exposição ao fluoreto pela dieta. Nas últimas décadas ocorreram mudanças significativas nos hábitos alimentares das crianças, aumentando o consumo de
bebidas processadas, como os sumos e refrigerantes, que podem conter concentrações elevadas de fluoreto (0,1 - 1,4 mg/L) (9, 17, 49).
Estudos norte-americanos sugerem que as crianças com menos de 1 ano de
idade consomem diariamente, em média, 85 mL de sumos e outras bebidas processadas por dia, as crianças com 1-2 anos consomem 255 - 348 mL e crianças com 3 - 5 anos consomem 298 - 406 mL (17, 56).
A nível europeu, alguns estudos polacos sugerem que 88% das crianças de 6
meses de idade consomem uma média de 114 mL de sumo por dia e as crianças de 12 meses consomem 208 mL de sumo (15).
Capítulo I- Fluoretos
16
Algumas plantas, principalmente o chá (Camellia sinensis), acumulam fluoreto nos seus tecidos (97%), particularmente nas folhas (3,2-400 mg/ kg), que
após a ebulição fica quase na totalidade disponível no chá (2). O teor de fluoreto nas folhas aumenta com a maturação das mesmas; nas folhas jovens varia entre 100-430 mg/kg, enquanto nas folhas mais antigas pode atingir
concentrações de 530-2350 mg/kg, embora estas últimas não sejam frequentemente usadas para o fabrico de chás e infusões (42, 57).
Deste modo, as pessoas que bebem grandes quantidades de chá podem ser expostas a concentrações elevadas de fluoreto. A concentração de fluoreto nos
chás é variada, podendo atingir máximos de 7 mg/L (2, 42). As infusões são boas alternativas ao chá pois apresentam concentrações mais baixas de
fluoreto (37).
Curiosamente, o teor de fluoreto nos chás e infusões descafeinados (3,19
mg/L) é significativamente mais elevado que nos chás e infusões com cafeína (1,50 mg/L), cuja diferença é atribuída ao uso de água mineral, que contém
naturalmente, um elevado teor de fluoreto, durante o processo de remoção da cafeína (56, 58).
Os produtos odontológicos, como as pastas dentífricas, os elixires e os géis, são também grandes fontes de fluoreto e que podem aumentar o risco de toxicidade, principalmente nas crianças (16).
Desde a sua introdução no mercado europeu nos anos setenta, as pastas
dentífricas enriquecidas com flúor representam 95% dos produtos odontológicos comercializados e conduziram a uma diminuição da incidência de cáries em todos os países europeus (5).
A união europeia homologou que as pastas dentífricas não deviam conter mais
de 1500 mg/kg, no entanto, as crianças com idade inferior a 6 anos, engolem quantidades consideráveis de pasta de dentes, o que contribui consideravelmente para o aumento da ingestão diária de fluoreto (5, 30).
Considerando que a quantidade média colocada nas escovas de dentes, por
crianças com menos de 6 anos de idade (faixa etária sem controlo da deglutição) é de 0,55g e se o dentifrício contém 1000 mg F/L, a exposição ao fluoreto é de 0,55 mg por lavagem de dentes. Em média, 48% dessa
quantidade é ingerida por crianças de 2 - 3 anos, 42% por crianças de 4 anos e 34% por crianças de 5 anos (49, 53).
Assim, recomenda-se aos pais que as crianças iniciem a lavagem dos dentes dos filhos após os 2 anos de idade para evitar a ingestão acidental de pasta
dentífrica, e assim, diminuir o risco de fluorose nas crianças. Além disso, após início da lavagem dos dentes a quantidade de pasta a colocar na escova não deve exceder o tamanho de uma ervilha (0,25-0,3 g) (5).
Os géis fluoretados, utilizados para aplicações tópicas, têm uma concentração
média de 5000 mg/kg (30). A concentração de fluoreto ingerida, após aplicação, oscila entre 10 a 35 mg de fluoreto, quando não é usado o aparelho de sucção, e de 2 a 7 mg, quando o aparelho é aplicado. Embora estas
concentrações excedam os limites estabelecidos como “seguros”, a sua aplicação é realizada com intervalos de tempo de 3 a 12 meses, pois apenas é
utilizado pelo médico dentista. Por outro lado, a aplicação deste tipo de
Capítulo I- Fluoretos
17
produto odontológico é restrita a crianças com elevado risco de cárie dentária (49, 59).
Por fim, os elixires orais contêm concentrações de fluoreto de 230 - 910 mg/kg. A quantidade de solução ingerida após o bochecho é inversamente
proporcional à idade e directamente proporcional à duração e ao volume de solução usado no bochecho (49).
A suplementação de flúor tem como objectivo principal a redução do risco de cárie dentária, devido ao efeito cariostático do fluoreto (30). Contudo, quando
ingeridos inapropriadamente, os suplementos de flúor constituem um fator de risco de toxicidade para as crianças, nomeadamente a fluorose dentária (5, 36).
A prescrição de suplementos de flúor para a prevenção da cárie dentária só
deveria acontecer em áreas onde a concentração de fluoreto na água é inferior a 0,3 mg/L. A suplementação de flúor é recomendada a indivíduos com elevado risco de cárie dentária, sendo que a dose recomendada é de 0,25 mg
de fluoreto por dia em crianças dos 2 aos 6 anos e 0,5 mg de fluoreto em crianças dos 7 aos 18 anos (16).
Deste modo, os odontologistas e os médicos dentistas devem ser cautelosos na prescrição de suplementos de flúor na dieta de crianças que consomem
quantidades substanciais de fluoreto por outras fontes da dieta (9, 17, 49).
O fluoreto também está presente em muitos medicamentos pediátricos, sem que haja uma finalidade clara. Através da análise da concentração de flúor em 114 medicamentos pediátricos líquidos, verificou-se que 99,12% dos
medicamentos apresentaram fluoreto na sua composição, com variações entre 0,0 e 97,8 mg F/L (49).
Um estudo sugeriu que a dose diária ingerida de fluoreto, tendo em conta as várias fontes de exposição (alimentos, bebidas, água, leite de vaca, pasta de
dentes enriquecida com flúor e suplementos de flúor), em áreas naturalmente fluoretadas é 0,11-0,20mg/Kg/dia (3).
5. Toxicidade dos fluoretos
Os indivíduos particularmente susceptíveis aos efeitos adversos do fluoreto são as crianças, os diabéticos, os doentes renais, os indivíduos com
osteoporose, as grávidas ou as mulheres que estão a amamentar e os indivíduos com carência de micronutrientes específicos como o cálcio, o
magnésio, o iodo e o selénio (13).
Os sintomas de uma intoxicação aguda por fluoreto são náuseas e vómitos,
salivação excessiva, diarreia, broncoespasmo, convulsões, coma (12), fibrilhação ventricular e arritmia, pupilas dilatadas, hemoptise, cãimbras,
hipercalemia, hipocalcemia e diminuição da função renal (34). Pode ainda provocar a morte devido ao bloqueio do metabolismo celular pois o fluoreto inibe processos enzimáticos, especialmente das metaloenzimas, responsáveis
Capítulo I- Fluoretos
18
por processos vitais importantes (26, 60). Alguns autores estimam que a dose letal de fluoreto nos humanos é de 32 - 64 mg /kg e que, numa intoxicação
aguda, a dose tóxica é de 5 mg /kg (34).
A ingestão de baixas concentrações de fluoreto, por um longo período de
tempo, está relacionada com alterações graves nas estruturas dentárias e ósseas (5). A ingestão crónica de fluoreto também afecta as células dos
tecidos moles, como por exemplo, as células renais, gónadas (30) e glândula pineal (13, 48), promove alterações comportamentais (diminuição da capacidade motora e de memória) (10), bioquímicas e histológicas (diminuição
da atividade enzimática da colinesterase plasmática, diminuição das células de Purkinje cerebelares e de receptores nicotínicos cerebrais) (34).
As manifestações tóxicas mais comuns dos fluoretos são a fluorose dentária e a fluorose esquelética (5, 33, 61).
5.1 Fluorose dentária
A fluorose dentária está relacionada com a exposição a elevadas concentrações de fluoreto durante o período de formação do esmalte (amelogénese) (13), podendo alterar a qualidade de vida, principalmente, das
crianças (59). O tempo de exposição, a idade, a dose ingerida (14) e a predisposição genética à fluorose dentária determinam a severidade da
fluorose (13).
As amelogeninas, constituem cerca de 90% das proteínas da matriz do
esmalte e estão envolvidas na regulação da forma e tamanho dos cristais de hidroxiapatita, numa reacção dependente de cálcio. Na fase precoce da maturação do dente (fase pré-eruptiva), a exposição ao fluoreto promove a
remoção da amelogenina da matriz do esmalte pelas amelogeninases e, consequentemente, há um aumento da cristalização e tamanho dos cristais de
apatita (5, 36, 62).
No entanto, a exposição a concentrações elevadas de fluoreto diminui a
hidrólise e remoção de amelogenina durante a amelogénese e inibe as proteinases envolvidas na hidrólise de amelogenina pela ligação do fluoreto ao
cálcio, o que resulta numa hipomineralização do esmalte, que se apresenta mais poroso (63-65). A fluorose também provoca lesões na estrutura e função de alguns órgãos, como o cérebro, fígado, rins e medula óssea (66, 67).
A figura 2 (68) ilustra as lesões no esmalte decorrentes da exposição crónica e
aguda aos fluoretos.
Capítulo I- Fluoretos
19
Figura 2: Lesões no esmalte dentário induzidas pela exposição crónica (A) e aguda (B) ao fluoreto. E: esmalte e D: dentina.
A fluorose dentária pode ser moderada ou severa (36) e caracteriza-se pela
hipomineralização da superfície dentária apresentando pigmentação branca no esmalte dentário (FD moderada) e pigmentação castanha (FD severa), podendo evoluir para cavidades dentárias (14), apresentando repercussões
estéticas, morfológicas e funcionais (43). As formas de fluorose menos severas não são esteticamente incómodas e são reversíveis (33).
A figura 3 (31, 69) apresenta dois casos de fluorose dentária severa.
Figura 3: Opacidade e pigmentação do esmalte em formas severas de fluorose dentária .
Capítulo I- Fluoretos
20
As crianças com idades inferiores a 8 anos são mais susceptíveis à fluorose dentária pois é neste período que a maturação do esmalte fica completa e que
ocorre a erupção da dentição permanente (15, 70), pelo que após esta faixa etária a vulnerabilidade à fluorose dentária diminui (36). Porém, esta manifestação de toxicidade do fluoreto pode ocorrer em faixas etárias
superioes, embora o risco seja reduzido (43, 71).
O diagnóstico de fluorose dentária é difícil uma vez que a opacidade do esmalte pode ter várias origens (raquitismo e subnutrição). Os índices descritivos são eficazes no diagnóstico e estabelecimento do grau de
severidade da fluorose dentária (5). Os mais importantes são: o índice de Fluorose Dentária de Dean (DFI) e o índice de Thylstrup-Fejerskov (TFI) (13,
48).
Alguns estudos sugerem que as manifestações clínicas e estéticas da fluorose
são irreversíveis. Porém, alguns autores observaram que a ingestão de uma combinação de cálcio, vitamina D e de ácido ascórbico pode diminuir a
toxicidade do fluoreto. Para além disso, a suplementação com proteína ajuda a controlar o estresse oxidativo induzido pelo fluoreto, apresentando benefícios na função hepática (58).
5.2 Fluorose esquelética
A exposição crónica ao fluoreto (4 – 5 anos) ou a ingestão de elevadas
concentrações de fluoreto (superiores a 3,6 mg/L durante 6 meses) pode desencadear a fluorose esquelética, ocorrendo alterações esqueléticas,
articulares, nefrológicas e neurológicas (13, 14, 72). Por exemplo, na África do Sul e na Índia verifica-se a incidência de fluorose esquelética para uma concentração de fluoreto na água de 8 mg/L (41).
As alterações ósseas mais frequentes são osteosclerose, rigidez nas
articulações, exostoses ósseas, cifose acentuada, calcificação dos ligamentos e osteoporose (35, 72).
Ao contrário da fluorose dentária, as deformações ósseas provocadas pela exposição a elevadas concentrações de fluoreto não ocorrem apenas durante os primeiros anos de vida; contudo, se a exposição ocorrer durante os
primeiros anos de vida ocorrerão deformações ósseas principalmente nos ossos de suporte corporal, como o fémur (31). Por outro lado, a fluorose
esquelética pode ser reversível, mesmo após exposição prolongada, desde que a fonte de exposição seja eliminada (13).
Existem vários factores que contribuem para as deformações ósseas e articulares, sendo a carência alimentar aquele que maior impacte tem na
saúde óssea. Primeiro, a carência de cálcio nas crianças pode agravar a fluorose esquelética e provocar a osteoporose, pelo que uma dieta rica em cálcio pode reduzir os efeitos da exposição ao fluoreto pois diminui a sua
absorção. A subnutrição pode provocar um crescimento ósseo raquítico e
Capítulo I- Fluoretos
21
impedir o desenvolvimento de um esqueleto forte e saudável, o que aumenta a susceptibilidade aos efeitos tóxicos do fluoreto (31).
A figura 4 (31, 72) ilustra as consequências da fluorose esquelética.
Figura 4: Radiografia do antebraço com calcificação do periósteo (membrana
de revestimento ósseo) (A) e deformações ósseas de Genuvalgum numa criança com fluorose esquelética (B).
5.3 Outros efeitos tóxicos
5.3.1 Citotoxicidade
Os epitélios do pulmão, rins, intestino e pele são diariamente expostos ao
fluoreto, no entanto as células do epitélio estão preparadas para suportar agressões externas, pelo que só se verificam efeitos tóxicos se ocorrerem
alterações na formação e desenvolvimento dos tecidos (30, 46).
A acção citotóxica do fluoreto está directamente relacionada com a sua
interação com o cálcio. Por um lado, o fluoreto forma complexos insolúveis com este ião, o que diminui acentuadamente a absorção gastrointestinal de
fluoreto provocando hipocalcemia e inibição de enzimas dependentes de magnésio e manganês (30). Por outro lado, concentrações elevadas de fluoreto aumentam a concentração intracelular de Ca2+ nos eritrócitos,
osteoblastos, túbulos proximais e no epitélio renal (1) uma vez que os ionóferos de cálcio formados pela complexação do fluoreto com o cálcio
Capítulo I- Fluoretos
22
atravessam facilmente a membrana celular, o que poderá induzir apoptose e/ou necrose e diminuir a proliferação celular (1, 30).
Para além disso, muitos complexos inorgânicos são formados entre o fluoreto e os iões metálicos (alumínio e berílio), e representam compostos
biologicamente activos em alguns processos fisiológicos e toxicológicos. A acção biológica é devida à semelhança estrutural destes compostos com o
grupo fosfato, interferindo com os sistemas enzimáticos responsáveis pelos processos de fosforilação e desfosforilação, como as GTPases e ATPases (30).
Também o transporte vesicular desempenha um papel importante no transporte de proteínas transmembranares entre o retículo endoplasmático e a membrana celular, por exocitose ou endocitose. A exposição a elevadas
concentrações de fluoreto pode comprometer este sistema de transporte. A fluorose dentária é um bom exemplo da influência do fluoreto neste tipo de
transporte pois afecta a fase secretora dos ameloblastos, reduzindo a síntese proteica (30).
5.3.2 Toxicidade no tracto gastrointestinal
Á excepção do monofluorfosfato dissódico (principal ingrediente ativo dos dentifrícios), os compostos fluoretados formam HF no estômago e este pode ser irritante para a mucosa gástrica (33). O monofluorfosfato dissódico é
absorvido após hidrólise enzimática por fosfatases, provocando por esse motivo uma menor irritação da mucosa gástrica comparativamente ao fluoreto
de sódio (34).
Alguns autores avaliaram a prevalência de distúrbios gastrointestinais numa
área endémica de fluorose dentária e esquelética na Índia. Verificaram que cerca de 50% da população em estudo era sintomática e que estavam
expostos a uma concentração média de 3,2 mg/L de fluoreto na água de consumo. Concluíram ainda que os pacientes que passaram a consumir água com concentrações de fluoreto iguais ou inferiores a 1 mg/L, os sintomas
gastrointestinais desapareciam após 2-3 semanas (33).
5.3.3 Nefrotoxicidade e hepatotoxicidade
O rim é um órgão muito susceptível a toxicidade aguda pelo fluoreto,
principalmente as células do epitélio do tubo proximal, devido à sua exposição a concentrações elevadas de fluoreto, pois é a principal via de excreção deste
elemento. A presença do enzima gamaglutamiltranspeptidase (-GT) na urina é um indicador de lesão renal (66).
O fígado, devido á sua elevada taxa metabólica, é particularmente susceptível à toxicidade do fluoreto (66). As enzimas aspartato transaminase (AST) e a Alanina transaminase (ALT) são biomarcadores de hepatoxicidade induzida
pelo fluoreto pois este elemento interfere com a actividade destes enzimas. A fosfatase alcalina (ALP) é um enzima marcador da toxicidade do fluoreto e
patologias ósseas, pelo que a diminuição da atividade da ALP no fígado é
Capítulo I- Fluoretos
23
atribuída ao aumento da estimulação osteoblástica após exposição ao fluoreto, uma vez que este interfere no metabolismo das células ósseas (26, 73).
5.3.4 Teratogenecidade
O fluoreto atravessa a placenta e é incorporado nos tecidos do feto. Estudos
experimentais em animais e humanos sugerem que a ingestão de elevadas concentrações de fluoreto durante a gravidez pode induzir alterações ósseas
no feto, no entanto a terotogenecidade pelo fluoreto não está bem esclarecida (33).
5.3.5 Neurotoxicidade
A exposição a concentrações elevadas de fluoreto pode desencadear
fenómenos de neurotoxicidade, como diminuir as capacidades cognitivas, de aprendizagem e memória, diminuir as capacidades motoras, conduzir a
distúrbios comportamentais em crianças (34, 71), promover alterações da função do sistema nervoso central, provocar um défice no QI (33, 74) reduzir a mielina das fibras nervosas, aumentar a apoptose neuronal, alterar os níveis
proteicos e de neurotransmissores e modificar a actividade de algumas enzimas cerebrais (10, 12).
São vários os mecanismos que justificam a neurotoxicidade do fluoreto: 1)
inibição da neurotransmissão mediada por fosfolipases; 2) alterações histológicas, provocando lesões neurodegenerativas, como diminuição do
número e tamanho dos neurónios e diminuição das células de Purkinje cerebelares; 3) aumento do estresse oxidativo; 4) redução da atividade de enzimas, como a acetilcolinesterase cerebral e colinesterase plasmática; 5)
redução dos receptores nicotínicos cerebrais (34, 72) e 6) alterações no metabolismo do glutamato, um neurotransmissor excitatório do hipocampo
responsável pelos processos de aprendizagem e memória (10).
5.3.6 Indução do stresse oxidativo
A exposição excessiva ao fluoreto está associada ao stresse oxidativo, à modulação da homeostase redox intracelular e às alterações no mecanismo de defesa antioxidante. O fluoreto induz a produção excessiva de espécies
reactivas de oxigénio, diminui a actividade de alguns enzimas antioxidantes (catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationo peroxidase (GPx)) e
altera o metabolismo do glutationo (GSH), principalmente a nível cerebral, hepático, renal, testicular e nos eritrócitos (26, 73, 75). Também inibe enzimas da via glicolítica (lactato desidrogenase), do ciclo de Krebs e das
reacções de desfosforilação (adenilato ciclase) (30, 46, 73).
O aumento da concentração de espécies reactivas de oxigénio, para além das lesões oxidativas, inibe as ATPases o que provoca a diminuição da síntese
Capítulo I- Fluoretos
24
celular de ATP, o aumento da concentração celular de ADP, AMP, GDP e fosfato e a alteração do potencial de membrana, perturbando a cadeia
respiratória e a função mitocondrial (30, 76). Há também uma inibição de citocromo C na mitocôndria, que resulta na indução e activação endógena de óxido nítrico (NO), o qual reage com as espécies reactivas de oxigénio, grupos
tiól e metais dos centros activos das proteínas formando aductos nitrosilo. A redução da actividade do citocromo C inibe a respiração mitocondrial devido à
despolarização da membrana mitocondrial (30). O desequilíbrio da homeostase redox induz a peroxidação lipídica (ataque dos fosfoslípidos das biomembranas pelos radicais livres), o que diminui a fluidez e
a permeabilidade membranar e, consequentemente, induz a apoptose celular (75, 76).
As espécies reactivas de oxigénio produzidas pela exposição ao fluoreto também induzem a resposta inflamatória mediada pelos macrófagos, células que participam na formação da placa aterosclerótica, o que faz do fluoreto um
importante factor pró-aterogénico no desenvolvimento de doenças cardiovasculares (75, 76).
5.3.7 Toxicidade do sistema reprodutor
Na Índia, onde a fluorose é endémica, são muitos os casos de infertilidade masculina associada ao fluoreto (77).
A exposição crónica ao fluoreto induz alterações nos níveis das hormonas sexuais, no ciclo menstrual, aumenta o aborto espontâneo e durante a
gravidez diminui a lactação, especialmente em pessoas com fluorose esquelética (33, 77). Os principais efeitos tóxicos do fluoreto na infertilidade
masculina resultam das alterações na estrutura e funcionalidade dos espermatozóides e interrupção da espermatogénese, o que diminui o número de espermatezóides. Para além disso, o fluoreto também interfe com o
metabolismo da hormona da tiróide que, indirectamente, influencia não só a espermatogénese, mas também outras funções reprodutivas (33, 78).
A administração de ácido ascórbico, cálcio e vitaminas D e E beneficia a recuperação das lesões provocadas no sistema reprodutor, principalmente as
lesões oxidativas. No entanto, não reduzem a concentração plasmática de fluoreto, pelo que os seus efeitos benéficos são, na sua totalidade, devido às
suas propriedades antioxidantes (34).
5.3.8 Aumento da toxicidade de metais
O fluoreto pode alterar a absorção, biodisponibilidade e/ou toxicidade do de
alguns metais como o alumínio e o chumbo (33).
O chumbo e o fluoreto possuem uma biodistribuição comum, principalmente
nos tecidos calcificados como o esmalte dentário, o que sugere uma interacção
Capítulo I- Fluoretos
25
biológica entre o chumbo e o fluoreto. Deste modo, a estrutura da hidroxiapatite também pode ser alterada pela substituição do cálcio pelo
chumbo, aumentando a retenção deste metal nos tecidos mineralizados (30, 60). Da mesma forma, o fluoreto pode afectar a concentração de outros metais nos tecidos calcificados como o zinco e o cádmio (60).
A formação de complexos de fluoreto e alumínio aumenta a absorção de
alumínio, que pode provocar maiores alterações neuronais que o próprio fluoreto, mas diminui a absorção de fluoreto, reduzindo assim os efeitos tóxicos deste ião (34). Estes complexos podem ainda funcionar como
activadores das proteínas G e, consequentemente, modular várias vias de sinalização, alterando a expressão genética, a reorganização do citoesqueleto
e o transporte vesicular intracelular e nucleo-citoplasmático (30).
A administração simultânea de arsénio e fluoreto apresenta uma menor
toxicidade no trato gastrointestinal (efeito antagónico), em comparação com a exposição individual a esses agentes tóxicos. No entanto, alguns estudos
sugerem que a exposição a misturas destes dois elementos aumenta o risco de efeitos genotóxicos e diminui o QI em crianças (30).
5.3.9 Desregulação endócrina
A acumulação de fluoreto na glândula pineal com a idade foi associada a fenómenos de desregulação endócrina. A glândula pineal, que também contém
hidroxiapatita, retém o fluoreto da mesma forma que os tecidos calcificados (13).
O fluoreto também promove o aumento ou a diminuição da secreção de insulina, aumenta a libertação de acetilcolina no cérebro e diminui a libertação
de acetilcolina nos gânglios cervicais (30).
A exposição a elevadas concentrações de fluoreto também provoca alterações
na hormona tiroideia, o que induz alterações no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), uma vez que a esta hormona intervém na maturação
pós-natal do sistema nervoso central e periférico (34).
6. Avaliação do risco
A aplicação de um modelo de avaliação de risco quantitativo permite avaliar a existência ou não de risco para a população associada à exposição ao fluoreto,
o qual é susceptível de provocar efeitos adversos na saúde (36).
São usados como biomarcadores de fluoreto: 1) o plasma, osso (mas não é viável em vida), dentes, urina, saliva, esmalte, cabelo, unhas, como biomarcadores de exposição (33, 38); 2) fatores genéticos, marcadores ácido-
base, crescimento ósseo e estado nutricional, como biomarcadores de
Capítulo I- Fluoretos
26
susceptibilidade e 3) redução na atividade e severidade das cáries dentárias, fluorose dentária e fluorose esquelética, como biomarcadores de efeito (50).
O cabelo apresenta vantagens em relação a outras amostras biológicas porque é facilmente recolhido, a recolha da amostra é indolor, fácil de transportar e
armazenar. Além disso, a análise capilar pode fornecer informação sobre a exposição crónica ao fluoreto (3).
As crianças constituem o grupo populacional vulnerável, em virtude da maior ingestão de alimentos face ao seu peso corporal. Logo, a avaliação da
exposição total ao fluoreto deve incluir as várias fontes de exposição a este ião (15).
O NOAEL (dose mais elevada que não provoca nenhum efeito adverso observável na saúde), tendo em conta a manifestação tóxica do fluoreto mais
comum (fluorose dentária) é 0,05 mg F/kg massa corporal/dia (5). Este valor é recomendado para crianças com idade superior a 6 meses; para crianças com idade inferior a 6 meses recomenda-se 0,01 mg F/kg massa corporal/dia
(79) (tabela 1).
O LOAEL (dose mais baixa que provoca efeitos adversos observáveis na saúde), para a fluorose dentária é 0,1 mg F/kg massa corporal/dia (5).
A tabela 1 (35, 70, 79) apresenta os valores da dose diária recomendada para o controlo da cárie dentária nas várias faixas etárias, bem como a respectiva
dose diária tóxica.
Tabela 1: Dose Diária Recomendada (DDR) para uma eficaz proteção da cárie dentária e Dose Diária Tóxica (DDT) com risco de fluorose .
Faixa etária Peso corporal
médio (Kg) DDR* (mg) DDT* (mg)
0 – 6 meses 7 0,01 0,7
7 – 12 meses 9 0,5 0,9
1 – 3 anos 13 0,7 1,3
4 – 8 anos 22 1 2,0
9 – 13 anos 40 2 10
14 – 18 anos 60 3 10
Mulheres ≥ 19
anos 61 3 10
Homens ≥ 19
anos 76 4 10
*: DDR, dose diária recomendada; DDT, dose diária tóxica em relação ao risco de fluorose.
Capítulo I- Fluoretos
27
A dose letal para adultos é 0,20-0,35 g F/Kg massa corporal (80). Em certas
áreas mundiais, em que a concentração de fluoreto ambiental é elevada, a população pode ingerir diariamente até 27 mg de fluoreto (81).
Para além da existência de várias vias de exposição diária ao fluoreto, existem outros factores que dificultam o estabelecimento de um método de avaliação
do risco do fluoreto. Na maioria dos estudos realizados para avaliar os efeitos tóxicos da exposição aguda e crónica ao fluoreto são utilizadas concentrações deste elemento muito superiores àquela a que o ser humano está exposto
diariamente, o que dificulta bastante o estabelecimento de limites de toxicidade. Por outro lado, a grande maioria destes estudos são realizados em
animais adultos jovens e sãos, expostos por um período relativamente curto, enquanto o ser humano está exposto ao fluoreto durante a sua vida inteira (iniciando pelo período intra-uterino), independentemente do seu estado de
saúde (34).
Face ao exposto, as principais medidas recomendadas para diminuir a exposição crónica ao fluoreto por via oral são: 1) a redução da concentração de fluoreto nos produtos odontológicos de uso diário, 2) rotular as embalagens
dos produtos fluoretados com instruções e precauções sobre o seu uso em crianças, 3) controlar a quantidade de pasta dentífrica utilizada para evitar a
deglutição, 4) contra-indicar o uso de elixires em crianças com idade inferior a 7 anos, 5) diminuir o consumo de refrigerantes, sumos e chás, principalmente nas crianças, 6) reduzir a suplementação de flúor em áreas fluoretadas,
natural ou artificialmente e 7) informar a população relativamente aos efeitos tóxicos do fluoreto (17, 32, 52).
6.1 Relação risco vs benefício
A adição de fluoreto à água de abastecimento público foi uma medida simples
e de baixo custo para reduzir a incidência de cárie dentária nas populações, principalmente na crianças (33). Porém, a redução da cárie dentária foi
acompanhada por um aumento da prevalência de fluorose dentária (15, 82) e de outras manifestações tóxicas.
No entanto, relativamente à fluoretação da água (maior fonte de exposição das populações ao fluoreto), vários autores concluíram que: 1) não existem
estudos suficientes que estabeleçam uma relação entre a fluoretação da água e a indução de cancro; 2) o fluoreto na água, em concentrações até 1 mg/L, não aumenta o risco de fraturas; 3) não há incidência de fluorose esquelética
na população exposta até 4 mg/L de fluoreto pela água de abastecimento público; 4) não há aumento do número de doentes renais ou com deficiências
orgânicas quando expostos até 8 mg/L de fluoreto na água de consumo público; 5) não existem efeitos adversos associados, exclusivamente, à fluoretação da água e 6) a exposição a 1 mg/L de fluoreto pela água, a longo
prazo, não induz alterações na densidade e mineralização óssea (5). Porém, também não existem estudos que garantam a total segurança de uma
exposição crónica ao fluoreto, mesmo para concentrações baixas (34).
Capítulo I- Fluoretos
28
Actualmente, as formas menos severas da fluorose são esteticamente aceitáveis, tendo em conta que a fluoretação da água e produtos de higiene
foram e continuam a ser os melhores meios de controlo da cárie dentária nas populações. No entanto, o risco de fluorose deveria ser considerado um problema de saúde pública, pois a presença de fluoreto em várias fontes pode
expor a população a concentrações deste ião acima da dose diária recomendada, contribuindo para um aumento do número de casos de
toxicidade pelo fluoreto (61).
Segundo as avaliações de risco dos nutrientes realizadas pela EFSA, o fluoreto
é o único nutriente sujeitado a uma avaliação da relação risco benefício, isto porque é muito ténue a linha que separa o NOAEL e o LOAEL (13, 71).
Capítulo II- Aspectos legais
29
Capítulo II – Aspectos legais
Ao longo das últimas duas décadas, análise de risco em relação aos nutrientes tem-se destacado no âmbito da investigação científica. Este interesse tem sido
estimulado pela crescente disponibilidade e comercialização de alimentos fortificados, alimentos funcionais e de suplementos dietéticos, bem pela necessidade de harmonização das abordagens internacionais, de forma a
diminuir barreiras comerciais e aumentar a protecção da saúde dos consumidores (13, 48).
