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1 INTRODUÇÃO
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O arsênio inorgânico é onipresente no meio ambiente, onde se apresenta,
principalmente, como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+), presentes em
pequenas quantidades nas rochas, no solo, na água, no ar e em certos alimentos
(FISHBEIN, 1981). Os seres humanos, expostos ao arsênio oriundo destas fontes
naturais, apresentam uma ingestão diária, geralmente, na faixa de 12-40 µg/dia
(UTHUS, 1994; THORNTON, 1996). Contudo, certas áreas distribuídas ao redor de
todo o mundo, como em Taiwan, México, Chile, Índia, Argentina e Estados Unidos,
contêm depósitos minerais naturais com quantidade suficiente de arsênio inorgânico
para contaminar a água e comprometer a saúde populacional (BORUM &
ALBERNATHY, 1994; CANTOR, 1996). Na Índia, por exemplo, os níveis de
arsênio excedem 300 µg/l e 1 mg/l, respectivamente, em 27% e 5% dos suprimentos
de água (CHAPELL et al., 1997), sendo muitas vezes superior ao nível máximo
permitido nos Estados Unidos, que é de 50 µg/l. Apesar de os reservatórios de água
dos Estados Unidos apresentarem, em geral, baixas concentrações de arsênio,
existem relatos de contaminação por este poluente em porções do Sudeste, onde os
níveis de arsênio na água atingem até mais de 1 mg/l (CHAN & HUFF, 1997;
WARNER et al., 1999; ATSDR, 1993).
Além destas fontes naturais de arsênio inorgânico, algumas atividades
humanas, como a mineração, a queima do carvão mineral e a aplicação de pesticidas,
herbicidas ou desfoliantes arsenicais, também podem introduzir o arsênio no meio
ambiente (HOOD, 1985). Apesar da exposição oral e crônica por meio da ingestão de
água e alimentos contaminados ser a forma mais comum de contaminação humana e
animal, a via inalatória também é tóxica e pode comprometer a saúde de indivíduos
3
que trabalham ou residem nas imediações de regiões com contaminação do ar por
este metal (ATSDR, 1993; HUGHES et al, 1995).
A preocupação com a contaminação ambiental por este metal pesado e suas
possíveis conseqüências para a saúde populacional tem crescido substancialmente em
diferentes países (NAS, 1999). Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio
inorgânico constitui-se em um dos principais contaminantes ambientais, vultosos
fundos têm sido dispensados no sentido de se estudar tanto os possíveis efeitos
deletérios deste metal pesado a nível populacional, como o seu máximo nível
aceitável, não tóxico, na água (CARLSON-LYNCH et al, 1994; CANTOR, 1996).
A absorção e a toxicidade do arsênio são dependentes tanto da forma de
exposição, quanto do metabolismo particular de cada animal ou indivíduo. As
espécies inorgânicas solúveis são as melhores absorvidas pelo trato gastro-intestinal,
sendo que as taxas de absorção variam de 40 a 100 % (PONTIUS et al., 1994). Após
a absorção ocorre a biotransformação, que consiste na redução do arsenato, a forma
pentavalente do arsênio inorgânico, em arsenito, sua forma trivalente (NEMETI &
GREGUS, 2002). O arsenito é a forma mais tóxica do arsênio inorgânico, sendo
altamente reativa com vários componentes tissulares, dada a sua alta afinidade por
grupos sulfidril. Em seres humanos, bem como na maioria das espécies de mamíferos
estudadas, este último sofre metilação, primariamente no fígado, formando os ácidos
metil-arsônico e dimetil-arsínico, que são excretados, sobretudo, na urina (VAHTER,
1999). O papel da metilação do arsênio é enigmático. O mesmo pode ser considerado
um mecanismo de detoxificação, uma vez que os metabólitos finais são menos
reativos com os constituintes dos diversos órgãos e tecidos, menos tóxicos e mais
facilmente excretados na urina (VAHTER & CONCHA, 2001). Porém, por outro
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lado, há evidências de que os metabólitos metilados do arsênio também possam
contribuir para a carcinogenicidade e a genotoxicidade deste metal pesado
(GOERING et al., 1999). Em seres humanos, a avaliação da metilação baseia-se,
principalmente, nas quantidades relativas dos diferentes metabólitos na urina, que
contém, em média, 10-30% de arsênio inorgânico, 10-20% de ácido metil-arsônico e
60-80% de ácido dimetil-arsínico (VAHTER & CONCHA, 2001). A capacidade de
metilação do arsênio inorgânico possui grande variabilidade intra e inter-espécies, o
que justifica, pelo menos em parte, as diferenças de susceptibilidade entre indivíduos
da mesma espécie e entre diferentes espécies (GOLUB, 1998; VAHTER, 1999).
Estudos comparando a toxicidade sistêmica do arsênio inorgânico em diferentes
animais sugerem ser o camundongo o modelo mais apropriado para o estudo da
toxicidade aguda por este metal (MITCHELL et al, 2000), justificando a sua escolha
no presente estudo.
O arsênio inorgânico é bem conhecido em saúde pública pela sua associação
com a ocorrência epidêmica de doenças cárdio-vasculares, cânceres e alterações de
pele nas áreas com elevada exposição a este agente (LIANFANG & JIANZHONG,
1994; CHEN et al., 1996). Estudos epidemiológicos têm mostrado que a exposição
crônica ao arsênio inorgânico pode promover lesões hepáticas, neuropatia periférica,
além de aumento da incidência de câncer de pulmão, pele, bexiga e fígado em seres
humanos (IARC, 1982). Este metal pesado também tem sido exaustivamente
estudado como um agente teratogênico em mamíferos, sendo o seu potencial para
promover toxicidade ao concepto durante o seu desenvolvimento intra-útero
(toxicidade desenvolvimental) investigado em algumas espécies de animais de
laboratório (HOOD, 1972; HOOD & BISHOP, 1972; HOOD & HARRISON, 1982;
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HOOD et al., 1988; DOMINGO et al., 1995; TABOCOVA et al, 1996; GOLUB et
al, 1998).
Dados oriundos de estudos com animais demonstraram que o arsênio
inorgânico pode causar malformações e óbito fetais, bem como retardo de
crescimento intra-útero em pelo menos quatro espécies de mamíferos (hamsters,
camundongos, ratos e coelhos) (HOOD, 1972; HOOD & BISHOP, 1972; HOOD &
HARRISON, 1982; HOOD et al., 1988; DOMINGO et al., 1995; TABOCOVA et al,
1996; GOLUB et al, 1998). Os efeitos são dependentes da dose, da via e do tempo de
exposição, bem como do dia da gestação no qual a exposição ocorre (TABOCOVA
et al, 1996; NEMEC et al, 1998). Em relação à via de administração deste agente,
estudos com diferentes modelos animais mostraram que o arsênio pode produzir
toxicidade desenvolvimental quando administrado tanto pela via oral (através da
administração do mesmo por sonda oro-gástrica), como pela injeção intra-peritoneal
(HOOD et al, 1988; NEMEC et al, 1998). Quando a mesma dose é administrada por
ambas as vias, os níveis séricos materno-fetais atingidos são maiores com a
utilização da segunda. Desta forma, a via injetável possibilita a administração de uma
dose menor, passível de promover a ocorrência de toxicidade fetal, na ausência de
efeitos adversos maternos.
Informações sobre a toxicidade desenvolvimental do arsênio inorgânico em
seres humanos limitam-se a uns poucos estudos epidemiológicos de populações
expostas a este contaminante pelas vias oral e inalatória (HOOD, 1972; IARC, 1982;
CARLSON-LYNCH et al., 1994; USEPA, 1996; GOLUB et al., 1998). Alguns
destes estudos evidenciaram um aumento na incidência de abortamento espontâneo,
natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das populações expostas. Contudo, a
6
interpretação destes dados é complicada, devido à exposição concomitante destas
populações a diversos poluentes e à possível presença de outras variáveis não
analisadas nestes estudos, o que dificulta a análise dos efeitos isolados da
contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres humanos (HOOD, 1972;
IARC, 1982; CARLSON-LYNCH et al., 1994; USEPA, 1996; GOLUB et al., 1998).
Dadas a escassez de informações e as limitações acima descritas, torna-se relevante a
obtenção de dados originados de estudos bem conduzidos em animais, para
tentarmos predizer os possíveis riscos da exposição humana a este contaminante no
que se refere a sua potencial toxicidade embrionária e fetal.
Alguns estudos evidenciaram que o arsênio produz uma grande variedade de
respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo anormalidades metabólicas
acompanhadas de inibição do crescimento e, eventualmente, de apoptose (BRISON
& SCHULTZ, 1997; MIRKES & LITTLE, 1998; LAROCHETTE et al, 1999;
BERNSTAM & NRIAGU, 2000). A desorganização de elementos estruturais do
citoesqueleto, vital para a integridade celular, aparentemente, é responsável pelas
alterações morfológicas presentes em algumas das linhagens de células estudadas e
expostas a este metal (CLARKSON, 1987; DEMEESTER et al., 1998; BERNSTAM
& NRIAGU, 2000). Contudo, detalhes das mudanças ultra-estruturais produzidas
pelo arsênio permanecem pobremente estabelecidos. Algumas evidências recentes
também sugerem que o arsênio promove, nas populações expostas a este elemento,
mutações oncogênicas, afetando algumas das enzimas relacionadas à replicação e ao
reparo do DNA, e aberrações cromossômicas. (HEI et al., 1998; GOLUB et al., 1998;
BERNSTAM & NRIAGU, 2000; LIU et al., 2001) A sensibilidade do fuso mitótico
ao arsênio, particularmente de seus componentes orgânicos, explica as aberrações
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cromossômicas bem documentadas em indivíduos que residem em áreas
contaminadas (CLARKSON, 1987; DEMEESTER et al., 1998; BERNSTAM &
NRIAGU, 2000). Contudo, não encontramos, na literatura, estudos sobre os possíveis
efeitos do arsênio na promoção de anomalias do fuso celular meiótico e aberrações
cromossômicas em células germinativas femininas, o que, pelo menos em parte,
explicaria a toxicidade desenvolvimental atribuída a este agente.
O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a produção de
radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares (HEI et al., 1998;
LAROCHETTE et al., 1999; BELZACQ et al., 2001; LIU et al., 2001). Existem
numerosas evidências de que o estresse oxidativo, dependendo de sua severidade,
pode promover a danificação de diversas proteínas intracelulares (STADTMAN,
1992; BERLETT & STADTMAN, 1997), algumas das quais são importantes para a
organização do fuso celular (ANTONIO et al. 2000; FUNABIKI & MURRAY,
2000; ABRIEU et al., 2001) e, ao mesmo tempo lesar, diretamente, o DNA e induzir
o mal alinhamento cromossômico (BECKMAN & AMES, 1998; LIMOLI et al.,
1998). Alguns estudos, por sua vez, demonstraram que a administração de
antioxidantes, como a N-acetil-cisteína e o L-ascorbato, preveniu a produção de
radicais livres do oxigênio e alguns dos efeitos tóxicos promovidos pelo arsênio
inorgânico (BARCHOWSKY et al., 1996; CHATTOPADHYAY et al., 2001),
sugerindo serem estes efeitos mediados, pelo menos em parte, pelo estresse
oxidativo. O estresse oxidativo também pode promover a apoptose em embriões pré-
implantação (SLATER et al., 1996). A apoptose, também denominada morte celular
programada, ocorre em embriões que falham na execução de eventos essenciais para
seu adequado desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular (JURISICOVA et al.,
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1998). Como previamente nós demonstramos que o comprometimento da função
mitocondrial produz importantes efeitos tóxicos na oogênese e no desenvolvimento
embrionário (LIU et al., 2000c, 2000d), e como o arsênio inorgânico sabidamente
altera a atividade desta organela celular e provoca estresse oxidativo e apoptose em
diferentes tipos celulares, nós levantamos a hipótese de que o arsênio inorgânico
poderia comprometer a meiose oocitária e o desenvolvimento embrionário, bem
como estimular a apoptose embrionária, eventos estes mediados, pelo menos em
parte, pela produção de radicais livres do oxigênio.
