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RICARDO DIAS DE CASTRO
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum
zeylanicum Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS
SINTÉTICOS SOBRE ESPÉCIES DE Candida
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA - UFPB
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
JOÃO PESSOA – PB
2010
1
RICARDO DIAS DE CASTRO
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum
zeylanicum Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS
SINTÉTICOS SOBRE ESPÉCIES DE Candida
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Produtos Naturais
e Sintéticos Bioativos do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Paraíba, como parte dos
requesitos para obtenção do título de
DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS
E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de
concentração: FARMACOLOGIA
Orientadora: Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
JOÃO PESSOA – PB
Novembro – 2010
2
C355a Castro, Ricardo Dias de.
Atividade antifúngica do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) e sua associação com antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida / Ricardo Dias de Castro. - - João Pessoa: [s.n.], 2010.
168 f.: il. -
Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima.
Tese (Doutorado) – UFPB/CCS, Programa de Pós-Graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos.
1. Agentes contra Candida albicans - Canela. 2. Cinnamomum zeylanicum.
3. Canela. 4. Miconazol. 5. Candidíase. 6. Sinergismo Farmacológico.
BS/CCS/UFPB CDU: 615.282.84: 582.677.2(043.2)
BS/CCS/UFPB CDU: 615.282.84:
582.677.2(043.2)
3
RICARDO DIAS DE CASTRO
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum zeylanicum
Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS
SOBRE ESPÉCIES DE Candida
Tese ________________ em ___/___/______
COMISSÃO EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
Universidade Federal da Paraíba – Orientadora
______________________________________________
Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
Universidade Federal da Paraíba – Examinador interno
______________________________________________
Profa. Dra. Margareth Formiga de Melo Diniz
Universidade Federal da Paraíba – Examinadora interna
______________________________________________
Profa. Dra. Lindomar de Farias Belém
Universidade Estadual da Paraíba – Examinadora externa
______________________________________________
Prof. Dr. Thompson Lopes de Oliveira
Universidade Federal da Paraíba – Examinador externo
______________________________________________
Prof. Dr. Alessandro Leite Cavalcanti
Universidade Estadual da Paraíba – Examinador exteno (suplente)
______________________________________________
Profa. Dra. Marianna Vieira Sobral Castello Branco
Universidade Federal da Paraíba – Examinador interno (suplente)
4
A João Tadeu de Castro (pai) e
Maria Cecília Abílio de Castro (filha)
pela representação do sentido da
vida.
5
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra Edeltrudes de Oliveira Lima pela orientação, convívio agradável e pelo
aprendizado imenso que tive ao longo deste trabalho;
Aos docentes do Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos por todo auxílio e ensinamentos;
Aos docentes, técnicos e pesquisadores do Laboratório de Micologia do
Departamento de Ciências Farmacêuticas pelo apoio e presteza.
Aos familiares, em especial a minha esposa (Gisely Maria Freire Abílio de Castro) e
mãe (Inês Maria Dias de Castro), pelo apoio incondicional na condução e construção
de minha vida profissional.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo fornecimento da bolsa de doutorado
no primeiro ano de estudo.
Aos alunos do curso de graduação em odontologia, especialmente os que integram
o Grupo de Pesquisa em Odontopediatria e Clínica Integrada, que compreenderam
minha ausência em alguns momentos.
Aos professores do Grupo de Pesquisa em Odontopediatria e Clínica Integrada
(GPOCI) pelo apoio e parceria.
Aos integrantes do Grupo de Estudos Culturais Transdisciplinares em Educação e
Saúde (GETES), em especial a Ana Elvira Steinbach Silva Raposo e Eduardo
Antônio de Pontes Costa, pelo apoio, amizade e incentivo.
A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para realização deste
trabalho.
6
CASTRO, R. D. Atividade atifúngica do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela) e de sua associação com antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida. 2010. 168f. Tese (Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos – Área de Concentração: Farmacologia) – UFPB/CCS, João Pessoa.
RESUMO
Objetivou-se investigar a ação antifúngica do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado a antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida. Para tanto, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), a Concentração Fungicida Mínima (CFM), índice de Concentração Inibitória Fracionada (ICIF), a Curva de Morte Microbiana promovida pelo OE isolado e associado a antifúngicos sintéticos, a ação sobre a parede celular fúngica e a interferência dessa associação sobre a micromorfologia fúngica. Quando avaliados isolados, C. zeylanicum e nistatina apresentaram CIM de, respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL. Após associação dos produtos avaliados, foi observada diminuição nos valores de CIM para ambas as substâncias, sendo encontrados valores de, respectivamente, 39 µg/mL e 32 µg/mL para o OE e nistatina, sendo verificado o valor do ICIF de 0,6024 (aditividade). Foi observado que em todas as concentrações avaliadas, os produtos isolados e associados foram capazes de reduzir significativamente o número de UFC/mL, quando comparados ao grupo controle a partir de 30 min. Também foi observada redução no desenvolvimento das estruturas morfológicas das células de C. albicans, como pseudo-hifas, bastoconídios e clamidoconídios. Quando associado ao miconazol, foi observado ICIF de, respectivamente, 4,1248 (antagonismo), 1,1248 (indiferença) e 1,1248 (indiferença), para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei. Assim, verifica-se que C. zeylanicum exibiu ação sobre cepas de Candida, que essa atividade antifúngica apresentada pelo C. zeylanicum ocorre, provavelmente, por ação do óleo essencial no processo de síntese da parede celular fúngica, que associação do OE de C. zeylanicum e nistatina promoveu potencialização do efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de C. albicans, promovendo redução na capacidade de desenvolvimento de estruturas morfológicas das células. Todavia, a associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao miconazol não constitui em uma possibilidade vantajosa para inibição de crescimento de Candida spp.
Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum. Nistatina. Canela. Miconazol. Candidíase. Sinergismo Farmacológico.
7
CASTRO, R. D. Antifungal activity of the essential oil of Cinnamomum zeylanicum Blume (cinnamon) and its combination with synthetic antifungals on Candida species. 2010. 168p. Thesis (PhD in Bioactive Synthetic and Natural Products - Concentration Area: Pharmacology) - UFPB / CCS, Joao Pessoa.
ABSTRACT
This study aimed to investigate the antifungal activity of essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with synthetic antifungal agents against Candida species. For this, it was determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC); Minimum Fungicidal Concentration (MFC); Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI); microbial death curve promoted by the EO alone and combined with synthetic antifungals; action on fungal cell wall and interference of this combination on the fungal micromorphology. When assessed alone, C. zeylanicum and nystatin showed MIC of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively. After combination, there was a reduction in MIC values for both substances, and were found values of respectively 39 µg/mL and 32 µg/mL for the EO and for Nystatin. It was verified a FICI value of 0.6024 (additivity). At all concentrations tested, these products alone and combined were able to reduce the number of CFU/mL, when compared with the control group from 30 min. It was also observed a reduction in the development of morphological structures of C. albicans cells, like pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia. When combined with miconazole, FICI values were 4.1248 (antagonism), 1.1248 (indifference) and 1.1248 (indifference), respectively, for C. albicans, C. tropicalis and C. krusei. Thus, it can be concluded that: C. zeylanicum showed activity against the Candida strains; this antifungal activity occurs, probably, by action of the essential oil in the process of fungal cell wall synthesis; the combination between C. zeylanicum EO and nystatin potentiated the inhibitory effect on growth of C. albicans strains, promoting a reduction in the development capacity of cellular morphologic structures. Nevertheless, the combination of C. zeylanicum EO and miconazole is not an advantageous possibility for growth inhibition of Candida spp.
Key-words: Cinnamomum zeylanicum. Nystatin. Cinnamon. Candidiasis. Miconazole. Drug synergism.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg – Micrograma
AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida
AMPC – Adenosina monofosfato cíclico
ASD – Agar Sabouraud Dextrose
ATCC – American Type Culture Collection
CCS – Centro de Ciências da Saúde
CDR – Cadmium-inducible
CFM – Concetração Fungicida Mínima
CIM – Concentração Initória Mínima
cm – Centrímetro
FIC – Concentração Inibitória Fracionada
g – Grama
h – Hora
HIV – Vírus da imunodeficiência humana
IgA-S – Imunoglobulina A secretora
IL-1 α – Interleucina 1 alfa
IL-2 α – Interleucina 2 alfa
m – Metro
M – Molar
MAPK – Proteína cinase ativada por mitógeno.
mg – Miligrama
Min – Minuto
mL – Mililitro
mm – Milímetro
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OE – Óleo essencial
PNPMF – Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RR – Risco relativo
SNC – Sistema Nervoso Central
SUS – Sistema Único de Saúde
TCT – Trifenil cloreto de tetrazólio
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa
UFC – Unidade formadora de colônia
UFPB – Universidade Federal da Paraíba
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Elementos moleculares presentes em mecanismos de transdução
de sinal envolvidos com a formação de fatores de virulência em C. albicans .
21
Figura 2 - Estrutura química da nistatina .......................................................... 25
Figura 3 - Estrutura química do miconazol ....................................................... 28
Figura 4 - Esquema para realização do ensaio de sinergismo pela técnica de
checkerboard. ....................................................................................................
48
Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de
Candida
Figura 1 - Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre C. albicans
ICB-12 (A) e C. tropicalis LM-708 (B). 1 - Matricaria chamomilla; 2 - Eugenia
uniflora; 3 - Cinnamomum zeylanicum; 4 - Citrus aurantifolia; 5 - Mentha
piperita; 6 - Citrus reticulata; 7 - Zingiber officinale ..........................................
61
Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
nystatin on strains of Candida spp.
Figure 1 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under
activity of the products assessed at MIC÷2 (p<0.0001). ……………………….
97
Figure 2 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under
activity of the products assessed at MIC (p<0.0001). ………………………….
97
Figure 3 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under
activity of the products assessed at MICx2 (p<0.0001). ……………………….
98
Figure 4 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under
activity of the products assessed at MICx4 (p<0.0001). ……………………….
98
Figure 5 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under
activity of the products assessed at MICx8 (p<0.0001). ……………………….
99
Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil
alone and combined with nystatin on micromorphology of Candida
albicans strains.
Figure 11 - Microscopic appearance of C. albicans strain (ATCC 40277): A -
growth control; B - C. activity of C. zeylanicum EO (39 µg/mL) combined with
nystatin (32 µg/ml); C - activity of nystatin (64 µg/ml); D - activity of C.
zeylanicum EO (312.5 µg/mL). ..............................................................
116
11
LISTA DE TABELAS
Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de
Candida.
Tabela 1 - Medida em milímetro dos halos de inibição de crescimento
microbiano produzidos pelos óleos essenciais sobre cepas de Candida. ........
60
Tabela 2 - Concentração Inibitória Mínima do Óleo essencial de C. zeylanicum
e Nistatina sobre cepas de Candida. .................................................................
61
Anti-Candida activity and chemical composition of Cinnamomum
zeylanicum Blume essential oil.
Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal
Concentration (MFC) of C. zeylanicum essential oil, nystatin and miconazole on
Candida strains……………………………………………………………………….
84
Table 2 - Action of the essential oil of C. zeylanicum on the fungal cell
wall………………………………………………………………………………………
85
Table 3 - Chemical characterization of C. zeylanicum leaf essential oil. …........ 86
Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
nystatin on strains of Candida spp.
Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum essential oil
and Nystatin on strains of C. albicans ATCC 40277. ……………………………...
96
Table 2 - Fractional Concentration Index (FIC) and Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) (µg/mL) after combination of C. zeylanicum essential oil
with Nystatin on the strain of C. albicans ATCC 40277. ..…………………………
96
Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
nystatin on strains of non-albicans Candida.
Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum essential oil
and Nystatin on strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC
40147…………………………………………………………………………………….
123
Table 2 - Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination
between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. tropicalis strain ATCC
40042. …………………………………………………………………………………….
125
Table 3 - Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination
between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. krusei strain ATCC
40147. …………………………………………………………………………………….
125
12
Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
miconazole on Candida strains.
Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum essential oil
and miconazole on Candida strains………….........................................................
138
Table 2 - Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) and MIC (µg/mL) after
combination between C. zeylanicum essential oil and miconazole against strains
of C. albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC
40147…………………………………………………………………………………..…
138
13
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da
atividade anti-Candida. ............................................................................
43
Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil
alone and combined with nystatin on micromorphology of Candida
albicans strains.
Quadro 2 – Micromorphology changes promoted by the products under
testo on C. albicans ATCC. 40277. ..........................................................
115
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15
2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 18
2.1 Geral ................................................................................................................ 18
2.2 Específicos ....................................................................................................... 18
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 20
3.1 Candidíase ...................................................................................................... 20
3.2 Terapia antifúngica ........................................................................................ 23
3.3 Limitação dos antifúngicos sintéticos ............................................................ 28
3.4 Produtos naturais ........................................................................................... 30
3.5 Cinnamomum zeylanicum .............................................................................. 34
3.6 Associação de drogas antifúngicas ................................................................ 38
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 42
4.1 Local de realização de pesquisa e cepas fúngicas ......................................... 42
4.2 Óleos essenciais ............................................................................................. 42
4.3 Produtos sintéticos .......................................................................................... 43
4.4 Screening para avaliação da atividade antifúngica ......................................... 43
4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ................................ 43
4.6 Deterteminação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) .......................... 44
4.7 Ensaio de sinergismo – método checkerboard ............................................... 44
4.8 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina sobre a
cinética do crescimento das leveduras ........................................................................
46
4.9 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina sobre a
micromorfologia de cepas de C. albicans .......................................................
46
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 49
5.1 Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de
Candida.............................................................................................................
50
15
5.2 Anti-Candida activity and chemical composition of Cinnamomum
zeylanicum Blume essential oil. …………………………………………….…….
65
5.3 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and nystatin
on Candida spp. …………………………………………………………………..…
85
5.4 Efeito do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume sozinho e associado à
nistatina sobre a micromorfologia de cepas de Candida albicans.
...........................................................................................................................
100
5.5 Efeito combinado da ação do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum
Blume e nistatina sobre cepas de Candida não-albicans.
.............................................................................................................................
115
5.6 Efeito combinado do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume e
miconazol sobre cepas de Candida. ...................................................................
128
6 CONCLUSÕES .................. ................................................................................ 144
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 146
16
INTRODUÇÃO
17
1 INTRODUÇÃO
Espécies de Candida têm sido associadas às infecções micóticas
superficiais e sistêmicas, podendo ser isoladas em até 60% da cavidade oral
de adultos, estando Candida albicans e C. tropicalis entre as mais prevalentes
(MARSH; MARTIN, 2005). Tais espécies apresentam fatores de virulência
envolvidos com a formação de biofilmes, sendo os fatores ambientais (saliva,
fluido gengival, pH e nutrientes) favoráveis aos processos de co-agregação e
co-adesão entre Candida e outros microrganismos, incluindo as bactérias
envolvidas com as principais patologias da cavidade oral, cárie dentária e
doenças periodontais (THEIN; SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2006).
Destaca-se que essa habilidade para formação de biofilme está intimamente
associada com a capacidade de causar infecções, representando um aumento
na resistência às drogas antifúngicas e às defesas imunológicas do hospedeiro
(HERIQUES; AZEREDO; OLIVEIRA, 2004; RAMAGE et al., 2005).
Mecanismos moleculares envolvidos com a patogenicidade de espécies
de Candida são elucidados na perspectiva da elaboração de fármacos que
apresentem maior especificidade e, consequentemente, menos efeitos
indesejáveis (OROZCO; ZHOU; FILLER, 2000; MONGE et al., 2006; MÜLLER
et al., 2007). Estes mecanismos estão relacionados à ativação da via de
transdução de sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, onde respostas
celulares envolvidas com crescimento invasivo, formação de parede celular,
adaptação ao estresse osmótico e reprodução ocorrem mediante vias de
sinalização intracelular (MONGE et al., 2006).
Atualmente, os agentes disponíveis para tratamento de infecções
fúngicas da cavidade oral, caracterizadas como superficiais, são representados
pelos poliênicos (anfotericina B, nistatina, entre outros) e azólicos (fluconazol,
itraconazol, miconazol, cetoconazol, entre outros), sendo estes últimos os
eleitos em primeira instância para tratamento dessas doenças e são
geralmente fungistáticos (WINGETER et al., 2007).
Diante das limitações de uso desses antifúngicos sintéticos,
evidenciadas pelo aumento da resistência pelos microrganismos, bem como
18
pelas reações indesejadas apresentadas pelos usuários, novos agentes são
propostos na tentativa de minimizar tais eventos. A resistência dos
microrganismos vem aumentando em função do uso indiscriminado de
antimicrobianos utilizados no tratamento de doenças infecciosas. Essa situação
tem impulsionado investigadores a estudarem novas substâncias
antimicrobianas de várias fontes, incluindo as plantas medicinais (BANSOD;
RAI, 2008).
A atividade antifúngica de produtos obtidos de plantas medicinais têm
sido cientificamente atribuída aos óleos essenciais, extratos, cumarinas,
terpenos, flavonóides, amidas, imidas e alcalóides (AQUINO et al., 2003;
GAYOSO et al., 2005; MOREIRA et al., 2007).
Nesse sentido, considerando a ampla atividade biológica apresentada
pelos produtos de origem natural, óleos essenciais obtidos a partir de espécies
vegetais têm sido investigados para determinação de suas atividades
antimicrobiana (WILSON; SOLAR; GHAOUTH, 1997; SRINIVASAN et al.,
2001; BONJAR; AGHIGHI; KARIMI, 2004; KONNING; AGYARE; ENNISON,
2004; GIORDANI et al., 2006; LIMA et al., 2006; BANSOD; RAI, 2008; JANTAN
et al., 2008; VIUDAS-MARTOS, 2008).
Assim, diante do aumento do número de indivíduos
imunocomprometidos e desenvolvimento de diversos mecanismos de
resistência por parte dos microrganismos, o propósito desse estudo foi avaliar a
susceptibilidade de espécies de Candida ao óleo essencial de Cinnamomum
zeylanicum Blume isoladamente e associado a produtos sintéticos.
19
OBJETIVOS
20
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Determinar a atividade antifúngica do óleo essencial obtido a partir das
folhas de C. zeylanicum isolado e associado a antifúngicos sintéticos sobre
Candida spp.
2.2 Específicos
Realizar screening com óleos essenciais para determinação da atividade
antifúngica sobre cepas de Candida;
Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM) do óleo essencial obtido de C. zeylanicum
sobre cepas de Candida;
Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM) do óleo essencial de C. zeylanicum associado
a antifúngicos sintéticos sobre cepas de Candida;
Determinar o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (método de
associação – checkerboard) do óleo essencial de C. zeylanicum
associado com os antifúngicos sintéticos;
Determinar a curva de morte microbiana promovida pelo óleo essencial
de C. zeylanicum isolado e associado a antifúngicos sintéticos;
Analisar a ação do óleo essencial de C. zeylanicum sobre a parede
celular fúngica;
Avaliar a interferência do óleo essencial de C. zeylanicum isolado e
associado a antifúngicos sintéticos sobre a micromorfologia fúngica.
21
REVISÃO DA LITERATURA
22
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Candidíase
A candidíase é uma infecção fúngica ocasionada pela presença de
leveduras do gênero Candida, que faz parte da família Cryptococcaceae, sendo
reconhecidas cerca de 81 espécies, destacando-se a C. albicans pela sua
virulência e potencial para promover doenças.
C. albicans é um patógeno oportunista que habita o corpo humano de
forma comensal e é a maior causa de infecções fúngicas em humanos. Estas
infecções normalmente ocorrem como consequência de uma alteração na
resposta imunológica e virulência da C. albicans, que apresenta considerável
plasticidade morfológica (MONGE et al., 2006).
Os mecanismos moleculares envolvidos com tal virulência estão
relacionados à ativação da via de transdução de sinal MAP (mitogen-activated
protein) Kinase, onde respostas celulares envolvidas com crescimento invasivo,
formação de parede celular, adaptação ao estresse osmótico e reprodução
ocorrem mediante vias de sinalização intracelular como MKc1, Cek1/2 e HOG1
MAP Kinase (MONGE et al., 2006).
Figura 1. Elementos moleculares presentes em mecanismos de transdução de sinal envolvidos
com a formação de fatores de virulência em C. albicans (MONGE et al., 2006).
A ativação da via MAPK também proporciona a ativação do fator de
transcrição Cph1, responsável pela forma filamentosa, considerada fator de
23
virulência para ocorrência de infecções sistêmicas, e do CLA4, responsável
pela formação do tubo germinativo e hifas. A via de ativação PKA proporciona
a formação de AMPc, que regula o fator Efg1, responsável pela formação de
hifas (PHAN; BELANGER; FILLER, 2000).
Ressalta-se que outras vias de sinalização intracelular, como a p38
MAPK, também estão envolvidas com a patogenicidade da C. albicans
(MULLER et al., 2007). Um vez instalada a infecção, mediadores pró-
inflamatórios, como TNF-α, IL-1α e IL-2α, são sintetizados e,
conseqüentemente, induzem a resposta inflamatória (OROZCO; ZHOU;
FILLER, 2000).
A produção de enzimas extracelulares, como fosfolipases e proteinases,
contribui para a virulência da C. albicans, já que são capazes de promover
destruição dos tecidos do hospedeiro. Menezes et al. (2005) verificaram que
67% e 80% das cepas de Candida isoladas da cavidade bucal de crianças
foram positivas para, respectivamente, fosfolipases e proteinases.
Assim como apresentado na Fig. 1, as vias de sinalização intracelular
podem sofrer interferências, proporcionando às células de C. albicans maior
complexidade na expressão dos seus fatores de virulência (MONGE et al.,
2006). O conhecimento acerca desses mecanismos pode contribuir para a
descoberta de novos agentes anti-Candida.
O papel da imunidade celular no controle da infecção causada por C.
albicans é considerado de extrema importância, pois determina a
susceptibilidade ou resistência dos indivíduos à infecção por este
microrganismo (CARVALHO et al., 2003). Para impedir a proliferação e
progressão de candidíases, o sistema imunológico elabora mecanismos de
defesa específicos e inespecíficos contra as leveduras. Dentre os mecanismos
envolvidos com esta defesa, as imunoglobulinas da classe IgA presentes nas
secreções e saliva desempenham papel fundamental. Nas infecções por
Candida das superfícies epiteliais, a IgA-s (secretora) age promovendo
agregação dos fungos e inibe sua aderência às células epiteliais da mucosa,
impedindo, consequentemente, sua proliferação (BADAUY et al., 2005).
24
Pacientes com candidíase recorrente apresentam uma baixa resposta
imune celular para antígenos de C. albicans. Este fato contribui para o
entendimento acerca da patogênese da cadidíase recorrente, abrindo
perspectivas para a utilização de agentes imunomoduladores com a finalidade
de restaurar a resposta imune destes pacientes (CARVALHO et al., 2003).
Clinicamente, a doença pode surgir como manifestações em mucosas
até quadros sistêmicos, com a invasão de diversos órgãos. As mucosas oral,
vaginal e esofágica são as mais acometidas em quadros de candidíases
(SIDRIM; MOREIRA, 1999).
As infecções sistêmicas, ocasionados pela disseminação hematológica,
podem causar microabscessos por todo corpo. Para disseminação das células
de C. albicans, o endotélio vascular participa ativamente do processo, havendo
interação entre receptores presentes nas células endoteliais e adesinas
expressas pelas leveduras (FILLER et al., 1995; MULLER et al., 2007).
Com relação às infecções superficiais, especialmente as que acometem
a cavidade bucal, objeto de interesse deste estudo, sabe-se que a mucosa
dessa região é o sítio mais frequente de candidíase superficial, e a colonização
por C. albicans ocorre em 10 a 50% dos indivíduos sadios. De forma geral,
essa colonização é controlada por antagonismo competitivo da microbiota
comensal, por competições nutritivas e pela produção de substâncias tóxicas
que podem também interferir no mecanismo de aderência dessas leveduras às
células epiteliais. A produção de ácido lático por essas células ou a
manutenção do pH salivar também são fatores limitantes da colonização
dessas leveduras (LORENZO, 2004).
Em indivíduos imunocomprometidos, especialmente os acometidos pelo
HIV/AIDS, cerca de 74% apresentam lesões na mucosa bucal ocasionados por
infecções causadas por Candida spp. (LASKARIS; HADJIVASSILIOV;
STRATIGOS, 1992; CAVASSANI et al., 2002). Ressalta-se que nestes
indivíduos a candidíase bucal pode funcionar como um marcador da
progressão da doença e preditivo para o aumento da imunossupressão
(MESQUITA; AGUIAR; TARQUINO, 1996). Pozzatti (2007) afirma que, diante
25
desse contexto, a pesquisa de novos agentes terapêuticos torna-se uma
medida de extrema importância.
A candidíase orofaríngea apresenta manifestações clínicas distintas, que
proporcionaram a seguinte classificação: a) pseudomembranosa (caracterizada
pela presença de placas brancas, facilmente destacáveis, que recobrem áreas
eritematosas da mucosa); b) eritematosa (presença de eritema de mucosa e/ou
atrofia de papilas do dorso da língua); c) hiperplásica (placas brancas que são
removidas apenas por leve abrasão); estomatite induzida por dentadura
(consiste em eritema granular confinado à área de palato duro recoberto pela
dentadura e muitas vezes associado à queilite angular. Essa estomatite está
presente em 65% dos portadores de dentaduras).
Essas lesões podem ser assintomáticas ou produzir dor, sensação de
queimação na língua, alteração do gosto, impedimento de fala e deglutição e
pertubação da qualidade de vida (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).
Dentre os microrganismos evolvidos com infecções fúngicas superficiais
da mucosa bucal, C. albicans representa o mais frequente. Entretanto, outras
espécies contribuem para o desenvolvimento da doença, como Candida
tropicalis e Candida krusei.
3.2 Terapia antifúngica
A abordagem medicamentosa para tratamento da candidíase inclui
agentes antifúngicos tópicos e sistêmicos (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).
As três principais classes de antifúngicos usados, atualmente, no tratamento da
candidíase são os polienos (como nistatina e anfotericina B), os imidazóis
(como clotrimazol e miconazol) e os triazóis (como o fluconazol e itraconazol)
(PAIVA et al., 2009).
Considerando que a candidíase bucal é uma infecção superficial,
geralmente, o tratamento inicial é feito com um agente tópico. Nistatina e
miconazol são as drogas de escolha inicial. Caso a terapêutica tópica não
26
apresente resultados, é iniciado o tratamento sistêmico, sendo o fluconazol a
droga mais prescrita (PAIVA et al., 2009).
A nistatina é um antifúngico extraído de culturas de Streptomyces, foi
descoberta em 1950 e é utilizada há mais de 50 anos na terapêutica. Seu uso é
fortemente influenciado pelo aumento do número de indivíduos
imunocomprometidos (casos de candidíase em pacientes com neoplasias,
AIDS e outros problemas sistêmicos) (TAVARES, 2001; SHIP; VISSINK;
CHALLACOMBE, 2007).
Ela pertence ao grupo dos polienos, classe de substância que se
caracteriza pela presença de átomos de carbono com dupla ligação, e mais
especificamente, aos grupos dos tetraenos, que são polienos com quadro
duplas ligações não saturadas em sequência. Devido a presença de grupos
carboxílicos e amino, que se encontram carregados em pH fisiológico, a
nistatina é considerada uma molécula anfotérica (CROY; KNOW, 2004;
KATZUNG, 2006).
Figura 2. Estrutura química da nistatina (Fonte: SILVA et al., 2003)
No que se refere ao mecanismo de ação, de forma geral, os antifúngicos
imidazólicos e nistatina bloqueiam a síntese do ergosterol, promovendo
defeitos na membrana celular e alterando padrões de permeabilidade, o que
proporciona a morte da célula (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).
O aumento da permeabilidade da membrana plasmática, proporcionado
pela nistatina, ocorre devido à formação de canais transmembranares, que
proporcionam a saída de água e íons essenciais, como potássio, amônio,
27
magnésio e fosfato, além de perdas de açúcares, ésteres de fosfato e
nucleotídeos (TAVARES, 2001; CROY; KNOW, 2004; SILVA et al., 2006).
A nistatina também se liga, em menor proporção, ao colesterol presente
na membrana plasmática, promovendo efeitos tóxicos nas células. Por este
fato, ela não é administrada por via parenteral, já que é capaz de promover
hemólise, necrose e abscesso no local da injeção, devido sua ligação à
membrana plasmática das hemácias (TAVARES, 2001; CROY; KNOW, 2004;
KATZUNG, 2006; SILVA et al., 2006).
Devido a este fato, a nistatina é empregada para uso tópico, mesmo
quando utilizada por via oral, buscando-se um efeito superficial na mucosa oral
ou disgestiva (FARAH; ASHMAN; CHALLACOMBE, 2000; TAVARES, 2001;
KATZUNG, 2006).
No tratamento da candidíase orofaríngea, a nistatina se apresenta na
forma de suspensão oral contendo 100.000 UI da droga em cada mL, e deve
ser administrada 3 a 4 vezes ao dia. O paciente deve bochechar o
medicamento por alguns minutos e em seguida deglutí-lo (GILMAN;
HARDMAN; LIMBIRD, 2003).
Bergendal e Isacsson (1980) avaliaram o efeito da nistatina no
tratamento de 48 pacientes com candidíase, que fizeram uso de nistatina três
vezes ao dia durante 14 dias. Os pacientes foram examinados em três
ocasiões distintas, a primeira no início do experimento, a segunda 14 dias após
o início do tratamento e no 28º dia após a suspensão do tratamento. Os
resultados apresentados demonstraram a redução dos aspectos clínicos de
inflamação após os 14 dias de tratamento, porém no 28º dia notou-se a
recorrência dos sinais de inflamação iguais aos encontrados anteriormente ao
tratamento.
Blomgren, Berggren e Jontell (1998) compararam a eficácia clínica do
fluconazol e nistatina no tratamento de 60 pacientes portadores de candidíase
oral. Foram realizados exames clínicos aos sete e vinte e um dias após o
exame inicial, e mensalmente nos seis meses seguintes. Os autores
28
concluíram que não houve diferença nos resultados dos tratamentos com os
dois fármacos, porém a aceitação do fluconazol pelos pacientes foi melhor.
