Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Ciências MédicasDepartamento de Farmacologia
Estudo de Bioequivalência de duas
formulações de pantoprazol em
voluntários sadios de ambos os sexos
Aluna: Maria Carla Petrellis
Orientador: Prof. Dr. Gilberto De Nucci
2004
Bioequivalência - Considerações
Adoção de uma
política de
medicamentos
genéricos
• Produção
• Garantia de Qualidade
• Prescrição
• Dispensação e uso
É parte fundamental das diretrizes
para promoção do uso racional de
medicamentos em nosso País
Medicamento Genérico: na concepção da OMS,
“ produto farmacêutico intercambiável”
• deve apresentar a mesma segurança e eficácia
do medicamento de referência
• produzido após a expiração da proteção patentá-
ria ou outros direitos de exclusividade pela DCI
(Denominação Comun Internacional), ou seja não
apresenta marca
Medicamentos Bioequivalentes (F.D.A):
• na mesma dose molar,
• a mesma indicação terapêutica
• nas mesmas condições experimentais,
(mesma via de administração)
São equivalentes farmacêuticos ou alternativas
farmacêuticas que , ao serem administrados:
Não apresentam
diferenças estatísticas
significantes quanto:
• à velocidade de absorção
• à extensão de absorção
Parâmetros para determinar a Parâmetros para determinar a
BioequivalênciaBioequivalência
• ASC (0-t) = Área sob a curva de concentração sangüínea vs tempo
• Cmax = Pico de concentração plasmática do fármaco
• t(max) = Tempo para atingir o pico da concentração máxima
A etapa crítica no Estudo de Bioequivalência
é o desenvolvimento e validação de ensaios
bioanalíticos
Consiste na realização de experimentos
Encontrar condições necessárias
para a quantificação do analito em questão
Validação de Métodos Bioanalíticos
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE, LC-MS/MS)
• Cromatografia Gasosa (CG, CG-MS/MS)
• Métodos Imunológicos (RIA, EMIT e ELISA)
Metodologias
Parâmetros da Validação Bioanalítica
Especificidade - Seletividade
Especificidade: o método produz uma única resposta
analítica para um único analito
Seletividade: a habilidade de uma técnica analítica
em distinguir e quantificar, ou não, uma droga em
relação a outras resposta de diferentes componentes
presentes nos fluidos biológicos
Linearidade*
Habilidade de se obter resultados diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra
*International Conference of Harmonization - ICH, Guideline for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996;
Comissionof European Communities – Comittee for Proprietary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994;
Buick et al., 1990.
Fatores na avaliação de curva de calibração:
• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas
determinações nominais da curva de calibração,
exceto para as concentrações do LOQ
• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas
determinações nominais do LOQ
• quatro das seis concentrações nominais devem
estar de acordo com critérios acima mencionados,
incluindo os pontos do LOQ e os pontos de
calibração de menor concentração.
• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual ou
maior que 0.95
Precisão
Grau de concordância entre os resultados de
análises individuais, quando o procedimento
analítico é aplicado em diversas vezes em uma
mesma amostra analítica, em idênticas condições
experimentais.
Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997; Brittain, 1998; Relatório final da ISO
(International Organization for Standardization), 1990/1991; Hartmann et al., 1994; Shan et al.,
1992; Buick et al.,1990; USPXX 1990; Brooks, 1985 Buick et
al., 1990
• Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): Habilida-
dade de repetições da metodologia empregada nas
mesmas condições laboratoriais, considerando um
único dia de análise
• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio):
Habilidade de repetições da mesma metodologia
aplicada sob diferentes condições laboratoriais,
em subseqüentes ocasiões que podem variar
semanas ou até meses
Exatidão
É definida como o grau de concordância
entre os valores individuais encontrados em relação
aos valores reais ou nominais
* Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,1998 e Mehta, 1989.
• Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio”
• Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio”
Limite de Quantificação (LQ)
Representa a mais baixa concentração de
um composto de investigação que atende os re-
quisitos para precisão e exatidão do ensaio ana-
lítico
A recuperação avalia a eficiência da extração
e sua variabilidade. Embora recuperações próximas
de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po-
dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa-
tas e reprodutíveis.
Recuperação
Estabilidade
Deve ser considerada durante a fase do
desenvolvimento analítico
Critérios de Aceitabilidade
• Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é
15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um
mínimo de 3 lotes.