A meiose é uma fase do ciclo celular especialmente sensível aos efeitos
deletérios de diversos agentes estressantes. Em seres humanos, a duração da primeira
divisão meiótica pode ser extremamente longa, uma vez que a mesma se inicia
durante a vida intra-uterina e se completa no menacme, somente se ocorrer a
ovulação. Durante esta longa prófase da primeira divisão meiótica, os oócitos estão
susceptíveis a diversos agentes externos, incluindo possíveis poluentes ambientais,
entre os quais talvez possamos incluir o arsenito, bem como às conseqüências
inexoráveis do envelhecimento celular. A má qualidade oocitária é uma das
principais causas do declínio da fertilidade feminina relacionado ao envelhecimento
(NAVOT et al., 1991). Em seres humanos é bem documentado o aumento
significativo da incidência de aneuploidias oocitárias e embrionárias com o avanço
da idade (HASSOLD & CHIU, 1985; PLACHOT et al., 1988). A maioria das
aneuploidias embrionárias é derivada, por sua vez, de erros iniciados na primeira
divisão meiótica oocitária (BATTAGLIA et al., 1996; ANGELL, 1997; VOLARCIK
et al., 1998). Apesar dos mecanismos envolvidos na gênese das anomalias meióticas
não serem bem compreendidos (NICOLAIDIS & PETERSEN, 1998; PETERSEN &
9
MIKKELSEN, 2000), sabemos que as mesmas podem contribuir para a falência do
desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do
oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado,
até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que não
impossibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento
embrionário pré e/ou pós-implantação, assim como a viabilidade futura do concepto
(PAVLOK et al., 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Os
achados acima referidos justificam a importância desta fase particular do ciclo
celular, bem como o interesse em se estudar os possíveis agentes capazes de
comprometer a sua normalidade.
As anomalias meióticas podem ser identificadas, do ponto de vista
morfológico, pela presença de aberrações no fuso celular e/ou na distribuição
cromossômica. O fuso celular é constituído, principalmente, pelos microtúbulos, cujo
elemento estrutural predominante é a tubulina, sendo crucial para a normalidade do
alinhamento e da separação cromossômicos, durante a primeira e a segunda dividão
meióticas. A imensa maioria dos estudos descritos na literatura tem utilizado a
imuno-coloração e a microscopia de fluorescência para documentar estas
modificações (MARO et al., 1984, 1986; SCHATTEN et al., 1985; HARAGUCHI et
al., 1989; KIM et al., 1996; HEWITSON et al., 1997). Contudo, esta metodologia
apesar de permitir a avaliação detalhada, não apenas do fuso celular, como também
do alinhamento e da separação cromossômicos, requer a fixação e a coloração do
material a ser analisado. Isto inviabiliza a sua aplicabilidade clínica na análise de
oócitos humanos, que serão utilizados em técnicas de reprodução assistida (WANG
et al., 2001a, 2001b; .WANG & KEEFE, 2002).
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Uma outra técnica utilizada, mais recentemente, para a avaliação morfológica
do fuso celular, é a microscopia de polarização, também denominada de pol-scope
(OLDENBOURG et al., 1996, 1999; LIU et al., 2000a). Esta técnica possibilita a
análise de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de fixação
ou de coloração. A birrefringência é uma propriedade óptica, característica de
algumas estruturas biológicas, como o resultado do seu arranjo molecular próprio,
presente no fuso celular. Isto permite a avaliação detalhada desta estrutura pelo pol-
scope, conforme descrito em estudos anteriores (LIU et al., 2000a, 2000b; WANG et
al., 2001a, 2001b). Entretanto, como os cromossomos são minimamente
birrefringentes, não podem ser diretamente avaliados por esta metodologia. Todavia,
se forem confirmados os achados de que a grande maioria das anomalias do fuso
celular é acompanhada por alterações cromossômicas, esta técnica também poderia
ter aplicabilidade prática na predição de possíveis anomalias cromossômicas
associadas a alterações do fuso celular, o que precisa ser mais bem investigado
(WANG & KEEFE, 2002). A comprovação da inocuidade desta tecnologia na
análise de oócitos vivos, inclusive humanos, é outra vantagem descrita deste método,
que poderá ser aplicado futuramente nas clínicas de reprodução humana, no sentido
de se realizar a triagem de anomalias dos fusos celulares oocitários, previamente à
utilização dos mesmos nas técnicas de reprodução assistida, o que poderá ter
implicações vantajosas (WANG et al., 2001a, 2001b; WANG & KEEFE, 2002).
A apoptose é um mecanismo fisiológico suicida, normalmente responsável
pela preservação da homeostase orgânica, incluindo o adequado desenvolvimento
embrionário (WYLLIE, 1994). Contudo, a regulação inadequada deste processo pode
resultar em uma série de condições patológicas, o que tem sido investigado nos
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últimos anos. Como citado anteriormente, este processo de morte celular ocorre em
embriões que falham na execução de eventos essenciais para seu adequado
desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular (JURISICOVA et al., 1998), o que
ressalta a importância deste processo na regulação do desenvolvimento embrionário
e a relevância de se estudar agentes passíveis de comprometer a sua regulação.
Os dois modelos distintos de morte celular, a apoptose e a necrose, podem ser
distinguidos com base nas suas diferenças morfológicas, bioquímicas e moleculares.
Em geral, as células sofrendo o processo de morte celular programada evidenciam
um padrão clássico de mudanças estruturais nucleares e citoplasmáticas, sendo os
achados morfológicos clássicos do início deste processo a presença de condensação e
de fragmentação da cromatina nucleares (WYLLIE et al., 1980; HARMON et al.,
1998). Vários métodos têm sido utilizados para a identificação deste processo de
morte celular. Como a endonucleólise é considerada um evento chave, que resulta na
lise do DNA nuclear e na formação de fragmentos pequenos de oligonucleotídeos, a
mesma é comumente utilizada para a detecção da apoptose por meio de diferentes
métodos. Um destes, denominado método de TUNEL (terminal desoxynucleotidyl
transferase mediated d-UTP nick and labeling), consiste na marcação enzimática dos
fragmentos do DNA, por meio do uso de uma enzima que se liga a porção 3’-
hidroxi-terminal destes fragmentos, a desoxinucleotidil transferase, e de nucleotídeos
marcados com fluorisceína, com a sua posterior identificação por meio do uso de
microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Este método possibilita não
apenas a identificação, como também a quantificação da apoptose, tanto em tecidos,
como em células isoladas, sendo rápido, preciso e, relativamente, de fácil execução
(GORCZYCA et al., 1993a, 1993b; GOLD et al., 1994).
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Dada a escassez de informações disponíveis no momento sobre os possíveis
riscos da exposição animal e, em última instância, da exposição humana ao arsênio,
elemento claramente reconhecido como contaminante ambiental, torna-se imperativo
a obtenção de dados, inicialmente, de estudos in vitro bem conduzidos e, a seguir, de
estudos in vivo, com o intuito de se determinar os seus potenciais efeitos deletérios
sobre a meiose oocitária e o desenvolvimento embrionário pré-implantação, bem
como estímulo à apoptose embrionária. Dentre os dois principais compostos do
arsênio inorgânico, optamos pelo estudo dos efeitos do arsenito, em virtude da sua
maior toxicidade, quando comparada à do arsenato, e ao fato deste agente ser o
principal responsável pelos efeitos tóxicos atribuídos a este metal (GOLUB et al.,
1998).
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2 OBJETIVOS
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Neste estudo, objetivamos avaliar os efeitos do arsenito na meiose oocitária,
no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em
camundongos.
Foram especificamente avaliados:
1. Os efeitos do tratamento in vitro com arsenito na meiose de oócitos
submetidos à maturação in vitro (artigo 1);
2. Os efeitos do tratamento in vitro com arsenito na presença do antioxidante
N-acetil-cisteína, na meiose de oócitos submetidos à maturação in vitro
(artigo 1);
3. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito na meiose tanto de oócitos
in vivo ovulados, como in vitro maturados (artigo 2);
4. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito no desenvolvimento
embrionário pré-implantação de embriões provenientes de oócitos
fertilizados in vivo (artigo 2).
5. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito na promoção de apoptose
em blastocistos cultivados in vitro, provenientes de oócitos fertilizados in
vivo (artigo 2).
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26
4 ARTIGO 1
27
O arsenito promove anomalias na meiose oocitária que podem ser
prevenidas pela co-administração de N-acetil-cisteína
Paula A. A. S. Navarroa,b,c, Lin Liua,b, Rui A. Ferrianic e David L. Keefea,b,d
a Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Women & Infants Hospital, Brown
University, Providence, Rhode Island 02905
b Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543
c Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-000, Brasil
d para quem as correspondências devem ser endereçadas: Marine Biological
Laboratory, 7 MBL Street, Woods Hole, MA, 02543, USA. E-mail:
APOIO FINANCEIRO
P.A.A.S. Navarro foi financiada por uma bolsa de Doutorado-Sanduíche concedida
pela Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) – Brasil.
28
RESUMO
Objetivo: Determinar se o tratamento in vitro com arsenito promoveria anomalias na
meiose de oócitos de camundongo maturados in vitro na presença deste agente.
Definir se a co-administração do antioxidante N-acetil-cisteína poderia prevenir as
anomalias meióticas induzidas pelo arsenito.
Desenho experimental: Realizamos um estudo morfológico.
Local de desenvolvimento do estudo: Laboratório de Medicina Reprodutiva,
situado no Marine Biological Laboratory.
Animais: Camundongas CD-1 com 6 semanas de idade submetidas a superovulação
por meio da administração de gonadotrofina sérica de éguas prenhas.
Intervenção: Oócitos imaturos foram submetidos à maturação in vitro na presença
de arsenito ou de arsenito mais N-acetil-cisteína e avaliados a seguir por meio de
microscopia de polarização (pol-scope) ou de fluorescência.
Principal resultado avaliado: O estudo avaliou características morfológicas do fuso
celular e da distribuição cromossômica.
Resultados: O tratamento in vitro com arsenito promoveu anomalias meióticas,
dependentes da dose e do tempo de exposição a este agente. A exposição a 2 µg/ml
de arsenito por 12-14 h ou a 8 µg/ml por 2 h produziu um completo bloqueio da
maturação oocitária. A exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou
anormalidades meióticas, respectivamente, em 75% e 80% dos oócitos in vitro
maturados (60% e 80% de aberrações na meiose I, respectivamente) e atraso no
processo de maturação in vitro, após 12-14 h em cultura. Todavia, após 15-17 h em
cultura, 65.2% dos oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a
metáfase II, dos quais 66,7% exibiram anormalidades. A co-administração de N-
29
acetil-cisteína, aparentemente, preveniu as anomalias meióticas e o retardo no
processo de maturação in vitro, induzidos pelo arsenito.
Conclusões: Nossos dados demonstraram que o arsenito causou anomalias meióticas
durante o processo de maturação in vitro de oócitos de camundongos, que foram,
aparentemente, prevenidas pela co-administração de N-acetil-cisteína. Estes achados
sugeriram que as aberrações meióticas induzidas pelo arsenito possam ser mediadas
pela produção de radicias livres do oxigênio.
