INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
“FARMACOCINÉTICA DE LAS BOROXAZOLIDONAS DE GLICINA, GLUTAMATO Y ASPARTATO Y SU RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD
FARMACOLÓGICA CENTRAL”
T E S I S
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias Quimicobiológicas
PRESENTA M. EN C. ALBERTO GARCÍA GONZÁLEZ
DIRECTORES
DR. EDUARDO RAMÍREZ SAN JUAN DR. GABRIEL MARCELÍN JIMÉNEZ
MÉXICO, D.F., DICIEMBRE DE 2010
1
2
3
4
5
Durante la realización de este proyecto se contó con el apoyo de
CONACYT (Beca escolar con registro No. 94745)
6
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS i RESUMEN ii ABSTRACT iii 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Farmacocinética 1 1.1.1. Absorción de los fármacos 5 1.1.2. Biodisponibilidad 6 1.1.3. Área bajo la curva 7 1.1.4. Concentración máxima 8 1.1.5. Tiempo en el que se alcanza la Cmáx 8 1.1.6. Distribución 8 1.1.7. Volumen de distribución 9 1.1.8. Biotransformación 10 1.1.9. Eliminación 11 1.2. Actividad biológica de compuestos del boro 13 1.2.1. Ácido bórico y sus sales 14 1.2.2. Derivados del ácido bórico 15 1.2.3. Organoboratos 17 1.2.4. Compuestos del boro en oncología 18 1.2.5. Boroxazolidonas 20 2. JUSTIFICACIÓN 22 3. HIPÓTESIS 23 4. OBJETIVOS 24 4.1. Objetivo general 24 4.2. Objetivos particulares 24 5. MATERIALES Y MÉTODOS 25 5.1. Material biológico 25 5.2. Toxicidad aguda DL50 25 5.3. Coordinación motora 27 5.4. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 28 5.4.1. Curvas de calibración y puntos control 29 5.5. Validación 30
7
5.6. Preparación y procesamiento de las muestras en manchas de sangre seca en rata 31 5.7. Farmacocinética 33 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 34 7. RESULTADOS 36 7.1. Toxicidad aguda DL50 36 7.2. Coordinación motora 41 7.3. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 45 7.4. Validación 52 7.5. Farmacocinética 55 8. DISCUSIÓN 60 8.1. Toxicidad aguda DL50 60 8.2. Coordinación motora 62 8.3. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 68 8.4. Validación 81 8.5. Farmacocinética 82 9. CONCLUSIONES 86 10. PERSPECTIVAS 90 11. REFERENCIAS 91 12. ANEXOS 100
8
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura Página
No.
1 Curso temporal de un fármaco después de la administración oral única 2
2 Parámetros farmacocinéticos que se pueden determinar después de una -
administración oral 4
3 Representación esquemática de la biodisponibilidad oral 7
4 Representación macromolecular del citocromo P-450 11
5 Aplicaciones químicas de compuestos organoboranos 13
6 Complejo de cinco miembros de ácido bórico con cis-dioles 14
7 Coordinación del boro en la Boromicina 16
8 Ácido 3-amino-4-carboxifenilbórico 18
9 Ácido para-carboxifenilbórico 19
10 DFBOZA de glicina 20
11 DFBOZA del ácido L-aspártico 21
12 DFBOZA del ácido L-glutámico 21
13 Adiestramiento de ratas en el Rotarod 28
14 Obtención de muestras de sangre a través de un corte en el extremo-
de la cola de la rata y manchas en las tarjetas Whatman 903 de algodón-
extrapuro 32
15 Efecto de la DFBOZA-gly (120 mg/kg sobre la coordinación motora-
en rata 42
9
16 Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg sobre la coordinación motora
en rata 43
17 Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg sobre la coordinación motora
en rata 44
18 Abundancia isotópica obtenida por ESI (+) de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp-
Y DFBOZA-L-glu 48
19 Patrones de fragmentación obtenidos por ESI (+) de DFBOZA-gly, -
DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu 49
20 Curvas de calibración utilizadas para la cuantificación de DFBOZA-gly, -
DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu 51
21 Cromatográmas que muestran canales independientes obtenidos por –
UPLC-MS/MS 54
22 Perfiles farmacocinéticos obtenidos en DBS en ratas Wistar macho, donde-
Se grafica concentración sanguínea contra tiempo, después de una dosis única-
intragástrica 56
23 Gráfica de la valoración iónica de glicina 77
Tabla Página
No.
1 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de glicina 36
2 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de aspártico 38
10
3 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de glutámico 39
4 Clasificación de las sustancias de acuerdo a su toxicidad aguda 40
5 Gradiente de elusión de la fase móvil utilizado en la separación de las-
difenilboroxazolidonas en estudio 45
6 Parámetros utilizados en el espectrómetro de masas por electrospray-
positivo y modo MRM para la cuantificación de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y-
DFBOZA-L-glu en DBS 47
7 Resultados de los parámetros obtenidos durante la validación del método-
analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de-
sangre seca en rata por UPLC-MS/MS 53
8 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la administración
intragástrica de una dosis única de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu-
en ratas Wistar macho 57
11
RESUMEN
Un número cada vez mayor de compuestos que contienen boro presentan una
actividad biológica importante, de especial interés son los derivados de -
aminoácidos borínicos con actividad en el Sistema Nervioso Central. Un método
validado, sensible y específico por cromatografía de ultra alta resolución (UPLC)
acoplado a un detector de espectrometría de masas en tandem se utilizó para la
cuantificación de las difenilboroxazolidonas de glicina (DFBOZA-gly), del ácido L-
aspártico (DFBOZA-L-asp) y del ácido L-glutámico (DFBOZA-L-glu) en manchas de
sangre seca de rata.
Resultados: La señal obtenida más intensa corresponde a los compuestos con 11B.
El procedimiento de extracción fue la elusión liquida de una perforación de 3.2 mm
de manchas de sangre seca (DBS) con acetonitrilo:ácido fórmico 0.1 % acuoso
(80:20 v/v); los métodos ensayados resultaron ser lineales, exactos y precisos en
un rango de 0.3 a 50 µg/mL para DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu, y de 0.1 a 5
µg/mL para DFBOZA-gly. Los picos con un tiempo de corrida de 2.0 minutos
exhiben limpieza cromatográfica, y una relación señal-ruido para el limite de
cuantificación aproximadamente de 15:1. El método se utilizó para evaluar la
farmacocinética de las moléculas y correlacionarlas con la actividad en el Sistema
Nervioso Central.
12
Conclusiones: La técnica de manchas en sangre seca representa una gran ventaja
para la recolección de pequeños volúmenes de muestras, fácil procesamiento y
almacenaje. La detección por UPLC-MS/MS nos permite no sólo identificar el
patrón isotópico del boro en las difenilboroxazolidonas, sino también para
cuantificarlas con precisión y especificidad.
La farmacocinética de estas moléculas presentan un volumen de distribución
aparente alto, esto sugiere la preferencia de las difenilboroxazolidonas de
aminoácidos a los tejidos grasos como el sistema nervioso central.
13
ABSTRACT
A growing number of boron-containing compounds exhibit many important
biological activities; of particular interest are the alpha-aminoacid borinic
derivatives with activity in the Central Nervous System. A validated, sensitive, and
specific Ultra-performance liquid chromatography/Tandem mass spectrometric
technique for quantification of the diphenylboroxazolidones of glycine (DBPX-gly),
L-aspartate (DPBX-L-asp), and L-glutamate (DPBX-L-glu) in dried blood spots of rat
blood.
Results: The most intense signal corresponds to compounds with 11B. The
extraction procedure was liquid elution of 3.2 mm punched DBS with acetonitrile:
aqueous formic acid 0.1% (80:20 v/v); and assays proved to be linear, falling
accurately and precisely within the range of 0.3 - 50 µg/mL for DPBX-L-asp and
DPBX-L-glu, and 0.1 - 5 µg/mL for DBPX-gly. Chromatograms exhibit clean 2.0 min
running time peaks, and signal-to-noise ratios for the low quantification limit were
ca. 15:1. The technique was used to evaluate the pharmacokinetics of the
molecules and to correlate these with activity in the Central Nervous System.
Conclusion: Dried blood spots represent an advantage for the collection of small
volumes of samples, and also in terms of processing and storage. UPLC-MS/MS
allow us not only to identify the isotopic pattern of boron in
diphenylboroxazolidones, but also to quantify them with accuracy and specificity.
14
Pharmacokinetics of these molecules exhibit a high apparent volume of
distribution; it suggests a preference of DPBX-aa for fatty tissues like CNS.
15
1. INTRODUCCIÓN
1.1. FARMACOCINÉTICA
Para que un fármaco llegue al sitio receptor o de acción, a partir del lugar en que
fue depositado, se requiere que éste sea transportado a través del organismo. Las
características de éste transporte a través del organismo, pueden variar según las
propiedades fisicoquímicas del fármaco, de la fisiología de las distintas especies
que lo reciban y dentro de la misma especie, del estado fisiopatológico de dicho
organismo receptor. La evolución temporal de un fármaco en el organismo se
puede esquematizar en cuatro etapas, cuyo desarrollo in vivo es prácticamente
simultáneo: absorción, distribución, biotransformación y excreción (ADBE). Esa
evolución temporal del principio activo in vivo influye o está relacionada con la fase
farmacodinámica a nivel de biofase y por tanto, de la actividad biológica del
fármaco en cuanto a intensidad y duración del efecto. El proceso ADBE forma
parte de una disciplina científica denominada Farmacocinética (FC), la cual estudia
la evolución temporal de concentraciones y cantidades de fármaco y sus
metabolitos en fluidos, tejidos y excretas biológicas, así como la respuesta
farmacológica observada, que puede ser terapéutica o tóxica y construye modelos
matemáticos para interpretar los datos obtenidos (Rowland y Tozer, 1995;
Cárdenas Rodríguez y Cortés Arroyo, 2000).
La FC trata de describir en términos simples los fenómenos complejos que están
involucrados en la respuesta terapéutica (Levy y Bauer, 1986). Para que se
16
produzca una respuesta farmacológica, el fármaco debe alcanzar, en el sitio de
acción, una determinada concentración y mantenerla el tiempo suficiente. Si bien
la concentración alcanzada depende de la cantidad de fármaco administrado,
también depende del grado y la velocidad de su absorción, distribución, unión o
depósitos en los tejidos, biotransformación y excreción (Fig. 1).
Figura 1. Curso temporal de un fármaco después de la administración
oral única.
El hecho de administrar un fármaco en el organismo tiene como objetivo la
obtención de un efecto farmacológico. El efecto de un fármaco se ha asociado a la
concentración plasmática que éste alcance, por lo que se infiere que si hay una
excreción
pH = 5 - 7
heces
pH = 1 - 3
desintegración
desintegración
disolución
disolución
absorción
metabolismo
intestinal
absorción
metabolismo
hepático
efecto farmacológico
vaciamiento gástrico
tránsito intestinal
17
alteración en las concentraciones plasmáticas entonces habrá cambios en la
actividad del fármaco (Erill, 1992).
El estudio de los procesos de absorción, distribución y eliminación de fármacos,
permite estimar el curso del fármaco en el organismo. Para realizar la estimación,
la farmacocinética utiliza diferentes parámetros. Dentro de los parámetros más
relevantes tenemos a la concentración máxima (Cmáx), el tiempo requerido para
alcanzar esta concentración (Tmáx), biodisponibilidad (F), el área bajo la curva
(ABC), el tiempo de vida media (t1/2), el volumen de distribución (Vd) y la
depuración (Cl).
Después de una administración por vía oral los parámetros que se pueden
determinar son la Cmáx, Tmáx, y el ABC mientras que los parámetros restantes se
puede calcular después de una administración intravascular (i.v.) (Cadwallader,
1983) (Fig. 2).
18
Figura 2. Parámetros farmacocinéticos que se pueden determinar
después de una administración oral (modificado de Goodman y Gilman
2007).
El ABC calculada matemáticamente, depende de la cantidad de fármaco absorbido
y nos permite tener una estimación de la biodisponibilidad, la cual es un indicador
del grado y la velocidad con la que un fármaco alcanza la circulación sistémica
(Cadwallader, 1983). Por otro lado, tanto la Cmáx como la Tmáx nos dan una idea
acerca de la velocidad de absorción, así como la posibilidad de alcanzar
concentraciones terapéuticas o tóxicas. Mientras que el t1/2 da una estimación de la
duración del efecto farmacológico y se puede definir como el tiempo que se
requiere para que una concentración dada del fármaco disminuya en un 50 %. El
Vd se refiere al volumen hipotético en el cual se distribuye un fármaco y la Cl se
0
20
40
60
ABC
Tmáx
Cmáx
Cpp
Tiempo
t1/2
Ke
19
refiere a la capacidad que tiene el cuerpo para eliminar un fármaco (Gibaldi y
Perrier, 1975; Rowland y Tozer, 1989).
1.1.1. ABSORCIÓN DE LOS FARMACOS
La absorción consiste en el paso de un fármaco desde su lugar de administración
hasta circulación sistémica para después ejercer sus efectos. Es la verdadera
entrada del principio activo en el organismo. El ritmo y la eficiencia de la absorción
dependen de la vía de administración. En la vía i.v., la absorción es completa; es
decir la dosis total del fármaco alcanza el compartimiento central. Sin embargo, si
la administración se lleva a cabo por vía extravascular, la absorción puede ser
incompleta y por lo tanto sólo una fracción de la dosis administrada llegará a la
sangre.
La absorción puede ser modificada por una gran variedad de factores como por
ejemplo: el nivel de vascularización, el flujo sanguíneo, las propiedades
fisicoquímicas del fármaco, el área de absorción, vaciado gástrico, estado físico del
medicamento, etc., (Goodman y Gilman΄s, 2007; Tietze y Lakshmi, 1994;
Mayersohn, 1987;). Los factores que modifican la absorción de un fármaco pueden
también alterar su biodisponibilidad total y como consecuencia sus efectos
farmacológicos. Para que un fármaco se absorba es necesario que se encuentre en
solución, ya que es la única manera en que puede pasar hacia la sangre.
