Técnica de Western Blotting
Objetivo da aula Estudar as frações: - gama-globulina precipitada - isotipo IgG purificado
Utilizando a técnica de Western Blotting
Técnica de Western Blotting (Immunoblotting)
Método utilizado para a imunodetecção de proteínas após sua separação por eletroforese em gel e transferência de um extrato
proteico para uma membrana adsorvente. Kurien & Scofield, 2006
Permite detectar, caracterizar e semi-quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades na amostra.
1973 – Edwin Southern Southern Blotting - DNA 1977 – James Alwine e colaboradores Northern Blotting - RNA 1979 – Towbin e colaboradores Western Blotting - Proteínas
Etapas da técnica
- Eletroforese – SDS-PAGE - Transferência para membrana - Bloqueio - Adição de anticorpos específicos - Detecção da reação
Alberts, Biologia Molecular da Célula 5ºedição
Eletroforese SDS-PAGE
Soro gama IgG
Transferência para membrana
Nitrocelulose (menor custo) PVDF (maior sensibilidade, ligação e retenção)
Bloqueio
Leite, soro albumina bovina (BSA) ou ovo albumina
- Membrana – alta afinidade por proteína
Adição de anticorpos específicos
Detecção de sinal (colorimétrico ou quimioluminescente)
Substrato da enzima Anticorpo secundário Conjugado com enzima
Anticorpo primário Proteína alvo
Membrana contendo proteína transferida
Indireto
Direta
Detecção da reação
Substrato DAB- Diaminobenzidina- cor marrom
https://www.youtube.com/watch?v=pRIn3p7x3V8
25KDa
50KDa
Aplicações no diagnóstico e pesquisa animal
Técnica recente que possui alta sensibilidade e especificidade com emprego crescente em diagnóstico de doenças animais.
Diagnóstico - Encefalopatias espongiformes transmissíveis
- Leishmaniose visceral americana
- Mieloencefalite equina por protozoário
- Salmonelose
- Mycoplasma hyopneumoniae (suínos)
- Mormo (Burkholderia mallei) em equinos
Pesquisa- Neoplasias
Doenças hereditárias
Descobertas de proteínas para produção de vacinas
Science, v 235
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