A nistatina tem sido proposta para o tratamento e profilaxia de infecções
fúngicas invasivas em pacientes imunodeprimidos. Em revisão sistemática,
onde foram incluídos 12 estudos (total de 1464 pacientes) que realizaram
experimentos clínicos randomizados que compararam a nistatina com o
fluconazol, anfotericina B e grupo controle não tratado (placebo), os autores
verificaram que o efeito da nistatina na colonização fúngica foi similar àquele
observado para o controle (RR=0,65), não houve diferença estatística
significante entre nistatina e fluconazol sobre a mortalidade dos pacientes e
que o fluconazol foi mais eficaz em impedir a infecção fúngica sistêmica
(RR=0,37). A partir dos dados observados o estudo indica que a nistatina não
deve ser recomendada para tratamento e profilaxia de infecções fúgicas em
pacientes imunocomprometidos (GOTZSCHE; JOHANSEN, 2002).
Em outra revisão sistemática onde foram incluídos 12 ensaios clínicos
controlados e randomizados envolvendo 1606 pacientes, foi verificado que para
profilaxia de infecções fúngicas sistêmicas em pacientes susceptíveis o
fluconazol deve ser prescrito (PLAYFORD et al., 2006).
Ainda na perspectiva da profilaxia de infecções fúngicas, uma revisão
sistemática que avaliou o efeito da nistatina e miconazol (agentes tópicos) na
prevenção de infecções fúngicas sistêmicas em recém-nascidos de baixo peso
identificou apenas 3 estudos clínicos, que apresentaram várias limitações
metodológicas, como ausência de randomização, falta de critérios para
alocamento da amostra, ausência de cegueira na intervenção e avaliação dos
resultados. Diante disso, os autores indicam que existe uma redução no risco
de desenvolvimento de infecções fúngicas sistêmicas nos recém-nascidos
tratados com antifúngicos tópicos. Entretanto, os resultados devem ser
analisados de forma cautelosa, considerando as limitações metodológicas
identificadas nos estudos avaliados (AUSTIN; DARLOW; MCGUIRE, 2009).
No que se refere à eficácia clínica da nistatina para tratamento de
candidíase oral, uma revisão sistemática de ensaios clínicos randomizados
publicados entre 1966 e 2000, 12 estudos foram considerados e sugerem
evidência para eficácia do tratamento de infecções fúngicas orais em pacientes
29
HIV-positivos com a utilização da nistatina, clotrimazol, fluconazol, cetoconazol
e itraconazol (PATTON; BONITO; SHUGARS, 2001).
O miconazol também é utilizado para tratamento das infecções fúngicas
superficiais. Sua atividade contra fungos, incluído Candida spp., é comparável
aos efeitos promovidos pela nistatina (SAWYER et al., 1975).
Figura 3. Estrutura química do miconazol (Fonte: KATZUNG, 2006).
Cardozo et al. (2001) avaliaram a eficácia clínica do miconazol na forma
de gel (Daktarin®) no tratamento de estomatite protética induzida por Candida
em 10 pacientes, que fizeram uso do medicamento quadro vezes ao dia,
durante 21 dias. O estudo indicou que miconazol na forma de gel promove
efetiva redução em todos os casos de infecção fúngica, quando comparada ao
grupo controle, formado por pacientes que não fizeram uso de nenhum
medicamento.
Um estudo clínico controlado randomizado (n=180 pacientes) que teve
como objetivo comparar o cetoconazol sistêmico (400 mg/dia) ao miconazol
mucoadesivo de liberação lenta (10 mg, 1 vez ao dia), foi verificado que em 7
dias a resposta clínica dos dois medicamentos foi semelhante. Entretanto,
associou-se maior ocorrência de reações adversas ao cetoconazol de
utilização sistêmica (VAN ROEV et al., 2004).
Em estudo clínico, randomizado, multicêntrico, comparativo e
classificado como fase III, que teve o objetivo de verificar a eficácia e
segurança de comprimidos mucoadesivos de miconazol (50 mg) com o gel de
miconazol (500 mg) no tratamento de candidíase oral em pacientes submetidos
30
a radioterapia para tratamento do câncer, os autores verificaram que ambos
medicamentos são capazes de tratar a infecção (p<0,0001) (BENSADOUN et
al., 2008).
Como dito anteriormente, a colonização fúngica, especialmente por C.
albicans, em pacientes em mucosa oral de usuários de próteses dentárias,
verifica-se com frequência a infecção, conhecida como estomatite protética.
Para combater tal infecção é proposta, além dos antifúngicos de uso superficial
(nistatina e miconazol) aqui descritos, a utilização de outros agentes químicos,
como hipoclorito de sódio e ácido acético, que são utilizados para emergir as
peças protéticas com a finalidade de desinfecção das mesmas (WEBB;
THOMAS; WHITTLE, 2005; AZUMA et al., 2006; ANDRADE, 2008).
3.3 Limitações dos antifúngicos sintéticos
A resistência fúngica aos agentes terapeuticamente disponíveis vem
aumentando como consequência do crescimento da população
imunocomprometida e do uso cada vez mais frequente de profilaxia e auto-
medicação (WANNMACHER; FERREIRA, 2007). A diminuição da
susceptibilidade de espécies de C. albicans e não-albicans foi inicialmente
relatada em 1970 em pacientes com candidíase mucocutânea crônica com
repetidos e prolongados tratamentos (RAUTEMAA et al., 2007).
O diagnóstico tardio e o relativo número reduzido de classes de
antifúngicos terapeuticamente disponíveis favorecem a mortalidade, que é
atribuída às infecções sistêmicas. Aliado a isso, a resistência fúngica aos
agentes disponíveis torna-se um problema para alguns grupos de pacientes,
especialmente os imunocomprometidos (CANNON et al., 2009).
Na terapia antifúngica de infecções mucocutâneas por via sistêmica, o
cetoconazol foi um dos primeiros a torna-se disponível. Entretanto, com pouco
tempo de introdução desse agente na terapêutica, as experiências clínicas
indicaram aumento na CIM necessária para realização de tratamentos
prolongados. Quanto ao fluconazol, tem sido observado que os portadores de
HIV/AIDS tratados para candidíase orofarígea com envolvimento esofágico
apresentam-se, com frequência, resistentes a este agente antifúngico (SMITH
31
et al. 1986). Em estudo que avaliou 168 amostras clínicas de candidíase oral
crônica foi verificado que 31,4% apresentaram-se resistente ao fluconazol (CIM
de 19,5 mg/mL) (RAUTEMAA et al., 2007).
Smith et al. (1986) apontam que o estudo da resistência das espécies de
Candida frente aos antifúngicos disponíveis deve levar em consideração:
condições clínicas dos pacientes (imunossupressão, possibilidade de interação
medicamentosa, presença de abscessos e cateteres); terapia antifúngica
(droga, dose, duração, via de administração); análise micológica antes e após o
tratamento e o método utilizado para diagnóstico.
Outro fator que pode contribuir para o desenvolvimento de resistência
fúngica é a necessidade de uso prolongado dos agentes antifúngicos. Em
estudo que avaliou a terapia antifúngica para tratamento de candidíase
orofaríngea em 61 pacientes imunocomprometidos, foi verificado que a duração
da terapia com clotrimazol, cetoconazol e fluconazol, variaram de,
respectivamente, 3 a 240, 11 a 44 e 7 a 138 dias (FAN-HAVARD et al., 1991).
Segundo Andes et al. (2006), doses administradas frequentemente
tendem a impedir a seleção de células resistentes aos antifúngicos. Em
contrapartida, regimes posológicos prolongados parecem contribuir para o
desenvolvimento de resistência.
Diante do evidente crescimento do número de patógenos resistentes aos
antimicrobianos atualmente utilizados na clínica, existe uma clara e emergente
necessidade de introduzir novos agentes antimicrobianos no arsenal
terapêutico (KHAN et al., 2009). No que se refere à resistência de cepas de
Candida aos antifúngicos sintéticos azóis, como fluconazol, miconazol e
intraconazol, diversos mecanismos contribuem para o fenômeno de resistência,
entre eles destacam-se: a superexpressão ou mutação do gene ERG11, que
codifica a enzima alvo dos azóis, a lanosterol 14-α-desmetilase (MARICHAL et
al., 1999); a superexpressão de genes CDR1, CDR2 e MDR1 que codificam
bombas de efluxo (PRASAD, 1995; WHINTE et al., 1998; BASSO et al., 2010;
MANOHARLAL et al., 2010); alterações do gene ERG-3 que codifica a enzima
∆5.6 esterol dessaturase, importante na síntese do ergosterol (HOWELL;
MALLET; NOBLE,1990), bem como alterações na composição lipídica da
membrana plasmática fúngica, o que dificulta o influxo do fármaco na célula
32
(LÖFFLER; EINSELE; HEBERT, 2000). Ressalta-se que estes mecanismos
podem ocorrer simultaneamente, contribuindo para ampliar o fenômeno de
resistência.
Segundo Sanglard et al., (1995), a superexpressão do gene BENr, que
codifica a bomba de efluxo, está intimamente relacionada ao mecanismo de
resistência aos agentes antifúngicos azóis apresentado pela C. albicans
isoladas de pacientes com HIV/AIDS.
Para Martel et al., (2010), isolados clínicos de C. albicans podem
apresentar resistência aos azóis (fluconazol, itraconazol, voriconazol,
cetoconazol e clotrimazol) e anfotericina B devido mutação dos genes ERG11
e ERG5, mesmo na presença de inibição de bombas de efluxo. O estudo
mostra que esses genes também estão envolvidos na produção do ergosterol,
alvo para as drogas estudadas. Dunkel et al. (2008) relatam que a expressão
do ERG11 e outros genes envolvidos com a biossíntese do ergosterol depende
da superexpressão do fator de transcrição UPC2P.
Segundo Pozzati et al., (2008), os mecanismos de resistência de
Candida spp. aos azóis podem ser explicados resumidamente da seguinte
forma: o gene EGR11 codifica a enzima alvo para ação do fármaco, lanosterol
14α-demetilase. Assim, quando esse gene sofre mutação, a enzima alvo passa
a não ser reconhecida pelos azóis. Além disso, em células resistentes observa-
se um aumento expressivo na expressão dos genes CDR e MDR que codificam
bombas de efluxo. Mutações em genes que codificam outras enzimas
envolvidas na via da biossíntese do ergosterol, como o ERG3, podem também
contribuir para a resistência.
O conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos com a
resistência de cepas de C. albicans fomenta o desenvolvimento de drogas que
possam atuar em outros alvos celulares.
3.4 Produtos naturais
Há muito tempo os produtos de origem natural são utilizados no mundo
inteiro pela terapêutica alternativa. Estima-se que as comunidades locais
utilizam cerca de 10% das plantas nativas com fins terapêuticos. Entretanto,
33
apenas 1% dos produtos utilizados ganha reconhecimento científico (KHAN et
al., 2009).
Sartorato et al. (2004) destacam que o uso de plantas medicinais é uma
prática rotineira nos países em desenvolvimento, especialmente na África, Ásia
e América Latina, onde existe uma necessidade de utilização da medicina
popular com solução alternativa para problemas de saúde.
Considerando a perspectiva de obtenção de novos fármacos, os
produtos naturais se diferenciam dos sintéticos sob o aspecto da diversidade
molecular. Sabe-se que a diversidade molecular dos produtos de origem
natural é muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar
dos avanços consideráveis, é ainda limitada. Isso proporciona a elaboração de
diversos novos fármacos com funções terapêuticas diversificadas (NISBET;
MOORE, 1997).
No Brasil, país com vasta biodiversidade, experiências atreladas ao
conhecimento popular aproximam a utilização de produtos naturais aos
recursos terapêuticos disponíveis, sendo, inclusive, esta prática recomendada
pelo poder público (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006). Em 3 de maio de
2006, o Ministério da Saúde, através da Portaria nº 971, aprovou a Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no âmbito do
Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2006).
Em 2007, O Ministério da Saúde do governo brasileiro lançou a Política
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), que visa garantir à
população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e
fitoterápicos, e tem como alguns dos seus objetivos: inserir plantas medicinais,
fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia no SUS, desenvolver
instrumentos de fomento à pesquisa, desenvolvimento de tecnologias e
inovações em plantas medicinais e fitoterápicos, nas diversas fases da cadeia
produtiva, promover e reconhecer as práticas populares e tradicionais de uso
de plantas medicinais, fitoterápicos e remédios caseiros, bem como
estabelecer uma política intersetorial para o desenvolvimento socioeconômico
na área de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2007).
34
O documento supracitado apresenta como diretriz o incentivo a
formação e a capacitação de recursos humanos para o desenvolvimento de
pesquisas, tecnologias e inovação em plantas medicinais e fitoterápicos. Para
tanto, reconhece-se a importância do apoio a qualificação técnica dos
profissionais da saúde, e demais envolvidos na produção e uso desses
produtos (BRASIL, 2007).
Essa política de atuação governamental visa enfrentar os empecilhos
para a utilização dos produtos naturais apontados por Oliveira, Oliveira e Diniz
(1997), que levantaram a problemática do desconhecimento dos profissionais
de saúde sobre as indicações e cuidados no uso de plantas medicinais. Do
ponto de vista dos usuários dos serviços de saúde, Ness, Sherman e Pan
(1999) retratam que as plantas medicinais são vistas apenas como uma
alternativa aos elevados custos dos medicamentos convencionais e não como
opção terapêutica devido às suas propriedades curativas das plantas.
Para Borba e Macedo (2006), existe uma clara necessidade de
minimizar a distância entre a técnica e pesquisas científicas das tradições e
crenças populares, proporcionando uma valorização dos conhecimentos
populares, agregando-lhes comprovação científica e, permitindo, assim,
divulgação à população em geral de conhecimentos úteis, antes utilizados
apenas in loco, valorizando tanto a cultura quanto a ciência de um povo.
A escolha da planta para utilização em estudos que avaliam suas
propriedades farmacológicas é feita considerando o uso terapêutico, o estudo
etnobotânico, a presença de determinadas substâncias ou de acordo com a
sua disponibilidade (MACIEL; PINTO; VIEGA, 2002). A abordagem
etnofarmacológica consiste em associar informações obtidas junto as
comunidades locais que utilizam a flora medicinal com estudos químicos e
farmacológicos desenvolvidos em laboratórios especializados (ELISABETSKY;
SOUZA, 2007).
Em pesquisa realizada na cidade de João Pessoa, Paraíba, Brasil, com
o objetivo de realizar um estudo etnobotânico sobre a indicação de plantas
medicinais para tratamento de patologias bucais feita por raizeros e usuários
35
dos serviços odontológicos do serviço público, foi verificado que, na maioria
dos casos, as plantas utilizadas são nativas da flora regional, sendo a Punica
granatum L. (Romã) a mais citada (SANTOS et al., 2009).
Em outro estudo realizado na cidade de Santa Cruz, Mato Grosso,
Brasil, Borba e Maciel (2006) verificaram que, para tratamento e prevenção de
afecções bucais, os habitantes locais citaram 87 espécies nativas do bioma
nativo, estando a Matricaria chamomilla (camomila), Crocus sativus (açafrão) e
Brickelia brasiliensis (arnica-da-serra), entre as lembradas.
Alguns extratos de plantas e metabólitos secundários possuem efeitos
inibitórios e letais dose-dependentes sobre diferentes microrganismos (SMITH-
PALMER; STEWART; FYFE, 1998). Dentre as substâncias extraídas, tomam
destaque os óleos voláteis, que em sua maioria evidencia forte atividade
antibacteriana e antifúngica, atribuídas a presença de monoterpenos, que
representam cerca de 90% dos compostos presentes (POZZATI, 2007;
SIMÕES et al., 2007).
Do ponto de vista das funções biológicas dos óleos essenciais, Harbone
(1993) aponta a existência de funções ecológicas, especialmente como
inibidores da germinação, na proteção contra predadores, na atração de
polinizadores, na proteção contra aumento de temperatura, entre outras. Em
relação às atividades farmacológicas, destacam-se a ação carminativa,
antiespasmódica, estimulante sobre secreções do aparelho digestivo, ação
cardiovascular (aumento do ritmo cardíaco), atividade secretora do epitélio
respiratório, ações sobre o SNC (estimulantes ou depressoras), ação
anestésica local, antiinflamatória e anti-séptica (SIMÕES et al., 2007).
Como reportado anteriormente, a literatura tem evidenciado que os óleos
essenciais apresentam expressiva atividade antifúngica (CHAMI et al., 2004;
GIORDANI et al., 2004; DUARTE et al., 2005; PEREIRA, 2009; CASTRO;
OLIVEIRA, 2010). Palmeira-de-Oliveira et al. (2009) realizaram ampla revisão
da literatura e observaram que a atividade anti-Candida de óleos essenciais
vem sendo extensivamente investigada na tentativa de disponibilizar
alternativas terapêuticas para o tratamento da candidíase. Entretanto, os
36
mecanismos de ação desses compostos e seus constituintes não estão
totalmente elucidados. Especula-se que a maioria dos óleos essenciais exerça
sua atividade antimicrobiana através de modificações na estrutura da parede
celular do microrganismo, aumentando a permeabilidade da membrana
citoplasmática, promovendo a deterioração de processos essenciais à
sobrevivência da célula. Sugere-se também que o rompimento da parede
celular deva-se ao caráter lipofílico (presença de monoterpenos) dos óleos
essenciais, que se acumulam nas membranas (COWAN, 1999; DORMAN;
DEANS, 2000; LAMBERT et al., 2001). Pozzatti (2007) refere-se, ainda, que a
ação antimicrobiana dessas substâncias pode ocorre devido à inativação de
algumas enzimas, incluindo as envolvidas na produção de energia e síntese de
componentes estruturais.
Diante do exposto, evidencia-se que novas pesquisas para avaliar a
atividade antifúngica de óleos essenciais apresentam perspectivas positivas,
representando possibilidades de obtenção de novos fármacos que sejam
utilizados no tratamento contra agentes infecciosos ou outras doenças.
3. 5 Cinnamomum zeylanicum
Cinnamomum zeylanicum, conhecida popularmente como canela, é uma
planta que pertence a família Lauraceae. Trata-se de uma árvore que
apresenta aproximadamente 10-15 m de altura, tem folhas com formato oval-
longo e flores que florescem em pequenos maços, com cor esverdeada e odor
característico.
A família Lauraceae pertence à divisão Magnoliophyta, sendo
considerada uma das famílias mais antigas. As Lauraceae apresentam-se
amplamente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, sendo
formadas por 49 gêneros e 2500 a 3000 espécies.
Essa família destaca-se das demais pela sua importância econômica.
Algumas espécies têm sido utilizadas pela indústria para a fabricação de
diversos produtos. Porém, a maioria das espécies tem seu uso restrito às
comunidades tradicionais que detêm o conhecimento empírico da utilização
dessas plantas (MARQUES, 2001).
37
O gênero Cinnamomum contém cerca de 250 espécies, que se
caracterizam por serem arbustos e árvores de pequeno a médio porte. As
espécies são encontradas em florestas tropicais onde crescem em montanhas
e planícies em solos bem drenados. Nas latitudes com circunstâncias
climáticas sazonais, tornam-se excessivamente raras (JANTAM et al., 2003;
JANTAN et al. 2008).
Esse gênero ocorre principalmente no sudeste e na Ásia oriental,
especialmente na Malásia. C. zeylanicum, C. loureirri, C. burmanni e C. cassia
são as espécies mais estudadas e utilizadas pela população. O óleo essencial
obtido das cascas é utilizado como condimento alimentar, na perfumaria e em
preparações farmacêuticas. O óleo da folha do C. zeylanicum apresenta
expressiva quantidade de eugenol (REYNOLDS, 1993).
Marques (2001) destaca que as Lauraceae, incluindo C. zeylanicum,
apresentam, na medicina popular, diferentes funções contra diversas doenças
e que o óleo essencial, armazenado em células secretoras encontradas na
folha e caule, representa um dos principais produtos responsáveis pelas
atividades farmacológicas. Na Europa, o óleo essencial obtido da casca dessa
planta vem sendo utilizado no controle da glicemia em pacientes portadores de
diabetes tipo II (MEADES et al., 2010).
Em relação a estas atividades, as propriedades antimicrobianas,
incluindo a antifúngica, do óleo essencial obtido do C. zeylanicum vêm sendo
amplamente estudadas por diversos pesquisadores (LIMA et al.,1993; BELÉM,
2002; BONJAR; AGHIGHI; KARIMI, 2004; MOREIRA, et al., 2007; ATAYDE et
al., 2008; BANSOD; RAI, 2008; JANTAM et al., 2008; KAHN et al., 2009;
PUANGPRONPITAG; SITTIWET, 2009).
Quale et al (1996) avaliaram a atividade in vitro do óleo essencial de C.
zeylanicum sobre isolados de Candida susceptíveis e resistentes ao fluconazol,
sendo encontradas concentrações inibitórias mínimas (CIM) que variaram entre
0,05 a 30 mg/mL. Esses resultados, segundo os autores, sugerem a realização
de estudos clínicos para tratamento de candidíase de mucosa bucal.
38
De forma semelhante, Pozzatti (2007) avaliou in vitro a atividade
antifúngica do óleo essencial de C. zeylanicum sobre isolados de Candida
comprovadamente susceptíveis e resistentes ao fluconazol. A autora verificou
que o produto testado apresentou CIM e Concentração Fungicida Mínima
(CFM) que variaram entre 200 a 1600 e 800 a 1600 µg/mL, respectivamente.
Carmo et al (2008) verificaram a interferência do óleo essencial C.
zeylanicum sobre o crescimento e morfogênese de algumas espécies de
Aspergillus potencialmente patogênicas. O produto testado apresentou potente
efeito antifúngico demonstrado pela visualização de grandes zonas de inibição
de crescimento de todas as linhagens testadas. Os valores de CIM50 e de
CIM90 foram 40 e 80 µL/mL, respectivamente. Nas concentrações de 80, 40 e
20 µL/mL o óleo demonstrou um significativo efeito fumigante, inibindo o
crescimento micelial radial de A. niger, A. flavus e A. fumigatus ao longo de 14
dias de exposição. A 80 e 40 µL/mL o óleo essencial promoveu inibição de
100% da germinação de esporos, das três espécies de Aspergillus.
Além do óleo essencial do C. zeylanicum, extratos obtidos dessa
espécie vegetal podem apresentar expressiva atividade antifúngica. Mishra et
al. (2009) verificaram que extratos obtidos em diferentes solventes foram
capazes de inibir crescimento de Alternaria solani e Curvularia lunata,
consideras espécies fúngicas capazes de promover infecções dermatológicas.
Lima et al. (2006) verificaram a atividade antifúngica do óleo essencial
de C. zeylanicum sobre 12 cepas de Candida, entre elas C. albicans, C.
guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea e C. tropicalis a partir
da técnica de difusão em meio sólido. Os autores puderam identificar que o
óleo avaliado apresentou destacáveis resultados, uma vez que houve inibição
de crescimento de 58% das cepas ensaiadas e CIM de 4%.
Quale et al. (1996) relata que o óleo essencial de C. zeylanicum
apresenta CIM que pode variar entre 0,03 a 0,5 mg/L sobre isolados clínicos de
Candida resistentes ao fluconazol. Resultados semelhantes foram observados
por Pozzatti et al. (2008).
39
Schmidt et al (2007) avaliaram a atividade antifúngica dos compostos
químicos presentes no óleo essencial de C. zeylanicum. Os autores verificaram
que o referido óleo inibe crescimento de cepas de Candida e que o eugenol,
composto majoritário do produto, apresenta expressiva atividade antifúngica.
Entretanto, os compostos minoritários presentes no óleo participam
decisivamente na atividade anti-Candida.
Em relação à composição química do óleo essencial de C. zeylanicum,
as pesquisas indicam que o eugenol é o principal componente do óleo
essencial de C. zeylanicum (SENANAYAKE; LEE; WILLS, 1978; LORENZI;
MATOS, 2003; POZZATTI, 2007).
Ressalta-se que apesar de todos os órgãos de uma planta poderem
acumular óleos essenciais, sua composição química, características físico-
químicas e odores podem variar segundo sua localização, adubação, solo e
clima. Embora controlada geneticamente, a biossíntese dos constituintes de
uma planta é fortemente afetada pelo ambiente, colheita e pós-colheita,
precipitação pluviométrica, temperatura, luminosidade e umidade (SARMAR;
TRIPATHI, 2008).
O eugenol pertence a um grupo de compostos constituintes de óleos
essenciais originados a partir da redução da cadeia lateral dos ácidos
cinâmicos, que por sua vez são derivados da fenilalanina. Esses compostos
também estão presentes em Syzygium aromaticum (cravo-da-índia), Pimpinella
anisum (erva doce), Foeniculum vulgare (funcho) e Illicium verum (anis-
estrelado) (SIMÕES et al., 2007).
Meades et al. (2010) sugerem que a atividade antibacteriana do óleo
essencial obtido das cascas do C. zeylanicum pode ser decorrente da ação do
Trans-cinamaldeído, composto encontrado em grande quantidade no produto.
Segundo os autores, essa substância pode interagir com Acetil-CoA
Carboxilase das bactérias, provendo sua morte.
Ressalta-se que o estudo da atividade antimicrobiana dos produtos
naturais, incluindo óleos essenciais, deve está, preferencialmente, associado a
análise química dos referidos produtos. Esta prática proporciona identificar as
40
principais substâncias presentes, o que pode sugerir provável atividade
biológica das mesmas.
3. 6. Associação de drogas antifúngicas
O estudo de efeitos interativos entre moléculas tem uma longa história.
Para as drogas antimicrobianas, o uso de duplas ou triplas combinações tem
início com a realização de estudos in vitro que indicam interações positivas
capazes de promover a inibição do crescimento dos microrganismos. Existem
vários modelos experimentais que mensuram os efeitos de combinações de
drogas. Um dos protocolos mais simples e conhecido é o teste chequerboard,
que proporciona uma disposição bidimensional de concentrações diferentes
das substâncias avaliadas. Esse teste permite o cálculo do índice de
Concentração Inibitória Fracionada (CIF) (ODDS, 2003).
Segundo Cuenca-Estrella (2004), os compostos antifúngicos associados
podem promover maior eficácia de cada droga, permitindo, assim, a utilização
de menores doses de cada droga. Para o autor, o método chequerboard e a
curva de morte microbiana são frequentemente utilizados na avaliação in vitro
da atividade de antimicrobianos combinados.
Existem vários mecanismos envolvidos com a atividade sinérgica com a
combinação de antifúngicos: a) inibição de diferentes estágios nas vias
bioquímicas intracelulares fúngicas essenciais a sobrevivência celular; b)
aumento da penetração do agente antifúngico proporcionada pela ação de
outro antifúngico na membrana celular fúngica. Essa interação pode ser
observada com a interação entre anfotericina B ou fluconazol e rifamicina; c)
inibição de proteínas carreadoras. Por exemplo: a anfotericina B inibe a ação
de proteínas de membrana plasmática que teriam a função de promover a
extrusão de flucitocina, que por sua vez permanece no interior da célula e
exerce seu efeito; d) inibição de diferentes alvos celulares simultaneamente.
Esse efeito pode ser observado em drogas que exercem o efeito sobre a
parede celular e outra que atua sobre a membrana plasmática (JOHNSON et
al., 2004).
41
O estudo e a descoberta de produtos naturais com princípios ativos que
apresentem atividade antimicrobiana intrínseca ou combinada com
antibióticos/antifúngicos de uso comum podem representar uma nova forma de
fazer frente aos microrganismos multiresistentes, além de impedir o contato
destes microrganismos com os produtos sintéticos, diminuindo o risco de se
selecionar novos ou melhores mecanismos de resistência. Dessa forma, pode-
se direcionar a indústria farmacêutica de forma a favorecer a produção e o uso
de fitoterápicos como adjuvantes de determinados tratamentos contra agentes
infecciosos ou outras doenças (COUTINHO, 2008).
Zago et al. (2009) destacam a possibilidade do uso de produtos naturais
combinados aos antimicrobianos tradicionais, no intuito de aumentar a
atividade antimicrobiana das drogas. Estes autores relatam que mesmo
produtos naturais que apresentam um efeito antimicrobiano não tão eficiente,
quando associados a produtos sintéticos apresentam sinergismo.
Nascimento et al. (2007) ressaltam que o uso associado de plantas
medicinais e/ou seus subprodutos concomitante ao uso de medicamentos
convencionais podem atuar inibindo, intensificando os efeitos terapêuticos dos
medicamentos ou não interferindo na resposta esperada.
Oliveira et al. (2006) afirmam que tal uso associado em ocasiões
especiais, como na dermatologia, plantas e seus subprodutos juntamente com
os medicamentos convencionais colocam o paciente muitas vezes em risco, já
que pode desencadear fitodermatoses decorrentes de mecanismos de irritação
ou fotossensibilidade.
A associação de produtos naturais a antimicrobianos convencionais tem
sido reportada por alguns autores (NASCIMENTO et al., 2007; COUTINHO et
al., 2009a; COUTINHO et al., 2009b; COUTINHO et al., 2009c; GAMARRA et
al., 2010; ZHAI et al., 2010). Coutinho et al. (2009a) observaram que a
associação do extrato de Hyptis martiusii Benth (cidreira–do-campo) a
clopromazina promove efeito sinérgico sobre cepas de Escherichia coli
resistente a aminoglicosídeos. Coutinho et al. (2010) também observaram que
essa combinação inibe crescimento in vitro de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina.
42
A atividade da combinação do produto de origem natural e antifúngico
convencional foi avaliada por Shiin e Kang (2003). Esses autores avaliaram a
atividade fungitóxica do óleo essencial de Agastache rugosa isolado e
associado ao cetoconazol sobre Blastoschizomyces capitatus, sendo
observada atividade sinérgica dos produtos avaliados sobre o microrganismo.