20
1.1.2. BIODISPONIBILIDAD
Se ha mencionado que la velocidad y la cantidad con que un fármaco llega a la
sangre, influyen en las etapas que conducen al efecto terapéutico. La cantidad
relativa de un fármaco inalterado administrado que alcanza la circulación general,
y la velocidad a la cual esto ocurre, se define como biodisponibilidad. Para
determinar la biodisponibilidad se comparan los niveles plasmáticos de un fármaco
después de haberlo administrado por una determinada vía (p. ej., oral) con los
niveles plasmáticos alcanzados tras su administración i.v., que permite que todo el
fármaco penetre rápidamente en la circulación. Los factores que influyen en la
biodisponibilidad de un fármaco son: metabolismo, solubilidad del fármaco,
inestabilidad química y tipo de formulación del medicamento, entre otros.
Otro aspecto importante relacionado al concepto de biodisponibilidad, es el de
Bioequivalencia: del cual se acepta que “la respuesta de los pacientes a un
medicamento puede ser variable. Esta variabilidad depende de factores tales como
la gravedad de la enfermedad y de la rapidez con que se metaboliza y excreta el
fármaco, así como de otros factores farmacocinéticos. Sin embargo, una fuente de
variación es la biodisponibilidad del fármaco en la forma farmacéutica utilizada, es
decir, la rapidez y la magnitud de su absorción” (Fig. 3).
21
Figura 3. Representación esquemática de la biodisponibilidad oral
(modificado de Rowland y Tozer, 1995).
1.1.3. AREA BAJO LA CURVA
El ABC es proporcional a la cantidad total de fármaco absorbida, esta en relación
con la biodisponibilidad, el ABC desde tiempo cero hasta infinito, representa la
cantidad de fármaco que llega a tejido sanguíneo. Cuando la aplicación del
medicamento es por vía intravenosa periférica (i.v.), el único parámetro
determinante de la biodisponibilidad es por tanto, el ABC, la cual representa un
100 % de biodisponibilidad, ya que se considera que la dosis aplicada, llega de
modo integro e instantáneo a circulación sistémica.
22
1.1.4. CONCENTRACION MÁXIMA
Este es un parámetro determinante de la biodisponibilidad de un fármaco
contenido en un medicamento, aplicado por vía extravascular (e.v.). Desde un
punto de vista cualitativo, este parámetro esta en función de la cantidad y de la
velocidad de absorción del principio activo. La Cmáx esta en función directa de la
cantidad de fármaco absorbida y en función inversa a su volumen aparente de
distribución.
1.1.5. TIEMPO EN EL QUE SE ALCANZA LA Cmáx
Este parámetro de la biodisponibilidad esta en función de: la velocidad de
absorción del principio activo; a mayor velocidad de absorción del fármaco, mas
tempranamente se presentara el denominado Tmáx, es decir, el tiempo en el cual la
concentración plasmática o sanguínea del fármaco fue la máxima. Así también esta
determinado por la velocidad de excreción del fármaco, la relación en este caso es
inversamente proporcional.
1.1.6. DISTRIBUCIÓN
Una vez que el fármaco se ha absorbido, el proceso de distribución es el
responsable del paso de fármacos de un lugar a otro del organismo, pudiendo
depender también de varios factores que limitan su velocidad. El proceso de
distribución es continuo hasta que se establece un equilibrio entre el fármaco libre
y el fármaco unido a proteínas ya sea en el espacio intravascular o extravascular
(Rowland y Tozer, 1989). Dentro de los factores que pueden determinar el patrón
23
de distribución de un fármaco está el flujo sanguíneo, ya que si un órgano recibe
una gran cantidad de flujo sanguíneo la distribución es muy rápida, mientras que
en los órganos que están poco perfundidos la distribución es lenta. Otro de los
factores son las propiedades fisicoquímicas del fármaco para atravesar las
membranas y la unión a proteínas (Gibaldi, 1991), limitando así su distribución a
los diferentes órganos. Se sabe que la distribución de un fármaco puede estar
limitada por la unión del fármaco a las proteínas plasmáticas, en particular a la
albúmina. La unión de los fármacos a las proteínas plasmáticas implica,
consecuencias farmacocinéticas importantes, ya que solamente el fármaco que se
encuentra en su forma libre puede dejar la circulación sanguínea, distribuirse en el
espacio extracelular y ejercer así sus efectos farmacológicos. La forma ligada
permanece en la sangre, no se metaboliza ni se elimina (Wepierre, 1987). Un
fármaco que se encuentra altamente unido a proteínas tiene un acceso restringido
a los sitios de acción y depuración, ya sea hepático o renal, de tal manera que se
puede retardar su metabolismo y consecuentemente su eliminación.
1.1.7. VOLUMEN DE DISTRIBUCIÓN
El volumen de distribución (Vd) es el volumen hipotético de líquido en el que se
dispersa un fármaco. Aunque el Vd carece de bases fisiológicas o físicas, resulta
útil para comparar la distribución de un fármaco con los volúmenes de los
compartimentos del organismo. El Vd es una constante de proporcionalidad que
relaciona la concentración en plasma o sanguínea y su cantidad en el organismo.
El Vd es un dato de la cinética de distribución del fármaco en el organismo, se
24
expresa como la relación entre la dosis de fármaco administrada y la concentración
del mismo medida en el plasma o sangre.
1.1.8. BIOTRANSFORMACIÓN
El metabolismo se refiere a la biotransformación química del fármaco,
generalmente se lleva a cabo hasta en dos fases: la fase I también conocida, como
reacciones no sintéticas, incluyen a las reacciones de oxidación/reducción,
hidrólisis, estas reacciones se llevan a cabo mediante enzimas que se encuentran
en el retículo endoplásmico o en los microsomas. Estas enzimas pertenecen al
grupo de las oxidasas de función mixta o al sistema citocromo P-450 (Fig. 4).
Convirtiendo al fármaco en moléculas más polares al adquirir grupos –OH, -NH2, u
otros (Kim y cols., 1998).
A las reacciones de conjugación o sintéticas también se le conoce como la fase
II, en este tipo de reacción al fármaco se le confiere polaridad con sustratos
endógenos como el ácido glucurónico, ácido acético o aminoácidos, entre otros, sin
embargo, sus metabolitos son mucho menos activos que los fármacos originales y
más polares por lo que se facilita su eliminación. La conjugación tiene lugar tanto
en los microsomas como en el citosol (Kim y cols., 1998).
25
Figura 4. Representación macromolecular del citocromo P-450 (tomada
de Shimada T., 1994).
1.1.9. ELIMINACIÓN
Los fármacos pueden ser eliminados del organismo por múltiples vías. Este
proceso se lleva a cabo por metabolismo y/o por excreción. Diferentes órganos son
26
los encargados de realizar la eliminación, entre los órganos más importantes
tenemos al hígado, el cual es el principal sitio para el metabolismo de la mayoría
de los fármacos (Rowland y Tozer, 1989). Sin embargo, algunos fármacos son
biotransformados por otros órganos como el riñón, el tracto gastrointestinal, los
pulmones, etc. Así, algunos fármacos se excretan en la bilis, otros como las
sustancias volátiles se excretan en la respiración, pero la mayoría se excreta a
través de los riñones. Cabe hacer mención que muy pocos fármacos se eliminan
sin cambio a través del riñón.
Algunos fármacos se extraen en forma deficiente por el hígado, esto significa que
sólo una pequeña cantidad de fármacos se extrae de la sangre en su paso a través
del hígado (Greenblatt, 1992). Por lo que podemos decir que si un fármaco es
eliminado predominantemente por vía renal, cualquier alteración en cuanto a la
capacidad del riñón para eliminar un fármaco, se traducirá en cambios
farmacocinéticos. Algunos factores que pueden influenciar la capacidad de
eliminación del riñón son la edad, la unión a proteínas, el grado de saturación de
los transportadores, interacción del fármaco en el sitio de depuración, el flujo renal
y el pH urinario entre otros. El proceso de eliminación es complejo al igual que
otros procesos como la absorción, la distribución y la biotransformación. Cuando se
presenta una aparente disminución del fármaco del organismo puede ser explicada
a través del parámetro de depuración o aclaramiento (Cl). El aclaramiento
sanguíneo puede ser considerado como el volumen de sangre que se limpia de
fármaco por unidad de tiempo.
27
1.2. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE COMPUESTOS DEL BORO
Compuestos orgánicos que contienen boro se conocen desde hace un siglo, y
muchos aspectos de sus propiedades químicas desde hace ya algún tiempo. Con el
descubrimiento y el desarrollo de la hidroboración, dio como resultado los
compuestos organoboranos que son ampliamente usados como reactivos e
intermediarios en síntesis orgánica (Petasis 2007, Yang 2003).
Como resultado de su reactividad y sus características químicas, los compuestos
organoboranos tienen propiedades básicas que han hecho posible el
descubrimiento y el aumento en el número de reacciones que han sido utilizadas
ampliamente en muchas áreas de síntesis química y aplicaciones farmacéuticas
(Fig. 5).
Figura 5. Aplicaciones químicas de compuestos organoboranos (tomada
de Petasis, 2007).
28
La estructura electrónica del boro y su posición estratégica en la tabla periódica
junto al carbono hace que los compuestos del boro trivalente tengan un
comportamiento como moléculas electrofílicas con una estructura trigonal planar.
Las interacciones estas unidades con especies aniónicas o neutras permite la
rehibridazación de sp2 a sp3, obteniéndose especies de geometría tetraédrica.
Estos compuestos en los que el boro presenta coordinación tetraédrica constituida
por anillos de cinco miembros, son muy estables, ya que estos anillos están libres
de tensión (Cotton y Wilkinson, 1980) (Fig. 6).
Figura 6. Complejos de cinco miembros de ácido bórico con cis-dioles
(modificada de Baran, 1989).
1.2.1. ÁCIDO BÓRICO Y SUS SALES
El ácido bórico se utiliza desde hace más de 200 años en la práctica médica, tanto
para su uso interno (sedante, espasmolítico, diurético) como externo (antiséptico).
En la actualidad, el ácido bórico figura en numerosas Farmacopeas y Recetarios y
su consumo es realmente muy elevado (Petasis, 2007). Aunque ha sido
gradualmente desplazado por preparados terapéuticamente más activos, sigue
desempeñando todavía un papel relativamente importante en especialidades
29
medicinales de diversos tipos, ya sea en forma pura o en forma de algunas de sus
sales, ésteres o complejos.
En este sentido vale pena remarcar que las soluciones “buffer” de borato parecen
tener valiosas propiedades antibactericidas que pueden ser aprovechadas en la
conservación de gotas oftálmicas o nasales (Kliegel, 1980). El borato de
fenilmercurio, junto con el cloruro de benzalconio son considerados como los
mejores conservadores de gotas oftálmicas. También se utiliza ácido bórico o
bórax asociado con sustancias tales como el acetato de fenilmercurio, el
cloramfenicol o el sulfato de neomicina.
El bórax, Na2B4O7.10H2O, es una de las sales simples más comunes derivadas del
ácido bórico, se le utiliza como antiséptico y bactericida suave en inflamaciones e
infecciones de las mucosas. En mezclas con fenol, fenolato, mentol, timol, glicerina
y clorofila, dispensado en forma de atomizador o para aplicaciones tópicas parece
tener una actividad superior a 600.000 U.I. de penicilina (Kliegel, 1980).
1.2.2. DERIVADOS DEL ÁCIDO BÓRICO
Diversas sales del ácido bórico de alcaloides y de numerosas bases nitrogenadas
como el borato de colina se utilizan en desordenes hepáticos y como
antituberculoso, borato de procaína (anestésico local), borato de
hexametilentetramina (antiséptico renal), borato de neomicina (uso oftalmológico),
borato de dodecilguanidinio (fungicida). Los complejos de ácido bórico con ácido
láctico o trietanolamina han sido utilizados como anticonceptivos.
30
Uno de los compuestos más interesantes dentro de este grupo es, sin duda, el
antibiótico “Boromicina” (Hunt, 2003) (Fig. 7). El cual fue aislado de cultivos de
una especie de Streptomyces antibioticus, siendo el primer compuesto natural
conteniendo boro que pudo ser aislado y caracterizado estructuralmente. Su
hidrólisis produce D-valina, ácido bórico y un compuesto macrocíclico
polihidroxilado (Yang y cols., 2003). Vale la pena recordar que también han sido
descritos boratos derivados de diversos antibióticos (eritromicina,
dihidroestreptomicina, clorotetraciclina, etc. (Goldbach y Wimmer, 2007).
Figura 7. Coordinación del boro en Boromicina (tomada de Baran, 1989).
31
1.2.3. ORGANOBORATOS
Estos compuestos contienen, por lo menos, un sustituyente hidrocarbonado sobre
el átomo de boro, en los últimos años han adquirido un interés farmacológico
relevante. Algunos triarilboranos, generalmente estabilizados con ciertas bases de
Lewis (aminas) han demostrado ser potentes fungicidas y germicidas de amplio
espectro (Kliegel, 1980 y Petasis, 2007). La acción fungicida de muchos
organoboranos parece ser una cualidad muy general en ellos.
Otro interesante antiséptico y bactericida resultó ser el ácido fenil-bórico,
especialmente en iones Ag (I) o Cu (II). Este compuesto tiene también
propiedades sedantes y sinergiza notablemente la actividad de hipnóticos tales
como el hidrato de cloral y los barbitúricos, así como también la acción de la
morfina, la codeína y la procaína (Yang y cols., 2003). El éster cíclico del ácido p-
tolilbórico es un tranquilizante muy efectivo. Otro grupo de sustancias relacionadas
estructuralmente con las recién descritas, poseen actividad espasmolítica.
