UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS, NEUROQUÍMICAS, HISTOPATOLÓGICAS E
BIOQUÍMICAS EM RATOS TRATADOS COM COCAÍNA E ETANOL ISOLADAMENTE OU EM ASSOCIAÇÃO
IRI SANDRO PAMPOLHA LIMA
Fortaleza-CE 2003
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS, NEUROQUÍMICAS, HISTOPATOLÓGICAS E
BIOQUÍMICAS EM RATOS TRATADOS COM COCAÍNA E ETANOL ISOLADAMENTE OU EM ASSOCIAÇÃO
IRI SANDRO PAMPOLHA LIMA
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles
Fortaleza-CE 2003
Esta dissertação encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca da Faculdade de Medicina da referida Universidade. A citação de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que seja de conformidade com as normas da ética científica. _________________________________ Iri Sandro Pampolha Lima
Dissertação aprovada em Banca Examinadora _____________________________________ Prof. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo
_____________________________________ Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
____________________________________ Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles (Orientadora)
A Deus por trilhar de maneira tão especial a minha vida colocando nela somente pessoas especiais
Aos meus amados pais, Irimatines e Fátima, incentivadores e amigos de todas as horas.
Aos meus irmãos, Alan e Wallace pela presença e apoio constantes.
À minha noiva Érica, pelo apoio e incentivo em todos os momentos
Agradecimentos
À Profa. Marta Maria de França Fonteles, minha orientadora, pela paciência e sabedoria na transmissão de seus conhecimentos, essenciais para minha formação acadêmica. À Profa. Glauce Socorro Barros Viana, pela recepção em seu laboratório e pelas importantes discussões que em muito contribuíram para a realização desta dissertação. Á Danielle Silveira Macedo, pelo constante apoio e incentivo, que em muito contribuíram nas horas difíceis. Ao Amigo Hélio, pelos conselhos e ajuda em todos os momentos. Aos amigos da pós-graduação: Silvânia, Lissiana, Rivelilson, Cícero e Vera, pela paciência e incentivos constantes. Aos Profs. do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos e constante disponibilidade. À Vilani Bastos, pela colaboração em todos os momentos. A todos os bolsistas pelo companheirismo e dedicação na execução dos experimentos. À todos que fazem parte do Laboratório de Neurofarmacologia, pela união, amizade e lealdade, que tornam o ambiente de trabalho produtivo, agradável e de fácil convivência. Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de Ciências da Saúde pelo apoio e cooperação.
Aos amigos do HUWC, pela ajuda e apoio durante o curso de mestrado. Ao Prof. Dário, pela inestimável ajuda na realização das análises histológicas. Ao Ivan, sempre companheiro e amigo, pela essencial colaboração no preparo das lâminas para análise histológica. À Polícia Federal, em especial à Dra. Graça, pelo apoio incondicional e pela realização das análises necessárias. À Dra. Gorete, do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, por sua colaboração nas análises bioquímicas. À minha noiva, Érica, pelo companheirismo, apoio e incentivo nos momentos mais difíceis. Ao conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro.
SUMÁRIO
Lista de Tabelas xi
Lista de Figuras xii
Lista de Abreviaturas xiv
Resumo xv
Abstract xvi 1. INTRODUÇÃO 1
1.1 Drogas de Abuso 1
1.2 Cocaína 2
1.2.1 Histórico 2
1.2.2 Formas de Cocaína 7
1.2.3 Vias de Exposição 9
1.2.4 Biotransformação da Cocaína 11
1.3 Cocaína e Neurotransmissão 12
1.3.1 Dopamina 12
1.3.2 Distribuição dos Neurônios Dopaminérgicos 13
1.3.3 Papel da Dopamina no Comportamento 14
1.3.4 O Transportador de Dopamina 15
1.3.5 Efeito da Cocaína no Sistema Dopaminérgico 17
1.3.6 Sistema Colinérgico 19
1.3.7 Circuitos Encefálicos e Drogas de Abuso 21
1.4 Etanol 26
1.4.1 Considerações Gerais 26
1.4.2 Farmacocinética 28
1.4.3 Etanol e Neurotransmissores 30
1.5 Cocaína e Etanol 32
2. OBJETIVOS 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS 38
3.1 Animais 38
3.2 Material Utilizado nos Experimentos 39
3.3 Preparo das Drogas 41
3.3.1 Cocaína 41
3.3.2 Determinação do Grau de Pureza da Cocaína 41
3.3.3 Etanol 42
3.4 Tratamento dos Grupos Experimentais 43
3.5 Estudos Comportamentais 44
3.5.1 Teste da Atividade Locomotora 44
3.6 Dissecação das Áreas Cerebrais 44
3.7 Determinação da Densidade dos Receptores Muscarínicos 45
3.8 Determinação da Densidade dos Receptores Dopaminérgicos 47
3.9 Dosagem de Proteína 50
3.9.1 Método 50
3.9.2 Soluções Reagentes 51
3.10 Determinação de Monoaminas e Metabólitos com HPLC 52
3.11 Análise Bioquímica 55
3.11.1 Métodos Bioquímicos 55
4.0 Estudo Histopatológico 64
4.1 Procedimento Experimental 64
5.0 Análise Estatística 65
6. RESULTADOS 66
6.1 Teste de Atividade Locomotora Espontânea 66
6.2 Efeitos da Administração Repetida de Cocaína, Etanol e a
Combinação Destes Sobre as Concentrações de DA, DOPAC,
HVA, 5-HT E 5-HIAA em CE de Ratos. 70
6.3 Efeitos da Administração Repetida de Cocaína, Etanol e a
Associação Destes Sobre os Receptores D2-símile em CE de Ratos 74
6.4 Efeitos da administração repetida de cocaína, etanol e a
associação destes sobre os receptores M1+M2 símile
em corpo estriado e córtex motor 79
6.5 Efeitos da Administração Repetida de Cocaína, Etanol e a
Associação Destes Sobre os Níveis de Enzimas Séricas 81
6.5 Análise Histopatológica de Animais Tratados com Cocaína,
Etanol e a Associação Destes 85
7. DISCUSSÃO 89
8. CONCLUSÕES 104