A associação do beberine, alcalóide presente na Hydrastis canadensis,
ao fluconazol apresentou sinergismo na atividade fungistática contra 40 cepas
de C. albicans resistentes ao fluconazol obtidas de isolados clínicos. Essa
interação sinérgica foi observada a partir da realização da técnica de
microdiluição, difusão em agar e determinação da curva de morte microbiana
(QUAN et al., 2006).
Observa-se na literatura uma escassez de estudos que retratam a
atividade antimicrobiana de óleo essencial de C. zeylanicum associado a
antimicrobianos convencionais. Nuryastuti et al. (2009) verificaram que o óleo
essencial obtido de Cinnamomum bumanni associado ao triclosan, gentamicina
ou clorexidina apresentou excelente atividade antibacteriana sobre isolados
clínicos de Staphylococcus epidermidis.
Shahverdi et al. (2007) verificaram que a ação combinada do trans-
cinnamaldeído, isolado do óleo essencial de C. zeylanicum, com a clindamicina
foi capaz de promover, in vitro, inibição de crescimento do Clostridium difficile
resistentes a clindamicina. O índice FIC foi de 0,312, confirmando a ação
sinérgica da clindamicina e o trans-cinnamaldeído.
Além da combinação de produtos naturais com antimicrobianos
convencionais, alguns autores sugerem a interação benéfica de dois ou mais
produtos de origem natural. Sukatta et al. (2008) verificaram que a associação
dos óleos essenciais obtidos de espécies de Cinnamomum e Syzygium
aromaticum é capaz de promover inibição de crescimento de Aspergillus niger,
Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Lasiodiplodia theobromae,
Phomopsis viticola e Rhizopus stolonifer.
43
MATERIAL E MÉTODOS
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
4. 1 Local de realização da pesquisa e cepas fúngicas
Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Micologia
do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal da Paraíba, que disponibilizou as cepas de C.
albicans LM 42V, C. albicans MD 37, C. albicans ICB 12, C. albicans ATCC
40277, C. albicans ATCC 76845, C. tropicalis ATCC 40042, C. tropicalis LM
759, C. tropicalis ATCC 13803, C. krusei ATCC 40147 e C. krusei LM 120.
4. 2 Óleos essenciais
Os óleos essenciais (Quadro 1) que tiveram a atividade antifúngica
avaliada foram obtidos na Ferquima Ind. e Com. Ltda (Vargem Grande
Paulista, São Paulo, Brasil), sendo seus parâmetros físico-químicos descritos
pelo fornecedor, que produz e comercializa óleos essenciais em escala
industrial. A emulsão do óleo essencial foi obtida seguindo as proporções
sugeridas pelo protocolo recomendado por Allegrini et al. (1973).
Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da
atividade anti-Candida.
Espécie Família Nome popular Densidade
g/mL
Citrus reticulata Rutaceae Tangerina Cravo 0,844
Citrus aurantifolia Rutaceae Limão Tahiti 0,868
Cinnamomum zeylanicum Lauraceae Canela Folha 1,040
Matricaria chamomilla Asteraceae Camomila Azul 0,916
Mentha piperita Lamiaceae Menta Piperita 0,899
Eugenia uniflora Myrtaceae Pitanga 0,905
Zingiber officinale Zingiberaceae Gengibre 0,970
45
4.3 Produtos sintéticos
Foram utilizados como controle positivo ou droga padrão a nistatina e
miconazol, ambos adquiridos na Sigma-Aldrich (São Paulo), na forma de pó. As
soluções foram preparadas no momento de execução dos testes, para alcance
da concentração desejada nos testes de sensibilidade.
4.4 Screening para avaliação da atividade antifúngica
O ensaio para determinação da atividade antifúngica dos óleos
essenciais foi realizado pelo método da difusão em meio sólido. Em placas de
Petri estéreis foram adicionados 20 mL de agar Sabouraud Dextrose (ASD)
fundido e resfriado a 45-50ºC. Após solidificação do agar, foi inoculado 1 mL da
suspensão fúngica na concentração de 106 UFC mL-1. Em seguida, discos de
papel de filtro estéreis foram embebidos em 50 µL dos óleos essenciais e
colocados sobre o meio de cultura.
Os resultados foram avaliados a partir da mensuração dos diâmetros
dos halos de inibição de crescimento fúngico em milímetros (mm). O ensaio foi
realizado em duplicata, sendo considerada a média aritmética dos valores
obtidos.
4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) – Técnica da
Microdiluição.
A determinação da CIM do óleo essencial foi realizada através da
técnica da microdiluição proposta por Ellof (1998). Inicialmente, foram
distribuídos 100 µL de caldo Sabouraud dextrose duplamente concentrado nos
orifícios das placas de microdiluição. Em seguida, foram distribuídos 100 µL da
emulsão do óleo essencial, a uma concentração inicial de 5.000 µg/mL, que foi
diluída seriadamente, à partir da retirada de uma alíquota de 100 µL da
cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Nos orifícios de cada
coluna foram dispensadas alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a
cada cepa ensaiada. Paralelamente, foram realizados controle da viabilidade
das cepas de leveduras ensaiadas. Ainda, foi realizado controle de
46
sensibilidade das cepas ensaiadas frente à ação antifúngica da nistatina e
miconazol, considerados padrões na utilização clínica, sendo ensaiados
através da técnica de microdiluição.
Os ensaios foram realizados em triplicata incubados a 35ºC durante 24-
48 horas. A leitura para determinação da CIM do óleo essencial sobre as cepas
de leveduras foi feita a partir do método visual. Foi levada em consideração a
formação ou não de aglomerados de células (“botão”) no fundo da cavidade da
placa. Dessa forma, considerou-se como CIM, a menor concentração do
produto em teste capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento das
cepas de leveduras utilizadas nos ensaios microbiológicos.
Para confirmação da presença de microrganismos viáveis nas
concentrações não inibitórias, foi utilizado o corante TCT (2, 3, 5 trifenil cloreto
de tetrazólio) no volume de 10 µL, que reflete a atividade das enzimas
desidrogenases, envolvidas no processo de respiração celular. Isto torna
possível distinguir as amostras vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas
que mantêm a sua cor (GRABE, 1976; DESWAL; CHAND, 1997).
4.6 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Após determinação da CIM, a concentração correspondente à inibitória e
as duas concentrações imediatamente mais concentradas, bem como os
controles positivos foram subcultivadas em placas de agar Sabouraud
dextrose. Após 24 horas de incubação a 30ºC, as leituras das CFMs foram
realizadas com base no crescimento dos controles, sendo considerada CFM a
menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.
4.7 Ação do óleo essencial de C. zeylanicum sobre a parede celular
fúngica.
A determinação da CIM do óleo essencial de C. zeylanicum, na
presença do sorbitol (0,8M), foi realizada pela microdiluição, utilizando placas
de microtitulação contendo 96 cavidades, com fundo em forma de “U”
(ALAMAR®) e em triplicata. Em cada orifício da placa, foram adicionados 100
µL do meio líquido CSD previamente adicionado de sorbitol de peso molecular
47
de 132,17 g (VETEC Química Fina Ltda – Rio de Janeiro/RJ), ambos
duplamente concentrados. Posteriormente, 100 µL da emulsão do óleo
essencial, também duplamente concentrado, foram dispensados nas cavidades
da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de
dois, foram obtidas concentrações de 10.000 µL/mL até 10 µL/mL do óleo
essencial e, no caso do sorbitol, uma concentração final de 0,8 M em cada
cavidade. Por fim, foram adicionados 10 µL do inoculo das espécies nas
cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa fúngica,
especificamente.
Um controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas cavidades
100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8M) também duplamente concentrados,
100 µL de água destilada estéril e 10 µL do inoculo de cada espécie. Para
verificar a ausência de interferência nos resultados pelo solvente utilizado na
preparação da emulsão, no caso o Tween 80, foi feito um controle no qual
foram colocado nas cavidades 100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8 M)
também duplamente concentrados, 100 µL de Tween 80 (10% em água
destilada estéril) e 10 µL da suspensão. Um controle de esterilidade também foi
realizado, onde foram colocados 200 µL do CSD em um orifício sem a
suspensão dos fungos. As microplacas foram semeadas e incubadas a 37ºC
por 48 horas para ser realizada a leitura (FROST et al., 1995; ZACCHINO,
2001).
4.8 Análise química do óleo essencial
A análise do óleo essencial de C. zeylanicum foi realizada no Laboratório
de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM), utilizando
o instrumento QP-5050A com um GC-17A (Shimadzu, Japão) (ADAMS, 2001;
MCLAFFERTY; STAUFFER, 1989).
48
4.9 Testes de sinergismo
4.9.1 Ensaio de sinergismo - Método checkerboard
O efeito combinado das duas substâncias (nistatina ou miconazol e óleo
essencial de C. zeylanicum) estudadas foi determinado a partir da técnica de
microdiluição - checkerboard para derivação do índice de concentração
inibitória fracionada (Índice CIF).
A turbidez das suspensões fúngicas foi comparada e ajustada àquela
apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo 0,5 da escala
McFarland, a qual corresponde a um inoculo de aproximadamente 106
unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL). Foram utilizadas soluções dos
produtos testados em concentrações determinadas a partir de suas respectivas
CIM. Inicialmente, 100 µL do meio de cultura Saboraud dextrose foram
adicionados nos poços da microplaca estéril contendo 96 cavidades, com fundo
em forma de “U” (ALAMAR®). Em seguida, 50 µL de cada produto testado, em
diversas concentrações (CIM÷8, CIM÷4, CIM÷2, CIM, CIM×2, CIM×4 e CIM×8)
foram adicionados no sentido vertical (nistatina ou miconazol) e horizontal (óleo
essencial) da microplaca, assim como mostra a figura 4. Finalmente, o meio de
cultura foi inoculado com 10 µL da suspensão fúngica. O crescimento fúngico
foi evidenciando pelo uso do corante TCT. O ensaio foi realizado em triplicata,
sendo as microplacas incubadas a 37 ºC por 48 horas (ELIOPOULOS;
MOELLERING, 1991; DUTTA et al., 2004).
O índice FIC foi calculado através da soma do FICA + FICB, onde A
representa o óleo essencial e B o miconazol ou nistatina. O FICA, por sua vez,
é calculado através da relação CIMA combinado/ CIMA sozinho, enquanto que o
FICB = CIMB combinado/CIMB sozinho. Este índice foi interpretado da seguinte
forma: sinergismo (<0,5), aditividade (0,5-1,0), indiferença (>1 e <4) ou
antagonismo (>4,0).
49
Ó
leo
ess
en
cia
l d
e C
. zeyla
nic
um
CIM × 8
CIM × 4
CIM × 2
CIM
CIM ÷ 2
CIM ÷ 4
CIM ÷ 8
CIM ÷ 8 CIM ÷ 4 CIM ÷ 2 CIM CIM × 2 CIM × 4 CIM × 8
Nistatina ou miconazol
Figura 4. Esquema para realização do ensaio de sinergismo pela técnica de
checkerboard.
4.7.2 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina
sobre a cinética do crescimento das leveduras
O estudo da interferência do produto teste (OE de C. zeylanicum)
isolado ou associado à nistatina sobre a viabilidade das cepas fúngicas foi
realizado através do método de contagem de células viáveis. Neste ensaio,
frente às concentrações inibitórias mínimas do OE, bem como, de sua
associação com a nistatina, foi observado o comportamento das cepas de
leveduras selecionadas. Inicialmente, 0,5 mL da suspensão de leveduras foi
inoculado em 4,5 mL de caldo Sabouraud contendo concentrações variadas do
OE, nistatina e associação dos produtos (CIM÷2; CIM; CIM×2; CIM×4 e
CIM×8). Nos intervalos 0, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min e 24 h após a
incubação, uma alíquota de 10 µL desse inóculo foi uniformemente inoculada
em placa de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose. Também foi realizado o
experimento controle, com crescimento livre de antifúngico.
As placas inoculadas foram incubadas a 35ºC por 48 horas. Após o fim
do período de incubação, foi realizada a contagem do número de células
viáveis, a qual foi expressa em UFC/mL e apresentada sob a forma de gráfico
da curva de morte microbiana (RASOOLI; MIRMOSTAFA, 2002).
50
4.6.3 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina
sobre a micromorfologia de cepas de C. albicans.
Para observação de alterações morfológicas das cepas de C. albicans
ATCC 40277 foi empregada a técnica do microcultivo para leveduras, utilizando
o meio ágar-arroz em câmara úmida (GUNGI; ARIM; BEPPU, 1983;
KURTZMAN; FELL, 1998).
Considerando os estudos previamente realizados por nós para
determinação das concentrações inibitórias mínimas dos produtos avaliados
sobre a mesma cepa deste estudo (CIM do EO de C. zeylanicum isolado =
312,5 µg/mL; CIM do EO de C. zeylanicum associado = 39 µg/mL; CIM da
nistatina isolada = 64 µg/mL; CIM da nistatina associada = 32 µg/mL), foram
adicionadas quantidades suficientes da emulsão do OE de C. zeylanicum e
nistatina, de forma isolada e associada, ao meio de cultura agar-arroz,
buscando-se a obtenção de variadas concentrações dos produtos no referido
meio (CIM, CIM×2, CIM×4 e CIM×8). Foram depositados 3 mL de ágar-arroz,
associados aos produtos teste, nas respectivas concentrações, fundidos sobre
uma lâmina estéril, contida sobre um suporte (outra lâmina) dentro de uma
placa de Petri. Após solidificação do meio, semeou-se a levedura, com auxílio
de uma agulha em “L”, fazendo 02 estrias paralelas. As estrias foram cobertas
com lamínulas esterilizadas. Para evitar ressecamento do meio, fez-se uma
câmara úmida, acrescentando 2 mL de água destilada sobre um pedaço de
papel de filtro (3x3 cm) estéril na placa, durante o período de incubação. A
placa foi fechada e após 24 h, 48 h e 72 h, examinou-se a preparação em
microscópio óptico. Foi observada em cada lâmina a presença de estruturas
características como pseudo-hifas, blastoconídios e clamidoconídios.
51
RESULTADOS E DISCUSSÃO
52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de
Candida.
5.2 Anti-candida activity and chemical composition of Cinnamomum zeylanicum
Blume essential oil.
5.3 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
nystatin on strains of Candida spp.
5.4 Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil alone
and combined with nystatin on micromorphology of Candida albicans strains.
5.5 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
nystatin on strains of non-albicans Candida.
5.6 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and
miconazole on Candida strains.
53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de
Candida
RESUMO
O propósito desse estudo foi identificar a atividade antifúngica de óleos
essenciais sobre cepas de Candida envolvidas com infecções da cavidade
bucal. Foram avaliados óleos essenciais obtidos a partir das seguintes
espécies vegetais: Citrus reticulata (Tangerina Cravo); Citrus aurantifolia
(Limão Tahiti); Cinnamomum zeylanicum (Canela); Matricaria chamomilla
(Camomila Azul); Mentha piperita (Menta); Eugenia uniflora (Pitanga) e Zingiber
officinale (Gengibre). A determinação da atividade antifúngica foi realizada
utilizando a técnica de difusão em meio de cultura sólido, onde discos de papel
de filtro foram embebidos nos óleos e colocados em placas de Petri contendo
agar Sabouraud Dextrose inoculado com cepas de Candida albicans e C.
tropicalis. Também foi observada a concentração inibitória mínima a partir do
método da microdiluição. Os ensaios foram realizados em duplicata. Foi
observada expressiva atividade antifúngica dos óleos essenciais de C.
zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita, que apresentaram halos com
diâmetros de inibição de crescimento microbiano de até, respectivamente, 48
mm, 30 mm e 19 mm. Ainda foi possível identificar que 66,7% das cepas
ensaiadas mostraram-se resistentes aos óleos essenciais de C. reticulata, M.
chamomilla, E. uniflora e Z. officinale. C. zeylanicum e nistatina apresentaram,
respectivamente, CIMs de 312 µg mL-1 e 32 µg mL-1. Os óleos essenciais
avaliados apresentam atividade antifúngica, sendo os melhores resultados
encontrados para C. zeylanicum. Sugere-se a realização de outros ensaios
para avaliação de atividade anti-Candida desse óleo essencial, que pode
apresentar-se como possível agente terapêutico no tratamento de infecções
fúngicas da cavidade bucal.
54
SCREENING DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE Candida1
SCREENING OF ESSENTIAL OILS ANTIFUNGAL ACTIVITY ON Candida
STRAINS
Ricardo Dias de Castro, Aluno do Curso de Doutorado Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos (Farmacologia) da UFPB, Professor Assistente do
Departamento de Clínica e Odontologia Social, Universidade Federal da
Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil. [email protected]
Edeltrudes de Oliveira Lima, Doutora, Professora Associada do Departamento
de Ciências Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa,
Paraíba, Brasil. [email protected].
Autor para correspondência
Ricardo Dias de Castro
Departamento de Clínica e Odontologia Social. Centro de Ciências da Saúde.
Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário I, Cidade Universitária,
João Pessoa, Paraíba. CEP: 58059-900.
Telefone: (83) 9317-1071
E-mail: [email protected]
1 Artigo aceito para publicação na Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e Clínica Integrada. DOI:
10.4034/1519.0501.2008.0082.0020
55
SCREENING DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE Candida
SCREENING OF ESSENTIAL OILS ANTIFUNGAL ACTIVITY ON Candida
STRAINS
Resumo
Objetivo: O propósito desse estudo foi identificar a atividade antifúngica de
óleos essenciais sobre cepas de Candida envolvidas com infecções da
cavidade bucal. Método: Foram avaliados óleos essenciais obtidos a partir das
seguintes espécies vegetais: Citrus reticulata (Tangerina Cravo); Citrus
aurantifolia (Limão Tahiti); Cinnamomum zeylanicum (Canela); Matricaria
chamomilla (Camomila Azul); Mentha piperita (Menta); Eugenia uniflora
(Pitanga) e Zingiber officinale (Gengibre). A determinação da atividade
antifúngica foi realizada utilizando a técnica de difusão em meio de cultura
sólido, onde discos de papel de filtro foram embebidos nos óleos e colocados
em placas de Petri contendo agar Sabouraud Dextrose inoculado com cepas
de Candida albicans e C. tropicalis. Também foi observada a concentração
inibitória mínima a partir do método da microdiluição. Os ensaios foram
realizados em duplicata. Resultados: Foi observada expressiva atividade
antifúngica dos óleos essenciais de C. zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita,
que apresentaram diâmetros de halos de inibição de crescimento microbiano
de até, respectivamente, 48 mm, 30 mm e 19 mm. Ainda foi possível identificar
que 66,7% das cepas ensaiadas mostraram-se resistentes aos óleos
essenciais de C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale. C.
zeylanicum e nistatina apresentaram, respectivamente, CIMs de 312 µg mL-1 e
32 µg mL-1. Conclusão: Os óleos essenciais avaliados apresentam atividade
antifúngica, sendo os melhores resultados encontrados para C. zeylanicum.
Sugere-se a realização de outros ensaios para avaliação de atividade anti-
Candida desse óleo essencial, que pode representar possível agente
terapêutico no tratamento de infecções fúngicas da cavidade bucal.
Descritores: Candidíase bucal, Candida, Óleo essencial
56
Abstract
Purpose: The purpose of this study was to identify the antifungal activity of
essential oils on Candida strains involved in oral cavity infections. Methods:
essential oils obtained from the following species were evaluated: Citrus
reticulata (Cravo Tangerine) Citrus aurantifolia (Tahiti Lime), Cinnamomum
zeylanicum (Cinnamon), Matricaria chamomilla (Blue Chamomile), Mentha
piperita (Mint), Eugenia uniflora (Pitanga) and Zingiber officinale (Ginger). The
determination of antifungal activity was performed using the diffusion technique
on solid medium, where filter paper discs were soaked in oils and placed in
Petri dishes containing Sabouraud dextrose agar inoculated with strains of
Candida albicans and C. tropicalis. It was also observed the minimum inhibitory
concentration from the microdilution method. Tests were performed in duplicate.
Results: We observed significant antifungal activity of essential oils of C.
zeylanicum, C. aurantifolia and M. piperita, which had halos of microbial growth
inhibition with diameters up to 48 mm, 30 mm and 19 mm, respectively. Still, it
was possible to identify that 66.7% of strains tested were resistant to essential
oils of C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora and Z. officinale. C. zeylanicum
and nystatin showed µg mL-1 and 32 µg mL-1 MIC, respectively. Conclusion:
The essential oils tested have antifungal activity, with best results for C.
zeylanicum. It is suggested to conduct other tests for evaluation of anti-Candida
activity of this essential oil, which could represent possible therapeutic agent in
the treatment of fungal infections of the oral cavity.
Descriptors: oral candidiasis, Candida, Essential Oil
Introdução
Cepas de Candida têm sido associadas às infecções micóticas
superficiais e sistêmicas, podendo ser isoladas em até 60% da cavidade bucal
de adultos, estando a Candida albicans e C. tropicalis entre as mais
prevalentes (1). Tais microrganismos apresentam fatores de virulência
envolvidos com a formação de biofilmes, sendo os fatores ambientais (saliva,
fluido gengival, pH e nutrientes) favoráveis aos processos de co-agregação e
57
co-adesão entre Candida e outros microrganismos, incluindo as bactérias
envolvidas com as principais patologias da cavidade bucal, cárie dentária e
doenças periodontais (2). Destaca-se que essa habilidade para formação de
biofilme está intimamente associada à capacidade de causar infecções,
representando um aumento na resistência às drogas antifúngicas e às defesas
imunológicas do hospedeiro (3-4).
Mecanismos moleculares envolvidos com a patogênicidade de espécies
de Candida são elucidados na perspectiva da elaboração de fármacos que
apresentem maior especificidade e, conseqüentemente, menos efeitos
indesejáveis (5-7). Estes mecanismos estão relacionados à ativação da via de
transdução de sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, onde respostas
celulares envolvidas com crescimento invasivo, formação de parede celular,
adaptação ao estresse osmótico e reprodução ocorrem mediante vias de
sinalização intracelular como MKc1, Cek1/2 e HOG1 MAP Kinase (6).
Atualmente, os agentes disponíveis para tratamento de infecções
fúngicas da cavidade oral, caracterizadas como superficiais, são representados
pelos poliênicos (anfotericina B, nistatina, entre outros) e azólicos (fluconazol,
itraconazol, miconazol, cetoconazol, entre outros), sendo estes últimos os
eleitos em primeira instância para tratamento dessas doenças e são
geralmente fungistáticos (8).
Diante das limitações de uso desses antifúngicos sintéticos,
evidenciadas pelo aumento da resistência pelos microrganismos, bem como
pelas reações indesejadas apresentadas pelos usuários, novos agentes são
propostos na tentativa de minimizar tais ocorrências. Nesse sentido,
considerando a ampla atividade biológica apresentada pelos produtos de
origem natural, óleos essenciais obtidos a partir das espécies vegetais de
Citrus reticulata (Tangerina Cravo), Citrus aurantifolia (Limão Tahiti),
Cinnamomum zeylanicum (Canela), Matricaria chamomilla (Camomola azul),
Mentha piperita (Menta piperita), Eugenia uniflora (Pitanga) e Zingiber officinale
(Gengibre) têm sido investigados para determinação de suas atividades
antimicrobiana (9-17).
58
Assim, foi propósito desse estudo avaliar a susceptibilidade de espécies
de C. albicans e C. tropicalis frente aos óleos essenciais de Citrus reticulata,
Citrus aurantifolia, Cinnamomum zeylanicum, Matricaria chamomilla, Mentha
piperita, Eugenia uniflora e Zingiber officinale.
Metodologia
Local de realização da pesquisa e cepas fúngicas
Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Micologia
do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, que
disponibilizou as cepas de C. albicans LM 42V, C. albicans 18F, C. albicans
MD 37, C. albicans LM 968, C. albicans ICB 12, C. albicans ATCC 76845 C.
tropicalis ATCC 13803, C. tropicalis LM 708, C. tropicalis LM 759, C. tropicalis
LM 28, C. tropicalis LM14, C. tropicalis LM 37 e C. tropicalis LM 13.
Óleos essenciais
Os óleos essenciais (Quadro 1) que tiveram a atividade antifúngica
avaliada foram obtidos na Ferquima Ind. e Com. Ltda (Vargem Grande
Paulista, São Paulo, Brasil), sendo seus parâmetros físico-químicos descritos
pelo fornecedor, que produz e comercializa óleos essenciais em escala
industrial.
Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da
atividade anti-Candida.
Espécie Família Nome popular Densidade
g/mL
Citrus reticulata Rutaceae Tangerina Cravo 0,844
Citrus aurantifolia Rutaceae Limão Tahiti 0,868
Cinnamomum zeylanicum Lauraceae Canela Folha 1,040
Matricaria chamomilla Asteraceae Camomila Azul 0,916
Mentha piperita Lamiaceae Menta Piperita 0,899
Eugenia uniflora Myrtaceae Pitanga 0,905
Zingiber officinale Zingiberaceae Gengibre 0,970
59
Avaliação da atividade antifúngica
O ensaio para determinação da atividade antifúngica dos óleos
essenciais foi realizado pelo método da difusão em meio sólido (18). Em placas
de Petri estéreis foram adicionados 20 mL de agar Sabouraud Dextrose (ASD)
fundido e resfriado a 45-50ºC. Após solidificação do agar, foi inoculado 1 mL da
suspensão fúngica na concentração de 106 UFC mL-1. Em seguida, discos de
papel de filtro estéreis foram embebidos em 50 µL dos óleos essenciais e
colocados sobre o meio de cultura.
Os resultados foram avaliados a partir da mensuração dos diâmetros
dos halos de inibição de crescimento fúngico em milímetros (mm). O ensaio foi
realizado em duplicata, sendo considerada a média aritmética dos valores
obtidos.
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) – Técnica da
Microdiluição
A determinação da CIM para o óleo essencial foi realizada através da
técnica da microdiluição, com algumas adaptações, preconizada pelo Método
de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da
Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica (19). Para realização desse
teste, foram escolhidas as cepas C. albicans ATCC 76845 e C. tropicalis ATCC
13803. Inicialmente, foram distribuídos 100 µL de caldo Sabouraud dextrose
nos orifícios das placas de microdiluição. Em seguida, foram distribuídos 100
µL da emulsão do óleo essencial, a uma concentração inicial de 5000 µg mL-1,
que foi diluída seriadamente à partir da retirada de uma alíquota de 100 µL da
cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora, gerando uma
concentração final de 39 µg mL-1. Nos orifícios de cada coluna foram
dispensadas alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a cada cepa
ensaiada na concentração de 106 UFC mL-1. Paralelamente, foram realizados
controle da viabilidade das cepas de leveduras ensaiadas. Realizou-se também
teste de sensibilidade das cepas ensaiadas frente à ação do antifúngico
nistatina, considerada droga de escolha na utilização clínica, em concentração
60
inicial de 64 µg mL-1. Para controle de qualidade da metodologia empregada,
foi realizado o teste de esterilidade do meio de cultura empregado.
Os ensaios foram realizados em duplicata e incubados a 35ºC durante
24-48 horas. A leitura para determinação da CIM dos óleos essenciais sobre as
cepas de leveduras foi feita a partir do método visual. Foi levada em
consideração a formação ou não de aglomerados de células (“crescimento
visual”) no fundo da cavidade da placa. Dessa forma, considerou-se como CIM,
a menor concentração do produto em teste capaz de produzir inibição visível
sobre o crescimento das cepas de leveduras utilizadas nos ensaios
microbiológicos (19).
Para confirmação da presença de microrganismos viáveis nas
concentrações não inibitórias, foi utilizado o corante TCT (2, 3, 5 trifenil cloreto
de tetrazólio) no volume de 10 µL, que reflete a atividade das enzimas
desidrogenases, envolvidas no processo de respiração. Isto torna possível
distinguir as amostras vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas que
mantêm a sua cor (20-21).
Resultados
A tabela 1 mostra os resultados do ensaio para determinação da
atividade antifúngica dos óleos essenciais avaliados. Observa-se que todos os
óleos essenciais apresentaram efetividade de inibição de pelo menos uma
cepa fúngica ensaiada, caracterizada pela formação de halos de inibição de
crescimento microbiano igual ou superior a 10 mm. Entre os resultados obtidos,
ressalta-se a atividade anti-Candida evidenciada pelos óleos essenciais de C.
zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita, visto que inibiram o crescimento de
todas as cepas ensaiadas (100%). Esta inibição pode ser verificada quando
observados os diâmetros dos halos de inibição do crescimento das leveduras,
onde foram encontrados valores de 38-48 mm para C. zeylanicum, 10-30 mm
para C. aurantifolia e 10-19 mm para M. piperita, sendo as cepas de C.
albicans 18F, C. albicans ICB 12 e C. tropicalis ATCC 13803 as mais sensíveis.
Os halos de inibição do crescimento fúngico podem ser observados na Figura
1.
61
Tabela 1. Medida em milímetro dos halos de inibição de crescimento microbiano
produzidos pelos óleos essenciais sobre cepas de Candida.
Cepas A B C D E F G H
C. albicans LM 42V 0 0 44 18 10 0 0 37
C. albicans 18F 15 16 48 30 19 10 14 35
C. albicans MD 37 0 0 40 8 11 0 0 39
C. albicans LM 968 12 13 40 20 13 0 10 40
C. albicans ICB-12 0 0 46 18 13 0 0 42
C. tropicalis LM 708 0 0 38 10 11 0 0 38
C. tropicalis LM 759 0 9 38 14 11 0 0 35
C. tropicalis LM 14 0 0 42 14 11 0 0 38
C. tropicalis LM 28 0 0 40 20 10 0 0 39
C. tropicalis ATCC 13803 10 10 42 17 14 0 9 41
C. tropicalis LM37 0 0 40 10 12 0 0 43
C. tropicalis LM 13 10 12 42 22 13 0 11 43
A – Citrus reticulata (Tangerina Cravo), B – Matricaria chamomilla (Camomila), C –
Cinnamomum zeylanicum (Canela folha), D – Citrus aurantifolia (Limão Tahiti), E – Mentha
piperita (Menta piperita), F – Eugenia uniflora (Pitanga), G - Zingiber officinale (Gengibre) e H –
nistatina
62
Fig. 1 Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre C. albicans ICB-12 (A)
e C. tropicalis LM-708 (B). 1 - Matricaria chamomilla; 2 - Eugenia uniflora; 3 -
Cinnamomum zeylanicum; 4 - Citrus aurantifolia; 5 - Mentha piperita; 6 - Citrus
reticulata; 7 - Zingiber officinale.