También se han sintetizado y ensayado como posibles sustancias antivirales y
antitumorales algunos derivados de ácidos aril-bóricos con estructura de teofilina.
Finalmente, cabe mencionar que algunos derivados organobóricos han demostrado
poseer propiedades de interés farmacológico, tales como el efecto diurético del
derivado de ácido alquil-bórico y que fue sintetizado siguiendo el esquema
estructural de los diuréticos de la serie de las tiazidas (Yang y cols., 2003), o la
acción anticoagulante del acido 3-amino-4-carboxi-fenilbórico (Fig. 8),
especialmente cuando se maneja en forma de un complejo de glucosa (Cao, 2002).
32
Figura 8. Ácido 3-amino-4-carboxifenilbórico (modificada de Yang y
cols., 2003).
1.2.4. COMPUESTOS DEL BORO EN ONCOLOGIA
El boro natural esta constituido por dos isótopos estables, el 10B (abundancia 20
%) y el 11B (abundancia 80 %). El 10B tiene una sección eficaz de captura
extremadamente elevada (ca. 3840 barn) para absorber neutrones térmicos,
sufriendo la siguiente reacción nuclear:
10B + n 7Li + α (E= 2.4 MeV)
En esta reacción tanto el 10B como los neutrones térmicos son inofensivos para los
tejidos pero su interacción libera una radiación de alta energía (Soloway y cols.,
1961). El tamaño de las dos partículas producidas (7Li + α) limita grandemente el
radio de acción de las mismas, por lo que prácticamente la radiación queda
circunscripta a la región celular en la que se encuentran los núcleos de 10B.
La elevada sección eficaz de captura del 10B para neutrones térmicos, que es casi
4000 veces mayor que la del Nitrógeno y unas 106 veces superior a la del Carbono
y el Oxigeno, hace que las posibles reacciones nucleares de neutrones térmicos
con estos tres átomos, que son siempre abundantes en toda la materia orgánica,
prácticamente carezcan de importancia frente a la captura de los proyectiles por
33
parte del 10B (Soloway y cols., 1998). De esta manera resultaría posible producir
una destrucción selectiva de tejido tumoral siempre que fuera posible enriquecer
esos tejidos en 10B (o simplemente con compuestos de boro).
Se han sintetizado y ensayado compuestos de boro de muy diverso tipo y
características, unas 200 especies preparadas y probadas para este fin. Entre los
compuestos ensayados podemos mencionar, a parte del ácido bórico y de ácidos
aril-bóricos, compuestos poliméricos y aductos diversos, así como sales derivadas
de los boranos (Soloway y cols., 1961).
También se han ensayado entre otros: derivados de aminoácidos, de pirimidinas,
de purinas, conteniendo boro; para alcanzar concentraciones más altas en el tejido
tumoral. Muchos de los sistemas mencionados han sido investigados,
esencialmente, en el tratamiento de tumores cerebrales (Soloway y cols., 1998).
Los dos compuestos más promisorios, al menos para el tratamiento de este tipo de
cáncer fueron la sal sódica del anión B10H102- [decahidro-closo-decaborato (2-)] así
como el ácido p-carboxifenilbórico (Fig. 9).
Figura 9. Ácido para-carboxifenilbórico (tomada de Baran, 1989).
34
1.2.5. BOROZAXOLIDONAS
Las boroxazolidonas son complejos neutros que son sintetizados a partir de la
reacción de un -aminoácido con ácidos borínicos, estos compuestos disminuyen
su polaridad debido a que el -aminoácido aumenta considerablemente su carácter
lipofílico. Esta propiedad se puede utilizar para la purificación de -aminoácidos y
para el paso a través de membranas. La cadena heterocíclica le confiere una alta
liposolubilidad además de una estabilidad a pHs y temperaturas altos.
Por la importancia de la glicina (gly), del ácido L-glutámico (L-glu) y del ácido L-
aspártico (L-asp), como neurotransmisores, se sintetizaron las
difenilboroxazolidonas (DFBOZA) de gly (Fig. 10), L-asp (Fig. 11) y L-glu (Fig. 12).
La síntesis de estos compuestos con potencial actividad como, agonistas o
antagonistas semejantes a la glicina, ácido glutámico y del ácido aspártico capaces
de atravesar la barrera hematoencefálica, es de gran interés debido a los efectos
farmacológicos que producen.
Figura 10. DFBOZA de glicina (tomada de Trujillo, 1999).
35
Figura 11. DFBOZA del ácido L-aspártico (tomada de Trujillo, 1999).
Figura 12. DFBOZA del ácido L-glutámico (tomada de Trujillo, 1999).
36
2. JUSTIFICACIÓN
Las moléculas que contienen enlaces B-N en su estructura, poseen una amplia
actividad biológica: insecticida, fungicida, herbicida, agente antibacterial (Jabbour
y cols; 2004, Dembitsky y cols; 2003, Morin 1994), y antineoplásica (Adams y cols;
1999, Teicher y cols, 1999). Las difenilboroxazolidonas son compuestos
aminoborados utilizados como agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del
cáncer (Soloway y cols; 1998), además han demostrado actividad apoptótica in
vitro (Velasco, B., y cols., 2007) y se ha encontrado que tienen efectos a nivel del
SNC, por lo anterior es importante describir el comportamiento farmacocinético de
estos compuestos en un modelo animal.
37
3. HIPÓTESIS
Si al administrar por vía intragástrica las difenilboroxazolidonas y éstas atraviesan
la barrera hematoencefálica, entonces se espera encontrar una relación entre el
curso temporal de las concentraciones del fármaco en sangre total y la actividad
farmacológica en el SNC.
38
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la farmacocinética de las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu
administradas por vía intragástrica en ratas, estableciendo una relación con la
actividad en SNC.
4.2. OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar la DL50 de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en ratas macho, por vía
intragástrica (i.g.).
Evaluar la coordinación motora en ratas macho utilizando un rodillo giratorio,
después de la administración i.g. de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu.
Desarrollar y validar un método bioanalítico por cromatografía de líquidos de ultra
alta resolución (UPLC) acoplado a un detector de espectrometría de masas en
tandem para la cuantificación de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en sangre de
rata.
Estimar los parámetros farmacocinéticos de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en
ratas macho, después de una administración i.g.
39
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. MATERIAL BIOLÓGICO
En todos los ensayos se utilizaron ratas Wistar macho de 250 a 300 g de peso. Se
siguió la Norma Oficial Mexicana para el cuidado y uso de animales para
laboratorio (NOM-062-ZOO-1999), así como también el protocolo de todas las
normas que exige el comité de bioética internacional y universal.
Los animales se alojaron en un local bajo temperatura regulada de 22 ± 2 oC,
humedad relativa de 50 ± 10 % y ciclos de luz/obscuridad de 12 horas cada uno.
5.2. TOXICIDAD AGUDA DL50
Se determinó la dosis letal50 (DL50) de los diferentes compuestos por el método de
Lorke (1981), en dos etapas.
PRIMERA ETAPA
Los animales se distribuyeron aleatoreamente formando 3 lotes experimentales de
cada compuesto, con 3 animales cada uno:
Log10
Lote 1: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 1000 mg/kg 3
Lote 2: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 100 mg/kg 2
Lote 3: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 10 mg/kg 1
Los compuestos se suspendieron en aceite de oliva comercial extravirgen y se
administraron por vía intragástrica con el uso de una cánula, se privó a los
40
animales de alimento por 12 h (aproximadamente) antes de iniciar el estudio;
después de la administración del compuesto se verificó y cuantificó mortalidad
durante 15 días, así como se observaron posibles cambios fisiológicos y/o
conductuales durante las 6 primeras horas después de la administración de los
compuestos, tales como: sedación, tremor, convulsión, etc.
SEGUNDA ETAPA
Los animales se distribuyeron aleatoreamente formando los siguientes lotes
experimentales de cada compuesto, con 3 animales cada uno, de acuerdo a los
resultados obtenidos en la etapa anterior:
Log10
Lote 1: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 1000 mg/kg 3
Lote 2: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 562.4 mg/kg 2.75
Lote 4: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 316.3 mg/kg 2.5
Lote 5: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 178 mg/kg 2.25
Lote 6: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 100 mg/kg 2
Lote 7: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 10 mg/kg 1
Los compuestos se suspendieron en aceite de oliva comercial extrapuro y se
administró por vía intragástrica con el uso de una cánula, siguiendo el protocolo de
la primera etapa; la DL50 se determino calculando la media geométrica de la Dosis
mínima letal y la Dosis mínima subletal encontrada.
41
5.3. COORDINACIÓN MOTORA
Algunas alteraciones mínimas neurobiológicas como la sedación y los cambios en la
función motora pueden determinarse utilizando la prueba del rodillo giratorio
(Rotarod). Se usó un Rotarod (Ugo Basile, modelo 7750) para ratas, éste aparato
consiste en una plataforma y una barra giratoria de 7 cm. de diámetro. La barra
con una longitud de 50 cm se divide en 4 secciones iguales en las cuales se
evaluaron 4 ratas simultáneamente.
Se utilizaron ratas Wistar macho de 250 a 300 g de peso, éstas se colocaron en la
plataforma y se les adiestro 3 días previos al ensayo (Fig. 13). Se utilizó 1 grupo
experimental aleatorizado (n=10) de acuerdo a la mitad de la DL50 encontrada
para cada boroxazolidona ensayada. La administración fue por vía intragástrica y
se evaluó la actividad a 0 h (pre-dosis), y a las 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0,
6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas después de los diferentes tratamientos. El Rotarod
se aceleró a 16 rpm y se mantuvo por un período de 5 min. Se registró el número
de ocasiones en las cuales los animales fueron derribados de la plataforma.
42
Figura 13. Adiestramiento de ratas en el Rotarod.
5.4. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE LAS DIFENILBOROXAZOLIDONAS EN MANCHAS DE
SANGRE SECA (DBS) EN RATAS POR UPLC MS/MS.
DESARROLLO
Para el desarrollo del método analítico se utilizó un UPLC (AcquityTM, Waters Co.,
Milford MA, USA) acoplado a un espectrómetro de masas/masas (Quattro Premier
XE, Waters Micromass, Manchester, UK).
El método analítico para la cuantificación de las boroxazolidonas se desarrolló
utilizando las correspondientes DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu con
una pureza de 99.1%, éstas se sintetizaron en el Laboratorio de Bioquímica
43
Experimental de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional,
el acetonitrilo y el metanol grado HPLC fueron adquiridos de JT Baker (Xalostoc,
Edo. de México), mientras que el formiato de amonio y el ácido fórmico (99.8 %)
se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). El agua calidad HPLC se
obtuvo a través de un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Las tarjetas de
algodón extrapuro libre de aditivos Whatman 903 fueron donadas gentilmente por
el Laboratorio de Tamiz Neonatal del Hospital General de México.
5.4.1. CURVAS DE CALIBRACIÓN Y PUNTOS CONTROL
Las soluciones madres de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu con
una concentración de (10 mg/mL) se prepararon en forma individual en ácido
fórmico al 0.1 % en metanol (v/v). Las soluciones de trabajo para el intervalo de
calibración fueron preparadas diez veces mas concentradas (3, 100, 200, 300, 400
y 500 µg/mL) en metanol:ácido fórmico 0.1 % en agua HPLC pH=3.9 (80:20 v/v),
además se preparo la solución de trabajo correspondiente al estándar interno
DFBOZA-gly (0.5 µg/mL) en acetonitrilo:ácido fórmico 0.1 % en agua HPLC (80:20
v/v), se mantuvieron en refrigeración a 4 ˚C, y protegidas de la luz blanca.
Curvas de calibración independientes (0.3, 10, 20, 30, 40 y 50 µg/mL) fueron
preparadas por adición de 900 µL de sangre total heparinizada de rata, libre de las
boroxazolidonas y 100 µL de las soluciones de trabajo correspondientes. Los
puntos control de calidad en los niveles bajo, medio y alto (1, 25 y 35 µg/mL
44
respectivamente), fueron preparados de la misma manera para evaluar la
exactitud y precisión de la técnica empleada.
Para la cuantificación de la DFBOZA-gly se prepararon soluciones de trabajo diez
veces más concentradas para el intervalo de calibración (1, 10, 20, 30, 40 y 50
µg/mL) y una solución de DFBOZA-L-asp (2 µg/mL) correspondiente al estándar
interno, se prepararon de forma idéntica a las anteriores. La curva de calibración
(0.1, 1, 2, 3, 4 y 5 µg/mL) y los puntos control de calidad (0.3, 2.5 y 3.5 µg/mL),
fueron preparada como se describió anteriormente en sangre total heparinizada de
rata.
5.5. VALIDACIÓN
El método analítico para la cuantificación de las boroxazolidonas en DBS se
desarrolló y posteriormente se validó cubriendo los parámetros de desempeño
analítico como: linealidad del método (empleando tres curvas de calibración
independientes durante 3 días consecutivos), repetibilidad (6 series de puntos
control de calidad) y reproducibilidad (6 series de puntos control durante 3 días
consecutivos), limite de cuantificación de: DFBOZA-gly (0.1 µg/mL), DFBOZA-L-asp
y DFBOZA-L-glu (0.3 µg/mL para ambas); 5 puntos para cada una de las
boroxazolidonas ensayadas, limite de detección de DFBOZA-gly (0.05 µg/mL),
DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu (0.15 µg/mL para ambas); 3 puntos para cada
boroxazolidona ensayada, y estabilidad de la muestra: sobre la mesa de trabajo,
45
en el automuestreador y a largo plazo (4 series de puntos control para cada
experiencia).