A nível internacional, os princípios de análise de risco têm sido adoptados pela Comissão do Codex Alimentarius (CCA), a organização inter-governamental
responsável pelo desenvolvimento de directrizes e normas internacionais que visam a protecção da saúde dos consumidores inerentes à alimentação (13,
48).
Na Europa, a European Food Safety Authority (EFSA), com personalidade
jurídica e independente das demais instituições da União Europeia (UE), presta à Comissão Europeia pareceres científicos independentes sobre todas as
matérias com impacto directo ou indirecto na segurança dos alimentos, com base no Regulamento (CE) nº. 178/2002, que constitui a base jurídica da autoridade (83).
Com vista a prestar apoio científico para o trabalho legislativo da Comissão
Europeia nesta matéria, o Comité Científico da Alimentação Humana (CCAH) emitiu, entre 2000 e 2003, uma série de opiniões sobre os níveis de ingestão máxima toleráveis de vitaminas e minerais e factores de segurança em relação
à sua utilização em alimentos fortificados e suplementos alimentares (77).
Sob o ponto de vista da EFSA, o fluoreto não é essencial para o crescimento e
desenvolvimento humano, mas esta entidade cite a sua importância na redução da cárie dentária (13, 48). A EFSA também não considera o fluoreto
como contaminante alimentar (84), pelo que é permitido a sua adição a alimentos segundo o Regulamento (CE) nº. 1925/2006 e a Directiva
2002/46/EC, relativos à presença de minerais em alimentos fortificados e suplementos alimentares, respectivamente (85, 86).
A Directiva 2008/100/CE (87), transposta pelo Decreto-lei nº. 54/2010 (88), relativa à rotulagem nutricional dos géneros alimentícios, no que respeita às doses diárias recomendadas, factores de conversão de energia e definições,
fixa uma DDR para o fluoreto de 3,5 mg, com base em valores de referência populacionais de vários Estados-Membros e de dados provenientes dos EUA e
com vista a proteger os indivíduos mais susceptíveis (13, 48, 77).
Podem ser usados em produtos de higiene oral 20 compostos de flúor (77). A
união europeia estipulou que as pastas dentífricas não deviam conter mais de 1500 ppm de fluoreto. De acordo com a Directiva 2007/53/CE (89), se a única
fonte de exposição ao flúor for pasta dentífrica com flúor entre 1 000-1 500 ppm, há um risco mínimo de que a pasta dentífrica, desde que se sigam as recomendações de uso, provoque fluorose nas crianças com idade não
superior a seis anos. Posteriormente, segundo a Directiva nº. 2009/129/CE (90), da rotulagem das pastas dentífricas que contenham compostos com flúor
Capítulo II- Aspectos legais
30
numa concentração entre 0,1-0,15 %, calculada como fluoreto, excepto se já se indicar que é desaconselhada a utilização em crianças (por exemplo,
“unicamente para adultos”), deve obrigatoriamente constar a seguinte advertência: “Crianças até aos seis anos: utilizar uma quantidade do tamanho de uma ervilha, com supervisão durante a escovagem para minimizar a
deglutição. Se estiver a tomar fluoreto proveniente de outras fontes, consulte o seu dentista ou o seu médico”.»
Relativamente aos suplementos alimentares de flúor, estes são recomendados pelas sociedades médicas de alguns países para a prevenção de cárie, sendo
que a prevenção e/ou tratamento usando fluoretos, na normalização europeia (91), é considerada como uma reivindicação medicinal e não para fins
nutricionais (13, 48). Porém, na UE é permitida a utilização do fluoreto de cálcio, do fluoreto de potássio, do fluoreto de sódio e do monofluorofosfato de sódio como fontes de fluoreto em géneros alimentícios (por exemplo, o sal) e
suplementos nutricionais, segundo o Regulamento (CE) nº. 1170/2009 (92), que apresenta a lista de vitaminas e minerais que podem ser adicionados aos
alimentos e suplementos alimentares.
Em Portugal, tal como já mencionado, a legislação nacional fixou um valor
paramétrico de 1,5 mg/L de fluoretos na água para consumo humano (8), em concordância com a Directiva 98/83/CE (93), relativa à qualidade da água
para consumo humano e que harmoniza o teor máximo de fluoretos nos vários estados membros. Contudo, a água de abastecimento público é cada vez mais substituída pelas águas engarrafadas, sendo que estas últimas podem conter
um teor máximo de fluoretos de 5 mg/L (94). As águas minerais naturais cuja concentração em fluoreto for superior a 1,5 mg/l devem ostentar, no rótulo, a
menção «contém mais de 1,5 mg/l de flúor: não é adequado o seu consumo regular por lactentes nem por crianças com menos de 7 anos» e incluir a indicação do teor real em flúor (95).
A exposição humana ao fluoreto através de tecidos comestíveis, incluindo a
carne, o leite e os ovos, é reduzida (96). No entanto, a homologação dos teores máximos de substâncias indesejáveis nos alimentos, embora possa contribuir simultaneamente para uma redução da exposição humana a
algumas formas tóxicas, é justificada principalmente pela manutenção da saúde animal (96). Neste sentido, a Directiva 2005/87/CE (97) e o Decreto-lei
nº. 236/2009 (98), que transcreve a directiva mencionada relativa às substâncias indesejáveis nos alimentos para animais, no que respeita ao chumbo, flúor e cádmio, estabelece limites máximos de fluoreto presente em
matérias-primas de origem vegetal e animal destinadas a integrar a alimentação animal.
No que respeita aos refrigerantes, sumos, néctares e outras bebidas não alcoólicas não está estabelecido um valor paramétrico de fluoretos uma vez
que a presença de fluoreto nestes géneros alimentícios está associada, principalmente, à água utilizada durante o processo de fabrico, que deve
obedecer ao estabelecido na legislação vigente (8) relativa à qualidade da água para a preparação de alimentos.
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
31
Capítulo III – Avaliação do consumo alimentar
1. Métodos de avaliação do consumo alimentar
A dieta nacional, bem estabelecida, é a base da definição da política alimentar
nacional (produção, distribuição, consumo dos alimentos necessários) e da promoção da saúde (99). A alimentação está directamente relacionada com a saúde, não só na infância mas também durante a fase adulta, o que justifica o
grande interesse na análise dos hábitos alimentares da população (100).
A alimentação pode ser avaliada sob várias perspectivas que, embora independentes, se complementam: 1) a perspectiva económica, na qual a relação entre a oferta e a procura, os preços dos alimentos e o orçamento
familiar são os principais componentes; 2) a perspectiva nutricional, com ênfase nos constituintes dos alimentos, indispensáveis à saúde e ao bem-estar
do indivíduo (macronutrientes e micronutrientes), nas carências nutricionais e nas relações entre a dieta e a doença; 3) a perspectiva social, centralizada nas associações entre a alimentação e a diferenciação social do consumo, os
ritmos e estilos de vida e 4) a perspectiva cultural, baseada nos gostos e preferências, hábitos, tradições culinárias, práticas, ritos e tabus, isto é, no
aspecto simbólico da alimentação. A união destas perspectivas revela a importância dos factores económicos, sociais, nutricionais e culturais na determinação do tipo de consumo alimentar de uma população (101, 102).
A escolha da metodologia de avaliação do consumo depende de numerosos
factores, tais como a finalidade do estudo, a população alvo, o custo e duração do estudo (103). As técnicas utilizadas para estimar a ingestão dietética podem ser classificadas em dois grupos: métodos quantitativos, como o diário
alimentar e o recordatório alimentar de 24h, que avaliam o consumo do participante num curto período de tempo (dias), e os métodos qualitativos,
tais como a história dietética e o questionário de frequência alimentar, que avaliam o consumo habitual (meses ou anos), permitindo associações com a incidência de determinadas doenças (102). Vários estudos têm demonstrado
uma grande variabilidade entre as metodologias aplicadas na determinação da ingestão diária de nutrientes, o que dificulta a interpretação dos resultados
obtidos, pelo que deve ser realizado um estudo de validação do método precedente à sua aplicação (102, 104).
Nenhum método de avaliação de consumo alimentar está isento de erros, pelo que é de extrema importância minimizar as fontes de erro passíveis de
controlo (105). Existem diversas variáveis que interferem no registo e posterior análise do consumo alimentar, principalmente no que respeita ao entrevistado, nomeadamente a memória, cultura, tabus, estado
socioeconómico e a idade. Para avaliar o consumo alimentar em grandes amostras populacionais, deve-se utilizar instrumentos válidos, económicos e
precisos, sendo necessário aplicar uma metodologia padronizada. A investigação directa do consumo alimentar a partir da aplicação de inquéritos constitui a forma ideal para caracterizar os padrões alimentares vigentes numa
dada população e a sua evolução ao longo do tempo (102).
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
32
Os inquéritos alimentares são métodos eficazes na avaliação qualitativa e quantitativa do consumo alimentar. Através da sua aplicação é possível
observar hábitos alimentares inadequados e o estado clínico e nutricional, o que permite implementar programas de educação alimentar, cuja finalidade é a prevenção de determinadas doenças, especialmente nas crianças e
adolescentes (100, 102).
Os inquéritos alimentares têm em vista um ou mais dos seguintes objectivos no campo da nutrição e da saúde pública (99):
Conhecer e acompanhar a situação alimentar de um país ou de grupos populacionais e as suas variações ou mudanças;
Comparar a alimentação de grupos da população quer pela sua condição sócio-económica (classe baixa, média ou alta), pelo percurso
profissional (com ou sem qualificação profissional) ou pelo meio de residência (meio urbano ou rural);
Averiguar as relações existentes entre o tipo ou nível da alimentação e
a situação económica dos indivíduos;
Averiguar as deficiências alimentares de um grupo da população num determinado período de tempo;
Servir de base para conhecer as necessidades nutricionais humanas ou
para estudos de investigação;
Avaliar se algum ou alguns nutrientes e/ou contaminantes estão a ser
ingeridos em dosagens que excedem os limites admissíveis podendo pôr em causa a saúde e bem estar dos indivíduos de uma determinada população.
É aliás este último tipo de avaliação que tentámos objectivar neste trabalho.
1.1 Diário alimentar
Neste tipo de metodologia de avaliação do consumo alimentar o entrevistado
regista detalhadamente, em formulário próprio, todos os géneros alimentícios consumidos ao longo do dia, nas respectivas porções. O registo deve ser efectuado após a refeição de modo a minimizar o erro associado à memória do
entrevistado. O diário alimentar deve ser realizado por um período não superior a quatro dias consecutivos, para não desmotivar o participante (99,
102, 106).
A principal vantagem inerente a esta metodologia é, então, a independência
em relação à memória do entrevistado. Os dias de registo podem ser meticulosamente distribuídos, proporcionando uma melhor estimativa do
consumo alimentar habitual e o estabelecimento de padrões alimentares numa população (102, 107).
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
33
Contudo, a alfabetização dos participados, a alteração de hábitos alimentares durante o período de execução e a omissão de alguns tipos de alimentos, são
algumas desvantagens associadas ao diário alimentar. Além disso, quando o registo impõe a definição das porções ou quantidades ingeridas, a necessidade de cooperação torna-se ainda maior. Por ser mais oneroso, o recurso ao diário
alimentar para estimar o consumo alimentar é restrito a pequenas amostras populacionais, que apresentam motivação e que sejam capazes de seguir
procedimentos de pesagem e registo adequados (102, 104).
1.2 Recordatório alimentar de 24h
O recordatório alimentar é amplamente utilizado em estudos de investigação de intervenção nutricional e monitorização de dietas terapêuticas. Este tipo de inquérito tem por objectivo a descrição detalhada do consumo de alimentos e
bebidas durante um período de 24 horas (102, 108).
A quantidade ou porção de cada alimento é definida por uma medida padrão (por exemplo, 200 mL) ou estimada através de fotografia ou imagem do produto alimentar (uma embalagem, por exemplo), o que implica a utilização
de nomes comerciais dos produtos alimentares. O recordatório alimentar deve ser aplicado por entrevistadores devidamente treinados, em entrevista
presencial ou via telefone, para uma eficaz padronização dos dados. Quando a população em estudo são crianças, o recordatório alimentar deve ser aplicado ao adulto responsável pela criança (100, 102).
A principal vantagem deste método é a rapidez e facilidade de aplicação, que
se traduz num elevado número de entrevistas com um custo associado muito reduzido. Contudo, não permite estimar a dieta habitual do entrevistado devido às alterações no consumo diário dos alimentos de cada indivíduo (102,
107). Para minimizar o erro associado às alterações diárias e sazonais da dieta, recomenda-se a realização de dois ou mais recordatórios em diferentes
alturas do ano.
Esta metodologia de avaliação do consumo alimentar é frequentemente
utilizada para estimar o consumo alimentar de crianças e adolescentes (106).
1.3 História alimentar
A história alimentar consiste numa extensa entrevista, realizada por
profissionais experientes, a fim de obter um padrão alimentar habitual (meses ou anos), o que implica a descrição exaustiva da quantidade e variedade de alimentos consumidos durante um período de tempo relativamente longo (99,
102, 109).
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
34
O método exige um registo alimentar de três dias constituído por uma lista de alimentos, cuja frequência e periodicidade de consumo devem ser
meticulosamente descritos (102).
Deste modo, a utilização da história alimentar permite uma descrição,
completa e detalhada, dos aspectos qualitativos e quantitativos do consumo dos alimentos. Este método ainda tem como vantagens permitir a avaliação da
ingestão habitual de todos os nutrientes, não está dependente das variações sazonais e diárias na dieta e, por isso, é muito utilizado em ambulatório. De entre as desvantagens da utilização deste método em estudos
epidemiológicos, é possível citar: a dependência da memória do indivíduo sujeito a entrevista; os custos com profissionais, inerentes a toda a análise de
dados e, ainda, o tempo dispensado para a obtenção da história alimentar de um elevado número de indivíduos (102, 107, 109).
1.4 Questionário de frequência alimentar
O questionário de frequência alimentar (QFA) é uma das metodologias
geralmente usadas em estudos epidemiológicos para avaliar a exposição nutricional a longo prazo e as possíveis correlações entre a dieta e o
desenvolvimento de doenças crónicas não transmissíveis (101, 110). Permite a avaliação de tendências e hábitos alimentares de uma população (111) e a identificação de indivíduos com padrões extremos de consumo, durante um
período de tempo definido (por exemplo, um ano ou vários meses) (112). A unidade de tempo mais usada para estimar a frequência de consumo é o ano
precedente, já que prevê um ciclo completo de estações do ano, no qual se inserem as alterações sazonais da dieta (113).
O QFA é composto por uma lista de alimentos e bebidas, podendo ser acompanhada da imagem comercial do produto, cuja frequência de consumo é
questionada ao indivíduo (101). Permite uma estimativa quantitativa do consumo alimentar, uma vez que fornece informação sobre a quantidade diária ingerida de determinados alimentos e/ou nutrientes (102, 114).
Para a elaboração de um questionário de frequência alimentar é necessária uma selecção dos alimentos de acordo com o padrão dietético da população
em estudo, a definição de porções alimentares adequadas às quantidades habitualmente consumidas e a formulação de uma lista com quase todos os
alimentos disponíveis para a população (102).
O número de itens alimentares enumerados no QFA é variável, sendo que
alguns autores recomendam que devem estar compreendido no intervalo de 5 a 350 (101).
Quando o objectivo do estudo é a análise de um ou mais nutrientes, a lista de alimentos pode ser elaborada a partir da identificação dos alimentos com
maior conteúdo do nutriente em questão. No entanto, se o objectivo é a estratificação da população em estudo segundo o seu consumo, a lista de
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
35
alimentos deverá ser constituída pelo maior número possível de alimentos que fornecem os nutrientes pela dieta (113).
Para a elaboração da lista de alimentos podem ser utilizadas diferentes estratégias. A mais simples, porém com maiores limitações, é a selecção dos
géneros alimentícios que contêm os nutrientes de interesse em tabelas de composição de alimentos. Uma outra estratégia corresponde à utilização de
informação epidemiológica que verifique a existência de associações entre o consumo de um determinado alimento e a presença de doença. A terceira abordagem, considerada a mais apropriada, é a obtenção de uma lista não
restrita de alimentos, elaborada através da aplicação de vários registos diários ou recordatórios de 24 horas na população. Posteriormente, é realizada uma
ponderação estatística, tendo em consideração a contribuição do alimento para o consumo total, bem como as diferenças interpessoais da população em estudo (113).
A frequência de consumo é definida em unidades de tempo: dias, semanas,
semestres ou anos, podendo contemplar ou não pequenas subdivisões destas unidades. Sugerem-se questões simples e de resposta fechada, com um número de categorias superior a 5 e inferior a 10, deixando um espaço em
branco para aqueles itens de alimentos que ultrapassam o consumo previsto (por exemplo, “superior a dez vezes por dia” ou “nunca ou inferior a uma vez
por mês”). Um elevado número de categorias permite a inclusão de alimentos minoritários da dieta, com pouca representatividade no consumo diário total, porém importantes para discriminar o perfil de consumo de uma população
(113). Nesse sentido, o número de categorias de resposta, por unidade de tempo, fornece ao entrevistado um grande número de possibilidades de
resposta, o que aumenta a exactidão da estimativa da frequência de consumo alimentar (112).
As categorias frequentemente utilizadas para caracterizar o perfil de consumo neste tipo de inquérito são: mais de três vezes ao dia, 2-3 vezes ao dia, 1 vez
por dia, 5-6 vezes por semana; 2-4 vezes por semana; 1 vez por semana; 1-3 vezes por mês; raramente ou nunca (115).
O QFA apresenta algumas vantagens, nomeadamente, baixo custo, fácil aplicação, capacidade de caracterizar a dieta habitual dos indivíduos, classificando-a de acordo com níveis de consumo e pode ser aplicado a uma
grande amostra populacional (101-103). Comparativamente a outros métodos, o QFA substitui a avaliação da ingestão alimentar de um ou vários
dias pela informação global de consumo por um período de tempo mais abrangente (65).
Pode ser aplicado por um entrevistador ou de auto-preenchimento em formato papel, sendo que esta última modalidade diminui o tempo e o custo do estudo
(116) mas exige o total esclarecimento do participante no que respeita às regras de preenchimento (117). Em estudos cuja amostra populacional inclui crianças, recomenda-se que o QFA seja preenchido pelos pais ou pelo adulto
responsável pela mesma (117).
Existe, ainda, a possibilidade de adaptar o QFA em formato electrónico, o que permite um uso mais eficiente do tempo, a criação directa de uma base de dados, reduz o risco de perda de dados, não há custos com impressão, o
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
36
cálculo do consumo é automático e evita questões sem resposta, estatisticamente denominadas de “missing values” (103, 116).
A determinação do consumo alimentar de forma fidedigna e credível ainda é um desafio, face às dificuldades metodológicas impostas (118). Deste modo,
apesar das muitas vantagens no que respeita à facilidade de aplicação e análise, os QFA apresentam algumas limitações, tais como a possibilidade de
apresentação de uma lista incompleta dos alimentos, o agrupamento erróneo ou inadequado dos alimentos e está sujeito a erros na estimativa da frequência e porções de consumo (99, 105, 118, 119).
Um QFA deve ser desenvolvido e validado tendo em conta a população em estudo, por forma a que este esteja de acordo com o tipo de alimentos que
incluem a dieta habitual, bem como assegurar a total perceptibilidade do questionário pela população alvo (114). Deste modo, os estudos de validação
irão determinar os erros de medição inerentes ao método, o que permitirá garantir uma maior precisão e exactidão dos resultados (113, 120).
A tabela 2 (102, 107) apresenta de forma resumida, as vantagens e desvantagens dos vários métodos de avaliação do consumo alimentar.
A possibilidade de caracterização da dieta habitual de uma criança, a facilidade de aplicação e o baixo custo justificam a escolha do QFA como metodologia de
avaliação do consumo alimentar. Neste sentido, foi elaborado um questionário de frequência alimentar com a finalidade de avaliar o consumo de
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões em crianças dos 6 aos 10 anos de idade. Porém, durante a realização do presente trabalho a falta de tempo impossibilitou a validação prévia do QFA
elaborado. É ainda importante referir que a amostra populacional, à qual o método foi aplicado, não é representativa da população infantil de uma região
ou de Portugal Continental.
Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar
37
Tabela 2: Aspectos comparativos entre os métodos de avaliação do consumo alimentar.
Método de
avaliação do
consumo
alimentar
Vantagens Desvantagens
Diário alimentar
método quantitativo
independente da
memória do entrevistado
permite uma estimativa
mais exacta do consumo
alimentar.
pode modificar os hábitos
alimentares
omissão no registo de
alguns alimentos
exige grande cooperação do
entrevistado
requer motivação do
participante.
Recordatório
alimentar de 24h
método quantitativo
rápido e de fácil
aplicação
baixo custo
exige pouco esforço do
entrevistado
permite determinar a
média e a distribuição do
consumo numa
população.
possibilidade de erros na
estimativa das porções
dependente da memória do
entrevistado
omissão no registo de certos
alimentos
pode não representar o
consumo habitual.
História alimentar
fornece informação
detalhada sobre o padrão
alimentar
permite avaliação da
ingestão habitual de todos
os nutrientes.
dependente da memória do
entrevistado
custo elevado
entrevista é muito longa.
Questionário de
frequência
alimentar
baixo custo e fácil
aplicação
caracteriza a dieta
habitual
permite a aplicação a
um grande número de
indivíduos.
possibilidade de haver uma
lista incompleta dos alimentos
possibilidade de
agrupamento inadequado dos
alimentos
requer memória de hábitos
do passado
método semi-quantitativo
possibilidade de erros na
estimativa da frequência e
porções de consumo.
Capítulo IV- Metodologia analítica
39
Capítulo IV - Metodologia analítica
1. Generalidades
A vasta exposição ao flúor e, consequentemente ao fluoreto, a que a população infantil está sujeita diariamente contribuiu significativamente para a
necessidade de desenvolver métodos analíticos selectivos e sensíveis para o doseamento de fluoretos em bebidas, tendo como base métodos normalizados.
De um modo geral, o método analítico utilizado para a determinação de
fluoretos deve possuir limiares analíticos suficientemente baixos. Para além disso, deve ser específico para evitar interferências analíticas, facilmente aplicado nos laboratórios de rotina e pouco dispendioso.
Paralelalamente foram realizados outros parâmetros da qualidade das bebidas
em estudo, nomeadamente, pH, ácido ascórbico e potencial redox, os quais, complementaram a caracterização das amostras.
2. Métodos de análise de fluoretos em alimentos
Vários métodos são descritos na literatura para a análise de fluoretos, em
água e matrizes alimentares, nomeadamente métodos potenciométricos (elétrodos seletivos a ião fluoreto), métodos cromatográficos (cromatografia
iónica), métodos colorimétricos (SPADNS e Alizarina) (121-123), eletroforese capilar (124) e, mais recentemente, a fluorometria (125). No entanto, de
entre os métodos mais difundidos, encontram-se os métodos colorimétrico e potenciométrico.
Existem métodos normalizados para a determinação quantitativa do ião fluoreto, os quais devem ser implementados em laboratórios de rotina após validação interna, como:
EPA 300.0 e Standard Methods 4110 B (cromatografia iónica) (126, 127);
ISO 10359-1:1992 e Standard Methods 4500-F C (eléctrodo selectivo a
ião fluoreto) (128, 129);
EPA 340.3 e Standard Methods 4500-F E (métodos complexométricos)
(130, 131);
Standard Methods 4500F-D (Método SPANDNS) (132).
Capítulo IV- Metodologia analítica
40
Esta secção apresenta um resumo das principais metodologias analíticas
utilizadas para a determinação do ião fluoreto em soluções, com maior destaque para os métodos potenciométricos, nomeadamente o eléctrodo selectivo a ião fluoreto, o qual foi utilizado no presente trabalho para a
determinação do teor de fluoretos nas bebidas comercializadas em Portugal Continental.
2.1 Métodos colorimétricos
Existem dois métodos complexométricos frequentemente utilizados para a
determinação do ião fluoreto: o método colorimétrico SPADNS ((2-parasulfofenilazo)-1,8-dihidroxi-3,6-naftaleno dissulfonato de sódio) e o
método complexométrico alizarina (133).
O método colorimétrico SPADNS é baseado na reacção entre o ião fluoreto e o
corante zircónio de cor vermelha (reagente SPADNS). O fluoreto forma com o corante um complexo aniónico incolor (ZrF6
2-). A concentração de fluoreto é
inversamente proporcional à cor produzida, ou seja, a cor torna-se progressivamente mais clara quando a concentração de fluoreto aumenta (134), sendo determinada espectrofotometricamente a 550-580 nm.
A reacção entre o ião fluoreto e o corante zircónio é influenciada pela acidez
do meio. A pH ácido, a reacção ocorre instantaneamente e a análise pode ser influenciada pelos iões interferentes (134). O intervalo de linearidade para a quantificação do ião fluoreto por este método é de 0,1 a 1,4 mg/L (132).
É um método que apresenta elevada sensibilidade (122), de rápida execução e
que envolve um custo reduzido (o único equipamento necessário à sua execução, um espectrofotómetro de UV/Vis, é um equipamento bastante utilizado em rotina), o que justifica a implementação deste método para a
análise de fluoretos em rotina (134). Porém, actualmente é pouco utilizado em laboratórios de rotina pois é um método com baixa selectividade (122).
O método SPADNS apresenta como principal vantagem, relativamente aos restantes métodos colorimétricos, a rápida reacção do corante com o ião
fluoreto. Para além disso, o reagente SPADNS também apresenta elevada estabilidade (133).
As principais interferências inerentes a este método colorimétrico são a alcalinidade, o alumínio, o ferro, o cloro residual livre, a cor e turvação, os
fosfatos e sulfatos. Sempre que uma destas substâncias estiver presente em quantidade suficiente para produzir erro de 0,1 mg/L ou na presença de matrizes coradas ou turvas, deve-se destilar previamente a amostra. A
interferência da alcalinidade pode ser reduzida com àcido clorídrico ou ácido nítrico. Relativamente ao cloro residual (agente desinfectante das águas
Capítulo IV- Metodologia analítica
41
consumo público), este deve ser eliminado recorrendo a um agente redutor, como o arsenito de sódio, que é bastante tóxico (134).
No método complexométrico alizarina, os iões fluoreto reagem com o complexo lantânio-alizarina formando o complexo fluoro-lantânio-alizarina. A
reacção é realizada a pH 4,5 e em meio de acetona a 16% (V/V) para estabilizar a cor e aumentar a sensibilidade. A absorvência do complexo
ternário azul é medida a 620 nm (135, 136). O intervalo de linearidade para a quantificação de fluoreto por este método é de 0,1 a 1,5 mg/L (130, 137).
O principal interferente do método da alizarina é o alumínio, que forma com o fluoreto um complexo extremamente estável, pelo que é necessário o tratamento da amostra com 8-hidroxiquinolina e posterior extracção com
clorofórmio. Porém, para teores de alúminio inferiores a 0,2 mg/L, a extracção não é necessária. Analogamente ao método SPADNS, as amostras devem ser
destiladas previamente (136, 138).
Comparativamente ao método SPADNS, o método alizarina possui maior
tempo de análise porque a formação do complexo fluoro-lantânio-alizarina é lenta (aproximadamente uma hora). Os iões sulfato e fosfato constituem
interferências dos métodos colorimétricos (133).
Apesar de apresentarem algumas vantagens, nomeadamente a simplicidade
da metodologia, boa precisão e reprodutibilidade (125), os métodos colorimétricos são cada vez menos utilizados para a análise de fluoretos, não
só por apresentarem algumas interferências, o que diminui a selectividade do método, mas também pela necessidade de pré-tratamento das amostras (39, 139).
2.2 Métodos potenciométricos
Em potenciometria directa mede-se a diferença de potencial entre um
eléctrodo indicador e um eléctrodo de referência, ambos mergulhados na
solução a analisar. O eléctrodo de referência é uma semi-pilha cujo potencial é
independente da solução a analisar. O eléctrodo indicador pode ser um
eléctrodo de membrana selectiva a um dado ião (140, 141).
O eléctrodo selectivo a ião fluoreto é muitas vezes utilizado para a
quantificação de fluoretos na água, poluentes industriais, ar, aerossóis, gases,
solos, urina, soro, plasma, plantas, alimentos, bebidas e outras amostras
biológicas (2).
A concentração de fluoretos é determinada com um elétrodo combinado
selectivo a ião fluoreto, que tem como membrana sensível um cristal de
fluoreto de lantâneo (LaF3) (142, 143), na qual se estabelece uma diferença
de potencial através do cristal quando o eléctrodo está em contacto com uma solução contendo iões fluoreto (144). A diferença de potencial estabelecida
está relacionada com o logaritmo da concentração de fluoreto, obedecendo à lei de Nernst (142, 143) no intervalo de concentrações de fluoreto de 0,1 a
Capítulo IV- Metodologia analítica
42
1000 mg/L, abaixo do qual a solubilidade do LaF3 contribui para a
concentração dos iões fluoreto na solução do analito (145). A medição de
fluoretos é influenciada pela força iónica, pelo pH e por espécies catiónicas polivalentes (141).
A célula electroquímica que incorpora o eléctrodo de membrana de LaF3, pode
ser representada por (142, 143):
Ag|AgCl, Cl (0,1M), F (0,1M)|cristal de LaF3||Solução||Eléctrodo de referência
Os fluoretos formam complexos com os catiões polivalentes, como o cálcio,
magnésio, alumínio e ferro, cuja formação depende do pH da solução, da
concentração de iões fluoreto e da presença de outros compostos
complexantes (146).
A pH ácido há formação de ácido fluorídrico (HF), o que diminui a
concentração de iões fluoreto em solução. Por outro lado, o ião hidróxido é
uma interferência do método de doseamento de fluoreto a pH > 8,
verificando-se a formação de um sólido de hidróxido de lantâneo La(OH)3
segundo a equação (141, 145):
FOHLaOHLaF SS 3)(3 )(3)(3 (equação 1)
Em meio básico verifica-se assim um aumento da concentração de iões de
fluoreto em solução (145). A leitura a pH 5–7 evita estas interferências, uma
vez que a esse pH o fluoreto inorgânico é totalmente ionizado (141).
As interferências pelos catiões polivalentes podem ser eliminadas pela
utilização de ajuste da força iónica, a solução tampão TISAB (Total Ionic
Strength Adjustment Buffer). O ácido trans 1,2-diaminociclo-hexano-N,N,N’,N’
tetracético (CDTA), um dos componentes da solução tampão TISAB, é um
agente complexante mais forte que o fluoreto e por isso complexa os catiões
interferentes, libertando os iões fluoreto em solução e mantendo o pH do meio
(146, 147).