Por outro lado, 66,7% das cepas ensaiadas mostraram-se resistentes
aos óleos essenciais de C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale,
estando as cepas de C. tropicalis LM 708 e C. tropicalis LM 759 entre as mais
resistentes. Considerando que óleo essencial de C. zeylanicum apresentou os
melhores resultados no teste de difusão em meio sólido, foi verificada a menor
concentração desse produto capaz de inibir o crescimento fúngico. Assim, foi
observada CIM de 312,5 µg mL-1 sobre as cepas de C. albicans ATCC 76845 e
C. tropicalis ATCC 13803. Por sua vez, a nistatina apresentou uma CIM de 32
µg mL-1 sobre as mesmas cepas (Tabela 2).
Tabela 2. Concentração Inibitória Mínima do Óleo essencial de C. zeylanicum e
Nistatina sobre cepas de Candida.
Cepas CIM (µg mL-1)
C. zeylanicum
CIM (µg mL -1)
Nistatina
C. albicans ATCC 76845 312,5 µg/mL 32 µg/mL
C. tropicalis ATCC 13803 312,5 µg/mL 32 µg/mL
A B
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
63
Discussão
Os resultados apontam que os óleos essenciais apresentam, assim
como destaca a literatura (22), atividade antimicrobiana, despontando como
possíveis agentes terapêuticos. Neste estudo, destaca-se a atividade anti-
Candida evidenciada pelo óleo essencial de C. zeylanicum, que promoveu a
formação de halos de inibição do crescimento em até 48 mm sobre as cepas
ensaiadas. Resultado semelhante foi apontado por outro estudo (23), onde foi
encontrado halo de inibição superior a 40 mm quando da avaliação da
atividade antifúngica do extrato etanólico da C. zeylanicum sobre cepas de C.
albicans. Esta expressiva atividade antifúngica da C. zeylanicum também foi
encontrada sobre espécies de Aspergillus, sendo encontrados halos de inibição
de crescimento de até 19 mm (14).
As cepas fúngicas também apresentaram-se sensíveis ao óleo essencial
de C. aurantifolia, sendo encontrados halos de inibição de crescimento de até
30 mm para C. albicans 18F. Estes resultados são semelhantes aos achados
de literatura (24), que evidenciaram que cepas de Candida são sensíveis ao
óleo em concentrações de até 256 mg/mL.
O óleo essencial obtido a partir da M. piperita apresentou atividade sobre
todas as cepas ensaiadas, com halos de inibição de crescimento de até 19
mm. Entretanto, não foi observada na literatura atividade anti-Candida do
extrato etanólico obtido a partir dessa espécie vegetal (25).
A incipiente atividade antifúngica evidenciada pelos outros óleos
essenciais avaliados (C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale)
também tem sido evidenciada por outros estudos (9,11,15,17,26).
Destaca-se que a avaliação da atividade antimicrobiana de óleos
essenciais apresenta algumas dificuldades, que estão associadas às
características químicas dos mesmos, como: volatilidade, insolubilidade em
água e complexidade, que podem interferir significativamente nos resultados
(22). Por outro lado, a hidrofobicidade apresentada pelos óleos essenciais pode
facilitar sua interação com estruturas celulares que tem constituição lipídica,
64
promovendo aumento da permeabilidade, provocando uma saída extensiva de
eletrólitos, indispensáveis à sobrevivência celular (27).
Assim, deve-se reconhecer que os óleos essenciais obtidos a partir de
plantas são considerados fontes promissoras para elaboração de fármacos
utilizados no tratamento de micoses, mesmo considerando que os fungos
envolvidos em infecções humanas apresentam-se relativamente mais sensíveis
aos antifúngicos sintéticos comerciais (28-29). Porém, considerando a
necessidade de ampliação do arsenal terapêutico antifúngico, devido,
principalmente, ao aumento do número de cepas resistentes aos produtos
comercialmente disponíveis, a busca por novos compostos antifúngicos
mostra-se de relevante significância (15).
Ressalta-se que este estudo representa uma avaliação inicial para
determinação da atividade antifúngica dos óleos essenciais, sendo, portanto,
necessário o desenvolvimento de outros ensaios pré-clínicos, que incluem a
determinação de concentrações fungicida e fungistática, avaliação da curva de
morte microbiana, além do desenvolvimento de estudos sobre o possível
mecanismo de ação e propriedades toxicológicas.
Conclusão
A partir dos resultados obtidos, foi possível observar o potencial
antifúngico dos produtos naturais avaliados, destacando o resultado
apresentado pelos óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicum (Canela) e
Citrus aurantifolia (Limão Tahiti), representando uma possível aplicação desses
produtos na prevenção e tratamento de doenças infecciosas ocasioadas por
espécieis de Candida.
Referências Bibliográficas
1. Marsh PD. Dental Plaque as a Microbial Biofilm. Caries Res 2004; 38(1):204-
211.
2. Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP. Effect of oral bacteria on
growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol 2006;
51(1):672-680.
65
3. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Adhesion of Candida albicans and
Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite. Biointerfaces 2004;
33(1):235-241.
4. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL. Candida Biofilms: an
Update. Eukaryot Cell 2005; 4(4):633-638.
5. Orozco AS, Zhou X, Filler SG. Mechanisms of the Proinflammatory
Response of Endothelial Cells to Candida albicans Infection. Infect Immun
2000; 68(3):1134-1141.
6. Monge RA, Roma’n E, Nombela C, Pla J. The MAP Kinase signal
transduction network in Candida albicans. Microbiology 2006; 152(1):905-912.
7. Müller V, Viemann D, Schmidt M, Endres N, Ludwing S, Leverkus M, et al.
Candida albicans Triggers Activation of Distinct Signaling Pathways to Establish
a Proinflammatory Gene Expression Program in Primary Human Endothelial
Cells. J Immunol 2007; 179(1): 8435-8445.
8. Wingeter MA, Guilhermetti E, Shinobu CS, Takaki I, Svidzinski TIE.
Identificação microbiológica e sensibilidade in vitro de Candida isoladas da
cavidade oral. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2007; 40(3): 272-276.
9. Jantan IB, Moharam BAK, Santhanam J, Jamal JA. Correlation between
chemical composition and antifungal activity of the essential oils of eight
Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology 2008; 46(6):405-412.
10. Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernández-Lopéz J, Pérez-Alvarez J.
Antifungal activity of lemon (Citrus lemon L.), mandarin (Citrus reticulata L.),
grapefruit (Citrus paradisi L.) and orange (Citrus sinensis L.) essential oils. Food
Control 2008; 19(1):1130-1138.
11. Konning GH, Agyare C, Ennison B. Antimicrobial activity of some medicinal
plants of Ghana. Fitoterapia 2004; 75(1):65-67.
12. Bonjar GH, Aghighi S, Karimi Nik A. Antibacterial and antifungal survery in
plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of Iran. J Bio
Sci 2004; 4(3):405-412.
13. Srinivasan D, Sangeetha N, Suresh T, Lakshmana P. Antimicrobial activity
of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J
Ethnopharmacology 2001; 74(1):217-220.
66
14. Bansod S, Rai M. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal
plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. WJMS
2008; 3(2):81-88.
15. Lima IO, Oliveira RAG, Lima EO; Farias NMP, Souza EL. Atividade
antifúngica de óleos essenciais sobre espécies de Candida. Rev Bras
Farmacogn 2006; 16(2):197-201.
16. Giordani R, Regli P, Kaloustian J, Portugal H. Potentiation of antifungal
activity os amphotericin B by essential oil from Cinnamomum cassia. Phytother
Res 2006; 20(1):58-61.
17. Wilson CL, Solar JM, Ghaouth AE. Rapid evaluation of plant extracts and
essential oils for antifungal activity against Bortrytis cinerea. Plant Dis 1997;
81(2):204-210.
18. Bauer AWMM, Kirby JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a
standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1966; 45(3):493-496.
19. National Committee For Clinical Laboratory Standard. Método de referência
para testes de diluição em caldo para determinação da sensibilidade de
leveduras à terapia antifúngica: norma aprovada – M27-A2, 2.ed., v. 23, n.15,
2002.
20. Deswal DP, Chand U. Standartization of the tetrazolium test for viability
estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Sci Technol 1997;
25(1):409-17.
21. Gabre DF. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: Agiplan, 1976. 85p.
22. Nascimento GGF, Locatelli J, Freitas PC, Silva GL. Antibacterial activity of
plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Braz J
Microbiol 2000; 31(1):247-256.
23. Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad A, Manazir AS, Siddiqui M,
Khan AU. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug
resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules 2008;
13(1):1-12.
24. Aibinu I, Adenipekun T, Adelowotan T, Ogunsanya T, Odugbemi T.
Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of Citrus aurantifolia
(lime fruit) as used locally. Afr J Trad 2007; 4(2):185-195.
67
25. Duarte MCT, Figueira GM, Sartoratto A, Rehder VLG, Delarmelina C. Anti-
Candida activity of brazilian medicinal plants. J Ethnopharmacology 2005;
97(2):305-311.
26. Onyeagba RA, Ugbogu OC, Okeke CU. Studies on the antimicrobial effects
of garlic (Allium sativum Linn), ginger (Zingiber officinale Roscoe) and lime
(Citrus auratifolia Linn). Afr J Biotechnol 2004; 3(10):552-554.
27. Prabuseenivasan S, Jayakumar M, Ignacimuthu S. In vitro antibacterial
activity of some plant essential oils. BMC Complementary and Alternative
Medicine 2006; 6(39):1-8.
28. Faleiro ML, Miguel MG, Ladeiro F, Venâncio F, Britto JC, Figueiredo AC,
Barroso JG, Pedro LG. Antimicrobial activity of essential oils isolated from
Portuguese endemic species of Thymus. Lett Appl Microb 2003; 29(1):130-135.
29. Shin S, Pyun M. Anti-Candida effects of estragole in combination with
ketoconaloze or amphotericin B. Phytother Res 2004; 18(1):827-830.
68
5.2. ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF
CINNAMOMUM ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL
RESUMO
O objetivo deste estudo foi identificar a atividade anti-Candida e a composição
química do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum (canela). Para
tanto, foram realizados ensaios para determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima (CFM) e a ação sobre a parede
celular fúngica do OE de C. zeylanicum sobre cepas de Candida albicans, C.
tropicalis e C. krusei. Também foi analisada a composição do OE através de
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Foi observada
atividade antifúngica do OE sobre as cepas ensaiadas, com 87,5% e 62,5%
das mesmas sensíveis, respectivamente, a uma CIM de 312,5 µg/mL e CFM de
2500 µg/mL. O eugenol (73,27%) e trans-β-cariofileno (5,38%) foram
encontrados em maiores concentrações. Os resultados apontam atividade anti-
Candida do OE analisado e sugerem que a mesma ocorre por ação sobre a
parede celular fúngica.
69
ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF CINNAMOMUM
ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL2
Ricardo Dias de Castro1, Edeltrudes de Oliveira Lima2
1 Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences, Department of
Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail:
2 Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences, Department of
Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João Pessoa, Paraíba, Brazil.
E-mail: [email protected]
Corresponding to:
Ricardo Dias de Castro
Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba.
CEP: 58030-230
Tel.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446
E-mail: [email protected]
2 Artigo enviado para Brazilian Journal of Infectious Diseases. DOI: 10.1590/S1413-
86702005000100016
70
ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF CINNAMOMUM
ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL
ABSTRACT
Objective: The purpose of this study was to identify the anti-Candida activity
and chemical composition of the essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum
(cinnamon). For this, tests were conducted to determine the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC) and the
action of C. zeylanicum EO on the fungal cell wall from strains of Candida
albicans, C. tropicalis and C. krusei. It was also analyzed the EO composition
by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Results: Significant
antifungal activity was observed in EO on the strains tested, with 87.5% and
62.5% of them sensitive, respectively, at a MIC of 312.5 µg/mL and MFC of
2500 µg/mL. Eugenol (73.27%) and trans-β-caryophyllene (5.38%) were found
in higher concentrations. Conclusions: The results indicate anti-Candida
activity of the EO analyzed and suggest that it occurs due to the action on the
fungal cell wall.
Keywords: Candidiasis, Cinnamomum zeylanicum, essential oils
INTRODUCTION
Candida species are opportunistic pathogens that inhabit the human
body as commensal microrganisms and are considered the major cause of
fungal infections in humans. Usually, infections caused by Candida spp. are
developed as a result of changes in immune response. The virulence of these
fungi is attributed to their morphological plasticity, because depending on
71
growing conditions they are capable to form hyphae, pseudohyphae and
chlamydospores.1 These fungi are able to inhabit skin surfaces and mucous
membranes, especially genital areas, intestinal tract and oral cavity whose
colonization is determined by their ability to adhere to human tissues as well as
to prosthetic devices and catheters.2,3
Candida albicans is considered the most pathogenic Candida specie.
However, a variety of other genus’ members such as C. tropicalis and C. krusei
have been cited as agents responsible for the significant increase in the number
of infections.4
One of the most important virulence factors of Candida species is their
ability to form biofilm, which has repercussions in the clinical context, because it
is associated with increased resistance to antimicrobial agents.5-8 Biofilms can
be formed by a single microbial specie or a mixture of microrganisms, including
fungi and bacteria. Fungal species that have the ability to form biofilms are
widely studied, especially as regards the action of antifungal agents.9-11
Given the evident growth in the number of pathogens resistant to
antibiotics currently used in the clinic, there is a clear and emerging need to
introduce new antimicrobial agents to the therapeutic arsenal.12 Concerning the
resistance of Candida strains to azole synthetic antifungal (fluconazole,
miconazole, itraconazole), several mechanisms contribute to the phenomenon
of resistance, among them are: the overexpression or mutation of ERG11 gene,
which encodes the azole target enzyme, the lanosterol 14-α-desmetilase13;
overexpression of CDR and MDR genes that encode efflux pumps14,15; changes
in ERG-3 gene that encodes Δ5.6 sterol desaturase enzyme, important in the
synthesis of ergosterol16, as well as changes in lipid composition of the fungal
72
plasma membrane, which hinders the influx of the drug in the cell.17 It is
emphasized that these mechanisms can occur simultaneously, contributing to
enlarge the phenomenon of resistance.
Thus, natural products, especially those derived from plant species, gain
importance due to their availability and basement of popular usage, which often
ensures safety with regard to their toxicology.
Among the plant species with therapeutic potential is Cinnamomum
zeylanicum Blume, popularly known as cinnamon. This is a plant specie from
Lauraceae family, native to Indonesia and cultivated in various regions of the
world. Several biological properties of C. zeylanicum are described: antiseptic,
analgesic, anti-spasmodic, astringent, insecticide and parasiticide.18 Studies
point out that the essential oil obtained from its leaves has broad antimicrobial
activity.12,18 Therefore, the purpose of this study was to evaluate the anti-
Candida activity and to identify the chemical composition of essential oil
extracted from leaves of C. zeylanicum.
MATERIAL AND METHODS
Fungal Strains
Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the
Department of Pharmaceutical Sciences of the Center for Health Sciences,
Federal University of Paraíba, which provided the strains of C. albicans ATCC
40277, C. albicans ATCC 40006, C. albicans MD 37, C. albicans ICB 12, C.
tropicalis ATCC 40042, C. tropicalis LM 759, C. krusei ATCC 40147 and C.
krusei LM 120.
73
Essential Oil
The essential oil of C. zeylanicum, which had evaluated the antifungal
activity and chemical composition, was obtained from Ferquima Ind. and Com.
Ltda (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brazil), whose physical and
chemical parameters were described by the supplier, which produces and
markets essential oils on an industrial scale .
The emulsion of essential oil was obtained following the proportions
suggested by the protocol recommended by Allegrini et al.19 , where in a test
tube, were added 0.4 mL of essential oil, 0.04 mL of TWEEN 80 and q.s.
(quantum sufficit) 5 mL of sterile distilled water. This mixture was agitated for
five minutes in Vortex apparatus.
Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
The MIC of the essential oil was determined through the microdilution
technique proposed by Ellof20. Initially, were distributed 100 µL of Sabouraud
dextrose broth (SDB) doubly concentrated into the microdilution plate wells.
Then, 100 µL of the emulsion of essential oil were distributed, with initial
concentration of 5.000 µg/mL, which was serially diluted transfering an 100 µL
aliquot from the most concentrated well and inserting it into the following one.
In each column’s wells were dispensed aliquots of 10 µL of the inoculum
for each strain tested. In parallel, it was made control of viability of the yeast
strains under study. Moreover, it was made control of sensitivity of the strains
assayed as regards the antifungal effect of nystatin and miconazole, which are
74
considered standards in clinical use, being tested by the microdilution
technique.
The tests were performed in triplicate and incubated at 35°C for 24-48
hours. The reading for MIC determination of essential oil on the yeast strains
was made by the visual method. It was taken into consideration the formation of
cells clusters ("button") at the bottom of the plate well. Thus, it was considered
as MIC the lowest concentration of the product under test capable to produce
visible inhibition on the growth of yeast strains used in the microbiological
assays.
To confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory
concentrations, it was used 10 µL of the dye 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride
in each well, which reflects the activity of dehydrogenase enzymes involved in
the process of breathing. It makes possible to distinguish the live samples, red-
colored, from the died samples that keep their color.21
Determination of Minimum Fungicidal Concentration (MFC)
After MIC determination, the concentration corresponding to the inhibitory
and the two concentrations immediately more concentrated, as well as the
positive controls were subcultivated on Sabouraud dextrose agar plates in
triplicate. After 24 hours of incubation at 30°C, the readings of MFCs were done
based on growth controls, being MFC the lowest drug concentration that
hindered visible growth of the subculture.
75
Action of C. zeylanicum essential oil on the fungal cell wall
The MIC determination of C. zeylanicum essential oil in the presence of
sorbitol (0.8M), was performed in triplicate by microdilution, using 96-well U-
bottom microtiter plates (ALAMAR ®). In each plate well were added 100 µL of
SDB medium previously supplemented with sorbitol presenting molecular
weight of 132.17 g (VETEC Química Fina Ltda - Rio de Janeiro / RJ), both
doubly concentrated. Subsequently, 100 µL of the emulsion of essential oil, also
doubly concentrated, were dispensed into the wells in the first row of the plate.
And through a serial dilution at a ratio of two, were obtained concentrations from
10,000 µL/mL to 10 µL/mL of essential oil and, in relation to sorbitol, a final
concentration of 0.8 M in each well. Finally, were added 10 µL of inoculum
strains in the wells, where each column of the plate corresponds to a fungal
strain, specifically.
A control of microrganism was performed by inserting 100 µL of the same
SDB and sorbitol (0.8 M) also doubly concentrated, 100 µL of sterile distilled
water and 10 µL of inoculum of each specie. To verify the absence of
interference with the results by the solvent used in emulsion preparation (Tween
80, in this case), it was made a control on which were added into wells 100 µL
of the same SDB and sorbitol (0.8 M) also doubly concentrated, 100 µL of
Tween 80 (10% in sterile distilled water) and 10 µL of suspension. A sterility
control was also conducted, where were placed 200 µL of SDB in a well without
the fungi suspension. The microplates were seeded and incubated at 37°C for
48 hours to accomplish the reading.22
76
Chemical analysis of the essential oil
The analysis of C. zeylanicum essential oil was performed at the
Fundamental Chemistry Laboratory, Federal University of Pernambuco, Brazil,
by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM), by using the
instrument QP-5050A with a GC-17A (Shimadzu, Japan).23,24
RESULTS
All strains tested were sensitive to essential oil obtained from leaves of
C. zeylanicum (Table 1), with MIC values ranging between 312.5 and 625
µg/mL, being 87.5% of Candida strains sensitive to the concentration of 312.5
µg/mL.
The essential oil of C. zeylanicum presented MFC of 2500 µg/mL to
62.5% of the strains tested. The strains of C. albicans ICB 12 and C. tropicalis
LM 759 are among the most sensitive (MFC 625 µg/mL). These data are
present in Table 1.
Table 2 brings MIC values of C. zeynalicum essential oil in presence and
absence of 0.8 M sorbitol osmotic protector. As can be seen, the test suggests
that the sorbitol protected the cells from the inhibitory effects of essential oil,
since there were changes in the MIC of the product analyzed against all strains
tested. The control with sorbitol ensured the reliability of the results and the
methodology since the strains were able to grow in the presence of sorbitol and
lack of essential oil evaluated. These results suggest that the antifungal activity
of essential oil of C. zeylanicum, somehow involves its direct interaction with the
cell wall of yeasts under study.
77
The chemical composition of essential oil from leaves of C. zeylanicum
was determined by gas chromatography coupled to a mass spectrometer (GC-
MS). The phytochemicals and their respective percentage in the essential oil
composition, molecular weights, charge/mass relation and retention times are
shown in Table 3.
DISCUSSION
The data presented in this study are similar to those described by Klan et
al.12 who found, through the test of diffusion in solid medium, halos of growth
inhibition of strains of C. albicans isolated from clinical infections larger than 40
mm and MIC of 780 µg/mL.
Quale et al.25 evaluated the antifungal activity of essential oil of C.
zeylanicum on Candida strains resistant to fluconazole. Were found MIC values
of C. zeylanicum ranging between 50 and 30,000 µg/mL. Another study, carried
out by Hili 26 showed that 72.2% of strains of C. albicans were sensitive to the
essential oil of C. zeylanicum at a concentration of 500 µg/mL.
Pozzatti et al.27 evaluated the susceptibility to the C. zeylanicum
essential oil of 138 strains of Candida, including C. albicans, C. tropicalis and C.
krusei, and was verified MIC ranging between 200 µg/mL and 1600 µg/mL.
However, it is emphasized that most strains requires 1600 µg/mL. For MFC,
variations were observed between 800 µg/mL and 1800 µg/mL.
Nystatin and miconazole, synthetic antifungal agents used as controls,
showed MIC of 64 µg/mL and 32 µg/mL, on, respectively, 87.5% and 75% of
Candida strains. These antifungal agents have been used as reference for the
78
treatment of superficial fungal infections caused by Candida species. The
miconazole is a representative for the azole antifungals whose mechanism of
action consists in inhibiting the synthesis of ergosterol by binding to the enzyme
lanosterol 14-α-demethylase, causing changes in the fungal cytoplasmic
membrane and, then, hindering the fungal development.28
Alves and Cury29 evaluated the susceptibility to the antifungal nystatin of
strains of C. albicans, C. tropicalis, C. krusei and found MIC and MFC values
ranged from, respectively, 0.5 µg/mL to 8 µg/mL and 8 µg/mL to 64 µg/mL.
Wingeter et al.30 assessed the sensitivity of strains of C. albicans and Candida
non albicans isolated from patients with denture stomatitis and observed MIC
values between 2 µg/mL and 64 µg/mL. These results are similar to those found
in this study, in which was observed for nystatin MIC values ranging from 32
µg/mL to 64 µg/mL and MFC of 64 µg/mL.
In relation to miconazole, Batista et al.31 found MIC values between 0.8
µg/mL and 2 µg/mL on 16 strains of C. albicans. Furthermore, the authors found
that the MFC of this azole showed wide variations (2.51 µg/mL to 64 µg/mL).
This study found that miconazole had MFC of 32 µg/mL on all strains tested.
The test with sorbitol, performed in this study, is based on the extent of
damage that products with antifungal activity produce on fungal cell wall
components. If the product acts somehow on the fungal cell wall, it will cause
lysis of their cells when in the absence of an osmotic stabilizer. Thus, this test
compares the MIC of antifungal products in the absence and presence of 0.8 M
sorbitol, an osmotic protector used to stabilize the fungal protoplasts.32
79
Protection with sorbitol is a test that has a broad spectrum of possibilities,
since it allows to detect not only agents that interfere with the synthesis of cell
wall polymers and its vicinity, but also the regulatory mechanisms involved in
these processes that complement each other as microscopic observation of
malformations detected in fungal strains analyzed previously.33 Thus, the results
of this study suggest testing to assess the action of C. zeylanicum essential oil
on fungal micromorphology.
C. zeylanicum is a plant that has significant amount of essential oil in its
leaves. This oil is quoted as having more than 72 substances.34 As shown in
Table 3, the GC-MS analysis resulted in identification of 17 components.
Among the phytochemicals, eugenol presented as major component, with
73.27% of the constituents, followed by trans-β-caryophyllene (5.38%) and
benzyl benzoate (4.04%). These results confirm those of other researchers in
previous reports, where it is recorded that eugenol is the main component of
essential oil of C. zeylanicum.27,34
It is noteworthy that despite all the organs of a plant can accumulate
essential oils, their chemical composition, physico-chemical characteristics and
odor can vary according to its location. Although genetically controlled, the
biosynthesis of the constituents of a plant is strongly affected by the
environment, harvesting and post harvest, rainfall, temperature, light and
humidity.35
Eugenol belongs to a group of essential oils constituents compounds
originated from the reduction of the side chain of cinnamic acids, which are
derived from phenylalanine. These compounds are also present in Syzygium
80
aromaticum (clove), Pimpinella anisum (aniseed), Foeniculum vulgare (fennel)
and Illicium verum (star anise-).36
From the results obtained, it is perceived that C. zeylanicum essential oil
presents itself as a promising product for the treatment of fungal infections
caused by Candida spp. However, it is suggested further microbiological tests
and pre-clinical studies to effectively elucidate the efficacy of this product in
treating candidiasis.
CONCLUSION
Analysis of antifungal activity of C. zeylanicum essential oil allowed to
conclude that this product has potent action on strains of C. albicans, C.
tropicalis and C. krusei, that this activity occurs, probably, by the action of
essential oil in the process of fungal cell wall synthesis and that eugenol
represents the major phytochemical component.
REFERENCES
1. Monge RA, Roma’n E, Nombela C, Pla J. The MAP Kinase signal
transduction network in Candida albicans. Microbiol 2006; 152:905-912.
2. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Adhesion of Candida albicans and
Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite. Colloids Surf B 2004;
33:235-241.
3. Donlan RM. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis
2001; 7:277–81.
4. Gilfillian, D, Sullivan, J, Haynes, K et al. Candida dubliniensis: phylogeny and
putative virulence factors. Microbiol 1998; 144:829-838.
81
5. Henriques H, Azeredo J, Oliveira R. Candida albicans and Candida
dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass and activity.
Br J Biomed Sci 2006; 63: 5-11.
6. Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP. Effect of oral bacteria on
growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol 2006; 51:672-
680.
7. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL. Candida biofilms: an
update. Eukaryot Cell 2005; 4:633-638.
8. Mukherjee PK, Chandra J. Candida biofilm resistance. Drug Resist Update
2004; 7: 301–9.
9. El-Azizi MA, Starks SE, Khardori N. Interactions of Candida albicans with
other Candida spp. and bacteria in the biofilms. J Appl Microbiol 2004;
96:1067–1073.
10. Bachmann SP, Walle KV, Ramage G et al. In vitro activity of caspofungin
against Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46:
3591–6.
11. Kuhn DM, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA. Antifungal
susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin B lipid
formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46:
1773–80.
12. Khan R, Islam B, Akram M et al. Antimicrobial activity of five herbal extracts
against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical
origin. Molecules 2008; 13:1-12.
82
13. Marichal P, Koymans L, Willemsens S et al. Contribution of mutations in the
cytochrome P450 14α-demethylase (Erg11p, Cyp51p) to azole resistance in
Candida albicans. Microbiol 1999; 145:2701-2713.
14. White TC, Marr KA, Bowden RA. Clinical, cellular, and molecular factors
that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998; 11:382-
492.
15. Prasad R, Wergifosse P, Goffeau A, Balzi E. Molecular cloning and
characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple
resistance to drugs and antifungals. Curr Genet 1995; 27:320-329.
16. Howell SA, Mallet AI, Noble WC. A comparison of the sterol content of
multiple isolates of the Candida albicans Darlington strain with other clinically
azole-sensitive and -resistant strains. J Appl Microbiol 1990; 69:692-696.
17. Löffler J, Einsele H, Hebert H. Phospholipid and sterol analysis of plasma
membranes of azole-resistant Candida albicans strains. FEMS Microbiol Lett
2000; 185:59-63.
18. Moreira ACP, Lima EO, Souza EL et al. Inhibitory effect of Cinnamomum
zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil and beta-pinene on the growth of
dematiaceous moulds. Braz J Microbiol 2007; 38:33-38.
19. Allegrini J, Bouchberg MS, Maillols H. Émulsions d’huiles essencielles,
fabrication et applications en microbiogie. Soc Phamc Montp 1973; 33:86.
20. Ellof JN. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal
inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med 1998; 64:711-
713.
83
21. Deswal DP, Chand U. Standartization of the tetrazolium test for viability
estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed. Sci Technol 1997;
25:409-17.
22. Frost DJ, Brandt KD, Cugier D, Goldman R. A whole-cell Candida albicans
assay for the detection of inhibitors towards fungal cell wall synthesis and
assembly. J. Antibiotic 1995; 28:306-309.
23. Adams RP. Identification of essential oil components by gas
chromatography/mass spectroscopy. Carol Stream, Illinois: Allured Publishing
Corporation, 1995.
24. McLafferty FW, Stauffer D. The wiley/NBS registry of mass spectral data.
New York: John Wiley Sons, 1989.
25. Quale JM, Landman D, Zaman MM et al. In vitro activity of Cinnamomum
zeylanicum against azole resistant and sensitive Candida species and a pilot
study of cinnamon for oral candidiasis. Am J Chin Med 1996; 24:103-109.