En esta etapa se siguieron los criterios de aceptación establecidos en la guía FDA
“Validación de métodos bioanalíticos”, los cuales son:
1.- Para las curvas de calibración se les realizó una regresión lineal determinando:
coeficiente de correlación (r) > 0.99, coeficiente de determinación (r2) > 0.98,
pendiente (m) ≠ 0 y la ordenada al origen (b).
2.- C. V. (coeficiente de variación) entre pendientes ≤ 15 %.
3.- Limite de cuantificación (primer calibrador): C. V. ≤ 20 % con respecto al valor
nominal y con relación señal/ruido > 10.
4.- A partir del segundo hasta el último calibrador: C. V. ≤ 15 % con respecto al
valor nominal.
5.- Límite de detección: relación señal/ruido > 3.
6.- Puntos Control de Calidad para cubrir los requisitos de precisión y exactitud
establecidos, C. V. ≤ 15 % con respecto al valor nominal.
5.6. PREPARACIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN MANCHAS
DE SANGRE SECA EN RATA
Una alícuota de 40 µL de sangre (una gota para el blanco, curva de calibración y
puntos control de calidad) fue colocada con una pipeta calibrada en la tarjeta
Whatman 903 en lugares independientes, las muestras de concentración
46
desconocida se obtuvieron por un corte longitudinal de la cola de la rata (aprox. 2
mm del extremo de la cola), se colectó la segunda gota extraída en la tarjeta (Fig.
14).
Figura 14. Obtención de muestras de sangre a través de un corte en el
extremo de la cola de la rata y manchas en las tarjetas Whatman 903 de
algodón extrapuro.
Las muestras se secaron en posición horizontal, protegidas de la luz durante al
menos 4 horas a temperatura ambiente. Una vez secas, las tarjetas se cubrieron
47
con una capa de papel y se empaquetaron en bolsas de plástico con cierre de
cremallera y bolsas desecantes, y se almacenaron entre 4 – 6 ˚C hasta su análisis.
Después de que las tarjetas se secaron, una perforación de 3.2 mm (Wallac 1296-
071, DBS Perforadora, Perkin Elmer, USA) fue realizada en el centro de cada
mancha de sangre seca (DBS) y se colocó en un tubo para microcentrífuga de 1.5
mL, se les adicionó 150 µL de la solución del estándar interno; los tubos se
cerraron herméticamente y se colocaron en un baño ultrasónico a 37 ˚C durante
15 minutos. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13,500 rpm durante 5
minutos a 20 ˚C. El sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio y se inyecto 10
µL al sistema UPLC.
5.7. FARMACOCINÉTICA
Los perfiles farmacocinéticos de cada boroxazolidona fueron evaluados en grupos
distintos con 8 ratas Wistar machos con un peso entre 250 g – 300 g. Los animales
se mantuvieron en un local bajo temperatura regulada de 22 ± 2 oC, humedad
relativa de 50 ± 10 % y ciclos de luz/obscuridad de 12 horas cada uno, con libre
acceso al alimento y el agua. Doce horas antes de la administración de las
boroxazolidonas, las ratas se mantuvieron en ayuno. Por la mañana, las
boroxazolidonas se suspendieron en aceite de oliva comercial extrapuro (DFBOZA-
gly, 120 mg/kg para DFBOZA-L-asp, 210 mg/kg y 160 mg/kg para DFBOZA-L-glu)
y se administró con la ayuda de una cánula vía intragástrica, cada rata recibió la
48
mitad de dosis correspondiente a la DL50 para cada boroxazolidona, previamente
determinada por el método de Lorke.
Las ratas fueron inmovilizadas en jaulas individuales de acrílico en cada toma de
muestra, y se les realizó un pequeño corte en el extremo de la cola para la
obtención de sangre capilar. Se colectaron muestras bajo el siguiente esquema
temporal 0 h (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24
horas.
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Parámetros farmacocinéticos
Los parámetros farmacocinéticos se calcularon con una dosis única extravascular,
utilizando un modelo no compartamental en sangre por medio del Software
WinNonlinTM V5.2 (Pharsight Co, Mountain View, CA, USA). Los parámetros
calculados fueron: el área bajo la curva de la concentración sanguínea versus
tiempo, desde el tiempo cero hasta las 24 horas (ABC0-t), área bajo la curva de la
concentración sanguínea versus tiempo, desde el tiempo cero hasta el infinito
(ABC0-∞), la depuración aparente del compuesto en la sangre después de la
administración intragástrica (Clapp), el volumen de distribución aparente (Vdapp), y
tiempo media de residencia (MRT).
La concentración máxima del compuesto en sangre (Cmáx) y el tiempo para
alcanzar dicha concentración después de la administración i.g. (Tmáx) fueron
obtenidos experimentalmente mediante la observación de los perfiles cinéticos de
cada animal.
49
La vida media de eliminación (t1/2) se determinó con una regresión lineal mínimos
cuadrados del logaritmo natural de la parte final del perfil farmacocinético (fase de
eliminación) y con la pendiente negativa de la curva, que es la constante de
eliminación (ke); t1/2 = (ln 2)/ke.
50
7. RESULTADOS
7.1. TOXICIDAD AGUDA
En la tabla 1, 2 y 3 se presentan los resultados obtenidos de los experimentos de
toxicidad aguda de las boroxazolidonas ensayadas; se obtuvo una DL50 para
boroxazolidona de glicina de 240 mg/kg, para la boroxazolidona de aspártico (420
mg/kg) y para la de glutámico de 320 mg/kg respectivamente.
Tabla 1. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de glicina.
No. DE ANIMALES DOSIS (mg/kg) MUERTOS VIVOS
3 1000 3 0
3 562.3 3 0
3 316.3 3 0
3 178 0 3
3 100 0 3
Cálculo de la media geométrica (DL50)
Dosis mínima letal = 316.3 mg/kg
Dosis mínima subletal = 178 mg/kg
DL50 = (316.3 mg/kg x 178 mg/kg) 1/2
51
La DL50 obtenida fue de 237.2 mg/kg, sin embargo para una mejor dosificación de
los animales se emplearon números enteros (por ejemplo: 240 mg/kg) de las dosis
letales obtenidas para cada DFBOZA.
Los signos que se observaron en las ratas, posterior a la administración de la
DFBOZA-gly fueron los siguientes: a dosis de 1000 mg/kg y 562.3 mg/kg después
de 60 minutos se manifestó la presencia de chasquidos, piloerección, cola de
Straub, movimientos involuntarios, aumento de la actividad motora, espasmos,
sacudida de perro mojado y temblor. El período entre la administración de la
DFBOZA-gly y muerte fue de 2 a 4 h, en este periodo se observaron convulsiones
de tipo tónico-clónicas. También se observó y cuantificó mortalidad hasta las 72
horas después de la administración del compuesto. En las dosis ensayadas de
316.3, 178 y 100 mg/kg se observaron: movimientos involuntarios, chasquidos,
sacudidas de perro mojado, piloerección y cola de Straub; no se presentó
convulsiones en el periodo observado.
Para la DFBOZA-L-asp (tabla 2) a dosis de 1000 mg/kg y 562.3 mg/kg se observó
piloerección, temblor y convulsiones. El temblor y las convulsiones tónico-clónicas
se presentaron con un tiempo de latencia de 4 a 6 h después de la administración
del compuesto. Cuantificándose mortalidad hasta las 48 horas después del
tratamiento (tabla 2). En las siguientes dosis evaluadas no se observó ningún
signo aparente por la administración del compuesto.
52
Tabla 2. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de aspártico.
No. DE ANIMALES DOSIS (mg/kg) MUERTOS VIVOS
3 1000 3 0
3 562.3 3 0
3 316.3 0 3
3 178 0 3
3 100 0 3
Cálculo de la media geométrica (DL50)
Dosis mínima letal = 562.3 mg/kg
Dosis mínima subletal = 316.3 mg/kg
DL50 = (562.3 mg/kg x 316.3 mg/kg) 1/2
DL50 = 420 mg/kg
Así mismo en la administración de la DFBOZA-L-glu (tabla 3), se miró piloerección,
movimientos involuntarios, espasmos, sacudida de perro mojado, temblor y
convulsiones tónico-clónicas, evidenciando mortalidad hasta las 72 horas después
53
de la administración del compuesto. En las dosis restantes ensayadas no se
manifestó alguna alteración, ni convulsiones.
Tabla 3. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de glutámico.
No. DE ANIMALES DOSIS (mg/kg) MUERTOS VIVOS
3 1000 3 0
3 562.3 3 0
3 316.3 2 3
3 178 0 3
3 100 0 3
Cálculo de la media geométrica (DL50)
Dosis mínima letal = 562.3 mg/kg
Dosis subletal = 316.3 mg/kg
Dosis mínima subletal = 178 mg/kg
DL50 = (562.3 mg/kg x 316.3 mg/kg x 178 mg/kg) 1/3
DL50 = 320 mg/kg
54
El valor de las dosis obtenidas de las difenilboroxazolidonas evalúa a las sustancias
como moderamente tóxicas (Lorke, 1983); mirar tabla 4.
Tabla 4. Clasificación de las sustancias de acuerdo a su toxicidad aguda
(Lorke, 1983).
CLASE DL50 (mg/kg)
Extremadamente tóxica 10
Tóxica 10 - 100
Moderamente tóxica 100 - 1000
Ligeramente tóxica 1000
55
7.2. COORDINACIÓN MOTORA El efecto de la DFBOZA de glicina se manifestó después de su administración i.g. a
dosis de 120 mg/kg sobre la coordinación motora en ratas, a las cuales se les
contabilizó el número de caídas del rodillo giratorio que presentaron en los
diferentes tiempos experimentados (figura 15). La alteración de la coordinación
motora en los animales es clara de las 1.5 a las 12 horas; el tiempo en el cual se
presentó el mayor número de caídas fue a las 2.0 horas (14 ocasiones en las que
el animal perdió el control motor en la plataforma giratoria) comparado con los
otros tiempos experimentales.
Se encontró una diferencia estadísticamente significativa (p 0.05) en el número de
caídas de las ratas del rodillo giratorio a las 2.0, 3.0, y 4.0 con respecto al resto de
los tiempos ensayados [0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24
horas].
Durante la evaluación temporal del efecto de la administración i.g. de la DFBOZA-
gly en el número de caídas de la plataforma giratoria de los animales, podemos
apreciar que durante el periodo comprendido de las 6 hasta las 12 horas los
animales siguieron manifestando anomalías en la coordinación motora
derribándose entre 7 y 11 ocasiones del rodillo giratorio.
56
Tiem po (h)
0 5 10 15 20 25
N o
. d
e c
aíd
as
0
2
4
6
8
10
12
14
16
aa
a
a
a
a
a
a
a
b
b
c
Figura 15. Efecto de la DFBOZA-gly (120 mg/kg) sobre la coordinación
motora en rata a los tiempos: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0,
4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas. Letras diferentes indican diferencia
estadísticamente significativa con una P<0.05 (prueba de Friedman, S-
N-K).
Las ratas tratadas con DFBOZA-L-asp después de una unidosis (210 mg/kg)
administrada por vía i.g., presentaron una notable deficiencia en la coordinación
motora a partir de las 4 a las 10 horas del intervalo de tiempo evaluado en el
rodillo giratorio (figura 16). La mayor incidencia en el número de caídas (entre 5 y
11 ocasiones) de los animales del rodillo giratorio se observó entre las 6 y 8 h del
periodo experimentado, con una diferencia significativa (P 0.05). Así mismo los
resultados muestran diferencias estadísticamente significativas (P 0.05) a las 4 y
57
10 h en el número de caídas, comparado con el resto de la evaluación temporal de
los animales en el rodillo giratorio.
Tiem po (h)
0 5 10 15 20 25
No
. d
e c
aíd
as
0
2
4
6
8
10
12
a
a
de
aa
a
a
c
b
Figura 16. Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) sobre la coordinación
motora en rata a los tiempos: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0,
4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas. Letras diferentes indican diferencia
estadísticamente significativa con una P<0.05 (prueba de Friedman, S-
N-K).
En la figura 17, se muestra el efecto de la DFBOZA-L-glu sobre la actividad motora
en ratas evaluada con el ensayo de rodillo giratorio. En los animales tratados con
una dosis única vía i.g. de DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) se apreció una anómala
coordinación motora, interpretada por el número de caídas percibidas de los
animales experimentados. Las caídas de los animales se acentuaron de las 1.5 a
las 6 horas después de la administración del compuesto. Es evidente el trastorno
58
en la actividad motora de los animales a las 3 h llegando hasta 12 ocasiones en las
cuales las ratas fueron derribadas del rodillo. Diferencias estadísticamente
significativas fueron encontradas a las 2.0, 3.0 y 4.0 horas (P 0.05,
respectivamente) con respecto a los tiempos en estudio: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5,
1.0, 1.5, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas, donde no se encontró diferencia
significativa en el número de caídas de la plataforma giratoria de los animales
ensayados.
Tiem po (h)
0 5 10 15 20 25
No
. d
e c
aíd
as
0
2
4
6
8
10
12
14
a
aa
a
a
a
b
c
a
b
Figura 17. Efecto de la DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) sobre la coordinación
motora en rata a los tiempos: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0,
4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas. Letras diferentes indican diferencia
estadísticamente significativa con una P<0.05 (prueba de Friedman, S-
N-K).
59
7.3. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE LAS DIFENILBOROXAZOLIDONAS EN MANCHAS DE
SANGRE SECA (DBS) EN RATAS POR UPLC MS/MS.
El desarrollo del método analítico se realizó utilizando un UPLC acoplado a un
espectrómetro de masas/masas. Los resultados cromatográficos óptimos que se
obtuvieron durante el desarrollo del método fueron los siguientes:
1.- Columna BEH Fenilo (100 x 2.1 mm de longitud y 1.7 µm de tamaño de
partícula, Acquity UPLC, Waters, Irlanda).
2.- Flujo cromatográfico constante de 0.25 mL/min.
