UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
Ana Carolina Baltazar Zeredo
EFICIÊNCIA DE BIODIGESTORES ANAERÓBIOS MODELO LAGOA
COBERTA NA REMOÇÃO DE VÍRUS ENTÉRICOS EM DEJETOS
SUINÍCOLAS
FLORIANÓPOLIS
2015
Ana Carolina Baltazar Zeredo
EFICIÊNCIA DE BIODIGESTORES ANAERÓBIOS MODELO LAGOA
COBERTA NA REMOÇÃO DE VÍRUS ENTÉRICOS EM DEJETOS
SUINÍCOLAS
Trabalho apresentado ao Curso de
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa Catarina como
requisito para a obtenção do título de
Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientadora: Profª. Drª. Célia Regina Monte
Barardi
Co-orientadora: MsC. Gislaine Fongaro
FLORIANÓPOLIS
2015
À minha família e seus esforços, sem os
quais eu jamais teria alcançado esta
conquista, dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeira e primordialmente a Deus, detentor de minhas
crenças, mas acima de tudo de meu destino. Sem a fé os momentos de tristeza
decresceriam minha determinação, as dificuldades naturais da caminhada
acadêmica se transformariam em obstáculos intransponíveis e limitariam meu
crescimento como profissional e ser humano.
Após, entretanto igualmente importante, agradeço ao apoio integral
recebido de minha família. Obrigada a meu irmão Felipe, com suas palavras
carinhosas, brincadeiras e abraço acolhedor em todos os momentos que
precisei; a meus tios Juliano e Fernanda, que me receberam de braços abertos
em meu primeiro ano em Florianópolis, onde tudo era tão novo e assustador.
Sou grata especialmente a meus pais Elisa e Carlos, que mais que suporte
emocional forneceram a mim suporte financeiro para a concretização deste
sonho.
Agradeço também ao meu namorado Everton, que por vezes acreditou
mais em meu potencial do que eu mesma. Obrigada pelo incentivo e pela
inesgotável paciência com meus momentos de dúvida. Obrigada pela pessoa
iluminada que és, e por quem sou quando estamos juntos.
À minha colega de apartamento e grande amiga Michele, obrigada pela
parceria especialmente no início de nosso curso, paciência e sinceridade para
falar o que tinha de ser dito. Agradeço a oportunidade de carregar para sempre
nossas aventuras, indagações, incertezas e amizade construída acerca de
todos esses fatores.
Aos amigos e amigas, meus mais sinceros e profundos agradecimentos.
Obrigada pelas sábias palavras de coragem e incentivo de sempre, obrigada
também pelos momentos felizes resultantes de nossos encontros. Vocês
trazem sentido a esta jornada mundana.
Dedico agradecimento especial à minha orientadora Célia Barardi e co-
orientadora Gislaine Fongaro. Seus ensinamentos foram preciosos; jamais
esquecerei da disponibilidade a mim dedicada, das palavras doces mas ao
mesmo tempo exigentes e de tudo que aprendi nesses dois anos de LVA.
Vocês serão eternas e inesquecíveis em meu coração.
Obrigada também a minha colega de laboratório e amiga Camila, por ter
acompanhado e auxiliado meus trabalhos sem ter obrigação alguma. Agradeço
por ter me ajudado a adquirir confiança na condução dos meus experimentos,
bem como pelas explicações até mesmo das dúvidas mais simples.
Agradeço por fim, mas não menos necessário, a toda a equipe do
Laboratório de Virologia Aplicada - LVA, que desde meu primeiro dia sempre se
mostrou prestativa para ensinar e repetir o que quer que fosse. Obrigada pela
preocupação nos dias em que não me encontrava tão bem, e por acrescentar
experiências e lições à minha vida. Levarei seus ensinamentos em um lugar
especial de minha mente e coração.
Enfim, obrigada a todos que participaram desta caminhada. Agradeço
com muita sinceridade e amor.
RESUMO
A biodigestão anaeróbia (BA) apresenta-se como uma alternativa de
tratamento de dejetos suinícolas, reduzindo seu potencial de poluir água, solos
e ar, bem como permite a geração de biogás e reciclo do efluente como
biofertilizante agrícola. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar a
eficiência da higienização de dejetos suinícolas através da BA psicrofílica,
usando adenovírus porcino (PAdV), circovírus porcino-2 (PCV-2) e rotavírus A
(RV-A) como biomarcadores. Para isso, amostras brutas (afluente) e
biodigeridas (efluente) provenientes de biodigestores anaeróbios psicrofílicos
foram coletadas sazonalmente durante primavera-verão (novembro-2014 a
janeiro-2015) e outono-inverno (maio a julho de 2014) em Juiz de Fora-MG. As
amostras foram processadas e concentradas para a quantificação das cópias
genômicas (CG) virais provenientes de PAdV, PCV-2 e RV-A por meio de
qPCR. Amostras positivas para PCV-2 foram avaliadas quanto à sua
infecciosidade por meio de cultura celular. PCV-2 e PAdV foram positivos em
100% das amostras (8/8) no período outono-inverno, enquanto RV-A esteve
presente em 87,5% (7/8) das amostras avaliadas. No período primavera-verão,
PCV-2 e RV-A foram positivos em 100% das amostras, enquanto PAdV foi
positivo em 87,5% das amostras. Não foram encontradas diferenças
significativas na quantidade de genomas quantificados por qPCR antes e
depois da BA. Ensaios de infecciosidade mostraram em afluente 5,7 Log10 CG
mL-1 e 6,37 Log10 CG mL-1 provenientes de PCV-2 infecciosos durante outono-
inverno e primavera-verão, respectivamente; Em efluente suinícola, 5,0 Log10
CG mL-1 e 3,86 Log10 CG mL-1 provenientes de PCV-2 infecciosos durante
outono-inverno e primavera-verão, respectivamente. O teste de infecciosidade
mostrou que após a BA durante o período de primavera-verão houve redução
significativa (2,5 Log10) de PCV-2 infecciosos em efluentes suinícolas, no
entanto durante o outono-inverno a redução não foi significativa (0,97 Log10). A
presença de vírus entéricos infecciosos no efluente final aponta para a
necessidade de desinfecção dessa matriz após a BA, visando reciclo seguro
desses efluentes na biofertilização e fertirrigação.
Palavras-chave: higienização, biodigestão anaeróbia, vírus entéricos,
patógenos, efluentes suinícolas, biofertilização.
ABSTRACT
The anaerobic biodigestion (AB) is an alternative used to treat swine raw
manure, reducing its potential to pollute water, soil and air. It also allows the
generation of biogas and the reutilization of the effluent as agricultural fertilizer.
In this context, the present study aimed to evaluate the efficiency of swine
manure higienization during anaerobic biodigestion, using porcine adenovirus
(PAdV), porcine circovirus-2 (PCV-2) and the rotavirus A (RV-A) as
bioindicators and pathogens model. Affluent (raw manure, not processed) and
effluent (biodigested) samples were collected seasonally during spring-summer
(November 2014 and January 2015) and autumn-winter (May to July 2014) in
Juiz de Fora city – MG state. Samples were processed and concentrated and
viral genomic copies (GC) originated from PAdV, PCV-2 and RV-A were
quantified by qPCR or RT-qPCR. PCV-2 and PAdV were positive in 100% of
the samples (8/8), while RV-A was present in 87,5% (7/8) of the samples in the
period of autumn-winter. In the spring-summer analysis, PCV-2 and RV-A were
positive in 100% of the samples while PAdV was in 87,5% of the samples. Not
significant differences were observed in the quantity of genomes quantified by
qPCR before and after the AB. Infectivity assays showed: in affluent 5,7 Log10 CG
mL-1 and 6,37 Log10 CG mL-1 from infectious PCV-2 during autumn-winter and
spring-summer, respectively; In swine effluent, 5,0 Log10 CG mL-1 and 3,86
Log10 CG mL-1 from infeccious PCV-2 during autumn-winter and spring-summer,
respectively. After the AB, during spring-summer infectious PCV-2 reduction
was significant (2,5 Log10) after biodigestion process, although during autumn-
winter this reduction was not significant (0,97 Log10). The presence of infectious
enteric viruses in the final effluent samples highlights the need of disinfection
after AB, aiming a safe reutilization of these effluents for further biofertilization
and fertigation purposes.