Deste modo, a determinação de fluoretos é sempre efectuada após uma
diluição em partes iguais com uma solução TISAB, que funciona como solução
de acerto e estabilização da força iónica das soluções amostra e padrão,
evitando interferências de catiões polivalentes tais como o Al (III), Fe (III) e
Si (IV), que são capazes de complexar ou precipitar os fluoretos e reduzir a
concentração destes na amostra (2).
Capítulo IV- Metodologia analítica
43
Tabela 3. Interferências mais comuns referentes ao método potenciométrico
para o doseamento de fluoretos.
Substância Concentração
(mg/L)
Tipo de erro
Alcalinidade (CaCO3) 7000 +
Alumínio (Al3+) 3,0 -
Cloretos ( Cl-) 20000
Cloro 5000
Cor e turvação
Ferro 200 -
Hexametafosfato
(NaPO3)6
50000
Fosfato (PO43-) 50000
Sulfato (SO42-) 50000 -
+ erro positivo - erro negativo
As vantagens deste método potenciométrico incluem: a eliminação de pré-tratamento da amostra na maioria dos casos, a redução de possíveis efeitos
de matriz (adição de solução tampão TISAB) (147), um grande intervalo de
linearidade, não é destrutivo e gama de temperatura do eléctrodo é de 0 50 ° C (144, 145).
Actualmente, os elétrodos seletivos a ião fluoretos têm sido amplamente
utilizados no doseamento de fluoretos, substituindo os métodos cromatográficos e espetrofotométricos, que embora mais sensíveis, são mais demorados e substancialmente mais caros. Como estes eléctrodos são fáceis
de usar, relativamente económicos, selectivos e sensíveis e possuem tempos de análise curtos são adequados para a monitorização de fluoretos em
produtos alimentares (2, 122, 144).
3. Análise do pH, do potencial redox e do ácido
ascórbico
A análise de ácido ascórbico nos alimentos é frequentemente utilizada como parâmetro de qualidade alimentar. A literatura existente refere vários métodos
Capítulo IV- Metodologia analítica
44
para a determinação quantitativa de ácido ascórbico nos alimentos, nomeadamente métodos volumétricos, espectrofotométricos, electroforese
capilar de zona e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (21, 22). Porém, de entre os citados, os métodos espectrofotométricos são os mais utilizados não só para a análise de produtos alimentares mas também como
base de comparação para novas metodologias (21, 148).
O método espectrofotométrico do 2,6-diclorofenol-indofenol baseia-se numa titulação usando como indicador o corante 2,6-diclorofenol-indofenol (azul). Neste método, o ácido ascórbico reduz o corante e, no ponto final da titulação,
o excesso de corante não reduzido confere à solução ácida uma coloração rosa, que facilita a visualização do ponto final da titulação, o qual é
quantificado espectrofotometricamente a 500 nm. Esta é uma técnica de fácil aplicação e baixo custo, comparativamente às restantes técnicas (148). Os pigmentos de xileno e as espécies redutores são substâncias interferentes
nesta metodologia, que devem ser eliminadas previamente com hidroquinona e formaldeído respectivamente (149). Esta técnica é referida pela AOAC
(Association of Official Analytical Chemists) para o doseamento de vitamina C em sumos de fruta (148).
As técnicas potenciométricas utilizadas para a determinação do pH e do potencial redox são amplamente utilizadas nos ensaios de rotina e, por isso
muito conhecidas, pelo que se dá uma informação elementar sobre as mesmas.
Para a determinação do pH por potenciometria é utilizado um eléctrodo combinado de vidro uma vez que está menos sujeito a interferências. O eléctrodo de vidro é constituído por um bolbo de vidro sensível à concentração
hidrogeniónica (H+) e contém no seu interior uma solução de ácido clorídrico
(HCl) 0,1M saturada com cloreto de prata (AgCl). Nesta solução está
mergulhado um fio de prata revestido de AgCl formando o eléctrodo de referência(150).
Para um bom funcionamento do eléctrodo a membrana deve estar hidratada. Quando se mergulha o eléctrodo na solução em análise, ocorre um processo
de troca catiónica entre os iões H+ da solução externa e os iões Na
+ ou Li
+ da
membrana de vidro, estabelecendo-se uma diferença de potencial entre o
eléctrodo de vidro e o eléctrodo de referência. Apenas estão envolvidos iões
monovalentes. A concentração de iões H+ no interior da membrana é
constante e a concentração destes iões na amostra em análise é variável, pelo
que é a diferença entre as concentrações interna e externa de H+ que produz
a diferença de potencial que é medida pelo potenciómetro. O pH de uma dada amostra depende da temperatura e ionização da mesma (150).
O potencial redox indica a “proporção” entre as substâncias oxidantes e redutoras presentes no meio, permitindo uma avaliação quantitativa da
tendência do meio para ser oxidante ou redutor. A sua determinação consiste na medição do potencial de um eléctrodo de platina, usando como referência um eléctrodo de calomelanos saturado. A medição do potencial redox é
influenciada pelo pH do meio ou pela presença de iões complexantes (150).
Quanto maior for o potencial redox, mais oxidante será o meio, pelo que as substâncias presentes na solução serão reduzidas (150).
Capítulo IV- Metodologia analítica
45
4. Validação de métodos analíticos
A validação de um método analítico é uma etapa fundamental da garantia da
qualidade analítica. As normas internacionais (ISO) e sistemas da qualidade (Boas práticas de laboratório; ISO/IEC 17025:2005) requerem a validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de validação, para a
obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso pretendido.
Segundo a NP EN ISO/IEC 17025:2005 (151), a validação de uma metodologia analítica é a confirmação através de exame e apresentação de evidência objectiva de que os requisitos específicos relativos a uma utilização
pretendida são satisfeitos”. Ou seja, a validação de um método analítico é um processo dinâmico que permite demonstrar que o método é “adequado” para o
fim a que se destina.
A estratégia a ser seguida na validação de um método analítico apresenta uma
natureza cíclica, de ações e procedimentos, como esquematizado na figura 5 (152, 153).
Figura 5. Natureza cíclica da estratégia a ser seguida na validação de um
método analítico.
Capítulo IV- Metodologia analítica
46
Deste modo, o estabelecimento e optimização de um método analítico exige uma primeira fase de desenvolvimento e validação do método analítico, na
qual se definem e seleccionam as melhores condições analíticas, e uma segunda fase de aplicação do método à análise de amostras (153).
Recomenda-se que a validação de métodos seja adaptada a cada caso, sendo progressivamente mais exigente e exaustiva (grau de validação superior) para
as situações sucessivamente indicadas (151):
a) Método normalizado;
b) Uma modificação menor da técnica, do equipamento ou do tipo de
produto a ensaiar relativamente a uma norma (ou documento normativo) existente; pressupõem-se que neste caso, as alterações não levantam dúvidas sobre a equivalência técnica de resultados;
c) Uma modificação maior da técnica e/ou equipamento e/ou tipo de
produto a ensaiar relativamente a uma norma (ou documento normativo) existente - neste caso, as alterações originam dúvidas sobre a equivalência técnica de resultados;
d) Método baseado em técnicas de ensaio/calibração ou medição
conhecidas, cuja aplicação ao ensaio/calibração pretendida venha descrita em literatura científica, não existindo norma de ensaio/calibração correspondente;
e) Método baseado em técnicas de ensaio/calibração ou medição
conhecidas, mas cuja aplicação ao ensaio/calibração pretendida não venha descrita na literatura científica;
f) Método baseado em técnicas (ou princípios) de ensaio/calibração ou medição inovadoras, não descritas na literatura científica.
Os parâmetros a partir dos quais se efectua a optimização e validação de métodos analíticos são (152, 154):
Seletividade/Especificidade;
Linearidade/Gama de trabalho;
Limiares analíticos (Limites de Detecção e Quantificação);
Sensibilidade;
Precisão;
Exatidão.
Capítulo IV- Metodologia analítica
47
4.1 Selectividade/Especificidade
A selectividade de um método analítico representa a capacidade que esse método possui de identificar e distinguir de forma inequívoca um determinado analito de outras substâncias, nomeadamente interferentes e outros
componentes de uma amostra (152).
Este parâmetro de validação pode ser avaliado através da realização de ensaios de fortificação da amostra ou de soluções padrão com os principais interferentes, verificando que o método não é influenciado pela sua presença
para recuperações de 100%. Quando se desconhecem quais as substâncias interferentes, a selectividade do método pode ser investigada por comparação
dos resultados obtidos com outros métodos (153, 154).
Algumas entidades internacionais, tais como a IUPAC ( International Union of
Pure and Applied Chemistry) (155) dão preferência ao termo “selectividade”, reservando a terminologia “especificidade” para procedimentos que são
completamente selectivos. Neste sentido, a especificidade refere-se a um método analítico específico para um determinado analito enquanto a seletividade reporta um método utilizado para a determinação de vários
analitos com capacidade de distinção entre eles.
4.2 Linearidade
A linearidade de um método é a capacidade de produzir resultados de ensaios que sejam directamente proporcionais à concentração de analito nas
amostras, num determinado intervalo de concentração (152).
A linearidade pode ser observada através da representação gráfica do sinal instrumental em função da concentração do analito (curva de calibração) ou
recorrendo a uma regressão linear pelo método dos mínimos quadrados (anexo 3) (156).
Os coeficientes de correlação linear são frequentemente utilizados para avaliar a linearidade de um método, porém estes parâmetros por si só não são
suficientes para justificar a linearidade de um método analítico. Devem por isso ser efectuados outros testes de linearidade, nomeadamente o teste dos
valores normalizados (anexo 4), o teste de análise de resíduos (anexo 5) e o teste de Mandel ou teste de Fisher/Snedecor (anexo 6)(156).
Capítulo IV- Metodologia analítica
48
4.3 Gama de trabalho
A gama de trabalho de um método analítico é definida como o intervalo de concentrações do analito de uma amostra (limites inferior e superior), para o
qual o método analítico é preciso, exacto e linear. É normalmente mais extensa que a gama de linearidade e é expressa nas mesmas unidades dos
resultados obtidos pelo método analítico (152, 154).
O Guia Relacre 13 (152) relativo à validação de métodos internos de ensaio
em análise química recomenda a avaliação da gama de trabalho através do teste de homogeneidade de variâncias (anexo 7) e a utilização da norma ISO 8466-1 (156) para modelos lineares e da norma ISO 8466-2 (157) para
modelos polinomiais. Se VT ≤ F ( n-1, n-1; 0,99), a diferença entre as variâncias não é significativa, então a gama de trabalho está bem ajustada.
A gama de trabalho deve incluir o intervalo de concentrações do analito na matriz em estudo, a concentração de cada amostra deve situar-se numa zona
robusta da curva de calibração e o limite inferior da gama de trabalho de ser igual ou superior ao limite de quantificação do método (157).
4.4 Limiares analíticos
Os limiares analíticos do método incluem o limite de detecção e o limite de
quantificação. São parâmetros de sensibilidade do método de análise, dependentes do analito e da matriz da amostra, e que devem ser
determinados a cada novo desenvolvimento metodológico.
4.4.1 Limite de detecção (LOD)
De acordo com a IUPAC (155), o limite de detecção, expresso em
concentração de analito, define-se como a concentração mínima de analito medida que é possível detectar com razoável certeza estatística num
determinado método analítico. Ou seja, a determinação do limite de detecção permite a estimativa da concentração a partir da qual a detecção do analito pode ser distinguida do ruído instrumental, não permitindo por isso uma
determinação quantitativa exacta do mesmo (153).
O limite de detecção pode ser matematicamente definido por:
03 SLOD (equação 2)
Em que,
Capítulo IV- Metodologia analítica
49
Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.
Em métodos analíticos cuja metodologia requer a utilização de uma curva de
calibração, o limite de detecção pode ser determinado a partir do desvio padrão residual da curva de calibração, segundo a expressão matemática:
b
xy
SLOD
3 (equação 3)
Em que
Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da
solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.
b Declive da curva de calibração.
4.4.2 Limite de quantificação (LOQ)
O limite de quantificação é uma característica de ensaios quantitativos definido
como a menor concentração do analito que pode ser quantificada numa amostra com precisão e exatidão aceitáveis, nas condições experimentais
definidas (153). Pode ser calculado através da expressão:
010 SLOQ (equação 4)
Em que
Desvio padrão correspondente a várias leituras (entre 10 e 20) do branco ou da solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.
Em métodos analíticos cuja metodologia requer a utilização de uma curva de calibração, o limite de quantificação pode ser determinado a partir do desvio padrão residual da curva de calibração, segundo a expressão matemática:
Capítulo IV- Metodologia analítica
50
b
xy
SLOQ
10 (equação 5)
Em que
Desvio padrão residual da curva de calibração.
b Declive da curva de calibração.
A gama de concentrações entre o limite de detecção e o limite de
quantificação deve ser entendida como uma zona de detecção qualitativa, e não quantitativa, pelo que não se devem reportar valores numéricos nesta gama de concentrações bem como, na gama de trabalho, o primeiro padrão
de calibração deve corresponder ao limite de quantificação.
4.5 Sensibilidade
Sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da resposta instrumental em função da concentração do analito, permitindo avaliar a
capacidade de um método para distinguir pequenas concentrações de um analito. Pode então ser definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido ΔL e a variação da concentração ΔC correspondente a esse acréscimo
(153, 155).
C
LadeSensibilid
(equação 6)
A sensibilidade depende da natureza do analito e do método utilizado, sendo
que em método cuja sensibilidade é elevada qualquer diferença na concentração do analito, mesmo que pequena, provoca uma grande variação
do sinal instrumental medido.
4.6 Precisão
A precisão de um método analítico define-se como o grau de concordância entre resultados de vários ensaios independentes obtidos nas mesmas
Capítulo IV- Metodologia analítica
51
condições experimentais, permitindo avaliar a dispersão dos resultados dos ensaios sobre uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões (158).
É geralmente expressa em desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) do resultado dos ensaios experimentais, sendo que
grandes valores de desvio padrão estão associados a uma baixa precisão analítica. O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a
metodologia utilizada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método de ensaio, não se admitindo valores superiores a 10% (152, 153).
A dispersão dos resultados é verificada através da repetitividade, da precisão intermediária e da reprodutibilidade (152, 153).
No entanto, durante este trabalho apenas foram realizados estudos de
precisão de índole intralaboratorial, ou seja, em condições de repetibilidade e precisão intermédia.
4.6.1 Repetibilidade
A repetibilidade exprime a precisão de um método analítico através da
realização de ensaios em condições idênticas, nomeadamente no mesmo laboratório, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, reagentes
e realizados em curtos intervalos de tempo, permitindo avaliar a variabilidade dos resultados associada a erros aleatórios (152, 153).
A precisão em condições de repetibilidade é expressa em termos de desvio
padrão (DP) ou desvio padrão relativo (DPR), a partir do qual calcula-se o limite de repetibilidade (r), definido como o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade específica (95%), a diferença absoluta entre
dois resultados de ensaio (159).
O limite de repetibilidade (r) pode ser calcula segundo a expressão:
rSr 8,2 (equação 7)
Em que
Desvio padrão, calculado a partir dos resultados obtidos em condições de repetibilidade.
Capítulo IV- Metodologia analítica
52
O Coeficiente de variação de repetibilidade ( ) ou desvio padrão relativo da
repetibilidade ( ) para cada nível de concentração, expresso em
percentagem é obtido por (152):
100)( x
SDPRCV r
rr (equação 8)
Em que
Concentração média do analito obtida em condições de repetibilidade.
Em rotina, a avaliação da precisão (repetibilidade) faz-se através da análise de
duplicados. A percentagem (%) da diferença de duplicados (DD) é calculada através da seguinte equação:
100% x
DDD (equação 9)
Em que
Diferença entre a concentração de analito obtida na análise de duas réplicas, |X1 -X2|.
Concentração média de analito (análise das duas réplicas, X1 e X2)
4.6.2 Precisão intermédia
A precisão intermédia expressa a precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo
laboratório ou em laboratórios diferentes, mas definindo exactamente as condições a variar, podendo estas incluir o analista, o equipamento e o intervalo de tempo (normalmente maior que em condições de repetibilidade)
(152, 153).
Capítulo IV- Metodologia analítica
53
4.6.3 Reprodutibilidade
A reprodutibilidade refere-se à precisão de um método efectuado em
condições diferentes, sobre uma mesma amostra fazendo variar as condições de ensaio. Nesse sentido, avalia o grau de concordância entre os resultados de
ensaios obtidos em laboratórios diferentes e em estudos de colaboração (152, 153).
Este parâmetro de avaliação da precisão é expresso em desvio padrão de reprodutibilidade, o qual permite calcular o limite de reprodutibilidade (R)
definido como o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade específica (95%), a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio, em condições de reprodutibilidade (159).
O limite de reprodutibilidade (RL) pode ser calculo segundo a expressão:
LRL SR 8,2 (equação 10)
Em que
Desvio padrão, calculado a partir dos resultados obtidos em
condições de reprodutibilidade.
O Coeficiente de variação de reprodutibilidade (CVRL) ou desvio padrão relativo da reprodutibilidade (DPRRL) para cada nível de concentração, expresso em percentagem é obtido por:
100)( x
SDPRCV RL
RLRL (equação11)
Em que
Concentração média do analito obtida em condições de
reprodutibilidade.
Capítulo IV- Metodologia analítica
54
4.7 Exactidão
A exactidão é definida como o grau de concordância entre o resultado de um
ensaio e o valor de referência aceite como convencionalmente verdadeiro, cuja avaliação está dependente (152, 153).
A exactidão é normalmente avaliada através de:
Materiais de Referência Certificados (MRC)
Ensaios interlaboratoriais
Testes comparativos
Ensaios de recuperação
Este parâmetro de validação analítica é geralmente expresso em percentagem
de recuperação de amostras em ensaios de fortificação ou em percentagem de erro relativo entre o valor medido e o valor aceite como verdadeiro, segundo
as seguintes expressões (152):
100(%)Re
PP
AARR
VC
VCVCc (equação12)
Em que
Concentração do analito na amostra fortificada.
Volume de amostra fortificada.
Concentração do analito na amostra.
Volume de amostra.
Concentração do padrão de fortificação.
Volume do padrão de fortificação.
E,
100)(
(%)
v
vlab
X
XXEr (equação13)
Em que
Capítulo IV- Metodologia analítica
55
Valor obtido experimentalmente (ou a média aritmética de valores
obtidos).
Valor aceite como verdadeiro, ou seja, o valor do material de referência interno ou do material de referência certificado.
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento do intervalo de linearidade e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mínimo, nove determinações contemplando a gama de trabalho
do procedimento, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta, em triplicado.
4.8 Descrição de métodos analíticos
Os métodos analíticos a validar no presente trabalho têm como principal
objectivo a determinação dos teores de fluoretos e de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões consumidas por crianças dos 6 aos 10 anos.
O procedimento de validação dos métodos de doseamento de fluoretos e de ácido ascórbico foi elaborado com base em guias Eurachem (153-155), guia
Relacre 13 (152) e normas nacionais e internacionais (151, 156-158, 160) utilizadas neste tipo de procedimentos.
Para o doseamento de fluoretos seleccionou-se um método do Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 4500-F C) (128, 150).
Para o doseamento de ácido ascórbico seleccionou-se um método espectrofotométrico, método do 2,6-diclorofenol-indofenol (NP-3030, 1985) (149).
Para a determinação do pH seleccionou-se um método do Standard Methods
for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 4500-H+ B)
(150, 161).
Para a determinação do potencial redox seleccionou-se um método do
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 2580) (150, 162).
Capítulo IV- Metodologia analítica
56
5. Questionário de frequência alimentar
Considerando a inexistência de trabalhos nacionais utilizando o questionário de
frequência alimentar (QFA) para a avaliação do consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões por crianças e a necessidade de aperfeiçoar a avaliação do consumo por este grupo, foi
desenvolvido um questionário de frequência alimentar para crianças dos 6 aos 10 anos de idade (anexo 9).
O principal objectivo da elaboração de um inquérito de frequência de consumo alimentar neste grupo etário foi avaliar a ingestão diária destes produtos e,
consequentemente, estimar a dose diária ingerida de fluoreto por esta via de exposição.
O questionário de frequência de consumo alimentar desenvolvido no âmbito deste estudo teve como modelo um questionário de frequência de consumo
alimentar desenvolvido pelo departamento de alimentação e nutrição do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (163).
5.1 Selecção dos géneros alimentícios
A selecção dos géneros alimentícios a colocar no QFA é feita com base no consumo dos mesmos por crianças dos 6 aos 10 anos de idade. Existe uma
extensa gama de bebidas destinadas ao consumo infantil e, ainda, muitas outras, que embora não o sejam, são susceptíveis de fazer parte da dieta das crianças.
Assim, os géneros alimentícios foram agrupados em sete grupos: refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e
infusões, segundo a Directiva 2001/112/CE (164) e a Portaria nº 703/96 (165) (anexo 2).
5.2 Elaboração de um questionário de frequência
alimentar
No presente estudo, as informações de cada criança foram obtidas através de
um questionário em papel de preenchimento pelos pais ou encarregados de educação das mesmas, englobando questões que permitem a identificação da
criança, o conhecimento do seu historial clínico, nomeadamente de higiene e saúde oral, e a obtenção de informação sobre a frequência de consumo de
bebidas. Para o preenchimento do mesmo, foram considerados os seis meses anteriores à aplicação do QFA.
O questionário foi dividido em duas partes. A primeira parte contempla dezassete questões que recolhe informação pessoal de cada participante, tais como o nome da escola que frequenta, o concelho e localidade de residência,
Capítulo IV- Metodologia analítica
57
ano de escolaridade e idade, género, peso (kg) e altura (cm), o número de elementos do agregado familiar e a escolaridade dos pais, se toma ou não
habitualmente medicamentos, se utilizou ou não no último ano suplementos de flúor ou elixires orais, se utiliza ou não pasta dentífrica enriquecida com flúor, a frequência diária de lavagem dos dentes, se já teve ou não diagnóstico
de cáries e, por fim, o número de refeições diárias que faz fora de casa. A segunda parte possui o questionário de frequência de consumo alimentar,
apresentando questões relativas à frequência e quantidade de consumo das bebidas seleccionadas.
A segunda parte do QFA exige a estruturação dos géneros alimentícios de forma clara e objectiva para o participante, a definição de porções e
frequência de consumo.
5.2.1 Elaboração de uma lista dos géneros alimentícios
De entre os vários produtos comercializados, importa avaliar a frequência de consumo de bebidas para consumo infantil ou que são susceptíveis de serem consumidas pelas crianças. Neste sentido, foi realizada uma pesquisa relativa
às bebidas comercializadas em grandes superfícies das regiões de Lisboa e Santarém.
Foram seleccionados vários tipos de bebidas, num total 159 produtos de diferentes marcas e sabores, representativos da totalidade da oferta no
mercado. Após selecção e identificação das bebidas a incluir no QFA, foi definida e estruturada a lista de bebidas, as quais foram divididas em sete grupos de acordo com o tipo de produto que representam, nomeadamente
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões (Tabela 4).
Tabela 4: Caracterização do tipo de bebidas incluídas no questionário de
frequência alimentar.
Grupo de bebida Número de amostras
seleccionadas
Refrigerantes 76
Sumos 16
Néctares 10
Bebidas de sumo 35
Concentrados 17
Chás 2
Infusões 3
Total 159
Capítulo IV- Metodologia analítica
58
5.2.2 Definição de porções e da frequência de
consumo
Com o objectivo de facilitar o preenchimento do QFA e, assim, reproduzir dados mais exactos do consumo do participante, cada bebida tem associada uma porção padrão, correspondendo a uma porção habitualmente consumida
em casa (um copo de 200 mL) ou equivalente a uma embalagem (uma lata de 330 mL, um pacote de 200 mL).
A frequência de consumo foi definida como número de vezes por dia, semana ou mês. Nesse âmbito, foram definidas dez categorias como opção de
resposta, nomeadamente: 1) dez ou mais vezes por dia, 2) oito a nove vezes por dia, 3) cinco a sete vezes por dia, 4) dois a quatro vezes por dia, 5) uma
vez por dia, 6) cinco a seis vezes por semana, 7) duas a quatro vezes por semana, 8) uma vez por semana, 9) uma a três vezes por mês e 10) nunca ou inferior a uma vez por mês.
Cada participante indica uma das dez categorias para cada bebida correspondente à sua frequência de consumo e na ausência de preenchimento
assume-se a décima categoria definida (nunca ou inferior a uma vez por mês).
5.2.3 Aplicação do questionário de frequência alimentar
Os questionários de frequência alimentar foram realizados em 217 alunos dos 5 aos 10 anos de idade de escolas do 1º Ciclo do Ensino Básico dos distritos
de Santarém e de Lisboa. Os QFA foram aplicados entre os meses de Maio e Outubro de 2011, o que justifica que algumas crianças do 1º ano ainda não
tenham completado os 6 anos de idade. Participaram no estudo duas escolas do distrito de Santarém, uma privada (escola A) e outra de ensino público (escola B), que enquadram a categoria de região rural. Ainda foram
consideradas duas escolas do distrito de Lisboa, uma pública (escola C) e outra de ensino privado (escola D), às quais foi atribuída a categoria de região
urbana (Tabela 5).
Após selecção das escolas foi realizado o convite para participação no estudo
através de entrevista presencial e entregue documento com os objectivos e síntese do presente estudo aos órgãos de gestão da escola (anexo 8).
Capítulo IV- Metodologia analítica
59
Tabela 5: Distribuição dos participantes por escola e distrito.
Escola Localização Número de
participantes
Região
rural
A Torres Novas
Distrito de Santarém 51
B Alcanena
Distrito de Santarém 72
Região
urbana
C Alvalade
Distrito de Lisboa 70
D Lapa
Distrito de Lisboa 24
É importante salientar que os pais e/ou encarregados de educação dispunham de todo e qualquer esclarecimento inerente ao preenchimento do questionário
de frequência alimentar na primeira folha que precede a primeira parte do questionário, bem como o objectivo do presente estudo em folha anexa ao
QFA.
5.3 Análise estatística dos dados
A análise dos dados é realizada através da utilização do programa informático de análise estatística SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versão
18.0 para a Microsoft Windows©.
Todos os dados contemplados nos questionários de frequência alimentar são
detalhadamente inseridos numa base de dados no mesmo programa, com vista a armazenar e tratar informaticamente a informação do QFA.
Na análise estatística, recorreu-se inicialmente à estatística descritiva dos dados, a qual consiste na recolha, organização, análise e interpretação de
dados empíricos através da determinação de medidas de localização e dispersão. Assim, para descrever as variáveis em estudo são utilizadas
frequências relativas e absolutas (%) e percentis (variáveis qualitativas) e média, mediana e desvio-padrão (variáveis quantitativas).
Numa segunda fase, foi realizada a estatística inferencial que visa retirar conclusões inerentes à população em estudo, com base na análise dos resultados obtidos para um ou mais subconjuntos (amostras ou variáveis
compostas), através de testes T e regressão binária logística. As relações entre variáveis são estatisticamente significativas para valores de p inferiores
a 0,05.
Capítulo V- Parte experimental
61
Capítulo V – Parte experimental
1. Equipamento e material
1.1 Equipamento
Balança Mettler Toledo, modelo AB204-S.
Balança Mettler Toledo, modelo P1210.
Banho ultrasons, Selecta.
Centrifuga Sigma, modelo 2K15.
Eléctrodo combinado de pH, Crison.
Eléctrodo combinado seletivo de fluoretos Thermo Scientific, modelo
9609BNWP.
Espectrofotómetro UV-Visível Hitachi, modelo U-2000.
Placa de agitação e aquecimento, com agitador magnético (com
revestimento de teflon) Cole Parmer, modelo 04644.
Potenciómetro Metter, modelo GLP22.
Sistema de obtenção de água desmineralizada, resinas de leito misto, Desminágua.
Sonda de potencial redox Eutech Instruments, modelo GE7960201B.
Sonda de temperatura, Crison.
Vortex Heidolph Reax, modelo 2000.
1.2 Material
Nesta secção descreve-se apenas o material específico utilizado no presente estudo e não, o material de uso corrente de laboratório.
Células de vidro com percurso óptico de 1 cm, LightPath Optical.
Micropipetas de 200 μL e 1000 μL, Gilson.
Tubos de centrífuga com rosca, PVC, 50 mL, Sarstedt.
Capítulo V- Parte experimental
62
2. Reagentes
No âmbito deste trabalho entende-se por reagente qualquer substância ou solução de uma dada marca comercial. As soluções preparadas no laboratório
serão apresentadas na secção 3 (soluções).
2.1 Análise de fluoretos
2.1.1 Reagentes gerais
Água desmineralizada, condutividade inferior a 1 S/cm.
Acetato de sódio anidro (CH3COONa), 99%, Carlo Erba.
Ácido 1,2-ciclo-hexilenodiaminotetraacético(CDTA), 99%, Merck.
Ácido acético glacial, (CH3COOH), 99,9%, Carlo Erba.
Cloreto de sódio (NaCl), 98%, Farma-Química.
Hidróxido de sódio (NaOH), 98%, Panreac.
2.1.2 Padrões
Fluoreto de sódio anidro (NaF), 99%, Merck.
2.1.3 Controlos
Solução mãe controlo de ião fluoreto (1000 mg/L), Eutech Intruments.
2.2 Análise de ácido ascórbico
2.2.1 Reagentes gerais
Água desmineralizada.
Acetato de sódio anidro (CH3COONa), 99%, Carlo Erba.
Ácido acético glacial, (CH3COOH), 99,9%, Carlo Erba.
Ácido ascórbico (C6H8O6), 99,7%, Panreac.
Ácido metafosfórico (H3PO4), 33,5-36,5%, Sigma-Aldrich.
Hidrogenocarbonato de sódio, (NaHCO3), 99,5%, Merck.
Sal sódico do 2,6-diclorofenol-indofenol (OC6H2Cl2NC6H4ONa), 90%,
Riedel-de Haën.
Xileno (C6H4(CH3)2), mistura de isómeros, 96%, António M.S. Cruz.
Capítulo V- Parte experimental
63
2.3 Determinação do pH
2.3.1 Padrões de calibração
Solução tampão pH=7,01±0,01 (25 ºC), Hanna Instruments. Solução tampão pH=4,01±0,01 (25 ºC), Hanna Instruments.
2.3.2 Controlos
Solução tampão pH=6,0±0,05 (20 ºC), Merck. Solução tampão pH=6,8±0,05 (20 ºC), Carlo Erba.
2.4 Determinação do potencial redox
2.4.1 Padrões de calibração
Padrão ORP Pretreatement 475 mV, Eutech Instruments.
Padrão ORP Quinydrone 86 mV, Eutech Instruments.
2.4.2 Controlos
Padrão ORP Quinhydrone 255 mV, Eutech Instruments.
3. Soluções
3.1 Análise de fluoretos
Todas as soluções são preparadas e armazenadas em frascos de polietileno. As soluções são armazenadas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
3.1.1 Soluções gerais
Solução de acetato de sódio a 15%
Dissolver 150 g de acetato de sódio (CH3COONa) em água desmineralizada e diluir para 1000 mL.