3.- La composición requerida de la fase móvil se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 5. Gradiente de elusión de la fase móvil utilizado en la separación
de las difenilboroxazolidonas en estudio.
Tiempo
(min)
Flujo
(mL/min)
% de A % de B Curva
Inicial 0.25 50 50 Inicial
1.0 0.25 100 0 7
1.5 0.25 50 50 11
2.0 0.25 50 50 7
Donde: A es acetonitrilo 100 % y B es formiato de amonio 2 mM a pH=3.3.
60
4.- La temperatura del automuestreador fue de 15 ˚C.
5.- La temperatura de la columna cromatográfica fue de 40 ˚C.
Con las condiciones antes descritas los tiempos de retención para la DFBOZA-gly,
DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu fueron: 1.36, 1.24 y 1.30 minutos,
respectivamente.
La optimización de los parámetros del detector de espectrometría de masas (tabla
6) se relizó por ionización en electrospray modo positivo ESI (+), utilizando una
solución de una concentración de 1,000 ng/mL para cada una de las
boroxazolidonas en estudio, las cuales se prepararon en metanol:ácido fórmico 0.1
% en agua HPLC pH=3.9 (80:20 v/v), los compuestos se determinaron por el
modo de adquisición MRM (monitoreo de múltiples reacciones), empleando las
siguientes transiciones iónicas; m/z1+ 240.15 >162.00 Th para DFBOZA-gly; m/z1+
298.20 >160.00 Th para DFBOZA-L-asp, y m/z1+ 312.20 >163.00 Th para
DFBOZA-L-glu.
61
Tabla 6. Parámetros utilizados en el espectrómetro de masas por
electrospray positivo y modo MRM para la cuantificación de: DFBOZA-
gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu en DBS.
Parámetros ESI (+) Valores Analizador Valores
Energía del capilar 3.0 kV L y H MR 1 14.0
Energía de cono 25.0 V Energía del ión 1 0.2
Energía del extractor 3.0 V Entrada 2.0
Radio frecuencia 0.1 V Colisión 8 gly/ 10 asp/ 50 glu
Temperatura de la fuente 120 °C Salida 2.0
Temperatura de desolvatación 400 °C L y H MR 2 13.5
Flujo de gas del cono 50 L/h Energía del ión 2 0.7
Flujo de gas de desolvatación 900 L/h Fotomultiplicador 650
Presión del gas de colisión 10 psi Argón Dwell 0.2 segundos
Donde:
L y H MR: resolución de masas altas y bajas respectivamente
La energía de colisión es expresada en electrón-volts
gly:DFBOZA-gly; asp:DFBOZA-L-asp; glu:DFBOZA-L-glu.
La figura 18, muestra la ionización del ión molecular para las tres
difenilboroxazolidonas evaluadas, así como su abundancia isotópica donde
podemos observar que los compuestos más abundantes corresponden al 11B,
aunque también se nota la abundancia isotópica del 10B (aproximadamente 20 %).
62
Figura 18. Abundancia isotópica obtenida por ESI (+) de: A) DFBOZA-gly,
B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu.
63
La fragmentación de las tres moléculas y el modo de adquisición MRM aumentaron la sensibilidad y la selectividad del
método analítico, aunque las boroxazolidonas evaluadas no son endógenas. Los fragmentos utilizados para la
cuantificación de las difenilboroxazolidonas se muestran en la figura 19, los cuales fueron los más estables y abundantes
comparada con la ionización química a presión atmosférica (APCI), datos no mostrados.
Figura 19. Patrones de fragmentación obtenidos por ESI (+) de: A) DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C)
DFBOZA-L-glu.
64
La cuantificación se realizó utilizando una curva de calibración de 6 puntos, por
medio de una ecuación lineal de concentraciones de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y
DFBOZA-L-glu versus la relación de áreas de DFBOZA-gly/DFBOZA-L-asp, DFBOZA-
L-asp/DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu/DFBOZA-gly, por la concentración del estándar
interno empleado respectivamente, utilizando un modelo ponderado 1/x (figura
20).
A)
65
B)
C)
Figura 20. Curvas de calibración utilizadas para la cuantificación de: A)
DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu en DBS en rata,
formato de salida de datos transformados del espectrómetro de masas.
66
7.4. VALIDACIÓN
Los resultados de la validación se muestran en la tabla 7, donde se observa que el
método analítico resultó ser lineal, preciso y exacto en cada nivel de
concentración. La estabilidad de las muestras se demostró desde el momento del
muestreo hasta su cuantificación, siendo estable durante 5 horas en la mesa de
trabajo, hasta 8 horas en el automuestreador y al menos 6 días entre 4 – 6 ˚C.
Durante el proceso de validación y toma de muestras se observó que las tres
DFBOZA evaluadas fueron inestables a la exposición a la luz blanca, por lo que el
muestreo y extracción de las muestras se realizo bajo luz roja. En la evaluación del
ensayo de acarreo se demostró que no hubo contaminación en la perforación e
inyección de las muestras blancos (blancos de reactivos, blancos de sangre y
muestras pre-dosis) después de la perforación e inyección de muestras con
concentraciones altas, correspondientes a puntos control de calidad altos o
concentraciones máximas obtenidas durante la farmacocinética de las
difenilboroxazolidonas en rata (figura 21). Todos los parámetros evaluados durante
la validación del método analítico para la cuantificación de las
difenilboroxazolidonas cumplen con los criterios de aceptación previamente
establecidos.
67
Tabla 7. Resultados de los parámetros obtenidos durante la validación
del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas
en manchas de sangre seca en rata por UPLC-MS/MS.
Los valores son presentados en porcentaje de recobro (% C.V.) para los puntos
controles de calidad con niveles: bajo, medio y alto.
Parámetros de la
validación DFBOZA-gly DFBOZA -L-asp DFBOZA -L-glu
Linealidad
y=a+bx
(0.1 – 5 g/mL)
y= 0.004+0.0895*x
r=0.9998
(0.3 – 50 g/mL)
y= 0.0007+0.0042*x
r=0.9993
(0.3 – 50 g/mL)
y= 0.003+0.0022*x
r=0.9985
Reproducibilidad
(3 días)
exactitud/precisión
Recobro (%C.V.)
n=18
95.75 (5.20)
95.05 (3.03)
91.78 (2.72)
97.36 (12.06)
99.55 (7.77)
103.57 (5.66)
99.17 (6.39)
99.02 (4.95)
99.63 (4.42)
Repetibilidad
exactitud/precisión
n= 6 / nivel
94.59 (6.83)
93.57 (2.87)
92.79 (2.13)
96.78 (6.29)
104.56 (5.96)
104.94 (5.66)
101.95 (6.14)
98.29 (4.02)
98.96 (3.19)
Límite de
cuantificación
Relación señal/ruido
98.90 (8.43)
14 : 1
101.61 (9.47)
17 : 1
103.56 (5.88)
16 : 1
Estabilidad sobre la
mesa
(5 h)
99.07 (5.43)
95.52 (4.66)
92.34 (2.72)
94.30 (0.66)
91.17 (0.67)
108.20 (3.57)
97.80 (1.83)
98.73 (1.08)
100.05 (2.95)
Estabilidad en
automuestreador
(8 h)
94.90 (6.54)
95.18 (3.63)
92.79 (2.02)
103.70 (7.06)
108.77 (2.06)
106.28 (3.24)
97.30 (3.76)
99.02 (3.69)
100.67 (2.69)
Estabilidad a largo
plazo
(6 días)
97.73 (5.10)
96.89 (2.79)
92.62 (2.58)
98.00 (5.60)
103.25 (7.59)
107.01 (2.64)
101.21 (7.92)
101.40 (3.14)
103.84 (3.43) Límite de detección
Relación señal/ruido
0.05 g/mL
5 : 1
0.1 g/mL
6 : 1
0.1 g/mL
8 :1
68
En la figura 21, se muestran los cromatográmas correspondientes a los blancos de sangre (muestras pre-dosis) de rata en
DBS obtenidos durante el ensayo de farmacocinética.
Figura 21. Cromatográmas que muestran canales independientes obtenidos por UPLC-MS/MS; 1) blanco de
sangre, 2) límite de cuantificación y 3) concentración máxima sanguínea obtenida en DBS en rata Wistar.
A) DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu.
7.5. FARMACOCINÉTICA
Los cursos temporales de las concentraciones sanguíneas de las boroxazolidonas
de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico después de una
administración única i.g. (120 mg/kg, 210 mg/kg y 160 mg/kg, respectivamente)
en ratas se muestran en la figura 23. Después de su administración se observó
que el área bajo la curva (ABC) en los grupos tratados con las
difenilboroxazolidonas de glicina y del ácido L-glutámico es menor en comparación
con el área bajo la curva de los animales que recibieron DFBOZA-L-asp.
La concentración sanguínea máxima obtenida (Cmáx) se encuentra disminuida en
más de un orden de magnitud en las ratas administradas con DFBOZA-gly y
DFBOZA-L-glu comparada con las ratas suministradas con DFBOZA-L-asp. También
podemos percibir que el tiempo en el que se alcanzó la concentración sanguínea
máxima (Tmáx) aumentó significativamente en las ratas con DFBOZA-L-asp
cotejado con las ratas tratadas con las boroxazolidonas de glicina y del ácido L-
glutámico (figura 22).
70
Figura 22. Perfiles farmacocinéticos obtenidos en DBS en ratas Wistar
macho, donde se grafica concentración sanguínea contra tiempo,
después de una dosis única intragástrica. A) DFBOZA-gly (120 mg/kg),
B) DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) y C) DFBOZA-L-glu (160 mg/kg). Los
datos están expresados en promedios ± el error estándar (n=8).
71
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos de las difenilboroxazolidonas de glicina,
del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico se pueden apreciar en la tabla 8.
Tabla 8.- Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la
administración intragástrica de una dosis única de DFBOZA-gly, DFBOZA-
L-asp y DFBOZA-L-glu en ratas Wistar macho (n=8).
Donde: Cmáx, concentración máxima sanguínea; Tmáx, tiempo en que se alcanza
Cmáx; ABC0-t, área bajo la curva del tiempo cero hasta la última toma de muestra;
ABC0-∞, área bajo la curva desde tiempo cero extrapolada hasta el infinito; t½, vida
media de eliminación; Vdapp, volumen aparente de distribución; MRT, tiempo
medio de residencia; Cl, depuración. Los valores muestran medias ± error
estándar.
Parámetros farmacocinéticos
DFBOZA-gly
(120 mg/kg) DFBOZA-L-asp
(210 mg/kg) DFBOZA-L-glu
(160 mg/kg)
Cmáx ( g/mL)
Tmáx
(h)
ABC0-t
( g*h/mL)
ABC0-∞
( g*h/mL)
t1/2
(h)
Vdapp
(L)
MRT
(h)
Cl
(L/min)
0.23 ± 0.01
2.31 ± 0.28
3.59 ± 0.07
11.80 ± 1.39
49.71 ± 8.27
191.78 ± 13.30
10.46 ± 0.12
3.09 ± 0.38
14.05 ± 1.03
6.25 ± 0.25
154.81 ± 4.28
165.76 ± 4.86
5.5 ± 0.17
2.72 ± 0.09
8.38 ± 0.17
0.35 ± 0.01
0.69 ± 0.11
2.53 ± 0.55
5.27 ± 0.48
6.96 ± 0.69
8.49 ± 2.17
91.22 ± 15.64
7.53 ± 0.71
6.88 ± 0.86
72
Posterior a la administración i.g. de una dosis única de la DFBOZA-gly (120
mg/kg), DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) y DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) en rata, se
encontraron los siguientes parámetros: Cmáx para la DFBOZA-L-asp (14.05 ± 1.03
µg/mL) y para los animales tratados con DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu (0.23 ± 0.01
µg/mL y 0.69 ± 0.11 µg/mL, respectivamente). Referidos al Tmáx se observó una
relación aproximada de 3:1 veces en el valor encontrado para la DFBOZA-L-asp
(6.25 ± 0.25 h) con respecto a los lotes administrados con DFBOZA-gly (2.31 ±
0.28 h) y a la DFBOZA-L-glu (2.53 ± 0.55 h).
De los valores calculados tenemos el ABC0-t y el ABC0-∞ las cuales resultaron ser
superiores para la DFBOZA-L-asp (154.81 ± 4.28 g*h/mL y 165.76 ± 4.86
g*h/mL) con respecto a los valores obtenidos en los perfiles farmacocinéticos de
las otras boroxazolidonas en estudio (tabla 8), manifestando una alteración en la
disposición de las moléculas en los animales.
El tiempo de vida media (t1/2) y el Vdapp calculado para la DFBOZA-gly (49.71 ±
8.27 h y 191.78 ± 13.30 L, respectivamente) fue mayúsculo cotejado con los
estimados para los animales tratados con las difenilboroxazolidonas del ácido L-
aspártico y del ácido L-glutámico; indicando una modificación en la fracción
biodisponible de la difenilboroxazolidona de glicina en circulación sistémica.
73
Por otro lado, en cuanto al MRT calculado para las boroxazolidonas
experimentadas (tabla 8), se contempla una disminución severa en la depuración
en los animales tratados con la DFBOZA-L-asp con respecto a la depuración de los
lotes administrados con la DFBOZA-gly y la DFBOZA-L-glu (tabla 8).
74
8. DISCUSION
8.1. Toxicidad aguda
La determinación de la toxicidad aguda es la primera etapa en la investigación
toxicologica y farmacológica de nuevas sustancias (Lorke, 1983). Un parámetro
indicativo de la toxicidad aguda de una sustancia es la DL50 (Marquardt, 1999) así
como los posibles efectos biológicos que se producen durante la evaluación de
dicha toxicidad. Por tal motivo, resultó interesante evaluar la toxicidad de las
difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico en
ratas por administración i.g. siguiendo el desarrollo experimental propuesto por
Lorke con la finalidad de obtener la DL50 con un menor número de animales, así
como un intervalo de dosis más específico en las que las boroxazolidonas
empleadas ejercieran una actividad biológica notable.