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Efeitos da administração repetida de cocaína sobre a atividade locomotora de ratos 67 Tabela 2- Efeitos da administração repetida de etanol sobre a atividade locomotora de ratos 68 Tabela 3- Efeitos da administração repetida de cocaína + etanol sobre a atividade locomotora de ratos 69 Tabela 4- Efeitos da administração de cocaína e etanol na densidade (Bmax) e Kd dos receptores dopaminérgicos D2-símile em corpo estriado de ratos 75
Tabela 5- Efeitos da administração de cocaína e etanol na densidade dos receptores colinérgicos em estriado de ratos 80 Tabela 6- Efeitos da administração de cocaína, etanol e a associação destes nos níveis de TGO, TGP e Colesterol total 83 Tabela 7- Efeitos da administração de cocaína, etanol e a associação destes nos níveis de Triglicerídeos e HDL 84
LISTA DE FIGURAS Figura 1- Folhas da planta Erythroxylon coca 03
Figura 2- Representação da estrutura da cocaína 04
Figura 3- Vias dopaminérgicas 14
Figura 4- Ações da cocaína na neurotransmissão dopaminérgica 17
Figura 5- Representação do sistema dopaminérgico 19
Figura 6- Representação das vias colinérgicas centrais 21
Figura 7- Metabolismo do Etanol 29
Figura 8- Representação estrutural do cocaetileno 33
Figura 9- Cromatografia da cocaína em comparação com padrão
da Polícia Federal
42
Figura 10- Aparelho de HPLC com detecção de fluorescência e
eletroquímica
53
Figura 11- Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos tratados com cocaína
71
Figura 12- Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos tratados com etanol
72
Figura 13- Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos tratados com cocaína + etanol
73
Figura 14- Efeitos da cocaína nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de ratos
77
Figura 15- Efeitos do etanol nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de rat
78
Figura 16- Efeitos da associação cocaína + etanol nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de ratos
79
Figura 17-
a) Músculo cardíaco normal de ratos tratados com salina. b e c) Músculo cardíaco de ratos tratados com cocaína 10 e 20mg respectivamente. d e e) Músculo cardíaco de ratos tratados com etanol 2 e 4g/kg respectivamente. f e g) Músculo cardíaco de animais tratados com interação baixas doses e altas doses respectivamente.
87
Figura 18- a) Fígado normal de ratos tratados com salina. b e c) Fígado de ratos tratados com cocaína 10 e 20mg respectivamente. d e e) Fígado de ratos tratados com etanol 2 e 4g/kg respectivamente. f e g) Fígado de animais tratados com interação baixas doses e altas doses respectivamente.
88
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HIAA Ácido-5-hidroxiindolacético
5-HT Serotonina
ALE Atividade locomotora espontânea
ATV Área tegmentar ventral
Bmax Densidade máxima de receptores
CE Corpo estriado
COLE-T Colesterol total
DA Dopamina
DOPAC Ácido diidroxifenilacético
HDL High Density Lipoprotein
HVA Ácido homovanílico
Kd Constante de dissociação
NAc Núcleo acumbente
NE Noradrenalina
SNC Sistema nervoso central
TGI Triglicerídeos
ACh Acetilcolina
ANOVA Análise de variância BSA Albumina sérica bovina
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EPM Erro padrão da média
HPLC Cromatografia líquida de alta performance
i.p. Intraperitoneal
v.o. Via oral
RESUMO
Avaliação das alterações comportamentais, neuroquímicas, histopatológicas e bioquímicas em ratos tratados com cocaína e etanol isoladamente ou em associação. IRI SANDRO PAMPOLHA LIMA. Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles. Dissertação de Mestrado. Curso de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2003.
No presente trabalho foram estudadas as alterações comportamentais, neuroquímicas (determinações dos níveis de monoaminas e metabólitos), histopatológicas e bioquímicas (lipoproteínas e transaminases) em corpo estriado de ratos tratados com cocaína e etanol isoladamente ou em associação. Foram utilizadas ratas Wistar (180-200 g), que foram tratadas durante 7 dias com cocaína (Coc 10 e 20 mg/kg, i.p.), etanol (Et 2 e 4g/kg, v.o.) e a associação destes (Coc 10 mg + Et 2g - interação baixas doses; Coc 20 mg + Etanol 4g - interação altas doses). Os resultados demonstraram que a atividade locomotora espontânea (ALE) foi aumentada após administração de cocaína em ambas as doses e diminuída após a administração de etanol em ambas as doses. Não foram observadas alterações na ALE na associação cocaína + etanol. O tratamento com cocaína e etanol causou um aumento de dopamina, sem alterações nos demais neurotransmissores e metabólitos. A associação cocaína + etanol em altas doses, promoveu aumento dos níveis de dopamina, diminuição de DOPAC e aumento dos níveis de 5-HT, sugerindo que essas drogas poderiam atuar diretamente nesses sistemas ou, indiretamente, através de um processo de modulação. A cocaína, etanol e a associação destes, após administração sub-crônica e em ambas as doses, causou uma downregulation em receptores D2-símile, não ocorrendo alterações nos valores de Kd. Os valores de Bmax e Kd dos receptores M1 + M2-símile não sofreram alterações. No estudo bioquímico, a administração de cocaína induziu um aumento nas concentrações de TGO e triglicerídeos, e diminuição das concentrações de TGP, colesterol total e HDL. O tratamento com etanol diminuiu os níveis de HDL, colesterol total e triglicerídeos. A associação cocaína + etanol promoveu em ambas as doses diminuição de trigicerídeos, HDL, TGP e colesterol total. Todos os tratamentos promoveram alterações histopatológicas em tecido cardíaco e hepático. Nossos resultados sugerem que a associação cocaína + etanol parece interferir de maneira mais intensa nos sistemas de neurotransmissão e nos parâmetros bioquímicos do que o uso das drogas isoladas.
