UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
PÂMELA PADARATZ
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DE
CHALCONAS E SUBSTÂNCIAS RELACIONADAS
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero
Itajaí, Maio de 2009.
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SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DE
CHALCONAS E SUBSTÂNCIAS RELACIONADAS
PÂMELA PADARATZ
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ’
____________________________________ Valdir Cechinel Filho, Doutor
Orientador
__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI)
Presidente
______________________________________ Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Co-orientador
______________________________________ Dr. Clóvis Antônio Rodrigues (UNIVALI)
Membro
______________________________________ Domingos Tabajara de Oliveira Martins (UFMT/Cuiabá-MT)
Membro
Itajaí (SC), 29, maio de 2009.
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Ao meu esposo Netto pela paciência e compreensão.Ao meu esposo Netto pela paciência e compreensão.Ao meu esposo Netto pela paciência e compreensão.Ao meu esposo Netto pela paciência e compreensão.
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Agradecimentos
Primeiramente agradeço às forças superiores que me fizeram mais forte e corajosa durante toda a caminhada! Ao meu marido Netto pelo apoio e pela compreensão na minha ausência! Ao meu pai pelo incentivo e pelo apoio financeiro. Minha eterna gratidão! Ao querido orientador Valdir Cechinel Filho que além de um mestre foi meu principal incentivador! Ao professor Rivaldo Niero que sempre esteve pronto pra me ajudar! A minha querida Fátima de Campos Buzzi, minha eterna orientadora, minhas palavras nunca expressarão toda a minha gratidão! Ao professor Rogério Corrêa pelas sábeis contribuições! Aos professores Clóvis Antônio Rodrigues e Sérgio Faloni pelas sugestões e contribuições durante a execução deste trabalho. Ao professor Franco Delle Monache e ao professsor Rivaldo Niero que auxiliaram na elucidação dos espectros. Aos alunos de iniciação científica da equipe da professora Fátima de Campos Buzzi que realizaram os testes da atividade antinociceptiva. Ao professor Alexandre Bella Cruz e sua equipe que realizaram os ensaios microbiológicos. Ao professor Alberto Gimenez e sua equipe pelos ensaios de atividade antiparasitária. Aos companheiros de laboratório: Lora, Dani, André, Luise e Ju. Obrigada pela ajuda e pela companhia! As minhas companheiras de trabalho principalmente Cínthia e Magali, pelo incentivo e pela compreensão das minhas ausências na farmácia. Obrigada! A Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-graduação, Extensão e Cultura da UNIVALI. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa. À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES). À Fundação de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do Estado de Santa Catarina (FAPESC). Obrigada também pelo apoio e incentivo da minha família, de amigos e pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste trabalho!
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SYNTHESIS AND EVALUATION OF THE BIOLOGICAL POTENTIA L
OF CHALCONES AND RELATED SUBSTANCES
PÂMELA PADARATZ
May/2009
Supervisor: Dr. Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of Pages: 90 Chalcones are chemically designated as α, β - unsaturated ketones with two aromatic rings, one connected directly to a ketone function (ring A), and the other connected to a double bond (ring B). These compounds can be obtained from natural sources, or synthetically produced by aldolic condensation reactions. Numerous studies have demonstrated that several chalcones and their derivatives have wide biological applicability, showing antiinflammatory, antinociceptive, antitumoral, antiviral and antileishmania properties, among others. The objective of this work was to synthesize and evaluate the antinociceptive activity of a series of chalcones derived from 2-hydroxy-4 ,6-dimethoxyacetophenone (xanthoxyline), and another new series of benzofuranones, taking into consideration the Topliss method for optimization of the pharmacological effect; synthesis and evaluation of antinociceptive activity of a new compound 2 - (1,3-dihydro-2-benzofuran-1-yl) -1 - (2-hydroxy-4 ,6-dimethoxyphenyl) ethanone (38) and evaluation of antileishmania, antimalarial and antimicrobial activity of some synthetized compounds. The chalcones were obtained from Claisen-Schmidt aldolic condensation reactions involving acetophenone xanthoxyline and aromatic aldehydes, and the benzofuranones were obtained from carboxybenzaldehyde and some acetophenones. The mechanism of the reaction probably occurs through a rearrangement between the carboxyl group and unsaturation of the carbons alpha and beta. The compounds were purified by conventional methods and characterized by the melting point and the usual spectroscopic methods. All the compounds exhibited significant antinociceptive activity, some of them being more active than the standard drugs. The chalcone (2E) -1 - (2-hydroxy-4 ,6-dimethoxyphenyl) -3 - (4-methylphenyl) prop-2-en-1-one (29) was the most active, but this series did not follow any of the parameters proposed by Topliss. Compound 3 - [2 - (4-chlorophenyl)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1 (3H)-one (36) was the most active of the series of benzofuranones. This series followed the physico-chemical parameter 2π-π2, which indicates that hydrophobic (π) parameters are predominantly involved in the antinociceptive activity. Based on the table of new substituents proposed by Topliss, 3 derivatives of (36) were synthesized and tested again to compare the results. Compound (40) showed greater activity, but was not more active than compound (36).The benzofuranone (38) derived from chalcone 2 - [(1E) -3 - (2-hydroxy-4 ,6-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl] benzoic acid (32) showed promising antinociceptive activity in several models of pain, but was not active in the malaria and leishmaniasis assays. None of the benzofuranones showed significant results in tests against fungi and bacteria. Keywords: Benzofuranones. Chalcones. Structure-activity relationship. Synthesis.
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SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DE
CHALCONAS E SUBSTÂNCIAS RELACIONADAS
PÂMELA PADARATZ
Maio/2009 Orientador: Dr. Valdir Cechinel Filho Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 90 As chalconas são quimicamente designadas como cetonas α,β - insaturadas com dois anéis aromáticos, um ligado diretamente à função cetona (anel A) e outro à dupla ligação (anel B). Estes compostos podem ser obtidos de fontes naturais ou sinteticamente através de reações de condensação aldólica. Inúmeros estudos têm demonstrado que várias chalconas e seus derivados possuem grande aplicabilidade biológica, apresentando propriedades antiinflamatórias, antinociceptivas, antitumorais, antivirais, antileishmania, entre outras. Objetivou-se neste trabalho a síntese e avaliação da atividade antinociceptiva de uma série de chalconas derivadas da 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona (xantoxilina) e outra série inédita de benzofuranonas levando em consideração o método de Topliss para a otimização do efeito farmacológico, síntese e avaliação da atividade antinociceptiva do composto inédito 2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)etanona (38) e a verificação da atividade antileishmania, antimalárica e antimicrobiana de alguns compostos sintetizados. As chalconas foram obtidas a partir de reações de condensação aldólica de Claisen-Schmidt, envolvendo a acetofenona xantoxilina e aldeídos aromáticos, já as benzofuranonas foram obtidas a partir do carboxibenzaldeído e diferentes acetofenonas e o mecanismo da reação ocorre provavelmente através de um rearranjo entre o grupo carboxila e a insaturação dos carbonos alfa e beta. Os compostos foram purificados e caracterizados por ponto de fusão e métodos espectroscópicos usuais. Todos os compostos exibiram significativa atividade antinociceptiva sendo mais ativos que os fármacos utilizados como referência. Com relação às chalconas a molécula (2E)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-(4-metilfenil) prop-2-en-1-ona (29) foi a mais ativa, porém, esta série não seguiu nenhum dos parâmetros propostos por Topliss. O composto 3-[2-(4-clorofenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3H)-ona (36) foi o mais ativo da série das benzofuranonas. Esta série seguiu o parâmetro físico-químico 2π– π 2, o que indica que são os parâmetros hidrofóbicos (π) que estão preponderantemente envolvidos na atividade antinociceptiva. Com base na tabela dos substituintes proposta por Topliss, foram sintetizados 3 derivados do (36) e testados novamente para a comparação dos dados. A molécula (40) apresentou maior atividade, porém não foi mais ativa que o composto (36). A benzofuranona (38) derivada da chalcona 2-[(1E)-3-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-oxoprop-1-en-1-il]ácido benzóico (32) apresentou promissora atividade antinociceptiva em vários modelos de dor, porém não foi ativa para malária e leishmaniose. Nenhuma das benzofuranonas apresentou resultado significativo nos testes contra fungos e bactérias. Palavras chave: Benzofuranonas. Chalconas. Relação estrutura-atividade. Síntese.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Figura 2:
Estrutura geral das chalconas.
Reação de síntese da floroacetofenona.
25
35
Figura 3: Reação de síntese da Xantoxilina. 36
Figura 4: Reação geral de condensação aldólica das chalconas. 37
Figura 5: Reação geral de condensação aldólica da chalcona (32). 41
Figura 6: Reação geral de síntese das benzofuranonas. 42
Figura 7: Esquema da reação de obtenção do composto (38). 46
Figura 8: Reação de síntese dos compostos (39), (40) e (41). 52
Figura 9: Espectro de RMN 1H da chalcona (27) (C3D6O / 300 MHz). 59
Figura 10: Espectro de RMN 13 C da chalcona (27) (C3D6O / 300 MHz). 60
Figura 11: Espectro de RMN 1H do composto (33) ((CD3)2SO/ 300 MHz). 63
Figura 12: Espectro de RMN 13 C do composto (33) ((CD3)2SO / 300 MHz). 64
Figura 13: Espectro de RMN 1H do composto (38) (CDCl3/ 300 MHz). 65
Figura 14: Espectro de RMN 13 C do composto (38) (CDCl3/ 300 MHz). 66
Figura 15: Efeito dos compostos (27-31), administrados em 3 concentrações
1, 3 e 10 mg/kg, via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo
ácido acético.
68
Figura 16:
Figura 17:
Efeito dos compostos (33), (34), (36) e (37) administrados nas
doses de 6, 10 e 30 mg/kg e do composto (35) nas doses de 3, 6,
10 e 30 mg/kg via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo
ácido acético.
Efeito do composto (40) administrado em 4 concentrações 0,5, 1, 3
e 10 mg/kg, pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo
ácido acético.
70
73
Figura 18: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações 0,5,
1.25 e 5 mg/kg, via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo
ácido acético.
74
Figura 19: Efeito do composto (38), administrado na dose de, 100mg/kg, via
oral no modelo de dor induzida pelo ácido acético.
75
Figura 20: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações: 3, 6 e
10mg/kg, via intraperitoneal na Fase I – fase neurogênica, no
modelo de dor induzida pela formalina
76
8
Figura 21: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações: 3, 6 e
10mg/kg, via intraperitoneal na Fase II – fase inflamatória, no
modelo de dor induzida pela formalina.
76
Figura 22: Efeito do (38) administrado na concentração de 3, 6 e 10 mg/kg, via
intraperitonial no modelo de dor induzido pela capsaicina.
77
Figura 23: Efeito do (38) administrado na concentração de 6, 10 e 30 mg/kg,
via intraperitonial no modelo de dor induzido pelo glutamato.
78
Figura 24: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona na atividade
antinociceptiva causada pela morfina (5 mg/kg-1,s.c.) e pelo
composto (38) no modelo de contorções induzidas pelo ácido
acético.
79
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores dos parâmetros físico-químicos π e σ e ambos
relacionados. 17
Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos
proposta por Topliss.
19
Tabela 3:
Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em
função dos prováveis parâmetros mais ativos.
20
Tabela 4: Estrutura, tempo reacional e rendimento das chalconas (27-31). 58
Tabela 5: Estrutura, tempo reacional e rendimento das benzofuranonas
(33-37).
62
Tabela 6: Estrutura, tempo reacional e rendimento das benzofuranonas
(39-41).
67
Tabela 7: Atividade antinociceptiva dos compostos (39), (40) e (41) no
modelo de dor induzida pelo ácido acético 0,6% via i.p.,
administrados na dose de 10 mg/kg.
72
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS: Ácido acetil salicílico
AINE: Antiinflamatório Não-esteroidal
Ar: Anel aromático
CC: Cromatografia em Coluna
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
d: Dubleto
dd: Duplo-dubleto
DI50: Dose de uma substância necessária para inibir as contorções abdominais em
50 % dos animais em teste em relação a um grupo controle (experimentos
laboratoriais)
EPM: Erro padrão médio
HbO2: Hemoglobina
Hz: Hertz
iNOS: Óxido nítrico sintetase induzível
i.p.: Intra peritoneal
IV: Infra Vermelho
J: Constante de acoplamento
Log P: Coeficiente de partição octanol/água
M: mol
m: Multipleto
N: Número de amostras
NIQFAR: Núcleo de investigações químico-farmacêuticas
NO: óxido nítrico
P: Erro padrão
Pf: Ponto de fusão
PAR: Paracetamol
QSAR: Quantitative structure activity relationship
Rdt: Rendimento
REA: Relação estrutura-atividade
rf: Fator de retenção
RMN 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
11
RMN 1H: Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio
s: Simpleto
SD: Desvio padrão
SIDA: Síndrome da imunodeficiência adquirida
SNC: Sistema Nervoso Central
t: Tripleto
TMS: Tetrametilsilano
TNF- α: Fator de necrose tumoral α
UFSC: Universidade Federal de Santa Catarina
UNIVALI: Universidade do Vale do Itajaí
νννν: Estiramento
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................
2 OBJETIVOS........................................ .................................................................
14
16
2.1 Objetivo geral........................................................................................... 16
2.2 Objetivos específicos............................................................................... 16
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................ ............................................... 17
3.1 Relação Estrutura-Atividade..................................................................... 17
3.2 Benzofuranonas....................................................................................... 20
3.3 Chalconas e Xantoxilina........................................................................... 22
4 PARTE EXPERIMENTAL............................... ..................................................... 34
4.1 Identificação dos compostos....................................................................
4.2 Síntese.....................................................................................................
4.2.1 Síntese da Floroacetofenona............................................................
4.2.2 Síntese da Xantoxilina.......................................................................
4.2.3 Síntese das Chalconas.....................................................................
4.2.4 Síntese das Benzofuranonas............................................................
34
34
34
35
36
41
4.3 Avaliação da Atividade Antinociceptiva...............................................
4.3.1 Animais..............................................................................................
4.3.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético....
4.3.3 Modelo de dor induzida pela formalina.............................................
4.3.4 Modelo de dor induzida pela capsaicina...........................................
4.3.5 Modelo de dor induzida pelo glutamato............................................
4.3.6 Modelo da sensibilidade térmica.......................................................
4.4 Análise Estatística....................................................................................
46
46
47
48
48
49
49
50
4.5 Relação Estrutura-Atividade – Método de Topliss...................................
4.6 Síntese dos derivados..............................................................................
4.6.1 Síntese dos derivados da série das benzofuranonas.......................
4.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana....................................................
4.8 Avaliação da Atividade Antiparasitária.....................................................
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................... ................................................
5.1 Síntese.....................................................................................................
5.1.1 Chalconas.........................................................................................
50
51
52
54
55
56
56
56
13
5.1.2 Benzofuranonas................................................................................
5.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva....................................................
5.2.1 Chalconas.........................................................................................
5.2.2 Benzofuranonas................................................................................
5.3 Avaliação da Atividade Antimicrobiana....................................................
5.3.1 Benzofuranonas................................................................................
5.4 Avaliação da Atividade Antiparasitária.....................................................
5.4.1 2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)etanona)...
6 CONCLUSÕES...................................................................................................
6.1 Chalconas................................................................................................
6.2 Benzofuranonas.......................................................................................
61
67
67
69
79
79
80
80
81
81
81
REFERÊNCIAS......................................................................................................
ANEXO A............................................ ....................................................................
ANEXO B............................................ ....................................................................
83
88
89
14
1 INTRODUÇÃO
O grande desafio dos pesquisadores e das grandes indústrias farmacêuticas
continua sendo a busca por novos medicamentos que possam curar as mais
variadas doenças e que possuam o mínimo de efeitos colaterais. Diferentemente dos
anos passados, hoje a descoberta de novas moléculas bioativas segue um
planejamento mais racional, no qual, a interdisciplinaridade permite construir
protótipos de fármacos de maneira mais direta, sem que haja a experimentação
aleatória (BARREIRO., 2007).