Al realizar el ensayo con la DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu en ratas
se observó; que en la etapa preliminar todas las boroxazolidonas evaluadas
provocaron la muerte de los animales a dosis de 1000 mg/kg (tabla 1, 2 y 3),
además presentándose piloerección, espasmos y convulsiones tónico-clónicas en
los animales; evidenciando la acción sobre el sistema nervioso central, ya que la
producción de convulsiones se da cuando una sustancia llega al SNC y genera la
actividad desordenada, sincrónica, excesiva e incontrolada de las neuronas
(Goodman y Gilman, 2007; Guyton, 2001).
75
En los lotes administrados con dosis de 10 y 100 mg/kg no se observó efecto
biológico importante, únicamente piloerección. En la siguiente etapa del estudio, se
ensayaron dosis equidistantes logarítmicamente de las difenilboroxazolidonas
experimentadas en los intervalos entre 100 y 1000 mg/kg, manifestándose en los
animales: movimientos involuntarios, piloerección, temblor y convulsiones tónico-
clónicas durante las siguientes 2 horas hasta el término del periodo observado (6
h). Después del tratamiento se encontraron animales muertos hasta las 72 horas a
dosis de 316.3 mg/kg para la DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu respectivamente.
Con los resultados de las dosis específicas utilizadas se cálculo la DL50 para cada
boroxazolidona en ratas macho con administración única por via i.g. arrojando los
siguientes valores: DFBOZA-gly=240 mg/kg, DFBOZA-L-asp=420 mg/kg y
DFBOZA-L-asp=320 mg/kg.
Nuestros resultados de las dosis letales encontradas, difieren de las encontradas
en la literatura en donde se obtuvieron las siguientes DL50: 105 mg/kg para
DFBOZA-gly, 638.8 mg/kg para DFBOZA-L-asp y 461.8 mg/kg para DFBOZA-L-glu
en ratones hembras por vía i.g. de la cepa NMR-1 y CF-1 respectivamente. Cabe
mencionar que el resultado del índice de toxicidad (DL50) de un compuesto esta
influenciado significativamente por diferentes variables como son: especie animal,
cepa, edad, sexo, dieta, vía de administración, entre otras (Doull, 1981), por tal
76
motivo no puede ser considerada como una constante biológica (Zbiden y Flury-
Roversi, 1981; Lorke, 1983; Casarett y Doull΄s, 1996).
De acuerdo a los resultados obtenidos y a la clasificación de toxicidad de
substancias realizada por la Organización Mundial de la Salud, las aseveraciones a
las que se puede llegar siguiendo el ensayo propuesto por Lorke son que la
boroxazolidona de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico se
consideran como substancias moderadamente toxicas y con un índice de toxicidad
de 3 respectivamente (Ariëns, 1978; Hodge y Sterner, 1949).
8.2. COORDINACIÓN MOTORA
Las actividades motoras se organizan jerárquicamente en el sistema nervioso
central. La medula espinal, el cerebro medio, el cerebelo, los ganglios basales y la
corteza cerebral, cada uno posee funciones motoras características. Cada nivel
contribuye a una calidad específica de organización y respuesta motora a la
actividad motora total. Los daños a los centros motores o a las trayectorias pueden
provocar trastornos o pérdida de la función motora, por una parte o pérdida de la
inhibición o de la modulación de las actividades del sistema nervioso central
residual por otra (Katzung, 2002; Estévez-González A. y cols., 2000).
Los ganglios basales se consideran centrales en el control motor, aunque también
intervienen en la conducta no motora, incluidas la cognición y la emoción
77
(Lawrence A.D., 2000). Existen tres componentes principales del sistema motor
implicados en la producción del movimiento voluntario: las vías corticospinales
(piramidales) que pasan a través de las pirámides bulbares y conectan la corteza
cerebral con los centros motores inferiores del tronco del encéfalo y la medula
espinal; los ganglios basales (núcleo caudado, putamen, globo pálido, sustancia
negra y el núcleo subtalámico, que forman el sistema extrapiramidal), un grupo de
estructuras interrelacionadas y situadas profundamente en ambos hemisferios
cerebrales, cuyas eferencias son dirigidas proximálmente a través del tálamo a la
corteza cerebral; y el cerebelo que constituye el centro de la coordinación motora
(Guyton y Hall, 2001, Young A.B., 1998).
Como se menciono anteriormente, la actividad motora es una variable que
involucra directamente el funcionamiento del SNC y por tal motivo resultó
interesante evaluar la actividad biológica que causan las difenilboroxazolidonas de
glicina, del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico a nivel central en las ratas, la
cual se evaluó utilizando un rodillo giratorio (previo adiestramiento de los
animales) y se cuantificó el numero de caídas en los diferentes lotes tratados por
un periodo de 5 minutos durante una cinética temporal de 24 horas.
En los lotes tratados con las difenilboroxazolidonas ensayadas fue clara la
incoordinación motora de los animales al evaluar el número de caídas de las ratas
de la plataforma giratoria. En el lote administrado con DFBOZA-gly fue marcado el
78
trastorno en la actividad motora cuantificándose el numero máximo de caídas de
los animales hasta en 14 ocasiones a las 2 horas después del tratamiento,
infiriendo el tiempo en el que se alcanza la actividad biológica máxima, el efecto
motor anormal se observó hasta las 12 horas con una diferencia significativa
estadísticamente; esto nos da una estimación de la permanencia del compuesto en
el organismo de la rata la cual produce una efecto biológico.
Los ganglios basales tienen a su cargo la ejecución automática de un plan motor
aprendido en la preparación para el movimiento. A medida que se aprende una
habilidad motora, los ganglios basales toman una función de ejecutar de modo
automático la destreza aprendida. Cuando están alterados o dañados los ganglios
basales, el individuo debe regresar a un mecanismo cortical más lento, menos
automático y preciso para la conducta motora (Leiguard R.C., 2000).
La afectación en la actividad motora de los animales tratados con las
difenilboroxazolidonas en este caso con la DFBOZA-gly puede ser atribuida a la
interacción con los receptores glicinérgicos, ya que en investigaciones donde se
causo la mutación de los receptores glicinérgicos, reduciendo la sensibilidad de
éstos se provocó numerosas alteraciones en el control motor. Estos desordenes
fueron caracterizados por una contracción muscular intensa (hipertonía) y
normalmente asociada a espasticidad muscular. En humanos la mutación de los
receptores de glicina, provoca rigidez muscular severa la cual se inicia por un
79
estimulo abrupto que puede ser ocasionado por varias causas, incluyendo la luz y
el sonido. La contracción muscular que se genera impide la ambulación y causa
inestabilidad postural (Bowery N.G., y Smart T.G., 2006).
Sin embargo la incoordinación motora provocada por la DFBOZA-gly en los
animales tratados, pudiera estar también relacionada con receptores ionotrópicos
entre los cuales se encuentra principalmente NMDA (localizado abundantemente
en los ganglios basales) e incluso involucrando de forma importante al
neurotransmisor dopamina (Vezina P., y Kim J.H., 1998). Esto debido a que la
dopamina sintetizada en la sustancia negra, a través de los receptores D1 del
estriado se utiliza para mantener un patrón de comportamiento motor, así como
mediante los receptores D2 que se utiliza para suprimir los movimientos
inapropiados y permite el cambio rápido a nuevos comportamientos motores
(Young A.B., 1998).
En cuanto a las difenilboroxazolidonas del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico
se observa el comportamiento motor anómalo, evaluado por el número de caídas
de los animales del rodillo giratorio. Para la DFBOZA-L-asp, el tiempo en el que se
observó el efecto biológico máximo fue entre 6 y 8 horas, disminuyendo el número
de caídas de los animales a lo largo del tiempo evaluado. En el lote administrado
con la difenilboroxazolidona del ácido-L-glutámico la incidencia máxima en el
80
número de caídas de los animales de la barra giratoria fue notable a las 3 horas
(12 ocasiones) disminuyendo conforme la evolución del tiempo.
Los neurotransmisores mas usados por las neuronas son de la clase de
compuestos llamados aminoácidos, los de tipo excitador son el ácido aspártico y el
ácido glutámico y son los mas abundantes aminoácidos libres en el cerebro del
mamífero (Tallan, Moore y Stein, 1954). La neurotransmisión mediada por estos
aminoácidos ocurre vía receptores ionotrópicos y metabotrópicos, los cuales están
acoplados a canales iónicos y proteínas G respectivamente. Los aminoácidos
excitatorios han sido implicados en numerosos procesos fisiológicos y de
comportamiento, así como se piensan que son la base del aprendizaje y la
memoria. Es conocido que los sistemas que usan glutamato como neurotransmisor
en los ganglios basales contribuyen de manera importante en la generación de la
actividad motora, aunque los receptores ionotrópicos de glutamato (NMDA, AMPA
y Kainato) han sido más estudiados, los receptores metabotrópicos también
contribuyen de manera importante en la actividad motora.
Por lo anterior y debido a la alteración en la coordinación motora de las ratas
evaluadas podemos inferir que la DFBOZA-L-asp, al igual que la DFBOZA-L-
glutámico están actuando sobre el receptor ionotrópico NMDA, ya que se produce
una estimulación motora excesiva de forma general en el SNC, lo cual se observó
en la dosis utilizadas para evaluar la toxicidad aguda de los compuestos, la cual
81
provocó convulsiones. Aunque con certeza no sabemos sobre que clase de
receptores estén actuando específicamente puede ser que estén actuando sobre el
receptor ionotrópico NMDA o en los receptores metabotrópicos glutamatérgicos
(mGluR΄s), ya que estudios funcionales han sugerido que el grupo II mGluR΄s los
cuales incluyen a los subtipos mGluR2 y mGluR3, ambos están negativamente
acoplados a la adenilato ciclasa, son abundantes en los ganglios basales, región
involucrada críticamente en la actividad motora (Jeffrey C. Watkins y David E.
Jane., 2006).
Se ha demostrado que la DFBOZA-L-glu efectivamente interacciona con receptores
de glutamatérgicos, tal como se encontró en el experimento donde se administró
DFBOZA-L-glu directamente en el globo pálido de rata, estructura neuronal que
posee gran cantidad de receptores de glutamato, la DFBOZA-L-glu fue capaz de
aumentar la actividad neuronal en el globo pálido, aumentando la frecuencia de
disparo de 13 de 16 neuronas en un 242 ± 48 % del valor basal (Araujo A. J.,
2004).
82
8.3. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE LAS DIFENILBOROXAZOLIDONAS EN MANCHAS DE
SANGRE SECA (DBS) EN RATAS POR UPLC MS/MS.
DESARROLLO CROMATOGRÁFICO
En el desarrollo de las condiciones cromatográficas de las difenilboroxazolidonas de
aminoácidos se buscó una alta sensibilidad del método, una resolución adecuada
de los picos cromatográficos y eficiencia en el tiempo de detección, es por eso que
todos los componentes y constituyentes que integraron el método cromatográfico
debieron tener como objetivo estas condiciones.
La selección de la fase móvil (FM) en cromatografías convencionales es en base a
la compatibilidad que tenga esta con los analitos a cuantificar o separar sin que
estos sufran algún tipo de reacción al ponerse en contacto con ella. Sin embargo
para la detección que fue utilizada en la cuantificación de las
difenilboroxazolidonas fue necesario que la FM modificara las propiedades químicas
de los compuestos en cuanto a su ionización sin perder de vista su coeficiente de
reparto entre la columna y la fase móvil. Otra característica es que todos los
componentes que la constituyan deben ser volátiles. La FM debe ayudar a la
columna en la obtención de una adecuada resolución, aun siendo detección por
espectrometría de masas, ya que si los picos no son óptimamente resueltos puede
existir aumento o supresión iónica por parte de interferencias provenientes de la
matriz biológica hacia las diferentes difenilboroxazolidonas cuantificadas.
83
Para lograr una adecuada selectividad y evitar interferencia iónica fue necesario
usar un gradiente cromatográfico el cual permitió una óptima cuantificación. Este
gradiente puede ser generado a través de diferentes curvas, en este caso se
emplearon curvas cóncavas, las cuales tienen como característica que al inicio de
la inyección de la muestra, el cambio en la proporción de la fase móvil es lento
aumentando su velocidad con respecto al tiempo de inyección, las curvas utilizadas
en este trabajo fueron la 7 y 11, siendo la once más lenta al inicio con respecto de
la siete. Los estándares de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu fueron disueltos
totalmente en una solución de metanol más ácido fórmico al 0.1 % con un pH de
3.9, con objeto de estabilizar las soluciones de trabajo (la estabilidad reportada por
Strang, 1989, de las difenilboroxazolidonas es a pH ácido de 2 a 5). Las
difenilboroxazolidonas de aminoácidos aquí estudiadas también son solubles en
ACN utilizando éste para la fase móvil la cual también contiene formiato de amonio
2 mM a pH 3.3. A pesar de que las soluciones de trabajo de los compuestos
estudiados fueron preparados en metanol (MeOH), este en espectrometría de
masas se tiene que usar con reservas cuando no se conoce el metabolismo de los
analitos a cuantificar (como por ejemplo las difenilboroxazolidonas de
aminoácidos), ya que con el voltaje utilizado y la temperatura puede favorecer la
reconversión entre el analito y su metabolito hidrolizado dentro del instrumento de
detección así como la presurización del sistema. La ionización molecular de las
difenilboroxazolidonas a través de la fase móvil es necesaria cuando se trata de un
84
método analítico con detección por electrospray. El pH utilizado para la
cuantificación de estas se estableció considerando el pka1 de los aminoácidos que
es de 2.4, 2.0 y 2.1 respectivamente para Gly, Asp y Glu. A este pH los
compuestos se encuentran ionizados y listos para viajar a través de la diferencia
de potencial dentro del detector de masas. Este pH es necesario mantenerlo
durante toda la corrida cromatográfica, por lo cual el uso de un buffer que lo
amortigüe es necesario, esta es la razón del uso del formiato de amonio 2 mM.