ABSTRACT
Behavioral, neurochemical, histopatological and biochemical alterations in rats treated with cocaine and ethanol singly or in association. IRI SANDRO PAMPOLHA LIMA. Supervisor: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles. Master’s Dissertation. Course of Post-graduation in Pharmacology. Departament of Physyology and Pharmacology, UFC, 2003. In the present work, behavioral, neurochemical (determination of monoamines and metabolites levels rat in striatum), histopatological and biochemical (lipoproteins and transaminases) alterations produced by cocaine, ethanol and the association of theses were analyzed. Females Wistar rats (180-200 g) were treated during 7 days with cocaine (Coc 10 and 20 mg/kg, i.p.), ethanol (Et 2 and 4g/kg, p.o.) and the association of theses (Coc 10 mg + Et 2g - low interaction doses; Coc 20 mg + Ethanol 4g - high interaction doses). The results demonstrated that the spontaneous locomotor activity (SLA) was increased after cocaine administration and decreased after ethanol in both doses. It was not observed alterations in the SLA in the association cocaine + ethanol. The treatment with cocaine and ethanol caused an increase in dopamine level. The association cocaine + ethanol in higher doses caused an increase of dopamine and serotonin and decrease of DOPAC levels, suggesting that those drugs would can actuate directly in those systems or, indirectly, across a process of modulation. Cocaine, ethanol and the association of theses, after subcronic administration and in both doses, caused a donwregulation of D2-like receptors, not by recurring alterations in the values of Kd. The values of Bmax and Kd of the M1 + M2-like receptors have not already suffered alterations. In the biochemical study, the administration of cocaine induced an increase the concentrations of TGO and triglycerides, and decrease of the concentrations of TGP, total cholesterol and HDL. The treatment with ethanol decreases the levels of HDL, total cholesterol and triglycerides. The association cocaine + ethanol caused in both doses decrease of triglycerides, HDL, TGP and total cholesterol. All treatments did promote histopatological alterations in cardiac and hepatic woven. Ours results suggest that the association cocaine + ethanol appears to interfere more intense in the systems of neurotransmitters and in the biochemical parameters than the use of the isolated drugs.
1 – INTRODUÇÃO
1.1 Drogas de Abuso
O aumento do uso de drogas de abuso tem levado a um crescimento do
comportamento criminal, trazendo ainda conseqüências diretas para a saúde. Estes
agentes estão relacionados diretamente com o crescimento do narcotráfico,
destruição de lares, aumento da criminalidade e diminuição da capacidade produtiva
do país (Leite et al., 1999). O principal componente lesivo destas drogas é o estado
de dependência que estas promovem nos usuários. Em estudos científicos, a
dependência física é definida como um estado adaptativo que se manifesta por
intensos distúrbios fisiológicos quando a administração da droga é suspensa,
enquanto que a dependência psíquica é caracterizada como uma condição na qual a
droga produz uma sensação de satisfação que leva a uma necessidade periódica ou
contínua de administração da droga para produzir prazer (Dupont et al., 1997). A
dependência e o abuso de drogas representam um sério problema de saúde pública.
Estima-se que mais de 2 milhões de pessoas são viciadas em cocaína só nos Estados
Unidos (Robins et al., 1999).
O termo droga teve origem na palavra droog (holandês antigo) que significa
folha seca. Atualmente a medicina define droga como sendo qualquer substância que
é capaz de modificar funções dos organismos vivos, resultando em mudanças
fisiológicas ou de comportamento (Leite et al., 1999).
Dependendo da ação que as drogas apresentam no SNC, podem ser
divididas em três grupos. Um grupo é formado por aquelas drogas que diminuem a
atividade cerebral, ou seja, deprimem o seu funcionamento, o que significa dizer que
a pessoa que faz uso desse tipo de droga fica "desligada", "devagar", desinteressada
pelas coisas. Em um segundo grupo estão aquelas que atuam aumentando a
atividade do cérebro, ou seja, estimulam o seu funcionamento fazendo com que, a
pessoa que se utiliza dessas drogas, fique "ligada", "elétrica", sem sono.
Há um terceiro grupo, constituído por aquelas drogas que agem modificando
mais qualitativamente que quantitativamente a atividade do cérebro. O cérebro passa
a funcionar de forma anormal e a sua atividade fica perturbada (Beedle et al., 1997).
As drogas de abuso são causadoras de muitos problemas comuns para várias
sociedades do mundo. Antigos textos religiosos mostram que, em todas as épocas e
lugares, os seres humanos deliberadamente usaram substâncias capazes de modificar
o funcionamento do sistema nervoso, induzindo sensações corporais e estados
psicológicos alterados. Essas drogas têm grande poder destrutivo não apenas para o
indivíduo, mas também para sua família e a sociedade. Dentre as drogas de abuso
hoje disponíveis, temos a cocaína e o etanol como os agentes mais utilizados, sendo
estas drogas alvos de inúmeros estudos. Progressos substanciais têm sido realizados
na elucidação das ações moleculares e celulares da cocaína e do etanol, entretanto,
os sítios e mecanismos que participam nos seus efeitos não estão bem elucidados
(Leite et al., 1999).
1.2 Cocaína
1.2.1 Histórico
A cocaína é uma substância naturalmente encontrada em dezenas de
espécies vegetais do gênero Erythroxylum (figura 1), sendo a Erythroxylum coca e a
Erythroxylum novogranatense as mais utilizadas no cultivo para a produção da
droga.
Figura 1 – Folhas da planta Erythroxylon coca
O hábito de mascar as folhas de coca pelos indígenas da região dos Andes
data de longo tempo. Com a chegada dos conquistadores espanhóis, esta forma de
uso foi estimulada, pois o consumo da droga facilitava a exploração do trabalho
escravo. Levada para a Europa pelos espanhóis, durante os séculos XVI e XVII,
difundiu-se o uso das folhas de coca na terapia sob as mais diversas aplicações: os
males do estômago, ulcerações de pele, doenças venéreas e dores de cabeça,
musculares e de dente (Gold, 1993, Escohotado, 1993).