Keywords: higienization, anaerobic biodigestion, enteric viruses, pathogens,
swine wastewater, biofertilization
LISTA DE ABREVIATURAS
ANDA Associação Nacional para Difusão de Adubos
ATCC American Type Culture Collection
BA Biodigestão Anaeróbia
cDNA DNA Complementar
CG/mL Cópias Genômicas por Mililitro
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
DNA Ácido Desoxirribonucleico
dNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura
FATMA Fundação do Meio Ambiente
GEE Gases de Efeito Estufa
HAdV Adenovirus Humano
HAdV-2 Adenovírus Humano Tipo 2
ICC-et-RT-qPCR Ensaio de Cultura Celular Integrada à RT-qPCR
Precedida por Tratamento Enzimático
mRNA RNA Mensageiro
OCDE Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OMS Organização Mundial da Saúde
PAdV Adenovírus porcino
PBS Tampão Salina Fosfato
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
PCV-2 Circovírus Porcino Tipo 2
PEG Polietilenoglicol
PSA Penicilina - Sulfato de Estreptomicina - Anfotericina
qPCR PCR em Tempo Real
RH Retenção Hidráulica
RNA Ácido Ribonucleico
RT Transcrição Reversa
RV-A Rotavírus Tipo A
SFB Soro Fetal Bovino
ST Sólidos Totais
UV Ultra-Violeta
SUMÁRIO DAS FIGURAS
Figura 1. Etapas da biodigestão anaeróbia. ..................................................... 16
Figura 2. Biodigestor anaeróbio em funcionamento, modelo lagoa coberta (A), e
sua representação esquemática (B). ................................................................ 18
Figura 3. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de
adenovírus........................................................................................................ 23
Figura 4. Suspensão viral de PCV-2 (A) – sorotipo não identificado - e suíno
acometido por circovirose (B). .......................................................................... 23
Figura 5. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de rotavírus:
as setas apontam partículas de camada dupla; os demais vírus contêm camada
tripla. A barra representa 100 nm. .................................................................... 25
Figura 6. Biodigestores anaeróbios semicontínuos de escala laboratorial,
unidade Embrapa Gado de Leite, Minas Gerais. .............................................. 28
Figura 7. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa
em Log10, obtida durante o período outono-inverno em afluente (a) e efluente
(b). .................................................................................................................... 36
Figura 8. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa
Log10, obtida durante o período primavera-verão em amostras de afluente (a) e
efluente (b). ...................................................................................................... 38
Figura 9. Distribuição da população viral avaliada durante primavera-verão e
outono-inverno. ................................................................................................ 40
Figura 10. Cópias genômicas (CG) totais (por qPCR) e detectadas a partir de
PCV-2 infecciosos (por ICC-et-RT-qPCR) presentes durante o outono-inverno
(a) e a primavera-verão (b). .............................................................................. 41
SUMÁRIO DAS TABELAS
Tabela 1. Avaliação de parâmetros físico-químicos das amostragens (n = 8 por
período). ........................................................................................................... 35
Tabela 2. Médias globais de cópias genômicas por mL (CG/mL), desvio padrão
e redução de carga viral pós-BA. ..................................................................... 39
SUMÁRIO DOS QUADROS
Quadro 1. Protocolos adotados, respectivas sondas e iniciadores utilizados
para qPCR........................................................................................................ 31
SUMÁRIO GERAL
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 144
1.1 Suinocultura ............................................................................................. 144
1.2 Biodigestão Anaeróbia e Reciclo de Efluentes Suinícolas ......................... 15
1.2.1 Tipos de Biodigestores Anaeróbios ......................................................... 17
1.2.2 Reciclo de Efluentes na Agricultura ......................................................... 19
1.3 Biomarcadores Virais para Monitoramento de Seguridade Sanitária de
Biofertilizantes Suinícolas ................................................................................ 21
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 27
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 27
2.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 27
3. METODOLOGIA .......................................................................................... 28
3.1 Amostragens .............................................................................................. 28
3.2 Parâmetros Físico-Químicos das Amostras ............................................... 29
3.3 Análises Virais ............................................................................................ 29
3.3.1 Eluição, Concentração e Clarificação de Amostras ................................. 29
3.3.2 Extração de Material Genético ................................................................ 29
3.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR) ................... 30
3.4 Controle Interno de Recuperação e Detecção Viral ................................. 322
3.5 Ensaio de Infecciosidade de PCV-2 ......................................................... 322
3.6 Análises Estatísticas .................................................................................. 34
4. RESULTADOS ........................................................................................... 355
4.1 Parâmetros Físico-Químicos .................................................................... 355
4.2 Ensaio de Recuperação Viral ................................................................... 355
4.3 Análise de Vírus Entéricos em Afluente e Efluente .................................. 355
4.4 População Viral Circulante em Dejetos Suínos .......................................... 39
4.5 Estudo de Infecciosidade de PCV-2 ........................................................... 40
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 42
6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 49
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 50
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 Suinocultura
A suinocultura destaca-se como uma importante atividade a níveis
nacional e mundial, especialmente devido à movimentação da economia e ao
valor nutricional da carne suína, que possui todos os aminoácidos essenciais,
como leucina, lisina e valina, além de elevados percentuais de ferro, zinco,
potássio e de vitaminas do complexo B (MAGNONI & PIMENTEL, 2007; ABPA,
2015).
A expansão da suinocultura no Brasil ao longo das décadas ancora-se
em três fatores principais: (a) introdução de novas tecnologias no sistema de
produção; (b) aumento do consumo interno e (c) conquista do mercado
internacional. Atualmente, o país figura entre os dez maiores produtores
mundiais de carne suína. No ano de 2013, o efetivo nacional de suínos foi
superior a 36 milhões de cabeças. Somente a região Sul deteve 48,8% da
produção nacional, tendo o estado de Santa Catarina participado
aproximadamente com 17% do efetivo total, o que representou mais de seis
milhões de cabeças; por sua vez, a região Sudeste conta com o segundo maior
rebanho do país (SUINOCULTURA INDUSTRIAL, 2013; ABPA, 2015).
Entretanto, o desenvolvimento da atividade levou ao aumento da
geração de dejetos, o que gera impactos ambientais negativos, caracterizando
este setor agropecuário como um grande poluidor de solos, ar e águas. Estima-
se que os suínos produzam diariamente uma quantidade de excretas
equivalente a quatro vezes ao produzido pelos humanos, sendo que cada
animal excreta 4,9 a 8,5% de seu peso vivo diariamente. Os dejetos se
caracterizam por uma mistura de fezes e urina, restos de ração, águas vazadas
dos bebedouros, águas utilizadas para higienizar as instalações e por vezes
águas oriundas das chuvas, que podem adentrar nas calhas. O volume final
produzido é variável, pois depende de um conjunto de fatores como
composição da alimentação, técnicas de manejo e estado psicológico dos
animais (HENN, 2005; OLIVEIRA, 2006; KUNZ et al., 2009; HACK, 2011).
15
Observa-se na literatura que o conhecimento acerca dos aspectos
químicos, físicos e microbiológicos de dejetos suinícolas e biodigestores vêm
crescendo a cada ano. Como consequência, devido ao crescente aumento da
população de suínos no Brasil, é imprescindível adotar técnicas de manejo,
estocagem, tratamento, uso e disposição correta dos dejetos dentro dos
sistemas de produção, objetivando a manutenção da qualidade ambiental, a
reutilização segura dos resíduos em outros sistemas agrícolas e maior
rentabilidade na produção (DE MOTES et al., 2004; KUNZ et al., 2010;
VIANCELLI et al., 2012; FONGARO et al., 2014; MARTHALER et al., 2014;
SAADY & MASSÉ, 2015).
1.2 Biodigestão Anaeróbia e Reciclo de Efluentes Suinícolas
O reciclo de dejetos suinícolas para fins de biofertilização dos solos
resultante do manejo dos resíduos gerados pela prática da suinocultura
apresenta-se como alternativa de baixo custo, viável e que pode substituir
parcial ou totalmente a adubação dos solos por fertilizantes químicos. Um dos
processos de tratamento que visa o reciclo de dejetos é a biodigestão
anaeróbia (BA), responsável por estabilizá-los parcialmente (BASTOS &
MARA, 1992; SCHERER, 2003).
A BA é um processo onde bactérias e arqueas (micro-organismos
procariotos) decompõem a matéria orgânica, na ausência de oxigênio gasoso,
gerando os gases metano (CH4) e dióxido de carbono (CO2). Neste sistema
são decompostos e tratados resíduos orgânicos provenientes de práticas
agrícolas, indústrias, municípios e demais atividades humanas e é gerado o
biogás, utilizado na geração de energia, sendo que os efluentes tratados
possuem potencial biofertilizante (ALMEIDA, 2008; ORRICO JR, ORRICO &
LUCAS JR, 2010; REIS, 2012; RIZZONI et al., 2012).
A decomposição de matéria orgânica por BA inclui as fases de hidrólise,
acidogênese, acetogênese e metanogênse, estando sujeita às condições
específicas de temperatura, pH e tempo de retenção hidráulica (RH) da
biomassa no sistema, bem como varia de acordo com a constituição do
substrato e concentração de nitrogênio. Durante a hidrólise, compostos
16
orgânicos complexos – proteínas, lipídios e carboidratos - são hidrolisados e
reduzidos a compostos mais simples - aminoácidos, ácidos graxos e açúcares,
pela ação de bactérias fermentativas hidrolíticas. Na acidogênese, os produtos
resultantes da hidrólise são metabolizados em hidrogênio (H2), dióxido de
carbono (CO2), amônia ionizada (NH4+), ácidos graxos voláteis (ácido acético,
propiônico e butírico), sais e alcoóis; nesta etapa atuam bactérias
acidogênicas, que podem ser anaeróbias obrigatórias ou facultativas. Durante a
acetogênese, os produtos oriundos da fase anterior são metabolizados e há
produção de ácido acético e H2, precursores da formação de metano; atuam
nesta etapa bactérias acetogênicas. A metanogênese, última fase da BA, é
caracterizada pela produção de metano (CH4) a partir da redução de ácido
acético e de CO2 por micro-organismos procariotos conhecidos como arqueas,
que são metanogênicos e anaeróbios (WOESE et al., 1978; BELLI FILHO,
1995; CARON et al., 2009). Nesta fase também será encontrado o efluente
biodigerido. A Figura 1 resume as etapas descritas.
Figura 1. Etapas da biodigestão anaeróbia.