Palavras chave: Arsenito, meiose, maturação in vitro, N-acetil-cisteína, antioxidante
30
ABSTRACT
Objectives: To determine whether in vitro treatment with arsenite could cause
meiotic abnormalities in mouse oocytes during in vitro maturation (IVM). We also
investigated the effect of co-administration of an antioxidant, N-acetylcysteine, on
arsenite-induced meiotic abnormalities
Design: Morphological study.
Setting: Laboratory for Reproductive Medicine, Marine Biological Laboratory,
Brown University.
Animal(s): Six-week-old CD-1 mice superovulated with pregnant mare’s serum
gonadotropin (PMSG).
Intervention: Imature oocytes were submited to IVM in the presence of either
arsenite or arsenite plus N-acetylcysteine and evaluated either by pol-scope imaging
or fluorescent microscopy.
Main outcome measure: The study examined meiotic spindle morphologic features
and chromosome alignments.
Results: In vitro arsenite treatment produced oocyte meiotic anomalies,
characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment, which were
dose and time dependent. Exposure to either 2 µg/ml of arsenite during 12-14 h or 8
µg/ml for 2 h arrested completely oocyte maturation. Exposure to 2 or 4 µg/ml of
arsenite for 2 h caused meiotic anomalies, respectively, in 75% and 80% of in vitro
treated oocytes (60% and 80% of abnormal MI oocytes, respectively) after 12-14 h in
culture. However, after 15-17 h in IVM culture, many oocytes (65.2%) treated with 2
µg/ml of arsenite for 2 h reached MII stage, with 43.5% exhibiting abnormalities.
Co-administration of N-acetylcysteine prevented meiotic abnormalities and the delay
31
in IVM induced by arsenite treatment, producing rates of normal MII oocytes after
12-14 h in IVM culture comparable to control cultures.
Conclusions: Our data demonstrate that in vitro arsenite treatment caused meiotic
abnormalities, which apparently could be prevented by in vitro co-administration of
N-acetylcysteine. These findings also suggest that arsenite-induced meiotic
aberrations can be mediated by reactive oxygen species.
Key words: arsenite, meiosis, in vitro maturation, N-acetylcysteine, antioxidant
32
INTRODUÇÃO
O arsênio inorgânico é um elemento onipresente no meio ambiente, onde
aparece principalmente como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+).
Pequenas quantidades de arsênio inorgânico estão normalmente presentes nas rochas,
no solo, na água, no ar e em certos alimentos (1). Entretanto, altos níveis deste
elemento podem resultar em contaminação ambiental, como a presente em diversos
países, distribuídos ao longo de todo o mundo (2,3). A preocupação com a
contaminação ambiental por este metal pesado e suas possíveis conseqüências para a
saúde populacional tem crescido continuamente em diferentes países.
Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio inorgânico constitui-se em um
dos principais contaminantes ambientais, vultosos fundos têm sido dispensados no
sentido de se estudar os possíveis efeitos deletérios deste metal pesado a nível
populacional (4,5).
Este elemento tem sido exaustivamente estudado como um agente
teratogênico em mamíferos. O seu potencial para promover toxicidade
desenvolvimental tem sido investigado tanto em algumas espécies de animais de
laboratório, como, epidemiologicamente, em seres humanos (5-13). Apesar do
grande número de estudos sobre a toxicidade desenvolvimental do arsênio
inorgânico, não encontramos, na literatura, estudos sobre os seus possíveis efeitos na
promoção de anomalias na meiose oocitária. A meiose é uma fase do ciclo celular
especialmente sensível aos efeitos deletérios de diversos agentes estressantes. Em
seres humanos, a duração da primeira divisão meiótica pode ser extremamente longa,
uma vez que a mesma é iniciada durante a vida intra-uterina e somente se completa
no menacme, se ocorrer a ovulação. Durante esta longa prófase da primeira divisão
33
meiótica, os oócitos estão susceptíveis a diversos agentes externos, incluindo
possíveis poluentes ambientais, entre os quais talvez possamos incluir o arsenito. Ao
mesmo tempo, existem diversas evidências de que distúrbios desta fase constituem-
se em uma das principais causas de aneuploidias humanas (14-16), o que justifica o
interesse particular no estudo de possíveis agentes capazes de comprometer esta fase
do ciclo celular.
O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a produção de
radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares (17-19). Existem
numerosas evidências de que o estresse oxidativo, dependendo de sua severidade,
pode promover a danificação de diversas proteínas intracelulares (20,21), algumas
das quais são importantes para a organização do fuso celular (22-24) e, ao mesmo
tempo lesar, diretamente, o DNA e induzir o mal alinhamento cromossômico (25,26).
Alguns estudos, por sua vez, demonstraram que a administração de antioxidantes,
como a N-acetil-cisteína, preveniu a produção de radicais livres do oxigênio e alguns
dos efeitos tóxicos promovidos pelo arsênio inorgânico (27), sugerindo serem estes
efeitos mediados, pelo menos em parte, pelo estresse oxidativo. A N-acetil-cisteína é
um precursor da glutationa, o antioxidante intracelular mais abundante, importante
para a manutenção da integridade celular e envolvido na proteção contra o estresse
oxidativo induzido pelo arsênio inorgânico (28). Estes dados estimularam a nossa
hipótese de que o arsenito poderia comprometer a meiose oocitária através da
produção de radicais livres do oxigênio, o que, pelo menos em parte, poderia ser
revertido com uso de antioxidantes, como a N-acetil-cisteína. Devido à escassez de
informações disponíveis no momento sobre os possíveis riscos da exposição animal
e, em última instância, da exposição humana ao arsênio, elemento claramente
34
reconhecido como contaminante ambiental, torna-se imperativo a obtenção de dados,
inicialmente, de estudos in vitro bem conduzidos, com o intuito de se determinar a
sua potencial toxicidade meiótica em células germinativas, o que, pelo menos em
parte, justificaria a sua toxicidade desenvolvimental.
Alguns estudos experimentais, realizados no sentido de se procurar elucidar
os efeitos in vitro deste poluente ambiental em diferentes espécies e tipos celulares,
demonstraram que o camundongo é o melhor modelo animal para o estudo da
toxicidade aguda pelo arsênio inorgânico (29), o que justifica a sua seleção no
presente estudo. Dentre os dois principais compostos do arsênio inorgânico, optamos
pelo estudo dos efeitos do arsenito, a forma trivalente do arsênio inorgânico, em
virtude de sua maior toxicidade quando comparada à forma pentavalente (arsenato) e
ao fato de ser este o principal agente arsenical responsável pelos efeitos tóxicos
atribuídos a este metal (13).
No presente estudo foram investigados os efeitos in vitro do arsenito na
meiose de oócitos submetidos à maturação in vitro, bem como o efeito da co-
administração de N-acetil-cisteína na prevenção das anomalias meióticas induzidas
por este agente.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes e Animais
Todos os reagentes foram comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO), com exceção dos listados a seguir. A gonadotrofina sérica de égua prenha
(PMSG), que foi utilizada para a superovulação, foi comprada da Calbiochem (La
Jolla, CA). Foram utilizadas, no presente estudo, camundongas CD1 com 6 semanas
35
de vida, compradas do Charles River Laboratory (Boston, MA). Os animais foram
aclimatizados por 1 semana antes de serem incluídos nos experimentos e estiveram
sob um ciclo de 14 horas na presença de luz e 10 horas no escuro. O presente projeto
de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animais do Marine Biological
Laboratory e do Women and Infants Hospital e os animais receberam os cuidados
estabelecidos pelo protocolo de cuidados animais aprovados por estes dois comitês.
As camundongas foram submetidas a superovulação por meio da injeção intra-
peritoneal de 5 IU de PMSG, seguida após 44-48 horas pelo sacrifício dos animais
para a obtenção dos oócitos imaturos, que foram utilizados nos experimentos de
maturação in vitro (IVM).
Tratamento In Vitro
A solução de estoque de arsenito sódico (1 mg/ml) foi preparada em água
duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. As
soluções de trabalho utilizadas no presente estudo (2, 4 e 8 µg/ml) foram obtidas pela
diluição da solução de estoque em meio de cultivo para maturação in vitro (IVM).
Foram determinados os efeitos in vitro de diferentes concentrações (2, 4 e 8 µg/ml) e
tempos de exposição ao arsenito (durante as 2 primeiras horas da cultura para IVM
ou durante todo o processo de IVM, ou seja, 12-14 horas) na progressão meiótica de
oócitos de camundongos submetidos à IVM.
A solução de estoque de N-acetil-cisteína (100 mg/ml) foi preparada em água
duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. A
solução de trabalho utilizada no presente estudo (30 mM) foi obtida pela diluição da
solução de estoque em meio de cultivo para IVM contendo 2 µg/ml de arsenito.
Excluído: camundongos
Excluído: , seguida após 46-48 horas da injeção intraperitoneal de 5 IU de gonadotrofina coriônica humana (hCG)
36
Obtenção de Oócitos Imaturos e Maturação In Vitro
O isolamento e o cultivo dos oócitos imaturos foram realizados de acordo
com protocolos descritos previamente (30). Para a obtenção de oócitos imaturos, as
fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical 44-48 horas após a injeção do
PMSG. Foi realizada a ooforectomia bilateral e a punção dos folículos ovarianos em
HKSOM a 34-37°C, para a obtenção dos oócitos imaturos envoltos pelos complexos
de células do cumulus. Os oócitos desnudos, não envoltos pelas células do cumulus,
não foram utilizados nos experimentos. Os complexos intactos de células do cumulus
e oócitos em estágio de vesícula germinal foram lavados 3 vezes em meio de cultivo
para maturação in vitro (Minimum Essential Medium – GIBCO, Grand Island, NY,
suplementado com 10% de albumina fetal bovina e 5 IU de PMSG/ml) e, após,
colocados em poços contendo: 1. apenas meio de cultivo para IVM (grupo controle);
2. meio de cultivo para IVM suplementado com diferentes concentrações e tempos
de exposição ao arsenito (2, 4 ou 8 µg/ml de arsenito apenas durante as 2 primeiras
horas da cultura para IVM ou 2 µg/ml de arsenito durante 12-14 ou 15-17 horas); 3.
meio de cultivo para IVM suplementado com 2 µg/ml de arsenito + 30 mM de N-
acetil-cisteína apenas durante as 2 primeiras horas da cultura para IVM. As placas de
Petri contendo os complexos oócitos-cumulus foram colocadas na incubadora a
37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado. Nos experimentos em que foi utilizada a
exposição in vitro ao arsenito ou ao arsenito + N-acetil-cisteína apenas durante as 2
primeiras horas do processo de IVM, as placas de Petri foram retiradas da incubadora
após este período, os complexos oócitos-cumulus, lavados pelo menos 3 vezes em
meio de cultura para IVM, e, após, mantidos neste meio até se completar 12-14 ou
15-17 horas de cultura. No grupo controle e no tratado com 2 µg/ml de arsenito por
37
12-14 horas, as placas de Petri foram mantidas na incubadora durante todo o
processo de IVM (12-14 horas). Após este tempo em cultura, as células do cumulus
foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM contendo 0,03% de
hialuronidase. Os oócitos livres das células do cumulus foram lavados 3 vezes em
HKSOM para a completa remoção da hialuronidade, lavados novamente 3 vezes em
KSOM pré-equilibrado e então colocados na incubadora por 30 minutos, a 37°C, em
7% de CO2 e em ar umidificado, para serem posteriormente submetidos a avaliação
pela microscopia de polarização (pol-scope) ou fixação para realização de
microscopia de fluorescência, para a avaliação do fuso celular e da distribuição
cromossômica, como descrito a seguir.