26. Hili P, Evans CS, Veness RG. Antimicrobial action of essential oils : the
effect of dimethylsulphoxide on the activity of cinnamon oil. Lett Appl Microbiol
1997; 24:269-275.
27. Pozzatti P, Scheid LA, Spader TB et al. In vitro activity of essential oils
extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and
fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol 2008; 54:950-956.
28. Chen A, Sobel JD. Emerging azole antifungal. Expert Opin Emerg Drugs
2005; 10:21-33.
29. Alves SH, Cury AE. Candida from câncer patients: susceptibility in vitro to
polyene antifungal agents. Rev Insti Med Trop 1992; 34:251-254.
84
30. Wingeter MA, Guilhermetti E, Shinobu CS et al. Microbiological identification
and in vitro sensitivity of Candida isolates from the oral cavity of HIV positive
individuals. Rev Inst Med Trop 2007; 40: 272-276.
31. Batista JM, Birman EG, Cury AE. Susceptibility to antifungal drugs of
Candida albicans strains isolated from patients with denture stomatitis Rev
Odontol Univ São Paulo 1999; 13:343-348.
32. Pereira FO. Atividade antifúngica do oleo essencial de Cymbopogon
winterianus Jowitt ex Bor sobre dermatófitos do gênero Trichophyton. [Tese de
doutorado]. João Pessoa: Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal da Paraíba, 2009.
33. Lesage G, Bussey H. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol Mol Biol Res 2006; 70: 317-343.
34. Senanayake UM, Lee TH, Wills RBH. Volatile constituents of cinnamon
(Cinnamomum zeylanicum) oils. J Agric Food Chem 1978; 26:822-824.
35. Sharmar N, Tripathi A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp
essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van
Tieghem. Microbiol Res 2006; 163:337-344.
36. Rastogi N, Domadia P, Shetty S, Dasgupta D. Screening of natural phenolic
compounds for potential inhibit bacterial cell division protein FtsZ. Indian J Exp
Biol 2008; 46:783-787.
85
Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration
(MFC) of C. zeylanicum essential oil, nystatin and miconazole on Candida strains.
C. zeylanicum Nystatin Miconazole
Strains MIC
(µg/mL)
MFC
(µg/mL)
MIC
(µg/mL)
MFC
(µg/mL)
MIC
(µg/mL)
MFC
(µg/mL)
C. albicans ATCC 40277 312.5 2500 64 64 32 32
C. albicans MD 37 312.5 2500 64 64 8 32
C. albicans ICB 12 625 625 64 64 32 32
C. albicans LM 42V 312.5 1250 64 64 32 32
C. tropicalis ATCC 40042 312.5 2500 64 64 32 32
C. tropicalis LM 759 312.5 625 64 64 32 32
C. krusei ATCC 40147 312.5 2500 64 64 32 32
C. krusei LM 120 312.5 2500 64 64 32 32
86
Table 2. Action of the essential oil of C. zeylanicum on the fungal cell wall.
Controls
Strains
MIC –
without
sorbitol
(µg/mL)
MIC – with
sorbitol
(µg/mL)
Sorbitol
Sterility
C. albicans ATCC 40277 312,5 625 + -
C. albicans MD 37 312,5 625 + -
C. albicans ICB 12 625 625 + -
C. albicans LM 42V 312,5 625 + -
C. tropicalis ATCC 40042 312,5 625 + -
C. tropicalis LM 759 312,5 625 + -
C. krusei ATCC 40147 312,5 625 + -
C. krusei LM 120 312,5 625 + -
+ presence of strain growth
- absence of strain growth
87
Table 3. Chemical characterization of C. zeylanicum leaf essential oil.
Peaks Retention time (min)
Compound % in the formulation
Molecular weight
charge/mass Relation
1 5.644 α-pinene 1.31 136 93.15
2 6.017 Camphene 0.45 136 93.10
3 6.218 Benzaldehyde 0.25 106 77.10
4 6.792 β-pinene 0.48 136 93.10
5 7.641 α-phellandrene 1.29 136 93.15
6 8.293 p-cymene 1.24 134 119.15
7 8.471 β-phellandrene 1.57 136 93.10
8 11.164 Linalool 3.31 136 71.10
9 14.217 4-terpineol 0.12 154 71.10
10 19.133 Safron 1.76 162 162.15
11 23.633 Eugenol 73.27 164 164.15
12 25.217 Trans-β-caryophyllene
5.38 204 41.05
13 26.133 Cinnamic alcohol acetate
2.53 176 43.00
14 26.498 α-humulene 1.01 204 93.10
15 29.511 Eugenol acetate 1.06 206 164.15
16 31.708 Caryophyllene oxide
0.92 177 43.05
17 38.655 Benzyl benzoate
4.04 212 105.10
88
5.3. COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL
OIL AND NYSTATIN ON STRAINS OF Candida spp.
RESUMO
Objetivou-se investigar a ação antifúngica do óleo essencial (OE) de
Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado à nistatina sobre cepas
de Candida albicans ATCC 40277. Para tanto, foi determinada a Concentração
Inibitória Mínima (CIM) de ambos os produtos avaliados, o índice de
Concentração Inibitória Fracionada (FIC) e o efeito do óleo essencial sozinho e
associado a nistatina sobre a cinética do crescimento das leveduras. Quando
avaliados isolados, C. zeylanicum e nistatina apresentaram CIM de,
respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL. Após associação dos produtos
avaliados, foi observada diminuição nos valores de CIM para ambas as
substâncias, sendo encontrados valores de, respectivamente, 39 µg/mL e 32
µg/mL para o OE e nistatina. O valor do índice de concentração fracionada
(CIF) foi de 0,6024. Foi observado que em todas as concentrações avaliadas,
os produtos avaliados isoladamente e associados foram capazes de reduzir o
número de UFC/mL, quando comparados ao grupo controle (p<0,0001), a partir
de 30 min. Os resultados indicam haver efeito aditivo da associação de C.
zeylanicum e nistatina para inibição de crescimento de cepas de C. albicans.
Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, Nistatina, Produto Natural,
Candidíase
89
COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume Essential Oil And
Nystatin On Strains Of Candida spp.3
Ricardo D. Castro*, Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences,
Department of Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-
mail: [email protected]
Edeltrudes de Oliveira Lima, Federal University of Paraiba, Center for Health
Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João
Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail: [email protected]
Fillipe de Oliveira Pereira, Federal University of Paraiba, Center for Health
Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João
Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail: [email protected]
Corresponding to:
Ricardo Dias de Castro
Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba, Brazil.
CEP: 58030-230
Fone.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446
E-mail: [email protected]
3 Artigo submetido ao periódico Journal of Essential Oil Research.
90
COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume Essential Oil And
Nystatin On Strains Of Candida spp.
ABSTRACT
This study aimed at investigating the antifungal activity of essential oil (EO) of
Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with Nystatin on strains
of Candida albicans ATCC 40277. For this, it was determined the Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) of both the products evaluated, the Fractional
Inhibitory Concentration Index (FIC) and the effect of the essential oil alone and
combined with Nystatin on the growth kinetics of yeasts. When assessed
separately, C. zeylanicum EO and Nystatin showed MICs of 312.5 µg/mL and
64 µg/mL, respectively. After combination, was observed a decrease in MIC
values for both substances, which went down to 39 µg/mL and 32 µg/mL for EO
and Nystatin, respectively. The value of the Fractional Concentration Index
(FIC) was 0.6024. It was observed that in all concentrations evaluated the
products assessed alone and in combination were able to reduce the number of
CFU/mL, when compared with the control group (p <0.0001) from 30 min. The
results indicate an additive effect of the association of C. zeylanicum with
Nystatin to inhibit growth of C. albicans strains.
Key words: Cinnamomum zeylanicum, Nystatin, Natural Product, Candidiasis
INTRODUCTION
C. albicans is an opportunistic pathogen that commensally inhabits the
human body and it’s the major cause of fungal infections in humans. These
infections usually occur as a result of a change in immune response and
virulence of this specie, which presents considerable morphological plasticity
(1). Clinically, the disease may arise as mucosal until systemic manifestations,
characterized by the invasion of various organs. The oral, vaginal and
esophageal mucosas are the most affected sites in cases of candidiasis (2,3).
In immunocompromised individuals, especially those affected by
Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), about 74% present lesions in
the oral mucosa caused by Candida spp infections (4). It is noteworthy that
91
candidiasis can act on these individuals as a marker of disease progression and
prediction for increased immunosuppression.
Late diagnosis and the relative small number of antifungal classes
therapeutically available favors mortality, which is attributed to systemic
infections. Allied to this, fungal resistance to agents available becomes a
problem for some patient groups, including the immunocompromised (5).
Therefore, given the evident growth in the number of pathogens resistant to
antibiotics currently used in the clinic, there is a clear and emerging need to
introduce new antimicrobial agents in the therapeutic arsenal (3,6).
The study and discovery of natural products that have antimicrobial
activity intrinsically or combined with antifungal drugs in common use may
represent itself as a new therapeutic tool against multiresistant microrganisms,
besides preventing contact of these microrganisms with synthetic products,
reducing the risk of selecting new or improved mechanisms of resistance. Thus,
it may guide the pharmaceutical industry in order to promote the production and
use of herbal products as adjuvant treatment on infectious agents (7).
In this perspective and considering the known antimicrobial activity of
essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum (6,7,8,9,10,11,12), the purpose
of this study was to evaluate the antifungal effect of the combination of this
natural product with Nystatin on Candida spp strains involved in superficial
infections of the oropharyngeal mucosa.
EXPERIMENTAL
Microrganisms
Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the
Center for Health Sciences, Federal University of Paraíba, Brazil, which
provided strains of C. albicans ATCC 40277.
Essential Oil
The EO whose antifungal activity is under study was obtained from
Ferquima Ind. and Comp. Ltda (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brazil). Its
92
physical and chemical parameters were described by the supplier, which
produces and markets essential oils on an industrial scale.
Considering the lipid-solubility of the essential oil, an emulsion was
prepared by adding TWEEN 80 and sterile distilled water, and this mixture was
stirred for five minutes in Vortex apparatus. The essential oil concentration used
in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g / mL).
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
The MIC determination for the essential oil and for Nystatin was
performed by microdilution technique, using 96-well U-bottom microtiter plates
(ALAMAR®). Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose Broth doubly concentrated
were distributed into the plate’s wells. Then, 100 µL of the emulsion of C.
zeylanicum EO and Nystatin were distributed at an initial concentration of 5,000
µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were conducted
serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most concentrated
well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10 µL of inoculum
correspondent to the strains under test were dispensed into the wells of each
column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests were performed
in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48 hours (13).
The reading to determine the essential oil MIC on the yeast strains was
made through the visual method. It was taken into consideration the formation
or non-formation of cellular clusters ("button") at the bottoms of the wells. Thus,
MIC was considered as the lowest concentration of the product under test
capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains used in
microbiological assays (13).
In order to confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory
concentrations, 10 µL of TTC dye (2, 3, 5 triphenyl tetrazolium chloride) were
inserted into the wells after 24 hours of incubation. The detection of
microrganisms viability reflects the activity of dehydrogenase enzymes, which
are involved in the fungal respiration process. It makes possible to distinguish
the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color (14).
93
Synergism assay – Checkerboard method
Combined effect between Nystatin and C. zeylanicum EO was
determined by the microdilution technique - checkerboard for derivation of the
Fractional Inhibitory Concentration index (FIC index).
The turbidity of the fungal suspension of C. albicans ATCC 40277 was
compared and adjusted to that presented by the barium sulphate suspension
referent to the tube 0.5 of McFarland scale, which corresponds to an inoculum
of approximately 106 Colony Forming Units/mL (CFU/mL). Solutions of the
products tested were used at concentrations determined from their respective
MIC. Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose culture medium were added into
the holes of a 96-well U-bottom microtiter plate (ALAMAR®). Then, 50 µL of
each product tested whose concentrations ranged among MIC÷4, MIC÷2, MIC,
MICx2 and MIC×4 were added in the horizontal (Nystatin) and vertical
(essential oil) directions of the plate. Finally, the culture medium was inoculated
with 10 µL of fungal suspension. Fungal growth was evidenced through the use
of TTC dye. The test was performed in triplicate, and the microplates were
incubated at 37ºC for 48 hours (15).
The FIC index was calculated as FICA + FICB, in which A represents the
EO and B is Nystatin. FICA is calculated through the ratio MICA combined /
MICA alone, while FICB = MICB combined / MICB alone. This index was
interpreted as follows: synergism (<0.5), additivity (0.5-1.0), indifference (> 1
and <4) or antagonism (> 4.0) (15,16).
Study of the effect of the essential oil alone and combined with Nystatin
on the growth kinetics of yeasts
The study of interference of the test product (C. zeylanicum EO) alone or
combined with Nystatin on the viability of fungal strains was performed using
the method of counting viable cells. In this assay, it was observed the behavior
of the yeasts strains compared to EO MIC values as well as to the values
obtained from its association with Nystatin. Initially, 0.5 mL of yeast suspension
was inoculated in 4.5 mL of Sabouraud Broth containing varied concentrations
94
of EO, Nystatin and combination of these products (MIC÷2; MIC, MIC×2, MIC×
4 and MIC×8). In the intervals 0, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min and 24 h
after incubation, an aliquot of 10 µL of inoculum was uniformly inoculated on
Petri plate containing Sabouraud Dextrose Agar. It was also conducted a
control experiment with antifungal-free growth.
The inoculated plates were incubated at 35°C for 48 hours. After
incubation period, it was conducted the counting of the number of viable cells,
which was expressed in CFU/mL and presented in a graphical form of microbial
death curve (17).
Data were statistically analyzed by analysis of variance for parametric
distributions, considering a 5% significance level (p<0.05). For this, statistical
program Graphpad Prism 5.0 was used.
RESULTS AND DISCUSSION
The essential oil of C. zeylanicum and Nystatin when evaluated
separately showed MICs of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively, on C.
albicans strain assessed, as seen in Table 1. These findings confirm the data
presented by other studies (3,18,19,20).
Meades et al. (21) suggest that the antimicrobial activity of the EO
obtained from C. zeylanicum may result from the action of trans-
cinnamaldehyde, a compound found in large quantity in the product. This
antimicrobial activity has also been attributed to eugenol, another component
found in abundance in this oil (3). This information is reinforced by Schmidt et
al. (18), who found that the chemical compounds present in C. zeylanicum EO,
particularly eugenol (the product’s major compound) inhibit growth of Candida
strains.
TABLE 1.
The study of interactive effects between molecules has a long history.
For antimicrobial drugs, the use of double or triple combinations starts with in
vitro studies which indicate that positive interactions can promote the inhibition
of microrganisms growth. There are several experimental models that measure
95
the effects of drug combinations. One of the simplest and well known protocols
is the "checkerboard" test, which provides a two-dimensional array of different
concentrations of the substances evaluated and allows the calculation of
Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) (22).
According to Cuenca-Estrella (23), the associated antifungal compounds
can promote greater effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower
doses of each drug. For this author, the checkerboard method and the microbial
death curve are often used in the in vitro evaluation of combined antimicrobials
activity.
After association of the products evaluated, it was verified reduction in
MIC values for both substances. The values found were 39 µg/mL and 32
µg/mL for the EO and Nystatin, respectively. These data represent for the EO
and Nystatin a reduction of respectively 87.52% and 50% from the
concentrations initially used. As shown in Table 2, the value of the Fractional
Inhibitory Concentration Index (FIC) was 0.6024, indicating an additive effect of
the association for the growth inhibition of C. albicans strains.
TABLE 2.
It was not found in the literature studies that evaluated the antifungal
effect of the combination of C. zeylanicum EO with Nystatin on Candida
albicans strains. However, the association of other natural products to
conventional antibiotics has been reported by some authors (2,7,24,25,26).
Once verified the additive effect of the combination of C. zeylanicum EO
with Nystatin in the inhibition of cell growth of C. albicans, it was sought to study
the effect of this combination on the growth kinetics of yeasts. It was observed
that all concentrations (MIC÷2, MIC, MICx2, MICx4 and MIC×8) of the products
tested alone or in combination were able to reduce the number of CFU/mL
when compared with the control group (p<0.0001). These data are shown in
Figures 1, 2, 3, 4 and 5, respectively.
FIGURE 1
96
FIGURE 2
FIGURE 3
FIGURE 4
FIGURE 5
The results obtained with the kinetics study indicate that the combination
of products (EO and Nystatin), even in lower concentrations, significantly
reduces the number of viable cells and that the contact time of the substances
with the cells positively favors such reduction.
In order to understand the mechanisms involved in the potentiation of the
effect afforded by this combination, the completion of other studies is required.
Johnson et al. (27) suggest that the synergistic activity of antifungal combination
may occur through inhibition of different stages in the yeast intracellular
biochemical pathways which are essential for cellular survival, for increasing
penetration of the antifungal agent provided by the action of other antifungal in
the fungal cell membrane, and for inhibiting carrier proteins, which would have
the task to promote the extrusion of drugs and inhibition of different cellular
targets simultaneously.
The results of this study suggest the conduction of antimicrobial tests that
reproduce biofilm formation, as they represent clinical situations characterized
by increased resistance to antifungal agents available and also suggest the use
of clinical isolates resistant to conventional antifungal agents. Thus, these
research findings represent the possibility of a new pharmaceutical formulation
for the treatment of superficial fungal infections, particularly those that affect the
oropharyngeal mucosa.
The combination of C. zeylanicum essential oil with Nystatin potentiates
the inhibitory effect on growth of C. albicans strains involved with
mucocutaneous infections of the oropharynx. This association may represent a
new therapeutic option to the treatment of this pathology.
97
Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum
essential oil and Nystatin on strains of C. albicans ATCC 40277.
MIC (µg/mL)
Strain C. zeylanicum Nystatin
C. albicans
ATCC 40277
312,5 64
Table 2. Fractional Concentration Index (FIC) and Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) (µg/mL) after combination of C. zeylanicum
essential oil with Nystatin on the strain of C. albicans ATCC 40277.
C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL
Nystatin MIC 32 µg/mL
FIC = 0.6024 (Additivity)
98
Figure 1. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of
the products assessed at MIC÷2 (*p<0.0001).
Figure 2. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of
the products assessed at MIC (*p<0.0001).
*
*
99
Figure 3. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of
the products assessed at MICx2 (p<0.0001).
Figure 4. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of
the products assessed at MICx4 (*p<0.0001).
*
*
100
Figure 5. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of
the products assessed at MICx8 (*p<0.0001).
REFERENCES
1. R.A. Monge, E. Roma’n, C. Nombela and J. Pla, J. The MAP Kinase signal transduction network in Candida albicans. Microbiology, 152, 905-912 (2006).
2. S. Gamarra, E.M.F. Rocha, Y.Q. Zhang, S. Park, R. Rao, D.S. Perlin. Mechanism of the synergistic effect of amiodarone and fluconazole in Candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother, 54, 1753-1761 (2010).
3. P. Pozzatti, L.A. Scheid, T.B. Spader, M.L. Atayde, J.M. Santurio, S.H. Alves. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol. 54, 950-960 (2008).
4. V.G.S. Cavassani, J.A. Sobrinho, M.G.N. Homem and A. Rapoport. Candidíase oral como marcador de prognóstico em pacientes portadores do HIV. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, 68, 630-634 (2002).
5. R.D. Cannon, E. Lamping, A.R. Holmes, K. Niimi, P.V. Baret, M.V. Keniya, K. Tanabe, M. Niimi, A. Goffeau and B.C. Monk. Efflux-Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Reviews, 22, 291-321 (2009).
6. R. Khan, B. Islam, M. Akram, S. Shakil, A.A. Ahmad, S.M. Ali, M. Siddiqui and A.U. Khan. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules, 14, 586-597 (2009).
*
101
7. H.D. Coutinho, J.G. Costa, E.O. Lima, V.S. Falcão-Silva, J.P. Siqueira-Júnior. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth and chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian Journal of Medical Research, 129, 566-568 (2009).
8. D. Puangpronpitag and C. Sittiwet. Antimicrobial properties of Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological Sciences, 2, 49-53 (2009).
9. M.L Atayde, J.M. Santurio, S.H. Alves, P. Pozzatti, L.A. Scheid and T.B. Spader. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, 54, 950-956 (2008).
10. I.B. Jantan, B.A.K. Moharam, J. Santhanam and J.A. Jamal. Correlation between chemical composition and antifungal activity of the essential oils of eight Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology, 46, 405-412 (2008).
11. S. Bansod, M. Rai. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. World Journal of Medical Sciences, 3, 81-88 (2008).
12. A.C.P. Moreira, E.O. Lima, E.L. Souza, M.A. Van Dingenen and V.N. Trajano. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 33-38 (2007).
13. J.N. Ellof. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med, 64, 711-713 (1998).
14. D.P. Deswal and U. Chand. Standartization of the tetrazolium test for viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and Technology, 25, 409-17 (1997).
15. N.K. Dutta, S.G. Dastidar, A. Kumar, K. Mazumdar, R. Ray and A.N. Chakrabarty. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian Journal of Microbiology, 35, 316-323 (2004).
16. C.H. Nightingale, P.G. Ambrose, G.L. Drusano and T. Murakawa. Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. New York Medical (2002).
17. I. Rassoli and S.A. Mirmostafa, S. A. Antibacterial properties of Thimus pubescens and Thymus serpyllum essential oil. Fitoterapia, 73, 244-250 (2002).
18. E. Schmidt, L. Jirovetz, K. Wlcek, G. Buchbauer, V. Gochev, T. Girova, A. Stoyanova and M. Geissler. Antifungal activity of eugenol and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 10, 421-429 (2007).
102
19. I.O. Lima, R.A.G. Oliveira, E.O. Lima, N.M.P. Farias and E.L. Souza. Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida. Revista Brasileira de Farmacognosia. 16, 197-201 (2006).
20. P.C. Gotzsche and H.K. Johansen. Nystatin prophylaxis and treatment in severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane Library, 1 (2002).
21. G.JR. Meades, R.L. Henken, G.L. Waldrop, M.M. Rahman, S.D. Gilman, G.P. Kamatou, A.M. Viljoen and S. Gibbons. Constituents of Cinnamon Inhibit Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta Medica. 76, 1570-1575 (2010).
22. F.C. Odds. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52, 1 (2003).
23. M. Cuenca-Estrella. Combinations of antifungal agents in therapy–what value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54, 854-869 (2004).
24. B. Zhai, H. Zhou, L. Yang, J. Zhang, K. Jung, C. Giam, X. Xiang, X. Lin. Polymyxin B in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65, 931-938 (2010).
25. H.D. Coutinho, J.G. Costa, E.O. LIma, V.S. Falcão-Silva and J.P. Siqueira-Júnior. Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and Alternative Medicine, 8, 9-13 (2009b).
26. A.M.A. Nascimento, M.G.L. Brandão, G.B. Oliveira, I.C.P. Fortes and E. Chartone-Souza. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against Staphylococcus aureus. Biomedical and Life Sciences, 92, 95-100 (2007).
27. M.D. Johnson, C. Macdougall, L. Ostrosky-Zeichner, J.R. Perfect and J.H. Rex. Combination Antifungal Therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48, 693-715 (2004).
103
5.4 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum zeylanicum Blume EM ASSOCIAÇÃO À NISTATINA SOBRE A MICROMORFOLOGIA DE CEPAS DE Candida albicans.
RESUMO
Este estudo avaliou o efeito combinado do óleo essencial de C. zeylanicum e
nistatina sobre a micromorfologia de cepas de Candida albicans ATCC 40277.
Para tanto, foi utilizada a técnica do microcultivo para leveduras, utilizando o
meio de cultura agar-arroz em câmara úmida. Examinou-se, a partir de
microscópio ótico, a presença de estruturas características como pseudo-hifas,
bastoconídios e clamidoconídios. Foi observado que o óleo essencial de C.
zeylanicum e nistatina, nas menores concentrações avaliadas, que
correspondem a, respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL, foram capazes de
inibir a formação de hifas, pseudo-hifas e clamidoconídeos. De forma
associada, mesmo em concentrações iniciais de 39 µg/mL e 32 µg/mL do OE
de C. zeylanicum e nistatina, respectivamente, foi possível observar resultado
semelhante, com a inibição do desenvolvimento das células fúngicas. Os
resultados indicam que o óleo essencial de C. zeylanicum isolado e associado
à nistatina é capaz de promover redução na capacidade de desenvolvimento
das células de C. albicans.
Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, Nistatina, Candida albicans,
sinergismo farmacológico
104
EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) ESSENTIAL OIL
ALONE AND COMBINED WITH NYSTATIN ON MICROMORPHOLOGY OF
Candida albicans STRAINS4
Ricardo Dias de Castro*1, Edeltrudes de Oliveira Lima2
1Doctorate Student: Bioactive Synthetic and Natural Products (Pharmacology),
Federal University of Paraíba. Assistant Professor, Department of Clinics and
Social Dentistry, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil.
[email protected]. CEP 58059-900.
2PhD, Associate Professor, Department of Pharmaceutical Sciences, Federal
University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil. [email protected].
CEP 58059-900.
Correspondence to:
Ricardo Dias de Castro
Departament of Clinics and Social Dentistry. Center for Health Sciences.
Federal University of Paraíba, Campus I, Cidade Universitária, João Pessoa,
Paraíba. POSTAL CODE: 58059-900.
Phone: 55 (83) 9317-1071
E-mail: [email protected]
4 Artigo submetido ao periódico Revista Brasieira de Farmacognosia.
105
EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) ESSENTIAL OIL
ALONE AND COMBINED WITH NYSTATIN ON MICROMORPHOLOGY OF
Candida albicans STRAINS
ABSTRACT
This study evaluated the combined effect between C. zeylanicum essential oil
and nystatin on the micromorphology of Candida albicans strains ATCC 40277.
For this, it was used the microculture technique for yeasts, using agar-rice
culture medium in a moist chamber. Under optical microscopy, it was examined
the presence of characteristic structures as pseudohyphae, blastoconidia and
chlamydoconidia. C. zeylanicum essential oil and nystatin, at the lowest
concentrations tested, 312.5 µg/mL and 64 µg/mL respectively, were able to
inhibit the formation of hyphae, pseudohyphae and chlamydoconidia. In
combination, even at initial concentrations of 39 µg/mL and 32 µg/mL for C.
zeylanicum EO and nystatin, respectively, similar results were observed,
through inhibition of fungal cells development. The results indicate that the
essential oil of C. zeylanicum alone and combined with nystatin is able to
promote reduction in the C. albicans cells development capacity.
Keywords: Cinnamomum zeylanicum, Nystatin, Candida albicans, Drug
synergism
INTRODUCTION
Considering that fungal resistance to therapeutic agents available has
been increasing as a result of a growing population of immunocompromised
individuals and frequent use of prophylaxis and empirical treatment with
106
antifungals (Andes et al., 2006, Rautemaa et al. 2007, Pozzati et al., 2008,
Dunkel et al. 2008, Cannon et al. 2009, Martel et al. 2010), there is a real need
to introduce new antimicrobial agents in the therapeutic arsenal (Khan et al.,
2009).
In the perspective of developing new drugs, natural products are
presented as a therapeutic possibility, since they differ from the synthetics with
regard to molecular diversity. It is known that the molecular diversity of natural
products is much higher than that derived from synthesis processes, which
despite of considerable progress, are still limited. This provides the
development of various new drugs with diverse therapeutic functions (Nisbet &
Moore, 1997).
Among the products derived from plants with recognized antifungal
activity, it’s highlighted the essential oil obtained from C. zeylanicum, which has
been widely studied by many researchers (Lima et al., 1993, Bonjar, Aghighi,
Karimi, 2004, Moreira et al., 2007, Atayde et al. 2008, Bansod & Rai, 2008,
Jantam al. 2008, Kahn et al. 2009, Puangpronpitag & Sittiwet, 2009).
Some authors propose the combination of antifungal compounds
conventionally used in the clinic with natural products, in an attempt to promote
greater effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower doses of both
products (Nascimento et al. 2007, Coutinho et al. 2009a, Coutinho et al. 2009b,
Coutinho et al. 2009c, Gamarra et al. 2010, Zhai et al. 2010). This combination
may represent a new way to tackle multi-resistant microrganisms, and prevent
contact of these microrganisms with synthetic agents, thus reducing the risk of
selecting new or improved mechanisms of resistance (Coutinho, 2008).
107
Given the above, this study aimed to evaluate the effect of C. zeylanicum
essential oil alone and combined with nystatin on the micromorphology of
Candida albicans strains involved with mucocutaneous infections.
MATERIAL AND METHODS
Microrganisms
Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the
Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, which provided
strains of C. albicans ATCC 40277.
Essential Oil
The EO whose antifungal activity has been under study was obtained
from Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo,
Brazil). Its physical and chemical parameters were described by the supplier,
which produces and markets essential oils on an industrial scale.
Considering the lipid-solubility of the essential oil, an emulsion was
prepared by adding TWEEN 80 and sterile distilled water, and this mixture was
stirred for five minutes in Vortex apparatus. The essential oil concentration used
in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g/mL).
Effect of the essential oil alone and combined with nystatin on the
micromorphology of C. albicans strains
For observation of morphological changes in the C. albicans strains
(ATCC 40277), it was used the technique of microculture for yeasts, using agar-
rice in moist chamber (Gungi, Arima, Beppu, 1983, Kurtzman & Fell, 1998).
108
Taking into consideration previous studies performed by us for
determination of Minimum Inhibitory Concentrations of these products on the
same strain used in this study (MIC of C. zeylanicum EO alone = 312.5 µg/mL;
MIC of C. zeylanicum EO combined = 39 µg/mL; MIC of nystatin alone = 64
µg/mL; MIC of nystatin combined = 32 µg/mL) were added sufficient amounts of
the EO’s emulsion and nystatin, alone and in combination, to the culture
medium agar-rice, in order to obtain various concentrations of the products
(MIC, MICx2, MICx4 and MICx8). Then, into a Petri plate were deposited 3 ml
of agar-rice associated with the products tested, on their respective
concentrations, blown on a sterile glass slide contained in a support (another
slide). After culture medium solidification, the yeasts were seeded by using a
needle in "L" and 02 parallel striations were made. The striations were covered
with sterile coverslips. To avoid desiccation of the medium, it was made a moist
chamber through addition of 2 mL of distilled water on a piece of sterile filter
paper (3x3 cm) on the plate, during the incubation period. The plate was closed
and after 24h, 48h and 72h, the preparation was examined under optical
microscope. In each slide was observed presence of characteristic structures as
pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia.