A química medicinal dedica-se á compreensão da relação entre a estrutura
química e atividade biológica de novos compostos bioativos que possam tornar-se
candidatos efetivos á novos fármacos, levando-se em consideração aspectos
farmacodinâmicos e farmacocinéticos (VIEGAS-JUNIOR et al.; 2006).
Na história do desenvolvimento de fármacos pode-se citar o AAS (Ácido
Acetil Salicílico) como pioneiro (1898) dentre os fármacos obtidos por meio sintético,
seguido de um barbital (ácido 5,5-dietilbarbitúrico) em 1903, o fenobarbital em 1912
e posteriormente outros barbitúricos com efeitos hipnóticos e sedativos. Durante o
período de 1940 a 1970 a química sintética conseguiu múltiplos fármacos para as
mais diversas patologias, como os anti-histamínicos Antergan (1942) e Neoantergan
(1944), o anti-hipertensivo Hidrazalina (1963) dentre muitos outros (YUNES;
CECHINEL-FILHO., 2007).
Barreiro e Fraga (2008) afirmam que cerca de 85% dos fármacos
disponíveis no mercado atual são de origem sintética, sendo que este número pode
ser maior se levarmos em consideração aqueles obtidos a partir de processos de
semi-síntese como por exemplo os antibióticos sintetizados a partir de intermediários
preparados em processos fermentativos, em um mercado que em junho de 2006
totalizava 600 bilhões de dólares, o que corresponde à um valor de US$ 510 bilhões
em fármacos sintéticos.
Atualmente, há significantes classes terapêuticas como: analgésicos,
antifúngicos, antiarrítmicos e antiinflamatórios, das quais a grande maioria dos
medicamentos disponíveis é de origem totalmente sintética (NEWMAN; CRAGG.,
2007). Vale ressaltar também, que no ano de 2006 os cinco fármacos mais vendidos
foram Plavir® (clopidogrel), atorvastatina e Zoccor® (sinvastatina) para doenças
15
cardiovasculares, Nexium® (esomeprazola) como antiúlcera e Seretide® (salmetereol
e fluticazona) como antiasmático, todos obtidos por meios sintéticos, totalizando US$
37,3 bilhões em vendas naquele ano (BARREIRO; FRAGA., 2008).
Contudo, apesar dos avanços tecnológicos observados nas pesquisas por
novas entidades químicas, a quantidade de novos fármacos lançados no mercado
não tem aumentado proporcionalmente, provavelmente devido à complexidade das
etapas que antecedem tal processo: a descoberta do fármaco, o desenvolvimento
pré-clínico e o desenvolvimento clínico.
O presente trabalho foi proposto seguindo a linha de atuação do Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) na síntese, identificação e
modificação estrutural de novas moléculas bioativas. A classe em estudo são as
chalconas derivadas do produto natural 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona, as quais
vêm sendo estudadas há alguns anos pelo grupo de pesquisa do NIQFAR (UNIVALI)
e demonstraram resultados relevantes quanto à atividade biológica. Foi ainda
abordada a classe das benzofuranonas, que possuem uma lactona em sua estrutura
e que também são moléculas que apresentaram promissoras propriedades
farmacológicas. Os produtos obtidos foram avaliados em diferentes modelos
experimentais de domínio do grupo de pesquisa ou em parceria com outras
instituições.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Sintetizar diferentes chalconas e substâncias relacionadas no intuito de obter
compostos biologicamente ativos.
2.2 Objetivos específicos
1- Preparar chalconas derivadas da Xantoxilina por meio de reações de
condensação aldólica levando em consideração o método de Topliss;
2- Sintetizar benzofuranonas a partir do 2-carboxibenzaldeído e cinco
diferentes acetofenonas baseando-se no método de Topliss;
3- Verificar o efeito antinociceptivo dos compostos sintetizados;
4- Estabelecer a relação estrutura-atividade das moléculas em estudo;
5- Preparar novas moléculas e comparar com as anteriores seguindo o
método de Topliss;
6- Verificar outras atividades biológicas como antileishmania, antimalárica,
antifúngica e antimicrobiana de alguns compostos sintetizados;
7- Comparar a atividade dos compostos em estudo com alguns fármacos
disponíveis no mercado farmacêutico;
17
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Relação Estrutura-Atividade
Na química medicinal, a otimização das estratégias de síntese é importante
na obtenção de bons resultados e na diminuição dos custos. Por isto, uma boa
estratégia permitirá conseguir um grupo de teste importante para realizar um
tratamento quantitativo da relação estrutura atividade. Várias estratégias foram
desenvolvidas para compreender os mais diversos parâmetros físico-químicos
envolvidos numa série de compostos (BOECK., 2005).
Hansch (1971) propôs através de uma equação que a atividade biológica
pode ser influenciada através da análise dos parâmetros hidrofóbicos, eletrônicos e
estéricos de compostos estruturalmente similares, porém, com substituintes
diferentes. Nos períodos anteriores pouco se conhecia sobre relação estrutura-
atividade e hidrofobicidade dos compostos (HANSCH, 1973; TOPLISS., 1993).
Já Topliss (1977), sugere um método não estatístico, denominado manual,
para aplicar o método de Hansch. Este método é baseado no fato de que alguma
correlação quantitativa deve existir entre atividade biológica, a hidrofobicidade e a
descrição molecular eletrônica dos substituintes aromáticos (YUNES et al.; 2002).
O método manual consiste na análise dos resultados da atividade
farmacológica de cinco compostos que possuam anel aromático na sua estrutura e
que estejam presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4 –OCH3.
(CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES., 1993). A avaliação da atividade biológica
está relacionada aos parâmetros hidrofóbicos (π), eletrônicos (σ) e estéricos (Es)
conforme demonstrados na tabela 1.
Tabela 1: Valores dos parâmetros físico-químicos π e σ e ambos relacionados. Substituinte π σ π - σ 2 π - σ π -2 σ π -3 σ - σ π + σ 2 π - π ²
H 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4-Cl 0.71 0.23 0.48 1.19 0.25 0.02 -0.23 0.94 0.92
3,4-Cl2 1.25 0.52 0.73 1.98 0.21 -0.31 -0.52 1.77 0.94
4-CH3 0.56 -0.17 0.73 1.29 0.90 1.07 0.17 0.39 0.81
4-OCH3 -0.02 -0.27 0.25 0.23 0.52 0.79 0.27 -0.29 -0.04
3-CF3,4-Cl 1.59 0.66 0.93 2.52 2.91 -0.39 -0.66 2.25 0.65
18
3-CF3,4-NO2 0.60 1.21 -0.61 -0.01 -1.82 -2.97 -1.21 1.81 0.84
4-CF3 0.88 0.54 0.34 1.22 -0.20 -0.74 -0.54 1.42 0.99
2,4-Cl2 1.42 0.46 0.96 2.38 0.50 0.04 -0.46 1.88 0.82
c-C5H9 2.14 0.02 2.16 4.30 2.18 2.20 0.02 2.12 -0.30
c-C6H11 2.51 -0.22 2.73 5.24 2.95 3.17 0.22 2.29 -1.28
4-CH(CH3)2 1.53 -0.05 1.58 3.11 1.63 1.68 0.05 1.48 0.72
4-C(CH3)3 1.98 -0.20 2.18 4.16 2.38 2.58 0.20 1.78 0.04
3,4-(CH3)2 0.99 -0.30 1.29 2.28 1.59 1.89 0.30 0.69 1.00
4-O(CH2)3CH3 1.55 -0.32 1.87 3.42 2.19 5.21 0.32 1.23 0.70
4-N(C3H5)2 1.18 -0.83 2.01 3.19 3.84 4.67 0.83 0.35 0.97
4-N(CH3)2 0.18 -0.83 1.01 1.19 1.84 2.67 0.83 -0.65 0.33
4-NH2 -1.23 -0.66 -0.57 -1.80 0.09 0.75 0.66 -1.89 -3.97
4-NHC4H9 1.45 -0.51 1.96 2.39 2.47 2.98 0.51 0.94 0.80
4-OCH(CH3)2 1.03 -0.45 1.48 2.51 1.93 2.38 0.45 0.58 1.00
3-CH3, 4-OCH3
0.54 -0.26 0.80 1.34 1.06 1.32 0.26 0.28 0.79
4-Br 0.86 0.23 0.57 1.49 0.40 1.55 -0.23 1.09 0.98
4-CF3 0.88 0.43 0.45 1.43 0.02 2.17 -0.43 1.31 0.99
4-C2H5 1.02 -0.15 1.17 2.19 1.32 1.47 0.15 0.87 1.00
4-O(CH2)2CH3 1.05 -0.25 1.30 2.35 1.55 1.80 0.25 0.80 1.00
3-CH3, 4-Cl 1.29 0.17 1.12 2.41 0.95 0.78 -0.17 1.46 0.92
3-Cl 0.71 0.37 0.34 1.05 -0.03 -0.30 -0.37 1.08 0.92
3-CH3 0.56 -0.07 0.63 1.19 0.70 0.77 0.07 0.49 0.81
3-OCH3 -0.02 0.12 -0.14 -0.16 -0.26 -0.38 -0.12 0.10 -0.04
3-N(CH3)2 0.18 -0.15 0.33 0.51 0.48 0.63 0.15 0.03 0.33
3,5-Cl2 1.25 0.75 0.50 1.75 -0.25 -1.00 -0.75 2.20 0.94
2-Cl 0.71 0.23 0.48 1.19 0.25 0.02 -0.23 0.94 0.92
2-CH3 0.56 -0.17 0.73 1.29 0.90 1.07 0.17 0.39 0.81
2-OCH3 -0.02 -0.27 0.25 0.23 0.52 0.79 0.27 -0.29 -0.04
2-F 0.14 0.06 0.08 0.22 0.02 -0.04 -0.06 0.20 0.28
4-F 0.14 0.06 0.08 0.22 0.02 -0.04 -0.06 0.20 0.28
4-NHCOCH3 -0.97 0.00 -0.97 -1.94 -0.97 -0.97 0.00 -0.97 -2.88
4-NHSO2CH3 -1.18 0.03 -1.21 -2.39 -1.24 -1.27 -0.03 -1.15 -3.75
4-NO2 -0.28 0.78 -1.06 -1.34 -1.84 -2.62 -0.78 0.50 -0.64
4-COCH3 -0.55 0.50 -1.5 -1.60 -1.55 -2.05 -0.50 -0.05 -1.40
4-SO2CH3 -1.63 0.72 -2.35 -3.98 -3.07 -3.79 -0.72 -0.72 -5.92
4-CONH2 -1.49 0.36 -1.85 -3.34 -2.21 -2.57 -0.36 -1.13 -5.20
19
4-SO2NH2 -1.82 0.57 -2.39 -4.21 -3.01 -3.53 -0.57 -1.25 -6.95
A ordem de potência para estes parâmetros relacionados aos 5 substituintes
encontra-se na tabela 2. A partir do resultado da atividade biológica dos compostos
utiliza-se esta tabela a fim de se encontrar qual parâmetro ou combinação dos
parâmetros estão envolvidos nos compostos mais ativos (TOPLISS; 1976).
Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por Topliss.
Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss
π 2π– π 2 σσσσ π + σσσσ 2π - σσσσ π - σσσσ π - 2σσσσ π - 3σσσσ Es
3,4-Cl2 1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5
4-Cl 2 1-2 2 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5
4-CH3 3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5
4-OCH3 4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5
H 4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1
A tabela 3 indica a proposta de seleção de novos substituintes que podem
otimizar a atividade farmacológica dos compostos em estudo. Aos parâmetros
relacionados π e σ, baseados nos estudos de correlação de Hansch, Topliss incluiu
também os efeitos estéricos (Es), que muitas vezes exercem influência dominante.
Este método visa uma síntese mais racional e objetiva, visto que, fazendo
primeiramente a análise e comparação dos resultados da atividade biológica com a
estrutura química dos compostos pode-se determinar futuras modificações
estruturais com o objetivo de obter um composto ainda mais potente que os iniciais.
20
Tabela 3: Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos.
Prováveis parâmetros mais ativos Seleção de novos s ubstituintes
π, π + σσσσ, σσσσ 3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;
4-C-C5H9
π, 2π – σσσσ, π – σσσσ 4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4-
O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
π - 2σσσσ, π – 3σσσσ, σσσσ 4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9;
4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3
2π – π2 4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3-
CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl2
Dentre os métodos modernos de correlação estrutura-atividade inclui-se o
software Hyperchem 7.0, onde as moléculas são minimizadas energeticamente e em
seguida, mapas de polarizabilidade são construídos a fim de verificar a distribuição
média da densidade eletrônica das moléculas. Realiza-se ainda no Hyperchem,
plotes envolvendo o parâmetro biológico obtido e os parâmetros quanto ao potencial
eletrostático, log P, a polarizabilidade, a energia de hidratação, a refratometria molar
e o volume molar (PADARATZ, P., 2006).
E ainda, a estratégia para o planejamento de novos fármacos pode se
basear na abordagem fisiológica, que depende diretamente do alvo terapêutico
pretendido para que se possa definir o mecanismo de ação específico da molécula
(BARREIRO; FRAGA., 2008). Conhecendo o tipo de receptor que o fármaco irá
atuar, torna-se mais fácil saber as características e qual estrutura específica ele
deve possuir.
3.2 Benzofuranonas
As benzofuranonas podem ser encontradas naturalmente, obtidas de plantas
e também podem ser obtidas por meios sintéticos. Esta é uma classe de compostos
ainda pouco estudada, porém possui estrutura química interessante e já existem
alguns indícios de atividade biológica de alguns derivados. Sua estrutura deve
21
conter uma lactona ligada a um anel aromático, podendo conter em ambos os lados,
tanto do lado do anel aromático quanto do lado da lactona radicais completamente
distintos.
Uma série de 5-acil-3substituídas-benzofuran-2(3H)-onas e seus respectivos
derivados o-hidroxi ácidos, com o anel aberto, foram sintetizados. Foi avaliada a
atividade antiinflamatória através da análise dos efeitos na produção de
ciclooxigenase e lipooxigenase em neutrófilos polimorfonucleares do peritônio de
porco e comparado entre os compostos com a lactona e os compostos com o anel
aberto. Foi verificado que tanto as benzofuranonas quanto os derivados com o grupo
o-hidroxi ácidos apresentaram atividade similares (CHAKRABARTI et al., 1987).
Pires e colaboradores (2001) sintetizaram 3 séries de derivados nitrofuranos
com indícios de atividade antibacteriana, dentre estas séries estão as 5-R-
substituídas (Z)-2- (5-nitrofuran-2-ilmetileno)-3(2H)-benzofuranonas (1).
O
O
O
R
NO2
(1)
Foi reportada a síntese de 5,7-Di-tert-butil-3-aril-3H-benzofuran-2-onas,
lactonas com potencial atividade antioxidante devido a presença dos hidrogênios
benzílicos (C-H). Foi verificado que variações estruturais como a presença de um
hidrogênio doador pode otimizar a atividade antioxidante (LUNDGAREN et al.,
2006).
Em uma pesquisa oito compostos fenólicos, incluindo duas misturas de
compostos, foram isolados das folhas e caule de Homalium brachybotrys. Dentre
estes compostos estava a 5,6-diidro-6-beta-glucopiranosiloxi-3-(hidroxifenil-metil)-
2(4H)-benzofuranona (A), 5-dihidro-7a-beta-glucopiranosiloxi-3-(hidroxifenilmetil)-
2(7aH)-benzofuranona (B), 5,6-dihidro-3-(hidroxifenilmetil)-2(4H)-benzofuranona (C)
e a 3-benzilidina-6-hidroxi-2-benzofuranona (D), sendo que, as benzofuranonas B, C
22
e D são produtos naturais inéditos (MOSADDIK; FORSTER; WATERMAN., 2007).