Otro de los integrantes de suma importancia en la cromatografía es la columna,
existen una infinidad de columnas cromatográficas en el mercado pero debido a
sus características únicas, la utilizada para la separación de las
difenilboroxazolidonas de aminoácidos en este estudio fue una columna con un
ligando C6-fenilo; el cual forma una fase estacionaria reversa especial para la
separación de compuestos con anillos aromáticos como es el caso de las
difenilboroxazolidonas, además tiene otras bondades que soportan las condiciones
que se requieren de presión y flujo en un sistema UPLC/MS-MS como son: tamaño
de partícula de 1.7 m que permite soportar flujos de fase móvil bajos (máximo
0.6 mL/min) a altas presiones hasta 15000 psi, lo cual permite un gasto de
disolventes mínimo comparado con otros sistemas que tienen gastos de hasta 2
mL/min, siendo este flujo tres veces más alto que el usado en la detección de las
difenilboroxazolidonas de aminoácidos ensayadas. Esto contribuye ecológicamente
ya que el uso de disolventes se reduce considerablemente, así como el costo del
85
método, ya que los tiempos de inyección usados en este método analítico fueron
de 2 min. Este tiempo tan corto de respuesta lo permite la dimensión de la
columna fenilo la cual fue de 2.1 x 100 mm. Las dimensiones y tamaño de
partícula de la columna así como el ligando dan como resultado una alta resolución
de los picos cromatográficos de las difenilboroxazolidonas de aminoácidos en
estudio. Cabe mencionar que esta columna soporta rangos de pH de 1 a 12
unidades, así como 4000 inyecciones y temperaturas de hasta 65 oC. El C. V. en
los tiempos de retención que esta reportado para esta columna es < 2.31 %, así
como un acarreo insignificante. Estas características nos permitieron tener
variaciones mínimas cromatográficas así como una alta selectividad y eficiencia en
la separación de picos debido a que se uso solo una columna durante todas las
etapas que involucraron esta tesis (desarrollo, validación y farmacocinética)
soportando el pH usado que fue de 3.9, la temperatura de 40 oC y el flujo de 0.25
mL/min.
La temperatura de la columna cromatográfica debe apoyar al sistema UPLC con el
control de la presión generada en el equipo y esto lo hace disminuyendo la
viscosidad de la fase móvil ya que esta propiedad de los líquidos es dependiente
de manera directamente proporcional a la temperatura. Al controlar la temperatura
de la columna se controla la cuantificación de los compuestos ya que ayuda a
mantener la resolución y geometría de los picos cromatográficos. Al optimizar la
temperatura se cuido de no exceder la máxima soportada por la columna y sobre
86
todo que las difenilboroxazolidonas no sufrieran alguna alteración molecular
descomponiendo su estructura y por ende interfiriendo en la detección del sus
iones moleculares y fragmentos esperados después de su paso por el detector de
masas. El camino más sencillo y rápido era el uso de la columna cromatográfica a
temperatura ambiente ya que no se contaba con información suficiente de
estabilidad de las difenilboroxazolidonas a temperaturas mayores a las ambientales
en el disolvente empleado en la técnica de extracción, sin embargo este método ni
siquiera fue considerado al realizar la optimización de este parámetro, ya que
durante una corrida cromatográfica la temperatura ambiente sufre oscilaciones y
estas oscilaciones se incrementan entre días, teniendo como consecuencia posibles
cambios en los tiempos de retención de los analitos y sus estándares internos, lo
cual generaría una deficiencia en la integración de los picos así como le restaría
robustez a la selectividad del método analítico. Por lo tanto tomando en
consideración lo anterior la temperatura óptima de la columna en la cuantificación
de las difenilboroxazolidonas de los aminoácidos estudiados fue de 40 oC.
El flujo cromatográfico debe generar una presión mínima de 7000 psi para trabajar
en condiciones de ultra alta resolución. Debe de ayudar a la columna
cromatográfica en la obtención de picos simétricos y finos, ya que flujos y
presiones bajas pueden producir asimetría en los picos y ensanchamiento,
obteniendo como resultado pérdida en la altura de los mismos. La altura de los
picos es muy importante ya que recordemos que durante la etapa de validación de
87
un método analítico por cromatografía, uno de los parámetros a evaluar es el
límite de detección y cuantificación, los cuales tienen como criterio de aceptación
un parámetro que relaciona la respuesta de señal/ruido y esto esta en función de
la altura del pico de las tres difenilboroxazolidonas analizadas y del ruido en la
línea base generado. La estabilidad del ruido de la línea base cromatográfica
puede ser afectado por fluctuaciones en el flujo, por lo cual este debe ser
constante y homogéneo, estas características las obtenemos con un flujo isocrático
como es nuestro caso, ya que si generamos un gradiente de flujo este puede
interferir en la estabilidad de la línea base debido al cambio de velocidad en los
pistones de la bomba cromatográfica, así como disminución de la vida útil de la
columna debido al constante cambio de presión generado dentro de esta (la
presión es directamente proporcional al flujo cromatográfico). Además de lo
anterior los picos geométricamente homogéneos son perfectamente cuantificables
sin el riesgo de sub y/o supra estimarlos con la consecuencia de obtener
concentraciones falsas. Es por eso es que cuando se desarrollo el método analítico
para la cuantificación de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu se realizó con un flujo
de 0.25 mL/min el cual generó una presión de 7600 psi aproximadamente con
anchos de pico menores a 0.4 de min, sin coleo y perfectamente integrables para
su cuantificación.
Para la optimización de la temperatura del automuestreador se tomo en
consideración la estabilidad de las tres diferentes difenilboroxazolidonas en la
88
mezcla de extracción ACN:ácido fórmico 0.1 % 80:20 v/v, así como el tiempo
probable calculado en el cual las muestras de la validación y la farmacocinética
quedarían almacenadas en al automuestreador antes de ser inyectadas. Al realizar
esta optimización se cuido que la mezcla que contenía a los compuestos no se
evaporara, por lo que fue necesario probar temperaturas por debajo de 20 oC que
es el punto de evaporación del ACN y del ácido fórmico, sin embargo como al
mezclar los componentes de la fase móvil estos forman una mezcla azeotrópica y
esta puede tener diferente punto de evaporación ya sea por arriba o por debajo a
20 oC se optimizo a 15 oC. Otro de los aspectos que fue cuidado para establecer
esta temperatura fue que durante todo en tiempo que estuvieran las muestras
dentro del automuestreador no existiera precipitación, ya que como son
compuestos relativamente nuevos, no se tenía información sobre una posible re-
cristalización en esas condiciones de pH, disolventes y temperatura. Ahora
sabemos que si las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu se protegen de la
luz, y se almacenan a la temperatura y mezcla de extracción antes descritas, son
estables por lo menos 8 horas en el automuestreador.
DETECCIÓN
Se seleccionó la espectrometría de masas como método de detección ya que
proporciona alta sensibilidad (desde 25 pg/mL), especificidad, precisión y
reducción en los tiempos durante el desarrollo analítico de nuevos compuestos en
diferentes matrices biológicas (Duncan., 2006).
89
El detector de espectrometría de masas utilizado en este trabajo nos permitió
seleccionar el tipo de ionización más adecuada para la detección de las
difenilboroxazolidonas en estudio, entre la ionización por electrospray (ESI) y la
ionización química a presión atmosférica (APCI). La ionización ESI es suave
(Duncan, 2006) comparada con la APCI, ya que la primera ioniza a través de un
cambio de pH en el medio mientras que la última ioniza con una descarga eléctrica
de corona, la cual puede incluso fragmentar a la molécula de interés antes de
entrar a la celda de colisión. Las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu son
moléculas anfipáticas debido a que tienen más de un grupo funcional ionizable.
Dependiendo del pH en donde se encuentren estas pueden estar ionizadas positiva
o negativamente, es por esto que se decidió trabajar con la ionización por ESI ya
que el pH proporcionado por la fase móvil de 3.3 favorece la polarización de los
compuestos sin necesidad de someterlos a una descarga eléctrica. Aunado a lo
anterior durante la optimización por detección MS se obtuvieron mejores
resultados con respecto a la abundancia y estabilidad de los picos por electrospray
comparado con APCI (datos no mostrados).
El tipo de ionización ESI puede ser usado en modo positivo o negativo
dependiendo de la carga de los iones en estudio. En nuestro caso las moléculas
fueron cargadas positivamente por lo cual el modo de ionización fue positivo (+).
La ionización de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu presumiblemente
90
se realiza en el sitio del carboxilo alfa ( -COOH) de los aminoácidos siendo el pKa1
de estos es 2.35, 1.99 y 2.1 respectivamente. Al observar la gráfica de valoración
de Gly (fig. 23), se puede apreciar que a valores de pH por debajo de su pKa1 los
dos grupos ionizables de éste aminoácido se encuentran protonados,
predominando la forma catiónica (+H3NCH2COOH). A pH por debajo de su punto
isoeléctrico, pero mayores a su pKa1 la forma predominante es (H3N+CH2COO-) de
zwitterion, mientras que cuando el pH del medio y el pKa1 son iguales existe un
equilibrio entre las dos formas (Voet., 1999).
Este razonamiento puede extrapolarse al comportamiento de la
difenilboroxazolidona de Gly, sin perder de vista que el heteroátomo de boro y el
enlace covalente coordinado que se forma con el grupo amino del aminoácido
puede modificar el pKa de los compuestos estudiados.
Si el pka1 de la Gly (2.35) es mucho menor al de un ácido monocarboxílico como
es el ácido acético (CH3COOH) el cual tiene un pka de 4.76 y esta gran diferencia
esta dada por la influencia electrostática de la carga positiva del grupo amino
(Voet., 1999), entonces podemos inferir que en las difenilboroxazolidonas al estar
comprometido éste grupo en un enlace covalente coordinado con el boro, esta
influencia disminuye, por lo cual el pka de los compuestos en estudio puede ser
mayor al de los aminoácidos. Entonces por los resultados en la ionización
molecular obtenidos, presumiblemente los valores de pka de las
91
difenilboroxazolidonas de los aminoácidos de Gly, L-asp y L-glu son mayores por lo
menos a 3.3 ya que a este pH son ionizadas en forma positiva.
Figura 23. Gráfica de la valoración iónica de glicina (Modificado de Voet,
1999).
El monitoreo de reacción múltiple (MRM) fue el método de adquisición empleado
en la cuantificación de las difenilboroxazolidonas. Este método fue útil en la
92
confirmación de las transiciones obtenidas durante la optimización de los picos
espectrométricos (picos MS) de los compuestos de interés. El método MRM fue
diseñado para garantizar que las transiciones encontradas fueran confiables para la
cuantificación de las muestras. Además de la confirmación de las transiciones,
corrobora que el voltaje del cono así como la energía de colisión fueron los
adecuados para su obtención. En este método se realiza la optimización del
“dwell”, el cual se optimizo por medio del número de puntos que se requieren para
la adquisición de los picos MS. Estos picos deben estar constituidos por al menos
de 15 puntos para no perder sensibilidad de la señal generada durante la
adquisición de los mismos y por ende perdida de sensibilidad en del método de
detección y como máximo 25 puntos para obtener picos simétricos y bien
definidos. El dwell usado en este trabajo fue de 0.2 seg con el cual los picos MS de
las difenilboroxazolidonas de aminoácidos fueron integrados por 20 y 22 puntos.
Los parámetros optimizados en el detector de masas tuvieron como objetivo
generar picos MS abundantes y estables. Siguiendo este objetivo los voltajes que
se establecieron para los parámetros: energía del capilar, energía de cono, energía
del extractor y radio frecuencia, se usaron en la selectividad de la relación m/z+1
de los iones moleculares de las diferentes boroxazolidonas analizadas,
facilitándoles su viaje dentro del detector MS a través de la generación de campos
electromagnéticos en el “T-wave” y primer cuadrupolo, seleccionando así solo los
iones con relación m/z+1 240.15, 298.20 y 312.20 Th (Cooks R.G., y cols., 1991)
93
respectivamente para las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu. Las
temperaturas de la fuente y de desolvatación así como su flujo de gas fueron
empleados para la óptima evaporación de la fase móvil, la cual al irse evaporando
forma gotas que contienen iones cargados positivamente, al evaporarse
completamente la fase móvil, el cúmulo de iones cargados sufren una fisión por la
repulsión generada de cargas iguales, a esta explosión se le llama de Coulomb la
cual deja libres a los iones moleculares para facilitar su entrada al detector MS
(Gaskell., 1997). El flujo de gas de cono fue empleado para repeler los iones que
no cumplan con las relaciones m/z+ antes mencionadas evitando así la entrada de
interferencias al espectrómetro. Al no permitir que otros iones se introdujeran al
instrumento, se aumento la selectividad del método y se prolongo la limpieza del
cono de entrada. La resolución de masas altas y bajas 1 así como la energía del
ión 1, fueron optimizadas para obtener anchos de pico MS de 1 uma como máximo
en los iones moleculares de las difenilboroxazolidonas. La presión del gas de
colisión y los electrón-volts de colisión fueron optimizados para la obtención de las
relaciones m/z+1 de los iones producto de 162.0, 160.0 y 163.0 Th, para las
boroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu respectivamente. Se observa que todas las
DFBOZA aquí estudiadas durante la fragmentación, pierden el grupo fenilo y la
cadena lateral del aminoácido correspondiente (fig. 19). Cabe señalar que la
energía de colisión necesaria para romper la cadena lateral de los aminoácidos fue
proporcional al tamaño de esta, es decir las energías de colisión obtenidas fueron:
8, 10 y 50 electrón-volts para Gly, L-asp y L-glu respectivamente, lo que coincide,
94
ya que la menor energía se uso en la fragmentación de DFBOZA-gly la cual carece
de cadena lateral, mientras que la mayor energía fue usada en la fragmentación
de DFBOZA-L-glu, la cual tiene la cadena lateral más grande. Las energías de
entrada y salida de la celda de colisión se optimizaron para incrementar aún más la
alta sensibilidad en la detección ya que a esta celda solo le permitió la entrada a
las relaciones m/z+ de los iones moleculares, mientras que la salida permitió solo el
paso hacia el segundo cuadrupolo de los iones con relaciones m/z+
correspondientes a los fragmentos. La resolución de masas altas y bajas 2 así
como la energía del ión 2, fueron optimizadas para generar anchos de pico MS de
1 uma como máximo en los iones producto de las difenilboroxazolidonas. El
fotomultiplicador se empleó para aumentar la señal electromagnética dada por los
fragmentos espectrométricos de los compuestos aquí mostrados.