Fonte: Caron et al. (2009) - adaptado
Portanto, a BA pode reduzir significativamente o potencial poluidor de
produtos gerados por atividades como a suinocultura ao permitir a ciclagem de
17
material orgânico devido a vários fatores como temperatura, pH, umidade e
variação na composição química da matriz original de abastecimento do
biodigestor, o que implica em menor contaminação dos solos, do ar e das
águas, agregando valor não só à economia, mas também à sustentabilidade
(MANYI-LOH et al., 2013).
No Brasil, alguns dispositivos legais indicam e regulamentam o uso de
efluentes originários da produção animal. A resolução no 357/2005 do
Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) prevê padrões de
lançamento de efluentes em corpos d’água. Por sua vez, a resolução
no 375/2006 que reformula a resolução nº 357/2005 regulamenta a aplicação
de lodo humano em solos. Embora a suinocultura esteja contemplada na Lei
9.605/98 - Lei de Crimes Ambientais - por ser atividade de alto potencial
poluidor, atualmente a legislação brasileira é pouco específica no que tange à
regulamentação do uso e reuso de efluentes gerados por este exercício
(ZANELLA et al., 2006). A instrução normativa nº 11/2009 estabelecida pela
Fundação do Meio Ambiente (FATMA) determina que a quantidade máxima de
dejetos suinícolas aplicados em lavouras seja de 50m³/ha/ano, seguindo
recomendações de adubação embasadas em laudo de análise de solo.
O controle e fiscalização ambiental são necessários para remodelar as
práticas e procedimentos adotados pelas diversas vertentes da agropecuária,
de modo que os impactos ambientais resultantes das mesmas sejam
minimizados, buscando-se o bem estar da comunidade e a consequente
melhora na qualidade de vida (ZANIN, BAGATINI & PESSATTO, 2010).
1.2.1 Tipos de Biodigestores Anaeróbios
O biodigestor é o reator responsável por realizar a BA, fornecendo
condições ótimas para o desempenho de micro-organismos anaeróbios
metanogênicos. Apresenta um compartimento onde é depositado o material
orgânico a ser decomposto, sendo basicamente constituído por um tanque de
digestão e um gasômetro. Cada modelo de biodigestor deve se adequar às
competências da propriedade em que será empregado, como a necessidade
de biogás e as cargas de resíduos requeridas. Além disso, sua localização
18
deve vislumbrar a facilidade de distribuição do biogás pela propriedade a fim de
diminuir custos de armazenamento e transporte (DEGANUTTI et al., 2002;
OLIVEIRA, 2004).
Para tanto, existem biodigestores que atuam de forma descontínua (ou
por batelada) e contínua / semi-contínua. Os que atuam em batelada operam
com quantidade determinada de dejetos, de modo que uma carga é inserida no
biodigestor, que é fechado por completo e somente é reaberto após a produção
de biogás, onde há a retirada do biodigestato para que se inicie um novo ciclo.
Em biodigestores de produção contínua / semi-contínua, mais comuns no
Brasil, os dejetos a serem digeridos são colocados concomitantemente ao seu
recolhimento, não havendo a necessidade de abertura do equipamento, ou
podem ser abastecidos com pequenas cargas de dejeto, diárias ou semanais
(DEGANUTTI et al., 2002). O modelo lagoa coberta é o mais comumente
empregado no Brasil (Figura 2).
Figura 2. Biodigestor anaeróbio em funcionamento, modelo lagoa coberta (A),
e sua representação esquemática (B).
Fonte: Fongaro et al. (2014) -
adaptado.
Os biodigestores anaeróbios também diferem em seu sistema
operacional em relação à temperatura empregada. Dessa maneira, os micro-
organismos presentes podem atuar por psicrofilia (ótimo de crescimento e
metabolismo ocorre em temperatura ambiente não controlada, entre 15 e
20ºC), mesofilia (ótimo de crescimento e metabolismo ocorre entre 30ºC e
19
40ºC) ou termofilia (ótimo de crescimento e metabolismo ocorre entre 45 e
60ºC). O aumento de temperatura permite que as reações biológicas
aconteçam mais rapidamente, embora não influenciem na produção de biogás
(MORITA, 1975; FULFORD, 1998; MIRANDA et al., 2006).
Após a passagem pelo biodigestor os dejetos brutos (afluentes) são
chamados de efluentes, os quais apresentam características nutricionais para
serem reciclados na agricultura na forma de biofertilização e fertirrigação. A
matéria orgânica, ao ser digerida, sofre aumento na concentração de nitrogênio
e de outros nutrientes, valorizando suas propriedades para reciclo agrícola
(MEDEIROS et al., 2003).
Em síntese, a biodigestão anaeróbia emerge como opção promissora
para a reciclagem da matéria orgânica e controle de maus odores resultantes
desta operação. Assim, a implantação e uso de biodigestores permite reutilizar
os dejetos de tal maneira que os mesmos possam ser convertidos em recursos
viáveis para contribuir com o desenvolvimento econômico e social (ZANIN,
BAGATINI & PESSATTO, 2010).
1.2.2 Reciclo de Efluentes na Agricultura
A agricultura mundial deverá ampliar em 80% a produção de alimentos
até 2050 para suprir as necessidades da população, que deve atingir a marca
de 9,7 bilhões de pessoas segundo relatório elaborado pela Organização para
Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) juntamente com a
Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO).
Estimativas da FAO também apontam que até 2030 haverá aumento do
consumo mundial em relação ao que é produzido atualmente, de 47% de carne
suína, 55% de carne de frango e 34% de carne bovina, além de alimentos
como açúcar, milho, arroz e soja. Especialmente para a agricultura brasileira, o
desafio reside em aumentar a produção conciliando sustentabilidade ambiental
(especialmente qualidade do solo e da água), decréscimo da pobreza e
desigualdade social.
20
Nesse contexto, o Brasil apresenta expressivo potencial para contribuir
com a produção alimentar para o planeta. De todo o território nacional, cerca
de 340 milhões de hectares são agricultáveis; deste valor, cerca de 172
milhões de hectares correspondem a áreas de pastagem. Entretanto, o país
requer anualmente grandes quantidades de fertilizantes para a produção
agrícola, demanda esta que exige capital e tempo despendido para aplicação.
Somente em 2014, as entregas de fertilizantes ao consumidor final no país
representaram 32 milhões de toneladas, caracterizando aumento de 9,7% em
relação ao ano anterior. O Brasil, segundo maior produtor de alimentos em
volume, é também reconhecido devido ao emprego de inovações tecnológicas
e de produtividade (GUAZZELLI, RUPP & VENTURINI, 2012; ANDA, 2014).
Segundo a Associação Nacional de Difusores de Adubo (ANDA), a
utilização de fertilizantes cresce 4,6% a cada ano. Fertilizantes químicos, além
do alto custo, alteram as condições ambientais em razão de suas propriedades
e devido ao uso excessivo. Neste âmbito, a aplicação de biofertilizantes
(provenientes de matéria orgânica) emergiu como uma alternativa consistente
para esta questão, disponibilizando uma nova perspectiva de produção
agrícola, de maneira que os resíduos gerados por exercícios agroindustriais
sejam aproveitados e o impacto ambiental minimizado. Os biofertilizantes
podem substituir os fertilizantes químicos e os mesclados, sendo produzidos a
partir de qualquer matéria orgânica fresca oriunda da agricultura ou da indústria
(MEDEIROS, WANDERLEY & WANDERLEY, 2003; GUAZZELLI, RUPP &
VENTURINI, 2012).
Um importante aspecto do biofertilizante é que este age como protetor
para a planta. Enquanto agrotóxicos e adubos minerais solúveis (em especial
os nitrogenados) tem ação tóxica - após adsorção pela planta conseguem
alterar a fisiologia vegetal, diminuindo a proteossíntese e acarretando no
acúmulo de aminoácidos e açúcares, compostos de fácil utilização por parte de
diversas pragas - o biofertilizante tem em sua composição componentes como
boro, magnésio, zinco, enxofre e nitrogênio, além de aminoácidos, vitaminas e
hormônios vegetais. A transformação de dejetos de suínos através da
biodigestão merece reconhecimento devido aos aspectos sanitários, de
21
reciclagem de nutrientes e à capacidade de geração de energia renovável
(MEDEIROS et al., 2003; MEDEIROS, WANDERLEY & WANDERLEY, 2003;
KONZEN, 2005; GUAZZELLI, RUPP & VENTURINI, 2012).
1.3 Biomarcadores Virais para Monitoramento de Seguridade Sanitária de
Biofertilizantes Suinícolas
Ampla é a gama de micro-organismos que ofertam riscos à saúde
humana e animal, destacando-se parasitas, bactérias e vírus. Estudos
epidemiológicos acerca de doenças enzoóticas, ou seja, doenças de ocorrência
estável em um rebanho ou determinada região, ainda são deficientes, embora
sejam indispensáveis para que seja mantido o controle sobre as enfermidades
que acometem suínos e consequentemente não interfira na cadeia produtiva
(ZANELLA & MORES, 2005; BILOTTA & KUNZ, 2013; VIANCELLI et al., 2013;
FONGARO et al., 2014).