Todos os procedimentos de manipulação oocitária foram realizados em placas
de Petri colocadas sobre uma placa aquecida para a adequada manutenção da
temperatura entre 34-37°C.
Microscopia de Fluorescência da Tubulina e da Cromatina
Os oócitos desnudos foram fixados e extraídos durante 30 minutos a 37°C em
um tampão estabilizador de microtúbulos (31,32). O oócitos foram lavados pelo
menos 3 vezes e bloqueados dutante a noite, a 4°C, em um meio de lavagem (PBS
suplementado com 0,02% de NaN3, 0,01% de Triton X-100, 0,2% de leite desnatado,
2% de soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de glicina). Após, os
oócitos foram incubados com anticorpos monoclonais de camundongo anti β-
tubulina (1:150), lavados e então incubados com isotiocianato de fluorisceína (FITC)
conjugado com IgG anti imunoglobulina de camundongo (1:200; Molecular Probes,
OR) a 37°C durante 2 horas. Após serem lavadas novamente, as amostras foram
38
colocadas sobre uma lâmina de vidro, coradas com Hoechst 33342 (10 µg/ml) em
meio de montagem constituído por Vectashield (H-1000, Vectyor) e presas pela
colocação de lamínulas. As amostras foram analisadas em um microscópio invertido
de fluorescência (Zeiss Axiovert 100T) e as imagens foram capturadas pelo software
Axio Vision 3.0.
Microscopia de Polarização (Pol-Scope)
Os fusos celulares de alguns oócitos foram imageados usando um
microscópio invertido (Zeiss Axiovert 100), equipado com uma vídeo câmera Cohu e
o com o hardware do pol-scope, o qual consiste de cristais elétricos e de um
controlador eletro-óptico (Cambridge Research & Instrumentation, Boston, MA)
(33,34). Os grupos de cristais elétricos foram controlados pelo computador através
do software MetaMorph (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos foram
imageados a 37°C, em poços de 100 µl de HKSOM, em placas de Petri revestidas
com vidro na parte inferior (MatTek Corp., Ashland, MA), colocadas sobre uma
placa aquecida a 37-38°C. O microscópio ficava contido em uma câmara isolada de
aço inoxidável, permitindo o adequado controle térmico que foi mantido em torno de
37 -38°C.
Para controlar algumas variações experimentais entre os oócitos,
especialmente a temperatura e o tempo após a coleta dos mesmos, foram realizadas,
para cada grupo, 3-4 réplicas de experimentos, sendo que apenas 4-5 oócitos foram
analisados em cada experimento.
O pol-scope, como descrito em estudos anteriores (33-37), possibilita a
visualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de
39
fixação ou coloração. Os fusos celulares são estruturas birrefringentes e, portanto,
passíveis da avaliação não invasiva por esta tecnologia. A racionalidade do uso do
pol-scope neste estudo foi avaliar se as anomalias do fuso celular causadas pelo
arsenito, caso confirmadas, poderiam ser detectadas por meio desta técnica inócua e
não invasiva, o que poderia ter implicações clínicas potenciais.
Caracterização das Anomalias da Meiose
Definimos como anomalias meióticas a presença de alterações do fuso celular
(perda total ou parcial da integridade de suas fibras e/ou de sua forma normal de
barril) e/ou mal alinhamento cromossômico (deste 1 único cromossomo mal alinhado
até o completo desalinhamento e/ou espalhamento cromossômico no interior celular).
A microscopia de fluorescência possibilita a avaliação detalhada destas 2 variáveis,
ao passo que a microscopia de polarização (pol-scope), como já descrito
anteriormente, possibilita a adequada análise apenas da morfologia do fuso celular.
RESULTADOS
Anomalias na meiose oocitária durante o processo de maturação in vitro
O tratamento in vitro com arsenito produziu anomalias meióticas em oócitos
de camundongo submetidos à maturação in vitro (Tab. 1 e 2; Fig 1 e 2).
Pela microscopia de fluorescência (Tab. 1), evidenciamos que no grupo
controle, vinte e seis de 27 oócitos (96,3%) completaram adequadamente o processo
de maturação in vitro (IVM), atingindo com normalidade a metáfase II após 12-14 h
em cultura. Na Fig. 1A visualizamos a imagem de um oócito controle, apresentando
o fuso celular morfologicamente normal em metáfase II e os cromossomos
40
apropriadamente distribuídos e alinhados. A exposição a 2 µg/ml de arsenito por 12-
14 h ou a 8 µg/ml por 2 h, bloqueou a maturação oocitária no estágio de vesícula
germinal (em respectivamente, 64.7% e 20% dos oócitos avaliados), ou de GVBD
(em respectivamente, 35.3% e 80% dos oócitos estudados), após 12-14 h de cultura.
A exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou atraso no processo de IVM e
anormalidades meióticas em, respectivamente, 75% e 80% dos oócitos avaliados.
Quatorze dos 20 oócitos (70%), submetidos à IVM na vigência de 2 µg/ml de
arsenito por 2 h, e 16 dos 20 oócitos (80%), submetidos à IVM na vigência de 4
µg/ml de arsenito por 2 h, apresentaram aberrações na primeira divisão meiótica,
após 12-14 h em cultura. Todavia, após 15-17 h em cultura, 15 dos 23 (65.2%)
oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a metáfase II, dos quais
66,7% (10 dos 15 oócitos que atingiram a segunda divisão meiótica) exibiram
anormalidades (Tab. 1). Nas Fig. 1B, C e D visualizamos exemplos de oócitos
apresentando anomalias meióticas, caracterizadas por perda da integridade do fuso
celular e mal alinhamento cromossômico, após 12-17 horas de IVM na vigência de 2
µg/ml de arsenite por 2 horas (vide legenda para maiores detalhes).
Pela microscopia de polarização (Tab. 2), evidenciamos que no grupo
controle, todos os 19 oócitos avaliados completaram o processo de maturação in vitro
(IVM), apresentando fusos celulares morfologicamente normais após 12-14 h em
cultura (Fig. 2A). A exposição a 2 µg/ml de arsenito por 12-14 h ou a 8 µg/ml por 2
h, bloqueou a maturação oocitária no estágio de vesícula germinal (em
respectivamente, 80% e 20% dos oócitos avaliados), ou de GVBD (em
respectivamente, 20% and 80% dos oócitos estudados), após 12-14 h de cultura. A
exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou atraso no processo de IVM e
41
anormalidades meióticas em, respectivamente, 75% e 90,9% dos oócitos avaliados.
Oito dos 12 oócitos (66,7%), submetidos à IVM na vigência de 2 µg/ml de arsenito
por 2 h, e 10 dos 11 oócitos (90,9%), submetidos à IVM na vigência de 4 µg/ml de
arsenito por 2 h, apresentaram aberrações no fuso celular da primeira divisão
meiótica, após 12-14 h em cultura. Entretanto, após 15-17 h em cultura, oito dos 11
(72,7%) oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a metáfase II, dos
quais 62,5% (5 dos 8 oócitos que atingiram a segunda divisão meiótica) exibiram
anormalidades (Tab. 2). Nas figuras 2B e C, são apresentados, respectivamente,
fusos celulares completamente ou parcialmente desintegrados de oócitos submetidos
à IVM na vigência de 2 µg/ml de arsenito nas 2 primeiras horas do processo de IVM
(vide legenda para maiores detalhes).
Obtivemos dados similares com o uso da microscopia de polarização e de
fluorescência no presente estudo.
Co-administração de N-acetil-cisteína e anomalias meióticas induzidas pelo
arsenito durante o processo de maturação in vitro
Enquanto a exposição a 2 µg/ml de arsenito nas 2 primeiras horas do processo
de IVM promoveu anormalidades meióticas em 80% e 75% dos oócitos avaliados,
respectivamente, pela microscopia de fluorescência e de polarização, após 12-14
horas de cultura, a co-administração de N-acetil-cisteína completamente preveniu a
detecção das anomalias meióticas induzidas pelo arsenito. Dos oócitos analisados,
submetidos à exposição concomitante a 2 µg/ml de arsenito e 30 mM de N-acetil-
cisteína durante as 2 primeiras horas do processo de IVM, 96,4% e 100%
42
alcançaram normalmente a metáfase II, segundo a análise, respectivamente, pela
microscopia de fluorescência e de polarização (Tab. 3; Fig. 3).
DISCUSSÃO
Os nossos dados demonstraram que a exposição in vitro ao arsenito promoveu
anomalias meióticas durante o processo de maturação in vitro de oócitos de
camundongo. As anomalias meióticas secundárias à administração do arsenito foram
dependentes da dose e do tempo de exposição a este agente. Desta forma, a
exposição a uma baixa concentração de arsenito (2 µg/ml), durante todo o processo
de maturação in vitro (12-14 horas), ou a uma elevada concentração (8 µg/ml),
apenas durante as 2 primeiras horas deste processo, bloqueou completamente a
maturação oocitária. Já a exposição a baixas concentrações de arsenito (2 ou 4
µg/ml) apenas durante as 2 primeiras horas do processo de IVM causou tanto atraso
no processo de IVM, uma vez que a maioria dos oócitos avaliados não atingiu a
segunda divisão meiótica após 12-14 horas em cultura, como elevada incidência de
anormalidades meióticas, sobretudo aberrações na metáfase da primeira divisão
meiótica. A prolongação do tempo de cultura para 15-17 horas reverteu parcialmente
este bloqueio do processo de IVM, uma vez que a maioria dos oócitos tratados com 2
µg/ml de arsenito durante as 2 primeiras horas da IVM (65.2%) atingiu a segunda
divisão meiótica, sem, contudo, prevenir a ocorrência de anomalias meióticas.
Apesar da microscopia de polarização permitir a avaliação apenas das características
do fuso celular, não possibilitando a análise do alinhamento cromossômico, houve
similaridade entre os dados obtidos por este método e pela microscopia de
fluorescência. A provável justificativa deste achado foi a concomitância de
43
anomalias do fuso celular e da distribuição cromossômica na imensa maioria dos
oócitos que apresentaram anormalidades meióticas produzidas pelo arsenito. Este
fato sugeriu que a utilização da microscopia de polarização poderia ser útil na
triagem de possíveis anormalidades, não só do fuso celular, como, indiretamente, do
alinhamento cromossômico, em células germinativas femininas, expostas a este
elemento. Como alguns estudos evidenciaram ser esta uma técnica inócua em oócitos
humanos (38-40), sugerimos que o pol-scope poderia ter aplicabilidade prática na
triagem de possíveis anomalias meióticas em oócitos humanos, oriundos de mulheres
expostas a este contaminante ambiental, previamente aos procedimentos de
reprodução assistida, o que precisa ser mais bem avaliado.
Como citado anteriormente, este metal pesado tem sido exaustivamente
estudado como um agente teratogênico em mamíferos, sendo que o seu potencial
para promover toxicidade desenvolvimental tem sido investigado em algumas
espécies de animais de laboratório (7-13). Dados oriundos de estudos com animais
demonstraram que o arsênio inorgânico pode causar malformações e óbito fetais,
bem como retardo de crescimento intra-útero (7-13). Informações sobre a toxicidade
desenvolvimental do arsênio inorgânico em seres humanos limitam-se a uns poucos
estudos epidemiológicos de populações expostas a este contaminante pelas vias oral
e inalatória (5,6,13). Alguns destes estudos evidenciaram um aumento na incidência
de abortamento espontâneo, natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das
populações expostas. Contudo, a interpretação destes dados é complicada, devido à
exposição concomitante destas populações a diversos poluentes e à possível presença
de outras variáveis não avaliadas nestes estudos, o que dificulta a análise dos efeitos
isolados da contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres humanos. Os
44
mecanismos responsáveis pela toxicidade desenvolvimental atribuída ao arsenito não
foram elucidados até o presente. Torna-se relevante a investigação se a exposição
ambiental a este poluente é capaz de promover disfunção oocitária e embrionária em
animais e mulheres residentes em áreas contaminadas. Todavia, os dados do presente
estudo, ao evidenciarem a capacidade do arsenito de promover, in vitro, anomalias
meióticas em células germinativas, podem dar subsídios, pelo menos em parte, para
se justificar a toxicidade reprodutiva deste metal pesado, o que precisa ser mais bem
avaliado por meio de estudos dos efeitos in vivo deste agente.