• Exatidão: A média dos valores do inter-day
devem ser menores que 15% do valor nominal
dos QCs, e não desviar mais que 20% para
LOQ QC.
• Sensibilidade: O menor ponto da curva de
calibração aceitável como limite de quantificação
(LOQ) do método é aquele com CV% 20%
(inter-day).
Pantoprazol
POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA
SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICASSUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICAS
Objetivos
• Avaliar a bioequivalência de duas formulações
de pantoprazol baseada na comparação dos
valores obtidos dos parâmetros farmacocinéticos
de cada formulação calculados a partir de medida
das concentrações plasmáticas de pantoprazol
• Validar a metodologia analítica por LC-MS/MS
empregada na quantificação das concentrações
de pantoprazol em amostras de plasma humano
Protocolo do Estudo
Seleção dos Voluntários
• Vinte e dois voluntários sadios de ambos os sexos
• Idade entre 18 e 45 anos (média= 30 ± 1 ano)
• Peso Corporal entre 55 e 100 kg (média 77,5 ± 10,1 kg)
• Entrevista e exames clínicos pré-estudo
• Assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido
do estudo
• Protocolo Clínico Aprovado pela Comissão de Ética da
Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal do
Ceará
Protocolo Clínico
• Delineamento aleatório cruzado, aberto de dois períodos,
com intervalos de 15 dias entre as doses de pantoprazol
• Hospitalização por 24 horas na Unidade de Farmacologia
Clínica
• Internação seguida de dieta padrão até 23:00 hs
• Jejum após 23:00hs, e início do estudo clínico às 7:00hs,
dose única por via oral de 40 mg de pantoprazol
• Dieta padrão às 12:00 e às 18:00 hs
• Restrições: alimentos contendo xantinas
Coleta das amostras
• Amostras de sangue foram coletadas através de escalpe
em veia superficial do antebraço do voluntário
• Os intervalos de coleta: antes (zero), 0.25, 0.5,0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 12.0 horas
•As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a
4000rpm
•Obtenção do soro e armazenamento na temperatura de
- 20°C
Protocolo Analítico
• Princípio do Método:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase-
reversa , acoplada a espectrometria de massa (LCMS/MS)
Extração Líquido-Líquido com emprego de
dietileter:diclorometano (70:30v/v) como solvente extrator
PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES
Pantoprazol
• Solução estoque de Pantoprazol (1.0 mg/mL)
em metanol:água (50:50)
• Concentração final de 10 g/mL
Carbamazepina (P.I)
• Solução estoque de carbamazepina (1.0 mg/mL)
em metanol:água (50:50)
•concentrações finais de 100 g/mL e 1 g/mL
PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE (C.Q)
• contaminação de plasma humano controle
• emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g/mL)
• obtenção dos seguintes pontos da curva de calibração:
Branco, Branco + PI, 35, 50, 70, 100, 200, 500 e 1000 ng/mL
Curva de calibração
Controle de qualidade:
• contaminação de plasma humano controle
• emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g mL)
• obtenção dos seguintes níveis de concentração:
CQA – 120 ng/mL
CQB – 800 ng/mL
CQC – 600 ng/mL (fator de diluição 1:5)
• temperatura de armazenamento - 20 °C
EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS
• 0.5 mL de amostras de plasma: voluntários, pontos
de da curva de calibração, controle de qualidade em
tubos de ensaio
• 0.05 mL de carbamazepina (1 g/mL)
• breve agitação, repouso por 5 minutos
• 4 mL de dietileter-diclorometano (70:30), em
seguida vigorosa agitação por 30 segundos, seguido
centrifugação
• obtenção da fase orgânica e transferência para tubos
de ensaio revestidos de silicone
• evaporação em banho- maria (37°C) sob fluxo
constante de nitrogênio
• reconstituição das amostras analíticas com 200 L
de fase móvel, em seguida breve agitação
• acondicionamento das amostras analíticas em vials
do injetor automático para posterior análise
CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA
Sistema de Cromatografia:
• Cromatografia Líquida Alta Eficiência de fase - reversa