Capítulo V- Parte experimental
64
Solução de hidróxido de sódio, 6N
Dissolver 240g de hidróxido de sódio (NaOH) em água desmineralizada isenta de CO2. Arrefecer e diluir para 1000 mL.
Solução tampão e de ajustamento da força iónica (TISAB)
Em copo de 1 L dissolver 57 mL de ácido acético glacial (CH3COOH), 58 g de
cloreto de sódio (NaCl) e 4,0 g de ácido 1,2-ciclo-hexilenodiaminotetraacético (CDTA) em 500 mL de água desmineralizada. Ajustar o pH da solução a 5,3-5,5 com solução de hidróxido de sódio, NaOH 6N (são necessários cerca de
125 mL). Agitar e arrefecer durante a adição de hidróxido de sódio. Transferir a solução para um balão volumétrico de 1000 mL e perfazer o volume com
água desmineralizada.
3.1.2 Soluções de calibração
Solução mãe de ião fluoreto, 100 mg/L (F)
Dissolver 0,221g de fluoreto de sódio anidro (NaF) previamente seco durante
1 hora na estufa a 102 - 104 ºC, em água desmineralizada e diluir para 1000 mL.
Solução padrão de ião fluoreto, 10 mg/L (F)
Diluir 100 mL de solução mãe de ião fluoreto (100 mg/L) para 1000 mL com
água desmineralizada.
3.1.3 Soluções padrão de controlo
Solução intermédia de controlo de ião fluoreto, 100 mg/L (F) Para balão volumétrico de 100 mL, pipetar 10 mL de solução mãe controlo de ião
fluoreto, 1000 mg/L. Perfazer o volume com água desmineralizada. Homogeneizar.
Solução padrão de controlo de ião fluoreto, 10 mg/L (F)
Diluir 100 mL de solução intermédia de controlo de ião fluoreto (100 mg/L)
para 1000 mL com água desmineralizada.
Capítulo V- Parte experimental
65
Solução padrão de controlo de ião fluoreto, 0,06 mg/L (F)
Diluir 600 μL de solução padrão de controlo de ião fluoreto (10 mg/L) para
100 mL com água desmineralizada.
3.1.4 Soluções de controlo instrumental
As soluções a seguir apresentadas foram preparadas de acordo com as especificações do fabricante (Thermo Scientific).
Solução de TISAB + 1 mL solução intermédia de controlo de fluoreto
(100 mg/L)
Para um frasco rolhado de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e 50 mL de TISAB. Adicionar 1 mL de solução mãe fluoretos 100 mg/L.
Homogeneizar e rolhar.
Solução de TISAB + 11 mL solução intermédia de controlo de fluoreto (100 mg/L)
Para um frasco rolhado de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e
50 mL de TISAB. Adicionar 11 mL de solução intermédia de ião fluoreto 100 mg/L. Homogeneizar e rolhar.
3.2 Análise de ácido ascórbico
Todas as soluções são preparadas e armazenadas em material de vidro
escuro.
As soluções são armazenadas ao abrigo da luz a uma temperatura de 5 ± 3 ºC.
3.2.1 Soluções gerais
Solução de ácido metafosfórico (H3PO4) a 6%
Em balão volumétrico de 500 mL, introduzir 30 g de ácido metafosfórico, 80 mL de ácido acético glacial e 200 mL de água desmineralizada. Dissolver por
agitação.
Perfazer o volume do balão com água desmineralizada, filtrar rapidamente e
guardar em frasco de vidro escuro. No frigorífico, esta solução tem uma duração de 7 a 10 dias.
Solução de ácido metafosfórico (H3PO4) a 3% (solução de extração)
Capítulo V- Parte experimental
66
Diluir 250 mL da solução de ácido metafosfórico a 6% e de ácido acético para 500 mL, com água desmineralizada.
Solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (solução corante)
Dissolver em balão volumétrico de 200 mL, 42 mg de hidrogenocarbonato de
sódio, 50 mg de sal sódico de diclorofenol-indofenol com 150 mL de água quente (50 a 60 ºC). Arrefecer e completar o volume do balão. Filtrar e
guardar no frio.
Solução de acetato de sódio/ácido acético (solução tampão)
Dissolver 300 g de acetato de sódio anidro em 700 mL de água desmineralizada. Adicionar 1000 mL de ácido acético glacial.
3.2.2 Soluções de calibração
Solução mãe de ácido ascórbico (C6H8O6), 1000 mg/L
Pesar 50±0,01 mg de ácido ascórbico.Transferir quantitativamente para um
balão volumétrico de 50 mL, dissolver com a solução de extração (ácido metafosfórico a 3%) e perfazer o volume com a mesma.
Solução de calibração de ácido ascórbico (C6H8O6) a 3 mg/L
Diluir 150 L de solução mãe de ácido ascórbico para 50 mL com solução de extração (ácido metafosfórico a 3%).
3.2.3 Soluções padrão de controlo
Solução mãe controlo de ácido ascórbico (C6H8O6), 1000 mg/L
Pesar 50 ± 0,01 mg de ácido ascórbico. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL, dissolver com a solução de extração (ácido
metafosfórico a 3%) e perfazer o volume com a mesma.
A pesagem do padrão de ácido ascórbico do controlo deve ser independente do da solução de calibração.
Solução controlo de ácido ascórbico (C6H8O6), 3 mg/L
Diluir 150 L de solução mãe de controlo de ácido ascórbico para 50 mL com solução de extração (ácido metafosfórico a 3%).
Capítulo V- Parte experimental
67
4. Implementação e validação dos métodos de ensaio
4.1 Análise de fluoretos
A figura 6 resume a sequência de ensaios utilizada ao longo do trabalho experimental.
Figura 6: Sequência do trabalho experimental para o controlo instrumental, optimização, validação e análise potenciométrica de fluoretos em
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.
4.1.1 Técnica
Analisar todas as tomas de ensaio (soluções de calibração, soluções controlo
e amostras) de acordo com o seguinte procedimento:
Adicionar a cada 25 mL de amostra, 25 mL de TISAB.
Colocar sobre a placa de agitação com agitador magnético.
Mergulhar os eléctrodos na amostra e deixar a agitar cerca de 3 minutos antes de fazer a leitura (ou até valor constante de leitura).
Ler no equipamento o valor da voltagem.
Diariamente fazer o controlo instrumental.
Capítulo V- Parte experimental
68
4.1.2 Controlo instrumental
Diariamente, antes da calibração, efectuar um controlo do estado eléctrodo combinado, de acordo com as especificações do fabricante.
Para dois frascos rolhados de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e 50 mL de TISAB.
Pipetar para cada frasco 1 mL e 11 mL de solução mãe fluoretos 100 mg/L, respectivamente. Homogeneisar e rolhar.
Medir o potencial de cada uma das soluções preparadas e registar.
A diferença entre o potencial das soluções de TISAB+1 mL e TISAB+11 mL deve estar compreendida entre 54-60 mV.
4.1.3 Estudo da linearidade
Preparar dezasseis soluções padrão de ião fluoreto com concentrações compreendidas entre 0,02 e 10 mg/L.
Medir os volumes correspondentes de solução padrão de fluoretos, 10 mg/L, para balões volumétricos de 25 mL e perfazer o volume com água desmineralizada.
Transferir para um copo de precipitação de 100 mL e seguir o procedimento técnico descrito na secção 4.1.1.
Colocar sobre a placa de agitação com agitador magnético.
Registar o valor da voltagem correspondente a cada ponto da curva de calibração e traçar a curva de calibração de fluoretos (mV vs concentração).
Efectuar a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados (anexo 3). Determinar o coeficiente de determinação da recta (R2) e o coeficiente de
variação do método (CVm, %). Definir o intervalo de linearidade após aplicação de vários testes estatísticos, nomeadamente, análise de resíduos (anexo 5), teste dos valores normalizados (anexo 4) e teste de Mandel (teste de Fisher-
Snedecor) (anexo 6).
Na tabela 6 apresentam-se os critérios de aceitação para a avaliação do
intervalo de linearidade.
Capítulo V- Parte experimental
69
Tabela 6: Critérios de aceitação para a definição do intervalo de linearidade.
Parâmetro Critério de aceitação
Coeficiente de determinação (R2) ≥ 0,995
Coeficiente de variação do método (CVm) ≤ 10%
Análise de resíduos ≤ 10%
Teste das áreas normalizadas ≤ 10%
Teste de Mandel VT ≤ F (1, N-3)95%
4.1.4 Gama de trabalho
Depois de definido o intervalo de linearidade, analisar 10 réplicas da solução padrão da concentração mais baixa da gama de concentração (0,06 g/L) e 10 réplicas da solução padrão de concentração mais alta da gama de
concentração (10 mg/L). Determinar o desvio padrão (S) e a variância (S2) das dez leituras referentes a cada nível de concentração.
A gama de trabalho foi avaliada pelo teste de homogeneidade das variâncias de acordo com a norma ISO 8466-1 (156)(anexo 7). A gama de trabalho está bem ajustada se VT ≤ F (N-1, N-1), 99%.
4.1.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ)
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método foram determinados por dois métodos diferentes. Um deles baseia-se no desvio
padrão residual da curva de calibração (Sx/y) e no declive (b). O outro baseia-se nos ensaios de repetibilidade, isto é, na determinação do desvio padrão das
leituras de 10 soluções padrão independentes, cuja concentração corresponde ao primeiro nível de concentração do intervalo de linearidade (0,06 mg/L).
Capítulo V- Parte experimental
70
4.1.6 Precisão
4.1.6.1 Repetibilidade
Analisar 10 soluções padrão de três níveis de concentração (baixo, intermédio e elevado): 0,06 mg/L, 0,8 mg/L e 10 mg/L, num total de 30 réplicas.
Determinar o desvio padrão relativo para cada nível de concentração.
4.1.6.2 Precisão intermédia
Analisar 10 soluções padrão para cada um de três níveis de concentração em
cada série de trabalho (0,06 mg/L, 0,8 mg/L e 10 mg/L), as quais foram analisadas em séries de trabalho independentes (2 dias: 10 análises/dia). Determinar o desvio padrão relativo das vinte determinações para cada nível
de concentração.
4.1.7 Exactidão
A exactidão do método foi avaliada através de estudos de recuperação (efeito
de matriz) e da análise de soluções controlo. Para avaliar as interferências de matriz na análise de fluoretos por potenciometria efectuar ensaios de recuperação em diferentes matrizes, incluindo sumos, bebidas de sumo,
néctares, refrigerantes, concentrados, chás e infusões.
Analisar seis réplicas de cada matriz após fortificação com 0,8 mg/L de
fluoreto (0,2 mL de solução intermédia de fluoretos a 100 mg/L e perfazer com amostra para um volume de 25 mL).
Analisar em cada série de trabalho duas soluções controlo de fluoretos (0,06 e
10 mg/L) e determinar o erro relativo. Determinar o erro médio obtido ao longo das várias séries de trabalho e respectivo desvio padrão relativo
(percentagem).
4.1.8 Limite de determinação do método (LD)
Após os estudos de recuperação é possível calcular o limite de determinação
(LD) do método potenciométrico para cada uma das matrizes estudadas. A determinação do LD é calculada de acordo com a seguinte equação:
Capítulo V- Parte experimental
71
(%)Re
100
cCLD P
(equação 14)
Em que
Cp Concentração de fluoretos no padrão de calibração (mg/L), correspondente
ao padrão de menor concentração.
Rec (%) Percentagem de recuperação.
4.1.9 Efeito do pH
Efectuar estudos de estabilidade a partir da análise de soluções padrão de fluoretos e a partir da análise de amostras de bebidas fortificados com fluoretos.
Selecionar uma amostra com pH ácido para o estudo do efeito do pH.
Para um balão de 25 mL, pipetar 5 mL de solução de acetato de sódio a 15%.
Perfazer o volume do balão com a amostra selecionada e homogeneisar.
Transferir a mistura anterior para um copo de precipitação de 100 mL e adicionar 25 mL de TISAB (copo I).
Num outro copo de precipitação de 100 mL, adicionar 25 mL de TISAB e 25 mL da amostra em estudo (copo II).
Seguidamente, preparar ensaios de fortificação da amostra selecionada, a três níveis de concentração de fluoretos.
Para três balões volumétricos de 25 mL, medir 5 mL de solução de acetato de
sódio a 15%.
Pipetar para cada balão 0,25 mL, 0,5 mL e 1 mL de solução padrão intermédia
de fluoretos 100 mg/L), de modo a obter concentrações finais de fluoretos de 1, 2 e 4 mg/L, respectivamente.
Perfazer o volume com a amostra em estudo e homogeneisar.
Em copos de precipitação de 100 mL (copos III, IV e V), adicionar 25 mL de TISAB e 25 mL das amostras fortificadas preparadas anteriormente.
Ler o potencial das amostras dos copos I a V de acordo com a técnica descrita na secção 4.1.1.
Capítulo V- Parte experimental
72
4.1.10 Análise das amostras
Diariamente preparar uma curva de calibração com quatro níveis de concentração (0,06 - 10 mg/L) em ião fluoreto.
Em cada série de trabalho, por cada 20 amostras, efectuar um ensaio em branco, um ensaio de recuperação e um ensaio duplicado.
Analisar 2 controlos correspondentes aos níveis de concentração extremos da gama de trabalho (0,06 e 10 mg/L).
Para o ensaio de recuperação, pipetar 0,5 mL de solução intermédia de
controlo de ião fluoretos para um balão volumétrico de 25 mL, perfazer o volume com a amostra seleccionada e agitar.
Analisar todas as soluções (calibradores, controlos, branco e amostras) de
acordo com o procedimento técnico descrito na secção 4.1.1..
Determinar a concentração de ião fluoreto (mg/L) nas soluções a partir da
curva de calibração correspondente.
4.2 Análise de ácido ascórbico
O doseamento do ácido ascórbico baseia-se na extração do ácido ascórbico por
uma solução de ácido metafosfórico e de ácido acético. Seguidamente dá-se a redução quantitativa do corante (2,6 diclorofenol-indofenol) pelo ácido ascórbico, extração do corante em excesso pelo xileno e sua determinação por
leitura espectrofotométrica a 500 nm.
A figura 7 resume a sequência de ensaios utilizada ao longo do trabalho
experimental.
Figura 7. Sequência do trabalho experimental para a optimização, validação e análise de ácido ascórbico por espetrofotometria de absorção molecular em
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.
Capítulo V- Parte experimental
73
4.2.1 Verificação da pureza do xileno
Verificar a pureza do xileno descorando uma pequena quantidade da solução
corante (2,6 diclorofenol-indofenol) com o ácido ascórbico e agitar com 10 mL de xileno.
Se, após 10 minutos de repouso, aparecer qualquer coloração na fase do xileno, proceder à sua destilação.
O xileno usado na determinação pode ser recuperado por agitação com
solução de hidróxido de sódio a 20% (m/m), seguida da redestilação.
4.2.2 Aferição da solução corante
Diluir 2 mL da solução padrão de ácido ascórbico a 3 mg/L com 2 mL da
solução de extração (ácido metafosfórico 3%).
Titular rapidamente com a solução corante (2,6 diclorofenol-indofenol) até
coloração rosa persistente durante 5 segundos.
Repetir a titulação mais duas vezes e registar o volume da solução corante gasto de cada vez. Os três valores obtidos não devem diferir entre si mais que
0,1 mL.
Proceder do mesmo modo para o ensaio em branco, substituindo os 2 mL da
solução padrão de ácido ascórbico (3 mg/L), por igual volume de solução de extração (ácido metafosfórico 3%).
Subtrair ao volume médio da solução corante gasto nas três titulações, o volume gasto no ensaio em branco e expressar a concentração da solução corante (miligramas de ácido ascórbico equivalente a 1,0 mL da solução
corante).
4.2.3 Estudo da linearidade
Adicionar a onze tubos de centrifugação, 3 mL solução de extração (ácido
metafosfórico 3%), 3 mL da solução padrão de ácido ascórbico a 3 mg/L e 3 mL de solução-tampão (acetato de sódio/ácido acético).
Adicionar a cada tubo de centrifugação diferentes volumes da solução corante
(2,6 diclorofenol-indofenol), 0-1 mL, em intervalos de 0,1 mL.
Adicionar 10 mL de xileno, rolhar os tubos e agitar. Centrifugar os tubos a
3000 g durante 3 minutos para que se processe a separação das fases.
Capítulo V- Parte experimental
74
Transferir com precaução a fase orgânica (xileno) para a célula do espectrofotómetro e medir a absorvência a 500 nm, utilizando como referência
a solução contida no primeiro tubo de centrifugação (branco).
Traçar a curva de calibração correspondente aos onze níveis de concentração de ácido ascórbico, absorvência versus volume da solução corante.
Efectuar a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. Determinar o coeficiente de determinação da recta (R2) e o coeficiente de variação do
método (CVm, %). Definir o intervalo de linearidade após aplicação de vários testes estatísticos, nomeadamente, análise de resíduos, teste das áreas normalizadas e teste de Mandel (teste de Fisher-Snedecor).
4.2.4 Gama de trabalho
Depois de definido o intervalo de linearidade, analisar 10 réplicas da solução
padrão da concentração mais baixa da gama de concentração (200 L) e 10 réplicas da solução padrão de concentração mais alta da gama de
concentração (900 L) e aplicar o teste da homogeneidade das variâncias.
4.2.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ)
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método foram
determinados através do desvio padrão residual da curva de calibração (Sx/y) e do declive (b) e com base em ensaios de repetibilidade.
Os limiares analíticos (LOD e LOQ) expressos em miligramas de ácido
ascórbico por 100 g de produto, são calculados com base na equação 2, secção 4.2.3.3. do presente capítulo, a qual corrige o volume máximo de
corante em excesso (V2) extrapolado da curva de calibração, usando a massa
de 10 g de amostra.
4.2.6 Análise das amostras
4.2.6.1 Preparação da amostra
Pesar, com rigor, 10 ± 0,0001 g e transferir para um balão volumétrico de
100 mL. Perfazer o volume do balão com a solução de extração (ácido metafosfórico 3%). Rolhar e homogeneisar. Guardar ao abrigo da luz.
Capítulo V- Parte experimental
75
4.2.6.2 Calibração do método analítico
Diariamente preparar uma curva de calibração com quatro níveis de concentração em ácido ascórbico.
Em quatro tubos de centrifugação introduzir 3 mL solução de extração (ácido metafosfórico 3%) e igual volume da solução padrão de ácido ascórbico, 3 mg/L.
Adicionar a cada tubo 3 mL de solução tampão (acetato de sódio/ácido
acético) e introduzir, respectivamente, 0, 200 L, 600 L e 1000 L da solução corante (2,6 diclorofenol-indofenol).
Adicionar 10 mL de xileno, rolhar os tubos e agitar. Centrifugar os tubos a 3000 g. Transferir com precaução a fase superior para a célula do
espectrofotómetro e medir a absorvência a 500 nm, utilizando como referência a solução contida no primeiro tubo de centrifugação (branco).
Traçar a curva de calibração de ácido ascórbico, absorvência vs volume da
solução corante.
4.2.6.3 Análise do ácido ascórbico
Num tubo de centrifugação, introduzir 3 mL da solução-amostra (4.2.3.1.), 3 mL de solução tampão (acetato de sódio/ácido acético) e 1 mL de corante
(2,6-diclorofenol-indofenol).
Adicionar 10 mL de xileno, rolhar o tubo e agitar vigorosamente durante 6
segundos. Centrifugar a 3000 g durante 3 minutos para que se processe a separação das fases.
Transferir com precaução a fase superior, de xileno, para a célula do
espectrofotómetro. Medir a absorvência da fase orgânica a 500 nm utilizando o xileno como branco e ler na curva de calibração, absorvência vs volume da
solução corante (registar o volume de corante).
O teor de ácido ascórbico, expresso em miligramas por 100 g de produto, é dado pela seguinte equação:
(equação 15)
Onde:
m0 massa, em miligramas, de ácido ascórbico, equivalente a 1,0 mL da solução corante;
m1 massa, em gramas, contida na alíquota da amostra utilizada na redução;
100
1
021 xm
mxVVascórbicoácidoteor
Capítulo V- Parte experimental
76
V1 volume, em mL, da solução corante adicionado à amostra para análise;
V2 volume, em mL, da solução corante em excesso, correspondente à absorvência lida da amostra, determinado na curva de calibração.
Em cada série de trabalho, por cada 20 amostras, efectuar um ensaio em
branco, um ensaio de recuperação e um ensaio duplicado.
Para o ensaio de recuperação, pipetar 0,5 mL de solução padrão de ácido
ascórbico a 3 mg/L para um balão de 25 mL e perfazer o volume com a
solução amostra (4.2.3.1.). Rolhar e homogeneisar. Seguir a técnica descrita
para a calibração analítica (4.2.3.2.).
Analisar 2 controlos correspondentes aos níveis de concentração extremos da
gama de trabalho (200 L e 900 L).
4.3 Determinação do pH
Calibrar o aparelho de pH diariamente, antes de se efectuar qualquer medição.
Desde que a sonda de temperatura esteja ligada, o aparelho faz a
compensação automática da temperatura (20 ºC). Sendo assim, introduzir sempre a sonda juntamente com o eléctrodo. Efectuar a calibração do
aparelho por meio de duas soluções tampão, pH=7,0 e pH=4,0.
Após calibração e antes de analisar as amostras, proceder à análise de uma solução controlo (pH=6,0 ou pH=6,8).
Em cada série de trabalho de 20 amostras, efectuar um ensaio duplicado.
O valor do pH vem expresso de acordo com a Escala Sörensen (0 – 14
unidades), seguida do valor da temperatura da amostra (na leitura).
4.4 Determinação do potencial redox
Antes de efectuar qualquer medição, mergulhar o eléctrodo de potencial redox no padrão de 475 mV (15 minutos).
Calibrar o potenciómetro com os calibradores de 475 mV e 86 mV. Analisar um controlo de potencial redox a 255 mV.
Em cada série de trabalho de 20 amostras, efectuar um ensaio duplicado.
O valor do potencial redox vem expresso em milivolte (mV) e o valor de
potencial lido corresponde directamente ao poder oxidante da amostra.
Capítulo V- Parte experimental
77
5. Selecção das amostras
Foram adquiridas 199 amostras entre Outubro de 2010 e Dezembro de 2010, em supermercados e hipermercados de Lisboa. As amostras adquiridas são
amostras destinadas ao consumo infantil ou susceptíveis de serem consumidas por crianças. As amostras foram agrupadas em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. De entre as
amostras, salienta-se a existência de uma grande variedade de refrigerantes, sumos e néctares em contraste com a pouca variedade existente de bebidas
de sumo, concentrados, chás e infusões para crianças.
O consumo destes produtos por crianças tem aumentado consideravelmente, não só em Portugal mas um pouco por todo o mundo. Em Portugal não
existem estudos que forneçam dados sobre o consumo destes produtos por crianças e, como tal, não é possível avaliar qual dos grupos de bebidas
mencionados é mais consumido pela população infantil. Uma vez que existe uma grande variedade de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo,
concentrados, chás e infusões em termos de marca e sabor disponíveis no mercado, realizou-se uma seleção destas amostras.
Os critérios de selecção das amostras foram os seguintes:
Amostras de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo e concentrados representativas das marcas e sabores existentes no
mercado, destinadas ao consumo infantil ou suscetíveis de o ser. Amostras de chás e infusões rotuladas especificamente para crianças.
No anexo 1 apresenta-se a lista das amostras analisadas.
Capítulo VI- Resultados e discussão
79
Capítulo VI – Resultados e discussão
O desenvolvimento de um método analítico implica a realização de vários estudos com vista à sua validação e posterior implementação em rotina. O
trabalho experimental centrou-se na optimização e validação do método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo de fluoretos. Com este objectivo definiu-se o intervalo de lineridade e gama de trabalho, os limiares
analíticos, a precisão e a exactidão do método. Após validação do método de ensaio, procedeu-se à análise das amostras e implementação em rotina de
ferramentas de controlo de qualidade, nomeadamente, análise de brancos, soluções controlo e estudos de recuperação.
Embora não se tenham optimizado e validado os outros métodos utilizados (determinação do pH, determinação do potencial redox e determinação da
vitamina C), foram utilizados os mesmos critérios de controlo de qualidade dos resultados obtidos.
As tabelas e figuras a seguir apresentadas estão organizadas pelo método de análise.
Apresenta-se também neste capítulo os resultados dos inquéritos de frequência de consumo alimentar, nomeadamente a caracterização da
população infantil em estudo, a avaliação do risco de toxicidade pelos fluoretos por regressão binária e o estabelecimento de relações entre o consumo de bebidas, bem como a ingestão diária de fluoretos por esta fonte da dieta, e
algumas variáveis de interesse no âmbito deste trabalho.
1. Análise de fluoretos
1.1 Controlo instrumental
O elétrodo combinado seletivo a iões fluoreto apresenta uma resposta linear quando a diferença entre o potencial das soluções de TISAB+1 mL e
TISAB+11 mL (secção 4.1.2., capítulo V) está compreendida entre 54-60 mV.
A figura 8 apresenta os valores das diferenças de potencial do elétrodo
registadas nas várias séries de trabalho e os limites (superior e inferior) definidos pelo fabricante como critério de aceitação.
Capítulo VI- Resultados e discussão
80
Figura 8. Diferença dos potenciais do elétrodo (LS – Limite Superior e LI –
Limite Inferior).
Os valores mínimo e máximo da diferença de potencial do elétrodo foram de
54 e 58,5 mV, respectivamente, com um valor médio de 56 1,2 mV. Todas as séries de trabalho apresentaram diferenças de potencial dentro do intervalo
de potenciais definido pelo fabricante.
1.2 Estudo da linearidade
A tabela 7 apresenta os resultados iniciais dos testes de linearidade do método potenciométrico, para a gama de concentrações de 0,02 a 10 mg/L.
O intervalo de concentrações estudado não apresenta uma boa correlação (R2=0,97) e o limite de quantificação provisório (determinado a partir do
declive e da ordenada na origem) é muito superior ao primeiro ponto da curva de calibração (0,02 mg/L), indicando que os primeiros valores da recta de
calibração não estão bem ajustados. A análise de resíduos e o teste dos valores normalizados apresentam valores superiores a 10% confirmando a falta de correlação entre os resultados.
53
54
55
56
57
58
59
60
61
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Po
ten
cia
l (m
V)
N.º de leituras
X1 Média LS LI
Capítulo VI- Resultados e discussão
81
Tabela 7. Parâmetros da primeira curva de calibração dos fluoretos para a
avaliação da linearidade do método potenciométrico.
Parâmetro Resultado
Número de pontos de calibração (N) 16
Intervalo de concentrações (mg/L) 0,02 10
Equação da recta y = -50,0966 x + 94,5382
Coeficiente de determinação (R2) 0,9792
Coeficiente de variação do método (CVm, %) 7,2
Análise de resíduos (%) - 11; 5,8
Teste dos valores normalizados (%) 95; 113
Teste de Mandel, VT ≤ F (1, N -3), 95% 3,1 ≤ 4,7
Limite de detecção (LOD), mg/L 0,38
Limite de quantificação (LOQ), mg/L 1,3
O intervalo de concentrações da curva de calibração foi reduzido para 0,06-10
mg/L, prepararam-se novas soluções padrão de fluoreto e efectuaram-se de novo todos os testes estatísticos de avaliação da linearidade.
A figura 9 apresenta os resultados dos testes estatísticos para o estudo da linearidade do método na gama de concentrações entre 0,06 e 10 mg/L (F).
O método é linear no intervalo de concentrações estudado (0,06 – 10 mg/L) apresentando um bom coeficiente de determinação (R2=0,9956), CVm < 10%
(2,4 %) e o valor teste (VT) é inferior ao valor tabelado F de Fisher/Snedecor (F(1;N-3;95%). A análise de resíduos e o teste dos valores normalizados apresentaram uma variação inferior a 10%.
Capítulo VI- Resultados e discussão
82
Figura 9. Testes estatísticos para o estudo da linearidade. (a) Curva de calibração e bandas de incerteza (superior e inferior), (b) análise de resíduos,
(c) valores normalizados e (d) teste de Mandel.
y = -54,704x + 95,472R² = 0,9956
0
30
60
90
120
150
180
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Pote
ncia
l (m
V)
log C
(a) Equação da reta e bandas de incerteza N = 14CVm (%) = 2,4
-15
-10
-5
0
5
10
15
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Resíd
uos (
%)
log C
(b) Análise de resíduos [-3,9; 2,7]
85
90
95
100
105
110
115
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Va
lore
s n
orm
aliza
do
s (
%)
log C
(c) Teste dos valores normalizados [98; 104]
Ajuste polinomialy = -3,355x2 - 55,727x + 97,024
R² = 0,997
0
30
60
90
120
150
180
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Pote
ncia
l (m
V)
log C
(d) Teste de Mandel VT = 1,1F (1; N-3: 95%) = 4,8
Capítulo VI- Resultados e discussão
83
1.3 Gama de trabalho
Após a definição do intervalo de linearidade aplicou-se o teste de
homogeneidade de variâncias aos extremos de concentração deste intervalo, nomeadamente, 0,06 e 10 mg/L.
Como o valor de VT (1,0) foi inferior ao valor tabelado (5,4) de F (9, 9; 99%), a gama de trabalho está bem ajustada.
1.4 Limiares analíticos (LOD e LOQ)
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados com base no declive e na ordenada da origem da curva de calibração e em ensaios de repetibilidade (tabela 8).
Tabela 8. Limiares analíticos do método potenciométrico com base nos
parâmetros da curva de calibração e em condições de repetibilidade.
Limiares Recta de
calibração
Condições de
repetibilidade
LOD, mg/L (F) 0,15 0,003
LOQ, mg/L (F) 0,50 0,009
Os valores de LOD e LOQ determinados com base na recta de calibração são
0,15 e 0,5 mg/L, respectivamente. Os mesmos limites calculados com base em estudos de repetibilidade são de 0,003 e 0,009 mg/L, respectivamente. Como o LOQ determinado com base em ensaios de repetibilidade é muito
inferior ao primeiro nível de concentração da gama de trabalho, o LOQ foi ajustado para 0,06 mg/L. Em rotina este LOQ será testado, introduzindo um
controlo diário com 0,06 mg/L.
1.5 Precisão
A tabela 9 apresenta os resultados do estudo da repetibilidade e da precisão
intermédia avaliadas com base no desvio-padrão relativo (DPR, %) de três níveis de concentração e dos limites de repetibilidade (r) e de precisão
intermédia (RI), respectivamente.
Capítulo VI- Resultados e discussão
84
Tabela 9. Repetibilidade e precisão intermédia do método potenciométrico.