A cocaína (figura 2), principal alcalóide ativo existente nas folhas da
Erythroxylum coca, foi isolada em 1860 por Niemann, que constatou seu gosto
amargo e o efeito peculiar que produzia na língua, tornando-a dormente e quase
insensível. Por volta de 1880, a cocaína estava disponível comercialmente, sendo,
logo, incorporada a diversas beberagens, entre essas, o famoso Vin Mariani, que era
conhecido como o “vinho dos atletas”. Rapidamente relatos enfatizavam os poderes
miraculosos da droga, bem como sua capacidade de eliminar a fadiga (Gold, 1993).
Figura 2 - Representação da estrutura da cocaína
Em 1884, Sigmund Freud fez o primeiro estudo pormenorizado dos efeitos
fisiológ
–
juntame
icos da cocaína e no livro Ueber Coca sugeriu cinco possíveis aplicações da
substância: aumentar a capacidade física, em doenças do aparelho digestivo, no
controle da morfinomania, como estimulante sexual e anestésico local. Na mesma
época, Carl Koller introduziu a cocaína na anestesia local da córnea, e Hall, na
odontologia. A anestesia espinhal verdadeira foi obtida por Augusto Bier, em 1898,
ao injetar a substância em animais, em um assistente e nele mesmo (Musto, 1992).
Nos Estados Unidos, por volta de 1885, a cocaína foi adicionada
nte com a cafeína – em um remédio popular considerado como o protótipo
da Coca-Cola, com indicações de uso contra dor de cabeça e como estimulante. Em
1892, Asa G. Chandler fundou a Coca-Cola Company e colocou a bebida no
mercado como um tônico para pessoas debilitadas. Até meados deste século (1903-
06), esta bebida continha aproximadamente 60mg de cocaína em 230 mL. A partir
da sua extração, a cocaína passou a ser empregada em vários produtos. Nesta época,
nos Estados Unidos, extratos de coca eram relatados como sendo a cura do
alcoolismo e morfinismo, sendo que esses preparados pavimentaram o caminho para
a cocaína em sua forma pura a partir de 1880. A cocaína foi distribuída na Europa,
pelo laboratório Merck, a especialistas para realizarem experimentos com a droga.
Nesta época, Sigmund Freud dedicou-se ao estudo da cocaína. A euforia
social relacionada à cocaína começou a se dissipar a partir da última década do
século passado. Relatos detalhando a dependência à cocaína, comportamento
psicótico induzido, convulsões e mortes causadas pelo consumo, gradativamente se
acumularam na literatura. Freud, em 1887, publicava Fissura e medo da cocaína,
descrevendo os sintomas paranóicos, as alucinações e deterioração física e mental
associada ao consumo repetido (Musto, 1992).
Nas décadas que se seguiram à introdução da cocaína nos Estados Unidos,
ela podi
idas à base de cocaína
ou de fo
a ser obtida em dois níveis diferentes: industrializado ou médico e por meio
do comércio da droga pura nas ruas. Até a última década do século XIX não existia,
naquele país, legislação sobre os atos médicos ou medicamentos em nível nacional.
Mesmo as profissões médicas estavam se organizando naquela época, de forma que
não existia controle sobre a propaganda da cocaína ou sobre os produtos que
continham a substância. Leis passaram a ser decretadas para coibir o acesso fácil à
substância acarretando um fortalecimento gradativo do mercado ilícito de cocaína,
fazendo com que a droga ilícita ficasse muito mais acessível.
A partir de 1900, surgiram vários medicamentos e beb
lhas de coca que permaneceram no mercado até 1914, quando foi editado o
Harrison Narcotic Act, que tornou ilegal o uso e a venda de cocaína nos Estados
Unidos da América. Em 1924, a Associação Americana de Medicina realizou um
estudo que atribuiu a morte de 26 pacientes à utilização da cocaína como anestésico,
o que restringiu o seu uso na clínica. O público, em resposta a estas informações,
passava a pressionar as autoridades para tomada de uma posição contra a droga. A
visão social da cocaína transformou-se em 30 anos (a partir de 1884); de um tônico
anunciado sem efeitos colaterais para a droga com restrições mais severas da história
atual; porém, no início do século XX, a droga continuava a ser permitida para
propósitos médicos. O período seguinte foi caracterizado pela extinção quase total
do consumo da droga. Os anos a partir de 1920 foram caracterizados pelo consumo
de derivados opiáceos e Cannabis, como ocorria no período imediatamente anterior
à cocaína. No início da década de 30, a cocaína deixava de ser um problema social
pela diminuição do uso. De 1914 a 1970, o consumo da droga, devido às suas
propriedades eufóricas, ficou restrito a alguns segmentos da sociedade. A partir dos
anos 70, com as restrições impostas à comercialização das anfetaminas, voltou o uso
generalizado de cocaína nos Estados Unidos da América, e no início da década de
80, com a introdução do crack, o consumo aumentou de forma alarmante (Gold,
1993).
É muito difícil explicar a ressurreição da cocaína nos Estados Unidos a
partir d
uma rep
o início da década de 70. Esse ressurgimento implicou, também, no quadro
de consumo de cocaína que pode ser observado desde a última década no Brasil. Um
grande número de fatores, porém, convergiram para a mudança no hábito de
consumo de drogas na população dos Estados Unidos; o primeiro deles refere-se a
uma população que nasceu e cresceu consumindo drogas. O consumo de maconha e
alucinógenos durante a década de 60 por um grande número de jovens norte-
americanos resultou na ausência do temor das restrições legais, bem como das
conseqüências médicas do assim chamado consumo light de drogas (Kendall, 1991).