Os suínos podem ser reservatórios naturais, e por vezes assintomáticos,
de patógenos entéricos virais (como o vírus da hepatite E e os rotavírus A e C)
e bacterianos (como Salmonella spp.). Sua saúde é dependente das condições
que os circundam, como alimentação, água, instalações e manejo. As doenças
que costumam manifestar-se nestes animais estão reunidas em dois grupos
principais: (a) epizoóticas – ocasionadas por agentes específicos e de alta
contagiosidade e taxas de morbidade e mortalidade; (b) multifatoriais – onde
um ou mais agentes infecciosos exercem sua patogenia em rebanhos,
ocasionando as conhecidas “doenças de rebanho”. Permanecem de forma
enzoótica nos rebanhos, ou seja, não apresentam mortalidade elevada, mas
impactam significativamente a economia por modificar a produtividade dos
animais. As enfermidades predominantes em rebanhos de suínos costumam se
manifestar quando os mesmos são mantidos em condições que levam à
imunossupressão (devido a fatores como estresse, confinamento, uso
indiscriminado de antibióticos, dentre outros) resultando em alta morbidade,
nem sempre correlacionada com mortalidade, resistência desenvolvida pelos
patógenos, redução de desempenho dos animais e aumento nos custos de
produção (ZANELLA & MORES, 2005; BAPTISTA et al., 2010).
22
Dentre os patógenos potencialmente presentes em dejetos suinícolas
destacam-se os vírus entéricos. Estes agentes podem estar no trato
gastrointestinal de humanos e animais, sendo introduzidos no ambiente depois
de eliminados em altas concentrações, especialmente por via fecal, além do
despejo de dejetos não tratados ou tratados de forma ineficiente,
permanecendo infecciosos e estáveis por períodos prolongados. Os vírus
entéricos são importantes devido a sua alta estabilidade em condições
ambientais adversas de pH, radiação ultravioleta (UV), salinidade e
temperaturas elevadas, condições essas que são muito desfavoráveis ou até
letais para outros microrganismos (FONG & LIPP, 2005; GRIFFIN, PLUMMER
& LONG, 2008).
Embora não se multipliquem no ambiente por serem parasitas
intracelulares obrigatórios, os patógenos virais podem perdurar por meses em
matrizes ambientais, mantendo sua viabilidade e capacidade de infecção,
sendo os vírus entéricos comumente identificados ao longo de todas as
estações do ano (TAVARES, CARDOSO & DE BRITO, 2005).
Os adenovírus porcinos (PAdV), circovírus porcinos-2 (PCV-2) e os
rotavírus-A (RV-A) são vírus que atendem às condições de estabilidade
anteriormente reportadas, sendo assim indicados como biomarcadores da
seguridade sanitária de águas residuárias e de efluentes suinícolas (HUNDESA
et al., 2006; VIANCELLI et al., 2011; FONGARO et al., 2014).
Os adenovírus (Figura 3) são vírus icosaédricos de 90 nm de diâmetro,
pertencentes à família Adenoviridae, não apresentam envelope e têm como
material genético DNA de dupla fita contendo aproximadamente 36.000 pares
de base. Existem 56 sorotipos, classificados em sete espécies (A-G), que
possibilitam a infecção de muitas espécies, incluindo humanos, bovinos e
suínos. Os adenovírus porcinos (PAdV) podem causar doenças neurológicas
em suínos, sendo abundantes nesta população e muito prevalentes e estáveis
em material fecal. Essas características fazem do PAdV um importante
biomarcador de contaminação ambiental e no controle de desinfecção
23
(HUNDESA et al., 2006; VIANCELLI et al., 2011; FIELDS, 2013; FONGARO,
2014).
Figura 3. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de
adenovírus.
Fonte: Fields (2013) - adaptado.
Os circovírus pertencem à família Circoviridae, subdividida nos gêneros
Circovirus e Gyrovirus, e estão distribuídos em pelo menos 11 espécies. Os
membros do gênero Circovirus são pequenos, não-envelopados, icosaédricos e
de tamanho aproximado entre 15 e 20 nm. Seu genoma é DNA de fita simples
circular. Os PCV-2 são eliminados em altas concentrações por via fecal ou por
secreção nasal em suínos. Causam a circovirose suína, doença endêmica da
suinocultura tecnificada, ao contrário de PCV-1 que não apresenta
patogenicidade. A mortalidade pode atingir até 35% da população
contaminada. Atualmente, é a doença que causa maior impacto econômico na
suinocultura brasileira. Por ser uma doença imunossupressora, deixa os suínos
mais vulneráveis a outros agentes patológicos que causam doenças
respiratórias e entéricas (TISCHER et al., 1982; ZANELLA & MORES, 2005;
FIELDS, 2013). A Figura 4 apresenta suspensão viral de circovírus porcino (A)
e um suíno acometido por circovirose (B).
Figura 4. Suspensão viral de PCV-2 (A) – sorotipo não identificado - e suíno
acometido por circovirose (B).
24
Fonte: Look For Diagnosis (A) e Fields (2013) (B) - adaptado.
Os rotavírus (Figura 5) estão contemplados no gênero Rotavirus, dentro
da família Reoviridae. Apresentam simetria icosaédrica, diâmetro de 100 nm,
RNA de dupla fita segmentado com aproximadamente 18.500 pares de base e
não contêm envelope. Compõem sete grupos distintos de A a G e podem
apresentar camada simples, dupla ou tripla. Os rotavírus são importantes
patógenos entéricos zoonóticos, acometendo humanos e animais. Estima-se
que os rotavírus do grupo A sejam os principais responsáveis pelas doenças
diarreicas que acometem animais e humanos (menores de 5 anos), atingindo
anualmente um milhão de crianças em países em desenvolvimento; no que se
refere a animais de produção, enterites associadas aos rotavírus constituem
um grave problema principalmente para leitões e bezerros. Os tipos A, B, C, E
e H são descritos na literatura como frequentemente detectados em suínos,
implicando diretamente na saúde pública humana e animal (SAIF & JIANG,
1994; ALFIERI et al., 1996; MARTELLA et al., 2010; FIELDS, 2013;
MARTHALER, 2014).
25
Figura 5. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de rotavírus:
as setas apontam partículas de camada dupla; os demais vírus contêm camada
tripla. A barra representa 100 nm.
Fonte: Fields (2013) - adaptado.
Dos patógenos entéricos mais comumente pesquisados, as bactérias
são as mais vulneráveis à inativação, seguidas pelos protozoários e só então
pelos ovos de áscaris e vírus entéricos, o que faz desses últimos excelentes
biomarcadores da eficiência dos processos de higienização e desinfecção de
diferentes matrizes biológicas e ambientais (FONG & LIPP, 2005).
Desenvolver estudos que melhor investiguem a atual condição sanitária
das granjas suinícolas é fundamental não só devido à questão sanitária - que
reflete na saúde populacional -, mas também pelo aspecto comercial frente à
alta distribuição, comercialização e consumo desta fonte proteica (ZANELLA &
MORES, 2005). Nesse contexto, o presente Trabalho de Conclusão de Curso
foi concebido para avaliar a presença e a persistência de PCV-2, PAdV e RV-A
em afluentes (dejetos brutos) e efluentes (dejetos pós BA psicrofílica) da
suinocultura na região Sudeste brasileira, estando inserido no projeto nacional
BiogasFert - Tecnologias para Produção e Uso de Biogás e Fertilizantes a
partir do Tratamento de Dejetos Animais no Âmbito do Plano ABC, decorrente
da parceria entre diferentes unidades da Embrapa no Brasil e a Fundação
Parque Tecnológico ITAIPU com universidades brasileiras federais e estaduais,
26
sendo cada universidade responsável por um aspecto do projeto. Iniciado em
setembro de 2012 e com duração prevista para 36 meses, o projeto está
interligado a programas em vigência na Embrapa, como as redes FertBrasil,
que investiga processos que podem contribuir para a maior eficiência e para a
inserção de novos nutrientes na agricultura nacional, e PECUS, que estuda os
GEE e o balanço de carbono em sistemas de produção na agropecuária. O
Projeto BiogasFert, cuja linha temática é o tratamento de dejetos animais,
ancora-se na necessidade de o agronegócio passar por avaliações constantes
principalmente no que diz respeito à execução de práticas interligadas ao meio
ambiente, descobrindo alternativas que resultem em tratamentos efetivos para
produção e uso dos biofertilizantes e biogás gerados, no intuito de promover a
expansão de forma sustentável dos sistemas de produção agropecuários.
Assim, almeja desenvolver e produzir práticas renovadoras, além de aprimorar
outras existentes, para otimizar o uso dos biofertilizantes orgânicos e
organominerais. Pretende também atuar na mitigação dos GEE, bem como traz
alternativas tecnológicas novas no que tange à produção e uso de biogás.
27
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a carga de vírus entéricos em dejetos suinícolas submetidos à
BA por psicrofilia nos períodos de outono-inverno e primavera-verão de 2014/
início de 2015, usando PAdV, PCV-2 e RV-A como biomarcadores.
2.2 Objetivos Específicos
Investigar a flutuação da população viral entérica durante as estações
avaliadas em 2014/ início de 2015 em afluentes sunícolas submetidos à
BA na região Sudeste do Brasil e comparar com a região Sul;
Avaliar a infecciosidade de PCV-2 em amostras tratadas em BA em
condições psicrofílicas.