Braun e pesquisadores (2008) sintetizaram recentemente uma nova
benzofuranona, a 3H-espiro[1-benzofuran-2-ciclopentan]-3-ona, por diferentes rotas
sintéticas e avaliaram a sua capacidade em inibir a proteína peptidil prolil cis/trans
isomerase Pin 1, a qual está envolvida em vários processos celulares incluindo o
controle do ciclo celular, transcrição, diferenciação e proliferação, porém, nenhuma
atividade foi encontrada.
No presente trabalho, as benzofuranonas (2) além de possuir o anel
aromático (B) ligado á lactona, há também outro anel (A) ligado a cetona onde
ocorreram as substituições. Esta série de compostos foi obtida ao acaso e ainda
realizaram-se estudos de relação estrutura-atividade para verificação de possível
atividade farmacológica.
OOO
A
BR
(2)
3.3 Xantoxilina e Chalconas
A 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona, conhecida como Xantoxilina (3), já
vem sendo estudada há algum tempo nos laboratórios de química e farmacologia da
UNIVALI. Primeiramente ela foi obtida a partir das folhas e ramos jovens da
Sebastiania schottiana (Euphorbiaceae), planta conhecida como “quebra-pedra” e
utilizada popularmente na forma de chá para o tratamento de patologias renais.
Atualmente, pode-se obter a xantoxilina em laboratório por um método puramente
sintético, através da metilação da floroacetofenona (BOECK, 2005).
23
O
CH3
O O
OH
CH3 CH3
(3)
Foi verificada a atividade antiespasmódica desta molécula, entretanto, não
apresentou resultado significativo (CALIXTO et al., 1990). Devido à xantoxilina não
apresentar efeitos farmacológicos expressivos e não apresentar seletividade por
agonistas e/ou tecidos, foram realizadas algumas modificações nos substituintes da
molécula dando origem a vários derivados (CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES.,
1993). Com o intuito de otimizar o efeito da xantoxilina com relação à atividade
antiespasmódica alguns derivados foram testados. Foi verificado que a presença dos
grupos metoxil e grupos carbonílicos são fatores importantes para a atividade
antiespasmódica. O grupo hidroxil aumenta, mas não é fundamental para a
atividade, e ainda, a introdução do segundo anel aromático foi determinante para o
aumento da atividade antiespasmódica (CECHINEL-FILHO et al., 1995).
Em um estudo realizado por Cechinel-Filho e pesquisadores (1996(a)),
verificou-se que a xantoxilina monobromada (4), produziu uma significativa atividade
antinociceptiva no modelo de dor induzido pelo ácido acético e na segunda fase do
teste da formalina. Esta substância foi mais ativa que os fármacos utilizados como
referência, aspirina e paracetamol, porém, a xantoxilina dibromada não apresentou
indícios de antinocicepção em nenhum dos dois modelos. Deste modo, a introdução
de apenas um átomo de bromo na molécula da xantoxilina pode gerar um potente
analgésico contra dor inflamatória, mas não contra dor aguda e/ou neurogênica.
O
CH3
O
O OH
Br
CH3
CH3
(4)
Neste mesmo estudo verificou-se a atividade antiedematogênica da
xantoxilina e seus derivados e constatou-se que a introdução de átomos de bromo
24
no anel aromático da xantoxilina, ao contrário do que foi observado no modelo de
dor induzido pelo ácido acético, não apresentou efeito antiedematogênico no teste
de edema de pata induzido pelo dextrano.
Ainda com relação à atividade antinociceptiva, um derivado da xantoxilina:
2-(4- bromobenzoil) – 3- metil-4,6-dimetoxi benzofurano (5) apresentou potente
atividade antinociceptiva nos modelos de dor induzida pelo ácido acético, pela
formalina e capsaicina, sendo muito mais ativo que os fármacos utilizados como
referência AAS e Paracetamol (VAZ et al., 1996).
O
O
O
CH3
CH3
CH3
O
Br
(5)
Em um estudo preliminar de atividade antifúngica foi relatado que 69% dos
fungos testados apresentaram alta sensibilidade à xantoxilina na concentração de
500 µg/mL, o que justifica o uso popular da S.schottiana contra algumas infecções
causadas por fungos (LIMA et al., 1995). Após a análise preliminar com significativa
atividade antifúngica, a xantoxilina exibiu atividade fungicida e fungiostática contra
os microrganismos: Candida albicans, C. tropicalis, C. neoformans, Microsporum
canis, Trichophytom rubrum, T. mentagrophytes, Epidermophyton floccosum,
Aspergillus flavus, A. parasiticus e Penicillum (CECHINEL-FILHO et al., 1996(b)).
Ainda com o intuito de avaliar a atividade antifúngica, alguns compostos derivados
da xantoxilina foram testados e o composto (6) que contém o grupo nitro inserido no
anel aromático foi o composto mais ativo neste estudo (PINHEIRO et al., 1999).
O
O
CH3
CH3
OCH3
OSO2
NO2
(6)
25
Visando o aumento do efeito biológico a xantoxilina passou a ser utilizada
principalmente como material de partida na síntese de chalconas juntamente com
aldeídos aromáticos.
As chalconas (Figura 1) ou também chamadas de cetonas α,β-insaturadas
são precursores da via de biosíntese dos flavonóides e isoflavonóides. São
responsáveis pelo pigmento das pétalas de algumas plantas e isso faz com que os
insetos e/ou pássaros sejam atraídos e realizem o processo de polinização. Podem
ser obtidas de origem natural ou sintética. Em sua estrutura encontra-se a porção
olefínica e a carbonila conjugadas, ligadas á grupamentos aromáticos.
O
A B
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
6
Figura 1: Estrutura geral das chalconas
Várias atividades biológicas de chalconas, e derivados, têm sido reportadas,
incluindo efeitos antinociceptivos (CAMPOS-BUZZI et al., 2006), antiinflamatórios
(TRAN et al., 2009), antifúngicos (LAHTCHEV et al., 2008), antimicrobianos
(NOWAKOWSKA; KEDZIA; SCHROEDER., 2007), além de atividade antileishmania
(BOECK et al., 2006), atividade antitumoral (NAVARINI et al., 2009) entre outras.
Segundo Chiaradia e colaboradores (2008) reações de substituição no anel
A e B por um hidrogênio ou qualquer outro substituinte pode resultar em compostos
com propriedades farmacológicas totalmente distintas, é por isso que o alvo principal
dos pesquisadores está na variedade de substituintes que se pode adicionar a estes
anéis.
Quando os nociceptores (receptores da dor) são ativados em resposta a
lesão tissular real ou iminente, a dor nociceptiva é a conseqüência (PORTH;
KUNERT, 2004). Testes em animais com fármacos analgésicos geralmente
determinam a nocicepção e envolvem a avaliação da reação de um animal a um
estímulo medianamente doloroso, com freqüência, mecânico ou térmico (RANG et
al., 2004). A chalcona CH7 (7), derivada da xantoxilina, apresentou significativo
aumento na atividade antinociceptiva quando administrada pela via intraperitoneal e
pela via oral causando uma redução de 92.2% e 62,7% respectivamente nas
contorções abdominais no modelo de dor induzido pelo ácido acético. E após análise
26
dos resultados de DI50, este mesmo composto apresentou efeito antinociceptivo
dose-dependente com inibição máxima de 92,2%, o que torna esta molécula muito
promissora com relação á atividade analgésica (CAMPOS-BUZZI et al., 2006).
O
O O
O H
C H 3 C H 3
O O H
A B
(7)
Uma série de 4-acetamidochalconas demonstrou significativa atividade
antinociceptiva no modelo de dor induzido pelo ácido acético. A chalcona que obteve
a maior porcentagem de inibição foi a substituída pelo grupo NO2 (8) na posição 4 do
anel B, sendo mais ativa que os fármacos utilizados como referência. Posteriormente
este composto foi avaliado em outros modelos de dor como a formalina, capsaicina,
glutamato e placa quente, sendo que neste último não apresentou resultado
significativo, o que indica que o composto não atua pela via opióide, porém o
mecanismo de ação pode estar relacionado com mediadores da inflamação
induzidos pela formalina (CAMPOS-BUZZI et al., 2007).
CH3 NH
O
O
N+
O-
OA B
(8)
Uma pesquisa realizada por Boeck e colaboradores (2005) demonstrou que
as chalconas derivadas da Xantoxilina que possuem grupos elétron sacadores na
posição 4 do anel B de sua estrutura, como bromo, flúor, cloro e nitro, demonstraram
significativa atividade antifúngica quando comparados ao composto sem
substituintes no mesmo anel. Já as chalconas com substituinte elétron doador como
metóxi, metil e metilenodióxi na mesma posição do anel B foram inativas.
Alguns estudos com relação à atividade antifúngica de hidróxi-chalconas
contra Cândida spp têm sido reportados. Com relação á posição do grupo fenólico
no anel aromático B a atividade antifúngica foi maior em o-OH seguindo do p-OH,
27
3,4-di-OH, m-OH. Este mecanismo pode estar envolvido, dentre outros, com a
formação de pontes de hidrogênio facilitando a ligação com grupos tióis de algumas
proteínas presentes nos fungos (BATOVSKA et al., 2006). Contrapondo este estudo,
o mesmo grupo testou chalconas contra outras espécies de fungos como S.
cerevisiae, H. polymorpha e K. lactis e concluíram que o efeito eletrônico de p-
substituintes no anel B não foram importantes para a atividade antifúngica
(LAHTCHEV et al., 2008).
Além da atividade antifúngica também foram relatados estudos com relação
a atividade antimicrobiana de chalconas. Os compostos com o grupamento
piperidina e 4-metil-piperidina (substituintes hidrofílicos) foram os mais ativos,
provavelmente pelo fato de que estes compostos são mais básicos que os
compostos com o grupamento piperazina ou morfolino e consequentemente de mais
fácil protonação (NOWAKOWSKA; KEDZIA; SCHROEDER., 2007). Tem-se relatado
que o efeito antibacteriano de chalconas deve-se a conjugação da cetona α,β-
insaturada com um grupo nucleofílico, como por exemplo, o grupo tiol
(NOWAKOWSKA., 2006).
As doenças coronarianas e os processos ateroscleróticos vêm afetando
grande parte da população brasileira podendo levar à morte, e a hipercolesterolemia
é um dos principais fatores envolvidos nestas patologias. Recentemente foi
reportada a síntese e avaliação hipolipidêmica de chalconas, especialmente a 4’,4-
diclorochalcona (9) que poderá ser usada como referência na busca por novas
moléculas para o tratamento da hiperlipidemia (SANTOS et al., 2006).
O
Cl Cl
A B
(9)
A inibição na produção prostaglandina E2 (PGE2) e óxido nítrico (NO) têm
sido propostos como terapia potencial para as diferentes desordens inflamatórias.
Nestes casos, como na artrite reumatóide, tem se observado uma excessiva
produção de NO por ativação dos macrógafos, por isso, o interesse em se
desenvolver potentes e seletivos inibidores de NO torna-se cada vez mais freqüente
(NOWAKOWSKA, 2006). Kim e colaboradores (2007) demonstraram que as
28
chalconas com maior efeito antiinflamatório foram (10), (11), (12) e (13), sendo que a
chalcona (13) é derivada da xantoxilina e também foi sintetizada e avaliada neste
trabalho. Acredita-se que elas atuam inibindo a produção de NO por diferentes
mecanismos celulares dependendo da estrutura química de cada uma.
Cl
Cl
O
OCH3
A B
O
OH
OCH3
A B
(10) (11)
Cl
O
OH
OCH3
A B
Cl
O
OH
OCH3
O
CH3
A B
(12) (13)
Mais recentemente uma pesquisa revelou que alguns aspectos estruturais
estão envolvidos na capacidade de algumas 2-hidroxichalconas inibir a produção de
PGE2 dentre eles estão: a presença de pelo menos dois grupos alcóxidos no anel B,
dos quais, pelo menos um substituído na posição 4 e outro substituído na posição 3
ou 5; a importância do grupo benzilóxi na interação chalcona e COX-2 e também
acredita-se que a capacidade das chalconas em inibir a produção de PGE2 não está
associada a suas propriedades citotóxicas (TRAN et al., 2009). Algumas chalconas
derivadas da trimetóxiacetofenona, acetofenona com um grupo metila a mais que a
xantoxilina, também foram avaliadas quanto a capacidade de inibir a produção de
mediadores químicos como o NO por exemplo. A relação estrutura-atividade
demonstrou que as chalconas com substituintes que reduzem a densidade
eletrônica no anel B, como o cloro e o grupo nitro, demonstraram melhor atividade e
seletividade na inibição de NO. No entanto, moléculas com grupo nitro, apresentam,
em geral, maior toxicidade que moléculas que contém átomo de cloro. A atividade
inibitória depende também da posição de grupos elétron-sacadores no anel B e de
29
acordo com os pesquisadores a posição orto parece ser a mais importante. Neste
caso a chalcona (14) foi a mais ativa, o que indica ser um composto que poderá
atuar como agente antiinflamatório, já que foi capaz de inibir um importante
mediador do processo inflamatório (CHIARADIA et al., 2008).
O
O
O
O
CH3
CH3 CH3
Cl
A B
(14)
O óxido nítrico, além de ser importante em muitas respostas inflamatórias,
está envolvido também na carcinogênese. Um estudo verificou que algumas
chalconas, flavonas e flavanonas sintéticas apresentaram atividade in vitro contra
algumas células tumorais (CABRERA et al., 2007). Mais recentemente foi reportada
a síntese de treze hidróxichalconas, sendo que três (15), (16) e (17) apresentaram
significativa atividade citotóxica contra algumas células de melanoma. A chalcona
(17) derivada da xantoxilina monobromada foi ativa, porém, não induziu apoptose
das células. As chalconas (15) e (16) induziram apoptose, e a semelhança estrutural
entre as duas moléculas é a presença do anel naftaleno no anel B. Acredita-se que a
alta atividade do composto (15) se deve ao OH livre presente no anel A, ou seja, a
quantidade de grupos hidroxil na chalcona pode ser o fator predominante para a
atividade citotóxica (NAVARINI et al., 2009).
O
OH
A B
OOH
A B
(15) (16)
OOH
OO
CH3 CH3
Br
O OH
A B
(17)
30
Hoje no Brasil há muitos estudos relacionados com as doenças
negligenciadas, sendo estas, causadas por deficiência na saúde pública, e de difícil
tratamento. A leishmaniose é um exemplo claro dessas doenças, por isso a
preocupação por parte dos pesquisadores em desenvolver um medicamento que
possa atuar em algum estágio da doença, já que não há muito interesse por parte
das indústrias farmacêuticas em investir nestas pesquisas.
Com relação às chalconas, um dos primeiros estudos com relação á
atividade antileishmania aconteceu em 1993 com a Licochalcona A (18), isolada da
raíz da Glycirrhiza inflata (YUNES et al., 2006).
O
OH
OCH3
OH
CH3CH3
CH2
A B
(18)
Estudos realizados com outras duas chalconas derivadas da xantoxilina
obtidas sinteticamente (19) e (20), porém ambas substituídas no anel B por grupos
como flúor ou nitro nas posições para e meta respectivamente apresentaram
significativo aumento na atividade antileishmania (BOECK et al., 2006).
O
OO
OH
CH3CH3
NO 2
A B
OO H
O O
C H 3 C H 3
F
A B
(19) (20)
A seletividade e facilidade na síntese destes compostos os tornam
potenciais candidatos a novas drogas com atividade antileishmania (YUNES et al.,
2006).
Outra doença expandida por deficiência na saúde pública é a SIDA
(Síndrome da Imunodeficiência adquirida). As três enzimas mais importantes
encontradas no vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) são transcriptase
31
reversa, protease e integrase, sendo que, esta última vem sendo considerada um
alvo potencial na busca por novas drogas anti-HIV, pois ela executa um papel
essencial na replicação do vírus. Recentemente uma pesquisa revelou que duas
chalconas (21) e (22) foram capazes de inibir seletivamente a enzima integrase
(DENG et al., 2006).