Infelizmente, a cocaína, até o início da década de 80, ressurgiu envolta por
utação de ser incapaz de promover dependência, de ser segura em relação às
conseqüências médicas e sociais e de ação ultracurta: a droga perfeita para interação
social. Tornou-se, em princípio, a droga dos ricos e famosos; músicos cantavam suas
virtudes, filmes mostravam o uso da cocaína como glamouroso, isento de riscos
(Weiss, 1994). No Brasil, considerado o maior corredor de tráfico da droga do
mundo, a cocaína trazia uma série de problemas que atingia as mesmas proporções
nos países industrializados; o mascar das folhas de coca acarreta dependência
semelhante à causada pela nicotina, sendo associada ao empobrecimento das
funções mentais. Além do bem conhecido estado de anarquia e corrupção pública
nos quais os países produtores se encontram, o imenso crescimento da produção,
atividade das mais lucrativas, vem causando conseqüências sociais e ambientais
incalculáveis (Negrete, 1992). Nenhuma outra plantação conhecida causa níveis
similares de erosão, principalmente por seu cultivo junto às encostas andinas
(Kendall, 1991). Uma respeitável parcela da população dos países produtores
encontra-se envolvida em atividades relacionadas ao tráfico (Negrete, 1992).
No Brasil, a cocaína era livremente comercializada já no início do século,
integran
.2.2 Formas de cocaína
A cocaína é o único anestésico local que ocorre naturalmente, estando
presente
endo encontrada
ainda em
ento
te de remédios ou em sua forma pura. Esta situação permaneceu até 1921,
quando as leis começaram a restringir o seu consumo. Em 1962, no primeiro
levantamento brasileiro sobre internações motivadas por consumo de drogas,
observou-se que apenas quatro casos eram motivados pelo consumo da cocaína,
enquanto neste mesmo ano 8.462 internações foram motivadas por álcool. Com o
crescimento do consumo observado na última década, em 1992 houve 866
internações em hospitais psiquiátricos por intoxicação aguda ou dependência da
droga. Em populações especificas, como as crianças de rua de grandes cidades, a
cocaína é proporcionalmente muito mais consumida (relatos em 46,5% destas
crianças na cidade de São Paulo). Com o surgimento do crack no estado de São
Paulo durante esta década, porém, o consumo e as conseqüências têm crescido
vertiginosamente (Leite et al., 1999).
1
nas folhas da Erythroxylum coca na proporção de 0,5 a 1,0%. É um éster do
ácido benzóico e da ecgonina (derivado da tropina) (Musto, 1992).
A Erythroxylum coca é a mais antiga das cocas cultivadas, s
um estado semi-selvagem nos Andes peruanos e bolivianos. Sua
cultura data de vários milênios e é responsável pela maior parte do suprim
mundial de cocaína. O processo de extração da cocaína para consumo ilícito é
iniciado colocando-se as folhas e solventes orgânicos (querosene, gasolina) em
recipientes (tanques); após um período de maceração, o extrato orgânico é separado
das folhas e evaporado. O resíduo obtido, denominado pasta de coca, contém
cocaína juntamente com outros alcalóides e óleos essenciais. A droga pode ser
obtida, também, por meio da secagem das folhas, digestão com ácido sulfúrico e
posterior extração, após precipitação com bicarbonato de sódio. Este produto pode
conter sulfato de cocaína (40-85%), além da cocaína na forma de base.
A pasta de coca é então tratada com ácido clorídrico (HCl) para formação de
cloridra
O cloridrato de cocaína apresenta-se na forma de pó ou grânulos brancos,
insolúve
to de cocaína, que corresponde a forma usual de tráfico. É raro, contudo,
encontrá-la na forma pura, sendo normalmente “diluída” com a adição de produtos
que procuram mimetizar sua ação farmacológica, cor ou sabor. São utilizados para
esta finalidade outros anestésicos locais (lidocaína), cafeína, efedrina, feniciclina,
quinina, estricnina, manitol, sacarose, heroína, talco e outros.
is em éter e solúveis em água, etanol e clorofórmio, apresentando ponto de
fusão a 196°C. A partir do cloridrato é possível obter cocaína na forma de base, que
é volátil e quimicamente mais estável. Essa transformação pode ser obtida pela
adição de soluções alcalinas (bicarbonato) ao cloridrato, extração com éter dietílico
e posterior evaporação do solvente orgânico pelo aquecimento. O produto obtido
dessa maneira é a cocaína na forma de base livre, mas o aquecimento propicia a
ocorrência de explosões devido às características do éter (Musto, 1992).
1.2.3 Vias de exposição
cocaína pode ser utilizada por aplicação direta nas mucosas ou através das
vias ora
cia clínica, pelo fato
da dro
erla), sua
velocid
(Musto, 1992).
A
l, respiratória (aspirada ou fumada) ou intravenosa. As vias de exposição
mais utilizadas ocorrem por meio do sistema respiratório pela aspiração e absorção
intranasal do cloridrato de cocaína ou pela inalação e absorção pulmonar da fumaça
proveniente do ato de fumar a cocaína na forma básica. A cocaína pode ser
consumida por várias vias e em uma grande variedade de doses (Jones, 1987). O uso
intravaginal já foi reportado (Collins et al., 1994). A droga também pode ser
aplicada por via retal (Schrank 1993). A cocaína apresenta ação equipotente quando
fumada ou administrada endovenosamente em termos de pico plasmático (Fischman,
1988). Além disso, a cocaína fumada (incluindo o crack) não apresenta os riscos de
infecção nem carrega o estigma (Johanson e Fischman, 1989).
A cinética de absorção intranasal é de extrema importân
ga ser muito utilizada por esta via. Após utilização pela via intranasal, o pico
máximo de concentração plasmática é observado entre 30 a 120 minutos após o uso.
Essa variação ocorre pelo fato de a cocaína produzir diferentes graus de
vasoconstrição, ocorrência de biotransformação no próprio local de administração
(mucosa nasal), diferenças interindividuais de velocidade de hidrólise ou diferenças
na prática da técnica de aspiração que leva à deglutição parcial da droga.