Os mecanismos responsáveis pelos efeitos tóxicos do arsenito na meiose
oocitária não foram bem esclarecidos até o momento, contudo, presumivelmente
envolvam a disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo (17-19,41,42). Como
descrito anteriormente, o arsenito pode comprometer a função mitocondrial e
estimular a produção de radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos
celulares (17-19). O estresse oxidativo, por sua vez, pode danificar diversas proteínas
intracelulares (20,21), algumas das quais são importantes para a organização do fuso
celular (22-24) e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar o DNA e induzir o
mal alinhamento cromossômico (25,26), produzindo, desta forma, anormalidades no
ciclo celular. Inclusive, há evidências de que o arsenito seja capaz de ocasionar estes
efeitos deletérios sobre o fuso celular e a integridade cromossômica em alguns tipos
celulares, possivelmente em virtude da indução da produção de radicais livres do
oxigênio (43). As anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência
do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade
do oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser
fertilizado, até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que
45
não impossibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o
desenvolvimento embrionário pré e/ou pós-implantação, bem como a viabilidade
futura do concepto (44-46).
Os nossos achados de que as anomalias meióticas induzidas pelo arsenito
puderam ser revertidas pela co-administração de N-acetil-cisteína, corroboraram os
dados da literatura (27) e sugeriram que a produção de radicais livres do oxigênio
possa estar envolvida na toxicidade deste agente à meiose oocitária. A análise da
viabilidade funcional dos oócitos expostos in vitro, concomitantemente, ao arsenito e
à N-acetil-cisteína, por meio da realização de fertilização in vitro e avaliação do
desenvolvimento embrionário pré e pós-implantação, seria de grande valia no sentido
de determinarmos se este antioxidante é capaz de prevenir, não somente as anomalias
morfológicas meióticas, como também as possíveis anomalias funcionais destas
células germinativas.
Nossos dados demonstraram que a exposição in vitro ao arsenito induziu
anomalias na meiose oocitária, dependentes da dose e do tempo de exposição a este
agente. A co-administração de N-acetil-cisteína preveniu, pelo menos aparentemente,
as anomalias meióticas induzidas pelo arsenito, sugerindo serem as mesmas, pelo
menos em parte, decorrentes do estresse oxidativo estimulado por este metal pesado.
Este estudo também forneceu um modelo para a avaliação dos efeitos in vitro de
outros metais pesados na meiose oocitária, durante o processo de maturação in vitro .
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51
Tabela 1. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos de camundongos, tratados in
vitro com diferentes concentrações de arsenito, após cultura para maturação in vitro.
Arsenito
(ug/ml)
Tempo
Exposição
(h)
No.
Total
Oócitos
GV
n
GVBD
n
Metáfase I
Normal Anormal
n n
Telófase I
Normal Anormal
n n
Metáfase II
Normal Anormal
n n
0 12-14 27 1 26
2 12-14 17 11 6
2 2 20 1 12 2 2 2 1
2* 2 23 8 5 10
4 2 20 3 16 1
8 2 25 5 20
GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown. *: 15-17h em cultura para maturação in vitro; Demais: 12-14h em cultura para maturação in vitro. Anormal: anomalias no fuso celular e/ou no alinhamento/distribuição cromossômicos.
Tabela 2. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos de camundongos, tratados in vitro com diferentes
concentrações de arsenito, após cultura para maturação in vitro.
Arsenito
(ug/ml)
Tempo
Exposição
(h)
No.
Total
Oócitos
GV
n
GVBD
n
Metáfase I
Normal Anormal
n n
Telófase I
Normal Anormal
n n
Metáfase II
Normal Anormal
n n
0 12-14 19 19
2 12-14 10 8 2
2 2 12 1 7 1 1 1 1
2* 2 11 3 3 5
4 2 11 9 1 1
8 2 10 2 8
GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown. *: 15-17h em cultura para maturação in vitro. Demais: 12-14h em cultura para maturação in vitro. Anormal: anomalias no fuso celular.
52
Tabela 3. Microscopia de fluorescência e de polarização de oócitos de camundongos, tratados in vitro com arsenito ou
com arsenito e N-acetil-cisteína, após cultura para maturação in vitro.
Método
Tratamento Tempo
Exposição
(h)
No.
Total
Oócitos
Metáfase I
Normal Anormal
n n
Telófase I
Normal Anormal
n n
Metáfase II
Normal Anormal
n n
M. Fluorescência As 2 20 13 2 2 2 1
As+NAC 2 28 1 27
M. Polarização As 2 12 1 7 1 1 1 1
As+NAC 2 11 11
M: microscopia; As: arsenito; NAC: N-acetil-cisteína. Dose: 2ug/ml de arsenito por 2 h; 30 mM de NAC por 2 h; Tempo em cultura para maturação in vitro: 12-14 h.
53
54
55
5 ARTIGO 2
56
EFEITOS DO ARSENITO NA MEIOSE, NO DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO E NA APOPTOSE EMBRIONÁRIA
DE CAMUNDONGOS
Paula A. A. S. Navarro1,2,3 , Lin Liu1,2, Rui A. Ferriani3 e David L.
Keefe1,2,4
1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Women & Infants Hospital,
Brown University, Providence, Rhode Island 02905
2 Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543
3 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de
Ribeira o Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo
14049-000, Brasil
4Correspondência para: Dr. David L. Keefe Brown University, Women and Infants Hospital, and Marine Biological Laboratory 7 MBL Street Woods Hole, MA 02543 USA Tel: (508) 289 7649 Fax: (508) 540 6902 E-mail: [email protected]
Título curto: Arsenito, meiose e desenvolvimento embrionário pré-implantação
Palavras chave: arsenito, anomalias meióticas, desenvolvimento embrionário pré-
implantação, apoptose.
57
RESUMO
O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de
respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da
função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e
carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do
comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na
oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento
embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos.
Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média
dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias,
durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de
anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal
alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in
vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com
arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas
de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96
h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de
núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e
de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior
nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes
dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir
tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação,
como para a apoptose embrionária.
58
ABSTRACT
Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress
responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by
growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental
effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on
oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development,
and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low
(0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal
injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of
meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal
misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro
treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h,
morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups.
Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly
differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was
significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group.
These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to
decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.
Short title: Arsenite, meiosis, and preimplantation development
Key words: arsenite, meiotic abnormalities, preimplantation development, apoptosis.
59
INTRODUÇÃO
O arsênio inorgânico é onipresente no meio ambiente, onde aparece
principalmente como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+). Pequenas
quantidades de arsênio estão normalmente presentes nas rochas, no solo, na água, no
ar e em certos alimentos [1], entretanto, altos níveis podem resultar em contaminação
ambiental. Os seres humanos geralmente estão expostos ao arsênio oriundo de fontes
naturais, apresentando uma ingestão diária tipicamente na faixa de 12-40 µg/dia
[2,3]. Contudo, existem depósitos minerais naturais, em certas regiões dispersas pelo
mundo, como em Taiwan, México, Argentina, Índia e Estados Unidos [4,5], com
quantidades suficientes de arsênio inorgânico para contaminar os reservatórios de
água e se constituírem em risco potencial para a saúde populacional. Na Índia, por
exemplo, os níveis de arsênio excedem 300 µg/l em cerca de 27% dos suprimentos
de água e 1 mg/l, em 5% dos reservatórios [6], sendo muitas vezes superior ao nível
máximo permitido nos Estados Unidos, que é de 50 µg/l. Apesar de os reservatórios
de água dos Estados Unidos apresentarem, em geral, baixas concentrações de
arsênio, existem relatos de contaminação por este poluente em porções do Sudeste,
onde os níveis de arsênio na água atingem até mais de 1 mg/l [7,8]. Além da
exposição oral e crônica por meio da ingestão de água e alimentos contaminados pelo
arsênio, a exposição pela via inalatória também é tóxica e pode comprometer os
indivíduos que trabalham ou residem nas imediações de regiões com contaminação
do ar por este metal [9,10].
A preocupação com a contaminação ambiental por este metal e suas possíveis
conseqüências para a saúde populacional é tamanha, que numerosas agências
internacionais têm procurado reduzir os níveis aceitáveis do mesmo na água de 50
Excluído:
Excluído: e de outras partes do país
Excluído: c
Excluído: c
Excluído: ocorrer
Excluído: em
60
para 10 µg/l. Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio inorgânico
constitui-se em um dos contaminantes ambientais presente tanto na Lista de
Prioridades Nacionais dos Estados Unidos [11], como na da Agência de Proteção
Ambiental Norte Americana, vultosos fundos têm sido dispensados no sentido de se
estudar os efeitos deletérios deste metal pesado a nível populacional e as possíveis
formas de se controlar e prevenir a contaminação ambiental [12].
Estudos epidemiológicos têm mostrado que a exposição crônica ao arsênio
inorgânico pode promover lesões hepáticas, neuropatia periférica, além de aumento
da incidência de câncer de pulmão, pele, bexiga e fígado em seres humanos [13].
Este metal pesado também tem sido exaustivamente estudado como um agente
teratogênico em mamíferos, sendo que o seu potencial para promover toxicidade
desenvolvimental tem sido investigado em algumas espécies de animais de
laboratório [14-21]. Dados oriundos de estudos com animais demonstraram que o
arsênio inorgânico pode causar malformações e óbito fetais, bem como retardo de
crescimento intra-útero [14-21]. A toxicidade desenvolvimental deste metal é
dependente da dose, da via de administração e do tempo de exposição [21].
Informações sobre a toxicidade reprodutiva e desenvolvimental do arsênio
inorgânico em seres humanos limitam-se a uns poucos estudos epidemiológicos de
populações expostas a este contaminante pelas vias oral e inalatória [11-14, 21].
Alguns destes estudos evidenciaram um aumento na incidência de abortamento
espontâneo, natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das populações
expostas. Contudo, a interpretação destes dados é complicada, em virtude da
exposição concomitante destas populações a diversos poluentes e da possível
presença de outras variáveis não analisadas nestes estudos, o que dificulta a análise
Excluído: c
Excluído: c
Excluído: c
Excluído: c
Excluído: dada
Excluído: à
Excluído: à
61
dos efeitos isolados da contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres
humanos [11-14, 21]. Devido à escassez de informações e às limitações acima
descritas, torna-se relevante a obtenção de dados originados de estudos bem
conduzidos, utilizando modelos animais adequadamente estabelecidos, para
tentarmos predizer os possíveis riscos da exposição humana a este contaminante no
que se refere a sua potencial toxicidade embrionária e fetal.