Al realizar el análisis de los picos espectrométricos de los iones moleculares de las
DFBOZA de los aminoácidos Gly, L-asp y L-glu (fig. 18), se observo que la
abundancia isotópica obtenida para el 10B y el 11B coincide con lo reportado por
Soloway y cols., 1998, ya que mencionan que la abundancia isotópica que se
encuentra naturalmente de ellos es de 19.7 % y 80.3 % respectivamente. Este
hallazgo confirma que las condiciones espectrométricas establecidas para la
cuantificación de las difenilboroxazolidonas de los tres aminoácidos aquí
presentados fueron adecuadas y confiables.
95
8.4. VALIDACIÓN
El método analítico fue diseñado para la cuantificación de las
difenilboroxazolidonas en sangre de rata, éste fue sensible, reproducible, confiable,
exacto, preciso, estable y selectivo.
En estudios pre-clínicos, la validación de los métodos que se emplean para la
cuantificación los compuestos en estudio es poco usual. Sin embargo, debido a la
importancia clínica que tienen las boroxazolidonas nos dimos a la tarea de realizar
esta etapa previa a la cuantificación de las muestras.
Durante el análisis de muestras biológicas es común intercalar puntos de
concentración conocida (puntos control, PC) como controles de calidad durante
una corrida cromatográfica (Swartz y cols., 2003), estos puntos deben cubrir todo
el intervalo de cuantificación por lo cual en este estudio se usaron tres niveles:
bajo (PC1), medio (PC2) y alto (PC3).
La selectividad del método se estableció eligiendo adecuadamente la columna
cromatográfica, la cual es específica para la retención de compuestos aromáticos.
El gradiente de la fase móvil nos permitió la separación de posibles interferencias
endógenas con los analitos. La espectrometría de masa es un técnica analítica de
alta selectividad ya que identifica compuestos con respecto a su relación m/z+.
De acuerdo a los resultados obtenidos el porcentaje de recobro de las
difenilboroxazolidonas ensayadas fue de: 94.19 % para DFBOZA-gly con un C. V.
96
de 2.25 %, 100.16 % para DFBOZA-L-asp con un C. V. de 3.14 % y 99.28 % para
DFBOZA-L-glu con un C. V. de 0.31 %.
8.5. FARMACOCINÉTICA
Manchas en sangre seca (DBS)
DBS, represento una técnica de muestreo más práctica y menos agresiva que nos
permitió obtener un volumen de muestra suficiente, sobre todo en especies
pequeñas como la rata. El formato de la tarjeta es una manera fácil de
almacenamiento de una gran cantidad de muestras que en muchas ocasiones
poseen una mayor estabilidad a temperatura ambiente en comparación con fluidos
biológicos frescos. Además de esto, DBS evitó la cateterización de los animales
durante largos periodos de muestreo en la farmacocinética. Por otra parte, los
procedimientos de extracción de muestras perforadas fueron automatizados por lo
que el método fue de alta eficiencia. Durante el acoplamiento del análisis DBS con
MS/MS es muy importante el uso de tarjetas de algodón extrapuro y libre de
aditivos que puedan interferir con la ionización del analito. Es importante utilizar
sangre heparinizada ya que la heparina no ha demostrado supresión iónica y no
así el EDTA. Se tomaron cuidados rigurosos durante el procesamiento de las
muestras así como se puso atención especial en el volumen depositado en las
tarjetas y la manipulación de las mismas, para minimizar la variabilidad en el
análisis cuantitativo de las boroxazolidonas en DBS (Li W., y Tse FLS., 2010).
97
En general, se acepta que existe una relación entre los niveles sanguíneos o
plasmáticos de un fármaco y la intensidad y duración de la respuesta
farmacológica observada (subterapéutica, terapéutica o tóxica), como resultado de
su administración a un organismo. Una relación directa de lo anterior, se basa en
dos principios, los cuales en conjunto dan validez a los estudios de
biodisponibilidad y farmacocinética lineal (Cárdenas-Rodríguez H.L., 2000).
A) La concentración plasmática del fármaco esta directamente relacionada con
la concentración en cualquier parte del organismo.
B) La intensidad de la acción farmacológica está relacionada directamente a la
concentración del fármaco en la biofase.
En condiciones fisiológicas normales, esto se cumple a través del equilibrio
dinámico establecido por la difusión reversible del fármaco entre sangre y tejidos
(Pallasch T.J., 1988).
La evolución temporal de concentraciones y cantidades de las
difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico fue
monitoreada en las ratas después de la administración única por vía i.g. donde uno
de los primeros resultados que saltan a la vista fue la diferencia marcada y amplia
entre los diferentes Cmáx entre DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu, análogos que
98
difieren solo en un grupo metileno en la cadena lateral carboxílica. El Cmáx obtenido
en las ratas tratadas con DFBOZA-gly y con DFBOZA-L-glu es mucho menor al que
presenta el grupo tratado con DFBOZA-L-asp, esto puede ser debido a una
disminución en la absorción de estas moléculas ya que el tiempo en que se alcanza
la concentración máxima sanguínea denota que la absorción ocurre
preferentemente en el estomago, en caso contrario el grupo tratado con la
DFBOZA-L-asp denota que el tiempo en que alcanza circulación sistémica se ve
aumentado (tmáx=6.25 ± 0.25 h) alrededor de 3 veces más que el tmáx
correspondientes a las otras difenilboroxazolidonas, infiriendo que la absorción
preferentemente se esta llevando a cabo en la superficie del intestino lo cual
puede explicar el valor alto de la concentración máxima sanguínea obtenida y el
ABC tan diferente con respecto a las demás boroxazolidonas en estudio. Sin
embargo se sugiere que este tipo de moléculas presentan una farmacocinética no
lineal; debido a los cambios notables en los parámetros farmacocinéticos obtenidos
como la eliminación, el volumen de distribución y semivida en función de la dosis o
concentración), esto por lo regular depende de la saturación de la unión a
proteínas, del metabolismo por el hígado o de la depuración (Goodman y Gilman,
2007).
Por otro lado el pico de concentración máxima sanguínea monitoreado en la
farmacocinética de las difenilboroxazolidonas ensayadas se correlaciona con la
actividad biológica máxima obtenida en el SNC en las ratas. El tiempo (tmáx) en el
99
que se presentó la concentración máxima sanguínea de las difenilboroxazolidonas
corresponde al tiempo donde se encontró el mayor número de caídas de los
animales del rodillo giratorio tras la administración de las boroxazolidonas, por lo
que el tmáx y Cmáx obtenidos experimentalmente corresponden a la actividad
máxima en el SNC evaluada con la actividad motora.
Ha sido bien establecido que el volumen de distribución aparente es un parámetro
que se correlaciona con la liposolubilidad de las moléculas. Un indicador de la
liposolubilidad es el logaritmo de la distribución de una molécula entre n-octanol y
agua (Log P), y se ha reportado en previas investigaciones el Log PDFBOZA-gly 1.48,
Log PDFBOZA-L-asp 0.98 y Log PDFBOZA-L-glu 1.16. Una alta liposolubilidad se asocio a
una mayor toxicidad de las difenilboroxazolidonas a nivel central.
El resultado obtenido fue una relación entre Vdapp y la toxicidad; un volumen de
distribución alto y Log P mayor se correlaciona con la DL50 inferior, que
corresponde a la DFBOZA-gly la cual resultó ser más tóxica. Los perfiles
farmacocinéticos de concentración sanguínea contra tiempo de las tres
boroxazolidonas se muestran en la figura 22 las cuales se pueden enlazar con las
cinéticas temporales de la evaluación de la coordinación motora en ratas.
100
9. CONCLUSIONES
La DL50 encontrada en ratas Wistar macho en unidosis por via i.g. de las
difenilboroxazolidonas son: DFBOZA-gly=120 mg/kg, DFBOZA-L-asp=210 mg/kg y
DFBOZA-L-asp=160 mg/kg, de acuerdo a estas dosis y al valor del índice de
toxicidad (3) presentado; se les considera como sustancias con toxicidad
moderada.
El efecto sobre la actividad motora y las convulsiones generadas provocadas por la
administración de la DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu indica que estas
boroxazolidonas tienen acción sobre SNC.
La incoordinación motora producida por las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y
L-glu durante la cinética temporal conducen a sugerir que podrían estar actuando
en los ganglios basales en el SNC.
Los mejores resultados en la ionización de las difenilboroxazolidonas se obtuvieron
por electrospray (ESI) con respecto a la ionización química a presión atmosférica
(APCI).
La máxima intensidad y estabilidad de las boroxazolidonas ensayadas se presentó
en modo positivo.
101
La DFBOZA-gly exhibió la señal más intensa durante la ionización por ESI (+).
La mayor abundancia isotópica de las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y L-glu
corresponde al 11B.
La fragmentación de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu y el método
de adquisición de datos (MRM) aumentaron la sensibilidad y la selectividad del
método bioanalítico.
El patrón fragmentación de las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y L-glu sugiere
la pérdida del fragmento correspondiente al grupo fenilo en todas las
boroxazolidonas cuantificadas.
La columna cromatográfica C6-fenilo la cual tiene una fase estacionaria reversa
especial brindo una óptima separación, identificación y cuantificación de las
difenilboroxazolidonas.
La farmacocinética de las difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido L-aspártico y
del ácido L-glutámico después de una administración única i.g. (120 mg/kg, 210
mg/kg y 160 mg/kg, respectivamente) en ratas, sugieren que presentan una
farmacocinética no lineal.
102
Los valores más altos de los parámetros farmacocinéticos calculados: Cmáx, Tmáx, y
el ABC correspondieron a la DFBOZA-L-asp, los cual indica una mayor absorción y
una mayor biodisponibilidad en el organismo.
La DFBOZA-gly fue la molécula que presentó un Vdapp muy elevado, lo cual denota
su alta liposolubilidad y sugiere que pudiera encontrarse en concentraciones altas
en el tejido extravascular.
El valor enorme de la t1/2 de la boroxazolidona de glicina implica el tiempo
prolongado de permanencia del compuesto en el organismo de la rata.
La farmacocinética de las difenilboroxazolidonas guarda una correlación directa
con el efecto biológico central en ratas.
Los compuestos que contienen boro en su estructura química constituyen un
campo creciente de la química médica con un amplio potencial en la terapéutica.
En particular, el estudio de las difenilboroxazolidonas de α-aminoácidos puede ser
una estrategia muy importante para aumentar la liposolubilidad de los
aminoácidos, y por lo tanto su biodisponibilidad en ciertos tejidos y órganos, en los
cuales juegan un papel muy importante (vías metabólicas del endotelio,
transmisión neuronal, cotransportadores epiteliales, etc.)
103
Las técnicas analíticas actuales demuestran la idoneidad para el monitoreo en DBS
de las difenilboroxazolidonas de α-aminoácidos en las farmacocinéticas preclínicas.
Esto también nos brindo la posibilidad de correlacionar las concentraciones en
sangre con el curso temporal de los efectos en el SNC.
La técnica UPLC MS/MS es una herramienta analítica muy sensible y específica que
permitió la medición de las DFBOZA de α-L-aa en cantidad de muestra limitada,
una situación común durante los estudios preclínicos en especies pequeñas como
las ratas.
104
10. PERSPECTIVAS
DBS representa una revolucionaria técnica analítica para la toma de muestra,
gestión y almacenamiento muestras biológicas. Sus aplicaciones abarcan no sólo
los ensayos preclínicos con animales pequeños, si no también en las tomas de
muestras pediátricas, e incluso los adultos en protocolos de largos periodos de
muestreo. Sin embargo, se deben generar más investigaciones sobre nuevos
materiales de soporte de las tarjetas, moléculas volátiles y la automatización de la
extracción. Actualmente el uso de DBS para fines cuantitativos se limita a
moléculas con altas concentraciones en sangre.
En lo que concierne a la farmacocinética de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y
DFBOZA-L-glu, será necesario hacer un mapeo en el SNC, para dilucidar la posible
distribución de dichas moléculas. El efecto sobre la actividad motora en ratas de
las difenilboroxazolidonas sugieren los ganglios básales como área de destino.
105
11. REFERENCIAS
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114
12. ANEXOS
Identificación espectrofotométrica de la DFBOZA-gly, donde se muestran dos
máximos de absorbencia a los 237.8 y 260 nm.
Espectro UV de la difenilboroxazolidona de glicina.
115
Identificación de la DFBOZA-gly, en el espectrofotómetro de IR.
Espectro de IR de la difenilboroxazolidona de glicina.
116
Identificación espectrofotométrica de la DFBOZA-L-asp, donde se muestra un
máximo de absorbencia a los 259 nm.
Espectro UV de la difenilboroxazolidona del ácido L-aspártico.
117
Identificación de la DFBOZA-L-asp, en el espectrofotómetro de IR.
Espectro de IR de la difenilboroxazolidona del ácido L-aspártico.
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