OH
OH
O
OH
O
OH
OCH3
A B A B
(21) (22)
Com o intuito de obter compostos mais ativos, Deng e colaboradores (2007)
aplicaram um modelo farmacofórico a partir destas duas chalconas mais ativas e
identificaram o composto (23) como mais potente que as chalconas iniciais.
NH N
NN
NH
NHN
OH
Br
NO2
(23)
Algumas chalconas foram aprovadas para uso na clínica médica
(DIMMOCK et al., 1999), uma delas é a Metochalcona (24) vendida na Espanha e na
Itália como Vezydryl ®, Auxibilina ® ou Megalip ® com atividade colerética e/ou
hepatoprotetora (Ni et al., 2004).
32
A B
OO
O
CH3
CH3
O
CH3
(24)
A Sofalcona (25) também é uma chalcona e possui atividade antiulcerosa e
mucoprotetora (ISOMOTO et al., 2005) vendida no Japão pelo nome de Solon®.
OCH3
O
OHCH3
O
O
OCH3
CH3
A B
(25)
Há também a Hesperidina Metil-Chalcona (26) vendidas em muitos países
com nomes como Fabroven®, Elancyl®, Venart®, entre outros, geralmente vem
associada a outros princípios ativos e é indicada em casos de patologias
relacionadas ao sistema circulatório.
O
O
O
OH OH
OH
CH3
OHOH
OH
O
OOH CH3
O
CH3
OH
O A
B
(26)
33
Como se pode perceber as chalconas têm demonstrado promissoras
atividades biológicas e perfil de segurança em muitos ensaios biológicos sendo
considerados compostos em potencial para a descoberta de novos protótipos de
fármacos (NI; MENG; SIKORSKI., 2004).
34
4 PARTE EXPERIMENTAL
4.1 Identificação dos Compostos
Para análise de pureza dos compostos sintetizados foi utilizado cromatografia
em camada delgada. Na caracterização foi utilizado ponto de fusão, técnicas
espectroscópicas de infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (RMN 1H) e ressonância magnética nuclear de carbono (RMN 13C).
Os pontos de fusão foram determinados com um aparelho Microquímica APF-
301.
Para a cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas
cromatofolhas de sílica gel PF254 Sigma, utilizando diferentes eluentes conforme
cada série de compostos. Os solventes utilizados foram adquiridos comercialmente
da Aldrich, Merck, etc. Os “spots” foram visualizados através de luz UV de ondas
curtas e com reagentes específicos em alguns casos.
Os espectros de infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro Bomem
100 (UNIVALI), com as substâncias incorporadas em pastilhas de KBr, sendo que as
absorções foram registradas em escala de centímetro recíproco (cm1). Os
espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro Brucker 300 MHz
(UNIVALI) usando como solvente Clorofórmio- d1; DMSO-d6 ou Acetona- d6
adquiridos comercialmente da Aldrich. Os deslocamentos químicos foram expressos
em valores adimensionais (ppm) em relação a um padrão interno de tetrametilsilano
(TMS).
4.2 Síntese
4.2.1 Síntese da Floroacetofenona (1-(2,4,6-trihidr oxifenil)etanona)
Para a obtenção da xantoxilina por meios sintéticos se fez necessário
sintetizar primeiramente a floroacetofenona a partir do floroglucinol. A reação ocorre
por condensação da nitrila com o fenol em presença de cloreto de zinco e ácido
clorídrico formando uma hidroxiarilcetona (VOGEL, 1987).
35
Foi adicionado 80g de Floroglucinol seco; 67,2 mL de Acetonitrila anidra;
320 mL de éter seco e 16g de zinco fundido, finamente pulverizado, em um balão de
1L, equipado com um tubo largo de desprendimento de gás e um tubo de segurança
de cloreto de cálcio, presos por meio de uma rolha de borracha com dois furos.
Enquanto o balão é resfriado em um banho de gelo, foi borbulhada uma corrente
rápida de gás clorídrico seco através da solução durante 2 horas, com agitação
ocasional. O balão foi deixado no freezer durante 24 horas e passado novamente
gás clorídrico na mistura laranja por mais duas horas. O balão ficou no freezer por 3
dias. Formou-se um precipitado amarelo-alaranjado do cloridrato de cetimina. O
sólido foi lavado com duas porções de éter anidro e transferido com ajuda de cerca
de 1L de água quente para um balão de fundo redondo equipado com um
condensador de refluxo. A solução foi fervida vigorosamente por 2 horas. Foi
adicionado 4-5g de carvão ativo e ferveu-se por mais 5 minutos. A solução foi filtrada
em funil de Buchner previamente aquecido e após algumas horas observou-se a
formação das agulhas amarelo-pálidas ou incolores de floroacetofenona (VOGEL,
1987). Um esquema da reação encontra-se no Figura 2. O rendimento foi de
aproximadamente 13%. Para a confirmação de pureza do produto formado ao final
da reação, foi realizada CCD, utilizando uma mistura de Clorofórmio/Metanol 75:15
como eluente.
OH
OH
OH
+ CH3CNHCl ZnCl2
Éter
OH OH
OH
NHCH3 ,HCl
OH OH
OH
O CH3
H2O
Floroglucinol Cloridrato de cetimina Floroacetofenona
Figura 2: Reação de síntese da floroacetofenona.
4.2.2 Síntese da Xantoxilina (1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)etan ona)
A floroacetofenona então foi misturada juntamente com o sulfato de dimetila,
acetona e carbonato de potássio sob refluxo para a metilação nos grupos –OH
36
especificamente nas posições 4 e 6 da estrutura e, conseqüente, formação da
xantoxilina.
Em um balão de duas bocas, foi adicionado 29,76 mmol de floroacetofenona
e 170 mL de acetona, deixando-se agitar até que todo o sólido fosse dissolvido. Em
seguida foi adicionado o carbonato de potássio (59,55 mmol) e gota a gota o sulfato
de dimetila (65,49 mmol), agitando-se sob refluxo até a formação completa da
xantoxilina (Figura 3). Após evaporar o solvente, acidificou-se com HCl concentrado
á 0oC. Ao final, a solução foi extraída com diclorometano (3 x 25 mL) (BOECK,
2005). A reação foi acompanhada por CCD utilizando os solventes Hexano/Acetato
de etila 60:40 e o produto final formado foi purificado por cromatografia em coluna
(CC) utilizando os mesmos solventes. A reação durou em torno de 24 h e o produto
foi obtido com 47% de rendimento.
O
CH3
OH
OH OH
+ (CH3)2SO4
O O
OH
CH3 CH3
O
CH3K2CO3
Acetona
Floroacetofenona Xantoxilina
Figura 3: Reação de síntese da Xantoxilina.
4.2.3 Síntese das Chalconas
As chalconas foram sintetizadas baseando-se no princípio de Topliss na
tentativa de verificar uma possível relação entra a estrutura química e atividade
biológica. As reações de síntese das chalconas sofreram modificações com o intuito
de facilitar a obtenção dos compostos, já que alguns grupamentos têm a
propriedade de doar ou sacar elétrons o que pode facilitar ou desfavorecer a reação.
37
4.2.3.1 Preparação das chalconas (27 – 31)
Esta série de chalconas foi sintetizada seguindo o método de condensação
aldólica de Claisen-Schmidt a partir da Xantoxilina e variando-se os aldeídos
aromáticos (Figura 4). As reações foram monitoradas através de CCD e os eluentes
utilizados foram Hexano/Acetato de etila 60:40. Os compostos obtidos foram
purificados através de cromatografia em coluna e como fase móvel foi utilizado
Hexano/Acetato de etila em diferentes concentrações.
OH
O O
O
CH3
CH3 CH3
+
O
H
OOH
O O
CH3 CH3
NaOH
EtOH/H2O
YY
A BAB
Y= H (27), 4-OCH3 (28), 4-CH3 (29), 4-Cl (30), 3,4-Cl2 (31)
Figura 4: Reação geral de condensação aldólica das chalconas (27 – 31).
(2E)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-fenilprop-2-en- 1-ona (27)
OO
O OH
CH3
CH3
A B
A xantoxilina (0,92 mmol) foi solubilizada em etanol (8 mL) e adicionou-se a solução
de NaOH 50% (p/v) (2,5 mmol). Depois de alguns minutos foi adicionado o
benzaldeído (0,95 mmol). A reação foi mantida sob refluxo por 1 hora. Após o
término da reação foi utilizado HCl 1:1 para a precipitação do produto. Em seguida o
produto formado foi filtrado em funil de Buchner (BOECK, 2005).
Duração: 1 h; rendimento: 47 %; p.f.: 88,9 – 90,4 oC (BOECK et al., 2006, p.f.= 85 –
86 oC).
Fórmula molecular: C17H15O4 (284 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1629,35 (ν -C=O).
38
1H RMN (C3D6O, ppm): 7,89 (d, Hα, J=15,75), 7,76 (d, Hβ, J=15,75 ), 5,95 – 7,61 (m,
7 H, Ar), 3,9 e 3,82 (s, CH3O), 14,32 (s, H-O). 13C RMN (C3D6O, ppm): 192,59 (C=O), 128,81 (Cβ) e 142,23 (Cα), 55,77 e 55,50 (2x
OCH3).
(2E)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil-3-(4-metoxifenil)p rop-2-en-1-ona (28)
OO
O OH
CH3
CH3O
CH3
A B
A metodologia foi similar a do composto 27, porém o tempo de reação foi de 17
horas.
Duração: 17 h; rendimento: 33 %; p.f.: 107,1 - 109 oC (BOECK et al., 2006, p.f.= 109
– 110 oC).
Fórmula molecular: C18H18O5 (314 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1629,35 (ν -C=O). 1H RMN (C3D6O, ppm): 7,91 (d, Hα, J=15,59), 7,76 (d, Hβ, J=15,59 ), 6,08 – 7,68 (m,
6 H, Ar), 4,0, 3,86 e 3,87 (s, 3x CH3O), 14,35 (s, H-O). 13C RMN (C3D6O, ppm): 193,34 (C=O), 128,95 (Cβ) e 143,25 (Cα), 56,48, 56,04 e
55,75 (3 x OCH3).
(2E)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-(4-metilfenil)p rop-2-en-1-ona (29)
OO
O OH
CH3
CH3CH3
A B
A metodologia foi similar a do composto 27 e a reação foi mantida á temperatura
ambiente em chapa de agitação por 17 horas.
39
Duração: 17 h; rendimento: 38 %; p.f.: 129 - 132 oC (BOECK et al., 2006, p.f.= 125 –
126 oC).
Fórmula molecular: C18H18O4 (298 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1629,35 (ν -C=O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 7,78 (d, Hα, J=15,58), 7,88 (d, Hβ, J=15,58 ), 5,97 – 7,9 (m, 6
H, Ar), 3,93 e 3,85 (s, OCH3), 14,32 (s, H-O), 2,4 (s, - CH3). 13C RMN (C3D6O, ppm): 192,5 (C=O), 128,41 (Cβ) e 142,53 (Cα), 55,52 e 55,84 (2x
OCH3).
(2E)-3-(4-clorofenil)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)p rop-2-en-1-ona (30)
OO
O OH
CH3
CH3Cl
A B
A metodologia foi similar a do composto 27 e a reação foi mantida á temperatura
ambiente em chapa de agitação por 14 horas.
Duração: 14 h; rendimento: 49 %; p.f.: 169,4 – 171,7 oC (BOECK et al., 2006, p.f.=
173 – 175 oC).
Fórmula molecular: C17H15O4Cl (318,5 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1630,68 (ν -C=O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 7,85 (d, Hα, J=15,43), 7,7 (d, Hβ, J=15,43 ), 5,95 – 7,53 (m, 6
H, Ar), 3,91 e 3,83 (s, 2x CH3O), 14,24 (s, H-O). 13C RMN (CDCl3, ppm): 192,3 (C=O), 128,03 (Cβ) e 140,74 (Cα), 55,87 e 55,58 (2x
OCH3).
40
(2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifen il)prop-2-en-1-ona (31)
OO
O OH
CH3
CH3Cl
Cl
A B
A metodologia foi similar a do composto 27 e a reação foi mantida á temperatura
ambiente em chapa de agitação por 12 h.
Duração: 12 h; rendimento: 58 %; p.f.: 121,9 – 123,1 oC (BOECK et al., 2006, p.f.=
120 – 123 oC).
Fórmula molecular: C17H14O4Cl2 (353 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1618,49 (ν -C=O). 1H RMN (C3D6O, ppm): 7,83 (d, Hα, J=16,1), 7,64 (d, Hβ, J=16,1 ), 5,96 – 7,58 (m, 5
H, Ar), 3,91 e 3,83 (s, 2x CH3O), 14,12 (s, H-O). 13C RMN (C3D6O, ppm): 191,99 (C=O), 129,27 (Cβ) e 139,21 (Cα), 55,96 e 55,54 (2x
OCH3).
4.2.3.2 Síntese da chalcona (32)
A chalcona (32) foi primeiramente sintetizada por Boeck e colaboradores
(2005) e também foram realizados alguns ensaios para a verificação da atividade
biológica. Numa série de chalconas derivadas da xantoxilina esta molécula foi a mais
potente com relação á atividade antinociceptiva, este dado serviu como base para a
continuação deste trabalho.
A síntese foi realizada utilizando como reagentes a xantoxilina e o 2-
carboxibenzaldeído. A reação foi monitorada através de CCD e como solventes
utilizou-se Hexano/Acetato de etila 60:40. A Figura 5 mostra o esquema da reação.
41
OO
O OH
CH3
CH3
O OH
A B
O
H
O
OH
CH3
OO
O OH
CH3
CH3
+A BEtOH/H2O
NaOH
Figura 5: Reação de condensação aldólica da chalcona (32).
2-[(1E)-3-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-oxoprop-1-en-1- il]ácido benzóico (32)
A xantoxilina (0,92 mmol) foi solubilizada em etanol (8 mL) em seguida foi
adicionado a solução de NaOH 50% (p/v) (2,5 mmol). Depois de alguns minutos
colocou-se o 2-carboxibenzaldeído (0,95 mmol). A reação foi mantida á temperatura
ambiente por 24 horas. Após o término a reação foi neutralizada com HCl 1:1 até
precipitação do produto, o qual, foi filtrado em funil de Buchner (BOECK, 2005).
Duração: 24 h; rendimento: 30 %; p.f.: 161,5 – 162 oC (BOECK et al., 2006, p.f.= 160
– 161 oC).
Fórmula molecular: C18H16O6 (328,0 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1640 (ν -C=O). 1H RMN (C3D6O, ppm): 3,84 e 3,93 (s, 2x CH3O), 7,81 (d, Hα, J =15,49), 8,44 (d, Hβ,
J = 15,49), 6,09-7,81 (m, 6H Ar), 13,99 (s, HO). 13C RMN (C3D6O, ppm): 199,06 (C=O), 128,9 (Cβ) e 139,6 (Cα), 55,30 e 55,44 (2x
OCH3).
4.2.4 Síntese das Benzofuranonas
Inicialmente tentou-se sintetizar uma série de chalconas derivadas da
chalcona (32), porém o que se obteve foi uma nova classe de compostos, as
benzofuranonas, que deixou de possuir a cetona α,β insaturada em sua estrutura e
passou a ter de um anel lactônico de cinco membros diretamente ligado ao anel
aromático.
42
4.2.4.1 Preparação dos compostos (33 – 37)
Estes compostos foram sintetizados a partir do 2-carboxibenzaldeído e
variando as acetofenonas (Figura 6) através de um mecanismo ainda não elucidado,
porém o que pode ter ocorrido é um rearranjo entre o grupo carboxila e a
insaturação dos carbonos α e β dando origem a esta nova classe de compostos. As
reações foram monitoradas através de CCD e como eluentes uma mistura de
solventes contendo Hexano/Acetato de etila 60:40. Os compostos foram purificados
através de cromatografia em coluna utilizando Hexano:Acetato de etila em diferentes
concentrações como fase móvel.