Quando a cocaína é utilizada na forma fumada (pasta, crack ou m
ade de absorção pode ser comparada a da via endovenosa, levando alguns
minutos para a droga atingir a circulação sistêmica e o cérebro. A absorção nesta via
ocorre nos alvéolos pulmonares, sendo facilitada pela extensa superfície pulmonar e
pelo tamanho das partículas produzidas na volatilização do crack. O aparecimento
dos efeitos desejados depende da quantidade da droga liberada na corrente
sangüínea, a qual está diretamente relacionada com a eficiência do ato de fumar. O
pico máximo de concentração plasmática é obtido com 6 a 8 minutos após a tragada
A injeção de cocaína é utilizada mais comumente por viciados em relação aos
usuários ocasionais. Quando administrada na forma injetável, até um grama da
parada para inalação é colocada em uma superfície translúcida,
mo
é
rapida
e
droga é adicionado, em cada ocasião, em uma colher. Adiciona-se então água, sendo
a mistura resultante colocada em uma seringa e injetada. A euforia acontece
imediatamente. O uso intravenoso de cocaína produz o pico de high (aumento da
força, energia e sensação de autoconfiança) 10 a 15 minutos após a injeção, com
duração de cerca de 30 a 45 minutos. Efeitos intensos podem ocorrer com doses
muito menores do que aquelas administradas oralmente (Rowbotham e Lowenstein,
1990). A morte súbita pode ocorrer rapidamente como resultado de um colapso
cardiorespiratório.
A administração intranasal é uma via comum de utilização da droga. A
cocaína quando pre
co um espelho, onde ela é finamente cortada com uma lâmina de barbear e
organizada em filas. Uma fila de cocaína consiste em aproximadamente 20 a 30 mg
(Commissaris, 1989; Cox et al., 1983). Seguindo a inalação, há uma rápida
passagem da cocaína para corrente sanguínea através da mucosa nasal rica em
capilares, e os níveis sanguíneos aumentam rapidamente (em 30 segundos a 2
minutos), com pico de 15 minutos a 1 hora após a inalação. (Higgins et al., 1990;
Weiss et al., 1994). Efeitos no humor são evidentes em 15 a 30 minutos após a
administração intranasal, e os efeitos cardiovasculares, incluindo elevação da
pressão arterial, aparecem em 15 a 20 minutos. Estes efeitos geralmente
desaparecem em 45 a 60 minutos, embora os metabólitos da cocaína ainda estejam
presentes na circulação por 4 a 6 horas após a administração (Weiss et al., 1994).
A cocaína pode ser fumada tanto na forma de pasta de coca como de crack,
forma mais freqüentemente usada. O conteúdo de cocaína na fumaça inalada
mente absorvido e a concentração sanguínea aumenta rapidamente. Efeitos
subjetivos como euforia e bem-estar geral ocorrem logo no início do uso. Com o uso
prolongado, porém, ocorre uma menor sensação de euforia, acompanhada d
ansiedade, hostilidade e extrema depressão. No caso do crack, há uma intensa
euforia inicial acompanhada por severa depressão, agitação e desejo por cocaína, 10
minutos após o uso (Leite et al., 1999).
O cloridrato de cocaína pode ser aplicado topicamente (única via lícita de
administração) como anestésico. Por causa de sua insuficiente absorção cutânea, não
ocorre
SFORMAÇÃO DA COCAÍNA
rodutos de biotransformação no
organismo por meio de processos enzimáticos e químicos, sendo pouco excretada na
urina na
lise espontânea (pH dependente) do grupo éster
carboxí
ileno ou etilcocaína, encontrada no
sangue
m efeitos psicotrópicos nesta via de administração (Brown, 1989; Ritchie e
Greene, 1990).
1.2.4 BIOTRAN
A cocaína é convertida extensamente a p
sua forma inalterada. Os principais produtos de biotransformação são a
benzoilecgonina e, em menor proporção, a ecgonina, a norcocaína e a
benzoilnorcocaína (Leite, 1999).
A benzoilecgonina corresponde a 29-45% da excreção urinária. Para sua
formação, a cocaína sofre hidró
lico. O éster metil ecgonina, maior produto de biotransformação depois da
benzoilecgonina, resulta da hidrólise espontânea e degradação enzimática por ação
das colinesterases plasmáticas e hepáticas. A hidrólise enzimática da
benzoilecgonina e a espontânea do éster metil ecgonina resultam no aparecimento da
ecgonina, que pode contribuir com 1 a 8% da excreção urinária de cocaína. Outro
produto de biotransformação é a norcocaína, que ocorre apenas em pequena fração
(2 a 6%), mas que é farmacologicamente ativa.
O uso combinado de cocaína e álcool produz uma substância
farmacologicamente ativa, denominada cocaet
e na urina de usuários de cocaína depois da administração simultânea de
cocaína e álcool. O cocaetileno pode ser metabolizado posteriormente em
benzoilecgonina, norcocaína e éster metil ecgonina. A cocaína apresenta meia-vida
de eliminação de aproximadamente 75 minutos quando administrada por via
intranasal e de 48 minutos por via oral (Wilkinson et al., 1980). A droga pode ser
detectada na mucosa nasal até 3 horas após a administração (Van Dyke et al., 1982),
enquanto que a cocaína metabolizada pelas colinesterases plasmáticas está presente
no sangue por até 3 horas, podendo ser detectada até 24 horas no máximo (Kogan et
al., 1977). O fumo da base de cocaína produz um produto pirolítico, o éster metil
anidroecgonina, que pode ser detectado na urina e serve como um marcador do uso
de cocaína por esta via (Ambre, 1988).