RESULTS AND DISCUSSION
The formation of hyphae and pseudohyphae is related to virulence
factors expressed by C. albicans, as these structures represent a barrier to
phagocytosis and allow the settlement of yeasts on epithelial tissue.
Morphological change is associated with the microrganism’s pathogenicity, and
109
it is believed that environmental factors influence the physiological state of the
commensal yeast (Romani, Bistoni, Puccetti, 2003).
This is the first study demonstrating the activity of the essential oil of C.
zeylanicum and nystatin alone and in combination on fungal micromorphology,
what hampers the comparison with other studies.
The results indicate that, when assessed alone at the lowest
concentrations under test (312.5 µg/mL for EO and 64 µg / mL for nystatin) the
products were able to inhibit the formation of hyphae, pseudohyphae and
chlamydoconidia. These data are consistent with information reported in the
literature about the recognized activity of these products against C. albicans
strains (Quale et al. 1996, Blomgren, Berggren, Jontell et al. 1998, Gotzsche &
Johansen, 2002, Lima et al., 2006, Playford et al. 2006, Moreira et al. 2007,
Pozzatti et al., 2008, Austin, Darlowo, Mcguire, 2009).
In combination, even at initial concentrations of respectively 39 µg/mL
and 32 µg/mL for C. zeylanicum EO and nystatin, similar results were observed,
occurring inhibition of fungal cells development.
On the other hand, as shown in Figure 1A, the cells seeded in culture
medium devoid of antifungal agent were able to develop themselves, and
therefore presented inherent characteristics of the specie, what reflects cells
viability and their normal capability of morphogenesis.
There are few studies designed to evaluate the activity of essential oils
on fungal micromorphology. In the study by Martins (2009) it was found that in
presence of Citrus limon Linn essential oil at 78 µg/mL, clinical isolates of C.
albicans were able to grow in an incipient way, and microscopic analysis
showed blastoconidia and rare rudimentary hyaline pseudohyphae.
110
This study represents a considerable advance in knowledge about the
antifungal activity of C. zeylanicum EO alone and combined with nystatin on C.
albicans strains. However, further researches to assess this activity on resistant
clinical isolates are needed. Furthermore, the use of experimental models that
reproduce the formation of biofilms should be considered, since they represent
a greater possibility to antifungals currently used in therapeutics.
CONCLUSION
The essential oil of C. zeylanicum alone and combined with nystatin is
able to promote reduction in the development of morphological structures of the
C. albicans cells, as pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia.
REFERENCES
Andes D, Forrest A, Lepak A, Nett K, Marchillo K, Lincoln I 2006. Impact of
Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug Resistance In Vivo:
Fluconazole and Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 50: (2374-
2383).
Atayde ML, Santurio JM, Alves SH, Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB 2008. In
vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against
fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol
54: (950-956).
Austin N, Darlow BA, Mcguire W 2009. Prophylactic oral/topical non-absorbed
antifungal agents to prevent invasive fungal infection in very low birth weight
infants (Cochrane Review). The Cochrane Library 7: Oxford: Update Software.
111
Bansod S, Rai M 2008. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal
plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. W Med
Sci 3: (81-88).
Blomgren J, Berggren U, Jontell M 1998. Fluconazole versus nystatin in the
treatment of oral candidosis. Acta Odontol Scand 56: (202-205).
Bonjar GH, Aghighi S, Karimi-Nik A 2004. Antibacterial and antifungal survery in
plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of Iran. J Biol
Sci 4: (405-412).
Cannon RD, Lamping E, Holmes AR, Niimi K, Baret PV, Keniya MV, Tanabe K,
Niimi M, Goffeau A, Monk BC 2009. Efflux-Mediated Antifungal Drug
Resistance. Clin Microbiol Rev 22: (291-321).
Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009a.
In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. & chlorpromazine against an
aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian J Med Res129: (566-568).
Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009b.
Potentiating effect of Mentha arvensis and chlorpromazine in the resistance to
aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In Vivo 23:
(287-289).
Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009c.
Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic
activity against methicillin--resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia
L. BMC Complement Altern Med 8: (9-13).
112
Coutinho HDM 2008. Avaliação da atividade antibacteriana e
fotossensibilizante de produtos naturais da região do cariri cearense. Tese de
doutorado. Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos, Universidade Federal da Paraíba. 2008.
Dunkel N, Liu TT, Barker KS, Homayouni R, Morschhäuser J, Rogers D 2008. A
Gain-of-Function Mutation in the Transcription Factor Upc2p Causes
Upregulation of Ergosterol Biosynthesis Genes and Increased Fluconazole
Resistance in a Clinical Candida albicans Isolate. Eukaryotic Cell 7: (1180-
1190).
Gamarra S, Rocha EMF, Zhang YQ, Park S, Rao R, Perlin DS 2010.
Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in Candida
albicans. Antimicrob Agents Chemother 54: (1753-1761)
Gotzsche PC, Johansen HK 2002. Nystatin prophylaxis and treatment in
severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane Library
4: Oxford: Update Software.
Gungi S, Arima K, Beppu T 1983. Screening of antifungal according to inducing
morfological abnormalities. Agric Biol Chem 47: (2061-1069).
Jantan I, Yeoh EL, Suriani R, Noorsiha A, Abu-Said A 2003. A comparative
study of the constituents of the essential oils of three Cinnamomum species
from Malaysia. J Essent Oil Res 15: (387-391).
Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad AA, Ali SM, Siddiqui M, Khan AU
2009. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug resistant
(MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules 14: (586-597).
113
Kurtzman CP, Fell JW 1998 The yeats, a taxonomie study. Amsterdam:
Elsevier Science B. V.
Lima EO, Gompertz OF, Giesbrecht AM, Paulo MQ 1993. In vitro antifungal
activity of essential oils obtained from officinal plants against dermatophytes.
Mycoses 36: (333-336).
Lima IO, Oliveira RAG, Lima EO, Farias NMP, Souza EL 2006. Antifungal
activity from essential oils on Candida species. Braz J Pharmacogn 16: (197-
201).
Martel CM, Parker JE, Bader O, Weig M, Gross U, Warrilow AGS, Kelly DE,
Kelly SL 2010. A Clinical Isolate of Candida albicans with Mutations in ERG11
(Encoding Sterol 14 -Demethylase) and ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is
Cross Resistant to Azoles and Amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother
54: (3578-3583).
Martins IMCLB. Avaliação da ação antifúngica de Citrus limon Linn. frente a
leveduras do gênero Candida. João Pessoa, 76p. Dissertação de Mestrado.
Programa de Pós Graduação em Odontologia, Universidade Federal da
Paraíba.
Moreira ACP, Lima EO, Souza EL, Van Dingenen MA, Trajano VN 2007.
Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil
and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Braz J Microbiol 38:
(33-38).
Nascimento AMA, Brandão MGL, Oliveira GB, Fortes ICP, Chartone-Souza E
2007. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus erythropappus oil or β-
114
bisabolene with ampicillin against Staphylococcus aureus. Biomedical and Life
Sciences 92: (95-100).
Nisbet IJ, Moore M 1997. Will natural products remain na important source of
drug research for the future? Curr Opin Biotechnol 8: (708-712).
Playford EG, Webster AC, Sorrell TC, Craig JC 2006. Antifungal agents for
preventing fungal infections in non-neutropenic critically ill and surgical patients:
systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. J Antimicrob
Chemother 57: (628-638).
Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB, Atayde ML, Santurio JM, Alves SH 2008. In
vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against
fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol
54: (950-960).
Puangpronpitag D, Sittiwet C 2009. Antimicrobial properties of Cinnamomum
verum aqueous extract. Asian J Biol Sci 2: (949-953).
Quale JM, Landman D, Zaman M, Bumey S, Sathe SS 1996. In Vitro Activity of
Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive Candida
Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. The American
Journal of Chinese Medicine 24: (103-109).
Rautemaa R, Richardson M, Pfaller M, Koukila-Käkhölä P, Perheentupa J,
Saxén H 2007. Decreased susceptibility of Candida albicans to azole
antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune
115
polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients. J
Antimicrob Chemother 60: (889-892).
Romani l, Bistoni F, Puccetti P 2003. Adaptation of Candida albicans to the host
environment: the role of morphogenesis in virulence and survival in mammalian
hosts. Curr Opin Microbiol 6: (338-343).
Zhai B, Zhou H, Yang I, Zhang J, Jung K, Giam C, Xiang X, Lin X 2010.
Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. J
Antimicrobial Chemother 65: (931-938).
116
Table 1. Micromorphological changes promoted by the products under test on C.
albicans strains (ATCC 40277).
Pseudohyphae Blastoconidia Chlamydoconidia
C.
ze
yla
nic
um
Alo
ne
MIC - + -
MIC x 2 - + -
MIC x 4 - + -
MIC x 8 - + -
Nysta
tin a
lone
MIC - + -
MIC x 2 - + -
MIC x 4 - + -
MIC x 8 - + -
C.
ze
yla
nic
um
+ n
ysta
tin MIC - + -
MIC x 2 - + -
MIC x 4 - + -
MIC x 8 - + -
H2O
-
+
+
+
(+): Presence
(-): Absence
117
Figure 1. Microscopic appearance of C. albicans strain (ATCC 40277): A - growth
control; B - C. activity of C. zeylanicum EO (39 µg/mL) combined with nystatin (32
µg/ml); C - activity of nystatin (64 µg/ml); D - activity of C. zeylanicum EO (312.5
µg/mL).
118
5.5 EFEITO COMBINADO DA AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE C.
zeylanicum Blume E NISTATINA SOBRE CEPAS DE Candida NÃO-
ALBICANS
RESUMO
O propósito deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial
(OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado à nistatina sobre
cepas de Candida não-albicans. Para tanto, foi determinada a concentração
inibitória mínima (CIM), utilizando o método da microdiluição, bem como a
concentração inibitória fracionada (FIC), visando conhecer os possíveis efeitos
sinérgicos da associação. Para realização dos ensaios foram utilizadas cepas
de C. tropicalis ATCC 40042 e C. krusei ATCC 40147. O OE de C. zeylanicum
e nistatina quando avaliados isoladamente apresentaram, respectivamente,
CIM de 312,5 µg/mL e 64 µg/mL sobre ambas as cepas ensaiadas. Quando
associados, foram encontrados CIM de, respectivamente, 39 µg/mL e 32 µg/mL
para o EO e nistatina. O valor do FIC foi de 0,6024 para ambas as cepas
ensaiadas, indicando aditividade do efeito inibitório sobre o crescimento
fúngico. Os resultados indicam que o OE de C. zeylanicum apresenta atividade
antifúngica sobre as cepas de Candida não-albicans avaliadas e que a
associação do mesmo à nistatina promove potencialização desse efeito.
Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum; sinergismo farmacológico;
Candida; Candida tropicalis
119
COMBINED EFFECT OF CInnamomum zeylanicum BLUME ESSENTIAL OIL AND NYSTATIN ON STRAINS OF NON-ALBICANS Candida5
Ricardo Dias Castro, Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences,
Department of Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-
mail: [email protected]
Edeltrudes de Oliveira Lima, Federal University of Paraiba, Center for Health
Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João
Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail: [email protected]
Corresponding to:
Ricardo Dias de Castro
Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba, Brazil.
CEP: 58030-230
Fone.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446
E-mail: [email protected]
5 Artigo submetido ao periódico Journal of Natural Medicines
120
COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL OIL
AND NYSTATIN ON STRAINS OF NON-ALBICANS Candida
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the antifungal activity of essential oil
(EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with Nystatin on
strains of non-albicans Candida. For this, it was determined the Minimum
Inhibitory Concentration (MIC), using the microdilution method, as well as the
Fractional Inhibitory Concentration (FIC) to determine the possible synergistic
effects of the association. Strains of C. tropicalis ATCC 40147 and C. krusei
ATCC 40042 were used in the tests. When assessed separately, C. zeylanicum
EO and Nystatin presented MICs of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively,
on both tested strains. When combined, were found MICs of 39 µg/mL and 32
µg/mL for the EO and for Nystatin, respectively. The FIC value was 0.6024 for
both tested strains, indicating additivity of the inhibitory effect on fungal growth.
The results indicate that C.zeylanicum EO has antifungal activity against the
strains of non-albicans Candida evaluated and that its association with Nystatin
potentiates this effect.
Key-words: Cinnamomum zeylanicum; Drug Synergism; Candida krusei;
Candida tropicalis
INTRODUCTION
Candidiasis is a fungal infection caused by the presence of yeasts of
Candida genus, which is a member of the family Cryptococcaceae. In total,
about 81 species are recognized, especially C. albicans for its virulence and
potential to promote disease. Besides that, other species also contribute to the
development of disease, such as C. tropicalis and C. krusei [1-3].
121
In immunocompromised individuals, especially those affected by HIV /
AISD, about 74% have lesions in the oral mucosa resulting from infections
caused by Candida spp. [4]. It is noteworthy that oral candidiasis in these
subjects can act as a marker of disease progression and as a predictive for
increasing immunosuppression.
Clinically, the disease may arise as mucosal until systemic
manifestations, characterized by the invasion of various organs. The oral,
vaginal and esophageal mucosas are the most affected sites in cases of
candidiasis. Systemic infections, occurring as a result of hematological
dissemination, may cause microabscesses throughout the body. For spreading
C. albicans cells, the vascular endothelium actively participates in the process,
through interaction between receptors present on endothelial cells and adhesins
expressed by yeasts [5,6]
The medication approach to treat candidiasis includes topical and
systemic antifungal agents. The three major classes of antifungal agents
currently used are polyenes (e.g. Nystatin and Amphotericin B), imidazoles
(such as Clotrimazole and Miconazole) and triazoles (e.g. Fluconazole and
Itraconazole) [7].
Whereas oral candidiasis is a superficial infection, usually the initial
treatment is done with a topical agent. Nystatin and Miconazole are the drugs of
initial choice. If topical therapy fails to submit results, systemic treatment is
initiated, and Fluconazole is the most prescribed drug [7].
However, considering the emergence of resistant species of albicans and
non-albicans Candida to agents therapeutically available as a result of the
increased number of immunocompromised population and of the increasingly
frequent use of prophylaxis and empirical treatment with antifungals [8], it’s
verified that there is a clear and emerging need to introduce new antimicrobials
agents in the therapeutic arsenal [9,10].
In this perspective, comes up the possibility to investigate the interactive
effects of conventional antifungal compounds and natural products [11]. This
interaction can promote greater effectiveness of each drug, thus allowing the
use of lower doses of both the substances [12].
122
Thus, considering the known antimicrobial activity of Cinnamomum
zeylanicum Blume essential oil [9, 13-15], the purpose of this study was to
evaluate the antifungal activity of this natural product alone and combined with
Nystatin on strains of C. tropicalis and C. krusei.
MATERIAL AND METHODS
Microrganisms
Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the
Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, which provided
strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147.
Essential Oil
The EO whose antifungal activity is under study was obtained from
Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo, Brazil). Its
physical and chemical parameters were described by the supplier, which
produces and markets essential oils on an industrial scale.
Considering the lipid-solubility of the essential oil, an emulsion was
prepared by adding TWEEN 80 and sterile distilled water, and this mixture was
stirred for five minutes in Vortex apparatus. The essential oil concentration used
in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g/mL).
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
The MIC determination for the essential oil and for Nystatin was
performed by microdilution technique, using 96-well U-bottom microtiter plates
(ALAMAR®). Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose Broth doubly concentrated
were distributed into the plate’s wells. Then, 100 µL of the emulsion of C.
zeylanicum EO and Nystatin were distributed at an initial concentration of 5.000
µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were conducted
serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most concentrated
well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10 µL of inoculum
correspondent to the strains under test were dispensed into the wells of each
column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests were performed
in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48 hours [16].
123
The reading to determine the essential oil MIC on the yeast strains was
made through the visual method. It was taken into consideration the formation
or non-formation of cellular clusters ("button") at the bottoms of the wells. Thus,
MIC was considered as the lowest concentration of the product under test
capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains [16].
In order to confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory
concentrations, 10 µL of TTC dye (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride) were
inserted into the wells after 24 hours of incubation. The detection of
microrganisms viability reflects the activity of dehydrogenase enzymes, which
are involved in the fungal respiration process. It makes possible to distinguish
the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color [17].
Synergism assay – Checkerboard method
Combined effect between Nystatin and C. zeylanicum EO was
determined by the microdilution technique - checkerboard - for derivation of the
Fractional Inhibitory Concentration index (FIC index).
The turbidity of the fungal suspensions of C. tropicalis ATCC 40042 and
C. krusei ATCC 40147 was compared and adjusted to that presented by the
barium sulphate suspension referent to the tube 0.5 of McFarland scale, which
corresponds to an inoculum of approximately 106 Colony Forming Units/mL
(CFU/mL). Solutions of the products tested were used at concentrations
determined from their respective MIC. Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose
culture medium were added into the holes of a 96-well U-bottom microtiter plate
(ALAMAR®). Then, 50 µL of each product tested whose concentrations ranged
among MIC÷4, MIC÷2, MIC, MICx2 and MIC×4 were added in the horizontal
(Nystatin) and vertical (essential oil) directions of the plate. Finally, the culture
medium was inoculated with 10 µL of fungal suspension. Fungal growth was
evidenced through the use of TTC dye. The test was performed in triplicate, and
the microplates were incubated at 37ºC for 48 hours [18,19].
The FIC index was calculated as FICA + FICB, in which A represents the
EO and B is Nystatin. FICA is calculated through the ratio MICA combined /
MICA alone, while FICB = MICB combined / MICB alone. This index was
124
interpreted as follows: synergism (<0.5), additivity (0.5-1.0), indifference (> 1
and <4) or antagonism (> 4.0) [18-20].
RESULTS AND DISCUSSION
The essential oil of C. zeylanicum and Nystatin, when assessed
separately, presented MIC of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively, on both
tested strains, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147, as seen in
Table 1. These findings confirm the data presented by other studies [11, 21-24].
The antifungal activity of C. zeylanicum EO has been attributed to its
major constituents [21].. As regards the chemical composition, studies indicate
that eugenol is the main component of this essential oil [11]. Meades et al [25]
suggest that this activity may be due to the action of trans-cinnamaldehyde.
Once identified the antifungal activity of C. zeylanicum essential oil on
the species of non-albicans Candida under test, it was sought to evaluate
whether this activity would suffer influence when the EO were combined with
Nystatin, a conventional antifungal used for the treatment of mucocutaneous
candidiasis.
Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum
essential oil and Nystatin on strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C.
krusei ATCC 40147.
MIC (µg/mL)
Strains C. zeylanicum Nystatin
C. tropicalis
ATCC 40042
312.5
64
C. krusei
ATCC 40147
312.5
64
As seen in Tables 2 and 3, there was a decrease in MIC values for both
substances. The values found were 39 µg/mL and 32 µg/mL for the EO and
Nystatin, respectively, representing a reduction of 87.52% and 50% from the
125
concentrations initially used. After obtaining these findings, FIC was calculated
and its value was 0.6024 for both strains tested, indicating additivity of the
inhibitory effect on fungal growth.
This is the first study evaluating the antifungal effect of the combination
between C. zeylanicum EO and Nystatin against non-albicans Candida species.
However, the association of other natural products to conventional antibiotics
has been reported by some contemporary authors [26-29], what reflects an
increasing interest for this type of theoretical and methodological approach.
There are several experimental models that measure the effects of drug
combinations. One of the simplest and well known protocols is the
"checkerboard" test, which provides a two-dimensional array of different
concentrations of the substances evaluated and allows the calculation of
Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) [11,12].
Johnson et al. [30] point out some probable mechanisms responsible for
synergistic activity presented by the combination of antifungal agents, as
follows: a) inhibition of different stages in the yeast intracellular biochemical
pathways, essential for cellular survival; b) increased penetration of the
antifungal agent provided by the action of other antifungal in the fungal cell
membrane. This interaction can be observed, for instance, through the
interaction between Amphotericin B or Fluconazole and Rifamycin; c) inhibition
of carrier proteins. For example, Amphotericin B inhibits the action of plasma
membrane proteins that would promote the extrusion of flucytosine, which
remains inside the cell and exerts its effect; d) inhibition of different cellular
targets simultaneously. This effect can be observed in drugs that exert their
effects on the cell wall and another that acts on the plasma membrane.
Given the above, it is recognized as promising the possibility of using
natural products combined with traditional antimicrobials in order to increase the
antimicrobial potential of drugs [31]. These combinations may represent a new
option for elimination of multiresistant fungi and for reducing the exposure of
conventional antifungal agents to these microrganisms, thus reducing the risk of
selecting new or improved mechanisms of resistance [29].
126
Table 2. Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination
between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. tropicalis strain ATCC
40042.
C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL
Nystatin MIC 32 µg/mL
FIC 0,6024 (Additivity)
Table 3. Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination
between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. krusei strain ATCC
40147.
C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL
Nystatin MIC 32 µg/mL
FIC 0,6024 (Additivity)
CONCLUSION
The essential oil of C. zeylanicum alone and combined with Nystatin is able to
promote reduction in the non-albicans Candida cells development capacity.
REFERENCES
1 Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP (2006). Effect of oral
bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol
51:672-680.
127
2. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R (2006). Candida albicans and Candida
dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass and activity.
Br J Biomed Sci 63:5-11.
3. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL (2005). Candida
Biofilms: an Update. Eukaryot Cell 4:633-638.
4. Laskaris G, Hadjivassiliov M, Tratigos J (1992). Oral signs and symptoms in
160 HIV-infected patients. J Oral Path Med 21:120-123.
5. Müller V, Viemann D, Schmidt M, Endres N, Ludwing S, Leverkus M; Roth J,
Goebelers M (2007). Candida albicans Triggers Activation of Distinct Signaling
Pathways to Establish a Proinflammatory Gene Expression Program in Primary
Human Endothelial Cells. J Immun 179:8435-8445.
6. Filler SG, Swerdloff JN, Hobbs C, Luckett PM (1995). Penetration and
Damage of Endothelial Cells by Candida albicans. Infect Immun 63:976–983.
7. Paiva ICA, Ribeiro RA, Pereira JV, Oliveira NMC (2009). Clinical and
laboratorial evaluation of Uncaria tomentosa (Cat’s Claw) gel on oral
candidiasis. Braz J Pharmacogn 19:423-428.
8. Rautemaa R, Richardson M, Pfaller M, Koukila-Käkhölä P, Perheentupa J,
Saxén H (2007). Decreased susceptibility of Candida albicans to azole
antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune
polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients. J
Antimicrob Chemother 60:889-892.
9. Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad AA, Ali SM, Siddiqui M, Khan
AU (2009). Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug
resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules
14:586-597.
10. Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB, Atayde ML, Santurio JM, Alves SH
(2008). In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices
against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J
Microbiol 54:950-960.
128
11. Odds FC (2003). Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts
between them. J Antimicrob Chemother 52:1.
12. Estrella-cuenca M (2004). Combinations of antifungal agents in therapy–
what value are they? J Antimicrob Chemother 54:854-869.
13. Puangpronpitag D, Sittiwet C (2009). Antimicrobial properties of
Cinnamomum verum aqueous extract. Asian J Biological Sci 2:49-53.
14. Atayde ML, Santurio JM, Alves SH, Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB
(2008). In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices
against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J
Microbiol 54:950-956.
15. Bansod S, Rai M (2008). Antifungal activity of essential oils from Indian
medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger.
W J Med Sci 3:81-88.
16. Ellof JN (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the
minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica
64:711-713.
17. Deswal DP, Chand U (1997). Standartization of the tetrazolium test for
viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and
Technology 25:409-17.
18. Dutta NK, Dastidar SG, Kumar A, Mazumdar K, Ray R, Chakrabarty NA
(2004). Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent diclofenac
sodium, and its synergism with streptomycin. Braz J Microbiol 35:316-323.
19. Eliopoulos GM, Moellering RC (1991). Antimicrobial combinations. In: Lorian
V (ed) Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, pp 434-44.
20. Nightingale CH, Ambrose PG, Drusano GI, Murakawa T (2002).
Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. New York
Medical.
21. Schmidt E, Jirovetz l, Wlcek K, Buchbauer G, Gochev V, Girova T,
Stoyanova A, Geissler M (2007). Antifungal activity of eugenol and various
129
eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of Candida
albicans. J Essent Oil Bearing Plants 10:421-429.
22. Gotzsche PC, Johansen HK (2002). Nystatin prophylaxis and treatment in
severely immunodepressed patients. Cochrane Database Syst Rev 4:
CD002033.
23. Patton IL, Bonito AJ, Shugara DA (2001). A systematic review of the
effectiveness of antifungal drugs for the prevention and treatment of
oropharyngeal candidiasis in HIV-positive patients. Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endodontol 92:170-179.
24. Quale JM, Landman D, Zaman M, Bumey S, Sathe SS (1996). In Vitro
Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive
Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. Am J
Chin Med 24:103-109.
25. Meades GJR, Henken RL, Waldrop GL, Rahman MM, Gilman SD,
Kamatou GP, Viljoen AM, Gibbons S (2010). Constituents of Cinnamon Inhibit
Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta Medica 76:1570-1575.
26. Gamarra S, Rocha EMF, Zhang YQ, Park S, Rao R, Perlin DS (2010).
Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in Candida
albicans. Antimicrob Agents Chemother 54:1753-1761.
27. Zhai B, Zhou H, Yang I, Zhang J, Jung K, Giam C, Xiang X, Lin X (2010).
Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. J
Antimicrob Chemother 65:931-938.
28. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP
(2009a). In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. and chlorpromazine
against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian J Med Res
129:566-568.
29. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP
(2009b). Potentiating effect of Mentha arvensis and chlorpromazine in the
130
resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In
Vivo 23:287-289.
30. Johnson MD, Macdougall C, Ostrosky-Zeichner I, l.; perfect, j. R.; rex, j. H.
Combination Antifungal Therapy. J Antimicrob Chemother, v. 48, n. 3, p. 693-
715, 2004.
31. Zago JAA, Ushimaru PI, Barbosa IN, Fernandes Júnior A (2009). Synergism
between essential oils antimicrobial drugs against Staphylococcus aureus and
Escherichia coli strains from human infections. Braz J Pharmacogn 19:828-833.
131
5.6 EFEITO COMBINADO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum
zeylanicum Blume E MICONAZOL SOBRE CEPAS DE Candida.
RESUMO
Considerando a necessidade de introduzir novos agentes terapêuticos para
tratamento de candidíase superficial, este estudo objetivou avaliar o efeito
combinado do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume e
miconazol sobre cepas de Candida. Para tanto, foi determinada a concentração
inibitória mínima (CIM) de ambos os produtos e o índice de concentração
inibitória mínima fracionada (FIC) – checkerboard Test. Quando avaliados
isolados, C. zeylanicum e miconazol apresentaram CIM de, respectivamente,
312,5 µg/mL e 32 µg/mL sobre todas as cepas ensaiaas. Após a associação
dos produtos, foi observado que o OE de C. zeylanicum inibiu o crescimento
das leveduras na concentração de 39 µg/mL. Por outro lado, o miconazol,
quando associado, apresentou CIM de, repectivamente, 128, 32 e 32 µg/mL,
sobre cepas de C. albicans, C. tropicalis e C. krusei. Esses resultados indicam
valores de FIC de, respectivamente, 4,1248 (antagonismo), 1,1248
(indiferença) e 1,1248 (indiferença), para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei.
Assim, verifica-se que associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao
miconazol não constitui em uma possibilidade vantajosa para inibição de
crescimento de Candida spp.
Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, miconazol, sinergismo
farmacológico, Candida spp., Candida albicans
132
5.6 COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL
OIL AND MICONAZOLE ON Candida strains
Ricardo Dias de Castro, Doctorate Student: Bioactive Synthetic and Natural
Products (Pharmacology), Federal University of Paraíba. Assistant Professor,
Department of Clinics and Social Dentistry, Federal University of Paraíba, João
Pessoa, Paraíba, Brazil. [email protected].
Edeltrudes de Oliveira Lima, PhD, Associate Professor, Department of
Pharmaceutical Sciences, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba,
Brazil. [email protected].
Correspondence to:
Ricardo Dias de Castro
Departament of Clinics and Social Dentistry. Center for Health Sciences.
Federal University of Paraíba, Campus I, Cidade Universitária, João Pessoa,
Paraíba. POSTAL CODE: 58059-900.
Phone: 55 (83) 9317-1071
E-mail: [email protected]
133
COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL OIL
AND MICONAZOLE ON Candida strains
ABSTRACT
Considering the need to introduce new therapeutic agents for the treatment of
superficial candidiasis, this study aimed to evaluate the combined effect of
essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume and miconazole on
Candida strains. For this, it was determined the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) of both products and the Fractional Inhibitory
Concentration index (FIC) - Checkerboard Test. When assessed alone, C.
zeylanicum and miconazole showed MIC of 312.5 µg/mL and 32 µg/mL,
respectively, against all strains tested. After combination, it was observed that
the EO inhibited the growth of yeast at a concentration of 39 µg/mL. On the
other hand, when combined, miconazole showed MIC of 128, 32 and 32 µg/mL
against strains of C. albicans, C. tropicalis and C. krusei, respectively. These
results indicate FIC values of 4.1248 (antagonism), 1.1248 (indifference) and
1.1248 (indifference), respectively, for C. albicans, C. tropicalis and C. krusei.
Thus, it’s verified that the combination between the essential oil of C.
zeylanicum and miconazole is not an advantageous possibility for growth
inhibition of Candida spp.