A B
B
AH
O
O
OH
+CH3
O
NaOH
EtOH/H2O
OOO
XX
X= H (33), 4-OCH3 (34), 4-CH3 (35), 4-Cl (36), 3,4-Cl2 (37)
Figura 6: Reação geral de síntese das benzofuranonas.
3-(2-oxo-2-feniletil)-2-benzofuran-1(3 H)-ona (33)
OOO
A
B
Primeiramente a acetofenona (0,92 mmol) foi solubilizada em etanol (25 mL), depois
foi adicionado a solução de NaOH 50% (p/v) (2,5 mmol). Depois de alguns minutos
colocou-se o 2-carboxibenzaldeído (0,95 mmol) e a reação foi mantida em chapa de
agitação com aquecimento contínuo por 14 h. Após o término da reação foi
adicionado algumas gotas de uma solução de HCl 1:1 até precipitação. O produto foi
filtrado em funil de Buchner (BOECK, 2005).
43
Duração: 14 h; rendimento: 53 %; p.f.: 146,5 – 147,5 oC.
Fórmula molecular: C16H13O3 (253 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1771,24 (ν -C-C=O), 1682,17 (ν -O-C=O) e 1212,16 (ν -
C-O). 1H RMN ((CD3)2SO, ppm): 3,8 – 3,82 (dd, 1H, CH2) e 3,76 – 3,8 (dd, 1H, CH2), 6,11
(dd,1H, CH), 7,51 – 8,01 (m, 9 H, Ar). 13C RMN ((CD3)2SO, ppm): 196,52 (C=O-C), 169,92 (O-C=O), 42,75 (CH2), 77,2
(CH).
3-[2-(3-metoxifenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (34)
OOO
OCH3
A
B
A metodologia foi similar a do composto 33 e o tempo de reação foi de 25 horas.
Duração: 25 h; rendimento: 68 %; p.f.: 121 – 122,5oC.
Fórmula molecular: C17H15O4 (283 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1759,95 (ν -C=O-C), 1676,9 (ν -C=O) e 1216,47 (ν -C-
O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 3,67 – 3,75 (dd, 1H, CH2) e 3,29 – 3,37 (dd, 1H, CH2), 6,15
(dd,1H, CH), 3,87 (s, 3H, OCH3), 6,92 – 7,94 (m, 8 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 194,38 (C=O-C), 170,11 (O-C=O), 43,24 (CH2), 76,55 (CH),
55,46 (OCH3).
44
3-[2-(4-metilfenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (35)
OOO
CH3A
B
A metodologia foi similar a do composto 33, porém a reação foi mantida a
temperatura ambiente e o tempo de reação foi de 5 horas.
Duração: 5 h; rendimento: 64 %; p.f.: 149,1 – 150,1 oC.
Fórmula molecular: C17H14O3 (266 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1761,57 (ν -C-C=O), 1673,5 (ν -O-C=O) e 1213,17 (ν -C-
O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 3,34 – 3,40 (dd, 1H, CH2), 3,73 – 3,78 (dd, 1H, CH2), 6,17
(dd,1H, CH), 2,42 (s, 3H, CH3), 7,29 – 7,92 (m, 8 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 196,0 (C=O-C), 170,15 (O-C=O), 43,67 (CH2), 77,7 (CH),
43,49 (CH3).
3-[2-(4-clorofenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (36)
OOO
ClA
B
A metodologia foi similar a do composto 33, porém a reação foi mantida á
temperatura ambiente em chapa de agitação por 30 minutos.
Duração: 20 min; rendimento: 45 %; p.f.: 147,5 – 148,6 oC.
Fórmula molecular: C16H11O3Cl (286,5 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1754,57 (ν -C-C=O), 1679,58 (ν -O-C=O) e 1217,88 (ν -
C-O).
45
1H RMN (CDCl3, ppm): 3,69 – 3,76 (dd, 1H, CH2) e 3,34 – 3,42 (dd, 1H, CH2), 6,15
(dd,1H, CH), 7,44 – 7,92 (m, 8 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 194,84 (C=O-C), 170,03 (O-C=O), 43,65 (CH2), 76,64 (CH).
3-[2-(3,4-diclorofenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (37)
OOO
Cl
Cl
A
B
A metodologia foi similar a do composto 33, porém a reação foi mantida á
temperatura ambiente em chapa de agitação por 20 minutos.
Duração: 20 min; rendimento: 78 %; p.f.: 192,3 – 192,4 oC.
Fórmula molecular: C16H10O3Cl (321g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1751,53 (ν -C-C=O), 1682,08 (ν -O-C=O) e 1215,47 (ν -
C-O). 1H RMN ((CD3)2SO, ppm): 3,85 – 3,93 (dd, 1H, CH2) e 3,72 – 3,8 (dd, 1H, CH2), 6,09
(dd,1H, CH), 7,59 – 8,21 (m, 7 H, Ar). 13C RMN ((CD3)2SO, ppm): 206,51 (C=O-C), 194,81(O-C=O), 42,84 (CH2), 76,84
(CH).
4.2.4.2 Síntese da benzofuranona (38)
Ao purificar a chalcona (32), verificou-se através da CCD que houve a
formação de outro produto com rf diferente do composto inicial e não apenas a
recristalização do mesmo. Através da análise espectroscópica pôde-se confirmar a
estrutura do novo composto formado.
46
2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il)-1-(2-hidroxi-4,6- dimetoxifenil)etanona (38)
Este composto foi obtido ao acaso a partir da recristalização da chalcona
(32) utilizando o metanol como solvente. Neste sentido o composto (32) foi
solubilizado em etanol e aquecido sob uma chapa quente (Figura 7).
OO
O OH
O OH
CH3
CH3
OO
O
O
OH
CH3
CH3
O
A B A
B
Aquecimento
Etanol
Figura 7: Esquema da reação de obtenção do composto (38).
Foi adicionado etanol em um bécker contendo o composto (32), esta solução foi
aquecida sob uma chapa quente. Após total solubilização, o mesmo foi resfriado até
a formação dos cristais do composto (38). Os cristais foram filtrados sob vácuo.
Rendimento: 53 %; p.f.: 172,8 – 173 oC.
Fórmula molecular: C18H16O6 (304 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1761,9 (ν -C-C=O), 1614,07 (ν -O-C=O) e 1216,62 (ν -C-
O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 3,81 (dd, 1H, CH2) e 3,41 (dd, 1H, CH2), 6,16 (dd,1H, CH),
5,92 – 7,91 (m, 6 H, Ar), 3,83 e 3,8 (s, 6H, 2x OCH3) , 13, 74 (s, OH). 13C RMN (CDCl3, ppm): 200,2 (C=O-C), 170,4 (O-C=O), 48,9 (CH2), 77,4 (CH), 55.6
(2x OCH3).
4.3 Avaliação da Atividade Antinociceptiva
4.3.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos ou fêmeas pesando entre 25 a
35 gramas, aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C c om ciclo claro/escuro de 12
horas mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com água e ração “ad
47
libitum”. Os animais permaneceram no ambiente do teste pelo menos 1 h antes da
realização dos experimentos para se adaptarem. Em todos os modelos diferentes
grupos de camundongos foram pré-tratados com os compostos sintetizados 30 min
antes da realização do teste, quando os compostos foram injetados via i.p, e 1 hora
antes, quando os compostos foram administrados pela via oral. Os animais do grupo
controle receberam somente veículo (soro fisiológico e tween 80).
Os procedimentos da pesquisa envolvendo animais seguiram os princípios
internacionais orientados para a pesquisa biomédica (ZIMMERNANN, 1983). A
presente pesquisa buscou atender todos os princípios éticos postulados pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e a lei n.º 6638, de 08 de
maio de 1979, mais especificamente o artigo 4º, parágrafo 1 e 2. Considerando
esses aspectos éticos, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical ou
câmara de CO2, a fim de evitar ao máximo o sofrimento desnecessário.
Os experimentos foram realizados pela equipe liderada pela professora Dra.
Fátima de Campos Buzzi do Curso de Farmácia da UNIVALI e estavam de acordo
com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde/MS de 10/10/96 tendo sido
aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da UNIVALI através do parecer
número 595/2007 (Anexo A).
4.3.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pel o ácido acético
Embora este seja um modelo de nocicepção pouco específico, ele permite
avaliar a atividade antinociceptiva tanto em nível central quanto periférico (SOUZA et
al., 2003). Basicamente as contorções abdominais consistem na contração da
musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas posteriores,
de acordo com o método descrito anteriormente (COLLIER et al., 1968; SOUZA et
al., 2003).
A DI50 dos compostos foi realizada nas doses que variaram de 0,5 a 30
mg/kg pela via i.p e 100 mg/kg quando administrados pela via oral. Foi aplicado
intraperitonealmente (i.p.) ácido acético (0,6 % (v/v), dissolvido em NaCl 0,9% (p/v)
numa dose de 0,15 ml/10 g de peso (COLLIER et al., 1968; SOUZA et al., 2003). As
contorções foram quantificadas cumulativamente durante 20 minutos e o indicativo
de antinocicepção foi a redução da resposta nociceptiva à contorção, em relação ao
grupo controle.
48
4.3.3 Modelo de dor induzida pela formalina
Este modelo é mais específico que o modelo de contorções abdominais, e
permite avaliar dois tipos distintos de dor: a dor neurogênica, que ocorre devido à
estimulação direta dos neurônios nociceptivos, e a de origem inflamatória que está
relacionada com a liberação de mediadores químicos da inflamação (SOUZA et al.,
2003).
Neste teste foi realizada a DI50 do composto (38) nas doses de 3,0, 6,0 e 10,0
mg/kg administrado pela via i.p.
Os camundongos receberam via intraplantar 20µL de solução formalina a
2,5% (v/v) (resultante da diluição de formaldeído 0,92%), e foram imediatamente
colocados sob um funil de vidro invertido ao lado de um espelho para auxiliar na
observação. Foi registrada durante os 5 minutos iniciais a dor de origem
neurogênica, expressa pelo tempo gasto com o comportamento de lamber ou
morder a pata injetada. Decorridos 10 minutos ocorreu o início da segunda fase do
processo doloroso, na qual, foi observada a dor inflamatória durante 15 minutos
observando também o tempo gasto pelo animal em lamber ou morder a pata injetada
(HUNSKAAR; FASMER; HOLE, 1985).
4.3.4 Modelo de dor induzida pela capsaicina
Através deste modelo pode-se analisar a possível ação modulatória dos
compostos em estudo, sobre a dor neurogênica. A injeção da capsaicina induz a
estimulação direta de receptores específicos localizados nos neurônios nociceptivos,
causando a liberação de vários neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa,
incluindo principalmente as taquicininas (substância P, neurocinina A e neurocinina
B) (SAKURADA et AL.,1992).
A DI50 do composto (38) foi realizada neste teste nas doses de 3,0, 6,0 e 10,0
mg/kg administrado pela via i.p.
Durante o teste os animais inicialmente passaram por um período de
adaptação de 20 minutos (sob um funil de vidro). Após este tempo, os animais
receberam pela via intraplantar 20 µL de capsaicina (1,6 µg / pata) em uma das
patas posterior e em seguida, os animais foram novamente colocados sob o funil de
49
vidro e então foi cronometrado o tempo em que permaneceram mordendo ou
lambendo a pata injetada por um período de 5 minutos, sendo este o indicativo de
dor.
4.3.5 Modelo de dor induzida pelo glutamato
Este estudo avalia substâncias que atuam sobre o sistema glutamatérgico. A
injeção de glutamato induz a estimulação direta dos neurônios nociceptivos,
causando a liberação de vários mediadores inflamatórios e neuropeptídeos
envolvidos na transmissão dolorosa (SOUZA et al., 2003).
O composto (38) foi administrado das doses de 6,0, 10,0 e 30 mg/kg pela via
i.p neste teste para verificar o valor da DI50.
Os animais receberam um volume de 20 µL de solução de glutamato (30
mmol/pata) injetada por via intraplantar na pata posterior direita. Em seguida, os
animais foram colocados individualmente em funis de vidro de 20 cm de diâmetro e
observados por 15 minutos. O tempo gasto em lamber ou morder a pata injetada foi
cronometrado e considerado indicativo de dor (Beirith et al., 1998).
4.3.6 Modelo de sensibilidade térmica (teste da pla ca quente)
Este modelo mede o limiar antinociceptivo de compostos com analgesia
semelhante aos opióides. Os animais foram pré-selecionados 24 horas antes do
teste para verificação do limiar nociceptivo.
Neste teste, o composto (38), foi administrado na dose de 10 mg/kg pela via
i.p. Os camundongos foram colocados sobre uma placa quente imersa em banho
maria previamente aquecido a 56oC. O tempo em segundos em que cada animal
levou para lamber, morder ou levantar as patas foi considerado indicativo do efeito
nociceptivo. O tempo máximo permitido aos animais para permanecer sobre a placa
é de 30 segundos para evitar danos teciduais causados pelo aquecimento (EDDY;
LEIMBACK, 1953; SOUZA et al., 2003). Também foi realizado um controle positivo
do teste com animais submetidos ao tratamento com morfina (5mg/kg) administrada
pela via subcutânea.
50
4.4 Análise Estatística
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média,
exceto a DI50 (dose que reduz a resposta para 50% em relação ao grupo controle),
que foi apresentada como média geométrica acompanhada de seu respectivo limite
de confiança em nível de 95%. As análises estatísticas dos resultados foram
realizadas por meio de análise de variância seguida pelo teste de múltipla
comparação utilizando-se o método de Dunnett, quando apropriado. Valores de p <
0,05 foram considerados como indicativos de significância. A DI50 foi estimada a
partir de experimentos individuais em programa estatístico Graphpad Instat.
4.5 Relação Estrutura-Atividade - Método de Toplis s
Foram sintetizados cinco compostos para cada série, sendo que, estes
possuíam anel aromático na sua estrutura onde estavam presentes os seguintes
substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4 –OCH3. (TOPLISS, 1976; CECHINEL-
FILHO; NUNES; YUNES., 1993). Com relação à série das chalconas os reagentes
utilizados foram: benzaldéido, 4-metóxibenzaldeído, 4-metilbenzaldeído, 4-
clorobenzaldeído e 3,4-diclorobenzaldeído, vale lembrar que, estas substituições
ocorreram no anel B das estruturas. No caso das benzofuranonas utilizou-se:
acetofenona, 4-metóxiacetofenona, 4-metilacetofenona, 4-cloroacetofenona e 3,4-
dicloroacetofenona e diferentemente das outras séries, as substituições ocorreram
no anel A. Estes compostos foram avaliados quanto à atividade antinociceptiva e foi
determinada a ordem de potência dos parâmetros hidrofóbicos, eletrônicos e
estéricos (Tabela 2).
Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por Topliss
Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss
π 2π– π 2 σσσσ π + σσσσ 2π - σσσσ π - σσσσ π - 2σσσσ π - 3σσσσ Es
3,4-Cl2 1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5
51
4-Cl 2 1-2 2 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5
4-CH3 3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5
4-OCH3 4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5
H 4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1
Após a avaliação deste método manual pôde-se estabelecer os reagentes
que foram utilizados nas próximas sínteses (Tabela 3) e desta forma, a atividade
biológica dos compostos contendo os substituintes sugeridos foi verificada
novamente para a validação do método.
Tabela 3: Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos
Prováveis parâmetros mais ativos Seleção de novos s ubstituintes
π, π + σσσσ, σσσσ, 3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;
4-C-C5H9
π, 2π – σσσσ,, π – σσσσ, 4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4-
O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
π - 2 σσσσ, π – 3 σσσσ, σσσσ 4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9;
4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3
2π – π2 4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3-
CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl2
4.6 Síntese dos derivados
Alguns derivados foram obtidos após análise das tabelas do método manual e
não-estatístico de Topliss com o intuito de obter um composto ainda mais ativo que
aqueles sintetizados anteriormente.