Apesar do grande número de estudos sobre a toxicidade desenvolvimental do
arsênio inorgânico, dados acerca de seus possíveis efeitos na meiose, no
desenvolvimento embrionário pré-implantação e na promoção de apoptose
embrionária são bastante escassos e limitam-se a uns poucos estudos dos efeitos in
vitro deste metal. O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a
produção de radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares de
mamíferos [22-25]. O estresse oxidativo, dependendo de sua severidade, pode
promover apoptose em embriões pré-implantação [26]. Recentemente, evidenciou-se,
em diferentes modelos animais, que a apoptose ou morte celular programada
ocorrem em embriões que falham na execução de eventos essenciais para seu
adequado desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular [27]. Contudo, até o
presente momento, desconhece-se se a exposição a contaminantes ambientais, como
o arsênio inorgânico, promove estresse oxidativo e apoptose em embriões de
mamíferos. Como previamente demonstramos que o comprometimento da função
mitocondrial produz importantes efeitos tóxicos aos oócitos e ao desenvolvimento
embrionário [28,29], e como o arsênio inorgânico sabidamente altera a atividade
desta organela celular e provoca estresse oxidativo e apoptose em diferentes tipos
celulares, levantamos a hipótese de que o arsênio inorgânico poderia comprometer a
Excluído: Dada
Excluído: a
Excluído: a
Excluído: desenvolvimental
Excluído: c
Excluído: c
Excluído: a
Excluído: c
Excluído: nos
Excluído: no
Excluído: c
Excluído: c
62
meiose oocitária e o desenvolvimento pré-implantação, bem como estimular a
apoptose embrionária. Dentre os dois principais compostos do arsênio inorgânico,
optamos pelo estudo dos efeitos do arsenito, a forma trivalente do arsênio inorgânico,
em virtude da sua maior toxicidade quando comparada à forma pentavalente
(arsenato) e ao fato de ser este o principal agente arsenical responsável pelos efeitos
tóxicos atribuídos a este metal [21].
No presente estudo foram investigados os efeitos do tratamento in vivo com
arsenito na meiose de oócitos in vivo ovulados e in vitro maturados, no
desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária, em
camundongos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes e Animais
Todos os reagentes foram comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO), com exceção dos listados a seguir. A gonadotrofina sérica de égua prenha
(PMSG), que foi utilizada para a superovulação, foi comprada da Calbiochem (La
Jolla, CA). Foram utilizados no presente estudo camundongos CD1 (fêmeas com 6
semanas de vida e machos com 2-3 meses) comprados do Charles River Laboratory
(Boston, MA). Os animais foram aclimatizados por 1 semana antes de serem
incluídos nos experimentos e estiveram sob um ciclo de 14 horas na presença de luz
e 10 horas no escuro. O presente projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de
Cuidados Animais do Marine Biological Laboratory e do Women and Infants
Hospital e os animais receberam os cuidados estabelecidos pelo protocolo de
Excluído: c
Excluído: e
Excluído: c
Excluído: e
Excluído: e
Excluído: 8 a 10 semanas
Excluído: camundongos
63
cuidados animais aprovados por estes dois comitês. As camundongas foram
submetidas a superovulação por meio da injeção intra-peritoneal de 5 IU de PMSG.
Tratamento com Arsenito
Uma solução de estoque de arsenito sódico (1 mg/ml) foi preparada em água
duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. As
soluções de trabalho utilizadas no presente estudo foram obtidas pela diluição da
solução de estoque em água duplamente destilada.
Previamente à indução da ovulação, as camundongas foram tratadas ou com
baixa (8 mg/kg ou 0,16 mg) ou com média dose de arsenito (16 mg/kg ou 0,32 mg)
por meio de 1 injeção intraperitoneal (ip) a cada 2 dias durante 14 dias, totalizando 7
injeções para cada animal. Os controles foram submetidos à injeção ip de água
destilada.
Nestes experimentos, visávamos determinar se o arsenito poderia causar
anomalias meióticas oocitárias, comprometimento do desenvolvimento embrionário
pré-implantação e apoptose embrionária em animais expostos a este poluente
ambiental, mesmo na ausência de toxicidade materna, o que poderia ser útil na
avaliação do risco potencial de populações vivendo em regiões contaminadas por
este metal pesado sem a evidência de comprometimento orgânico. Foi utilizada,
portanto, uma dose baixa de arsenito, sendo escolhida a dose de 8 mg/kg, em virtude
de estudos prévios terem determinado ser esta a menor dose capaz de produzir
toxicidade desenvolvimental em camundongas grávidas, na ausência de promoção de
efeitos adversos maternos [30].
Excluído: , seguida após 46-48 horas da injeção intraperitoneal de 5 IU de gonadotrofina coriônica humana (hCG)
Excluído: como a
64
Estudos comparando a administração do arsenito por injeção parenteral (ip) e
por sondagem oro-gástrica evidenciaram que, quando se administrava a mesma dose
por ambas as vias, a freqüência de óbito embrionário e de malformações fetais era
maior pela via injetável do que pela enteral, ao mesmo tempo em que a mortalidade
materna era menor pela via parenteral [21]. Estes dados justificam a seleção pela via
de administração ip neste estudo.
Foi estabelecida a administração do arsenito ao longo de 14 dias para
mimetizarmos uma curta exposição crônica ao referido metal e a cada 2 dias para
evitarmos o alto nível de estresse ao qual os animais foram submetidos
secundariamente às injeções, o que poderia simular efeitos adversos a este metal,
mimetizando um possível efeito tóxico secundário ao tratamento com arsenito nos
animais tratados.
Ambas as doses de arsenito utilizadas ao longo do presente estudo não foram
tóxicas para todos os animais tratados.
Obtenção de Oócitos e de Embriões e Cultivo In Vitro
Para a obtenção dos oócitos maduros ovulados in vivo, as fêmeas foram
sacrificadas por deslocamento cervical 14 horas após a injeção de 5 IU ip de
gonadotrofina coriônica humana (hCG), a qual foi administrada 46-48 horas após a
administração do PMSG. Os complexos oócitos-cumulus foram liberados da ampola
do oviduto em meio de cultivo otimizado com potássio e tamponado com HEPES
(HEPES-buffered potassium simplex optimized médium, HKSOM) a 34-37°C. Os
demais procedimentos também foram realizados em placas de Petri colocadas sobre
uma placa aquecida para a adequada manutenção da temperatura entre 34-37°C. As
65
células do cumulus foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM
contendo 0,03% de hialuronidase [31]. Os oócitos livres das células do cumulus
foram, então, lavados 3 vezes em HKSOM para completa remoção da hialuronidade,
lavados novamente 3 vezes em KSOM pré-equilibrado e então colocados na
incubadora por 30 minutos, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado, para serem
posteriormente submetidos a avaliação pela microscopia de polarização (pol-scope)
ou fixação para realização de microscopia de fluorescência, para avaliação do fuso
celular e da distribuição cromossômica, como descrito a seguir [32,33].
O isolamento e o cultivo dos oócitos imaturos foram realizados de acordo
com os protocolos descritos previamente [34]. Para a obtenção de oócitos imaturos,
as fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical 44-48 horas após a injeção
do PMSG. Foi realizada a ooforectomia bilateral e a punção dos folículos ovarianos
em HKSOM a 34-37°C, para a obtenção dos oócitos imaturos envoltos pelos
complexos de células do cumulus. Os oócitos desnudos, não envoltos pelas células
do cumulus, não foram utilizados nos experimentos. Todos os procedimentos de
manipulação oocitária foram realizados em placas de Petri colocadas sobre uma
placa aquecida para a adequada manutenção da temperatura entre 34-37°C. Os
complexos intactos de células do cumulus e oócitos em estágio de vesícula germinal
foram lavados 3 vezes em meio de cultivo para maturação in vitro (Minimum
Essential Medium – GIBCO, Grand Island, NY, suplementado com 10% de
albumina fetal bovina e 5 IU de PMSG/ml) e colocados na incubadora a 37°C, em
7% de CO2 e em ar umidificado, durante 12-14 horas. Após este tempo em cultura,
as células do cumulus foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM
contendo 0,03% de hialuronidase [31]. Os oócitos livres das células do cumulus
66
foram lavados 3 vezes em HKSOM para a completa remoção da hialuronidade,
lavados novamente 3 vezes em KSOM pré-equilibrado e então colocados na
incubadora por 30 minutos, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado, para serem
posteriormente submetidos à avaliação pela microscopia de polarização (pol-scope)
ou fixação para realização de microscopia de fluorescência, para avaliação do fuso
celular e da distribuição cromossômica, como descrito a seguir [32,33].
Os oócitos fertilizados in vivo foram obtidos de fêmeas submetidas à
superovulação com PMSG, indução da ovulação com hCG e cópula com machos
CD-1 com 2 a 3 meses de idade e fertilidade comprovada. Imediatamente após a
injeção ip de 5 UI de hCG, cada fêmea foi colocada, individualmente, com um
macho. As fêmeas foram avaliadas após 20-21 horas em contato com os machos,
sendo que aquelas que apresentavam placas vaginais esbranquiçadas, indicativas da
presença da cópula, foram sacrificadas por deslocamento cervical. Os zigotos
envoltos pelas células do cumulus foram coletados dos ovidutos das fêmeas e
colocados em placas de Petri contendo HKSOM. As células do cumulus foram
removidas através de delicada pipetagem em HKSOM contendo 0,03% de
hialuronidase. Os zigotos livres das células do cumulus foram, então, lavados 3 vezes
em HKSOM para a completa remoção da hialuronidade e lavados novamente 3 vezes
em KSOM pré-equilibrado. A manipulação in vitro destes oócitos foi realizada em
HKSOM a 34-37°C sobre uma placa aquecida. Os oócitos fertilizados in vivo foram
cultivados em poços de 50 µl de KSOM, suplementado com aminoácidos essenciais
e 2,5 mM de HEPES [35-37], sob óleo mineral, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar
umidificado. Os embriões foram avaliados quanto à clivagem após 24 horas em
cultivo, à formação de mórula após 72 horas e ao desenvolvimento para blastocisto
67
após 96 horas de cultura. Após a última avaliação com 96 horas de cultura, os
blastocistos foram fixados e o número de células apoptóticas determinado, como
descrito a seguir.
Microscopia de Fluorescência da Tubulina e da Cromatina
Os oócitos desnudos foram fixados e extraídos durante 30 minutos a 37°C em
um tampão estabilizador de microtúbulos [32,33]. O oócitos foram lavados pelo
menos 3 vezes e bloqueados dutante a noite, a 4°C, em um meio de lavagem (PBS
suplementado com 0,02% de NaN3, 0,01% de Triton X-100, 0,2% de leite desnatado,
2% de soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de glicina). Após, os
oócitos foram incubados com anticorpos monoclonais de camundongo anti β-
tubulina (1:150), lavados e então incubados com isotiocianato de fluorisceína (FITC)
conjugado com IgG anti imunoglobulina de camundongo (1:200; Molecular Probes,
OR) a 37°C durante 2 horas. Após serem lavadas novamente, as amostras foram
colocadas sobre uma lâmina de vidro, coradas com Hoechst 33342 (10 µg/ml) em
meio de montagem constituído por Vectashield (H-1000, Vectyor) e presas pela
colocação de lamínulas. As amostras foram analisadas em um microscópio invertido
de fluorescência (Zeiss Axiovert 100T) e as imagens foram capturadas pelo software
Axio Vision 3.0.
Microscopia de Polarização (Pol-Scope)
Os fusos celulares de alguns oócitos foram analisados usando-se um
microscópio invertido (Zeiss Axiovert 100), equipado com uma vídeo câmera Cohu e
o com o hardware do pol-scope, o qual consiste de cristais elétricos e de um
68
controlador eletro-óptico (Cambridge Research & Instrumentation, Boston, MA)
[38,39]. Os grupos de cristais elétricos foram controlados pelo computador através
do software MetaMorph (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos foram
avaliados a 37°C, em poços de 100 µl de HKSOM, em placas de Petri revestidas com
vidro na parte inferior (MatTek Corp., Ashland, MA), colocadas sobre uma placa
aquecida a 37-38°C. O microscópio ficava contido em uma câmara isolada de aço
inoxidável, permitindo o adequado controle térmico que foi mantido em torno de 37-
38°C.