Key-words: Cinnamomum zeylanicum, Miconazole, Drug Synergism, Candida
spp., Candida albicans
INTRODUCTION
C. albicans is an opportunistic pathogen that inhabits the human body as
commensal microrganism and it’s considered the major cause of fungal
infections in humans. Usually, these infections are developed due to C. albicans
virulence, which presents considerable morphological plasticity, and as a result
of changes in immune response (MONGE et al., 2006).
134
The molecular mechanisms involved with such virulence are related to
the activation of MAP (mitogen-activated protein) Kinase signal transduction via,
where cellular responses involved in invasive growth, cell wall formation,
osmotic stress adaptation and reproduction occur through intracellular signaling
pathways as MKc1, Cek1/2 and HOG1 MAP Kinase (MONGE et al., 2006).
The activation of MAPK pathway also provides activation of the
transcription factor Cph1, responsible for the filamentous form, considered
virulence factor for the occurrence of systemic infections, and CLA4,
responsible for the formation of the germ tube and hyphae. The PKA pathway
activation provides the formation of cyclic AMP, which regulates the factor Efg1,
also responsible for the formation of hyphae (LO et al., 1997; PHAN;
BELANGER; FILLER, 2000).
With regard to superficial infections, especially those affecting the
oropharynx, object of interest in this study, it is known that the mucosa of this
region is the most frequent site affected by superficial candidiasis, and
colonization by C. albicans occurs in 10-50% of healthy individuals. The drug
approach to treating this type of candidiasis includes topical and systemic
antifungal agents. Miconazole and nystatin are the drugs of initial choice. If
topical therapy fails to submit results, systemic treatment is initiated, and
fluconazole is the most prescribed drug (PAIVA et al., 2009).
However, currently is considerably increasing the number of occurrences
of Candida species resistance to antifungal agents available (ANDES et al.
2006; BASSO JR et al. 2010; MANOHARLAL et al., 2010, MARTEL et al.,
2010) . Prolonged use of these agents acts as a factor that may contribute to
the development of fungal resistance (FAN-HAVARD et al., 1991). Moreover, it
is evident a growing population of immunocompromised individuals and
increasingly frequent use of prophylaxis and empirical treatment with
antifungals (RAUTEMAA et al., 2007).
Give the above, natural products have been proposed in an attempt to
obtain new drugs, since they differ from synthetic products as regards molecular
diversity, which is much higher in natural products than that derived from
135
synthesis processes, that despite of considerable advances, is still limited. This
provides the development of various new drugs with diverse therapeutic
functions. Within this context, it’s highlighted the recognized antifungal activity
of essential oil of Cinnamomum zeylanicum Blume (LIMA et al. 1993; JANTAM
et al. 2003; BONJAR; AGHIGHI, KARIMI, 2004; MOREIRA, et al., 2007;
ATAYDE et al. 2008; BANSOD, RAI, 2008; KAHN et al. 2008;
PUANGPRONPITAG; SITTIWET, 2009).
As a proposal to introduce new formulations in the therapeutic arsenal
capable of tackling multi-resistant microrganisms and preventing or minimizing
contact of these microrganisms with synthetic products, thus reducing the risk to
select new or improved mechanisms of resistance, some researchers propose
the combination of natural products and conventional antimicrobial agents
(NASCIMENTO et al. 2007; SHAHVERDI et al., 2007; COUTINHO et al. 2009a;
COUTINHO et al. 2009b; COUTINHO et al. 2009c; COUTINHO et al. 2010;
GAMARRA et al., 2010; ZHAI et al., 2010).
In this perspective, this study aimed to evaluate the combined effect
between C. zeylanicum essential oil and miconazole against Candida strains.
MATERIAL AND METHODS
Strains
Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the
Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, which provided
strains of C. albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei
ATCC 40147.
Essential Oil
The EO whose antifungal activity has been under study was obtained
from Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo,
Brazil). Its physical and chemical parameters were described by the supplier,
which produces and markets essential oils on an industrial scale.
Considering the lipid-solubility of the essential oil, an emulsion was
prepared by adding TWEEN 80 and sterile distilled water, and this mixture was
136
stirred for five minutes in Vortex apparatus. The essential oil concentration used
in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g/mL).
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
The MIC determination for the essential oil and for miconazole was
performed by microdilution technique, using 96-well U-bottom microtiter plates
(ALAMAR®). Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose Broth doubly concentrated
were distributed into the plate’s wells. Then, 100 µL of the emulsion of C.
zeylanicum EO and miconazole were distributed at an initial concentration of
5,000 µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were
conducted serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most
concentrated well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10
µL of inoculum correspondent to the strains under test were dispensed into the
wells of each column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests
were performed in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48
hours (ELLOF, 1998).
The reading to determine the essential oil MIC on the yeast strains was
made through the visual method. It was taken into consideration the formation
or non-formation of cellular clusters ("button") at the bottoms of the wells. Thus,
MIC was considered as the lowest concentration of the product under test
capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains (ELLOF,
1998).
In order to confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory
concentrations, 10 µL of TTC dye (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride) were
inserted into the wells after 24 hours of incubation. The detection of
microrganisms viability reflects the activity of dehydrogenase enzymes, which
are involved in the fungal respiration process. It makes possible to distinguish
the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color
(GRABE, 1976; DESWAL; CHAND, 1997).
Synergism assay – Checkerboard method
Combined effect between C. zeylanicum EO and miconazole was
determined by the microdilution technique - checkerboard - for derivation of the
Fractional Inhibitory Concentration index (FIC index).
137
The turbidity of the fungal suspensions was compared and adjusted to
that presented by the barium sulphate suspension referent to the tube 0.5 of
McFarland scale, which corresponds to an inoculum of approximately 106
Colony Forming Units/mL (CFU/mL). Solutions of the products tested were used
at concentrations determined from their respective MIC. Initially, 100 µL of
Sabouraud Dextrose culture medium were added into the holes of a 96-well U-
bottom microtiter plate (ALAMAR®). Then, 50 µL of each product tested whose
concentrations ranged among MIC÷4, MIC÷2, MIC, MICx2 and MIC×4 were
added in the horizontal (miconazole) and vertical (essential oil) directions of the
plate. Finally, the culture medium was inoculated with 10 µL of fungal
suspension. Fungal growth was evidenced through the use of TTC dye. The
test was performed in triplicate, and the microplates were incubated at 37ºC for
48 hours (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991; DUTTA et al., 2004).
The FIC index was calculated as FICA + FICB, in which A represents the
EO and B is miconazole. FICA is calculated through the ratio MICA combined /
MICA alone, while FICB = MICB combined / MICB alone. This index was
interpreted as follows: synergism (<0.5), additivity (0.5-1.0), indifference (> 1
and <4) or antagonism (>4.0) (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991;
NIGHTINGALE et al., 2002; DUTTA et al., 2004).
RESULTS AND DISCUSSION
As seen in Table 1, C. zeylanicum EO and miconazole when assessed
alone presented, respectively, MIC of 312.5 µg/mL and 32 µg/mL on strains of
C. albicans, C. tropicalis and C. krusei. These findings confirm the data
presented by other studies (QUALE et al., 1996; CARDOSO et al. 2001; VAN
ROEV et al., 2004; LIMA et al. 2006; SCHMIDT et al., 2007; POZZATTI et al.
2008).
After combination of the products under test, a change in MIC values was
observed for both substances. Were found values of respectively 39 µg/mL and
128 µg/mL for C. zeylanicum EO and miconazole on C. albicans 40277 strains
(Table 2). These data represent a decrease of 87.52% in the essential oil MIC.
138
However, it was necessary to increase the concentration of miconazole in 400%
to promote growth inhibition of the strains assessed. The FIC value was 4.1248,
indicating antagonism of the effect. It is noteworthy that, even considering
reduction of the concentration of the natural product evaluated, the increase in
miconazole concentration may represent a greater possibility of generating
resistance mechanisms by Candida strains.
Nascimento et al. (2000) point out that the combined use of medicinal
plants and/or their products and byproducts with the concomitant use of
conventional drugs can act by inhibiting, enhancing the therapeutic effects of
drugs or otherwise by interfering with the expected response. Oliveira et al.
(2006) emphasize that such combined use on special occasions may put the
patient at risk, since it can trigger acquisition of resistance by microrganisms or
can initiate mechanisms of irritation or other adverse effects.
On the other hand, with respect to strains of C. tropicalis and C. krusei,
there was a decrease in the EO MIC (39 µg/mL) and maintenance of
miconazole MIC (32 µg/mL). Then, it was observed a FIC value of 1.1248 for
both strains, thereby indicating indifference of the effect produced by the
association, when compared with the products tested alone.
In literature, it was found no study evaluating the antifungal effect of the
combination between C. zeylanicum EO and miconazole against Candida spp.
It’s emphasized that the findings of this study do not preclude the
completion of other studies to investigate the association of other natural
products with conventional agents used in the clinic. According to Cuenca-
Estrella (2004), the combined antifungal compounds can promote greater
effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower doses of each
product. For this author, the checkerboard method and the microbial death
curve are often used in the in vitro evaluation of combined antimicrobials
activity. This information is reinforced by Odds (2003), which reaffirms the
viability of the checkerboard test in the study of interactive effects between
molecules.
139
CONCLUSION
The results observed in this study indicate that the combination between
C. zeylanicum essential oil and miconazole is not an advantageous possibility
for in vitro growth inhibition of Candida spp., since was verified antagonist or
indifferent effect when compared with the potential of these products alone.
Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum
essential oil and miconazole on Candida strains.
MIC (µg/mL)
Strains C. zeylanicum Miconazole
C. albicans ATCC 40277 312.5 32
C. tropicalis ATCC 40042 312.5 32
C. krusei ATCC 40147. 312.5 32
Table 2. Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) and MIC (µg/mL) after
combination between C. zeylanicum essential oil and miconazole against strains of C.
albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147.
C. albicans
ATCC 40277
C. tropicalis
ATCC 40042
C. krusei
ATCC 40146
C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL 39 µg/mL 39 µg/mL
Miconazole MIC 128 µg/mL 32 µg/mL 32 µg/mL
FIC 4.1248 1.1248 1.1248
Effect Antagonism Indifference Indifference
140
REFERENCES
ANDES, D.; FORREST, A.; LEPAK, A.; NETT, K.; MARCHILLO, K.; LINCOLN,
L. Impact of Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug Resistance In
Vivo: Fluconazole and Candida albicans. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 50, n. 7, p. 2374-2383, 2006.
ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H.; POZZATTI, P.; SCHEID, L.
A.; SPADER, T. B. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as
spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp.
Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11, p.950-956, 2008.
BANSOD, S.; RAI, M. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal
plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. World
Journal of Medical Sciences, v. 3, n. 2, p. 81-88, 2008.
BASSO JR, L. R.; GAST, C. E.; MAO, Y.; WONG, B. Fluconazole Transport
into Candida albicans Secretory Vesicles by the Membrane Proteins Cdr1p,
Cdr2p, and Mdr1p. Eukaryotic Cell, v. 9, n. 6, p. 960-970, 2010.
BONJAR, G. H.; AGHIGHI, S.; KARIMI NIK, A. Antibacterial and antifungal
survery in plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of
Iran. Journal of Biological Sciences, v. 4, n. 3, p. 405-412, 2004.
CARDOZO, E. I.; PARDI, G.; PERRONE, M.; SALAZAR, E. Estudio de la
Eficacia del Miconazol Topico (Daktarin® Jalea Oral) en Pacientes con
Estomatitis Sub-Protesica Inducida por Candida. Acta odontolologica
Venezolana, v. 39, n. 3, p. 45-53, 2001.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; FALCÃO-SILVA, V. S.; SIQUEIRA-JÚNIOR,
J. P.; LIMA, E. O. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the resistance to
aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Pharmaceutical Biology. v. 48, n. 9, p. 1002-1006, 2010.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. &
141
chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian
Journal of Medical Research. v. 129, n. 5, p. 566-568, 2009a.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. Potentiating effect of Mentha arvensis and
chlorpromazine in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. In Vivo. v. 23, n. 2,, p. 287-289, 2009 B.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA, J. P. JR. Herbal therapy associated with antibiotic therapy:
potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant Staphylococcus
aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and Alternative
Medicine. v. 8, p. 9-13, 2009b.
CUENCA-ESTRELLA, M. Combinations of antifungal agents in therapy–what
value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n.5, p. 854-
869, 2004.
DESWAL, D. P.; CHAND, U. Standartization of the tetrazolium test for viability
estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and
Technology, v.25, n.1, p.409-17, 1997.
DUTTA, N. K.; DASTIDAR, S. G.; KUMAR, A.; MAZUMDAR, K.; RAY, R.;
CHAKRABARTY, A. N. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent
diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian Journal of
Microbiology, v. 35, n. 1, p. 316-323, 2004.
ELIOPOULOS, G. M.; MOELLERING, R. C. Antimicrobial combinations. In:
LORIAN, V. (ed): Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, MD, p. 434-441,
1991.
ELLOF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal
inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica, v. 64, n. 8,
p. 711-713, 1998.
FAN-HAVARD, P.; CAPANO, D.; SMITH, S. M.; MANGIA, A.; ENGL, R. H. K.
Development of Resistance in Candida Isolates from Patients Receiving
142
Prolonged Antifungal Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.
35, n. 11, p. 2302-2305,1991.
GABRE, D. F. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: AGIPLAN, 1976. 85P.
GAMARRA, S.; ROCHA, E. M. F.; ZHANG, Y. Q.; PARK, S.; RAO, R.; PERLIN,
D. S. Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in
Candida albicans. Antimicrobiolgy Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 5, p.
1753-1761, 2010.
JANTAN, I.; YEOH, E. L.; SURIANI, R.; NOORSIHA, A.; ABU SAID, A. A
comparative study of the constituents of the essential oils of three
Cinnamomum species from Malaysia. Journal of Essential Oil Research, v.
15, p. 387-391, 2003.
KHAN R, ISLAM B, AKRAM M.; SHAKIL, S.; AHMAD, A, A.; ALI, S. M.;
SIDDIQUI, M.; KHAN, A. U. Antimicrobial activity of five herbal extracts against
multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin.
Molecules, v. 14, n. 2, p. 586-597, 2009.
LIMA, E. O.; GOMPERTZ, O. F.; GIESBRECHT, A. M.; PAULO, M. Q. In vitro
antifungal activity of essential oils obtained from officinal plants against
dermatophytes. Mycoses, v. 36, n, 9-10, p. 333-336, 1993.
LIMA, I. O.; OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; FARIAS, N. M. P.; SOUZA, E. L.
Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida. Revista
Brasileira de Farmacognosia. V. 16, n. 2, p. 197-201, 2006.
MANOHARLAL, R.; GORANTALA, J.; SHARMA, M.; DOMINIQUE, S.;
PRASAD, R. PAP1 [poly(A) polymerase 1] homozygosity and hyperadenylation
are major determinants of increased mRNA stability of CDR1 in azole-resistant
clinical isolates of Candida albicans. Microbiology, v. 156, n. 1, p. 313-326,
2010.
MARTEL, C. M; PARKER, J. E.; BADER, O.; WEIG, M.; GROSS, U.;
WARRILOW, A. G. S.; KELLY, D. E.; KELLY, S. L. A Clinical Isolate of Candida
albicans with Mutations in ERG11 (Encoding Sterol 14 -Demethylase) and
ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is Cross Resistant to Azoles and
143
Amphotericin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 9, p.
3578-3583, 2010.
MONGE, R. A.; ROMA’N, E.; NOMBELA, C.; PLA, J. The MAP Kinase signal
transduction network in Candida albicans. Microbiology, v. 152, n. 1, p. 905-
912, 2006.
MOREIRA ACP, LIMA EO, SOUZA EL, VAN DINGENEN, M. A.; TRAJANO, V.
N. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential
Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Brazilian Journal
of Microbiology, v. 38, n. 1, p. 33-38, 2007.
NASCIMENTO, A. M. A.; BRANDÃO, M. G. L.; OLIVEIRA, G. B.; FORTES, I. C.
P.; CHARTONE-SOUZA, E. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus
erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against Staphylococcus
aureus. Biomedical and Life Sciences, v. 92, n. 1, p. 95-100, 2007.
NIGHTINGALE, C. H.; AMBROSE, P. G.; DRUSANO, G. L.; MURAKAWA, T.
Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. 2ª ed.
New York Medical, 2002.
ODDS, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between
them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 52, n. 1, p. 1, 2003.
OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; VIEIRA, W. L.; FREIRE, K. R. L.; TRAJANO,
V. N.; LIMA, I. O.; SOUZA, E. L.; TOLEDO, M. S.; SILVA-FILHO, R. N. Estudo
da interferência de óleos essenciais sobre a atividade de alguns antibióticos
usados na clínica. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 1, p. 77-82,
2006.
PAIVA, L. C. A.; RIBEIRO, R. A.; PEREIRA, J. V.; OLIVEIRA, N. M. C.
Avaliação clínica e laboratorial do gel da Uncaria tomentosa (Unha de Gato)
sobre candidose oral. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2, p.
423-428, 2009.
PHAN, Q. T.; BELANGER, P. H.; FILLER, S. G. Role of hyphal formation in
interactions of Candida albicans with endothelial cells. Infection and Immunity,
v. 68, n. 6, p. 3485-3490, 2000.
144
POZZATTI, P.; SCHEID, L. A.; SPADER, T. B.; ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J.
M.; ALVES, S. H. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as
spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp.
Can J Microbiol. v. 54, n. 11, p. 950-960, 2008.
PUANGPRONPITAG, D.; SITTIWET, C. Antimicrobial properties of
Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological Sciences.
v. 2, n. 2, p. 49-53, 2009.
QUALE, J. M.; LANDMAN, D.; ZAMAN, M.; BUMEY, S.; SATHE, S. S. In Vitro
Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive
Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. The
American Journal of Chinese Medicine, v. 24, n. 2, p. 103-109, 1996.
RAUTEMAA, R.; RICHARDSON, M.; PFALLER, M.; KOUKILA-KÄKHÖLÄ, P.;
PERHEENTUPA, J.; SAXÉN, H. Decreased susceptibility of Candida albicans
to azole antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune
polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients.
Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 60, n., 4, p. 889-892, 2007.
SCHMIDT, E.; JIROVETZ, L.; WLCEK, K.; BUCHBAUER, G.; GOCHEV, V.;
GIROVA, T.; STOYANOVA, A.; GEISSLER, M. Antifungal activity of eugenol
and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of
Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, v. 10, n. 5, p. 421-
429, 2007.
SHAHVERDI A. R.; MONSEF-ESFAHANI, H. R.; TAVASOLI, F.; ZAHERI, A.;
MIRJANI, R. Trans-cinnamaldehyde from Cinnamomum zeylanicum bark
essential oil reduces the clindamycin resistance of Clostridium difficile in vitro.
Journal of Food Science, v. 72, n. 1, p. 55-58, 2007.
VAN ROEY, J.; HAXAIRE, M.; KAMYA, M.; LWANGA, I.; KATABIRA, E.
Comparative efficacy of topical therapy with a slow-release mucoadhesive
buccal tablet containing miconazole nitrate versus systemic therapy with
ketoconazole in HIV-positive patients with oropharyngeal candidiasis. Journal
of Acquired Immune Deficiency Syndromes. v.35, n. 2, p. 144-150, 2004.
145
ZHAI, B.; ZHOU, H.; YANG, L.; ZHANG, J.; JUNG, K.; GIAM, C.; XIANG, X.;
LIN, X. Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal
effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 65, n. 5, p. 931-938, 2010.
146
CONCLUSÕES
147
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:
Os produtos naturais avaliados no screening tem um potencial
antifúngico, destacando-se o resultado apresentado pelo óleo essencial
de Cinnamomum zeylanicum Blume;
C. zeylanicum exibiu ação sobre cepas de C. albicans, C. tropicalis e C.
krusei;
A atividade antifúngica apresentada pelo C. zeylanicum ocorre,
provavelmente, por ação no processo de síntese da parede celular
fúngica;
O eugenol representa o componente fitoquímico majoritário do óleo
essencial de C. zeylanicum;
A associação do óleo essencial de C. zeylanicum e nistatina promoveu
potencialização do efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de C.
albicans;
O óleo essencial de C. zeylanicum isolado e associado à nistatina é
capaz de promover redução na capacidade de desenvolvimento de
estruturas morfológicas das células de C. albicans;
O óleo essencial de C. zeylanicum apresenta atividade antifúngica sobre
as cepas de Candida não-albicans avaliadas e que a associação do
mesmo à nistatina promove potencialização desse efeito;
A associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao miconazol promove
antagonismo (sobre cepas de C. albicans) ou indiferença (sobre cepas
de C. tropicalis e C. krusei) do efeito, quando comparado ao potencial
desses produtos avaliados isoladamente sobre Candida spp.
148
REFERÊNCIAS
149
7 REFERÊNCIAS
ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas
chromatography/mass spectroscopy. Carol Stream, Illinois: Allured
Publishing Corporation, 1995.
AIBINU, I.; ADENIPEKUN, T.; ADELOWOTAN, T.; OGUNSANYA, T.;
ODUGBEMI, T. Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of
Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally. African Journal of
Traditional, v. 4, n. 2, p. 185-195, 2007.
ALBUQUERQUE, U. P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na
descoberta de novos fármacos de interesse médico e farmacêutico:
fragilidades e perspectivas. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16,
p. 678-689, 2006.
ALLEGRINI, J; BOUCHBERG, M.S.; MAILOLS, H. Émulsiond d’huilles
essentielles fabricaton et applications en microbiologie. Society Pharmacy
Montpellier. v. 33, n. 1, p. 73-86, 1973.
ALVES, S. H.; CURY, A. E. Candida from câncer patients: susceptibility in
vitro to polyene antifungal agents. Revista do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo, v. 34, n. 3, p.251-254, 1992.
ANDES, D.; FORREST, A.; LEPAK, A.; NETT, K.; MARCHILLO, K.;
LINCOLN, L. Impact of Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug
Resistance In Vivo: Fluconazole and Candida albicans. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 7, p. 2374-2383, 2006.
ANDRADE, I. P. B. Efeitos do vinagre sobre Candida albicans aderidas in
vitro em resina acrílica termicamente ativada. Ciência Odontológica
Brasileira, v.11, n.1, p.91-98, 2008.
AQUINO, P.L.P.; LIMA, E.O.; FARIAS, M.P.; FREIRE, K.R.L.; SOUZA, E.L.;
CECHINEL FILHO, V.; CORRÊA, R.; ANDRICOPULO, A. Atividade
150
antifúngica de maleimidas contra dermatófitos isolados de Tinea captis.
Revista Brasileira de Análises Clínicas, v, 35, n. 4, p.191-194, 2003.
ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H.; POZZATTI, P.; SCHEID,
L. A.; SPADER, T. B. In vitro activity of essential oils extracted from plants
used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible
Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11, p.950-956,
2008.
AUSTIN, N.; DARLOW, B. A.; MCGUIRE, W. Prophylactic oral/topical non-
absorbed antifungal agents to prevent invasive fungal infection in very low
birth weight infants (Cochrane Review). The Cochrane Library, v. 7, n. 4,
2009.
AZUMA, C. R. S.; CASSANHO, A. C. A.; SILVA, F. C.; ITO, C. Y. K.;
JORGE, A. O. C. Atividade antimicrobiana de soluções de ácido acético de
diferentes tipos e procedências sobre Candida albicans. Revista de Pós-
graduação, v.13, n.2, p.164-167, 2006.
BACHMANN, S. P.; VANDE-WALLE, K.; RAMAGE, G.; PATTERSON, T. F.;
WICKES, B. L.; GRAYBILL, J. R.; LÓPEZ-RIBOT, J. L. In vitro activity of
caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 46, n. 11, p. 3591-3596, 2002.
BADAUY, C. M.; BARBACHAN, J. J.; RADOS, P. V.; SANT’ANA FILHO, M.;
CHIES, J. A. Relationship between Candida infection and immune cellular
response in inflammatory hyperplasia. Oral Microbiology and
Immunology, v. 20, n.2, p. 89-92, 2005.
BANSOD, S.; RAI, M. Antifungal activity of essential oils from Indian
medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A.
niger. World Journal of Medical Sciences, v. 3, n. 2, p. 81-88, 2008.
BASSO, L. R. J.; GAST, C. E.; MAO, Y.; WONG, B. Fluconazole Transport
into Candida albicans Secretory Vesicles by the Membrane Proteins Cdr1p,
Cdr2p, and Mdr1p. Eukaryotic Cell, v. 9, n. 6, p. 960-970, 2010.
151
BATISTA, J. M.; BIRMAN, E. G.; CURY, A. E. Susceptibility to antifungal
drugs of Candida albicans strains isolated from patients with denture
stomatitis Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo, v. 13,
n. 4, p. 343-348, 1999.
BAUER, A. W. M. M.; KIRBY, J. C.; TURCK, M. Antibiotic susceptibility
testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical
Pathology, v. 45, n. 3, p. 493-496, 1966.
BELÉM, L. F. Estudo epidemiológico da pitiriase versicolor e atividade
antifúngica de produtos naturais e sintéticos contra seu agente
etiológico. 2002. Tese de Doutorado. Universidade Federal da Paraíba,
João Pessoa, Paraíba.
BENSADOUN, R. J.; DAOUD, J.; EL GUEDDARI, B.; BASTIT, L.;
GOURMET, R.; ROSIKON, A.; ALLAVENA, C.; CÉRUSE, P.; CALAIS, G.;
ATTALI, P. Comparison of the efficacy and safety of miconazole 50-mg
mucoadhesive buccal tablets with miconazole 500-mg gel in the treatment of
oropharyngeal candidiasis: a prospective, randomized, single-blind,
multicenter, comparative, phase III trial in patients treated with radiotherapy
for head and neck cancer. Cancer, v. 112, n. 1, p. 204-211, 2008.
BERGENDAL, T.; ISACSSON, G. Effect of nystatin in the treatment of
denture stomatitis. Scandinavian Journal of Dental Research, v. 88, n. 5,
p. 446-454, 1980.
BLOMGREN, J.; BERGGREN, U.; JONTELL, M. Fluconazole versus
nystatin in the treatment of oral candidosis. Acta Odontologica
Scandinavica, v. 56, n. 4, p. 202-205, 1998.
BONJAR, G. H.; AGHIGHI, S.; KARIMI NIK, A. Antibacterial and antifungal
survery in plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions
of Iran. Journal of Biological Sciences, v. 4, n. 3, p. 405-412, 2004.
152
BORBA, A. M.; MACEDO, M. Plantas medicinais usadas para a saúde bucal
pela comunidade do bairro Santa Cruz, Chapada dos Guimarães, MT,
Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 20, n. 4, p. 771-782, 2006.
BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos
Estratégicos. Brasília, 2007.
BRASIL. Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006. Aprova a Política
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e dá outras
providências. Diário Oficial da União, Brasília, DF, jun. 2006.
CANNON, R. D.; LAMPING, E.; HOLMES, A. R.; NIIMI, K.; BARET, P. V.;
KENIYA, M. V.; TANABE, K.; NIIMI, M.; GOFFEAU, A.; MONK, B. C. Efflux-
Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Reviews, v.
22, n. 2, p. 291-321, 2009.
CARDOZO, E. I.; PARDI, G.; PERRONE, M.; SALAZAR, E. Estudio de la
Eficacia del Miconazol Topico (Daktarin® Jalea Oral) en Pacientes con
Estomatitis Sub-Protesica Inducida por Candida. Acta odontologica
Venezolana, v. 39, n. 3, p. 45-53, 2001.
CARMO, E. S. Susceptibilidade de fungos do gênero Aspergillus a óleos
essenciais. Dissertação de mestrado 2008. Dissertação de Mestrado.
Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba.
CARVALHO, L. P.; BACELLAR, O.; NEVES, N; A.; CARVALHO, E M.;
JESUS, A. R. Avaliação da resposta imune celular em pacientes com
candidíase recorrente. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, v. 36, n. 5, p. 571-576, 2003.
CASTRO, R. D.; LIMA, E. O. Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial
de Eucalyptus globulus L. sobre Candida spp. Revista de Odontologia da
UNESP, v. 39, n. 3, p. 179-184, 2010.
153
CAVASSANI, V. G. S.; SOBRINHO, J. A.; HOMEM, M. G. N.; RAPOPORT,
A. Candidíase oral como marcador de prognóstico em pacientes portadores
do HIV. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, v. 68, n. 5, p. 630-
634, 2002.
CHAMI, N.; CHAMI, F.; BENNIS, S.; TROUILLAS, J.; REMMAL, A.
Antifungal treatment with carvacrol and eugenol of oral candidiasis in
immunosuppressed rats. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 8, n.
3, p. 217-226, 2004.
CHEN, A.; SOBEL, J. D. Emerging azole antifungal. Expert Opinion on
Emerging Drugs, v. 10, n. 1, p. 21-33, 2005.
COUTINHO, H. D. M. Avaliação da atividade antibacteriana e
fotossensibilizante de produtos naturais da região do cariri cearense.
2008. Tese de Doutorado. Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa,
Paraíba.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; FALCÃO-SILVA, V. S.; SIQUEIRA-
JÚNIOR, J. P.; LIMA, E. O. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the
resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Pharmaceutical Biology, v. 48, n. 9, p. 1002-1006, 2010.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. &
chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian
Journal of Medical Research. v. 129, n. 5, p. 566-568, 2009a.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. Potentiating effect of Mentha arvensis and
chlorpromazine in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. In Vivo. v. 23, n. 2,, p. 287-289, 2009b.
COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;
SIQUEIRA, J. P. JR. Herbal therapy associated with antibiotic therapy:
potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant
154
Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and
Alternative Medicine, v. 8, p. 9-13, 2009c.
COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical
Microbiology Reviews, v. 12, n. 4, p. 564-582, 1999.
CROY, S. R.; KNOWN, G. S. The effects of pluronic block aggregation state
of nystatin. Journal Controlled Release, v. 95, n. 2, p. 161-171, 2004.