• Bomba binária
Column Chromatography:
• Coluna analítica de fase-reversa :Genesis 4 m C8;
150x4.6 mm diâmetro interno na temperatura de 40 °C
Fase Móvel: 80% Acetonitrila – 0.1% ácido trifluoroacé-
tico(TFA) – 20% Água Deionizada
Fluxo constante: 0.9 mL/min por gradiente isocrático
–
Eluente: 100 L/min analisado no detector MS/MS
Injetor Automático: alíquotas de 40 L/min na tempera-
tura 10 °C
Tempo de Eluição: 4 minutos
Tempo de Retenção: Pantoprazol (1.86 min) e Carbama-
zepina (2.2 min)
Detector: O Espectrômetro de massa do tipo Quatro II
equipado com “ atmospheric pressure ionization (API)
electrspray” , operando de modo positivo (MS+)
• Pantoprazol : 366.1 > 91.50 , 50V e 35 eV
• Carbamazepina: 236.89 > 194.09 , 25V e 15 eV
Resultados
Validação Analítica
normal blank plasma lot-0101687446
1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0
100
%
3999BT008 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
1261.37
Figura 1 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Branco (MRM
of two channels; ES+ 366.10 91.50)
lipemic blank plasma lot-gdn200799
1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0
100
%
3999BT010 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
126
Figura 2 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Lipêmico (MRM of
two channels; ES+ 366.10 91.50)
hemolized blank plasma lot-gdn200799
1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0
100
%
3999BT014 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
51.01.35
Figura 3 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Hemolisado (MRM of
two channels; ES+ 366.10 91.50)
std 35 ng/ml Analyte / IntStd
1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20Time0
100
%
0
100
%
3999rv275 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
1.20e31.83
3999rv275 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09
2.18e3Area
2.22;754
Figura 4 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Limite de Quantificação
pantoprazol (35ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 366.10 91.50). (B)
Padrão interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM of two channels; ES+
236.89 194.09)
a
b
vol- 01 1st phase 5h
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
39990126 MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
8.88e31.89
1.811.770.11 0.551.00
2.012.25 2.74 3.47
39990126 MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09
1.39e52.20
39990126 MRM of 2 Channels ES+ TIC
1.41e52.20
1.87
Figura 5 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário
coletada 5 horas após administração da formulação teste (40 mg de panto-
prazol), (MRM: 366.10 91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão
interno carbamazepina (50 ng/mL), (MRM: 236.89 194.09).(C)Concentração
plasmática máxima (99 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10 91.50) e seu
padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09)
a
b
c
Figura 6 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário
coletada 3 horas após administração da formulação padrão (40mg de panto-
prazol), (MRM: 366.10 91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão
interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09).(C)Concentração
plasmática máxima (145 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10 91.50) e seu
padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09)
vol- 01 2nd phase 3h
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
39990154 MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50
9.74e31.87
0.840.57 1.26
1.942.03 3.032.36 3.153.45
39990154 MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09
1.25e52.17
39990154 MRM of 2 Channels ES+ TIC
1.27e52.17
1.87
a
b
c
vol- 01 1st phase 1h:30min
240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360m/z0
100
%
39990115 1 (0.033) MRM of 2 Channels ES+ 1.43e3236.9
366.1
Pantoprazole in MP Inf 10uL/mL Cone 50 + TFA 0.01% msms 35
125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450m/z0
100
%
test12 1 (0.527) Daughters of 366ES+ 5.11e6x2
151.874
336.211293.036215.939