52
4.6.1 Síntese dos derivados da série das benzofuran onas
Para a obtenção de uma molécula mais ativa foram selecionadas as
seguintes acetofenonas: 3-metóxiacetofenona, e 4-bromoacetofenona e a 3,4-
dimetóxiacetofenona também foi utilizada devido a disponibilidade em laboratório e
para efeito de comparação com relação á atividade biológica. As reações foram
realizadas utilizando as acetofenonas selecionadas e o 2-carbóxibenzaldeído em
meio básico e foram acompanhadas através de CCD utilizando uma mistura de
solventes Hexano/Acetato de etila 70:30. Um esquema geral das reações encontra-
se na Figura 8.
OOO
A
B
CH3
O
X
+
O
H
O
OH
NaOH
EtOH/H2O
X X= 3,4-OCH3 (39), 3- OCH3 (40), 4-Br (41).
Figura 8: Reação de síntese dos compostos (39), (40) e (41).
3-[2-(3,4-dimetóxifenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1( 3H)-ona (39)
OOO
O
O
CH3
CH3
A
B
Primeiramente a acetofenona (1,93 mmol) foi solubilizada em etanol (16 mL), depois
foi adicionado a solução de NaOH 50% (p/v) (5,25 mmol). Depois de alguns minutos
colocou-se o carboxibenzaldeído (1,99 mmol). A reação foi mantida em chapa de
agitação por 48 horas. Após o término da reação foi adicionado algumas gotas de
uma solução de HCl á 50% até precipitação. O produto foi filtrado em funil de
Buchner (BOECK, 2005).
Duração: 48 h; rendimento: 59 %; p.f.: 152 – 152,7 oC.
53
Fórmula molecular: C18H16O5 (312 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1760,22 (ν -C-C=O), 1670,79 (ν -O-C=O) e 1259,44 (ν -
C-O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 3,72 – 3,78 (dd, 1H, CH2) e 3,33 – 3,39 (dd, 1H, CH2), 6,17
(t,1H, CH), 3,95 (2s, 6H, 2x OCH3), 6,88 – 7,93 (m, 7 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 194,49 (C=O-C), 170,19 (O-C=O), 43,17 (CH2), 77,50 (CH).
3-[2-(3-metóxifenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (40)
OOO
OCH3
A
B
A metodologia foi similar a do composto 39, porém o tempo de reação foi de 24
horas.
Duração: 24 h; rendimento: 57 %; p.f.: 134,2 – 135,8 oC.
Fórmula molecular: C17H14O4 (282 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1765,21 (ν -C-C=O), 1682,33 (ν -O-C=O) e 1255,98 (ν -
C-O). 1H RMN (CDCl3, ppm): 3,74 – 3,78 (dd, 1H, CH2) e 3,37 – 3,43 (dd, 1H, CH2), 6,17
(t,1H, CH), 3,87 (s, 3H, O-CH3), 7,14 – 7,93 (m, 8 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 195,86 (C=O-C), 170,15 (O-C=O), 43,77 (CH2), 77,45 (CH).
3-[2-(4-bromofenil)-2-oxoetil]-2-benzofuran-1(3 H)-ona (41)
OOO
BrA
B
A metodologia foi similar a do composto 39, porém o tempo de reação foi de 28
horas.
54
Duração: 28 h; rendimento: 43 %; p.f.: 147 – 149,9 oC.
Fórmula molecular: C16H11O3Br (330,9 g/mol).
IV (pastilhas de KBr, cm-1 ): 1749,28 (ν -C-C=O), 1682,99 (ν -O-C=O) e 1215,92 (ν -
C-O). 1H RMN (C3D6O, ppm): 3,78 (dd, 1H, CH2) e 3,75 (dd, 1H, CH2), 6,15 (t,1H, CH), 7,58
– 8,03 (m, 8 H, Ar). 13C RMN (CDCl3, ppm): 195,02 (C=O-C), 170,00 (O-C=O), 43,59 (CH2), 77,02 (CH).
4.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
As análises de atividade antimicrobiana foram realizadas no Laboratório de
Pesquisa em Microbiologia do curso de Farmácia da UNIVALI pela equipe do
professor Dr. Alexandre Bella Cruz.
Para os testes microbiológicos foram utilizados os microrganismos: Bactérias
Gram-negativas: Escherichia coli (ATCC 11775), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853); Bactérias Gram-positivas: Bacillus cereus (ATCC 14579), Bacillus subtilis
(ATCC ATCC 2385), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P); fungo leveduriforme:
Candida albicans (ATCC 10231).
Os compostos foram dissolvidos em solução de dimetilformamida (DMF) e
solução aquosa com 10% de tween 80 (4:6) e adicionadas em séries de 10 frascos
com capacidade para 5 mL em diferentes concentrações (50 a 500 µg/mL). Em
seguida, a cada frasco foi adicionado 1 mL de meio agar Mueller-Hinton para as
bactérias e ágar Sabouraud dextrosado para a levedura, seguido de imediata
homogeneização da mistura. Após a solidificação dos respectivos meios de cultura,
os microrganismos, previamente ativados, foram inoculados com alça calibrada de
10 µL, sendo então, incubados a 37 °C por 18 a 24 horas para as bactérias e 25 °C
por 24 a 48 horas para o fungo leveduriforme, A concentração final de DMF nos
ensaios não excedeu a 2 %.
Após o período de incubação, efetuou-se a leituras da concentração inibitória
mínima através da observação da presença ou não de crescimento visível. Para
interpretação dos resultados foi considerada como concentração inibitória mínima
aquela que inibir totalmente o crescimento microbiano.
55
Como controle positivo empregou-se frascos com os microrganismos
inoculados sem a presença dos compostos teste. A leitura dos resultados foi
considerada válida somente quando houve crescimento microbiano nos controles.
Utilizou-se também como controle negativo os antibacterianos Amoxicilina (Sigma A-
8523) e Vancomicina (Sigma V-2002), e o antifúngico Cetoconazol (Sigma K-1003).
Os ensaios foram repetidos por três vezes.
4.8 Avaliação da Atividade Antiparasitária
A atividade contra a doença de chagas, antileishmania e antimalárica foram
avaliadas pelo grupo da Universidad Mayor de San Andrés de La Paz na Bolívia sob
a orientação do professor Dr. Alberto Gimenez. Os experimentos foram realizados in
vitro utilizando culturas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. donovani na forma
promastigotas cultivados a 26 °C em meio Schneider suplementado com 5% de soro
fetal bovino inativado (56 °C x 30min). Parasitas e m fase logarítmica de crescimento
na concentração de 1x106 parasitas/mL foram distribuídos em micro-placas de 96
poços com diferentes concentrações das substâncias a serem testadas (100, 50 e
25 µg/mL) e incubados por 72 horas. A atividade foi determinada através da
contagem óptica de células em um microscópio invertido. Os testes foram realizados
em triplicata e os medicamentos utilizados como referência foram Pentamidina /
Glucantime (50 - 100 µg/mL). Sob as mesmas condições, formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi foram cultivadas em meio com infusão de fígado e triptose
suplementado com 5% de soro fetal bovino. Os parasitas foram distribuídos na
concentração de 1x104 parasitas/mL e os medicamentos utilizados como referência
foram Mebendazol (10 µg/mL) / Anfotericina B(10 µg/mL). A IC50 das substâncias foi
determinada através da interpolação da curva obtida plotando o logarítmico da
concentração utilizada versus a porcentagem de inibição utilizando um programa de
informática específico (GIMENEZ et al., 2004).
56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese
5.1.1 Chalconas
As chalconas foram sintetizadas através de uma derivação do método geral
de condensação aldólica de Claisen-Schimdt (CORREA et al., 2001) a partir da
xantoxilina e variados aldeídos aromáticos. O mecanismo destas reações ocorre em
quatro etapas, exemplificado no Esquema 1 para a chalcona (27). A primeira etapa
ocorre a partir da catálise básica do NaOH, o qual, remove um próton do carbono α
da acetofenona formando um íon enolato que se estabiliza pela ressonância. Na
segunda etapa este age como nucleófilo (carbânion) atacando o carbono carbonílico
dos diferentes aldeídos aromáticos, produzindo um alcóxido que na terceira etapa
remove um próton de uma molécula de água para formar o aldol. Na quarta, e última
etapa, ocorre a remoção do hidrogênio α, devido à sua acidez. E, em seguida, a
eliminação da hidroxila β formando a dupla ligação. E desta forma, a estabilização
do produto final pela ressonância das duplas ligações conjugadas.
1a Etapa
+
O
H
O
CH2
O-
+ OH2OH
-
-:CH2
2a Etapa
O
H +
O O
OOH
CH3
CH3
O O
OOH
CH3
CH3
O-
-:CH2
57
3a Etapa
O-
O O
OOH
CH 3
CH 3
+ O
H
H
O H O O
OOH
CH 3
CH 3
+ OH-
4a Etapa
OH O
H H
O
OOHCH3
CH3
+ OH-
OH O
OOH
CH3
CH3
O-
+ OH2
O O
OH O
CH3
CH3+ OH-
Esquema 1: Mecanismo de condensação aldólica das chalconas.
Todas as chalconas desta série, inclusive a chalcona (32), já foram relatadas
na literatura com indícios de atividade antinociceptiva (CAMPOS BUZZI et al., 2006)
e atividade antileishmania (BOECK et al., 2006). Porém, optou-se pela síntese
destes compostos segundo o método de Topliss com o objetivo de realizar a DI50 no
modelo de dor induzido pelo ácido acético, verificar possível relação estrutura-
atividade biológica e conseqüentemente sintetizar compostos mais potentes que os
iniciais validando assim o método proposto.
Os resultados das sínteses encontram-se na Tabela 4. Os compostos (29) e
(30) foram purificados através de coluna cromatográfica utilizando como solventes
Hexano:Acetato de etila e os compostos (27), (28) e (29) foram recristalizados
utilizando etanol e água. As reações apresentaram rendimentos satisfatórios (33 a
58%) e tempo de duração bem diversificado principalmente quando comparadas as
sínteses em temperatura ambiente e refluxo.
Algumas metodologias sofreram modificações com intuito de diminuir o tempo
da reação e aumentar o rendimento como, por exemplo, submeter às reações a
refluxo. Segundo Atkins e Jones (2001) muitas reações acontecem mais
58
rapidamente quando a temperatura é aumentada, ou seja, um acréscimo de 10oC
acima da temperatura ambiente pode duplicar a velocidade da reação. Porém,
mesmo submetendo ao refluxo, o tempo da reação contendo o grupo OCH3 não foi
menor que as outras reações que permaneceram á temperatura ambiente. O que
pode justificar este fato, é que, além dos substituintes do benzaldeído tem-se dois
grupos metóxi e um grupo hidróxi na acetofenona, ou seja, mais dois grupos
ativadores moderado e forte respectivamente que estariam doando elétrons,
intensificando a ligação C-H e dificultando a remoção do próton pelo NaOH e
conseqüentemente aumentando o tempo da reação e também diminuindo o
rendimento do produto final formado.
Tabela 4: Estrutura, tempo reacional e rendimento das chalconas (27-31).
OO
O OH
CH3
CH3
RA B
Estrutura
R
Código Tempo
reacional (h)
Rendimento
(%)
Ponto de fusão
(oC)
H (27) 1 (Refluxo) 47 88,9 – 90,4
4-OCH3 (28) 17 (Refluxo) 33 107,1 - 109
4-CH3
(29)
17 (Agitador
magnético)
38
129,0 – 132,0
4-Cl
(30)
14 (Agitador
magnético)
49
169,4 – 171,7
3,4-Cl
(31)
12 (Agitador
magnético)
58
121,9 – 123,1
Todas as chalconas foram caracterizadas por ponto de fusão e comparadas
com dados da literatura e também por espectroscopia de ressonância magnética
59
nuclear de carbono e hidrogênio. Os espectros de 1H RMN e 13C RMN da chalcona
(2E)-1-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona (27) foram selecionados a
título de ilustração e para demonstração dos valores. No espectro de 1H RMN
(Figura 9) pode-se observar um simpleto em 14,32 ppm referente ao hidrogênio do –
OH e outros dois em 3,82 e 3,90 ppm referentes aos hidrogênios das metoxilas. Em
7,76 (J= 15,75) e 7,89 ppm (J= 15,75) são evidenciados dois dubletos referentes aos
hidrogênios α,β insaturados e a constante de acoplamento (J) confirma a geometria
na forma E para o grupo alceno das chalconas sintetizadas. Os dois dubletos
presentes na região de 5,95 a 6,1 ppm são referentes aos hidrogênios dos carbonos
3’ e 5’ do anel A. E os sinais em 7,39 a 7,61 ppm são referentes aos hidrogênios
aromáticos do anel B.
X1a A811604_001.esp
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1Chemical Shift (ppm)
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.00
Nor
mal
ized
Inte
nsity
3.000.932.840.950.79
14.3
2
7.92
7.87
7.79
7.61
7.39
6.10
6.09
5.95
3.90
3.82
Figura 9: Espectro de RMN 1H da chalcona (27) (C3D6O / 300 MHz).
OO
O HOCH 3
CH 3
H
H
H
H
H
H
H
H
H
2
3
45
6A B
2'
3'
4'5'
6'α
β
11 '
60
No espectro de RMN 13 C (Figura 10) tem-se o sinal referente a carbonila em
192,59 ppm. A acetona absorve em 203,8 ppm, porém, a presença de uma
insaturação α,β causa um deslocamento para campo alto e a causa provável é a
deslocalização de carga pelo anel benzênico ou pela ligação dupla que torna o
carbono da carbonila menos deficiente de elétrons (SILVERSTEIN, BASSLER,
MORRILL., 1994). Os carbonos olefínicos α e β são observados em 142,23 e 128,81
ppm respectivamente. Os sinais em 55,5 e 55,77 ppm são referentes aos carbonos
das metoxilas. Em 106,28, 162,45, 93,76, 168,35, 91,18 e 166,19 ppm tem-se os
sinais referentes aos carbonos 1’ a 6’ presentes no anel A. E os carbonos 1 a 6
presentes no anel B podem ser verificados em 135,52, 129,98, 77,4, 76,56, 76,98 e
128,81 ppm. Segundo Silverstein e colaboradores (1994) os átomos de carbono
aromáticos substituídos podem ser distinguidos dos demais átomos de carbono pela
diminuição da altura do pico. X!a A811604_013.esp
190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50Chemical Shift (ppm)
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.00
Nor
mal
ized
Inte
nsity
192.
59
168.
3516
6.19
162.
45
142.
23
135.
52
129.
9812
8.81
128.
3012
7.49
106.
28
93.7
691
.18
77.4
076
.98
76.5
6
55.7
755
.50
Figura 10: Espectro de RMN 13 C da chalcona (27) (C3D6O / 300 MHz).
OO
OHOCH3
CH3
H
H
H
H
H
H
H
H
H
2
3
45
6A B
2'
3'
4'5'
6'α
β
11'
61
5.1.2 Benzofuranonas
O objetivo desta síntese era inicialmente obter chalconas derivadas da
molécula 2-[(1E)-3-(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)-3-oxoprop-1-en-1-il]ácido benzóico
(32) previamente sintetizada e com promissora atividade biológica, mas o que
obteve-se foi uma série de compostos inédita com a presença de uma lactona ligada
ao anel aromático chamada de benzofuranona. Esta classe foi caracterizada em
1988 por Nobuo e colaboradores na tentativa de sintetizar compostos a partir de 2-
carbóxi flavanonas e dependendo da reação obteve-se dois produtos de classes
diferentes: a flavanona com a presença do grupo ácido carboxílico no anel e a
lactona ligada diretamente ao anel aromático, chamada benzofuranona.