CUENCA-ESTRELLA, M. Combinations of antifungal agents in therapy–
what value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n.5,
p. 854-869, 2004.
DESWAL, D. P.; CHAND, U. Standartization of the tetrazolium test for
viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science
and Technology, v.25, n.1, p.409-17, 1997.
DONLAN, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerging
Infectious Diseases, v. 7, n. 2, p. 277-281, 2001.
DORMAN, H. J. D.; DEANS, S. G. Antimicrobial agents from plants:
antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology,
v. 88, n. 22, p. 308-316, 2000.
DUARTE, M. C.; FIQUEIRA, G. M.; SARTORATTO, A.; REHDER, V. L.;
DELARMELINA, C. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants.
Journal of Ethnopharmacology, v. 97, n. 2, p. 305-311, 2005.
DUNKEL, N.; LIU, T. T.; BARKER, K. S.; HOMAYOUNI, R.;
MORSCHHÄUSER, J.; ROGERS, D. A Gain-of-Function Mutation in the
Transcription Factor Upc2p Causes Upregulation of Ergosterol Biosynthesis
Genes and Increased Fluconazole Resistance in a Clinical Candida albicans
Isolate. Eukaryotic Cell, v. 7, n. 7, p. 1180-1190, 2008.
DUTTA, N. K.; DASTIDAR, S. G.; KUMAR, A.; MAZUMDAR, K.; RAY, R.;
CHAKRABARTY, A. N. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory
155
agent diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 35, n. 1, p. 316-323, 2004.
EL-AZIZI, M. A.; STARKS, S. E.; KHARDORI, N. Interactions of Candida
albicans with other Candida spp. and bacteria in the biofilms. Journal of
Applied Microbiology, v. 96, n. 5, p. 1067-1073, 2004.
ELIOPOULOS, G. M.; MOELLERING, R. C. Antimicrobial combinations.
In: LORIAN, V. (ed): Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, MD, p.
434-441, 1991.
ELISABETSKY, E.; SOUZA, G. C. Etnofarmacologia como ferramenta na
busca de substâncias ativas. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;
GOSMAM, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6º Ed. Porto Alegre: Editora
da UFRGS; Florianópolis, 2007.
ELLOF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the
minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta
Medica, v. 64, n. 8, p. 711-713, 1998.
FALEIRO, M. L.; MIGUEL, M. G.; LADEIRO, F.; VENÂNCIO, F.; BRITTO, J.
C.; FIGUEIREDO, A. C.; BARROSO, J. G.; PEDRO, L. G. Antimicrobial
activity of essential oils isolated from Portuguese endemic species of
Thymus. Letters in Applied Microbiology, v. 29, n, 1, p. 130-135, 2003.
FAN-HAVARD, P.; CAPANO, D.; SMITH, S. M.; MANGIA, A.; ENGL, R. H.
K. Development of Resistance in Candida Isolates from Patients Receiving
Prolonged Antifungal Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
v. 35, n. 11, p. 2302-2305,1991.
FARAH, C. S.; ASHMAN, R. B.; CHALLACOMBE, S. J. Oral candidosis.
Clinics in Dermatology, v. 18, n. 5, p. 553-562, 2000.
156
FILLER, S. G.; SWERDLOFF, J. N.; HOBBS, C.; LUCKETT, P. M.
Penetration and Damage of Endothelial Cells by Candida albicans.
Infection and Immunity, v. 63, n. 3, p. 976–983, 1995.
FROST, D. J.; BRANDT, K. D.; CUGIER, D.; GOLDMAN, R. A whole-cell
Candida albicans assay for the detection of inhibitors towards fungal cell
wall synthesis and assembly. Journal of Antibiotics, v. 28, n. 4, p. 306-
309, 1995.
GABRE, D. F. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: AGIPLAN, 1976.
85P.
GAMARRA, S.; ROCHA, E. M. F.; ZHANG, Y. Q.; PARK, S.; RAO, R.;
PERLIN, D. S. Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and
Fluconazole in Candida albicans. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 54, n. 5, p. 1753-1761, 2010.
GAYOSO, C.W.; LIMA, E.O.; OLIVEIRA, V.T.; PEREIRA, F.O.; SOUZA,
E.L.; LIMA, I.O.; NAVARRO, D.F. Sensitivity of fungi isolated from
onychomycosis to Eugenia cariophyllata essential oil and eugenol.
Fitoterapia, v. 76, n, 2, p.247-249, 2005.
GILFILLIAN, D.; SULLIVAN, J.; HAYNES, K.; PARKINSON, T.; COLEMAN,
D. C; GROW, N. A. R. Candida dubliniensis: phylogeny and putative
virulence factors. Microbiology, v. 144, n.4, p. 829-838, 1998.
GILMAN, A. G.; HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E. As Bases
Farmacológicas da Terapêutica. 10 º Ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill
Interamericana do Brasil, 2003, p. 413.
GIORDANI, R.; REGLI P.; KALOUSTIAN, J.; MIKAIL, C.; ABOU, L.;
PORTUGAL, H. Antifungal effect of various essential oils against Candida
albicans. Potentiation of antifungal action of amphotericin B by essential oil
from Thymus vulgaris. Phytotherapy Research, v. 18, n. 12, p. 990-995,
2004.
157
GIORDANI, R.; REGLI, P.; KALOUSTIAN, J.; PORTUGAL, H. Potentiation
of antifungal activity os amphotericin B by essential oil from Cinnamomum
cassia. Phytotherapy Research, v. 20, n. 1, p. 58-61, 2006.
GOTZSCHE, P.C.; JOHANSEN, H. K. Nystatin prophylaxis and treatment in
severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane
Library, v.1, n. 2, 2002.
GUNGI, S.; ARIMA, K.; BEPPU, T. Screening of antifungal according to
inducing morfological abnormalities. Agricultural and Biological
Chemistry. v. 47, n. 9, p. 2061-1069, 1983.
HARBONE, J. B. Ecological biochemistry. 4º Ed. London: Academic,
1993.
HENRIQUES, H.; AZEREDO, J.; OLIVEIRA, R. Candida albicans and
Candida dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass
and activity. British Journal of Biomedical Science, v. 63, n. 1, p. 5-11,
2006.
HENRIQUES, M.; AZEREDO, J.; OLIVEIRA, R. Adhesion of Candida
albicans and Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite.
Biointerfaces, v. 33, n.1, p. 235-241, 2004.
HILI, P.; EVANS, C. S.; VENESS, R. G. Antimicrobial action of essential oils:
the effect of dimethylsulphoxide on the activity of cinnamon oil. Letters in
Applied Microbiology, v. 24, n. 4, p. 269-275, 1997.
HOWELL, S. A.; MALLET, A. I.; NOBLE, W. C. A comparison of the sterol
content of multiple isolates of the Candida albicans Darlington strain with
other clinically azole-sensitive and resistant strains. Journal of Applied
Microbiology, v. 69, v. 5, p. 692-696, 1990.
JANTAN, I. B.; MOHARAM, B. A. K.; SANTHANAM, J.; JAMAL, J. A.
Correlation between chemical composition and antifungal activity of the
158
essential oils of eight Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology, v.
46, n. 6, p. 405-412, 2008.
JANTAN, I.; YEOH, E. L.; SURIANI, R.; NOORSIHA, A.; ABU SAID, A. A
comparative study of the constituents of the essential oils of three
Cinnamomum species from Malaysia. Journal of Essential Oil Research,
v. 15, p. 387-391, 2003.
JOHNSON, M. D.; MACDOUGALL, C.; OSTROSKY-ZEICHNER, L.;
PERFECT, J. R.; REX, J. H. Combination Antifungal Therapy. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy, v. 48, n. 3, p. 693-715, 2004.
KATZUNG, B.G. Farmacologia Básica e Clínica. 9º Ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2006, 668p.
KHAN R, ISLAM B, AKRAM M.; SHAKIL, S.; AHMAD, A, A.; ALI, S. M.;
SIDDIQUI, M.; KHAN, A. U. Antimicrobial activity of five herbal extracts
against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical
origin. Molecules, v. 14, n. 2, p. 586-597, 2009.
KONNING, G. H.; AGYARE, C.; ENNISON, B. Antimicrobial activity of some
medicinal plants of Ghana. Fitoterapia, 75, n. 1, p. 65-67, 2004.
KUHN, D. M.; CHANDRA, J.; MUKHERJEE, P. K.; GHANNOUM, M. A.
Antifungal susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin
B lipid formulations and echinocandins. Antimicrobial and Agents
Chemotherapy, v. 46, n. 6, p. 1773-1780, 2002.
KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The yeats, a taxonomie study. 4ª ed.
Amsterdam: Elsevier Science B. V., 1998.
LAMBERT, R. J.; SKANDAMIS, P. N.; COOTE, P. J.; NYCHAS, G. J. A
study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano
essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, v. 91,
n. 3, p. 453-462, 2001.
159
LASKARIS, G.; HADJIVASSILIOV, M.; STRATIGOS, J. Oral signs and
symptoms in 160 HIV-infected patients. Journal of Oral Pathology and
Medicine, v. 21, n. 3, p. 120-123, 1992.
LESAGE, G.; BUSSEY, H. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 70, n. 2, p.317-343,
2006.
LIMA, E. O.; GOMPERTZ, O. F.; GIESBRECHT, A. M.; PAULO, M. Q. In
vitro antifungal activity of essential oils obtained from officinal plants against
dermatophytes. Mycoses, v. 36, n, 9-10, p. 333-336, 1993.
LIMA, I. O.; OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; FARIAS, N. M. P.; SOUZA, E.
L. Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida.
Revista Brasileira de Farmacognosia. V. 16, n. 2, p. 197-201, 2006.
LÖFFLER, J.; EINSELE, H.; HEBERT, H. Phospholipid and sterol analysis
of plasma membranes of azole-resistant Candida albicans strains. FEMS
Microbiology Letters, v. 185, n. 1, p. 59-63, 2000.
LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e
exóticas. Plantarum, Nova Odessa: São Paulo, 2003.
LORENZO, J. L. Microbiologia para o estudante de odontologia. São
Paulo: Editora Atheneu, 2004.
MACIEL MAM, PINTO AC, VEIGA JR VF. Medicinal plants: The need for
multidisciplinary scientific studies. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438,
2002.
160
MANOHARLAL, R.; GORANTALA, J.; SHARMA, M.; DOMINIQUE, S.;
PRASAD, R. PAP1 [poly(A) polymerase 1] homozygosity and
hyperadenylation are major determinants of increased mRNA stability of
CDR1 in azole-resistant clinical isolates of Candida albicans. Microbiology,
v. 156, n. 1, p. 313-326, 2010.
MARICHAL, P.; KOYMANS, L.; WILLEMSENS, S; BELLENS, D.;
VERHASSELT, P.; LUYTEN, W.; BORGERS, M; RAMAEKERS, F. C. S.;
ODDS, F. C; BOSSCHE, H V. Contribution of mutations in the cytochrome
P450 14α-demethylase (Erg11p, Cyp51p) to azole resistance in Candida
albicans. Microbiology, v. 145, n. 1, p. 2701-2713, 1999.
MARQUES, C. A. Importância econômica da família Lauraceae Lindl.
Floresta e Ambiente, v. 8, n, 1, p. 195-206, 2001.
MARSH, P.; MARTIN, P. Microbiologia oral. São Paulo: Editora Santos, 4º
Edição. 2005.
MARTEL, C. M; PARKER, J. E.; BADER, O.; WEIG, M.; GROSS, U.;
WARRILOW, A. G. S.; KELLY, D. E.; KELLY, S. L. A Clinical Isolate of
Candida albicans with Mutations in ERG11 (Encoding Sterol 14 -
Demethylase) and ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is Cross Resistant to
Azoles and Amphotericin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.
54, n. 9, p. 3578-3583, 2010.
MARTINS, I. M. C. L. B. Avaliação da ação antifúngica de Citrus limon
Linn. frente a leveduras do gênero Candida. 2008. Dissertação de
Mestrado. Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba.
MCLAFFERTY, F. W.; STAUFFER, D. The wiley/NBS registry of mass
spectral data. New York: John Wiley Sons, 1989.
MEADES, G. JR.; HENKEN, R. L.; WALDROP, G. L.; RAHMAN, M. M.;
GILMAN, S. D.; KAMATOU, G. P.; VILJOEN, A. M.; GIBBONS, S.
Constituents of Cinnamon Inhibit Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta
Medica, v. 76, n. 14, p.1570-1575, 2010.
161
MENESES, E. A.; CAVALCANTE, M. S.; FARIAS, R. B.; TEIXEIRA, A. B.;
PINHEIRO, F. G.; BEZERRA, B. P.; TORRES, J. C. N.; CUNHA, F. A.
Frequencia e atividade enzimática de Candida albicans isoladas da mucosa
bucal de crianças de uma creche da prefeitura de Fortaleza. Jornal
Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 4, n. 1, p. 9-13, 2005.
MESQUITA, R. A.; AGUIAR, M. C. F.; TARQUINO, S. B. C.; GOMEZ, R. S.;
BERTAZZOLI, R. Candidíase oral na infecção HIV. Revista do CROMG, v.
4, n. 1, p. 27-31, 1998.
MISHRA, A. K.; MISHRA, A.; KEHRI, H. K.; SHARMA, B.; PANDEY, A. K.
Inhibitory activity of Indian spice plant Cinnamomum zeylanicum extracts
against Alternaria solani and Curvularia lunata, the pathogenic dematiaceous
moulds. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 8, n. 9, p.
1-7, 2009.
MONGE, R. A.; ROMA’N, E.; NOMBELA, C.; PLA, J. The MAP Kinase signal
transduction network in Candida albicans. Microbiology, v. 152, n. 1, p. 905-
912, 2006.
MOREIRA ACP, LIMA EO, SOUZA EL, VAN DINGENEN, M. A.; TRAJANO,
V. N. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae)
essential Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 38, n. 1, p. 33-38, 2007.
MÜLLER, V.; VIEMANN, D.; SCHMIDT, M.; ENDRES, N.; LUDWING, S.;
LEVERKUS, M.; ROTH, J.; GOEBELERS, M. Candida albicans Triggers
Activation of Distinct Signaling Pathways to Establish a Proinflammatory
Gene Expression Program in Primary Human Endothelial Cells. Journal of
Immunology, v. 179, n.1, p. 8435-8445, 2007.
.MUKHERJEE, P. K.; CHANDRA, J. Candida biofilm resistance. Drug
Resistance Update, v. 7, n. 4, p. 301-304, 2004.
NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L.
Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-
162
resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, n. 1, p. 247-
256, 2000.
NASCIMENTO, A. M. A.; BRANDÃO, M. G. L.; OLIVEIRA, G. B.; FORTES,
I. C. P.; CHARTONE-SOUZA, E. Synergistic bactericidal activity of
Eremanthus erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against
Staphylococcus aureus. Biomedical and Life Sciences, v. 92, n. 1, p. 95-
100, 2007.
National Committee For Clinical Laboratory Standard. Método de
referência para testes de diluição em caldo para determinação da
sensibilidade de leveduras à terapia antifúngica: norma aprovada –
M27-A2, 2.ed., v. 23, n.15, 2002.
NESS, J.; SHERMAN, F. T.; PAN, C. X. Alternative medicine: What the data
say about common herbal therapies. Geriatrics, v. 54, n. 10, p. 33-38. 1999.
NIGHTINGALE, C. H.; AMBROSE, P. G.; DRUSANO, G. L.; MURAKAWA,
T. Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. 2ª
ed. New York Medical, 2002.
NISBET, L. J.; MOORE, M. Will natural products remain na important source
of drug research for the future? Current Oppinion in Biotechnology, v. 8,
n. 6, p. 708-712, 1997.
NURYASTUTI, T.; MEI, H. C. V.; BUSSCHER, H. J.; IRAVATI, S.; AMAN, A.
T.; KROM, B. P. Effect of Cinnamon Oil on icaA Expression and Biofilm
Formation by Staphylococcus epidermidis. Applied and Environmental
Microbiology, v. 75, n. 21, p. 6850-6855, 2009.
ODDS, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts
between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 52, n. 1, p. 1,
2003.
OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; VIEIRA, W. L.; FREIRE, K. R. L.;
TRAJANO, V. N.; LIMA, I. O.; SOUZA, E. L.; TOLEDO, M. S.; SILVA-FILHO,
R. N. Estudo da interferência de óleos essenciais sobre a atividade de
163
alguns antibióticos usados na clínica. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 18, n. 1, p. 77-82, 2006.
OLIVEIRA, R. A. G.; OLIVEIRA, K. R. A.; DINIZ, M. F. F M. A fitoterapia no
serviço de saúde pública da Paraíba. Revista de Extensão, v. 2, p. 21-31.
1997.
ONYEAGBA, R. A.; UGBOGU, O. C.; OKEKE, C. U. Studies on the
antimicrobial effects of garlic (Allium sativum Linn), ginger (Zingiber
officinale Roscoe) and lime (Citrus auratifolia Linn). African Journal of
Biotechnology, v. 3, n. 10, p. 552-554, 2004.
OROZCO, A.; S.; ZHOU, X.; FILLER, S. G. Mechanisms of the
Proinflammatory Response of Endothelial Cells to Candida albicans
Infection. Infection and Immunity, v. 68, n. 3, p. 1134-1141, 2000.
PAIVA, L. C. A.; RIBEIRO, R. A.; PEREIRA, J. V.; OLIVEIRA, N. M. C.
Avaliação clínica e laboratorial do gel da Uncaria tomentosa (Unha de Gato)
sobre candidose oral. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2, p.
423-428, 2009.
PALMEIRA-DE-OLIVEIRA, A.; SALGUEIRO, L.; PALMEIRA-DE-OLIVEIRA,
R.; MARTINEZ-DE-OLIVEIRA, J.; PINA-VAZ, C.; QUEIROZ, J. A.;
RODRIGUES, A. G. Anti-Candida activity of essential oils. Mini Reviews in
Medicinal Chemistry, v. 9, n. 11, p. 1292-1305, 2009.
PATTON, L. L.; BONITO, A. J.; SHUGARA, D. A. A systematic review of the
effectiveness of antifungal drugs for the prevention and treatment of
oropharyngeal candidiasis in HIV-positive patients. Oral Medicine, Oral
Pathology, Oral Radiology and Endodontology, v. 92, n. 2, p. 170-179,
2001.
PEREIRA FO. Atividade antifúngica do oleo essencial de Cymbopogon
winterianus Jowitt ex Bor sobre dermatófitos do gênero Trichophyton.
2009. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal da Paraíba, João
Pessoa, Paraíba
164
PHAN, Q. T.; BELANGER, P. H.; FILLER, S. G. Role of hyphal formation in
interactions of Candida albicans with endothelial cells. Infection and
Immunity, v. 68, n. 6, p. 3485-3490, 2000.
PLAYFORD, E. G.; WEBSTER, A. C.; SORRELL, T. C.; CRAIG, J. C.
Antifungal agents for preventing fungal infections in non-neutropenic
critically ill patients (Cochrane Review). The Cochrane Library, v.25, n. 1,
2006.
POZZATTI P. Susceptibilidade de Candida spp. sensíveis e resistentes
ao fluconazol frente a óleos essenciais extraídos de condimentos.
2007. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Santa Maria,
Santa Maria, Rio Grande do Sul.
POZZATTI, P.; SCHEID, L. A.; SPADER, T. B.; ATAYDE, M. L.;
SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H. In vitro activity of essential oils extracted
from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-
susceptible Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11,
p. 950-960, 2008.
PRABUSEENIVASAN, S.; JAYAKUMAR, M.; IGNACIMUTHU, S. In vitro
antibacterial activity of some plant essential oils. BMC Complementary and
Alternative Medicine, v. 6, n. 39, p. 1-8, 2006.
PRASAD, R.; WERGIFOSSE, P.; GOFFEAU, A.;BALZI, E. Molecular
cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1,
conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics,
v. 27, n, 4, p. 320-329, 1995.
PUANGPRONPITAG, D.; SITTIWET, C. Antimicrobial properties of
Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological
Sciences. v. 2, n. 2, p. 49-53, 2009.
QUALE, J. M.; LANDMAN, D.; ZAMAN, M.; BUMEY, S.; SATHE, S. S. In
Vitro Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and
Sensitive Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral
165
Candidiasis. The American Journal of Chinese Medicine, v. 24, n. 2, p.
103-109, 1996.
QUAN, H.; CAO, Y.; XU, Z.; ZHAO, J.; GAO, P. QUIN,, X.; JIANG, Y. Potent
In Vitro Synergism of Fluconazole and Berberine Chloride against Clinical
Isolates of Candida albicans Resistant to Fluconazole. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 3, p. 1096-1099, 2006.
RAMAGE, G.; SAVILLE, S. P.; THOMAS, D. P.; LO’PEZ-RIBOT, J. L.
Candida Biofilms: an Update. Eukaryotic Cell, v. 4, n. 4, p. 633-638, 2005.
RASSOLI, I.; MIRMOSTAFA, S. A. Antibacterial properties of Thimus
pubescens and Thymus serpyllum essential oil. Fitoterapia, v. 73, n.3, p.
244-250, 2002.
RASTOGI, N.; DOMADIA, P.; SHETTY, S.; DASGUPTA, D. Screening of
natural phenolic compounds for potential inhibit bacterial cell division protein
FtsZ. Indian Journal of Experimental Biology, v. 46, n. 11, p. 783-787,
2008.
RAUTEMAA, R.; RICHARDSON, M.; PFALLER, M.; KOUKILA-KÄKHÖLÄ,
P.; PERHEENTUPA, J.; SAXÉN, H. Decreased susceptibility of Candida
albicans to azole antifungals: a complication of long-term treatment in
autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy
(APECED) patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 60, n., 4,
p. 889-892, 2007.
REYNOLDS, J. E. F. Martindale, The Extra Pharmacopoeia. Thirtieth
Edition. Singapore, Info Access & Distribution.1993.
ROMANI, L.; BISTONI, F.; PUCCETTI, P. Adaptation of Candida albicans to
the host environment: the role of morphogenesis in virulence and survival in
mammalian hosts. Current Opinion in Microbiology, v. 6, n. 4, p. 338-343,
2003.
166
SAMAR, N.; TRIPATHI, A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp
essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van
Tieghem. Microbiological Research, v. 163, n. 3, p. 337-344, 2008.
SANGLARD, D.; KUCHLER, K.; ISCHER, F.; PAGANI, J. L.; MONOD,M.;
BILLE, J. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida
albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 39, n. 11, p. 2378-2386,
1995.
SANTOS, E. B.; DANTAS, G. S. ; SANTOS, H. B.; DINIZ, M. F. F. M.;
SAMPAIO, F. C. Estudo etnobotânico de plantas medicinais para problemas
bucais no município de João Pessoa, Brasil. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 19, n. 18, p. 321-324, 2009.
SARTORATTO, A.; MACHADO, A. L. M.; DELARMELINA, C.; FIGUEIRA,
G. M.; DUARTE, M. C. T.; REDHER, V. L. G. Composition and antimicrobial
activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 35, n. 4, p. 275-280, 2004.
SAWYER, P. R.; BROGDEN, R. N.; PINDER, R. M. SPEIGHT, T. M.;
AVERY, G. S Miconazole: a review of its antifungal activity and therapeutic
efficacy. Drugs, v. 9, n.6, p. 406-423, 1975.
SCHMIDT, E.; JIROVETZ, L.; WLCEK, K.; BUCHBAUER, G.; GOCHEV, V.;
GIROVA, T.; STOYANOVA, A.; GEISSLER, M. Antifungal activity of eugenol
and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of
Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, v. 10, n. 5, p.
421-429, 2007.
SENANAYAKE, U. M.; LEE, T. H.; WILLS, R. B. H. Volatile constituents of
cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) oils. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v.26, n. 4 , p. 822-824, 1978.
167
SHAHVERDI A. R.; MONSEF-ESFAHANI, H. R.; TAVASOLI, F.; ZAHERI,
A.; MIRJANI, R. Trans-cinnamaldehyde from Cinnamomum zeylanicum bark
essential oil reduces the clindamycin resistance of Clostridium difficile in
vitro. Journal of Food Science, v. 72, n. 1, p. 55-58, 2007.
SHARMAR, N.; TRIPATHI, A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp
essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van
Tieghem. Microbiology Research, v. 163, n. 3, p. 337-344, 2006.
SHIN, S.; PYUN, M. Anti-Candida effects of estragole in combination with
ketoconaloze or amphotericin B. Phytotherapy Research, v. 18, n. 1, p.
827-830, 2004.
SHIN, S.; KANG, C. A. Antifungal activity of the essential oil of Agastache
rugosa Kuntze and its synergism with ketoconazole. Letters in Applied
Microbiology. v. 36, n. 2, p. 111-115, 2003.
SHIP. J. A; VISSINK, A.; CHALLACOMBE, S. J. Use of prophylactic
antifungal in the immunocompromised host. Oral Surgery, Oral Medicine,
Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology, v. 103, n. 1, p. 6-14,
2007.
SIDRIM, J. J. C.; MOREIRA, J. L. B. Fundamentos clínicos e
laboratoriais da micologia médica. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1999.
SILVA, L.; COUTINHO, A.; FEDOROV, A.; PRIETO, M. Conformation and
self-assembly of nystatin nitrobenzoxadiazole derivative in lipid membranes.
Biochimica et Biophysica Acta, v. 1617, n. 1, p. 69-70, 2003.
SILVA, L.; COUTINHO, A.; FEDOROV, A.; PRIETO, M. Nystatin-induced
lipid vesicles permeabilization is strongly dependent of sterol structure.
Biochimica et Biophysica Acta. V. 1758, n. 4, p. 452-459, 2006.
SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.;
MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao
mediciamento. 6ª ed. Porto Alegre: Editora da UFRGS. 2007. 1102p.
168
SMITH, K. J.; WARNOCK, D. W.; KENNEDY, C. T.; JOHNSON, E. M.;
HOPWOOD, V.; VAN CUTSEM, J.; VANDEN BOSSCHE, H. Azole
resistance in Candida albicans. Journal of Medical and Veterinay
Mycology. v. 24, n. 1, p. 133–144. 1986.
SMITH-PALMER, A.; STEWART, J.; FYFE, L. Antimicrobial properties of
plant essential oils and essences against five important food-bome
pathogens. Letters in Applied Microbiology, v. 26, n. 2, p. 118-122, 1998.
SRINIVASAN, D.; SANGEETHA, N.; SURESH, T.; LAKSHMANA
PERUMALSAMY, P. Antimicrobial activity of certain Indian medicinal plants
used in folkloric medicine. Journal of Ethnopharmacology, v. 74, n. 1, p.
217-220, 2001.
SUKATTA, U.; HARATHAITHANASAN, V.; CHANTARAPANONT, W.;
DILOKKUNANANT, U.; SUPPAKUL, P. Antifungal Activity of Clove and
Cinnamon Oil and Their Synergistic Against Postharvest Decay Fungi of
Grape in vitro. Natural Science, v. 42, n. 5, p. 169-174, 2008.
TAVARES, W. Manual de antibióticos e quimioterápicos
antiinfecciosos. 3º Ed., Rio de Janeiro: Atheneu, 2001, p. 749.
THEIN, Z. M.; SAMARANAYAKE, Y. H.; SAMARANAYAKE, L. P. Effect of
oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives
of Oral Biology, v. 51, p. 672-680, 2006.
VAN ROEY, J.; HAXAIRE, M.; KAMYA, M.; LWANGA, I.; KATABIRA, E.
Comparative efficacy of topical therapy with a slow-release mucoadhesive
buccal tablet containing miconazole nitrate versus systemic therapy with
ketoconazole in HIV-positive patients with oropharyngeal candidiasis.
Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, v.35, n. 2, p. 144-
150, 2004.
VIUDA-MARTOS, M., RUIZ-NAVAJAS, Y., FERNÁNDEZ-LOPÉZ, J.;
PÉREZ-ALVAREZ, J. Antifngal activity of lemon (Citrus lemon L.), mandarin
169
(Citrus reticulata L.), grapefruit (Citrus paradisi L.) and orange (Citrus
sinensis L.) essential oils. Food Control, v. 19, .n.1, p. 1130-1138, 2008.
WANNMACHER, L. Antifúngicos. In: WANNMACHER, L.; FERREIRA, M.
B. C. Farmacologia Clínica para Dentistas.3ª Edição. Guanabara Koogan:
Rio de Janeiro, 2007.
WEBB, B. C.; THOMAS, C. J.; WHITTLE, T. A 2-year study of Candida-
associated denture stomatitis treatment in aged care subjects.
Gerodontology. v. 22, n. 3, p. 168-176, 2005.
WHITE, T. C.; MARR, K. A; BOWDEN, R. A. Clinical, cellular, and molecular
factors that contribute to antifungal drug resistance. Clinical Microbiology
Reviews, v. 11, n. 2, p. 382-402, 1998.
WILSON, C. L.; SOLAR, J. M.; GHAOUTH, A. E. Rapid evaluation of plant
extracts and essential oils for antifungal activity against Bortrytis cinerea.
Plant Disease, v. 81, n. 2, p. 204-210, 1997.
WINGETER, M. A.; GUILHERMETTI, E.; SHINOBU, C. S.; TAKAKI, I.;
SVIDZINSKI, T. I. E. Identificação microbiológica e sensibilidade in vitro de
Candida isoladas da cavidade oral. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, v. 40, n. 3, p. 272-276, 2007.
ZAGO, J. A. A. ; USHIMARU, P. I.; BARBOSA, L.N.; FERNANDES JÚNIOR,
A. Sinergismo entre óleos essenciais e drogas antimicrobianas sobre
linhagens de Staphylococcus aureus e Escherichia coli isoladas de casos
clínicos humanos. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n.4, p 828-
833, 2009.
ZHAI, B.; ZHOU, H.; YANG, L.; ZHANG, J.; JUNG, K.; GIAM, C.; XIANG, X.;
LIN, X. Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent
fungicidal effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 65, n. 5, p.
931-938, 2010.
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