185.033 262.249 366.109
a
b
Figura 7 – Espectro de massa: (A) Espectro do pantoprazol adquirido em
Q1, energia do cone = 50v. (B) Espectro dos produtos de íons do panto-
prazol adquirido em Q2 após colisão induzido dissociação, energia do
cone = 50v e energia de colisão – 35eV
a
b
Figura 8 - Espectro de massa da carbamazepina: (A) Q1= 25v (B) Q2 = 25v / 15eV
CARBAMAZEPINE
150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250m/z0
100
%
0
100
%
Scan ES1.64e8236.9
236.7
190.9150.1153.9 192.9
211.5
237.0
237.9
CARBAMAZEPINE Daughters 236.9ES1.99e7194.2
192.2
237.2
Compound 1 name: pantoprazol Coefficient of Determination: 0.991042 Calibration curve: 0.00395875 * x + 0.0187051 Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 ng/ml 0
4.13
Response
Figura 9 – Curva de calibração obtida após a contaminação de plasma
humano com pantoprazol (35 – 1000 ng/mL) e carbamazepina (50 ng/mL)
Validação do Inter- Ensaio da Curva de Calibração
Concentração (ng/mL-1)
35
50
70
100
200
500
1000
r2
Lote 1 32.3 59.2 70.8 92.4 140.8 505.1 1022.0 0.9900 Lote 2 33.2 43.8 75.4 105.3 213.4 497.6 946.2 0.9940 Lote 3 34.2 50.7 68.4 120.9 220.8 528.7 972.9 0.9962 Lote 4 29.8 41.5 66.3 111.7 227.0 526.4 934.2 0.9920 Média 32.8 49.8 70.0 105.2 200.5 515.8 975.9 0.99305 DP 3.7 10.7 6.2 14.8 37.4 33.2 62.5 0.00266 DPR (%) 11.2 21.5 9.0 14.1 18.6 6.4 6.4 EP (%) -6.2 -0.2 0.00 5.2 0.2 3.1 -2.4
Tabela 1- Validação da Curva de Calibração
Validação dos Controles de Qualidade
Inter - Ensaio
Intra - Ensaio
Concentração (ng/mL-1)
120
800 3000*
120 800 3000*
n 34 39 34 7 8 7 Média 122.8 756.2 564.2 117.6 765.7 595.1 DP 18.4 112.2 82.9 10.1 73.5 65.2 DPR (%) 14.9 14.8 14.6 8.6 9.6 10.9 EP (%) 2.3 -5.4 -5.9 -1.9 -4.2 -0.8
Tabela 2- Validação dos Controles de Qualidade
*Controle de Qualidade 3000ng/mL foi diluído na proporção de 1:5 para quantificação
Parâmetros Farmacocinéticos
Concentração Média
0 2 4 6 8 10 12
0
75
150
225
300
375
450
PantoprazolPantozol
Tempo (h)
C (
ng
/mL
)
Figura 10- Concentrações plasmáticas (médias aritméticas EP) de
pantoprazol em função do tempo para as duas formulações de pantoprazol
(40mg) administradas em 22 voluntários sadios de ambos os sexos.
Parâmetros Pantoprazol Pantozol
ASC[0-12](ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
949.9
726.2 – 1242.6
908.7
683.5 – 1208.1
ASC[0-](ng.h.mL 1)
Média Geométrica 90% IC
971.2
755.6 – 1247.3
1071.1
831.0 – 1380.0
Cmax (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
524.2
416.8 – 659.1
525.2
400.1 – 689.5
Cmax / ASC[0-12] (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
0.6
0.5 – 0.7
0.6
0.6 – 0.7
Parâmetros Pantoprazol Pantozol
t1/2 (h) Média Geométrica 90% IC
0.949
0.797 – 1130.0
0.882
0.725 – 1073.0
Ke (h 1) Média Geométrica 90% IC
0.729
0.614 – 0.867
0.775
0.642 – 0.936
tmax (h) Mediana Faixa
2.3
1.0 – 5.0
2.5
1.0 – 5.0
Tabela 3 – Parâmetros farmacocinéticos de pantoprazol obtidos após a
administração de cada uma das formulações de pantoprazol (40mg) nos 22
voluntários.
Parâmetros % das razões Pantoprazol/Pantozol
Paramétrico Não
Paramétrico
ASC[0-12](ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
105.5
95.2 – 116.8
104.3
93.9 – 117.7
ASC[0-](ng.h.mL 1)
Média Geométrica 90% IC
102.6
91.5 – 115.1
102.0
89.1 – 114.8
Cmax (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
99.8
88.2 – 112.8
98.9
88.3 – 114.2
Cmax / ASC[0-12] (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC
105.6
99.7 – 111.9
105.4
97.9 – 112.4
Parâmetros % das razões Pantoprazol/Pantozol
Paramétrico Não
Paramétrico
t1/2 (h) Media Geométrica 90% IC
108.5
89.9 – 130.8
106.1
96.6 – 118.3
Ke (h 1) Média Geométrica 90% IC
107.0
89.4 – 128.0
105.5
93.4 – 118.0
tmax (h) Média Geométrica 90% IC
-0.542b
-1.057-0.027c
-5.00
-1.25 – 0.00
Tabela 4 – Análise estatística das razões individuais teste/referência da ASC 0-12h, ASC0-, Cmax, e das diferenças teste – referência de Tmax entre ambas as formulações de pantoprazol bMédia Aritmética das diferenças individuaisc90% das diferenças individuais
Conclusão
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