Concentração
fluoretos (mg/L)
Repetibilidade
n=10
Precisão intermédia
n=20, 2 dias
DPR (%) r DPR (%) RI
0,06 2,0 0,010 5,3 0,009
0,80 2,4 0,043 2,8 0,053
10 2,0 0,53 1,8 0,46
O método potenciométrico com eléctrodo selectivo de fluoretos é preciso. Nos
ensaios de repetibilidade os valores de DPR variam entre 2,0 e 2,4% e nos ensaios de precisão intermédia variam entre 1,8 e 5,3%, cumprindo os
critérios de aceitação definidos.
1.6 Exactidão
A exatidão do método foi avaliada através da análise de seis réplicas de 20
amostras fortificadas com 0,8 mg/L de fluoretos: 3 refrigerantes, 4 sumos, 4 néctares, 2 bebidas de sumo, 2 concentrados, 2 chás e 3 infusões. A tabela 10
apresenta os resultados das recuperações (Rec, %) médias obtidas para cada matriz, em condições de repetibilidade.
Tabela 10. Estudos de recuperação dos fluoretos em várias matrizes alimentares em condições de repetibilidade.
Refrigerante Sumo Néctar
Bebida
de
sumo
Concentrado Chá Infusão
Rec
(%),
n = 6
114 90 101 101 83 95 95
DPR
(%) 7,3 4,0 6,7 8,4 0,5 1,0 1,1
A vacompadiobesin Asso0,devamcore
Fim
recuperaçariou entroncentrado
médio de radrão relaiferenças btidas nastatisticamnfusões.
s figuras oluções co,06 mg/L,esvio padralor médio
mg/L e umontrolo deespectivam
igura 10:mg/L (n=10
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Co
nce
ntr
açã
o (
mg
/L)
ção médiare 83 e 1os, apresrecuperaçãativo de 7estatistica
as 7 mmente sig
10 e 11 rontrolo. A apresentrão relativo de 10 m
m desvio e 0,06 e 1mente.
: Erro rela0).
1,1 1,1
1 2
VaEr
a das matr14%. A rentando uão mais e7,3%. A aamente s
matrizes enificativas
representaconcentraando valo
vo de 1,9%mg/ L, aprpadrão re10 mg/L v
ativo da an
1
0,5
0
3
alor experirro (%)
rizes em erecuperaçãum desvioelevado é análise essignificativestudadas
s entre as
am o erro ação médiares que v
%. A soluçresentandoelativo de variaram e
nálise de
0,9
0,4
4 5Nº Con
imental
Capí
estudo, emão média o padrão a dos re
statística (vas (p<0,s, poréms recuper
associadoa da soluçariam entção controo valores 1,2%. O entre 0,37
soluções c
1,8
2,2
6 7ntrolos
CC
ítulo VI- Re
m condiçõemais baix relativo efrigerante(ANOVA) ,05) entre não e
rações de
o à leituração controre 0,058 e
olo de 10 mque variam erro ass7-3,5% e
controlo d
2
3,3
0
8
Controlo 0Critério de
esultados e
es de repexa correspde 0,5%
es, com uindica quee as recuexistem de néctares
a de cadalo de 0,06e 0,062 mmg/L aprem entre 9ociado às entre 0,6
e fluoreto
0,9
3,5
9 10
,06 mg/Le aceitação
discussão
85
etibilidade,ponde aos. O valorum desvioe existemuperaçõesdiferençass, chás e
uma das60 mg/L é
mg/L e umesenta um9,9 e 10,2s soluções62- 1,6%,
os de 0,06
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Err
o (
%)
o
5
, s r o
s s e
s é
m m 2 s ,
6
Capítulo VI- Resultados e discussão
86
Figura 11: Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 10 mg/L (n=10).
Os resultados dos estudos de recuperação (80≤ Rec,% ≤120) e da análise de
soluções controlo (erro < 5%) mostram que o método potenciométrico para a análise de fluoretos é exacto.
1.7 Limite de determinação do método (LD)
O valor do limite de determinação (LD) foi calculado com base nos valores médios de recuperação nas diferentes matrizes analisadas.
A tabela 11 apresenta os limites de determinação do método para
refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões e a respectiva média.
Tabela 11. Limite de determinação do método potenciométrico para a análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.
Refrigerante Sumo Néctar Bebida
de sumo
Concentrado Chá Infusão
LD,
mg/L
0,05 0,07 0,06 0,06 0,07 0,06 0,06
1,6
0,6
1,4
1,1
0,7 0,7
1,3 1,1
0,3
1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Erro
(%
)
Co
ncen
tração
(m
g/
L)
Nº Controlos
Valor experimental Controlo 10 mg/L
Erro (%) Critério de aceitação
Capítulo VI- Resultados e discussão
87
O limite de determinação médio do método de potenciométrico é de 0,06
mg/L. Como os valores de recuperação nas várias matrizes são próximos dos 100%, o limite de determinação médio é igual ao limite de quantificação e corresponde ao primeiro nível de concentração da gama de trabalho.
1.7.1 Efeito do pH
Uma das principais interferências do método potenciométrico é a formação de
ácido fluorídrico em condições acídicas que reduz substancialmente a concentração de iões fluoreto em solução, o que influencia as determinações.
A maioria das amostras analisadas possui pH ácido e, como tal, é importante verificar se a acidez das matrizes em estudo não interfere com o doseamento
de fluoreto nas mesmas.
A figura 12 apresenta os valores da recuperação para os 3 níveis de
fortificação da amostra, com e sem a adição de acetato de sódio a 15 %.
Figura 12. Efeito do pH nas recuperações de amostras ácidas.
0
20
40
60
80
100
120
0,25 0,5 1
Recu
peração
(%
)
Volume de fortificação (mL)
Amostra com acetato Amostra sem acetato
Capítulo VI- Resultados e discussão
88
Considerou-se como valor de referência ou padrão, a recuperação da amostra com a adição da solução de acetato de sódio a 15 %, pois apresenta um valor
de pH no intervalo 5-7, garantindo a ausência da interferência do ácido fluorídrico (HF). Os valores das recuperações de referência para os três níveis de fortificação (0,25 , 0,5 e 1 mL) foram 80, 87 e 100%, respectivamente.
Os valores das recuperações das amostras sem a adição de solução de acetato
de sódio para os níveis de fortificação de 0,25, 0,5 e 1 mL foram 87, 85 e 97%, com um desvio padrão relativo de 5,8 , 1,9 e 2,4 %, respectivamente.
O erro associado aos valores de recuperação das amostras sem a adição de solução de acetato de sódio a 15% apresentou valores de 8,6 , 2,6 e 3,4 % para os níveis de fortificação 0,25 , 0,5 e 1 mL, respectivamente.
Quando analisados como duplicados, os valores de recuperação com e sem
adição de acetato de sódio a 15 % apresentam diferenças de duplicados (DD %) inferiores a 10 % para os 3 níveis de fortificação (0,25, 0,5 e 1 mL), apresentando valores de 8,2 , 2,7 e 3,4 %, respectivamente.
Os resultados sugerem que na análise de fluoretos em meio ácido não existem
perdas significativas de ião fluoreto livre (DD% ≤ 10% e erro ≤ 10%), não sendo necessário o controlo de pH durante a análise das amostras.
1.8 Controlo de qualidade interno (CQI)
Ao longo das várias séries de trabalho, os valores dos parâmetros da curva de
calibração (coeficiente de determinação, declive e ordenada na origem), dos padrões de controlo, das recuperações e dos duplicados foram introduzidos
numa folha de cálculo com o objectivo de delinear as primeiras cartas de controlo (de médias e amplitudes) do método potenciométrico.
Em função dos valores individuais de cada parâmetro foram definidos os valores limite das cartas de controlo, nomeadamente a média (valor médio
dos valores obtidos para o parâmetro em análise), limite superior de controlo (LSC), limite superior de aviso (LSA), limite inferior de aviso (LIA) e o limite inferior de controlo (LIC).
A tabela 12 apresenta os resultados do controlo de qualidade relativos à determinação dos fluoretos.
Verifica-se que os valores do coeficiente de determinação (R2) oscilam em torno de um valor médio de 0,9984 registando um mínimo e um máximo de
0,9954 e de 0,9999, respectivamente. Comparando estes valores com o critério estabelecido para o coeficiente de determinação (R2
≥ 0,995) verifica-se que todas as séries de trabalho cumprem o requisito do critério de
aceitação.
Capítulo VI- Resultados e discussão
89
Os declives apresentam um valor médio de -54,8 com um desvio padrão relativo de 3,7%. A ordenada na origem oscila entre 95,5 e 111, apresentando
um valor médio de 104 e um desvio padrão relativo de 4,3%.
A exactidão foi avaliada através de padrões de controlo e de ensaios de
recuperação. Ao longo das várias séries de trabalho, o erro associado aos controlos foi sempre inferior a 10%, à excepção do controlo correspondente ao
primeiro ponto da curva de calibração, 0,06 mg/ L (14%). Isto sugere que o limite de quantificação do método deverá ser superior a 0,06 mg/L, uma vez que nesta concentração o desvio padrão relativo não cumpre o critério de
aceitação e é muito superior aos valores obtidos para os restantes controlos ( 5%). Como a concentração de fluoretos nas amostras é muito superior a este valor e como analisámos mais controlos nas séries de trabalho, validámos
todos os resultados obtidos. Em trabalhos futuros, o primeiro ponto da curva de calibração deverá ser 0,1 mg/L.
Nos ensaios de fortificação das várias matrizes com fluoreto, a recuperação média foi de 90%, oscilando entre 80-103% com um desvio padrão relativo de
6,9%. O método mostrou-se exacto (80≤ Rec,% ≤120).
A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade através da análise de duplicados ao longo das várias séries de trabalho. Uma vez que o desvio padrão e o valor médio têm valores muito próximos, as variáveis LIA (limite
inferior de aviso) e LIC (limite inferior de controlo) teriam valores negativos. Então, estas variáveis não são representativas da diferença de duplicados (%),
cujos valores são sempre positivos. Por esse motivo, a carta de controlo apresenta apenas as LSC e LSA e o valor médio.
Os valores de diferença de duplicados oscilaram entre 0,11- 2,9%, embora o valor de 2,9% seja único e corresponda à análise de um refrigerante com 0,2
mg/ L de fluoreto. O desvio padrão relativo associado à análise de duplicados é de 0,72% indicando que o método potenciométrico com eléctrodo de fluoretos é muito preciso.
Capítulo VI- Resultados e discussão
90
CQ
IP
arâm
etro
N
Carta d
e c
on
trolo
Ou
tros p
arâm
etros
Média
LIA
LS
ALIC
LS
CM
ínim
oM
áxim
oD
PR
(%
)
Curva
calibração
Declive
8-5
4,8
-58,8
-50,7
-60,9
-48,6
-57,9
-52,2
3,7
Orden
ada n
a
orig
em
9104
94,9
113
90,5
117
95,5
111
4,3
Coefi
cie
nte
determ
inação (
R2)
90,9
984
0,9
949
1,0
02
0,9
932
1,0
04
0,9
954
0,9
999
0,1
7
Padrões
Controlos
0,0
6 m
g/L
20
0,0
726
0,0
525
0,0
926
0,0
425
0,1
03
0,0
593
0,0
883
14
0,3
mg/L
12
0,3
04
0,2
74
0,3
34
0,2
59
0,3
49
0,2
71
0,3
20
5,0
0,8
mg/L
17
0,7
90
0,7
16
0,8
64
0,6
79
0,9
01
0,7
25
0,8
67
4,7
10
mg/L
18
10,1
9,5
410,6
9,2
710,9
9,5
210,5
2,7
Du
plicados
DD
(%
)48
0,8
4-
2,1
-2,7
0,1
12,9
0,7
2
Recu
peração
Rec (
%)
12
90
78
102
71
109
80
103
6,9
Tab
ela
12
. Parâ
metr
os d
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olo
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ualidade inte
rno r
ela
tivo à
análise d
e flu
ore
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méto
do p
ote
ncio
métr
ico.
Capítulo VI- Resultados e discussão
91
1.9 Análise de amostras
Depois de validado, o método potenciométrico foi aplicado à análise de 183 géneros alimentícios: 106 refrigerantes, 23 sumos, 37 néctares, 6 bebidas de sumo, 5 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as
características das amostras analisadas.
A tabela 13 apresenta os teores de fluoretos nas 183 amostras analisadas.
Tabela 13. Concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,
bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal continental.
Amostra N Média ±DP
(mg/L)
Mínimo
(mg/L)
Máximo
(mg/L) DPR %
Refrigerantes 106 0,39 ± 0,34 0,10 2,0 88
Refrigerantes à
base de extratos 26 0,86 ± 0,35 0,50 2,0 41
Refrigerantes
gaseificados 15 0,18 ± 0,07 0,10 0,34 38
Refrigerantes à
base de sumo 65 0,25 ± 0,14 0,10 1,1 58
Sumos 23 0,37 ± 0,11 0,18 0,59 29
Néctares 37 0,33 ± 0,16 0,11 0,65 48
Bebidas de
sumo 6 0,40 ± 0,24 0,24 0,83 59
Concentrados 5 0,29 ± 0,12 0,12 0,43 40
Chás 3 0,16 ± 0,04 0,12 0,19 22
Infusões 3 0,12 ± 0,01 0,11 0,13 11
Total 183 0,37 0,28 0,10 2,0 76
Capítulo VI- Resultados e discussão
92
Todas as amostras analisadas apresentam níveis de concentração de fluoretos superiores ao LOQ (0,06 mg/ L).
Comparando os diferentes tipos de matriz, verifica-se que a concentração média de fluoretos é mais elevada em bebidas de sumo, apresentando um
valor médio de 0,40 ± 0,24 mg/L, seguida dos refrigerantes e dos sumos com 0,39 ± 0,34 mg/L e 0,37 ± 0,11 mg/L, respectivamente. A concentração
média de fluoretos mais baixa foi observada nas infusões, com um valor médio de 0,12 ± 0,01 mg/L, seguida dos chás com uma concentração média de fluoretos de 0,164 ± 0,122 mg/L. Os néctares e os concentrados possuem
teores de fluoretos muito idênticos, apresentando valores médios de 0,33 ± 0,16 mg/L e 0,29 ± 0,12 mg/L, respectivamente.
Considerando a totalidade das amostras analisadas, os valores de concentração mais elevados correspondem a refrigerantes, nomeadamente ice
teas e tisanas, correspondendo a um máximo de 2,0 mg/ L de fluoreto. Contudo, a concentração de fluoreto mais baixa também foi determinada num
refrigerante (0,10 mg/L). Verifica-se ainda, que não existe uma correspondência entre a concentração de fluoreto e a marca e/ou o sabor.
A análise de variância (ANOVA) indica que não existem diferenças estatisticamente significativas entre a concentração de fluoretos nos refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e
infusões (p= 0,48).
A literatura apresenta alguns estudos de análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, chás e infusões. Segundo Heilman e colaboradores (17) a concentração de fluoreto nos refrigerantes analisados variou entre 0,07 e 1,37
mg/L, sendo que a maioria dos refrigerantes apresentou teores de fluoretos próximos de 1 mg/L. No entanto, no presente estudo a média do teor de
fluoretos nos refrigerantes foi bastante mais baixa (0,39 mg/L).
Opydo-Szymaczek e colaboradores (56) dosearam fluoretos em refrigerantes e
sumos. Verificaram que os ice teas apresentam teores mais elevados de fluoretos (1,28 mg/L) e que o teor de fluoreto em sumos é baixo (0,01- 0,29
mg/L), o que está de acordo com o verificado no presente trabalho.
Num outro trabalho de Tokalioglu e colaboradores (2) a concentração média
de fluoreto em sumos de fruta foi de 0,23 mg/L (0,05-0,50 mg/L) e de 0,85 mg/ L em chás e em infusões (0,4 - 2,8 mg/L). Porém, neste estudo não foi
observado teores de fluoretos nos chás e infusões nesta ordem de grandeza. Isto pode ser devido ao reduzido número de exemplares analisados destes produtos, uma vez que a variedade de chás e infusões destinados ao consumo
infantil é muito pequena.
Relativamente aos refrigerantes, verifica-se que não existe uniformidade nas
concentrações das várias amostras analisadas, o que é visível na grande discrepância entre os valores mínimo e máximo de concentração de fluoretos
destas amostras. Deste modo, assume-se que existem várias gamas de concentração dentro deste grupo de amostras.
As amostras de refrigerantes à base de extrato, refrigerantes gaseificados e refrigerantes à base de sumo representam três gamas de concentração de
fluoreto distintas. Os refrigerantes à base de extractos representam a primeira
Capítulo VI- Resultados e discussão
93
gama de concentrações e possuem um valor médio de 0,86 mg/L, com teores compreendidos entre 0,50 e 2,0 mg/L de fluoreto. A segunda gama de
concentração, na qual se inserem os refrigerantes gaseificados, apresenta um valor médio de 0,18 mg/L, com teores de fluoreto mínimo e máximo de 0,10 e 0,34 mg/L, respectivamente. Por fim, a terceira gama de concentrações de
fluoreto inclui os refrigerantes à base de sumo e apresenta teores de fluoreto entre o LOQ e 1,1 mg/L, com um valor médio de 0,25 mg/L.
A análise estatística (ANOVA) indica que existem diferenças estatisticamente
significativas entre a concentração de fluoreto nos refrigerantes (p < 0,01). No
entanto, esta diferença é devida exclusivamente ao subgrupo dos refrigerantes
à base de extractos, uma vez que não existem diferenças estatisticamente
significativas entre o teor de fluoretos nos refrigerantes à base de sumo e os
refrigerantes gaseificados (p > 0,05).
Os resultados obtidos estão de acordo com a literatura. Heilman e
colaboradores (17) verificaram que certa de 71% dos refrigerantes
gaseificados analisados excedia os 0,60 mg/L de fluoreto, com valores entre
0,02 a 1,3 mg/ L. Opydo-Szymaczek e colaboradores (56) verificaram que nos
refrigerantes à base de extractos de chá, o teor de fluoreto é mais elevado
(0,35-1,1 mg/L).
Considerando que a dose diária recomendada de fluoreto para uma criança de
8 anos é de 1 mg F/Kg peso corporal, se uma criança com essa idade e com
25 kg consumir 200 mL de uma das amostras analisadas, com concentração
média de fluoretos de 0,37 mg/ L, contribui com, aproximadamente 0,3% da
DDR (0,003 mg/ kg). A dose diária a partir da qual há risco de toxicidade pelo
fluoreto nessa criança é 2,0 mg/Kg, logo seria necessário que esta criança
consumisse diariamente cerca de 135 litros da bebida em questão para
manifestar efeitos tóxicos.
2. Análise de ácido ascórbico
2.1 Estudo da linearidade
A tabela 14 apresenta os resultados referentes ao estudo da linearidade do
método espectrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico.
Capítulo VI- Resultados e discussão
94
Tabela 14. Avaliação da linearidade do método espetrofotométrico para a análise de ácido ascórbico.
PARÂMETRO RESULTADOS
Número de pontos de calibração
(N) 10 9
Volume de corante (mL) 0,1 1,0 0,2 – 1,0
Equação da recta y = 0,3062x – 0,0131 y = 0,3208x – 0,0238
Coeficiente de determinação
(R2) 0,9912 0,9965
Coeficiente de variação método
(CVm, %) 6,5 2,9
Análise de resíduos (%) -13; 100 -5,4; 4,1
Valores normalizados (%) 72; 121 80; 114
Teste de Mandel
VT ≤ F (1, N -3), 95%
9,6 > 5,6 2,3 6,0
Limite de detecção (LOD) 0,09 0,05
Limite de quantificação (LOQ) 0,30 0,17
No primeiro intervalo de volumes testado (0,1-1,0 mL), o método não
apresenta uma boa correlação (R2 ≤ 0,995), embora apresente um coeficiente de variação do método (CVm) inferior a 10%. A análise de resíduos, o teste dos valores normalizados e o teste de Mandel não cumprem os critérios de
aceitação definidos, logo, o intervalo testado não é linear.
O limite de quantificação provisório (determinado a partir do declive e da ordenada na origem da curva de calibração) é superior ao primeiro ponto da curva de calibração (0,1 mL), indicando que o primeiro valor da recta de
calibração não está bem ajustado.
A gama de volumes da solução corante da curva de calibração foi reduzida de 0,1-1,0 mL para 0,2-1,0 mL e efectuaram-se de novo todos os testes estatísticos de avaliação da linearidade.
Capítulo VI- Resultados e discussão
95
Neste intervalo, o método cumpre todos os requisitos inerentes ao estudo da linearidade.
2.2 Gama de trabalho
Após a definição do intervalo de linearidade aplicou-se o teste de homogeneidade de variâncias. Como o valor de VT (4,24) foi inferior ao valor
tabelado (5,35) de F (9, 9; 99%), a gama de trabalho 0,2-1,0 mL está bem ajustada.
Em rotina, a curva de calibração obedeceu a esta gama de trabalho, tendo-se seleccionado três volumes: 0,2 mL, 0,6 mL e 1,0 mL.
2.3 Limiares analíticos (LOD e LOQ)
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados com base no declive e na ordenada da origem da curva de calibração e em
ensaios de repetibilidade (tabela 15).
Tabela 15. Limares analíticos do método espetrofotométrico com base na
curva de calibração e em condições de repetibilidade.
Limiares Recta de
calibração
Condições de
repetibilidade
LOD (mL corante) 0,05 0,016
LOQ (mL corante) 0,17 0,055
Os valores de LOD e LOQ determinados em condições de repetibilidade são inferiores aos determinados com base na curva de calibração (declive e ordenada na origem). Como a gama de trabalho é de 0,2 a 1,0 mL, o limite de
quantificação foi ajustado ao ponto da recta de calibração correspondente a 0,95 mL uma vez que quanto maior for o volume de corante em excesso,
menor é a concentração de ácido ascórbico presente na solução para reduzir o corante. Assim, 0,95 mL corresponde a uma concentração de ácido ascórbico de 0,1 mg/ 100g.
Capítulo VI- Resultados e discussão
96
2.4 Precisão
A tabela 16 apresenta os resultados do estudo da repetibilidade e da precisão intermédia, que foram avaliadas com base no desvio-padrão relativo (DPR, %) de três níveis de volume e respectivos limites de repetibilidade (r) e limites de
precisão intermédia (RI).
Tabela 16. Repetibilidade e precisão intermédia do método espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico.
Volume
corante
(mL)
Repetibilidade
n=10
Precisão intermédia
n=20, 2 dias
Média
(mL)
DPR
(%) r
Média
(mL)
DPR
(%) RI
0,20 0,21 2,3 0,014 0,20 8,0 0,045
0,60 0,53 1,9 0,029 0,54 3,3 0,050
1,0 0,97 3,3 0,088 0,92 5,6 0,14
O método é preciso porque em condições de repetibilidade e de precisão intermédia, apresenta valores de DPR (%) inferiores a 10%. No entanto, tal
como era esperado, em condições de precisão intermédia, os valores de DPR são superiores aos obtidos em condições de repetibilidade, sendo mais significativo para o padrão mais baixo (0,2 mL).
2.5 Exactidão
A exatidão do método foi avaliada através da análise de 10 réplicas de 3 soluções controlo (0,2, 0,6 e 1 mL). A figura 13 apresenta os resultados dos
volumes médios obtidos para cada controlo, em condições de repetibilidade.
Capítulo VI- Resultados e discussão
97
Figura 13: Análise de soluções controlo de ácido ascórbico, n=10.
O volume médio do padrão de controlo de 0,2 mL é 0,21 mL, apresentando
valores que variam entre 0,19 e 0,21 mL e um desvio padrão relativo de 3,8 %. O padrão de controlo de 0,6 mL apresenta um valor médio de 0,56 mL,
apresentando valores que variam entre 0,55 e 0,57 mL e um desvio padrão relativo de 1,4 %. O volume médio do padrão de controlo de 1 mL é 0,98 mL, apresentando valores que variam entre 0,96 e 0,98 mV e um desvio padrão
relativo de 0,9 %.
O desvio padrão relativo associado a cada um dos padrões foi sempre inferior ao critério de aceitação dos padrões controlo (DPR< 10%).
O erro associado a cada padrão controlo variou entre 2,6-6,8%, 4,3-9,0% e
1,5-4,3% para os padrões controlo de 0,2, 0,6 e 1 mL, respectivamente. Os resultados mostram que o método espectrofotométrico para a análise de ácido
ascórbico é exacto (erro < 10%).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0,2 mL 0,6 mL 1 mL
Volu
me (
mL)
Padrões Controlo
Valor Referência
Valor experimental
Capítulo VI- Resultados e discussão
98
2.6 Controlo de qualidade interno (CQI)
Como controlo de qualidade interno procedeu-se à avaliação da curva de calibração (coeficiente de determinação, declive e ordenada na origem), soluções padrão controlo correspondentes aos extremos e meio da curva de
calibração (0,2, 0,6 e 1 mL de corante), ensaio de recuperação e análise de duplicados.
Os valores obtidos ao longo das séries de trabalho permitiram elaborar as primeiras cartas de controlo de médias e amplitudes do método
espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico (Tabela 17).
Todas as séries de trabalho cumprem o requisito do critério de aceitação definido para o coeficiente de determinação (R2
≥ 0,995), uma vez que os
valores oscilaram entre 0,997 e 1,000.
Os declives apresentam um valor médio de 0,32 com um desvio padrão relativo de 2,5%. A maior dispersão verifica-se ao nível da ordenada na origem (DPR=34%), em virtude da oscilação em torno de valores positivos e
negativos.
Ao longo das várias séries de trabalho o erro associado aos controlos foi sempre inferior a 10%, uma vez que para este critério de aceitação, os controlos poderiam oscilar entre 0,18-0,22 mL (controlo de 0,20 mL), 0,54-
0,66 mL (controlo de 0,60 mL) e 0,90-1,1 mL (controlo de 1,0 mL). Podemos assim concluir que, o método é exacto na gama de trabalho validada.
A exactidão do método também foi avaliada através da fortificação das várias matrizes analisadas com ácido ascórbico (ensaio de recuperação). A
recuperação oscilou entre 94 e 122 %, embora apenas duas amostras tivessem ultrapassado o critério de aceitação de 20% (121% e 122%). O método confirmou que é exacto, apresentando um valor médio de recuperação
de 101% com um desvio padrão de 11%.
A precisão associada à análise dos controlos é boa, com um desvio padrão relativo inferior a 4,0% para os três controlos em análise.
A precisão também foi avaliada através da análise de duplicados ao longo das várias séries de trabalho, obtendo-se um desvio padrão na ordem dos 4,0%.
A análise de duplicados permitiu verificar que o método é preciso. Há uma grande concordância entre os valores das réplicas ao longo das várias séries
de trabalho, obtendo-se uma diferença de duplicados média de 5,3%, com um desvio padrão de 3,6%.
Capítulo VI- Resultados e discussão
99
CQ
IP
arâm
etro
N
Carta d
e c
on
tro
loO
utro
s p
arâm
etro
s
Méd
iaLIA
LS
ALIC
LS
CM
ínim
oM
áxim
oD
PR
(%
)
Curva
calibração
Decli
ve
8
0,3
18
0,3
01
0,3
34
0,2
93
0,3
42
0,3
06
0,3
27
2,5
Ord
en
ad
a n
a o
rig
em
-0,0
198
-0,0
334
-0,0
062
-0,0
403
0,0
006
-0,0
310
-0,0
094
34
Co
efi
cie
nte
determ
inação
(R
2)
0,9
991
0,9
965
1,0
02
0,9
953
1,0
03
0,9
971
1,0
00
0,1
3
Padrões
Controlos
0,2
mL
14
0,2
04
0,1
89
0,2
20
0,1
81
0,2
28
0,1
90,2
23,8
0,6
mL
0,5
92
0,5
59
0,6
25
0,5
42
0,6
42
0,5
70,6
12,8
1,0
mL
1,0
05
0,9
81
1,0
30
0,9
69
1,0
42
0,9
81
1,0
24
1,2
Du
pli
cad
os
DD
(%
)15
5,3
-8#
-10#
010
3,6
*
Recu
peração
Rec (
%)
15
101
85
115
80
120
94
122
11*
*Valo
r corr
espondente
ao d
esvio
padrã
o (
DP)
# V
alo
res d
e L
SA e L
SC
definid
os p
elo
labora
tório
Tab
ela
1
7.
Parâ
metr
os
do
contr
olo
de
qualidade
inte
rno
rela
tivo
à
análise
de
ácid
o
ascórb
ico
pelo
m
éto
do
espetr
ofo
tom
étr
ico d
o 2
,6-d
iclo
rofe
nolindofe
nol.
Capítulo VI- Resultados e discussão
100
Uma vez que o desvio padrão e valor médio têm valores muito próximos, as variáveis LIA (limite inferior de aviso) e LIC (limite inferior de controlo) teriam valores negativos. Como estas variáveis não são representativas da diferença
de duplicados (%), cujos valores são sempre positivos, a carta de controlo apresenta apenas as LSC e LSA e o valor médio.
Como definimos como critério de aceitação da precisão 10%, definimos este valor como limite superior de controlo (LSC). Considerou-se como limite
superior de aviso 8%, isto é, o dobro do desvio padrão obtido arredondado à
unidade superior (23,6=7,2).
2.7 Análise de amostras
Depois de validado, o método espetrofotométrico foi aplicado à análise de 166 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17 sumos, 26 néctares, 3
bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões (tabela 18). No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.
Tabela 18. Teor médio de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal
continental.
Amostra n Média ±DP
(mg/100g)
Mínimo
(mg/100g)
Máximo
(mg/100g)
Refrigerantes 110 0,82 ± 0,49 0,01 2,2
Sumos 17 1,1 ± 0,39 0,57 2,0
Néctares 26 1,3 ± 0,45 0,58 1,9
Bebidas de sumo 3 1,0 ± 0,23 0,82 1,3
Concentrados 4 0,79 ± 0,17 0,58 0,99
Chás 3 0,22 ± 0,19 0,10 0,44
Infusões 3 0,47 ± 0,05 0,44 0,52
Total 166 0,90 0,50 0,01 2,2
Capítulo VI- Resultados e discussão
101
Apenas algumas amostras de refrigerantes apresentam teores de ácido ascórbico inferior ao LOQ expresso em mg/100g de produto (0,1 mg/ 100g).
Comparando os diferentes tipos de matriz, verifica-se que a concentração média de ácido ascórbico é maior em néctares, seguida dos sumos e bebidas
de sumo. A concentração de ácido ascórbico mais baixa foi observada em amostras de chá e em infusões com concentração média de ácido ascórbico
inferior a 0,50 mg/100 g. Os refrigerantes e os concentrados possuem teores de ácido ascórbico muito idênticos, apresentando valores médios de 0,82 mg/100g e 0,79 mg/100g, respectivamente.
Verifica-se que algumas marcas apresentam maiores teores de ácido ascórbico para produtos idênticos (tipo de bebida e/ou sabor). Para além disso, os
produtos infantis apresentam uma concentração de ácido ascórbico superior face aos restantes produtos analisados. Tal como esperado, os produtos à
base de laranja ou de outros citrinos possuem teores de ácido ascórbico mais elevados.