28
3. METODOLOGIA
3.1 Amostragens
As amostras analisadas neste trabalho foram provenientes de distintas
unidades de criação de suínos em fase de engorda, da raça x, em Juiz de
Fora, Minas Gerais. Os dejetos foram recolhidos e encaminhados para
biodigestores situados na unidade Embrapa Gado de Leite, no mesmo
município. Com uma área total de 1.429,875 km², Juiz de Fora está a sudeste
do estado, com altitude máxima de 1.104 metros e mínima de 467 metros. Sua
latitude é de 21º 41' 20" ao Sul, enquanto a longitude é de 43º 20' 40" a Oeste
(PREFEITURA DE JUIZ DE FORA, 2006).
As amostras de dejeto suinícola bruto e tratado (afluente e efluente,
respectivamente) foram coletadas durante os períodos outono-inverno, entre os
meses de maio e julho e primavera-verão entre os meses de novembro e
janeiro em 2014/ início de 2015, a partir de biodigestores anaeróbios
semicontínuos que atuaram em condição de psicrofilia (temperatura
ambiente/não controlada).
Os ensaios de BA foram realizados utilizando-se quatro biodigestores
semicontínuos de escala laboratorial, com capacidade para armazenar 60 litros
de dejetos cada um e foram submetidos à RH por 60 dias. Os biodigestores
eram alimentados semanalmente com 2 litros de dejetos para posterior coleta.
Figura 6. Biodigestores anaeróbios semicontínuos de escala laboratorial,
unidade Embrapa Gado de Leite, Minas Gerais.
29
3.2 Parâmetros Físico-Químicos das Amostras
Afluentes e efluentes de biodigestores anaeróbios psicrofílicos foram
avaliados quanto a temperatura amostral, pH, teor de sólidos totais (ST) e
nitrogênio amoniacal total (NAT). Todas as análises físico-químicas foram
realizadas de acordo com APHA (2012), no laboratorio de físico-química da
Embrapa Gado de Leite e foram gentilmente fornecidas para comporem os
demais dados gerados.
3.3 Análises Virais
3.3.1 Eluição, Concentração e Clarificação de Amostras
A eluição das amostras foi realizada de acordo com o protocolo descrito
e estabelecido no Laboratório de Virologia Aplicada por Schlindwein et al.
(2010) e Viancelli et al. (2012). Utilizou-se 20 mL de cada amostra, a seguir foi
acrescentado 200 µL de cloreto de alumínio (AlCl3) [0,05 M] como agente
precipitador de partículas e o pH foi ajustado para 3,5 com ácido clorídrico
(HCl) [1M]. Em sequência, as misturas foram homogeneizadas em gangorra
durante 30 minutos, seguidas de centrifugação sob as condições 2500 g a 4ºC
durante 15 min. Ao final desta etapa houve a formação de precipitado, que foi
ressuspenso em 10 mL de tampão glicina em pH 9, agitado novamente por
mais 30 min e centrifugado a 8000g também por 30 min a 4ºC. O sobrenadante
de cada amostra foi coletado e a concentração das partículas virais foi feita
através da adição de 8% do volume final de cada amostra de Polietilenoglicol
6000 (PEG 6000) e em seguida clarificada adicionando-se 1/5 do volume final
da amostra de clorofórmio, para posteriormente ser centrifugado a 1500g a 4ºC
por 2 min. Ao final do procedimento, um volume aproximado de 4 mL por
amostra foi obtido, distribuído em alíquotas e refrigerado a -20°C para análises
posteriores.
3.3.2 Extração de Material Genético
Os concentrados virais foram submetidos à extração dos ácidos
nucleicos totais utilizando kit comercial de extração Invitek RTP DNA/RNA Mini-
vírus, seguindo recomendações do fabricante. Ao final do procedimento, as
colunas de sílica contendo o material genético isolado foram eluídas em
30
tampão de eluição (pH 7,5) pré-aquecido por meio de centrifugação a 12500g
por 1min para então ser armazenado à -20ºC para análises futuras.
3.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR)
A reação em cadeia de polimerase (PCR) é adotada em estudos
distintos de detecção de marcadores virais de contaminação de origem
humana ou animal, como adenovírus humano (HAdV) e adenovírus porcino
(PAdV). A PCR é muito executada especialmente devido à sua sensibilidade,
sendo que a PCR em Tempo Real (qPCR) permite não só a detecção da
sequência buscada como também a quantificação do material genético em
amostras ambientais e biológicas (HUNDESA et al., 2009).
Para detectar e quantificar as cópias genômicas virais de PAdV adotou-
se o protocolo descrito por Hundesa et al. (2009). Os iniciadores e a sonda
reconhecem um fragmento de 68 pb do gene hexon de PAdV e foram
desenhados especificamente para amplificar este fragmento de PAdV.
Para PCV-2 o protocolo empregado foi estabelecido por Opriessnig et al.
(2003). Não dá informações esclarecedoras sobre iniciadores e sondas,
apenas cita que os mesmos foram desenhados usando determinado sotfware
seguindo recomendações do fabricante.
Para mensurar as cópias genômicas presentes em RV-A o protocolo
utilizado foi descrito por Zeng et al. (2008). A cepa de referência para a
determinação de seus iniciadores e sonda foi a X81436ST3, através do gene
NSP3, com 1049 pb.
Todas as sondas e iniciadores específicos estão descritos no Quadro 1.
31
Quadro 1. Protocolos adotados, respectivas sondas e iniciadores utilizados para qPCR.
Vírus Protocolo Nome Sequência
PCV-2 Opriessnig et al. (2003)
Iniciador Direto 5’TGGCCCGCAGTATTCTGAATT3’
Iniciador Reverso
5’CAGCTGGGACAGCAGTTGAG3’
Sonda de hidrólise
5’6FAM-CCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATG-
TAMRA-3’
PAdV Hundesa et al. (2009)
Iniciador Direto 5’AACGGCCGCTACTGCAAG3’
Iniciador Reverso
5’AGCAGGCTCTTGAGG3’
Sonda de hidrólise
5’FAM-CACATCCAGGTGCCGC-TAMRA3’
RV-A Zeng et al. (2008)
Iniciador Direto 5’ACCATCTUUCACRTRACCCTCTATGAG3’
Iniciador Reverso
5’GGTCACATAACGCCCCTATAGC3’
Sonda de hidrólise
5’VIC-AGTTAAAAGCTAACACTAACACTGTCAAA-
MGB3’
Legenda: FAM= Fluoróforo; TAMRA= Sequestrador; VIC= Fluoróforo; MGB= Sequestrador.
Para detecção de RV-A, por se tratar de um vírus de genoma RNA, o
material foi previamente submetido à reação de transcrição reversa (RT) para
síntese do DNA complementar (cDNA).
A qPCR foi procedida utilizando o Kit Taqman Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems). Esse kit contém os principais reativos prescritos para
que a PCR ocorra (dNTPs, enzima Taq DNA polimerase, co-fatores
enzimáticos e condições salinas adequadas), sendo adicionados sondas e
iniciadores descritos anteriormente no Quadro 1.
As reações foram realizadas em placas de 96 cavidades em
equipamento StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
Todas as amostras foram analisadas em duplicata, na presença de controles
negativos (sem adição do ácido nucleico) e utilizando curva padrão –
32
fragmentos de DNA/cDNA clonados em plasmídeo - com as sequências-alvo
dos vírus analisados, disponíveis no Laboratório de Virologia Aplicada.
3.4 Controle Interno de Recuperação e Detecção Viral
Como controle interno e para determinar a eficiência de recuperação
viral foi utilizado o Adenovírus Humano-2 (HAdV-2). HAdV-2 é um vírus de
tropismo respiratório e foi propagado em cultivo celular, em células A549
derivadas de carcinoma de pulmão humano e permissivas à maioria dos
adenovírus humanos.
Afluente e efluente suinícolas, conhecidamente negativos para HAdV-2,
foram inoculados com 8,0x108 CG/mL-1 de HAdV-2, concentrados e clarificados,
bem como submetidos à extração de ácidos nucleicos conforme descrito
anteriormente no item 3.3.2.
As titulações e recuperações virais foram determinadas por meio de
qPCR, através do Kit Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)
utilizando iniciadores, sondas e condições de reação previamente descritas por
Hernroth et al. (2002), onde as sequências foram: AdV Direto 5’-C(AT)T ACA
TGC ACA TC(GT) C(CG)G G-3’; AdV Reverso: 5’-C(AG)C GGG C(GA)A
A(CT)T GCA CCA G-3’ e AdV Sondas Ad:ACDEF [5’-(6FAM) CCG GGC TCA
GGT ACT CCG AGG CGT CCT (TAMRA)-3’] e Ad:B [5’-(6FAM) CCG GAC
TCA GGT ACT CCG AAG CAT CCT (TAMRA)-3’].
3.5 Ensaio de Infecciosidade de PCV-2
Com o objetivo de demonstrar a infecciosidade viral, realizou-se ensaio
de cultura celular integrada (ICC) à RT-qPCR precedida por tratamento
enzimático (et), técnica denominada ICC-et-RT-qPCR, de acordo com Fongaro
et al. (2013), para quantificar PCV-2 infecciosos originalmente presentes nas
amostras de afluente e efluente suínos provenientes do processo de BA. Os
ensaios foram realizados em réplica e em duplicatas.
Para isso, foi elaborado um pool amostral com 1000 µL de cada uma
das 4 amostragens previamente eluídas, concentradas e clarificadas, de
acordo com o descrito no item 3.3.1, totalizando 4000 µL por período (outono-
33
inverno e primavera-verão). Desse pool, 400 µL foram utilizados para os
ensaios.