1.3 COCAÍNA E NEUROTRANSMISSÃO
ição no cérebro
ursor dos neurotransmissores aminérgicos
que possuem estrutura química denominada de catecol. Estes neurotransmissores são
denomi
1.3.1 – DOPAMINA
- Produção e distribu
O aminoácido tirosina é o prec
nados catecolaminas e compreendem a dopamina, noradrenalina e
adrenalina. Neurônios catecolaminérgicos estão relacionados com a regulação do
movimento, humor, atenção e das funções vicerais. Os neurônios dopaminérgicos
(produtores de dopamina) apresentam a enzima tirosina hidroxilase (TH), um
catalizador da conversão de tirosina em DOPA. O DOPA é convertido então no
neurotransmissor dopamina pela dopa descarboxilase. Quando é gerado um
potencial de ação (despolarização da membrana), ocorre a exocitose do
neurotransmissor dopamina para a fenda sináptica. A dopamina atua então em
receptores pré e pós-sinápticos para promoção de seus efeitos, sendo recaptada para
o neurônio para o término do processo sinalizador (Bear, 2001; Connors 2001).
1.3.2 – DISTRIBUIÇÃO DOS NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS
s celulares
calizados no cérebro. Estes são classificados em A8, A9 e A10 (Dahlstrom &
Fuxe,
A9 e que terminam na região denominada corpo
• , é originado no grupo A10 e parte
do grupo A9. Estes neurônios terminam no estriado ventral, o qual inclui o
• upo de neurônios dopaminérgicos se origina nos grupos A9 e A10
e termina em várias regiões do córtex cerebral que são envolvidas na atenção e
Os neurônios dopaminérgicos têm origem em três grupo
lo
1964, Bjorklund & Lindvall, 1984), correspondendo às regiões cerebrais
denominadas campo retrorubral (A8), substância negra pars compacta (A9) e área
tegumentar ventral (A10) (Figura 3). Os axônios dos neurônios dopaminérgicos
provenientes destes grupos celulares se estendem para regiões do mesencéfalo,
formando três sistemas neuronais:
• Sistema nigroestriatal que compreende os neurônios dopaminérgicos
originados no grupo de células
estriado dorsal. Esta região contem o núcleo caudado e o putamen e esta
envolvida com o aprendizado de movimentos complexos executados
automaticamente sob comando voluntário.
O segundo circuito, o sistema mesolímbico
núcleo accumbens e tubérculo olfatório, o septo, a amígdala central e o núcleo
profundo da formação reticular (Ungerstedt, 1971). O estriado ventral tem
papel no aprendizado e na performance de certos comportamentos de
motivação.
O terceiro gr
memória curta, formando o sistema mesocortical (Thierry et al., 1973).
Figura 3 – Vias dopaminérgicas
1.3.3 – PAPEL DA DOPAMINA NO COMPORTAMENTO
Inúmeras evidências indicam que a dopamina exerce um importante papel na
motivação e no reforço (Wise 1982; Robbins et al., 1989; Di Chiara 1995). A ação
da dopamina no comportamento depende de três fatores principais: (1) o tipo de
estímulo que ativa os neurônios dopaminérgicos, (2) a(s) área(s) cerebral(is)
afetada(s) pela dopamina e (3) o modo de neurotransmissão dopaminérgica (se
fásico-sináptico ou tônico-não-sináptico).
Os neurônios dopaminérgicos são ativados por estímulos encorajadores para
os animais interpretarem ou repetirem um certo comportamento (estímulo
motivacional). Estes estímulos convergem dos grupos celulares dopaminérgicos A8,
A9 e A10 para várias áreas cerebrais onde ficam as terminações dos neurônios
dopaminérgicos. Assim, através da ativação destes neurônios, o estímulo
motivacional pode influenciar a atividade de várias partes do cérebro que podem
determinar diferentes funções comportamentais. Este mecanismo pode ser uma das
razões do extenso papel da dopamina no comportamento.
1.3.4 – O TRANSPORTADOR DE DOPAMINA
A cocaína bloqueia a captação de dopamina, 5-hidroxitriptamina (5-HT) e
norepinefrina (NE) no SNC (Figura 4), promovendo um acúmulo destes
neurotransmissores na fenda sináptica. Porém, a determinação de qual destas ações
está associada com os efeitos de reforço só foi elucidado recentemente. Existe uma
correlação positiva significativa entre as potências da cocaína e alguns compostos
relacionados, que bloqueiam a captação de dopamina e suas habilidades como
reforçadores em situações de auto-administração em macacos rhesus (Ritz et al.,
1987), sendo que correlações significativas entre os efeitos de reforço e o bloqueio
da captação de NE e 5-HT não foram encontradas. Estes dados sugerem que o
bloqueio da captação de dopamina é um passo essencial na mediação dos efeitos de
reforço da cocaína. Um outro suporte desta hipótese dopaminérgica provém da
evidência de que o receptor da cocaína e o transportador de dopamina são proteínas
idênticas. Particularmente, fortes evidências provêm dos experimentos de clonagem.
Outros estudos mostram que vários inibidores da captação de dopamina, como os
análogos da cocaína de alta afinidade, mazindol e vários análogos do GBR12909, se
ligam a um sítio comum e interagem competitivamente, o que leva à conclusão de
que eles se ligam ao transportador de dopamina (Carroll et al., 1992; Reith et al.,
1992). Além do mais, Grilli et al., 1991, mostraram que a expressão de sítios de
ligação da cocaína e sítios de captação de dopamina ocorrem ao mesmo tempo
durante o desenvolvimento celular in vitro.
Uma outra indicativa de que os sítios de ligação da cocaína e o transportador
de dopamina estão intimamente relacionados é o fato de que os sítios de ligação da
cocaína são distribuídos no SNC em áreas que apresentam altas concentrações de
dopamina em terminais nervosos. Enquanto estes dados indicam um papel
proeminente da dopamina, alguns trabalhos indicam que interações significativas
entre diferentes sistemas mediadores neuroquímicos, como o serotonérgico,
gabaérgico e adrenergico, podem estar envolvidos na modulação das ações de
reforço da cocaína e compostos relacionados.