Os teores em ácido ascórbico nas várias matrizes apresentam diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,01). No entanto, não existem diferenças
estatisticamente significativas dos teores de ácido ascórbico nas matrizes de
refrigerantes, sumos, bebidas de sumo e concentrados (p > 0,05) e, ainda,
entre as matrizes de chás e infusões (p > 0,05).
É importante referir que a adição de ácido ascórbico sintético como antioxidante durante o processamento destes produtos aumenta a sua
qualidade e o seu valor nutricional, uma vez que também aumenta consideravelmente o seu teor de ácido ascórbico (22). A maioria das amostras analisadas possui como ingrediente o aditivo E300 (ácido ascórbico) de acordo
com o princípio quantum satis (166), à excepção dos chás e infusões, pelo que podemos concluir que o teor de ácido ascórbico nas amostras analisadas pode
ter origem natural e sintética.
3. Determinação do pH
3.1 Controlo de qualidade interno (CQI)
A análise do pH das amostras foi precedida da análise de dois padrões controlo de pH, pH=6,0±0,1 (20 ºC) e pH=6,8±0,1 (20 ºC).
As figuras 14 e 15 representam o erro associado à leitura de cada um dos padrões controlo. O pH médio do controlo de pH=6,0 é 6,01, apresentando
valores entre 5,9 e 6,1 e um desvio padrão relativo de 0,67%. O controlo de pH 6,8 apresenta um valor médio de 6,81, apresentando valores entre 6,7 e
6,9 e um desvio padrão relativo de 0,66%.
Capítulo V
102
Figura
Figura
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0p
H
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
pH
VI- Resultad
a 14. Erro
15: Erro
0,7
1
1 2
0,6
1
1 2
dos e discus
relativo d
relativo da
1,2
0,7
1,3
3 4 5
Valor experErro (%)
1,0
0,7
1,2
3 4 5
Valor expeErro (%)
ssão
a análise (n=
a análise d(n=
3
0,7
0,2
0
6 7Nº Cont
rimental
2
0,7
0,3
0
6 7Nº Cont
erimental
de padrõe=15).
de padrõe= 15).
0,5
0,2
0,7
8 9 10trolos
0,1
0,4
0,6
8 9 10trolos
es de contr
s de contr
0,3
0,7
1,
11 12 1
Controlo pH=Critério de a
6
0,7
0,4
0,
0 11 12 1
Controlo pH=Critério de ac
rolo de pH
rolo de pH
,0
0,2 0,2
0
13 14 15
=6,0ceitação
,7
0,4
0,6
0
13 14 15
=6,0ceitação
H=6,0±0,1
=6,8±0,1
,00,0
0,5
1,0
1,5
Err
o (
%)
0,3
0,0
0,5
1,0
1,5
Err
o (
%)
()
Capítulo VI- Resultados e discussão
103
O erro associado aos controlos de pH=6,0 e pH=6,8 variaram entre 0-1,3% e entre 0,1- 1,2%, respectivamente.
A análise de duplicados referentes a 15 amostras apresentou um valor médio de diferença de duplicados igual a 1,0% com um desvio padrão relativo de
0,71%.
Os resultados mostram que o método potenciométrico para a determinação do
pH é preciso (DPR1%) e exacto (erro < 1,5%).
3.2 Análise de amostras
Analisaram-se 164 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17 sumos, 24 néctares, 3 bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.
A tabela 19 apresenta os valores médios do pH nas 166 amostras analisadas.
Tabela 19. Valores médios do pH de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal
continental.
Amostra N Média ±DP Mínimo Máximo DPR
(%)
Refrigerantes 110 3,1 ± 0,27 2,4 3,7 8,6
Sumos 17 3,7 ± 0,15 3,2 3,9 4,2
Néctares 24 3,6 ± 0,24 3,0 3,8 6,8
Bebidas de sumo 3 3,6 ± 0,16 3,4 3,7 4,5
Concentrados 4 3,0 ± 0,38 2,7 3,5 13
Chás 3 6,0 ± 0,38 5,7 6,4 6,3
Infusões 3 5,7 ± 0,23 5,5 5,9 4,1
Total 164 3,4 0,59 2,4 6,4 18
Capítulo VI- Resultados e discussão
104
Existem diferenças estatisticamente significativas entre os valores de pH das amostras (p<0,05). O pH das amostras é maior nas amostras de chá
(pH=6,0± 0,38) e nas infusões (pH=5,7±0,23). As restantes amostras
apresentam valores de pH muito próximos e ácido (pH3-4). O valor de pH mais baixo foi observado nos refrigerantes (pH=2,4). A maior variação de pH
ocorre dentro dos refrigerantes, apresentando valores de pH mínimo e máximo de 2,4 e 3,7, respectivamente, sendo que as colas possuem pH mais ácido.
4. Determinação do potencial redox
4.1 Controlo de qualidade interno (CQI)
Ao longo de 15 séries de trabalho analisaram-se três padrões de controlo de potencial redox 475 mV, 255 mV e 86 mV (figura 16).
Figura 16. Análise dos padrões de controlo de potencial redox, n=15.
0
100
200
300
400
500
600
86 mV 255 mV 475 mV
mV
Padrões Controlo
Valor Referência
Valor experimental
Capítulo VI- Resultados e discussão
105
O potencial redox médio do padrão de controlo de 475 mV é 469 mV, apresentando valores entre 438 e 484 mV e um desvio padrão relativo de 2,6
%.
O padrão de controlo de 255 mV apresenta um valor médio de 258 mV,
apresentando valores entre 252 e 264 mV e um desvio padrão relativo de 1,5 %.
O potencial redox médio do padrão de controlo de 86 mV é 85 mV, apresentando valores que variam entre 81 e 90 mV e um desvio padrão
relativo de 3,3 %.
O desvio padrão associado a cada um dos padrões foi muito inferior ao critério
de aceitação dos padrões controlo (DPR=10%).
O erro associado a cada padrão controlo variou entre 0,81-6,3%, 0,24-3,7% e 0,06-7,7% para os padrões controlo de 86 mV, 255 mV e 475 mV, respectivamente.
Os resultados mostram que o método tem uma boa precisão e exactidão, a
qual foi comprovada pelos valores satisfatórios de DPR (< 1%) e pelos baixos valores de erro relativo obtidos na análise de controlos.
A análise de duplicados referentes a 15 amostras apresentou um valor médio de diferença de duplicados igual a 1,3% com um desvio padrão relativo de 0,90%.
Os resultados mostram que o método potenciométrico para a determinação do
potencial redox é preciso (DPR<2%) e exacto (erro<8%).
4.2 Análise de amostras
Analisaram-se 164 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17
sumos, 24 néctares, 3 bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.
A tabela 20 apresenta o potencial redox médio das 164 amostras analisadas.
Existem diferenças estatisticamente significativas entre os potenciais redox das matrizes em estudo (p<0,05). Todas as amostras analisadas possuem
potenciais redox positivos, portanto os meios são pouco oxidantes e as substâncias presentes nas matrizes alimentares não são oxidadas.
Capítulo VI- Resultados e discussão
106
Tabela 20. Potencial redox médio de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas
de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal
continental.
Amostra N Média ±DP Mínimo Máximo DPR
(%)
Refrigerantes 110 216± 65 119 450 30
Sumos 17 134 ± 21 105 184 16
Néctares 24 154 ± 20 125 194 13
Bebidas de sumo 3 140 ± 17 125 158 12
Concentrados 4 222 ± 47 166 275 21
Chás 3 105 ± 10 93 113 9,8
Infusões 3 120 ± 8,6 110 127 7,2
Total 164 193± 65 93 450 34
O potencial redox é maior em concentrados e nos refrigerantes com valores
médios na ordem dos 220 mV. No grupo dos refrigerantes, os valores mais elevados de potencial redox corresponderam às colas e ice teas. Os chás e as
infusões apresentam um potencial redox muito inferior, cerca de metade do valor dos refrigerantes e concentrados. Estas bebidas possuem propriedades
anti-oxidantes inerentes às plantas do chá e das infusões.
5. Questionários de frequência alimentar
A apresentação dos resultados resultantes da análise da informação recolhida nos questionários de frequência alimentar foi dividida em duas partes. A
primeira parte apresenta a caracterização e distribuição dos participantes envolvidos no presente estudo em função da idade, escola, região, peso, altura e escolaridade dos pais. A segunda parte compreende o tratamento e
análise de resultados dos questionários para estimativa da ingestão diária de fluoreto (DDI) a partir dos itens alimentares enumerados no QFA, a verificação
de relações entre a dose diária ingerida de fluoretos e algumas variáveis de interesse, bem como avaliar o risco de toxicidade pelos fluoretos a partir da
dieta.
Capítulo VI- Resultados e discussão
107
5.1 Caracterização da amostra
A amostra populacional é constituída por 217 crianças de ambos os sexos, com idades compreendidas entre os 5 e os 10 anos de idade.
5.1.1 Distribuição das crianças por idade e género
Das 217 crianças inquiridas, 110 (50,7%) são do sexo feminino e 107 (49,3%)
do sexo masculino. Verifica-se que existe uniformidade em relação ao género dos participantes inquiridos e que a amostra é maioritariamente representada
por crianças dos 6 aos 8 anos, inclusive (80,6%) (Figura 17). A média ± desvio padrão (DP) de idades é de 7,0 ± 1,2 anos.
Figura 17: Número de participantes distribuídos por idade e género,
n=217.
Capítulo VI- Resultados e discussão
108
5.1.2 Distribuição das crianças por peso e altura
Não foram considerados 9 inquiridos que não mencionaram o seu peso e 25 crianças que não fizeram referência à sua altura (n=192).
A distribuição das crianças por peso e altura em função da idade consta da figura 18.
A média do peso das crianças foi de 29 ± 6,8 kg, com valores compreendidos entre 16 e 61 kg. As crianças apresentam alturas, em cm, que variaram entre
93 e 156 cm, apresentado um valor médio de 131 ± 12 cm. Tal como seria expectável há um aumento do peso e da altura com a idade.
Figura 18: Descrição dos participantes por altura e peso em função da
idade.
5.1.3 Distribuição das crianças por escola e ano de
escolaridade
Capítulo VI- Resultados e discussão
109
A distribuição das crianças por escola e ano de escolaridade consta da figura 19.
Verifica-se que as escolas com maior participação de alunos no estudo foram as escolas de ensino público, nomeadamente as escolas A e C, apresentando
uma percentagem de participação de 33 e 32,3 %, respectivamente. Assim, 75 crianças (35%) frequentam o ensino privado e 142 (65%) o ensino público.
Figura 19: Distribuição dos participantes por escola e ano de escolaridade.
Capítulo VI- Resultados e discussão
110
Atendendo à escolaridade, é possível afirmar que estão bem representados os
quatro níveis de escolaridade, à excepção da escola D que não possui um número de participantes representativo dos três primeiros níveis de escolaridade, 1º, 2º e 3º anos respectivamente. A percentagem de
participantes dos 4 níveis de escolaridade (1º, 2º, 3º e 4º ano) é 20, 20, 29 e 31%, respectivamente.
5.1.4 Distribuição das crianças por região
As crianças foram categorizadas em duas regiões, urbana e rural, em função da escola que frequentavam. Os alunos das escolas C e D integram a região urbana e os alunos da escola A e B foram incluídos na região rural.
Da figura 20 consta a distribuição das crianças inquiridas por região urbana e
rural.
Das 217 crianças inquiridas, 94 (43%) frequentam escolas em meio urbano e
123 (57%) têm a sua escola situada em meio rural.
Figura 20: Número de participantes por região.
94
43%
123
57% Região Urbana
Região Rural
Capítulo VI- Resultados e discussão
111
5.1.5 Distribuição das crianças por nível de
escolaridade dos pais
A figura 21 apresenta a distribuição dos inquiridos por nível de escolaridade da mãe e do pai.
A partir da distribuição das crianças por escolaridade dos pais, observa-se que os níveis de escolaridade dos pais com maior representação são o ensino
secundário e a licenciatura, correspondendo 12% ao ensino básico, 37% ao ensino secundário, 13% a bacharelato, 31% a licenciatura e 7% a mestrado
ou doutoramento. Conclui-se, ainda, que a percentagem de pais com graus académicos superiores à licenciatura é pouco representativa, representando 6,3 e 6,7% da escolaridade do pai e da mãe, respectivamente. Do total de
participantes, 4% não apresentou resposta para o item escolaridade dos pais, pelo que da distribuição constam 209 crianças (Figura 5).
Figura 21: Nível de escolaridade dos pais e/ou encarregados de educação
dos participantes.
0 10 20 30 40
Ensino Básico
Ensino Secundário
Bacharelato
Licenciatura
Mestrado/Doutoramento
7,0
39
12
35
6,7
16
35
15
28
6,3
Percentagem (%)
Escolaridade do Pai
Escolaridade da Mãe
Capítulo VI- Resultados e discussão
112
5.2 Resultados dos questionários de frequência
alimentar
Foram recolhidas informações, através de QFA, que permitiram estimar a
frequência de consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. A estimativa diária da ingestão de fluoretos por
kg de peso corporal foi determinada através dos dados de consumo de cada criança obtidos no QFA, bem como pela utilização do teor de fluoretos em cada bebida, determinado analiticamente.
Tendo em conta que as crianças também ingerem quantidades apreciáveis de
fluoreto através da deglutição de pasta dentífrica, estimou-se a dose diária ingerida de fluoreto através das duas fontes de exposição, bebidas e pasta dentífrica, e através de regressão binária logística avaliou-se o risco de
toxicidade pelos fluoretos.
5.2.1 Estimativa da ingestão diária de fluoretos
Os 217 alunos inquiridos afirmaram consumir, em média, pelo menos uma vez por mês algumas das bebidas no período dos seis meses que precederam a aplicação do QFA. Conclui-se que os refrigerantes representam 85% do
consumo de bebidas pelas crianças e que os refrigerantes à base de extracto integram o tipo de bebida mais consumido pelos participantes (70%), sendo
que 29% das vezes este tipo de bebida é consumido pelo menos 1 vez por semana. As bebidas de sumo representam a menor opção de consumo por parte das crianças (0,52%) (Figura 22).
Capítulo VI- Resultados e discussão
113
Figura 22: Distribuição do consumo por tipo de bebida.
Tendo em conta, que dos 159 itens alimentares colocados no questionário de
frequência alimentar 98 foram sujeitos a análise para doseamento de fluoretos, determinou-se a quantidade média de fluoreto ingerido diariamente (mg fluoreto/kg de peso corporal) a partir destas fontes alimentares. Por outro
lado, a lavagem dos dentes pode aumentar a ingestão de fluoreto, principalmente nas crianças pois estas engolem toda ou uma grande parte da
pasta de dentes. Está legislado na União Europeia (89) que o teor de fluoreto em pastas dentífricas não deve exceder 1500 ppm por isso, considerando um teor médio de fluoreto de 750 ppm por pasta dentífrica e uma massa
recomendada de pasta por lavagem de 0,25 g, e ainda que a maioria da pasta seria engolida pela criança, determinou-se a contribuição de duas lavagens
diárias dos dentes na ingestão total de fluoretos (mg fluoreto/ kg de peso corporal/ dia).
Dos 217 inquiridos, 11 não responderam à questão relativa ao peso (kg), pelo que foram considerados como “missing values” e não foram contabilizados
para a estimativa da ingestão diária de fluoretos. Assim, os resultados a seguir apresentados reflectem o tratamento dos dados de 206 inquiridos.
Para a determinação da ingestão média de fluoretos a partir das bebidas, considerou-se o valor médio de cada categoria de frequência de consumo
alimentar assinalado no QFA. Os resultados da ingestão média de fluoretos foram discutidos em percentis (P95, P97,5 E P99) de modo a avaliar a dispersão da dose diária ingerida de fluoretos pelas crianças.
A tabela 21 apresenta os valores médios de ingestão diária de fluoreto a partir do consumo de bebidas e a média da estimativa de ingestão diária de fluoreto
70%
8,8%
5,8%
4,6%
4,4%
2,6%
1,5%
1,4%
0,52%
Refrigerante à base de
extracto
Néctares
Refrigerante à base de
sumo
Sumos
Refrigerante com gás
Concentrados
Chás
Infusões
Bebidas de sumo
Capítulo VI- Resultados e discussão
114
associada à exposição através do consumo de bebidas e de pasta dentífrica. Refere ainda o número de crianças que excedem a dose diária recomendada
(DDR) por esta via de exposição.
Tabela 21: Ingestão diária de fluoreto (mg/kg de peso corporal) dos inquiridos pelo consumo de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.
Fonte DDI Mínimo Máximo P95 P97,5 P99 n
(>DDR)
Bebidas 0,011 0,0 0,12 0,041 0,077 0,12 9
Refrigerante 0,009 0,0 0,112 0,039 0,076 0,11 9
Sumo 0,0003 0,0 0,007 0,0017 0,003 0,004 0
Néctar 0,0013 0,0 0,032 0,006 0,080 0,020 0
Bebida de
sumo 0,0 0,0 0,001 0,0 0,0 0,00 0
Concentrado 0,0 0,0 0,006 0,0 0,001 0,002 0
Chá 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0
Infusão 0,0 0,0 0,001 0,0 0,0 0,0 0
Bebidas e
pasta
dentífrica
0,024 0,010 0,14 0,057 0,094 0,13 12
A ingestão diária de fluoreto a partir do consumo de bebidas é superior ao valor legislado de DDR em 9 inquiridos (4,3%), sendo que, em todos os casos, é o consumo de refrigerantes que contribui com teores mais elevados de
fluoreto. A ingestão diária média de fluoretos pelas bebidas é de 0,011 mg/kg de peso corporal/dia.
No entanto, quando são consideradas as duas fontes de exposição ao fluoreto, verifica-se que, pelo menos 5% dos inquiridos (P95) ingerem uma dose de
fluoreto superior a 0,05 mg/kg de peso corporal/dia. A análise de variância (ANOVA) permite concluir que existem diferenças estatisticamente
significativas entre a ingestão diária de fluoreto nas duas fontes de fluoretos consideradas (bebidas e bebidas mais pasta) (p<0,01), cujo valor médio de ingestão aumenta com o aumento do número de fontes de exposição ao
fluoreto.
De modo a estimar o risco de toxicidade pelo fluoreto para uma frequência de consumo superior, no cálculo da ingestão diária de fluoreto e posterior estimativa do risco de toxicidade por regressão binária logística, considerou-se
o extremo superior de cada categoria assinalada no QFA, por exemplo, se o inquirido respondeu “1 a 3 vezes por mês” considera-se como frequência de
consumo 3 vezes por mês.
A tabela 22 apresenta os valores de ingestão diária de fluoreto pelas crianças
através do consumo de bebidas e de pasta dentífrica, considerando o extremo do intervalo da categoria de frequência de consumo alimentar.
Capítulo VI- Resultados e discussão
115
Tabela 22: Ingestão diária de fluoreto (mg/kg peso corporal) pelo consumo
de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.
Fonte DDI Mínimo Máximo P90 P95 P99 n
(>DDR)
Bebidas
0,019 0,005 0,13 0,035 0,052 0,13 11
Bebidas e
pasta
dentífrica
0,032 0,013 0,15 0,049 0,069 0,14 20
O valor médio de ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas
é 0,019 mg/kg de peso corporal e a ingestão diária de fluoretos pelas duas fontes de exposição, bebidas e pasta dentífrica, é 0,032 mg/kg de peso corporal/dia. Verifica-se que existem diferenças estatisticamente significativas
entre a ingestão diária de fluoretos e a partir do consumo de bebidas e a ingestão diária de fluoretos a partir do consumo de bebidas e de pasta
dentífrica (p<0,01), pelo que a deglutição de pasta durante a escovagem dos dentes aumenta consideravelmente a exposição ao fluoreto pela dieta.
É de salientar que, pelo menos, 5 % da população inquirida (P95) apresenta uma ingestão de fluoretos superior à dose diária recomendada (0,05 mg/kg
peso corporal/dia) através do consumo de bebidas. Quando considerada também a ingestão de pasta dentífrica como fonte de exposição ao fluoreto, cerca de 10% das crianças estão expostas a uma dose de fluoreto igual ou
superior à dose diária recomendada. Este valor poderia aumentar consideravelmente se fossem contabilizadas outras fontes de exposição ao
fluoreto, tais como a água de consumo público.
5.2.2 Regressão binária para avaliar o risco de
toxicidade por fluoretos
O objectivo da regressão logística é determinar a melhor relação entre a
variável resposta (a variável dependente, que neste estudo é o risco de toxicidade pelos fluoretos) e um conjunto de variáveis explicativas ou preditivas, cujo modelo final é aquele que minimiza o número de variáveis e
maximiza a precisão do modelo (167).
Com essa finalidade, foi aplicado o método de regressão logística binário, método stepwise foward, para definir um modelo que avalia o risco de toxicidade pelo fluoreto a partir de uma DDI de fluoreto superior a 0,05 mg/kg
de peso corporal. De entre os inquiridos, foram retiradas duas crianças por representarem outliers, pelo que a o modelo de regressão apresentado diz
respeito a 215 inquiridos.
Capítulo VI- Resultados e discussão
116
O modelo inicial apenas com uma constante, ou seja, considerando que todos os inquiridos não apresentam risco de toxicidade pelos fluoretos pelo consumo
dos itens alimentares em estudo, apresenta uma percentagem de acerto de 91,2 % (sendo que a percentagem de erro do método é de 8,8%).
A primeira variável a ser incluída é a que tiver a estatística Wald mais alta. No modelo final obtido, encontram-se as variáveis categóricas “Refrigerantes à
base de extracto” e “idade”, que apresentam estatísticas de Wald de 15,4 e 5,4, respectivamente.
Posteriormente, foram analisadas algumas estatísticas de avaliação do ajuste geral dos modelos de regressão logística, que constam da tabela 23. A estatística de probabilidade -2log likelihood diminui à medida que é incluída
uma variável no modelo. Por outro lado, as medidas pseudo R2 aumentaram à medida que as variáveis preditivas foram incorporadas no modelo. Isto indica
uma melhoria no ajuste do modelo. O pseudo R2 de Nagelkerke no último passo foi de 0,234, o que indica que 23,4% do risco de toxicidade pelo
fluoreto é explicado pelo consumo de refrigerantes à base de extracto e pela idade.
Tabela 23: Estatísticas de validação do modelo de regressão logística.
Passo -2 Log
likelihood
R2Cox &
Snell
R2
Nagelkerke
1 99,677 0,077 0,171
2 93,669 0,105 0,234
A medida Hosmer e Lemeshow avalia as diferenças estatísticas entre as
classificações previstas pelo modelo e as observadas da variável dependente, neste caso o risco de toxicidade, através da estatística chi-square. Um bom
ajuste de modelo é verificado por uma estatística chi-square não significativa (p>0,05) (167). Conclui-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre os resultados observados e os previstos pelo modelo de
regressão (tabela 24).
Tabela 24: Teste de Hosmer e Lemeshow.
Passo Qui-
quadrado Significância
1 1,919 0,589
2 9,306 0,231
Capítulo VI- Resultados e discussão
117
Estas medidas, no seu todo, provam um bom ajuste do modelo e sugerem a aceitação do modelo final como um modelo significativo de regressão binária.
A percentagem de acerto do modelo final de 2 variáveis é 92,2%, verificando-se que há um aumento na percentagem de acerto relativamente ao modelo
inicial (91,2%). Além disso, as taxas de acerto individuais são elevadas, o que sugere a ausência de erros na previsão de qualquer uma das variáveis.
Conclui-se que a estimativa do risco de toxicidade pelo fluoreto no modelo é precisa e que o modelo tem uma ótima sensibilidade (98,9%), porém baixa especificidade (23,5%).
Da tabela 25 consta a classificação do modelo final proposto por regressão binária para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos.
Tabela 25: Classificação do modelo final de regressão binária logística.
Observado
Previsto
Risco de
toxicidade Percentagem
0 1
Passo 1
Risco de toxicidade
0 175 1 99,4
1 16 1 5,90
Percentagem global 91,2
Passo 2
Risco de toxicidade
0 174 2 98,9
1 13 4 23,5
Percentagem global 92,2
Assim, o modelo de regressão binária logística utilizado neste trabalho permite
identificar o risco de toxicidade pelo fluoreto a partir do consumo de refrigerantes à base de extractos e da idade, segundo a equação (167):
1,482 - idade 0,626 - extrato de base à tesrefrigeran Consumo 0,464 Risco
A tabela 26 apresenta os coeficientes e razão de chance do modelo de
regressão binária proposto.
Capítulo VI- Resultados e discussão
118
Tabela 26: Coeficientes (B) e razão de chance (Exp(B)) da regressão binária para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos.
B Exp (B)
Passo 1
Refrigerantes à base de
extracto 0,450 1,569
Constante -3,16 0,043
Passo 2
Idade -0,626 0,534
Refrigerantes à base de
extracto 0,464 1,591
Constante -1,482 0,227
Verifica-se que o consumo de refrigerantes à base de extracto explica melhor
o risco de toxicidade (1,591) do que a idade (0,534).
Por exemplo, sempre que a categoria definida como frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto aumenta uma unidade, o risco de toxicidade
aumenta 59% (1,59 1 = 0,59). Da mesma forma se verifica que o aumento
de um ano na idade da criança diminui o risco de toxicidade pelo fluoreto, o que está de acordo com o expectável devido ao aumento do seu peso corporal.
Deste modo, tomando como exemplo, uma criança com 6 anos (definida com
um número 2 na variável idade na base de dados) e com uma frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto de 1 vez por dia (definida como número 6 na variável consumo na base de dados), tem-se que:
0,05 1,482 - 2 0,626 - 6 0,464 Risco
Assim, pode conclui-se que esta criança estaria no limiar máximo admissível e bastaria um pequeno aumento do consumo para ficar sujeita a risco de
toxicidade pelo fluoreto.
Capítulo VI- Resultados e discussão
119
5.2.3 Relações entre o consumo e variáveis de interesse
A fim de verificar possíveis diferenças entre o consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões e algumas
variáveis de interesse, foram realizados testes t para comparação de médias, uma vez que este teste é suficientemente robusto para distribuições que não estejam dentro da normalidade (168).
Importa referir que as relações a seguir apresentadas foram as que
consideramos serem as mais relevantes no âmbito deste trabalho.
5.2.3.1 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o
género e idade
Verifica-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre a dose diária ingerida de fluoretos e o género, informação que consta da tabela
27.
Verifica-se que não existe exposição diária ao fluoreto (DDI igual a zero)
através do consumo de bebidas de sumo, chás e infusões em ambos os sexos e de néctares no sexo feminino.
Embora se observe que os valores médios de ingestão diária de fluoreto a partir de sumos, néctares e concentrados são superiores no sexo feminino
relativamente ao sexo masculino, estes não são estatisticamente diferentes. Os rapazes apresentam um maior valor médio de ingestão diária de fluoreto a partir de refrigerantes face às raparigas. A ingestão diária média de fluoretos é
0,010 e 0,011 mg/kg de peso corporal nas raparigas e nos rapazes, respectivamente.
Relativamente à frequência de consumo da totalidade das bebidas por género, conclui-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre o
consumo médio e o género (p>0,05). No entanto, quando a análise é feita por tipo de bebida (refrigerante, sumo, néctar, bebida de sumo, concentrado, chá
e infusão), verifica-se que a frequência de consumo de sumos é estatisticamente superior (p<0,05) nas raparigas, em relação aos rapazes.
Capítulo VI- Resultados e discussão
120
Tabela 27: Valores médios da dose diária ingerida de fluoreto por género.
Bebida
Significância
estatística
(p-value)
Género
DDI de fluoretos
(mg/kg peso
corporal/dia)
Refrigerantes p >0,05
M 0,0101
F 0,0080
Sumos p >0,05
M 0,0002
F 0,0003
Néctares p >0,05
M 0,0011
F 0,0015
Bebidas de
sumo p >0,05
M 0,0
F 0,0
Concentrados p >0,05
M 0,0
F 0,0001
Chás p >0,05
M 0,0
F 0,0
Infusões p >0,05
M 0,0
F 0,0
Em relação à idade, não se observaram diferenças estatisticamente significativas na ingestão diária de fluoretos a partir do consumo de bebidas
entre as crianças dos 5 aos 10 anos. Também não existem diferenças significativas na frequência de consumo e a idade das crianças, pelo que não é
possível definir um perfil de consumo ao longo da faixa etária estudada. Contudo, verifica-se uma tendência de maior consumo de chás e infusões nas crianças mais velhas, cuja significância estatística não foi possível determinar
uma vez que o consumo destes itens alimentares não foi representativo da amostra populacional.
Capítulo VI- Resultados e discussão
121
5.2.3.2 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a região
Da tabela 28 consta a distribuição dos valores médios da ingestão diária de fluoretos por região rural e urbana.
Tabela 28: Valores médios de ingestão diária de fluoretos, por região.
Bebida
Significância
estatística
(p-value)
Região
DDI de fluoretos
(mg/kg peso
corporal/dia)
Refrigerantes p < 0,01 Rural 0,0118
Urbana 0,0052
Sumos p < 0,05 Rural 0,0001
Urbana 0,0004
Néctares p >0,05 Rural 0,0013
Urbana 0,0013
Bebidas de sumo p >0,05 Rural 0,0
Urbana 0,0
Concentrados p >0,05 Rural 0,0
Urbana 0,0001
Chás p >0,05 Rural 0,0
Urbana 0,0
Infusões p >0,05 Rural 0,0
Urbana 0,0
Pela comparação dos valores médios de ingestão de fluoretos entre as regiões
rural e urbana verifica-se que apenas existem diferenças estatisticamente significativas no caso dos refrigerantes e sumos, sendo que a ingestão diária
de fluoretos via refrigerantes é superior nas crianças da região rural enquanto isso acontece com as crianças da região urbana relativamente aos sumos.
Relativamente ao consumo de bebidas, verifica-se que a frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto é estatisticamente superior (p<
0,05) na região rural, face à região urbana. Não existem diferenças significativas entre consumo dos restantes tipos de bebidas nas duas regiões.
Capítulo VI- Resultados e discussão
122
5.2.3.3 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a escolaridade dos pais
Avaliou-se a possível influência da escolaridade do pai e da mãe no consumo de bebidas refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados,
chás e infusões e, consequentemente, a ingestão diária de fluoretos através das bebidas.
Verificou-se haver uma maior frequência de consumo de refrigerantes (p< 0,01) e chás (p< 0,05) quando a escolaridade do pai é mais baixa, . Porém,
quanto à ingestão diária de fluoretos só são verificadas diferenças estatisticamente significativas quando estes são veiculados através de refrigerantes (p< 0,05), ou seja, quando o nível de escolaridade do pai é
menor o consumo de refrigerantes e, consequentemente, a ingestão diária de fluoretos é maior.