Inicialmente, células ST (originárias de testículo suíno, ATCC CRL-
17460), foram cultivadas e propagadas em meio RPMI (Gibco BRL)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB), 1% de antibióticos e
antifúngicos (PSA - penicilina G 100U/mL; sulfato de estreptomicina 100µg/mL
e anfotericina B 0,25µg/mL) e mantidas a 37ºC sob 5% de CO2.
Posteriormente ao período de 24h de incubação, as células foram
cultivadas em placas de 24 cavidades, em densidade de 3,0x105 células/ mL. A
monocamada celular foi inoculada com 100 µL do pool amostral tratado com
2% de antibióticos e antifúngico em diluição não citotóxica (1:60) e incubada
por 1h à 37ºC sob atmosfera de 5% de CO2 para que ocorresse a adsorção
viral. Os inóculos foram aspirados e a monocamada celular lavada por três
vezes com tampão salina fosfato 1x (PBS 1x). Após, 1mL de meio RPMI 1x foi
adicionado em cada cavidade, que foi reincubada nas mesmas condições por
24h. Como controle de qualidade do teste foi utilizada uma quantidade
conhecida de PCV-2 infecciosos como controle positivo e PCV-2 inativados por
1h a 99ºC e 30 min sob radiação ultra-violeta como controle negativo, de
acordo com Fongaro et al. (2013).
Após este período, o sobrenadante celular foi removido e a
monocamada celular foi lavada novamente com PBS 1x, por duas vezes. A
extração do material genético foi realizada como descrito previamente no item
3.3.2. A seguir, o material genético extraído foi tratado com 1U de DNase I
(Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante para eliminar
possível contaminação com DNA presente na amostra, oriundo de vírus não
infecciosos. Os RNAs presentes foram submetidos à transcrição reversa (RT)
com hexanucleotídeos (iniciadores randômicos), para obtenção do cDNA.
Imediatamente após o processo descrito, a reação de qPCR foi realizada como
descrito por Opriessnig et al. (2003) para quantificação do número de CG totais
provenientes de mRNA viral, indicando e quantificando os vírus infecciosos que
estavam em processo de replicação.
34
3.6 Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism
5.0 Statistical. Para avaliar a diferença entre os grupos utilizaram-se os testes
One-Way de variância (ANOVA), com 95% de confiança, seguido do teste
Bonferroni's Multiple Comparison para avaliar potencialmente as diferenças
entre os grupos. Quando necessário, testes de correlação foram realizados
através do Pearson Correlation. Os valores considerados significativos foram
os que apresentaram p≤0,05.
35
4. RESULTADOS
4.1 Parâmetros Físico-Químicos
A Tabela 1 apresenta os resultados dos parâmetros físico-químicos para
as amostras de afluente e efluente avaliadas. As diferenças entre os valores do
outono-inverno e da primavera-verão foram estatisticamente significativas
segundo o teste qual o teste aplicado aqui? (p≤0,05).
Tabela 1. Avaliação de parâmetros físico-químicos das amostragens (n = 8 por período).
Parâmetros Afluente Efluente
Primavera-Verão Outono-Inverno Primavera-Verão Outono-Inverno
Temperatura amostral (ºC)
24,0±2,8 16,0±3,3 25,0±1,8 17,0±2,1
pH 6,7±0,1 6,8±0,4 6,5±0,2 6,6±0,2
ST (g/L) 68±2,1 43±3,1 35±3,2 45±3,2
NAT (mg/L) 1454,8±72,07 624,0±97,2 1738,7±195,2 896,2±87,7
Legenda: ST – sólidos totais; NAT – nitrogênio amoniacal total.
4.2 Ensaio de Recuperação Viral
A recuperação média de vírus entéricos mensurada por qPCR, adotando
HAdV-2 como modelo, pelo método de concentração viral utilizando eluição e
clarificação a partir de afluente e efluente de suínos foi de 32,0%.
4.3 Análise de Vírus Entéricos em Afluente e Efluente
Um total de dezesseis amostras foram avaliadas quanto a presença e
quantificação de PAdV, PCV2 e RV-A, sendo oito amostras por período (quatro
amostras de afluente e quatro de efluente).
Os resultados mostraram que PCV-2 esteve presente em 100% (16/16)
das amostras avaliadas e que destas amostras 94% (15/16) continham
genomas de PAdV e RV-A. Segregando estes dados por período, durante o
outono-inverno a positividade apresentada nas amostras foi de 100% (8/8) para
PCV-2 e PAdV e 87,5% (7/8) para RV-A; durante a primavera verão, PCV-2 e
RV-A foram detectados em 100% (8/8) das amostras e PAdV foi detectado em
87,5% (7/8) dessas.
Os resultados de quantificação em CG virais demonstraram que durante
o outono-inverno as amostras de afluente apresentaram as seguintes médias,
36
expressas na Figura 7(a), em CG/mL (Log10) por unidade de biodigestor
anaeróbio avaliado:
PCV-2 7,68; 7,61; 6,45 e 7,00;
PAdV 4,85; 4,72; 4,43 e 5,02;
RV-A não houve detecção; 4,82; 4,30 e 3,37.
Para amostras de efluente referentes ao mesmo período, as médias
apresentadas por unidade de biodigestor, expressas na Figura 7(b), foram em
CG/mL (Log10):
PCV-2 5,91; 6,62; 6,14 e 6,16;
PAdV 4,19; 4,67; 4,71 e 4,67;
RV-A 3,06; 3,17; 3,64 e 2,95.
Lembra da versão anterior? Estava escrito “biodigestor 1, biodigestor 2..” para
cada um dos vírus e para cada uma das estações, fazendo com que a palavra
fosse repetida muitas vezes. Então, como não dava de fazer tabela porque há
o gráfico a seguir, deixei apenas os valores de cada biodigestor.
Figura 7. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa
em Log10, obtida durante o período outono-inverno em afluente (a) e efluente
(b).
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0
2
4
6
8
10PCV-2 PAdV RV-A
a)Afluente
CG
/mL
(L
og
10)
Biodigestor
37
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0
2
4
6
8
10PCV-2 PAdV RV-A
b)Efluente
Biodigestor
CG
/mL
(L
og
10)
Durante o período primavera-verão as médias em amostras de afluente,
expressas na Figura 8(a), foram em CG/mL (Log10):
PCV-2 5,1; 7,6; 7,9 e 6,3;
PAdV 6,9; 8,8; 8,7 e 8,0;
RV-A 9,0; 8,2; 6,8 e 8,1.
No entanto, as médias para amostras de efluente, expressas na Figura
8(b), foram em CG/mL (Log10):
PCV-2 7,1; 5,3; 7,1 e 6,0;
PAdV 6,8; não houve detecção; 6,0 e 9,0;
RV-A biodigestor 1 – 7,9; biodigestor 2 – 7,9; biodigestor 3 – 7,7 e
biodigestor 4 – 5,4.
38
Figura 8. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa
Log10, obtida durante o período primavera-verão em amostras de afluente (a) e
efluente (b).
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0
2
4
6
8
10 PCV-2 PAdV RV-A
a) Afluente
CG
/mL
(L
og
10)
Biodigestor
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0
2
4
6
8
10 PCV-2 PAdV RV-A
b) Efluente
CG
/mL
(L
og
10)
Biodigestor
Considerando os valores de vírus entéricos em amostras de afluente e
efluente de biodigestores anaeróbios, foram calculadas as médias globais por
período e a redução da carga viral após BA, referentes aos períodos outono-
inverno e primavera-verão. Durante o outono-inverno as reduções de PCV-2,
PAdV e RV-A foram, em Log10, 1,11, 0,20 e 1,17, respectivamente. Em relação
39
ao período primavera-verão, as reduções de PCV-2, PAdV e RV-A foram 0,70,
1,20 e 0,80, respectivamente (Tabela 2).
Tabela 2. Médias globais de cópias genômicas por mL (CG/mL), desvio padrão e redução de
carga viral pós-BA.
Amostra CG Média Geral/mL ± Desvio Padrão (Log10)
Outono-Inverno PCV-2 PAdV RV-A Afluente 7,40 ± 0,50 4,81 ± 0,21 4,47 ± 0,60 Efluente 6,29 ± 0,25 4,60 ± 0,21 3,30 ± 0,26
Primavera-Verão Afluente 7,50 ± 1,10 8,50 ± 0,76 8,50 ± 0,77 Efluente 6,80 ± 0,75 7,30 ± 1,25 7,70 ± 1,04
Redução (Log10) Outono-Inverno 1,11 0,20 1,17 Primavera-Verão 0,70 1,20 0,80
As reduções virais encontradas não foram estatisticamente significativas
(ANOVA, p≤0,05).
4.4 População Viral Circulante em Dejetos Suínos
A população viral representada por PCV-2, PAdV e RV-A nos dejetos
excretados pelos suínos (afluente da BA) foi quantificada em 16,68 Log10
(CG/mL) durante o outono-inverno e 24,50 Log10 (CG/mL) durante a primavera-
verão). Desse valor global, no período outono-inverno, os vírus representaram
em relação à população total:
PCV-2: 44,36% (7,40 Log10)
PAdV: 28,84% (4,81 Log10)
RV-A: 26,80% (4,47 Log10).