Para controlar algumas variações experimentais entre os oócitos,
especialmente a temperatura e o tempo após a coleta dos mesmos, foram realizadas
3-4 réplicas de experimentos para cada grupo, sendo que apenas 4-5 oócitos foram
analisados em cada experimento.
O pol-scope, como descrito em estudos anteriores [38,39], possibilita a
visualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de
fixação ou coloração. Os fusos celulares são estruturas birrefringentes e, portanto,
passíveis da avaliação não invasiva por esta tecnologia. A racionalidade do uso do
pol-scope neste estudo foi avaliar se as anomalias do fuso celular causadas pelo
arsenito, caso confirmadas, poderiam ser detectadas por meio desta técnica inócua e
não invasiva, o que poderia ter implicações clínicas potenciais.
Caracterização das Anomalias da Meiose
Consideramos como um fuso celular normal em metáfase aquele
caracterizado pela presença de fibras distribuídas simétrica e radialmente com o
formato de barril, com orientação paralela à membrana cortical, presença de 2 polos
Excluído: μ
69
anastrais e cromossomos alinhados ao longo de sua parte média. As anomalias
meióticas foram definidas pela presença de alterações do fuso celular (perda total ou
parcial da integridade das suas fibras e/ou da sua forma normal de barril) e/ou mal
alinhamento cromossômico (deste 1 único cromossomo mal alinhado até o completo
espalhamento cromossômico no interior da célula).
Quando analisados pelo pol-scope, os fusos celulares em metáfase foram
caracterizados pela presença de fibras birrefringentes distribuídas radialmente, com a
forma de barril e orientadas paralelamente à membrana cortical. Como os
cromossomos são minimamente birrefringentes, apareceram com uma região escura
ao longo da porção média do fuso celular metafásico. As anomalias meióticas foram
definidas segundo esta técnica pela presença de anormalidades apenas do fuso celular
(perda total ou parcial da integridade das suas fibras, e/ou da sua forma normal de
barril e/ou o seu completo desaparecimento).
Detecção de Apoptose Embrionária
Os embriões foram fixados em paraformaldeído a 3,7% diluído em PBS
contendo 0,1% de polivinilpirrolidona. A fragmentação do DNA nuclear embrionário
foi detectada pelo método TUNEL (terminal desoxynucleotidyl transferase mediated
d-UTP nick and labeling), utilizando o Kit de Detecção de Morte Celular In Situ
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Os núcleos foram corados com PI
(propidium iodine 50 µg/ml; Molecular Probes, Eugene, OR), como descrito
previamente [28,40,41]. A fluorescência foi detectada pelo uso de um microscópio
invertido (Zeiss Axiovert 100). Em adição à análise acima descrita, também foi
70
avaliada a presença de perda da integridade celular e de condensação nuclear como
indicativos de apoptose [42,43].
Análise Estatística
A análise de variância (ANOVA) e o teste exato de Fisher, usando o software
StatView do SAS (Cary, NC), foram utilizados para as comparações das médias. O
teste do Chi-Quadrado foi utilizado para as comparações das percentagens. Foi
considerado como estatisticamente significante a presença de P < 0,05.
RESULTADOS
Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito na Meiose de Oócitos de
Camundongo Ovulados In Vivo
A incidência de anomalias na meiose oocitária, caracterizadas por alterações
no fuso celular e/ou na distribuição cromossômica, evidenciadas por microscopia de
fluorescência, foi significantemente maior (p < 0,05) em ambos os grupos tratados
com arsenito (presença de 25 % de anomalias no grupo tratado com a dose baixa e
62,5 %, com a dose média), do que no grupo controle, que exibiu fusos celulares
normais e adequada distribuição cromossômica em todos os oócitos ovulados in vivo.
No grupo tratado com a dose baixa, quatro oócitos (7,2%) apresentaram perda da
integridade do fuso celular, sem comprometimento da distribuição cromossômica,
cinco oócitos (8,9%) exibiram anomalias da distribuição cromossômica, sem
alterações do fuso celular e cinco oócitos (8,9%) evidenciaram tanto alterações do
fuso celular, quanto da distribuição cromossômica. No grupo tratado com a dose
média, dois oócitos (5%) foram ovulados no estágio de vesícula germinal (GV) e seis
Excluído: ¶
71
(15%), na metáfase da meiose I (MI), apresentando anomalias tanto do fuso celular,
como da distribuição cromossômica, evidenciando um bloqueio in vivo da maturação
oocitária. Neste mesmo grupo, dezenove oócitos (47,5%) exibiram anomalias da
metáfase da meiose II (MII; sendo que 1 oócito apenas exibiu anormalidades da
distribuição cromossômica e 18, alterações tanto do fuso celular, quanto da
distribuição cromossômica). Neste grupo, apenas 13 oócitos (32,5%) apresentaram
fusos celulares normais em metáfase da MII, exibindo cromossomos alinhados na
sua porção mediana (Tab. 1 e Fig. 1). Na Fig. 1 evidencia-se a presença de: 1.
cromossomos adequadamente alinhados e distribuídos na porção mediana de um fuso
celular morfologicamente normal na metáfase da MII de um oócito do grupo
controle; 2. mal alinhamento de alguns poucos cromossomos, distribuídos sobre um
fuso celular morfologicamente anormal em um oócito do grupo tratado com a baixa
dose de arsenito; 3. completa desintegração do fuso celular, que se apresenta como
aglomerados de microtúbulos dispersos pelo citoplasma oocitário, associada à
desintegração ou condensação cromossômicas, características do processo inicial de
fragmentação oocitária, presentes em dois oócitos do grupo tratado com a dose média
de arsenito.
Quando utilizamos a microscopia de polarização (pol-scope), detectamos
anomalias no fuso celular em 15,4% (2 de 13 oócitos) e 46,2% (6 de 13 oócitos) dos
oócitos dos grupos tratados, respectivamente, com a baixa e a média dose de arsenito
(Tab. 2 e Fig. 2). Como descrito previamente, o pol-scope possibilita a visualização
de fusos celulares normais e anormais em oócitos vivos, sem a necessidade de
fixação e de coloração. Contudo, os cromossomos não são adequadamente avaliados
por esta técnica, por serem estruturas minimamente birrefringentes. Assim sendo, a
72
menor percentagem de anomalias meióticas detectada pela microscopia de
polarização (baixa dose: 15,4% e média dose: 46,2%), quando comparada com a
microscopia de fluorescência (baixa dose: 25% e média dose: 62,5%), provavelmente
se deve à habilidade limitada do pol-scope em avaliar a distribuição cromossômica.
Na Fig. 2 evidencia-se que o pol-scope possibilitou a visualização detalhada das
fibras birrefringentes de um fuso celular normal em oócitos controles, bem como a
perda da integridade das fibras e/ou da forma do fuso celular em oócitos tratados
com ambas as doses de arsenito.
Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito na Meiose de Oócitos de
Camundongo Maturados In Vitro
O tratamento in vivo com arsenito também produziu anomalias meióticas em
oócitos de camundongo coletados imaturos e submetidos à maturação in vitro. Pela
microscopia de fluorescência (Tab. 3 e Fig. 3), evidenciamos que no grupo controle,
48 de 50 oócitos (96%) completaram in vitro o processo de maturação, atingindo a
metáfase II após 12-14 h em cultura e apresentando fusos celulares
morfologicamente normais, com cromossomos apropriadamente distribuídos e
alinhados (Fig. 3A). No grupo tratado com a baixa dose de arsenito, 3 de 64 oócitos
permaneceram no estágio de vesícula germinal ou de GVBD (vesícula germinal
breakdown), e 51 oócitos (79,7%) atingiram a metáfase II, contudo destes, 12
(18,8%) exibiram anomalias meióticas, caracterizadas por mal alinhamento de uns
poucos cromossomos sobre fusos celulares intactos (Fig. 3B) ou completo
desalinhamento cromossômico sobre fusos celulares com perda da integridade
morfológica (Fig. 3C). No grupo tratado com a dose média de arsenito, trinta e nove
Excluído: sobre as
73
oócitos (81,2%) atingiram a metáfase II após 12-14 h em cultura. Contudo, a
percentagem de anomalias meióticas detectada neste grupo (52,1%) foi
significantemente maior do que a apresentada pelo grupo tratado com a dose baixa
deste metal pesado (28,1%). A dose média de arsenito produziu, além de uma maior
percentagem, também uma maior severidade de anormalidades meióticas, sendo que
dos 19 oócitos deste grupo com aberrações na metáfase II, dezoito (94,7%)
evidenciaram cromossomos completamente desalinhados e fusos celulares
desintegrados (Fig. 3D).
Pela microscopia de polarização (Tab. 4), detectamos anomalias no fuso
celular em 31,6% e 46,7% dos oócitos imaturos oriundos de animais tratados,
respectivamente, com as doses baixa e média de arsenito, após 12-14 h em cultura
para maturação in vitro, achados estes comparáveis aos obtidos pela microscopia de
fluorescência. Na fig. 4A evidencia-se, com o uso do pol-scope, a visualização
detalhada de um fuso celular normal em metáfase II em um oócito controle. Nas
figuras 4B e 4C, são apresentados, respectivamente, fusos celulares parcial ou
completamente desintegrados, após o tratamento com as doses baixa e média de
arsenito, respectivamente.
Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito sobre o Desenvolvimento e a
Apoptose em Embriões Pré-implantação
Os zigotos de camundongos CD-1 do grupo controle clivaram normalmente
(93,6%) após 24 h em cultivo, bem como se desenvolveram adequadamente para
mórula (86,1%) após 72 h e para blastocisto (84,8%) após 96 h em cultura. Os
zigotos, provenientes dos animais tratados com a baixa e a média dose de arsenito,
Excluído: ssomo
Excluído: mente
74
apresentaram, respectivamente, taxas de clivagem de 71,4% (n = 98) e 51% (n = 96),
de formação de mórula de 65,3% e 45,8% e de desenvolvimento para blastocisto de
63,3% e 44,8%. Observamos uma redução significativa das taxas de clivagem e de
desenvolvimento para mórula e blastocisto nos grupos tratados com ambas as doses
de arsenito, quando comparados entre si e com o grupo controle (Tab. 5 e Fig. 5),
sugerindo que o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação
induzido pelo arsenito é dependente da dose de administração. A percentagem de
fragmentação, observada nos zigotos após 24 h em cultura, foi similar entre os
grupos tratados, porém, mostrou-se significativamente maior nestes do que nos
controles (Tab. 5).
Os blastocistos que se desenvolveram a partir dos oócitos fertilizados
coletados do grupo controle contiveram, em média, 60,5 núcleos, dos quais 2,5%
eram apoptóticos, como evidenciado pela coloração pelo método do TUNEL (Tab.
6), resultado este similar aos descritos na literatura [40]. Não detectamos diferença
significativa na média do número total de núcleos dos blastocistos provenientes do
grupo controle e do tratado com a dose baixa de arsenito (60,5 e 62,5 núcleos,
respectivamente). Entretanto, evidenciamos uma redução significativa na média do
número total de núcleos dos blastocistos provenientes do grupo tratado com a dose
média de arsenito (53,8 núcleos), quando comparada com a do grupo controle e a do
tratado com a dose baixa deste metal. Não observamos diferença significativa na
percentagem de núcleos apoptóticos dos blastocistos provenientes do grupo controle
e do tratado com a dose baixa de arsenito (2,5 e 2,1%, respectivamente). Entretanto,
evidenciamos uma elevação significativa na percentagem de núcleos apoptóticos dos
blastocistos provenientes do grupo tratado com a dose média de arsenito (6,3%),
75
quando comparada com a do grupo controle e a do tratado com a dose baixa deste
metal.