O mecanismo da reação ainda é pouco elucidado, mas acredita-se que
primeiramente ocorra a condensação aldólica seguida da formação da chalcona e
posteriormente ocorra o rearranjo entre a carboxila do benzaldeído e o carbono α,β-
insaturado formando assim a lactona. Porém, durante as sínteses, pôde-se observar
sempre em que o tempo de reação ou a temperatura eram aumentados a formação
de um segundo produto de coloração amarela e com rf menor que as
benzofuranonas. Acredita-se que este composto formado possa ser a chalcona
correspondente, já que o anel lactônico pode sofrer hidrólise muito facilmente, e
justifica também, o valor menor de rf, já que as chalconas possuiriam o grupamento
carboxila, sendo este mais polar que a lactona. Entretanto, não foi possível o
isolamento e a caracterização deste subproduto nas condições reacionais
realizadas.
Estes compostos foram obtidos com rendimentos e tempos de reação
variados (Tabela 5), da mesma forma como nas chalconas foram feitas modificações
na metodologia das sínteses visando diminuir o tempo de reação e otimizar os
rendimentos. Devido a dificuladade encontrada na tentativa de recristalizar os
produtos desta série, todos os compostos foram purificados através de coluna
cromatográfica utilizando como solventes hexano e acetato de etila.
62
Tabela 5: Estrutura, tempo reacional e rendimento das benzofuranonas (33-37).
R
OO
O
A
B
Estrutura
R
Código Tempo
reacional (h)
Rendimento
(%)
Ponto de fusão
(oC)
H
(33)
14 (Chapa de
aquecimento)
53
146,5 - 147,5
4-OCH3
(34)
25 (Chapa de
aquecimento)
68
121,0 - 122,5
4-CH3
(35)
5 (Agitador
magnético)
64
149,1 – 150,1
4-Cl
(36)
20 min
(Agitador
magnético)
72
147,5 – 148,6
3,4-Cl
(37)
20 min
(Agitador
magnético)
78
192.3 – 192,4
As reações não obedeceram os parâmetros físico-químicos eletrônicos, pois
o tempo da reação do composto substituído pelo grupo metil, que apresenta
propriedade de doar elétrons, foi maior que o tempo das reações dos compostos que
continham o substituinte cloro (36) e (37) quando comparadas às outras sínteses.
Este fato ocorre provavelmente devido a capacidade do Cloro em sacar elétrons,
deixando a ligação C-H mais fraca, facilitando a remoção do próton e a formação da
chalcona com consequente formação da benzofuranona. O longo tempo de duração
da reação de formação do (34) pode ser explicada devido ao fato de que o grupo
63
metóxi é um grupo ativador moderado, ou seja, doador de elétrons, dificultando a
formação do produto final, principalmente quando comparado com o metil, um grupo
ativador fraco.
Todos os compostos desta série foram caracterizados por ponto de fusão e
espectroscopia de ressonância magnética nuclear de carbono e hidrogênio. Os
espectros de 1H RMN e 13C RMN da benzofuranona 3-(2-oxo-2-feniletil)-2-
benzofuran-1(3H)-ona (33) foram selecionados a título de ilustração para uma
análise mais detalhada. No espectro de 1H RMN (Figura 11) pode-se observar a
presença de dois duplos dubletos em 3,8 e 3,88 ppm e 3,67 e 3,76 ppm referentes
aos hidrogênios Ha e Hb e um duplo dubleto em 6,11 ppm referente ao hidrogênio
Hc. Em 7,51 e 8,01 ppm encontram-se os hidrogênios aromáticos. O sinal em 2,5
ppm refere-se ao DMSO residual e em 3,48 ppm caracteriza a presença de água no
solvente (GOTTLIEB, KOTLYAR, NUDELMAN, 1997).
C1 A808540_001.esp
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5Chemical Shift (ppm)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Nor
mal
ized
Inte
nsity
2.000.787.93
8.01 7.98
7.84
7.76 7.
757.
687.
637.
56 7.53
7.51
6.14 6.12
6.11
6.10
3.88
3.87 3.
823.
803.
763.
733.
48
2.50
Figura 11: Espectro de RMN 1H do composto (33) ((CD3)2SO/ 300 MHz).
No espectro de RMN 13 C (Figura 12) tem-se o sinal referente a carbonila da
cetona em 196,52 ppm e a carbonila da lactona em 169,92 ppm. Segundo
AB
O
O
H
HO
H 1
23
4
561 '2 '
3 '
4 ' 5 '
6 '
89
1 0
c
a
b
7
64
Silverstein e colaboradores (1994) a carbonila da lactona é absorvida em torno de
177,9 ppm. O carbono 9 pode ser observado em 42,75 ppm e o carbono 8 em 77,2
ppm. Os carbonos aromáticos encontram-se na região de 122,92 e 149,94 ppm. Os
carbonos do anel B podem ser verificados em 125,52, 124,98, 128,88, 122,92,
134,99 e 149,94 ppm referentes aos carbonos C1, C2, C3, C4, C5 e C6
respectivamente. E os sinais dos carbonos do anel A que podem ser verificados na
figura são C3’ em 129,36 ppm, C4’ em 128,19 ppm e C5’ em 136,25 ppm.
C1 C A808540_013.esp
200 192 184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8Chemical Shift (ppm)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Nor
mal
ized
Inte
nsity
38.6
538
.92
39.2
239
.49
39.7
640
.03
42.7
577.2
0
122.
9212
4.98
125.
5212
8.19
128.
8812
9.3613
4.39
136.
25
149.
94
169.
92
196.
52
Figura 12: Espectro de RMN 13 C do composto (33) ((CD3)2SO / 300 MHz).
5.1.2.1 Síntese da 2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il )-1-(2-hidroxi-4,6-
dimetoxifenil)etanona (38)
A benzofuranona inédita (38) foi obtida ao acaso na tentativa de
recristalizar a chalcona (32) com etanol. Após recristalização, os cristais foram
filtrados e a pureza do produto foi certificada por CCD. Neste procedimento foi
possível observar a mudança do rf e uma pequena alteração da cor da mancha da
placa cromatográfica quando submetida a luz UV. Após análise por RMN 1H e 13C foi
AB
O
O
H
HO
H 1
23
4
561 '2 '
3 '
4 ' 5 '
6 '
89
1 0
c
a
b
7
65
confirmada a estrutura de uma benzofuranona com a presença de uma lactona
conjugada ao anel B e não sendo observado a presença do carbono α,β insaturado.
No espectro de RMN 1H (Figura 13) pode-se verificar um simpleto em 13,74
ppm referente ao hidrogênio da hidroxila e dois simpletos em 3,83 e 3,80 ppm
referente aos hidrogênios das duas metoxilas. Em torno de 6,16 ppm pode-se
observar um duplo dubleto referente ao hidrogênio Hc. Em 3,78 - 3,85 e 3,39 - 3,46
ppm juntamente com os hidrogênios das metoxilas encontram-se os hidrogênios Ha
e Hb. E os hidrogênios dos anéis aromáticos encontram-se na região entre 5,92 –
7,91 ppm.
CH7 B A76072.001
13.5 13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0Chemical Shift (ppm)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Nor
mal
ized
Inte
nsity
1.057.531.050.980.993.080.960.933.
393.433.46
3.78
3.80
3.83
3.85
5.92
6.10
6.16
6.177.277.
547.
567.
577.
60
7.677.90
7.92
13.7
4
Figura 13: Espectro de RMN 1H do composto (38) (CDCl3/ 300 MHz).
No espectro de RMN 13 C (Figura 14) pode-se verificar os sinais das duas
carbonilas em 200,16 e 170,43 ppm para a carbonila da cetona (C10) e da lactona
(C7) respectivamente. Os sinais em 48,9 e 77,4 ppm são referentes aos carbonos
C9 e C8 respectivamente. Os carbonos das metoxilas estão sobrepostos em 55,6
ppm. Os carbonos do anel B podem ser verificados em 123,00, 125,57, 125,92,
129,18, 134,15 e 150,21 ppm referentes aos carbonos C4, C2, C1, C3, C5 e C6
respectivamente. E os sinais dos carbonos do anel A são evidenciados em 90,99,
93,74, 105,61, 162,66, 166,71 e 167,72 ppm referentes aos carbonos C5’, C3’, C1’,
AB
O
O
H
HO
H
O
O
O H
CH 3
C H 3
1
23
4
561 '2 '
3 '
4 ' 5 '
6 '
89
1 0
c
a
b
7
66
C2’, C6’ e C4’.
CH7 B1 A76072.013
200 192 184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48Chemical Shift (ppm)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Nor
mal
ized
Inte
nsity
48.8
5
55.6
1
76.5
877
.42
90.9
993
.74
105.
61
123.
0012
5.57
125.
9212
9.18
134.
15
150.
21
162.
6616
6.71
167.
7217
0.43
200.
16
Figura 14: Espectro de RMN 13 C do composto (38) (CDCl3/ 300 MHz).
5.1.2.2 Síntese dos derivados
Foram obtidos 3 derivados da benzofuranona (36), dois substituídos nas
posições meta (40) e meta e para (39) pelo grupo metóxi e outro substituído pelo
átomo de bromo na posição para (41). Os compostos foram obtidos com
rendimentos que variaram de 43 a 59% e tempos de reação de 24 a 48 h utilizando
agitador magnético à temperatura ambiente (Tabela 6).
AB
O
O
H
HO
H
O
O
O H
CH 3
C H 3
1
23
4
561 '2 '
3 '
4 ' 5 '
6 '
89
1 0
c
a
b
7
67
Tabela 6: Estrutura, tempo reacional e rendimento das benzofuranonas (30-41).
R
OO
O
A
B
Estrutura
R
Código Tempo
reacional (h)
Rendimento
(%)
Ponto de fusão
(oC)
3,4- OCH3
(39)
48 (Agitador
magnético)
59
152 – 152,7
3-OCH3
(40)
24 (Agitador
magnético)
57
134,2 – 135,8
4-Br
(41)
28 (Agitador
magnético)
43
147 – 149,9
5.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva 5.2.1 Chalconas
Para todos os compostos desta série foi realizada a DI50 no modelo de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6% administrado
intraperitonealmente em diferentes doses. O modelo de contorções abdominais tem
sido empregado amplamente para análise da atividade analgésica de diferentes
tipos de compostos, uma vez que mostram boa correlação com a ação analgésica
encontrada em outros modelos pré-clínicos, bem como, em estudos clínicos
(CAMPOS-BUZZI et al., 2006; COSTA et al., 2007).
As chalconas apresentaram percentagem de inibição de 53 a 92% na dose
de 10 mg/kg (Figura 15). Estes valores, quando comparados a alguns fármacos
68
utilizados na terapêutica, como o ácido acetil salicílico (AAS) e o paracetamol (PAR)
cujas inibições são de 38 e 35% respectivamente, na mesma dose, foram bastante
superiores. Além disso, todas as chalconas apresentaram um perfil dose-
dependente com valores de DI50 inferiores aos valores referentes aos fármacos
utilizados como referência AAS (DI50 = 133 (73-243)) e PAR (DI50 = 125 (104-150)).
Figura 15: Efeito dos compostos 27 - 31, administrados em 3 concentrações 1, 3 e 10 mg/kg pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
OO
O O H
CH 3
CH 3
A B
OO
O OH
CH3
CH3O
CH3
A B
OO
O O H
CH 3
CH 3C H 3
A B
OO
O O H
CH 3
CH 3C l
A B
OO
O O H
CH 3
CH 3C l
C l
A B
69
O composto mais efetivo desta série foi a chalcona (27) que apresentou um
percentual de inibição de 92%, porém a molécula mais potente foi a (29) com um
valor de DI50 de 8,22 (5,87 – 11,54) µmol/kg sendo cerca de 16 vezes mais potente
que os fármacos utilizados na clínica como o Ácido Acetil Salicílico e Paracetamol
que possuem valores de DI50 de 133 (73-243) µmol/kg e 125 (104-150) µmol/kg,
respectivamente .
Apesar da seleção de Topliss, não foi possível estabelecer uma correlação
entre as estruturas químicas e a atividade antinociceptiva encontrada (efeito estéreo,
parâmetros eletrônicos, hidrofóbicos ou ambos), uma vez que o segundo composto
mais efetivo possui o grupo –CH3 (29) e o menos efetivo possui o grupo -OCH3 (28)
os quais, possuem características semelhantes. O mesmo ocorreu para ordem de
potência que coloca novamente (29) como mais potente e (28) como menos potente
da série não obedecendo nenhum dos parâmetros sugeridos por Topliss.
5.2.2 Benzofuranonas
Foi realizada a DI50 das benzofuranonas no modelo de contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6% administrado intraperitonealmente em
diferentes doses. A partir do resultado deste modelo pôde-se estabelecer uma
relação estrutura atividade segundo o método de Topliss e selecionar novos
reagentes para a posterior síntese de moléculas teoricamente mais ativas que as
iniciais.
Os compostos foram capazes de inibir 69,5 a 97,7% das contorções na dose
de 30 mg/kg e apresentaram perfil dose-dependente com valor de DI50 entre 33,73
(29,19 – 38,96) e 52,68 (47,24 – 65,68) µmol/kg (Figura 16). As duas
benzofuranonas que possuem substituintes elétron retiradores, um ou dois átomos
de cloro na sua estrutura foram mais efetivas que as outras que possuem grupos
elétrons doadores ou nenhum substituinte. Ainda assim, o composto (35) que possui
o substituinte metil, ativador fraco, e que possui a capacidade de doar elétrons e o
composto (33) que não possui substituintes, foram mais efetivos que o (34) que
possui o grupo metóxi, um ativador moderado, e que também doa elétrons.
70
Figura 16: Efeito dos compostos 33, 34, 36 e 37 administrados nas doses de 6, 10 e 30 mg/kg e do composto 35 nas doses de 3, 6, 10 e 30 mg/kg pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
A benzofuranona (36) que possui um átomo de cloro na posição para do
anel A foi a mais efetiva e também a mais potente, pois apresentou um percentual
A
B
OO
O
A
B
OO
O
O
CH3
A
B
OO
O
CH 3A
B
OO
O
C l
A
B
OO
O
Cl
Cl
71
de inibição de 97,7% e um perfil dose-dependente com um valor de DI50 de 33,73
(29,19 – 38,96) µmol/kg seguido da molécula (37) que possui dois átomos de cloro
nas posições 3 e 4 do anel A, depois o (35) que possui o grupo metil na posição 4 do
mesmo anel, (33) que não possui substituintes e (34) com o grupo metóxi na posição
para do anel A. Com base na Tabela 2, pode-se afirmar que esta série seguiu o
parâmetro físico-químico 2π–π2 proposto por Topliss, o que indica que são os
parâmetros hidrofóbicos (π) que estão preponderantemente envolvidos na atividade
antinociceptiva desta série de compostos.
Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por Topliss
Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss
π 2π– π 2 σσσσ π + σσσσ 2π - σσσσ π - σσσσ π - 2σσσσ π - 3σσσσ Es
3,4-Cl2 1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5
4-Cl 2 1-2 2 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5
4-CH3 3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5
4-OCH3 4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5
H 4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1
Com base nestes dados, a segunda etapa seria a análise da Tabela 3 e a
seleção dos novos substituintes a serem introduzidos para a obtenção dos
compostos teoricamente mais ativos que o (36). Os reagentes selecionados foram
os seguintes benzaldeídos substituídos: 4-bromobenzaldeído (41), 3-
metóxibenzaldeído (40) pois estavam disponíveis para uso e ainda 3,4-
dimetóxibenzaldeído (39) que não está presente na tabela, mas devido a
disponibilidade em laboratório e estrutura semelhante ao (40), foi também utilizado
como reagente para a síntese das novas moléculas.
72
Tabela 3: Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos.