Para o período primavera-verão, os patógenos virais representaram em relação
à população total circulante:
PCV-2: 30,60% (7,50 Log10)
PAdV: 34,70% (8,50 Log10)
RV-A: 34,70% (8,50 Log10).
Os resultados estão demonstrados graficamente na Figura 9.
40
0 10 20 30 40 50
PCV-2
PAdV
RV-A Outono-Inverno
Primavera-Verão
Distribuição Sazonal (%)
Figura 9. Distribuição da população viral avaliada durante primavera-verão e
outono-inverno.
O estudo de correlação (Pearson) mostrou que a população de RV-A e
PAdV esteve correlacionada positivamente ao longo das estações do ano
(r2=0,89).
4.5 Estudo de Infecciosidade de PCV-2
Amostras positivas em qPCR para PCV-2 foram submetidas ao teste de
infecciosidade viral usando cultura celular, já que dos vírus aqui avaliados este
é o único cultivável in vitro a partir de amostras ambientais.
Em amostras de afluente, PCV-2 infecciosos foram detectados nos
seguintes valores: a) 5,73 Log10 (GC/mL) durante período de outono-inverno; b)
6,37 Log10 (GC/mL) durante período de primavera-verão. Em amostras de
efluente (pós BA), PCV-2 infecciosos foram detectados nos valores de: a) 5,00
Log10 (GC/mL) durante período de outono-inverno; b) 3,86 Log10 (GC/mL)
durante período de primavera-verão. A Figura 10 apresenta estes resultados,
organizados por período, comparando os valores de vírus totais (quantificados
por qPCR) e vírus infecciosos (quantificados por ICC-et-RT-qPCR).
41
Figura 10. Cópias genômicas (CG) totais (por qPCR) e detectadas a partir de
PCV-2 infecciosos (por ICC-et-RT-qPCR) presentes durante o outono-inverno
(a) e a primavera-verão (b).
Aflu
ente
Eflu
ente
0
2
4
6
8
10PCV-2 Totais
PCV-2 Infecciosos
a) Outono-Inverno
CG
/mL
(L
og
10)
Aflu
ente
Eflu
ente
0
2
4
6
8
10PCV-2 Totais
PCV-2 Infecciosos
b) Primavera-Verão
CG
/mL
(L
og
10)
A redução de PCV-2 infecciosos após BA foi calculada. Assim, a BA
durante outono-inverno reduziu estes patógenos em 0,97 Log10, o equivalente a
87,30%; durante a primavera-verão, BA reduziu PCV-2 em 2,5 Log10, o
equivalente a aproximadamente 99,5%, sendo esta última considerada
estatisticamente significativa (ANOVA, p≤0,05).
42
5. DISCUSSÃO
A expansão de atividades que geram alto teor de resíduos, como
sistemas de produção animal, intensificaram as indagações acerca de práticas
que envolvem o saneamento rural a nível nacional e mundial. Nas três últimas
décadas, o comércio mundial de suínos cresceu consideravelmente. O
desenvolvimento desta indústria correlaciona-se diretamente com impactos na
qualidade ambiental, principalmente devido à quantidade de matéria orgânica
retida nos dejetos, além da presença de nutrientes e do risco aumentado de
disseminação de patógenos, inclusive os relacionados às zoonoses, como aqui
reportado (BILOTTA & KUNZ, 2013; MONINI et al., 2015).
O uso de biodigestores anaeróbios se tornou uma alternativa para o
tratamento de dejetos suinícolas no Brasil, visando a produção de biogás e a
reutilização dos efluentes biodigeridos - ou biodigestato (dejetos após a BA) -
como biofertilizante agropecuário, podendo recuperar áreas rurais danificadas
e diminuindo a dependência por adubação química do solo, o que
proporcionaria o menor desgaste do mesmo, sendo viável economicamente.
Porém, se descartados sem tratamento adequado, os dejetos suinícolas podem
colocar em risco a saúde humana, animal e ambiental (BILOTTA & KUNZ,
2013; FONGARO et al., 2014).
No presente estudo, dejetos suinícolas foram processados em
biodigestores anaeróbios psicrofílicos. Afluente e efluente foram avaliados
durante primavera-verão e outono-inverno quanto a parâmetros físico-químicos
e microbiológicos, utilizando PAdV, PCV-2 e RV-A como modelos de
patógenos entéricos.
O monitoramento das propriedades físico-químicas mostrou diferenças
significativas (p≥0,05) nas amostras antes e após o tratamento dos dejetos. As
concentrações em efluentes foram superiores às de dejeto bruto, resultado
ancorado por Wiesmann et al. (2007), o qual verificou a degradação de
nitrogênio orgânico e amonificação de estruturas complexas como proteínas
presentes nas partículas virais. O equilíbrio de NH4+ e NH3 influenciou
diretamente as oscilações de concentração NAT durante outono-inverno e
43
primavera-verão, sendo estas oscilações diretamente proporcionais à
temperatura e pH (TCHOBANOGLOUS et al., 2003).
Em relação às propriedades microbiológicas, os vírus entéricos foram
utilizados como biomarcadores de eficiência de tratamento de dejetos
suinícolas devido à sua resistência e prevalência em matrizes ambientais.
Biomarcadores, segundo Peakall (1994), são agentes que apresentam
resposta biológica mediante a um tratamento, podendo-se representar uma
gama de outros marcadores.
Os RV-A destacam-se como patógenos zoonóticos comumente
envolvidos no quadro diarreico agudo grave em crianças e suínos jovens, tanto
em países emergentes quanto em desenvolvidos, sendo considerado o
principal vírus causador de mortes por diarreias (CABALLERO et al., 2004;
COSTA et al., 2004; TONIETTI et al., 2013; MONINI et al., 2015).
Os PCV-2 são considerados de interesse econômico na suinocultura,
devido às síndromes por ele causadas, destacando-se o Tremor Congênito
Suíno (TCS), que afeta animais recém-nascidos, e a Síndrome Definhante
Multissistêmica de Suínos Desmamados (SDMSD). PCV-2 têm sido
investigados em seu aspecto zoonótico por duas razões principais: amplitude
genotípica e detecção de anticorpos contra circovírus em humanos. A
circovirose suína potencializa perdas econômicas à suinocultura mundial e
nacional; além das perdas diretas causadas pela morte dos animais, a doença
determina prejuízos em função da conversão alimentar diminuída, sensibilidade
dos animais para infecções secundárias e associação do vírus com demais
patógenos. PCV-2 é um modelo de biomarcador especialmente interessante
por ser cultivável in vitro e isolado a partir de amostras ambientais. Porém, tem
algumas desvantagens, devido ao fato de não produzir efeito citopático visível
(FRANÇA et al., 2005; FONGARO et al., 2014).
Já os adenovírus são capazes de infectar a maioria dos vertebrados.
Causam, dentre outras enfermidades, gastroenterites e infecções respiratórias,
embora normalmente não produzam patologias clínicas severas. A constante
presença de PAdV em amostras fecais suinícolas, sua distribuição uniforme
sazonalmente e ao redor do globo e estabilidade diante da ampla gama de
44
condições adversas para outros patógenos fazem destes vírus indicadores
adequados de contaminação ambiental (DE MOTES et al., 2004; FONG &
LIPP, 2005).
A recuperação viral das amostras semeadas com HAdV-2,
concentradas, submetidas à extração de ácidos nucleicos e à reação de qPCR
foi de 32%, sugerindo que todos os resultados obtidos no presente trabalho
referem-se à 32% dos genomas virais presentes nas amostras ambientais e
que a técnica teve sucesso em concentrar os vírus originalmente presentes nas
mesmas. Este procedimento visou o controle dos mecanismos de
concentração, extração do material genético e detecção por PCR quantitativo
aqui conduzidos, sendo sua determinação possível através da mensuração da
quantidade de vírus adicionado previamente ao procedimento e a quantidade
final recuperada.
No presente trabalho, PAdV foi detectado em 94% das amostras (15/16),
corroborando resultado de De Motes et al. (2004) na Catalunha (Espanha), que
analisou amostras provenientes de vários sistemas de criação e produção de
suínos. Quanto a prevalência de RV-A, 94% das amostras (15/16) continham
genomas desse vírus, indicando sua excreção nos dejetos de suínos e sua
possível persistência no efluente biodigerido. Marthaler et al. (2014) avaliaram
a presença de RV-A, RV-B e RV-C em amostras coletadas no México, EUA e
Canadá, destacando a prevalência de rotavírus totais em 6.251 das 7.508
(83%) das amostras avaliadas. Quando PCV-2 foi avaliado, 100% das
amostras (16/16) apresentaram genoma deste vírus. Fongaro et al. (2014),
Viancelli et al. (2012) e Garcia et al. (2012) também detectaram o genoma
deste patógeno entérico em amostras de efluentes suínos tratados em
biodigestor anaeróbio psicrofílico na região Sul do Brasil.
Este estudo foi o primeiro conduzido em granjas de criação de suínos no
Sudeste brasileiro. Os resultados apontaram, mesmo com pequeno número
amostral, que há excreção intermitente de PAdV, PCV-2 e RV-A, salientando a
necessidade de integração das pesquisas existentes e a condução de novos
trabalhos semelhantes a este nas distintas regiões do país, para que seja
traçado o perfil de prevalência destes patógenos de acordo com as condições
45
regionais de criação e sazonalidade. Como a atividade é exercida em todas as
regiões brasileiras, a investigação dos referidos patógenos deve ser estendida
às mesmas, visto que implicam em seguridade humana e animal (BOSCH,
1998; GARCIA et al., 2012; FONGARO et al., 2013; TONIETTI et al., 2013;
AHMED, 2015; VIANCELLI et al, 2015).