DISCUSSÃO
Os nossos dados demonstraram que o arsenito promoveu anomalias meióticas
tanto nos oócitos ovulados in vivo, como nos maturados in vitro, provenientes de
camundongas tratadas in vivo com este metal pesado, independentemente da
detecção de qualquer efeito adverso nos animais tratados. Estes dados confirmaram
os nossos achados prévios de que o arsenito induz, in vitro, anormalidades na meiose
oocitária (dados não publicados; vide artigo 1) e estimularam a suposição de que este
poluente ambiental possa ser capaz de causar aberrações na meiose oocitária de
diferentes espécies de mamíferos, incluindo de seres humanos, mesmo na ausência
de efeitos tóxicos evidenciáveis clinicamente, o que precisa ser mais bem elucidado.
As anomalias meióticas secundárias à administração do arsenito foram dependentes
da dose administrada, sendo mais freqüentes e severas nos oócitos oriundos dos
animais tratados com a maior dose. Os mecanismos responsáveis pelos efeitos
tóxicos do arsenito na meiose oocitária não foram bem esclarecidos até o momento,
contudo, presumivelmente envolvam disfunção mitocondrial e estresse oxidativo
[22-25, 44,45]. Como descrito anteriormente, o arsenito pode comprometer a função
mitocondrial e estimular a produção de radicais livres do oxigênio em diferentes
espécies e tipos celulares [22-25]. O estresse oxidativo pode danificar diversas
proteínas intracelulares [46,47], algumas das quais são importantes para a
organização do fuso celular [48-50] e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar,
diretamente, o DNA e induzir o mal alinhamento cromossômico [51,52]. As
Excluído:
Excluído:
76
anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do
desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do
oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado,
até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que não
possibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento
embrionário pré e/ou pós-implantação, bem como a viabilidade futura do concepto
[53-55].
As mitocôndrias desempenham um papel crucial nos estágios iniciais da
apoptose [56-59]. Em vários organismos, a liberação de fatores pró-apoptóticos,
como o citocromo c e o fator indutor de apoptose, do espaço intermembrana
mitocondrial para o citosol, está envolvida na ativação da caspase e na indução de
apoptose nuclear [56-59]. Estudos têm mostrado que tanto a perda da integridade da
membrana mitocondrial externa, com conseqüente liberação do citocromo c, como a
despolarização da membrana mitocondrial interna são responsáveis pela ativação da
caspase e desencadeamento da cascata de apoptose via Bcl-XL [60]. Em estudos
anteriores, demonstramos que alguns agentes capazes de comprometer a função
mitocondrial e estimular a produção de radicais livres do oxigênio podiam induzir
apoptose em zigotos de camundongos [28,29]. Os achados de que quando submetido
ao estresse oxidativo, o citoplasma oocitário era capaz de transmitir o potencial
apoptótico para o núcleo oocitário saudável, após a reconstrução do oócito por
transferência nuclear, reforçaram a importância central das mitocôndrias no
desencadeamento da morte celular programada também em células germinativas
[29]. Em estudos prévios [dados não publicados], demonstramos que o arsenito
promoveu disfunção mitocondrial em oócitos de roedores. Outros autores, como
77
descrito a seguir, demonstraram que o estresse oxidativo, secundário à estimulação
da produção de radicais livres do oxigênio, estava envolvido na genotoxicidade e na
apoptose induzidas pelo arsenito em diferentes tipos celulares [61,62]. Applegate e
colaboradores [61] demonstraram que o arsenito induziu o aumento da expressão de
hemeoxigenase e peroxidase, enzimas características do estresse oxidativo, em várias
linhas de células de mamíferos. Por outro lado, a ativação de enzimas antioxidantes,
como a superóxido desmutase, reduziu a incidência da genotoxidade induzida pelo
arsenito em linfócitos humanos cultivados in vitro [45]. Wang e Huang [62],
utilizando células ovarianas de hamster chinês, mutantes caracterizadas por
deficiência em reparar seu DNA, evidenciaram que o arsenito induziu um aumento
dependente de dose na produção de micronúcleos, característicos da fase inicial do
processo de morte celular programada. Os dados do presente estudo corroboraram os
da literatura e demonstraram que o arsenito foi responsável pelo desencadeamento de
apoptose durante o desenvolvimento pré-implantação de embriões de camundongo,
identificada tanto pela presença de condensação e de fragmentação da cromatina
nucleares, que se constituem em achados morfológicos clássicos do início do
processo de apoptose [42,43], como pelo método de TUNEL. Este efeito foi
claramente dependente da dose, uma vez que apenas os blastocistos oriundos dos
animais tratados com a maior dose do arsenito apresentaram uma elevação
significativa da percentagem de núcleos apoptóticos. Sugerimos que, provavelmente,
a indução da apoptose embrionária, induzida pelo arsenito, foi secundária à disfunção
mitocondrial promovida pelo mesmo. Os nossos dados também evidenciaram que o
arsenito comprometeu o desenvolvimento embrionário pré-implantação de zigotos
fertilizados in vivo e originados de camundongas tratadas in vivo com este agente,
78
previamente à indução da ovulação. Este efeito, caracterizado pela redução
significativa das taxas de clivagem e de desenvolvimento para mórula e para
blastocisto, foi dependente da dose de arsenito administrada, sendo mais acentuado
nos embriões oriundos dos animais tratados com a dose maior deste metal.
Sugerimos que o mesmo possa ser decorrente dos efeitos deletérios do arsenito na
meiose oocitária e da indução de apoptose embrionária, o que merece maior
investigação. Se a exposição ambiental a este poluente é capaz de promover
disfunção oocitária e embrionária em mulheres residentes em áreas contaminadas
também precisa ser mais bem elucidada, uma vez que se comprovado, tal achado
apresentaria inúmeras aplicações práticas ao nível de saúde reprodutiva populacional.
Nossos dados demonstraram que o arsenito induziu anomalias na meiose
oocitária, comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação e
apoptose em embriões de camundongos, mesmo na ausência de efeitos adversos aos
animais tratados. Estes efeitos foram dependentes da dose e, presumivelmente,
estejam correlacionados, uma vez que as anomalias meióticas podem ter contribuído
tanto para o aumento da apoptose, como para o comprometimento do
desenvolvimento embrionário pré-implantação. Este estudo também forneceu um
modelo para a avaliação dos efeitos de outros metais pesados na meiose e no
desenvolvimento pré-implantação de roedores.
Agradecimentos P.A.A.S. Navarro agradece o apoio financeiro fornecido pela
Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
na forma de uma bolsa de Doutorado-Sanduíche.
79
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86
Tabela 1. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos ovulados in vivo,
provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.
Arsenito
(mg/kg/2d)
No.
Total
Oócitos
GV
n
Metáfase I
Nl AF + CM
n n
Metáfase II
Nl SD CM AF+ CM
n n n n
Percentagem
Total de
Anomalias (%)
0 63 63 0.0 a
8 56 42 4 5 5 25.0 b
16 40 2 6 13 1 18 62.5 c
GV: vesícula germinal; n = número; Nl = normal; AF = anomalia do fuso celular; CM = mal alinhamento cromossômico. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).
Tabela 2. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos ovulados in
vivo, provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.
Arsenito
(mg/kg/2d)
No.
Total
Oócitos
Metáfase II
Normal Fuso Anormal
n n
Percentagem
Total de
Anomalias (%)
0 15 15 0.0
8 13 11 2 15.4
16 13 7 6 46.2
87
Tabela 3. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos maturados in vitro,
provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.
As No.
Total
Oócitos
GV
n
GVBD
n
Metáfase I
Nl AF + CM
n n
Telófase I
Nl AF + CM
n n
Metáfase II
Nl AF CM AF + CM
n n n n
Percentagem
Total de
Anomalias (%)
0 50 1 1 48 0,0 a
8 64 1 2 2 5 2 1 39 3 9 28,1b
16 48 2 6 1 20 1 18 52,1c
As: arsenito (mg/kg/2d); GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown; n = número; Nl = normal; AF = anomalia do fuso celular; CM = mal alinhamento cromossômico. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).
Tabela 4. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos maturados in vitro, provenientes de camundongas,
tratadas in vivo com arsenito.
Arsenito
(mg/kg/2d)
No. Total
Oócitos
Vesícula
Germinal
n
Metáfase I
Normal Fuso Anormal
n n
Metáfase II
Normal Fuso Anormal
n n
Percentagem Total
de Anomalias
(%)
0 18 18 0,0
8 19 1 2 12 4 31,6
16 15 8 7 46,7
88
Tabela 5. Desenvolvimento embrionário pré-implantação de zigotos de camundongos do grupo controle
e dos grupos tratados in vivo com arsenito.
Treatmento Número
Embriões
Cultivados
24 horas
2 células 1 célula Frag.
n % n % n %
48 horas
4-8 células
n %
72 horas
Mórula
n %
96 horas
Blastocisto
n %
Controle 79 74 93.6a 1 1.3 4 5.1b 68 86.1a 68 86.1 a 67 84.8 a
As 0.16 mg* 98 70 71.4b 4 4.1 24 24.5a 67 68.4b 64 65.3 b 62 63.3 b
As 0.32 mg** 96 49 51.0c 26 27.1 21 21.9a 47 48.9c 44 45.8 c 43 44.8 c
As: arsenito; *: As 0.16mg/ 2 dias/ 7 injeções i.p. **: As 0.32mg/ 2 dias/ 7 injeções i.p. Frag: fragmentação. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).
Tabela 6. Indução de apoptose, detectada pelo método de TUNEL, em blastocistos de camundongos do
grupo controle e dos grupos tratados in vivo com arsenito.
Arsenito
(mg/kg/2d)
Número
Embriões
No. de núcleos
anormais ± Std
No. de núcleos
apoptóticos ± Std
No. total de
núcleos ± Std
% de núcleos
apoptóticos ± Std
0 43 58.9 ± 12.0 1.5 ± 1.2 60.5 ± 12.3a 2.5 ± 1.8c
8 29 61.2 ± 7.4 1.3 ± 0.9 62.5 ± 6.8a 2.1 ± 1.7c
16 20 50.4 ± 11.8 3.4 ± 1.6 53.8 ± 11.4b 6.3 ± 4.0d
Os valores são dados em média ± SD (desvio padrão). a versus b e c versus d indicam diferença significante (p < 0,05).
89
90
91
92
Excluído: ¶ ¶¶¶
93
6 CONCLUSÕES
94
Considerando especificamente os objetivos iniciais desta tese, foi possível
concluir que:
1. O arsenito promoveu anomalias meióticas, dependentes da dose e do tempo de
exposição, em oócitos de camundongo submetidos à maturação in vitro na
presença deste agente;
2. A co-administração de N-acetil-cisteína preveniu as anomalias meióticas
induzidas pelo arsenito em oócitos de camundongos submetidos à maturação in
vitro na presença concomitante destes dois compostos;
3. O tratamento in vivo com arsenito também promoveu anomalias na meiose,
evidenciadas tanto nos oócitos ovulados in vivo, como nos maturados in vitro;
4. O tratamento in vivo com arsenito comprometeu, de uma forma dependente da
dose administrada, o desenvolvimento embrionário pré-implantação, produzindo
uma redução significativa das taxas de clivagem e de desenvolvimento para
mórula e blastocisto, nos dois grupos tratados;
5. O tratamento in vivo com arsenito aumentou significativamente a apoptose nos
blastocistos provenientes do grupo tratado com a maior dose de arsenito (efeito
também dependente da dose administrada).
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