Conclui-se assim que a escolaridade do pai ao nível do Ensino Básico e Secundário tem um maior impacte no consumo e na ingestão diária de
fluoreto (p< 0,01) comparativamente a pais com grau de Mestre ou de Doutor.
Procedendo-se de igual modo relativamente ao nível de escolaridade da mãe, verificou-se que a frequência de consumo de sumos (p< 0,05) e concentrados
(p< 0,01) é significativamente superior para níveis de escolaridade mais baixa. O consumo de sumos e concentrados é maior (p< 0,05) quando as
mães só possuem o Ensino Secundário completo comparativamente às mães com Licenciatura. Quanto à ingestão diária de fluoretos só se verificam diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05) ao nível dos sumos, sendo
que a ingestão de fluoretos é maior (p< 0,05) em crianças cuja mãe possui apenas o Ensino Secundário , face à Licenciatura.
Em suma, pode estimar-se que a baixa escolaridade dos pais potencia o consumo de alguns dos géneros alimentícios em estudo, o que aumenta a
ingestão diária de fluoretos nas crianças e, consequentemente, o risco de manifestações tóxicas induzidas por este elemento.
5.2.3.4 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o tipo de escola
O tipo de escola, pública ou privada, não discrimina a ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas pelas crianças. Não se observam
diferenças estatisticamente significativas entre a ingestão diária de fluoretos, bem como na frequência de consumo de bebidas, em escolas do mesmo tipo mas de regiões distintas ou em escolas de tipo de ensino diferente de uma
mesma região.
Capítulo VI- Resultados e discussão
123
No entanto, tendo em conta que se verificaram diferenças estatisticamente significativas na frequência de consumo de bebidas e na dose diária ingerida
de fluoretos nas regiões rural e urbana (secção 5.2.3.2.), pode sugerir-se que não é a escolha do tipo de escola para os filhos que estará relacionada com consumos diferentes mas sim as regiões onde vivem os pais e as crianças.
6. Relação entre os resultados analíticos e os resultados da avaliação de consumo alimentar
As bebidas analisadas com maior teor médio de fluoretos são as bebidas de sumo (0,40 mg/L), seguida dos refrigerantes (0,39 mg/L) e dos sumos (0,37
mg/L), embora este último em menor quantidade. Porém, as bebidas de sumo e os sumos são consumidos em pequena percentagem pela população em
estudo, apresentando um consumo de apenas 0,52 e 4,6% respectivamente. Conclui-se assim que, tanto as bebidas de sumo como também os sumos, não constituem fontes apreciáveis de exposição ao fluoreto nas crianças.
Em contrapartida, os refrigerantes para além de apresentarem um teor de
fluoretos elevado face às restantes bebidas, são também o tipo de bebida eleito para consumo pelas crianças, representando cerca de 85% do consumo total de bebidas. Para além disso, alguns refrigerantes à base de extracto,
nomeadamente ice teas e tisanas, podem conter teores de fluoretos na ordem dos 2,0 mg/ L, aumentando consideravelmente a ingestão de fluoretos nas
crianças visto que este subgrupo dos refrigerantes também é um dos mais consumido (70%) pela população infantil inquirida. Através da análise de regressão binária também se verificou que o consumo de refrigerantes à base
de extracto é a variável que maior influência tem no risco de toxicidade pelos fluoretos
Conclui-se assim que o consumo de refrigerantes, principalmente de refrigerantes à base de extracto, pode ser responsável por uma ingestão diária
de fluoretos superior a 0,05 mg/kg de peso corporal (DDR), valor que poderá aumentar consideravelmente se consideradas todas as vias de exposição
diária das crianças a este elemento.
Os restantes tipos de bebidas apresentam teores médios de fluoretos entre
0,16 e 0,33 mg/L e apresentam um consumo inferior a 9%, pelo que não constituem por si só veículos maioritários de exposição ao fluoreto pela dieta.
Capítulo VII- Conclusões
125
Capítulo VII - Conclusões
O trabalho apresenta várias secções experimentais, nomeadamente, optimização e validação de métodos, estudos de ocorrência nas várias
matrizes alimentares em estudo (refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões) e questionário de frequência alimentar e
respectiva avaliação da ingestão de fluoretos. Por este motivo, as conclusões foram divididas em duas secções, em que na primeira se apresentam as conclusões sobre optimização, validação e controlo de qualidade dos métodos
instrumentais e na segunda a análise e interpretação dos resultados obtidos nas amostras e com os QFA.
1. Optimização, validação e controlo de qualidade dos métodos instrumentais
O método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo ao ião fluoreto permite a análise em rotina dos fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,
bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.
O método optimizado e validado é linear na gama entre 0,06-10 mg/L (F), apresentando um limite de determinação (R2) de 0,9956 e um coeficiente de variação (CVm) de 2,4 %. O método apresenta uma boa precisão no intervalo
de linearidade estudado, quer em condições de repetibilidade, quer em condições de precisão intermédia.
O limite de detecção e limite de quantificação determinados em condições de
repetibilidade foram de 0,003 e 0,009 mg/L (F), respectivamente, sendo que o limite de quantificação foi ajustado ao primeiro nível de concentração da gama
de trabalho (0,06 mg/L).
O método é preciso apresentando desvios padrão relativos inferiores a 10 %,
em condições de repetibilidade e de precisão intermédia, na gama de trabalho do método.
Os estudos de recuperação permitiram concluir que existem diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05) entre as várias matrizes estudadas
(refrigerantes, néctares, sumos, bebidas de sumo, infusões e chás), verificando-se que nos néctrares, chás e infusões as interferências de matriz são menores face às restantes matrizes alimentares.
No intervalo de valores de pH das amostras não existem diferenças
estatisticamente significativas para os teores de fluoretos a vários valores de pH e, deste modo, não há necessidade de métodos de pré-tratamento da amostra (correcção do valor de pH) no doseamento de fluoretos.
O limite de determinação do método é coincidente com o limite de
quantificação, apresentando um valor de 0,06 mg/L.
Capítulo VII- Conclusões
126
Os resultados dos ensaios de controlo de qualidade realizados em rotina (declive e ordenada da origem da curva de calibração, brancos, análise de
duplicados, análises de controlos e estudos de recuperação) cumpriram os critérios de aceitação definidos, à excepção do controlo correspondente ao primeiro ponto da curva de calibração, 0,06 mg/ L, sugerindo que em estudos
futuros o limite de quantificação do método, e consequentemente o primeiro ponto da curva de calibração, deverá ser igual a 0,1 mg/L.
O método espetrofotométrico do 2,6-diclorofenol-indofenol permite a determinação do teor em vitamina C nas várias bebidas e é linear na gama
entre 0,2-1,0 mL de corante. Em condições de repetibilidade, o limite de detecção e o limite de quantificação foram de 0,016 e 0,055 mL,
respectivamente. O limite de quantificação foi ajustado a 0,2 mL, correspondendo ao primeiro nível de volume da gama de trabalho (0,1 mg/100g de produto).
O método para a análise de ácido ascórbico é preciso, com desvios padrão
relativos inferiores a 10% em condições de repetibilidade e de precisão intermédia. O erro associado à análise de padrões de controlo apresenta uma variação inferior a 10% indicando que o método espectrofotométrico é exacto.
O controlo de qualidade interno (curva de calibração, soluções padrão controlo, ensaio de recuperação e análise de duplicados) cumpre os critérios
de aceitação definidos.
O método potenciométrico para a determinação do pH foi exato e preciso, apresentando valores de erro percentual inferiores a 1,5 % na análise de controlos e desvio padrão relativo de 0,71 % na análise de duplicados.
Em relação à determinação do potencial redox, o método é exato e preciso,
apresentando valores de erro inferiores a 8,0 % na análise de controlos e valores de desvio padrão relativo inferiores a 2 % na análise de duplicados.
2. Ácido ascórbico, pH, potencial redox e ocorrência de fluoretos
nas bebidas em estudo e avaliação da exposição aos fluoretos
em crianças dos 6 aos 10 anos
Relativamente à análise das amostras, o teor médio de ácido ascórbico é mais
elevado em néctares (1,25 ± 0,45 mg/100 g) e mais baixo em chás (0,22 ± 0,19 mg/100g) uma vez que, à excepção dos chás e infusões, o aditivo E300
(ácido ascórbico) é adicionado a estas matrizes alimentares com a finalidade de aumentar a qualidade do produto e/ou o seu valor nutricional. Os refrigerantes e os concentrados possuem teores de ácido ascórbico muito
idênticos, apresentando valores médios na ordem dos 0,8 mg/100g.
Existem diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações de ácido ascórbico de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões (p < 0,01), cuja diferença está associada
principalmente à grande dispersão de teores médios de ácido ascórbico entre os néctares e os chás.
Capítulo VII- Conclusões
127
As bebidas, vulgarmente conotadas como alimentação infantil, bem como os produtos à base de citrinos, possuem um maior teor de ácido ascórbico,
comparativamente às restantes amostras analisadas.
Relativamente ao pH, verifica-se que todas as matrizes analisadas são
ligeiramente ácidas. O pH é maior em chás (6,00 ± 0,38) e menor em concentrados de frutos (3,00 ± 0,38). No entanto, a nível individual, alguns
refrigerantes apresentam valores de pH inferiores a 3,0, nomeadamente as colas.
A análise de variância (ANOVA) indica que o pH em chás e infusões é significativamente mais elevado que nas restantes matrizes (p < 0,05) e que não existem diferenças estatisticamente significativas entre o pH de sumos,
néctares e bebidas de sumo. A maior variação de pH ocorre nos refrigerantes.
No que respeita ao potencial redox, conclui-se que este parâmetro é maior em concentrados (222 mV). Os chás e as infusões apresentam valores de potencial redox médios mais baixos (105 mV e 120 mV, respectivamente). No
entanto, foi dentro do grupo dos refrigerantes que se verificaram os valores mais elevados de potencial redox, nomeadamente nas cocas e ice teas. Todas
as matrizes estudadas são meios pouco oxidantes.
O potencial redox nas matrizes de concentrados e refrigerantes é
significativamente superior (p<0,05), face aos restantes tipos de bebidas analisados.
Em relação à análise de fluoretos, observa-se que a concentração média de fluoretos é mais elevada em bebidas de sumo (0,40±0,24 mg/L) e
refrigerantes (0,39 ± 0,34 mg/L) e mais baixa nas infusões (0,12±0,01 mg/L). Os néctares e os concentrados possuem teores de fluoretos muito
semelhantes (0,3 mg/L).
A maior dispersão de valores de fluoretos ocorre nas amostras de
refrigerantes (0,18 - 0,86 mg/L), sendo que o teor de fluoretos nos refrigerantes à base de extractos é significativamente superior (p<0,05) relativamente aos refrigerantes gaseificados e refrigerantes à base de sumo.
No entanto, não existem diferenças estatisticamente significativas na concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de
sumo, concentrados, chás e infusões (p>0,05).
Os resultados deste estudo mostram que os produtos consumidos por crianças
apresentam níveis consideráveis de fluoretos, principalmente as bebidas de sumo, os sumos e refrigerantes à base de extracto, podendo ser uma via de
exposição adicional aos fluoretos pela dieta. Porém, uma criança de 8 anos teria de consumir em média 135 L de uma destas bebidas para atingir a dose diária tóxica de fluoretos (2 mg/kg de peso corporal/dia).
A análise dos inquéritos de frequência de consumo alimentar permitiu verificar
que os refrigerantes, principalmente os refrigerantes à base de extracto, e os néctares são, dos tipos de bebidas estudados, aqueles que são mais consumidos pelas crianças da faixa etária estabelecida (5 a 10 anos). As
bebidas de sumo constituem o tipo de bebidas menos consumidas pelas crianças, apresentando uma percentagem de consumo inferior a 1%.
Capítulo VII- Conclusões
128
A ingestão diária média de fluoretos a partir do consumo de bebidas é 0,011 mg/kg de peso corporal, valor que aumenta consideravelmente quando
contabilizada também a deglutição de pasta dentífrica (0,024 mg/kg de peso corporal).
Das crianças inquiridas, 9 excedem a dose diária recomendada de fluoretos (0,05 mg/kg de peso corporal/dia), principalmente devido ao consumo de
refrigerantes. Se considerarmos também a deglutição de pasta dentífrica, 12 crianças excedem a dose diária recomendada de fluoretos. Conclui-se, porém, que não existem diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre a
ingestão diária de fluoretos veiculados pelas bebidas e a ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.
O modelo de regressão binária estimado para avaliação do risco de toxicidade dos fluoretos é preciso, possui uma percentagem de acerto elevada (92,2%) e
apresenta uma ótima sensibilidade (98,9%), porém baixa especificidade (23,5%). Segundo o modelo, o risco de toxicidade pelo fluoreto nas crianças
inquiridas também é explicado pelo consumo de refrigerantes à base de extracto e ainda pela idade, sendo que a primeira variável possui maior influência no modelo.
A utilização de testes t para comparação de médias permitiu concluir que o consumo de sumos é estatisticamente superior nas raparigas (p < 0,05),
porém o género não discrimina o consumo médio da totalidade das bebidas analisadas (p > 0,05). Relativamente à ingestão diária de fluoretos a partir de
bebidas, embora se verifique uma tendência de maior consumo nas raparigas face aos rapazes, esta não é significativo.
Não existem diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05) no consumo de bebidas e, consequentemente, na ingestão diária de fluoretos a partir
destas fontes e a idade das crianças, o que não permite definir um perfil de consumo e/ou de ingestão diária de fluoretos na faixa etária estudada.
Considerando a distribuição das crianças por regiões, rural e urbana, apenas existem diferenças no consumo de refrigerantes à base de exctrato nas duas
regiões, verificando-se que o consumo é estatisticamente superior na região rural (p < 0,05). A ingestão diária de fluoretos via refrigerantes e sumos é significativamente diferente nas regiões urbana e rural, concluindo-se que a
ingestão de fluoretos através de refrigerantes é superior nas crianças da região rural enquanto a ingestão de fluoretos via sumos é maior nas crianças
da região urbana.
Também a escolaridade dos pais permite discriminar o consumo de bebidas e
a ingestão diária de fluoretos a partir destas fontes da dieta. Relativamente à escolaridade do pai, verifica-se que o consumo de refrigerantes e,
consequentemente, a ingestão diária de fluoretos é maior para níveis de escolaridade mais baixos, apresentando o ensino básico e secundário um maior impacte face ao grau de mestre e doutor.
No que respeita à escolaridade da mãe, o consumo de sumos e concentrados
pelas crianças é superior quando a mãe apresenta o ensino secundário, relativamente à licenciatura. Contudo, a ingestão diária de fluoretos apenas é significativamente superior via sumos nas mães com ensino secundário face às
mães com licenciatura.
Capítulo VII- Conclusões
129
Conclui-se assim que níveis baixos de escolaridade dos pais potenciam o consumo de algumas bebidas pelas crianças e, consequentemente, a ingestão
diária de fluoretos.
Quanto ao tipo de escola frequentada pelas crianças, pública ou privada, não
se observam diferenças significativas (p > 0,05) no consumo de bebidas, bem como na ingestão diária de fluoretos por esta fonte de exposição, sugerindo
que o tipo de escola frequentada pela criança não tem influência no consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.
Após relacionar os resultados de determinação do teor de fluoretos nas bebidas com os resultados dos inquéritos de frequência de consumo alimentar,
verifica-se que os refrigerantes, para além de representarem um dos tipos de bebidas analisadas com maior teor de fluoretos (0,39 mg/L), são também as
bebidas mais consumidas (85%), com maior destaque os refrigerantes à base de extracto. Da mesma forma, a análise de regressão binária justifica o risco
de toxicidade pelos fluoretos com o aumento do consumo de refrigerantes à base de extracto.
Conclui-se então que o consumo de refrigerantes, nomeadamente refrigerantes à base de extractos, pode ser responsável por uma ingestão diária de fluoretos superior a 0,05 mg/ kg de peso corporal, face às restantes
bebidas que apresentam baixa percentagem de consumo (< 9%). Refere-se ainda que nenhuma das amostras analisadas ultrapassa a dose diária tóxica de
fluoretos (a nível individual). Os dados de consumo sugerem igualmente que a dose tóxica não é atingida.
Desta forma, relativamente aos fluoretos, ainda que sejam uma ferramenta de extrema importância no combate à cárie dentária e saúde oral das populações,
é pertinente o controlo da sua ingestão a partir do momento em que as crianças adoptam uma alimentação semelhante à dos adultos (a partir dos 12 meses). Deste modo, a consciencialização das populações quanto à relação
risco/benefício do flúor deve ser valorizada, principalmente em relação às crianças, pois são um grupo de elevada susceptibilidade à toxicidade pelo
fluoreto.
Em estudos futuros deveria-se ter em atenção os seguintes itens:
Aumentar o número de inquiridos e de regiões nacionais, com vista a
estimar e definir um padrão de consumo alimentar e/ou de ingestão diária de fluoretos pelas bebidas representativos do país, uma vez que o
número de participantes no presente estudo para a avaliação do consumo alimentar não é representativo da população infantil de Portugal Continental.
Comparar ou combinar o método de QFA com outras metodologias de avaliação de consumo, nomeadamente o método de diário alimentar,
pois em virtude do curto período de tempo disponível para a realização do presente trabalho não foi possível proceder à validação prévia do
QFA aplicado para a avaliação do consumo alimentar de crianças, o que poderá constituir uma limitação da metodologia aplicada pela ausência de prova de reprodutibilidade e exactidão dos resultados.
Capítulo VII- Conclusões
130
Deverá aumentar-se o número de bebidas estudadas na análise de fluoretos, aumentando o número de lotes de cada bebida, de forma a
aumentar a representatividade dos produtos que se encontram no mercado em Portugal.
No entanto, podemos concluir que, a exposição das crianças aos fluoretos tem aumentado, nomeadamente através da dieta, embora não sejam só as
bebidas que contribuem para esse aumento. Como tal, estudos que combinassem várias vias de exposição seriam uma forma de avaliar a
exposição aos fluoretos, não só das crianças mas da população portuguesa.
Anexos
131
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93. Official Journal of the European Communities.Council Directive 98/83/EC of 3 November 1998,on the quality of water intended for
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94. European Food Safety Authority EFSA. Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain on arequest of the Commission related
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95. Jornal Oficial da União Europeia,Directiva 2003/40/CE da Comissão de 16 de Maio de 2003,que estabelece a lista, os limites de concentração e as
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nascente., (2003).
96. European Food Safety Authority EFSA. Opinion of the scientific panel on
contaminants in the food chain on a request from the commission related to fluorine as undesirable substance in animal feed (Request N° EFSA-Q-2003-034). 2004.
97. Jornal Oficial da União Europeia.Directiva 2005/87/CE da Comissão de 5 de Dezembro de 2005,que altera o anexo I da Directiva 2002/32/CE do
Parlamento Europeu e do Conselho, relativa àssubstâncias indesejáveis nos alimentos para animais, no que respeita ao chumbo, flúor e cádmio., (2005).
98. Decreto-Lei n.º 236/2009 de 15 de Setembro, Diário da República, 1.ª série, n.º 179,15 de Setembro de 2009, (2009).
99. Gonçalves F. Nutrição Humana. 3ª Edição ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian; 2005.
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
138
100. Haftenberger M, Heuer T, Heidemann C, Kube F, Krems C, Mensink G. Relative validation of a food frequency questionnaire for national health
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107. Zukowska J, Biziuk M. Methodological evaluation of method for dietary
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113. Slater B, Philippi S, Fisberg R, Latorre M. Validation of a semi-quantitative adolescent food frequency questionnaire applied at a public
Anexos
139
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114. Cheng Y, Yan H, Dibley M, Shen Y, Li Q, Zeng L. Validity and reproducibility of a semi-quantitative food frequency questionnaire for use among pregnant women in rural China. Asia Pacific Journal of Clinical
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116. Swierk M, Williams P, Wilcox J, Russell K, Meyer B. Validation of an Australian electronic food frequency questionnaire to measure
polyunsaturated fatty acid intake. Nutrition. 2011;27(6):641-6.
117. Shatenstein B, Amre D, Jabbour M, Feguery H. Examining the Relative
Validity of an Adult Food Frequency Questionnaire in Children and Adolescents. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 2010;51(5):645-52.
118. Ishihara J, Yamamoto S, Iso H, Inoue M, Tsugane S, Grp JFVS. Validity of a self-administered food frequency questionnaire (FFQ) and its
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119. Miller M, Yeo Y, Khor M, Clover E, Magarey A. Repeatability of a Short
Food Frequency Questionnaire to Assess Calcium Intake in Older Australians. Journal of Aging Research. 2010;June 7:1-5.
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121. Badugu R, Lakowicz J, Geddes C. A wavelength-ratiometric fluoride-sensitive probe based on the quinolinium nucleus and boronic acid
moiety. Sensors and Actuators B-Chemical. 2005;104(1):103-10.
122. Noh J, Coetzee P. Evaluation of the potentiometric determination of trace
fluoride in natural and drinking water with a fluoride ISE. Water Sa. 2007;33(4):519-29.
123. Badugu R, Lakowicz J, Geddes C. Anion sensing using quinolinium based
boronic acid probes. Current Analytical Chemistry. 2005;1(2):157-70.
124. Garrido M, Lista A, Palomeque M, Band B. Fluorimetric determination of
fluoride in a flow assembly integrated on-line to an open/closed FIA system to remove interference by solid phase extraction. Talanta. 2002;58(5):849-53.
125. Zolgharnein J, Shahrjerdi A, Azimi G, Ghasemi J. Spectrophotometric Determination of Trace Amounts of Fluoride Using an Al-Xylenol Orange
Complex as a Colored Reagent. Analytical Sciences. 2009;25(10):1249-53.
126. Environmental Protection Agency. Determination of Inorganic Anions by
Ion Chromatography. EPA 30001993.
127. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. IC with
Chemical Suppression of Eluent Conductivity. SMEWW 4110 B1997.
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
140
128. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Ion-Selective Electrode Method. SMEWW 4500-F C1997.
129. International Organization for Standardization. Water quality - Determination of fluoride. Part 1: Electrochemical probe method for potable and lightly polluted water ISO 10359-11992.
130. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Complexone Method. 4500-F E1997.
131. Environment Protection Agency. Fluoride by Colorimetry. EPA Method 34031971.
132. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. SPADNS
Method. 4500-F D1997.
133. Ferreira R, Benedet H. Comparação de Métodos para a Determinação do
Flúor. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos. 1999;17(1):53-8.
134. Bandini T, Vilela M, Macêdo J. Utilização do método colorimétrico spadns
para análise de fluoreto em águas de abastecimento em juiz de fora (mg). Revista Analítica. 2003;5(4).
135. Neal M, Neal C, Wickham H, Harman S. Determination of bromide, chloride, fluoride, nitrate and sulphate by ion chromatography: comparisons of methodologies for rainfall, cloud water and river waters at
the Plynlimon catchments of mid-Wales. Hydrology and Earth System Sciences. 2007;11(1):294-300.
136. Kayal N, Singhb N. New Approach for the Determination of Fluorine in Glass. Eurasian Journal of Analytical Chemistry. 2007;2(3):142-50.
137. Agency EP. Fluoride by Colorimetry. EPA Method 34031971.
138. Nishimoto J, Yamada T, Tabata M. Solvent extraction and fluorometric determination of fluoride ion at ppb level in the presence of large excess
of aluminum(III) and iron(III) by using an expanded porphyrin, sapphyrin. Analytica Chimica Acta. 2001;428:201-8.
139. Farajzadeh M. An extractive-spectrophotometric method for determination of fluoride ions in natural waters based on its bleaching effect on the iron (III)-thiocyanate complex. Journal of the Chinese
Chemical Society. 2004;51(2):303-8.
140. Leal AAX, Henriques CA, Luna AS. Revalidação do método analítico de
determinação de pH associado à troca de equipamento. Revista Analytica. 2008;33:52-5.
141. Duly E, Luney S, Trinick T, Murray J, Comer J. Validation of an ion
selective electrode system for the analysis of serum fluoride ion. Journal of Automatic Chemistry. 1995;17(6):219-23.
142. Yuwono M. Determination of fluoride in black, green and herbal teas by ion selective electrode using a standard addition method. Dental Journal (Maj Ked Gigi). 2005;38(2):91-5.
143. Yuwono M, Ebel S. Determination of fluoride impurities in calcium ascorbate comparison of gas chromatography and ion selective electrode
potentiometry. Archiv Der Pharmazie. 1997;330(11):348-52.
Anexos
141
144. Bratovcic A, Odobasic A, Catic S. The advantages of the use of ion-selective potentiometry in relation to UV/VIS spectroscopy. Agriculturae
Conspectus Scientificus. 2009;74(3):139-42.
145. Rajkovic M, Novakovic I. Determination of fluoride content in drinking water and tea infusions using fluoride ion selective electrode Journal of
Agricultural Sciences. 2007;52(2):155-68.
146. Borjigin S, Ashimura Y, Yoshioka T, Mizoguchi T. Determination of
Fluoride Using Ion-selective Electrodes in the Presence of Aluminum. Analytical Sciences. 2009;25(12):1437-43.
147. Konieczka P, Zygmunt B, Namiesnik J. Comparison of fluoride ion-
selective electrode based potentiometric methods of fluoride determination in human urine. Bulletin of Environmental Contamination
and Toxicology. 2000:794-803.
148. Oliveira RG, Godoy HT, Prado MA. Optimization of a colorimetric method to determine ascorbic acids in fruit jelly. 2010;30(1):244-9.
149. NP-3030: Frutos, produtos hortícolas e seus derivados. Determinação do teor de ácido ascórbico. Processos correntes, (1985).
150. Clesceri L, Greenberg A, Eaton A. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th ed. Washington DC: American Public Association; 2005.
151. NP EN ISO/IEC 17025: 2005, Requisitos gerais de competência para laboratórios. IPQ; 2005.
152. RELACRE. Guia RELACRE 13 Validação de métodos internos de ensaio em análise química. Fevereiro 2000 ed: Associação de Laboratórios Acreditados de Portugal; 2000.
153. EURACHEM. The fitness for purpose of analytical methods - a laboratory guide to method validation and related topics. 1998 [20-01-09];
Available from: http://www.eurachem.org/guides/mval.htm.
154. EURACHEM. Guide to quality in analytical chemistry. 2002 [20-01-09];
Available from: http://www.eurachem.org/guides/accr.htm.
155. Thompson M, Ellison SLR, Wood R. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical Report).
Pure and Applied Chemistry. 2002;74(5):835-55.
156. International Organization for Standardization ISO. Water Quality -
calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance characteristics. Part 1 : statistical evaluation of the linear calibration function. ISO 8466-1. Geneva1990.
157. International Organization for Standardization ISO. Water Quality - calibration and evaluation of analytical methods and estimation of
performance characteristics. Part 2: calibration strategy for non-linear second order calibration functions. ISO 8466-2. Geneva1993.
158. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness
and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions. ISO 5725-1. Geneva1994.
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
142
159. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 6: Use in
paractice of accuracy values. ISO 5725-6. Geneva1994.
160. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: basic
method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. ISO 5725-2. Geneva1994.
161. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Electrometric Method. 4500-H+ B2000.
162. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Oxidation-
Reduction Potencial Measurement in Clean Water. SMEWW 25801997.
163. Porto AA. "Contributo para a estimativa de edulcorantes intensos num
grupo de jovens estudantes em portugal", dissertação para a obtenção do grau de Mestre.: Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.; 2009.
164. Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Directiva 2001/112/CE do Conselho de 20 de Dezembro de 2001, relativa aos sumos de frutos e a
determinados produtos similares destinados à alimentação humana., (2002).
165. Portaria nº 703/96 de 6 de Dezembro, Diário da República, Iª Série - B,
nº 282, 6 de Dezembro de 1996. 1996.
166. Decreto-Lei n.º 363/98 de 19 de Novembro,Diário da República, Iª Série,
n.º 268, 19 de Novembro de 1998, (1998).
167. Maroco J. Análise Estatística com Utilização do SPSS. 3ª Edição ed: Silabo; 2007. 824 p.
168. Lumley T, Diehr P, Emerson S, Chen L. The importance of the normality assumption in large public health data sets. Annual Review of Public
Health. 2002;23:151-69.
169. Barreira MJMM. "Ocorrência de patulina em alimentos destinados a
lactentes e crianças: optimização e validação do método de análise por SPE-HPLC-UV", Dissertação para a obtenção do grau de Mestre.: Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.; 2009.
Anexos
143
Anexos
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
144
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
Tabela 29. Características das amostras de refrigerantes.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RAa1I
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de limão
(0,1%), extrato de
chá preto (0,12%)
RAa1II
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de limão
(0,1%), extrato de
chá preto (0,12%)
RAa2IV
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de manga
(0,2%), extrato de
chá preto (0,1%)
RAa2V
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de manga
(0,2%), extrato de
chá preto (0,1%)
RAa2VI
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de manga
(0,2%), extrato de
chá preto (0,1%)
RAa3VII
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%), extrato de
chá preto (0,12%)
RAa3VIII
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%), extrato de
chá preto (0,12%)
RAa3IX
Refrigerante de
extrato de chá
e sumo á base
de concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%), extrato de
chá preto (0,12%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
145
Tabela 30. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RAb1X1
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de fruta (18%)
maçã, laranja,
ananás e manga,
polpa de goiaba
(1,5%), polpa de
banana (0,5%)
RAb1X2
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de fruta (18%)
maçã, laranja,
ananás e manga,
polpa de goiaba
(1,5%), polpa de
banana (0,5%)
RAb1X3
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de fruta (18%)
maçã, laranja,
ananás e manga,
polpa de goiaba
(1,5%), polpa de
banana (0,5%)
RAb2XI2
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de laranja
(10%) maçã, ananás
e manga (9%), polpa
de alperce (0,5%)
RAb2XI3
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de laranja
(10%) maçã, ananás
e manga (9%), polpa
de alperce (0,5%)
RAb3XII1
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de ananás
(10%), maçã e
laranja (4,5%) e
polpa de banana
(0,5%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
146
Tabela 31. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RAb3XII2
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de ananás
(10%), maçã e
laranja (4,5%) e
polpa de banana
(0,5%)
RAb3XII3
Bebida
refrigerante de
sumo de fruta
200 mL N.A
Sumo de ananás
(10%), maçã e
laranja (4,5%) e
polpa de banana
(0,5%)
RAc1XIII
Refrigerante
gaseificado de
extratos
vegetais
1500
mL N.A Extratos Vegetais
RBa1I1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBa1I2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBa1I3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBb1II1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBb1II2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBb1II3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBb2III1 Sumo de fruta 200 mL N.A Sumo de laranja á
base de concentrado
RBb2III2 Sumo de fruta 200 mL N.A Sumo de laranja á
base de concentrado
RBb2III3 Sumo de fruta 200 mL N.A Sumo de laranja á
base de concentrado
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
147
Tabela 32. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RBc1IV1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã,
maracujá e ananás,
puré concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
RBc1IV2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã,
maracujá e ananás,
puré concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
RBc1IV3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã,
maracujá e ananás,
puré concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
RBc2V1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã,
aroma de pêssego
RBc2V2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã,
aroma de pêssego
RBc2V3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã,
aroma de pêssego
RBd1VI1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
RBd1VI2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
148
Tabela 33. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RBd1VI3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
RBd2VII1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
RBd2VII2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
RBd2VII3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã
RBe1VIII1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBe1VIII2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBe1VIII3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja a
partir de concentrado
RBe2IX1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
maçã, limão, ananás
e maracujá. Puré
concentrado de
alperce, manga ,
banana, goiaba,
papaia e pêssego
RBe2IX2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
maçã, limão, ananás
e maracujá. Puré
concentrado de
alperce, manga ,
banana, goiaba,
papaia e pêssego
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
149
Tabela 34. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RBe2IX3 Refrigerante de
sumo de Fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
maçã, limão, ananás
e maracujá. Puré
concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego
RBe3X1 Refrigerante de
sumo de Fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBe3X2 Refrigerante de
sumo de Fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBe3X3 Refrigerante de
sumo de Fruta 200 mL N.A
Puré concentrado de
pêssego e maçã,
extrato de maçã.