Prováveis parâmetros mais ativos Seleção de novos s ubstituintes
π, π + σσσσ, σσσσ 3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;
4-C-C5H9
π, 2π – σσσσ, π – σσσσ 4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4-
O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
π - 2σσσσ, π – 3σσσσ, σσσσ 4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9;
4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3
2π – π2 4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3-
CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl2
A atividade antinociceptiva destes compostos foi avaliada no modelo de dor
induzida pelo ácido acético (0,6%) na dose de 10 mg/kg (Tabela 7). Quando
comparados ao composto selecionado inicialmente como mais ativo da série (36)
que apresentou um percentual de inibição de 73,5% na dose de 10 mg/kg, a
benzofuranona (40) com o substituinte 3-metóxi foi a mais efetiva, pois foi capaz de
inibir 93,50% das contorções na mesma dose.
Tabela 7: Atividade antinociceptiva dos compostos (39), (40) e (41) no modelo de dor induzida pelo ácido acético 0,6% via i.p., administrados na dose de 10 mg/kg.
OOO
A
B
R
Substituinte (R) Código % Inibição
3,4 – OCH3 39 49,40
3 – OCH3 40 93,50
4- Br 41 50,80
Para realizar uma comparação entre a potência dos compostos, foi realizada
a DI50 do composto (40) (Figura 17) apresentando um perfil dose-dependente com
um valor de 9,64 (7,84 – 11,88) µmol/kg sendo cerca de 3,5 vezes mais potente que
73
a benzofuranona (36).
Figura 17: Efeito do composto 40 administrado em 4 concentrações 0,5, 1, 3 e 10 mg/kg, pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Estes dados confirmam a existência de uma correlação quantitativa entre a
estrutura química e a atividade biológica encontrada. Neste caso, os parâmetros
hidrofóbicos estavam preponderantemente envolvidos com a atividade
antinociceptiva.
5.2.2.1 Potencial Antinociceptivo da 2-(1,3-dihidro -2-benzofuran-1-il)-1-(2-
hidroxi-4,6-dimetoxifenil)etanona (38)
A atividade antinociceptiva do (38) foi avaliada em maiores detalhes devido à
prévia atividade considerável do composto e para efeitos de comparação com a
chalcona (32) previamente obtida e testada por Campos-Buzzi et al (2006), já que
neste caso ocorre uma mudança no grupo farmacofórico da molécula, a chalcona
perde a estrutura olefínica e forma a lactona ligada ao anel B, o que pode influenciar
diretamente na atividade biológica. Além disso, tanto a chalcona como a
benzofuranona são derivados do produto natural xantoxilina, a acetofenona de
grande interesse, citada no início do trabalho.
74
A benzofuranona 2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il)-1-(2-hidroxi-4,6-
dimetoxifenil)etanona (38) foi avaliada no modelo de contorções induzidas pelo ácido
acético nas doses de 0,5, 1,25 e 5,0 mg/kg pela via intraperitoneal e apresentou um
perfil dose-dependente com um valor de DI50 de 6,1 (5,1 – 7,6) µmol/kg e um
percentual de inibição de 92,5% na dose de 5,0 mg/kg (Figura 18). O composto (38)
foi 1,4 vezes mais ativo que o (32), sendo que, este, em outro estudo, apresentou
um percentual de inibição de 92,2% e um valor de DI50 de 8,7 (6,3 – 11,9) µmol/kg
(CAMPOS-BUZZI et al, 2006) e aproximadamente 22 vezes mais ativo que o AAS e
Paracetamol, medicamentos utilizados como referência.
Figura 18: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações 0,5, 1.25 e 5 mg/kg, via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Neste mesmo modelo de dor o composto foi avaliado também pela via oral na
dose de 100 mg/kg (Figura 19) e apresentou uma inibição significativa de 55,1%.
Porém, o composto (32) foi mais ativo, apresentando uma inibição de 62,7%,
sugerindo que o grupo carboxílico pode contribuir para biodisponibilidade por esta
via. Embora este seja um modelo de dor não-específico, já que outras atividades
podem ser verificadas como atividade anticolinérgica e antihistamínica, o fato do
composto (38) reduzir significativamente o número de contorções abdominais sugere
um potencial antinociceptivo para esta molécula, podendo ser testada em outros
modelos envolvendo, por exemplo, receptores colinérgicos e histamínicos e
mediadores da acetilcolina e da histamina (CHOI et al., 2003).
75
Figura 19: Efeito do composto (38), administrado na dose de, 100mg/kg, via oral no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
O composto (38) também foi avaliado no modelo de dor induzido pela
formalina, o qual é caracterizado por avaliar duas fases distintas de dor (SOUZA,
2003). A primeira fase tem início logo após a injeção da formalina e mantem-se por 5
minutos, acredita-se que ela decorra da estimulação química direta dos nociceptores
(aferentes tipo C e A), por mediadores químicos como a substância P, o glutamato e
a bradicinina, responsáveis pela nocicepção neurogênica (HUNSKAR et al., 1985;
1987). A segunda fase tem início com 15 minutos e termina aos 30 minutos, após a
injeção da formalina. Esta resposta é decorrente da liberação de vários mediadores
químicos pró-inflamatórios, como a histamina, serotonina, prostaglandinas e
bradicinina. (HUNSKAAR; HOLE, 1985; 1987; TJØLSEN; HOLE, 1997).
São essas duas fases que podem refletir em diferentes processos
patológicos, e que impedem a elucidação do possível mecanismo envolvido na
analgesia (SHIBATA et al., 1989). Medicamentos que agem no sistema nervoso
central, como os opióides, inibem as duas fases da dor envolvendo os efeitos
produzidos pela liberação de prostaglandinas em resposta a uma inflamação
(HUNSKAAR, 1987; SHIBATA, 1989). Alguns antiinflamatórios não-esteroidais
(AINEs) como o AAS, atuam unicamente nos tecidos periféricos e diminuem a
nocicepção somente na segunda fase, enquanto outros como o ácido mefenâmico,
atua tanto no SNC como em tecidos periféricos e acaba afetando as duas fases,
embora a resposta à segunda fase seja inibida por doses menores que na primeira
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle 100 mg/kg
núm
ero
de c
onto
rçõe
s
**
55,10%
76
fase (ROSLAND et al., 1990). A molécula (38) inibiu significativamente a primeira e
a segunda fase do teste da formalina (Figuras 20 e 21), porém foi mais ativa na
segunda fase, podendo atuar tanto no SNC como em níveis periféricos.
Figura 20: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações: 3, 6 e 10mg/kg, via intraperitoneal na Fase I – fase neurogênica, no modelo de dor induzida pela formalina. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Figura 21: Efeito do composto (38), administrado em 3 concentrações: 3, 6 e 10mg/kg, via intraperitoneal na Fase II – fase inflamatória, no modelo de dor induzida pela formalina. Cada coluna representa uma média de 06 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Com o objetivo de melhor avaliar a atividade deste composto inédito foi
realizado o ensaio no modelo de dor induzido pela capsaicina, a qual desencadeia a
dor neurogênica. Neste modelo a benzofuranona (38) apresentou uma inibição de
74,8% com um valor de DI50 de 12,6 (9,8 – 16,2) µmol/kg sendo 4 vezes mais
77
potente que o Diclofenaco de Sódio [47 (35 – 65) µmol/kg] utilizado como referência
(Figura 22). Diversos mediadores químicos estão envolvidos nesta ação, tais como
as neurocininas (substância P, neurocinina A e neurocinina B), peptídeos
relacionados ao gene da calcitocina (CGRP), somastotatina, óxido nítrico e
aminoácidos excitatórios (SAKURADA et al., 1992; 1996). A capsaicina também
estimula as terminações nervosas nociceptivas por se ligar a um receptor expresso
pelos neurônios aferentes nociceptivos chamado receptor vanilóide. Este estímulo
químico atua sobre os nociceptores polimodais causando a dor (RANG et al., 2004).
Portanto, o composto em estudo pode atuar antagonizando o efeito da capsaicina
nos receptores vanilóides, diminuindo o limiar de dor.
Figura 22: Efeito do (38) administrado na concentração de 3, 6 e 10 mg/kg, via intraperitonial no modelo de dor induzido pela capsaicina. Cada coluna representa uma média de 08 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Os mecanismos que envolvem a antinocicepção causada pelo composto
(38) podem ser, pelo menos em parte, devido à interação desta molécula com
receptores excitatórios, como mostra os resultados do modelo de dor induzido pelo
glutamato (Figura 23). Este modelo foi proposto por Beirith, Santos e Calixto (1998),
sendo aplicado para o estudo de substâncias que atuam sobre o sistema
glutamatérgico, o qual também está envolvido na transmissão nociceptiva. A injeção
de glutamato induz a estimulação direta dos neurônios nociceptivos, causando a
liberação de vários mediadores inflamatórios e neuropeptídeos envolvidos na
transmissão dolorosa como a substância P, neurocinina A e neurocinina B. Assim,
este teste é empregado com o objetivo de evidenciar a possível interação dos
compostos com o sistema glutamatérgico, seja inibindo diretamente sua ação
78
através do antagonismo de seus receptores, seja inibindo a liberação de outros
mediadores inflamatórios (BEIRITH; SANTOS; CALIXTO, 1998).
Figura 23: Efeito do (38) administrado na concentração de 6, 10 e 30 mg/kg, via intraperitonial no modelo de dor induzido pelo glutamato. Cada coluna representa uma média de 06 a 08 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
Com o intuito de avaliar se o composto (38) atua pela via opióde foi realizado
o teste de sensibilidade térmica em placa quente. A morfina foi utilizada neste teste,
como controle positivo, por atuar através de receptores opióides (µ, κ e δ) que uma
vez acoplados a proteína G, quando ativados irão produzir duas ações que
conduzem a uma hiperpolarização neuronal: diminuir o influxo de cálcio para dentro
da célula e/ou inibir a adenilato ciclase, com conseqüente redução dos níveis de
AMPc e, ativar os canais de potássio (GALEOTTI et al. 2006). Entretanto, o
composto em questão não foi capaz de aumentar o limiar de dor neste teste,
mostrando-se ineficaz pela via opióide (dados não mostrados).
Já no modelo de dor induzido pelo ácido acético para o grupo tratado com
morfina o resultado foi bastante significativo (Figura 24). A antinocicepção exercida
pelo (38) neste teste não foi significativamente antagonizada pela naloxona quando
comparada com a morfina, portanto, mecanismos envolvendo o sistema opióide não
estão relacionados com o efeito antinociceptivo.
79
Figura 24: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona na atividade antinociceptiva causada pela morfina (5 mg/kg-1,s.c.) e pelo composto (38) no modelo de contorções induzidas pelo ácido acético 0,6%. Cada coluna representa uma média de 06 a 08 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM. Asteriscos indicam diferenças significantes (**p<0,01) quando comparadas com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnet.
O mecanismo da atividade antinociceptiva do composto (38) ainda não está
bem elucidado, mas sabe-se que não está associado aos receptores opióides.
Contudo, esta benzofuranona inédita foi mais potente que a chalcona original no
modelo de dor induzida pelo ácido acético e que alguns medicamentos utilizados na
clínica, o que a torna uma molécula promissora na procura por novos agentes
analgésicos.
5.3 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
5.3.1 Benzofuranonas (33-37) e (38)
As análises de atividade antimicrobiana foram realizadas no Laboratório de
Microbiologia da UNIVALI pela equipe do professor Dr. Alexandre Bella Cruz. Para a
avaliação da atividade antimicrobiana foram testados representantes de bactérias
Gram-positiva (Staphylococcus aureus) e Gram-negativa (Escherichia coli) e fungo
leveduriforme (Candida albicans).
Nenhuma das benzofuranonas testadas apresentou atividade significativa
até a concentração de 500 µg/mL.
80
5.4 Avaliação da Atividade Antiparasitária
5.4.1 2-(1,3-dihidro-2-benzofuran-1-il)-1-(2-hidrox i-4,6-dimetoxifenil)etanona (38)
A atividade contra a doença de chagas, antileishmania e antimalárica foram
avaliadas pelo grupo da Universidad Mayor de San Andrés de La Paz na Bolívia sob
a orientação do professor Dr. Alberto Gimenez. Os experimentos foram realizados in
vitro utilizando culturas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. donovani na forma
promastigotas, formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Plasmodium
falciparum. Os testes foram realizados em triplicata e os medicamentos utilizados
como referência foram Pentamidina / Glucantime (50 - 100 µg/mL) e Mebendazol
(10 µg/mL) / Anfotericina B (10 µg/mL).
A molécula em estudo não apresentou indícios de atividade contra os
parasitas citados acima. Porém, isto não implica na exclusão deste composto ou
derivados em outros estudos de atividade antiparasitária.
81
6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo permitiram as seguintes conclusões:
6.1 CHALCONAS
- Foram sintetizadas 6 chalconas derivadas do produto natural xantoxilina, através
da reação de condensação aldólica de Claisen-Schimidt. As reações resultaram em
compostos com rendimentos entre 30 a 58% e tempos de reação variados.
- Os compostos foram caracterizados através de Infravermelho e Espectroscopia de
ressonância magnética nuclear de carbono e hidrogênio (RMN 1H e RMN 13C).
- A chalcona mais ativa foi a (29) que possui o grupo metil na posição para do anel,
porém, todas mostraram-se bastante promissoras quanto à atividade analgésica,
sendo elas, mais ativas que os fármacos de referência AAS e Paracetamol.
- Esta série não seguiu nenhum dos parâmetros estabelecidos por Topliss, portanto,
sugere-se utilizar outros métodos mais específicos de QSAR, para que se possa
sintetizar derivados teoricamente mais ativos que as chalconas iniciais.
- A classe das chalconas vem sendo estudadas a algum tempo e continuam
demonstrando características promissoras para serem candidatas à protótipos de
futuros fármacos.
6.2 BENZOFURANONAS
- Foram sintetizadas 9 benzofuranonas inéditas a partir do 2-carboxibenzaldeído e
cinco diferentes acetofenonas baseando-se no método de Topliss;
- Os rendimentos variaram entre 53 a 78% e os tempos de reação foram variados,
dependendo do substituinte e do método da síntese.
- Os compostos foram caracterizados através de Infravermelho e Espectroscopia de
ressonância magnética nuclear de carbono e hidrogênio (RMN 1H e RMN 13C).
- Da série das benzofuranonas a mais ativa foi a (36) que possui o grupo cloro na
posição para do anel B, porém, todas apresentaram promissora atividade
82
antinociceptiva, sendo elas também mais ativas que os fármacos utilizados como
referência AAS e Paracetamol.
- Esta série seguiu o parâmetro físico-químico 2π– π2 proposto por Topliss, o que
indica que são os parâmetros hidrofóbicos (π) que estão envolvidos na atividade
antinociceptiva dos compostos.
- A partir do composto (36) foram sintetizados três derivados com os adequados
substituintes, e estes foram avaliados novamente para a certificação da validação do
método de Topliss. A molécula (40) apresentou maior efetividade e potência que o
(36). Portanto, para esta série, foi possível aplicar o método proposto.
- A benzofuranona (38) apresentou significativa atividade antinociceptiva no modelo
de dor induzida pelo ácido acético sendo 1,4 vezes mais ativo que a chalcona (32) e
aproximadamente 22 vezes mais ativo que o AAS e Paracetamol, medicamentos
utilizados como referência.
- Pela via oral a benzofuranona (38) apresentou indícios de inibição na dose de 100
mg/kg.
- A molécula (38) inibiu significativamente a primeira e a segunda fase do teste da
formalina, porém foi mais ativa na segunda fase.
- No modelo de dor induzido pela capsaicina e glutamato a mesma apresentou
indícios de atividade sobre a dor neurogênica pela via das taquicininas.
- A via opióide também foi verificada através do ensaio da placa quente, para a qual
o resultado não foi significativo.
- Os resultados encontrados demonstram que as benzofuranonas inéditas obtidas
neste trabalho são moléculas potencialmente ativas e bastante promissoras quanto
à atividade analgésica, sendo de grande importância a continuidade dos estudos a
fim de se elucidar o mecanismo de ação e a possível relação estrutura-atividade
destes compostos.
83
REFERÊNCIAS
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ANEXO A - Parecer de aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UNIVALI
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ANEXO B – Artigo publicado na revista Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology
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