De fato, dejetos suinícolas são relatados por apresentarem níveis
consideráveis de microrganismos, como PAdV, PCV-2 e RV-A. Vírus cujo
material genético é o DNA, como PCV-2 e PAdV podem apresentar maior
resistência no ambiente se comparados aos vírus de genoma RNA, como o
RV-A; no caso do RV-A, cabe relembrar que por ser zoonótico afeta, além de
suínos e humanos, bovinos jovens (DE MOTES et al., 2004; HUNDESA et al.,
2006; ESTES & KAPIKIAN, 2007; HUNDESA et al., 2009; VIANCELLI et al.,
2013).
No presente trabalho, durante o outono-inverno, PCV-2 e RV-A atingiram
1 log de redução, enquanto para PAdV o valor de redução foi inferior a 1 log.
Em contraste, durante a primavera-verão apenas PAdV atingiu 1 log de
redução, e PCV-2 e RV-A apresentaram valor abaixo de 1. Apesar de haver
redução da concentração viral, esta não atingiu o esperado para tratamentos
considerados eficientes (99,9%), segundo o recomendado pela
Regulamentação da União Europeia, EC Nº1774/2002.
Amostras de afluente monitoradas durante o outono-inverno mostraram
que PCV-2 foi da população viral total a mais frequente, seguida por PAdV e
RV-A. Esta prevalência foi observada por Fongaro et al. (2014) e Viancelli et al.
(2013) em avaliação para os mesmos vírus no Sul do Brasil, o que demonstra a
prevalência deste patógeno em criações de suínos no efetivo nacional. Em
contrapartida, durante a primavera-verão, da população total viral avaliada
PCV-2 foi a menos frequente, sendo as populações de PAdV e RV-A as mais
representativas. Os resultados sugerem que PCV-2 foi mais sensível ao
aumento da temperatura que PAdV e RV-A, considerando seus genomas
mensurados por qPCR ou RT-qPCR.
Embora a qPCR e RT-qPCR forneçam o número de genomas virais
presente em amostras, por si só não diferenciam partículas virais infecciosas
46
das não infecciosas, já que são amplificados todos os segmentos de DNA/RNA
provenientes de vírus íntegros e não íntegros, o que pode implicar em
avaliações inverídicas de infecciosidade. Assim, se o objetivo for avaliar a
infecciosidade viral, ensaios que integrem cultura celular e técnicas
moleculares são recomendáveis, sendo que o método de ICC-et-RT-qPCR e
suas variações contemplam tal objetivo (KO et al., 2003; HAMZA et al., 2011;
FONGARO et al., 2013; FONGARO et al., 2014).
Nesse sentido, foi investigada a infecciosidade de PCV-2 provenientes
de afluentes e efluentes suinícolas através de ICC-et-RT-qPCR. O modelo
PCV-2 foi adotado por ser dos vírus avaliados o mais frequentemente
detectado e por ser cultivável in vitro. Os resultados indicaram que a BA
durante o outono-inverno reduziu PCV-2 em menos de 90% (0,97 Log10), e no
período primavera-verão a redução foi estatisticamente significativa (>99%,
2,50 Log10).
Explica-se que no período de primavera-verão, são atingidas
temperaturas ambientais favoráveis à BA (superiores a 24ºC), melhorando
assim sua eficiência. Isto impactou a inativação viral, favorecendo a
higienização do dejeto durante a produção de biogás e biofertilizante. A
temperatura está intimamente relacionada à inativação de patógenos,
especialmente os entéricos virais, que em geral apresentam sensibilidade
semelhante para mudanças térmicas. Em temperaturas mais baixas, a
concentração viral costuma ser detectada em níveis elevados. A inativação
viral não se deve somente ao efeito térmico, mas também ao efeito exercido
pela matriz, sendo que estes costumam apresentar-se correlacionados (WEN
et al., 2004; BERTRAND et al., 2012).
Em adição, a temperatura ambiental é variável de acordo com a estação
vigente e a região de origem das amostragens. O aumento térmico pode
desnaturar proteínas estruturais e modificar a atividade de algumas enzimas,
além de degradar os ácidos nucleicos dos vírus; entretanto, quando
submetidos a tratamentos com temperaturas inferiores, vírus com genoma de
DNA, como é o caso de PCV-2, costumam apresentar menor degradação de
47
seu material genético, e por consequência sua infecciosidade viral é mantida
(TULADHAR et al., 2012; CARRATALÀ, et al., 2013).
O decréscimo observado na infecciosidade de PCV-2 também pode ser
decorrente de sua capacidade de agrupamento com outras partículas virais e
de suas propriedades, tais como ponto isoelétrico e carga iônica, ou das
características da própria matriz - a qual contém sólidos em que os vírus
podem se agregar - como pH e teor de matéria orgânica. A agregação viral
aumenta o tamanho das estruturas e inibe a adsorção celular, o que pode gerar
falsos resultados positivos de redução. Entender o comportamento das
partículas virais em relação à agregação ou adsorção é necessário para
elucidar alguns dos processos envolvidos na disseminação e infecciosidade
viral. Assim, as análises das propriedades de superfície dos vírus têm sido
cada vez mais difundidas (DIKA et al., 2011).
De maneira geral, suínos são considerados reservatórios biológicos de
patógenos zoonóticos, que podem ser excretados intermitentemente nos seus
dejetos. Conforme define a OMS (2002), zoonoses são enfermidades
infecciosas transmissíveis de forma natural de animais para o homem ou vice-
versa. Em locais de produção intensiva, onde os animais estão concentrados, a
transmissão pode ser favorecida.
Cardoso (2009) divide as zoonoses que envolvem suínos em seu ciclo
de transmissão em dois grupos: a) zoonoses transmitidas por alimentos e b)
zoonoses transmitidas especialmente por contato direto. Ambas têm impacto
deletério perante o consumidor, podendo resultar em prejuízo substancial para
a cadeia produtiva como um todo. Portanto, os animais de produção intensiva
devem ser o centro de medidas de controle que visam bloquear infecções
zoonóticas em humanos (VASCONCELLOS, 2001).
Assim, é importante entender e aplicar os conceitos de biosseguridade
animal e biossegurança humana, que envolvem um conjunto de medidas
integradas capazes de controlar e reduzir a ocorrência de doenças –
zoonóticas ou não- em uma população. A biosseguridade, particularmente,
inclui isolamento, profilaxia e cuidados sanitários dos rebanhos de modo a
evitar o contágio e difusão por patógenos, sejam eles vírus, bactérias, fungos
48
ou parasitas, que impactam na cadeia produtiva e na saúde humana
(VASCONCELLOS, 2001; PORKWORLD, 2013).
A alta prevalência de PCV-2, PAdV e RV-A em amostras de efluente
suíno mostra que os sistemas de BA, nas condições estudadas, não obtiveram
sucesso em eliminar os patógenos entéricos virais durante todo o ano, mesmo
com as mudanças de temperaturas.
Considerando os resultados aqui obtidos, o efluente biodigerido em
biodigestores anaeróbios psicrofílicos devem ser higienizados (pós-tratados).
Alternativamente essa higienização poderá ser realizada por meio de
estocagem em esterqueiras, lagoas sequenciais, emprego de calagem, uso de
biocidas como amônia não-ionizada e outros (EMMOTH et al., 2011;
BERTRAND et al., 2012; FONGARO et al., 2014; MAGRI et al., 2015).
Cabe ressaltar que a necessidade de tratamentos adicionais à BA
psicrofílica não exclui sua importância, visto que o processo diminui a
disposição indevida de dejetos gerados não só pela suinocultura como também
por outras práticas, como bovinocultura e avicultura, bem como é apto para
produção de energia limpa e renovável (biogás), permitindo o reciclo de
nutrientes na agricultura para produção alimentícia (biofertilizante), o que faz da
biodigestão prática economicamente viável e sustentável (MEDEIROS,
WANDERLEY & WANDERLEY, 2003; BILOTTA & KUNZ, 2013).
É recomendável, portanto, estudos epidemiológicos e levantamento das
condições de criação de suínos não somente na região Sudeste, mas em todo
o território nacional, bem como o melhoramento do processo de BA e pós-
tratamento do efluente final nas granjas de todo o país, sendo o PCV-2 um
biomarcador para inferir a redução de patógenos antes do reciclo agrícola. Em
adição, órgãos competentes devem considerar os estudos regionais e
nacionais e compilar a programas de gestão de dejetos animais, visando
práticas aplicáveis e reciclo agropecuário, de modo que a produtibilidade seja
potencializada, sustentável e segura.
49
6. CONCLUSÕES
A higienização de dejetos suinícolas por meio de BA em condição
psicrofílica, no Sudeste do Brasil, apresentou maior potencial durante o período
de primavera-verão. Porém, por si só, o tempo de 60 dias de RH não foi
considerado suficiente para reduzir no mínimo 99,9% dos patógenos presentes,
adotando PAdV, PCV-2 e RV-A como biomarcadores. Recomenda-se que para
fins de reciclo agrícola haja o pós-tratamento do efluente produzido nessas
condições visando qualidade ambiental, o que implica em melhoria na saúde
humana e animal.
50
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