RBa2XI1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã ananás e
maracujá, puré de
concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
RBa2XI2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã ananás e
maracujá, puré de
concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
RBa2XI3 Refrigerante de
sumo de Fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, maçã ananás e
maracujá, puré de
concentrado de
alperce, manga,
banana, goiaba,
papaia e pêssego.
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
150
Tabela 35. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RCa1I1
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão á
base de concentrado
(1%), extrato de chá
preto (0,12%)
RCa1I2
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão á
base de concentrado
(1%), extrato de chá
preto (0,12%)
RCa1I3
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão á
base de concentrado
(1%), extrato de chá
preto (0,12%)
RCa2II1
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de manga á
base de concentrado
(0,2%), extrato de
chá preto (0,07%)
RCa2II2
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de manga á
base de concentrado
(0,2%), extrato de
chá preto (0,07%)
RCa2II3
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de manga á
base de concentrado
(0,2%), extrato de
chá preto (0,07%)
RCa3III1
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego á
base de concentrado
(0,2%), extrato de
chá preto (0,06%)
RCa3III2
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego á
base de concentrado
(0,2%), extrato de
chá preto (0,06%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
151
Tabela 36.Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RCa3III3
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%), extrato de chá
preto (0,06%)
RCb1IV Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RCb1V1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RCb1V2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RCb1VI1 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RCb1VI2 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RCb1VI3 Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã,
laranja, ananás,
banana, alperce,
goiaba, limão, toranja,
uva e kiwi
RD1I1 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
ananás (10%), sumo
de maçã, laranja,
maracujá, alperce,
goiaba, manga e
banana
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
152
Tabela 37. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RD1I2 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
ananás (10%), sumo
de maçã, laranja,
maracujá, alperce,
goiaba, manga e
banana
RD1I3 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
ananás (10%), sumo
de maçã, laranja,
maracujá, alperce,
goiaba, manga e
banana
RD2II1 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumos de maçã,
laranja, maracujá,
ananás, alperce,
goiaba, manga e
banana
RD2II2 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumos de maçã,
laranja, maracujá,
ananás, alperce,
goiaba, manga e
banana
RD2II3 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumos de maçã,
laranja, maracujá,
ananás, alperce,
goiaba, manga e
banana
RD3III1 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
morango (6%), sumo
de laranja, ananás,
maracujá, ananás,
alperce, goiaba,
manga e banana
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
153
Tabela 38. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RD3III2 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
morango (6%), sumo
de laranja, ananás,
maracujá, ananás,
alperce, goiaba,
manga e banana
RD3III3 Refrigerante de
sumos de fruta 200 mL N.A
Sumo e polpa de
morango (6%), sumo
de laranja, ananás,
maracujá, ananás,
alperce, goiaba,
manga e banana
REa1I
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão (1%)
á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
REa1II
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão (1%)
á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
REa1III
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de limão (1%)
á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
REa2IV
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%) á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
REa2V
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%) á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
154
Tabela 39. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
REa2VI
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(0,2%) á base de
concentrado, extrato
de chá (0,1%)
RFa1I Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de limão, sumo
de ananás (3%),
sumo de laranja
(3%), sumo de
tangerina
RFb1II Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de fruta de
laranja (4%), limão
(3,5%) sumo de
ananás (1,5%), polpa
de graviola á base de
graviola (1%)
RFc1III Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã
(8,9%), romã (1%),
arando
RFd1IV Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de laranja
(3,9%), sumo de
limão (3,6%), sumo
de ananás (1,5%),
sumo de maracujá
(1%).
RFe1V Refrigerante de
sumo de fruta 200 mL N.A
Sumo de maçã
(8,3%), sumo de
morango (1%), sumo
de framboesa, sumo
de amora a partir de
um concentrado.
RHa1I
Refrigerante
aromatizado
com frutos
2000
mL N.A
Sumo de maçã
proveniente de
concentrado (0,8%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
155
Tabela 40. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RHa2II
Refrigerante
aromatizado com
frutos
2000
mL N.A Frutos tropicais
RHb1III
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
2000
mL N.A
Sumo de ananás
proveniente de
concentrado (0,5%)
RIa2II Refrigerante de
sumo 500 mL N.A
Sumo de maçã
(28%), sumo de
limão (1,6%), extrato
de ginkgo biloba
(0,01%)
RIa3III Refrigerante de
sumo 500 mL N.A
Sumo de maçã
(28%),sumo de limão
(1,6%), extrato de
gingko biloba
(0,01%)
RIa4IV
Refrigerante de
extratos de
ervas
500 mL N.A
Sumo de maçã (23%)
,sumo de abacaxi
(5,1%) sumo de
limão (1,3%), extrato
de erva-mate
(0,03%)
RIb1IV
Refrigerante de
extratos de
ervas
330 mL N.A
Sumo de limão
(0,6%), extrato de
chá preto com aroma
de bergamota
(0,14%)
RIb2V
Refrigerante de
extratos de
ervas
330 mL N.A
Sumo de
limão(0,5%), extrato
natural de ervas:
tilia, camomila, e
cidreira (0,25%)
RJaI
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
1000
mL N.A Extratos Vegetais
RJbII
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
1000
mL N.A Extratos Vegetais
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
156
Tabela 41. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RJcIII
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
1000
mL N.A Extratos Vegetais
RJcIV
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
330 mL N.A Extratos Vegetais
RLI
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
1000
mL N.A Extratos Vegetais
RLaII
Refrigerante á
base de extratos
vegetais
330 mL N.A Extratos Vegetais
RM1I
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
500 mL N.A
Chá: água e extrato
de chá preto (4,7%),
sumo de limão á base
de concentrado
(0,1%)
RM2II
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
500 mL N.A
Chá: água e extrato
de chá preto (4,7%),
sumo de manga á
base de concentrado
(0,13%)
RM3III
Refrigerante de
extrato de chá
com sumo
500 mL N.A
Chá: água e extrato
de chá preto (4,7%),
sumo de pêssego á
base de concentrado
(0,1%)
RN1I
Refrigerante de
extratos
vegetais
500 mL N.A Extrato de chá
RO1I
Refrigerante
aromatizado
com água de
nascente
500 mL N.A Água de nascente e
aroma de limão
RO2II
Refrigerante
aromatizado
com água de
nascente
500 mL N.A Água de nascente e
aroma de limão
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
157
Tabela 42. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RO3III
Refrigerante
aromatizado
com água de
nascente
500 mL N.A Água de nascente
RP1I Refrigerante de
sumo de frutas 250 mL N.A
Sumo concentrado de
ananás (6%)
RQ1I Refrigerante de
sumo de frutas 250 mL N.A
Sumo de laranja,
limão, toranja e
tangerina proveniente
de concentrado
(12%), polpa de
laranja (2%) e Extrato
de casca de laranja
RR1I Refrigerante de
sumo de frutas 250 mL N.A
Sumo e polpa de
laranja (10%)
RR1II Refrigerante de
sumo de frutas 250 mL N.A
Sumo e polpa de
laranja (10%)
RS1I Refrigerante de
sumo
1000
mL N.A
Sumo de limão
(13,5%) á base de
concentrado, polpa de
limão
RT1I Refrigerante de
sumo de frutas
1500
mL N.A
Sumo de laranja
(12%), sumo de
limão(5%), sumo de
cenoura(3%),sumo de
maçã
RT2II Refrigerante de
sumo de frutas
1000
mL N.A
Sumo de ananás
(20%) e extrato de
erva-cidreira (0,02%)
RU1I Refrigerante de
sumo de frutos
1500
mL N.A
Sumo de ananás
proveniente de
concentrado (9,2%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
158
Tabela 43. Características das amostras de refrigerantes (continuação).
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
RU2II Refrigerante de
sumo de frutos
1500
mL N.A
Sumo de laranja
proveniente de
concentrado (8,7%)
RV1I Refrigerante de
sumo de frutos
1000
mL N.A
Sumo de laranja á
base de concentrado
(8 %)
RV2II Refrigerante de
sumo de frutos
1000
mL N.A
Sumo de laranja á
base de concentrado
(8 %)
RX1I Refrigerante de
sumo de frutas
1500
mL N.A
Sumos de Laranja
(14%) proveniente de
concentrado
RX2II Refrigerante de
sumo de frutas
1500
mL N.A
Sumos de maracujá
(5%) e Laranja (5%)
provenientes de
concentrados
RWI Refrigerante
aromatizado 330 mL N.A
Refrigerante
aromatizado de lima-
limão
RZ1I
Refrigerante de
extratos
vegetais
250 mL N.A extratos vegetais de
lima-limão
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
159
Tabela 44. Características das amostras de sumo.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
SAa1I1
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A
Sumo de ananás (51%)
e sumo de uva á base
de concentrado (49%)
SAa1I2
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A
Sumo de ananás (51%)
e sumo de uva á base
de concentrado (49%)
SAa2II1
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A Sumo de laranja á base
de concentrado
SAa2II2
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A Sumo de laranja á base
de concentrado
SAa2II3
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A Sumo de laranja á base
de concentrado
SAa3III1
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(51%) e sumo de uva á
base de concentrado
(49%)
SAa3III2
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(51%) e sumo de uva á
base de concentrado
(49%)
SAa3III3
Sumo á base
de
concentrado
200 mL N.A
Sumo de pêssego
(51%) e sumo de uva á
base de concentrado
(49%)
SAb1IV Sumo
Biológico
1500
mL N.A
100% sumo de laranja
biológica
SAb2V Sumo
Biológico 1 Litro N.A
100% sumo de maçã
biológica
SB1I1
Sumo á base
de
concentrado
300 mL N.A
Sumo de maçã
reconstituído (81,9%),
banana (11,5%) e
alperce (5%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
160
Tabela 45. Características das amostras de sumo.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
SB1I2 Sumo á base de
concentrado 300 mL N.A
Sumo de maçã
reconstituído
(81,9%), banana
(11,5%) e alperce
(5%)
SB1I3 Sumo á base de
concentrado 300 mL N.A
Sumo de maçã
reconstituído
(81,9%), banana
(11,5%) e alperce
(5%)
SB2I1 Sumo á base de
concentrado 330 mL N.A
Sumo de maçã à base
de sumo concentrado
reconstituído 100%
SB2I2 Sumo á base de
concentrado 330 mL N.A
Sumo de maçã à base
de sumo concentrado
reconstituído 100%
SC1I1 Sumo á base de
concentrado 125 mL N.A
Sumo de frutas
(laranja, maçã, pêra e
ananás) á base de
concentrado
SC1I2 Sumo á base de
concentrado 125 mL N.A
Sumo de frutas
(laranja, maçã, pêra e
ananás) á base de
concentrado
SC2II1 Sumo á base de
concentrado 250 mL N.A
Sumo de maçã à base
de concentrado
SD1I Sumo de fruta 250 mL N.A
Sumo de uva e
framboesa à base de
concentrado
SEa1I Sumo á base de
concentrado 330 mL N.A
Sumo de maçã à base
de concentrado
SEa2II Sumo á base de
concentrado 330 mL N.A
Sumo de laranja à
base de concentrado
SEa2III Sumo á base de
concentrado 330 mL N.A
Sumo de laranja à
base de concentrado
SF1I Sumo 750 mL N.A 100% sumo de
beterraba
SF2II Sumo 750 mL N.A
80% sumo de maçã,
20% sumo de
groselha
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
161
Tabela 46. Características das amostras de néctares.
Código da
amostra Amostra Porção
Grupo etário
recomendado Ingredientes
NAa1I Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de
manga
NAa2II Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de
pêra
NAa3III Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de
pêssego
NAa4IV
Néctar á base de
sumo
concentrado
330 mL N.A
Sumo de uva e
ananás, polpa de
maçã, sumo de
laranja
NAb1V
Néctar á base de
sumo
concentrado
330 mL N.A
Polpa de Laranja
(23%), cenoura
(14%), manga
(12%), limão (1%)
NAb2VI
Néctar á base de
sumo
concentrado
330 mL N.A
Sumo de uva tinta,
amora, maçã,
morango,
framboesa
NAc1VII
Néctar á base de
sumo
concentrado
330 mL N.A Sumo e polpa de
maracujá
NAb3VIII Néctar de sumo 1000
mL N.A
Sumo e polpa de
framboesa (28%)
e maçã (22%)
NB1I1 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de pêra
(50%)
NB1I2 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de pêra
(50%)
NB2II1 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de pêssego
(50%)
NB2II2 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de pêssego
(50%)
NB2II3 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de pêssego
(50%)
NB3I1 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de manga
(40%)
NB3I2 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de manga
(40%)
NB3I3 Néctar á base de
puré 200 mL N.A
Puré de manga
(40%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
162
Tabela 47. Características das amostras de néctares (continuação).
Código da
amostra Amostra Porção
Grupo etário
recomendado Ingredientes
NB4III Néctar á base de
concentrado 200 mL N.A
Sumo de ananás
(60%)
NB4IV Néctar á base de
concentrado 200 mL N.A
Sumo de ananás
(60%)
NCa1I1 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêra
(50%)
NCa1I2 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêra
(50%)
NCa1I3 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêra
(50%)
NCa2II1 Néctar 200 mL N.A Polpa de alperce
(40%)
NCa2II2 Néctar 200 mL N.A Polpa de alperce
(40%)
NCa2II3 Néctar 200 mL N.A Polpa de alperce
(40%)
NCa3III1 Néctar 200 mL N.A Polpa de manga
(35%)
NCa3III2 Néctar 200 mL N.A Polpa de manga
(35%)
NCa3III3 Néctar 200 mL N.A Polpa de manga
(35%)
NCa4II1 Néctar 200 mL N.A
Sumo de uva,
cereja, morango,
amora, framboesa
(40%) polpa de
morango (10%)
NCa4II2 Néctar 200 mL N.A
Sumo de uva,
cereja, morango,
amora, framboesa
(40%) polpa de
morango (10%)
NCa5II1 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêssego
(50%)
NCa5II2 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêssego
(50%)
NCa5II3 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêssego
(50%)
NCb1IV1 Néctar Light 330 mL N.A
Sumo de laranja,
maçã e maracujá
(48%), polpa de
banana (2%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
163
Tabela 48. Características das amostras de néctares (continuação).
Código da
amostra Amostra Porção
Grupo etário
recomendado Ingredientes
NCb1IV2 Néctar Light 330 mL N.A
Sumo de laranja,
maçã e maracujá
(48%), polpa de
banana (2%)
NCb2IV Néctar Light 330 mL N.A
Sumo de laranja
(30%) polpa de
manga (15%)
NCb3V Néctar Light 330 mL N.A
Polpa de morango
e maçã (35%),
sumo de maçã
(10%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
164
Tabela 49. Características das amostras de bebidas de sumo
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
BSB1I Bebida de
sumo 200 mL N.A
Sumo de laranja
(12%) à base
sumo de laranja
concentrado.
BSB2II Bebida de
sumo 200 mL N.A
Sumo de fruto
concentrado á
base de sumo de
morango (7%),
maçã (1%), kiwi
e sabugo
BSB3III Bebida de
sumo 200 mL N.A
Sumo de fruto á
base de sumo de
maçã (5%) e
pêssego (7%)
BSA1I
Bebida de
sumo e de
concentrado
proveniente de
agricultura
Biológica
1000
mL N.A
Sumo de laranja
(50%), sumo de
cenoura
(11,5%), sumo
Concentrado de
limão (0,5%)
BSCa1I
Bebida de
sumo de fruta
com leite
330 mL N.A
Sumo de
pêssego (17%),
leite magro
(10%), polpa de
manga (3%)
BSDa1I Bebida á base
de sumo 330 mL N.A
Sumo de ananás
á base de
concentrado,
extracto de coco
(0,1%)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
165
Tabela 50. Características das amostras de concentrados.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
TA1I Concentrado 1000
mL N.A
Sumo de frutas
(50%) (ananás,
laranja e maracujá
e polpa de manga,
banana e alperce)
TA2II Concentrado 840 mL N.A
Sumo de ananás
(25%) uva e laranja
á base de
concentrado
TB1I Produto em
pó 30 g N.A
Sumo de maçã
desidratado (0,7%)
TB2II Produto em
pó 31 g N.A
Sumo de laranja
desidratado (0,6%)
TC1I
Produto em
pó para
preparar
uma bebida
refrigerante
40 g N.A
Sumo de beterraba
em pó, sumo de
laranja em pó
(0,1%)
Tabela 51. Características das amostras de chá.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
CA1I1 Chá 200 g > 4 Meses
Extracto de ervas e
óleo de : camomila,
erva-cidreira,
hortelã-pimenta,
funcho, erva-doce e
tomilho (1,4%)
CA1I2 Chá 200 g > 4 Meses
Extracto de ervas e
óleo de : camomila,
erva-cidreira,
hortelã-pimenta,
funcho, erva-doce e
tomilho (1,4%)
CA2II Chá 200 g > 4 Meses
Extracto de ervas
(funcho, erva doce e
camomila)
Anexo 1 – Características das amostras analisadas
166
Tabela 52. Características das amostras de infusões.
Código
da
amostra
Amostra Porção Grupo etário
recomendado Ingredientes
IA1I
Infusão
com
extractos
de
plantas
199 g N.A
Extracto solúvel
de tília (2,4%),
erva-cidreira
(1,2%) e flor de
laranjeira (0,4%)
IA2II
Infusão
com
extractos
de
plantas
200 g N.A
Extracto solúvel
de camomila
(1,8%), funcho
(1,6%) e lúcia-
lima (0,5%)
IB1I
Infusão
de
plantas
50 g Do nascimento
á idade adulta
Extracto solúvel
de erva-doce
(0,45), extracto
solúvel de
camomila
(0,35%)
Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas
167
Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas (91, 165)
Refrigerantes
Refrigerantes à base de extracto
Refrigerante resultante da diluição em água de extractos e
aromatizantes, podendo eventualmente incluir sumo, polme ou respectivos derivados e ainda outros ingredientes comestíveis de origem vegetal.
Refrigerantes gaseificados
Refrigerante com teor de dióxido de carbono superior a 2 g/L.
Refrigerantes à base de sumo Refrigerante, turvo ou límpido, resultante da diluição em água de sumo
ou polme de frutos, respectivos concentrados ou desidratados, com um teor de sumo compreendido entre os limites mínimos a seguir indicados (m/m) e a concentração mínima fixada para o néctar do mesmo fruto,
podendo conter aromatizantes naturais ou idênticos aos naturais:
I) Ananás, morango, limão, toranja e frutos ácidos diversos — 6%; II) Laranja —8%;
III) Alperce e pêssego—12%; IV) Maçã, pêra e uva —16%;
V) Outros frutos e misturas de frutos—10%.
Sumos (Sumo de frutos)
Designa o produto fermentescível, mas não fermentado, obtido a partir de uma ou mais espécies de frutos sãos e maduros, frescos ou conservados pelo
frio, com a cor, o aroma e o gosto característicos dos sumos dos frutos de que provém.
Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas
168
Néctares (Néctar de frutos)
Designa o produto fermentescível, mas não fermentado, obtido por adição de água e de açúcares e/ou mel a sumo de frutos, sumo de frutos fabricado a
partir de um produto concentrado, sumo de frutos concentrado, sumo de frutos desidratado/em pó, a polmes de frutos ou a uma mistura destes
produtos.
Bebidas de sumo (Sumo de frutos fabricado a partir de um produto concentrado)
Designa o produto obtido por reposição num sumo de frutos concentrado da
água extraída do sumo durante a concentração e por restituição das substâncias aromáticas e, se for caso disso, da polpa e das células eliminadas
do sumo, mas recuperadas durante o processo de produção do sumo de frutos de partida ou de sumo da mesma espécie de frutos.
Concentrados (Sumo de frutos concentrado ou sumo de frutos desidratado/em pó)
Designa o produto obtido a partir de sumo de uma ou mais espécies de frutos
por eliminação física de uma parte determinada da água. Quando o produto se destinar a consumo directo, a água eliminada não poderá representar menos
de 50 % ou,
designa o produto obtido a partir de sumo de uma ou mais espécies de frutos
por eliminação física de quase toda a água.
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados
169
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados (156, 169)
A forma algébrica da equação de uma recta é dada por:
abxy (equação 16)
Onde:
b Declive da recta.
α Ordenada na origem.
Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão.
Esta recta é formada por um conjunto de pares ordenados e independentes,
(x1, y1);…; (xn, yn) onde n é o número de pontos da recta. A média dos valores
de (concentração dos padrões utilizados) representa-se por e a média dos
valores de (sinal instrumental) representa-se por , e a posição é
designada por centróide.
O cálculo do coeficiente de correlação, R , pode ser usado como um dos
parâmetros para avaliar uma calibração analítica:
i
i
i
i
i
i
i
yyxx
yyxx
R22
(equação 17)
As curvas de calibração devem apresentar valores de coeficiente de correlação
superiores a 0,995, no entanto quanto mais próximo do valor de 1 (correlação
positiva) ou de -1 (correlação negativa) estiver este coeficiente maior será a
qualidade dos resultados. Para o cálculo do coeficiente de correlação é
necessário ter em conta algumas precauções para que não se cometam erros
de interpretação, pois um bom coeficiente correlação não é sinónimo da
existência de uma relação linear. Assume-se ainda que todos os erros
associados aos valores de são desprezáveis face aos valores de .
O coeficiente de determinação da recta (R2) é dado pelo quadrado do
coeficiente de correlação.
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados
170
Neste método demonstra-se que os coeficientes e b da recta de regressão
de em , são dados por:
N
i
i
N
i
ii
xx
yyxx
b
1
2
1
(equação 18)
E,
xbya (equação 19)
Onde:
Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão.
Valores individuais do sinal instrumental.
Média dos valores de x (concentração dos padrões utilizados).
Média dos valores de y (sinal instrumental).
Os coeficientes e b dão uma estimativa verdadeira da função que é limitada
pela dispersão inevitável do método. A precisão da estimativa é quantificada
pelo desvio padrão residual ( ) da recta de regressão:
2
1
2
N
bxay
S
N
i
ii
xy
(equação 20)
Este desvio padrão exprime a dispersão dos valores do sinal em torno da
curva de calibração. Os desvios padrão de declive, , e da ordenada da
origem, , são dados por:
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados
171
N
i
i
xy
b
xx
S
S
1
2 (equação 21)
N
i
i
N
i
i
xya
xxN
x
SS
1
2
1
2
(equação 22)
e podem ser usados para calcular os limites de confiança de e :
btSb (equação 23)
atSa (equação 24)
sendo t o valor da variável de Student para o nível de confiança desejado de
(n-2) graus de liberdade.
Cálculo da concentração
Após ter determinado o declive e a ordenada na origem de uma recta de
regressão, pode-se calcular o valor de correspondente a um valor médio de
. A concentração de uma amostra por interpolação da curva de calibração é
calculada pela seguinte equação:
b
ayx i
i
(equação 25)
Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados
172
Desvio Padrão do método (Sm)
Este parâmetro permite ao analista verificar a qualidade do seu trabalho:
b
S
S xy
m (equação 26)
Coeficiente de variação do método (CVm)
Este parâmetro permite comparar diferentes calibrações e métodos analíticos
e é expresso pela equação (em %):
100x
SCV m
m (equação 27)
Anexo 4 – Teste dos valores normalizados
173
Anexo 4 – Teste dos valores normalizados (169)
A distribuição dos valores normalizados tem como objectivo avaliar a dispersão dos valores obtidos na calibração em relação aos valores óptimos, por forma a que não seja superior a um intervalo previamente estabelecido.
A partir da equação da recta obtida na regressão linear, estimou-se o sinal
instrumental (potencial, mV), para as concentrações usadas. Para cada um desses valores, calculou-se a razão entre o valor da diferença de potencial obtida experimentalmente e o valor da diferença de potencial estimada
através da regressão linear.
A diferença de potencial para a qual esta razão se aproxima mais de 1 é denominada V100, ou seja é a diferença de potencial correspondente ao ponto experimental com melhor correlação. Aplicou-se então a equação seguinte
para cada uma das concentrações:
100100
exp
V
V
VosnormalizadValores est
(equação 28)
Em que: Valor de diferença de potencial estimado a uma determinada
concentração.
Valor da diferença de potencial obtida experimentalmente a uma
determinada concentração.
Diferença de potencial correspondente ao ponto experimental com
melhor correlação.
Após o cálculo destes valores, foi traçado um gráfico de valores normalizados versus a logarítmo da concentração.
Para admitir a existência de linearidade, numa determinada gama de concentração, foi definido que os valores normalizados não podiam ter um
desvio superior a 10% isto é, deverão estar compreendidos entre 90 e 110%.
Sempre que existirem valores normalizados que apresentem um desvio superior a 10% devem ser excluídos, reduzindo a gama de concentrações e aplicando-se novamente o teste até que estes requisitos sejam satisfeitos.
Anexo 5 – Análise de resíduos
174
Anexo 5 – Análise de resíduos (169)
Um bom indicador da linearidade é a determinação dos resíduos, a qual se
baseia na avaliação da distância entre os valores de experimentais e os
valores ideais da recta de calibração. Uma representação gráfica destes
valores em função das concentrações deve dar origem a um conjunto de
pontos que se dispõem aleatoriamente em torno do eixo dos . Caso contrário
poderá ser indicativo de que a função que melhor se ajusta ao conjunto de pontos experimentais poderá ser uma curva e não uma recta.
Para admitir a existência de linearidade numa determinada gama de concentração, foi definido que os valores deviam ter um desvio igual ou
inferior a 10%, ou seja, estar compreendidos entre 0 e 10%. Sempre que existirem resíduos que apresentem um desvio superior a 10% devem ser
excluídos, reduzindo a gama de concentrações e aplicando-se novamente o teste até que estes requisitos sejam satisfeitos.
Calcula-se a concentração estimada ( ) com base na equação da recta obtida para o composto em questão:
abxy ,
(equação 29)
Onde:
b Declive da recta.
α Ordenada na origem (correspondente à equação da recta de calibração para o analito).
Valores individuais do logaritmo da concentração da solução padrão.
O resíduo representa o quociente entre os valores experimentais e os valores estimados da diferença de potencial da recta de calibração, em percentagem.
Após o cálculo destes valores, foi traçado um gráfico de resíduos (%) versus logaritmo da concentração.
Anexo 6 – Teste de Mandel
175
Anexo 6 – Teste de Mandel (156, 169)
A linearidade pode ser avaliada estatisticamente, de acordo com a norma ISO 8466-1, pelo teste de Fisher/Snedecor ou teste de Mandel.
A partir do conjunto de resultados obtidos (sinal instrumental versus
concentração), conjunto de pares ordenados, calcula-se a função de calibração
linear (ISO 8466-1) e a função de calibração não-linear (ISO 8466-2), bem
como os respectivos desvios padrão residuais, e , do seguinte modo:
2
1
2
N
yy
S
N
i
ii
xy
(equação 30)
3
1
2
2
2
N
yy
S
N
i
ii
y
(equação 31)
Onde:
N Número de padrões de calibração.
Sinal obtido para um padrão de determinada concentração.
Sinal estimado pela função de calibração linear para um padrão da mesma concentração.
Sinal estimado pela função de calibração polinomial do segundo
grau para um padrão da mesma concentração.
Calcula-se a diferença de variâncias ( ) através da equação:
2
2
22 32 yx
y SNSNDS
(equação 32)
Anexo 6 – Teste de Mandel
176
Obtém-se o valor teste, VT :
2
2
2
yS
DSVT
(equação 33)
O valor teste ( VT ) é comparado com o valor tabelado da distribuição F de
Fisher/Snedecor, para um grau de confiança de 95%.
Critérios de aceitação:
a) Se VT ≤ F: a função de calibração polinomial não conduz a um ajustamento significativamente melhor, e por isso, a função de calibração
é linear.
b) Se VT > F: a função de calibração é não linear e por isso a gama de trabalho deve ser reduzida tanto quanto possível de forma a cumprir a alternativa a). Caso não seja possível, deverá ser utilizada uma função de
calibração não linear.
Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias
177
Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias (169)
A gama de trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade de
variâncias, quando se utiliza uma metodologia que envolve o traçado de uma curva de calibração.
O primeiro e o último ponto do intervalo de linearidade são analisados em 10 réplicas independentes. Este teste avalia se o intervalo de concentrações do intervalo de linearidade está bem ajustado, por análise das variâncias dos
padrões que delimitam a recta de calibração. O valor da variância de cada padrão foi determinado, de acordo com a equação:
1
10
1
2
2
i
j
j
i
in
yy
S
(equação 34)
Sendo
i
j
ji
in
y
y
10
1
,
(equação 35)
As variâncias foram testadas para examinar se existem diferenças significativas entre elas nos limites do intervalo de linearidade, efectuando o cálculo do valor teste VT:
2
1
2
22
1
2
2 SSseS
SVT
(equação 36)
Ou
2
2
2
12
2
2
1 SSseS
SVT
(equação 37)
O valor VT é comparado com o valor tabelado da distribuição F de
Snedecor/Fisher, de acordo com o número de graus de liberdade envolvidos, para um grau de confiança de 99%.
Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias
178
Se VT ≤ F ( ; ; 0,99), a diferença entre as variâncias não é significativa, logo a gama está bem ajustada.
Se VT > F ( ; ; 0,99) a diferença entre as variâncias é significativa o
que implica que a gama de trabalho tem que ser reduzida, até que VT ≤ F.
Nota: , =( n-1 ) e F 0,99 = 5,35 , para n =10
Anexo 8 – Convite às escolas
179
Anexo 8 – Convite às escolas
Anexo 8 – Convite às escolas
180
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
181
Anexo 9 – Questionário de frequência alimentar
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
182
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
183
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
184
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
185
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
186
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
187
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
188
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
189
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
190
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
191
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
192
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
193
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
194
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
195
Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar
196
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