Grandes progressos também foram alcançados na elucidação das
características da estrutura da cocaína, que são significativas na ligação ao
transportador de dopamina. As características estruturais importantes incluem a
configuração levorotatória, um substituinte beta-orientado em C-2 e C-3, e o anel
benzênico no carbono C-3 (Ritchie et al., 1990).
Além das características estruturais relevantes na ligação da cocaína, vários
laboratórios estão envolvidos na caracterização da proteína transportadora de
dopamina propriamente dita. Estes estudos levaram ao desenvolvimento de técnicas
que eventualmente resultaram na clonagem e expressão do DNAc do transportador
de dopamina cocaína-sensível (Kilty et al., 1991; Shimada et al., 1991). Este achado
dá a oportunidade de elucidar a seqüencia molecular que resulta na captação de
dopamina e determinar como este processo é perturbado pela cocaína. Finalmente,
este conhecimento pode ser útil no desenvolvimento de medicamentos para o
tratamento da dependência pela cocaína. Pela alteração do transportador de
dopamina através de mutações sítio-direcionadas, é possível determinar se as
mudanças diferentemente alteram a ligação de cocaína e dopamina. O achado de que
um resíduo de ácido aspártico encontrado em uma região particular parece ser
crucial para ambos, transporte de dopamina e ligação da cocaína, enquanto outras
áreas são importantes apenas para o transporte de dopamina, dá suporte à
possibilidade da capacidade do desenvolvimento de antagonistas da cocaína que não
interfiram com o transporte normal de dopamina (Kitayama et al., 1992).
Vesículas com DA Neurônio pré-ganglionar
DA
Cocaína bloqueia recaptação de DA
Neurônio pós-ganglionar Receptores pós-sinápticos
Figura 4 – Ações da cocaína na neurotransmissão dopaminérgica
1.3.5 – EFEITO DA COCAÍNA NO SISTEMA DOPAMINÉRGICO
A cocaína produz muitos efeitos neuroquímicos, mas seu principal
mecanismo de ação envolve a monoamina dopamina. A cocaína produz um bloqueio
na recaptação de dopamina, permitindo que esta fique na fenda sináptica por um
período prolongado de tempo. O aumento deste neurotransmissor em certas áreas do
cérebro, como por exemplo, no núcleo accumbens, é responsável pelos efeitos de
reforço da cocaína (figura 4).
A ativação do sistema nervoso simpático também ocorre, explicando os
efeitos ativadores simpáticos da cocaína, os quais incluem: taquicardia, aumento da
pressão arterial sistólica, midríase e outros efeitos simpáticos (Ritchie e Greene,
1990). Mais especificamente, os receptores D1, D2 e D3 podem estar envolvidos no
efeito de reforço no sistema dopaminérgico mesolímbico. A atividade do receptor D1
foi demonstrada predominantemente no shell do Núcleo accumbens, o qual está
relacionado com aspectos motivacionais do vício promovido pela cocaína (Koob et
al., 1997). Leshner 1996, também sugeriu que os receptores D1 podem estar
envolvidos na saciedade pela cocaína, visto que agonistas D1 suprimem a auto-
administração em ratos. Os receptores D2 têm também importância nos efeitos de
reforço da cocaína. De acordo com Leshner 1996, estes receptores têm um possível
papel nos comportamentos motores envolvidos no vício por cocaína, considerando
que agonistas D2 induzem um comportamento de procura pela droga. Koob et al.,
1997, sugeriram que isto é devido a um aumento na quantidade de receptores D2 no
corpo estriado, o qual está envolvido nos comportamentos motores. Os receptores
D3 também têm efeitos sobre a habilidade da cocaína em produzir reforço, mas o
mecanismo de ação destes receptores ainda precisa ser elucidado (Koob et al.,
1997). Semelhante aos receptores D1, os receptores D3 foram encontrados no shell
do núcleo accumbens, mas não no core. (Koob et al., 1997). Em suma, os receptores
D1, D2 e D3 exercem um papel na habilidade da cocaína produzir reforço.
O bloqueio da recaptação de dopamina pode estar relacionado a um aumento
na atividade locomotora com os dias de administração. Feldman et al., 1997
demonstraram que microinjeções de cocaína no núcleo accumbens resultavam em
aumento na atividade locomotora. Porém, estes pesquisadores explicaram que o
mecanismo pelo qual a cocaína produz seus efeitos comportamentais pode envolver
mais do que um simples bloqueio na recaptação de dopamina.
Figura 5 – Representação do sistema dopaminérgico
1.3.6 – SISTEMA COLINÉRGICO
A acetilcolina é o neurotransmissor responsável pela transferência de
impulsos dos neurônios colinérgicos de células nervosas colinoceptivas para células
de tecidos inervados (Tucek et al., 1993). Este sistema possui um importante papel
nos processos de memória e aprendizado (Ohno et al., 1993). Os núcleos da base
apresentam ampla inervação colinérgica, sendo esta mais intrínseca no corpo
estriado, vindo de interneurônios colinérgicos (figura 6).
Dale, em 1914, dividiu as ações da acetilcolina em muscarínicas e nicotínicas.
Estes efeitos são mediados por duas classes distintas de receptores que possuem
pouca coisa em comum, a não ser a habilidade de se ligar a acetilcolina (Ehlert et al.,
1995). Os receptores muscarínicos são amplamente distribuídos em todo o corpo e
exercem inúmeras funções vitais no cérebro e no sistema nervoso autonômico
(Lefkowitz et al., 1996). No cérebro, os receptores muscarínicos são importantes na
memória (Drachman e Leavitt, 1974; Safer e Allen, 1971) e na patofisiologia de
doenças afetivas (Janowsky et al., 1972; Janowsky et al., 1973; Sitaram et al., 1980)
e esquizofrenia (Davis et al., 1975; Karson et al., 1991; Tandon et al., 1991; Tandon
et al., 1992). Devido ao seu possível papel na função cognitiva, os receptores
muscarínicos são alvo de pesquisa no caso da doença de Alzheimer (Richelson,
1995).
A demonstração da existência de concentrações muito altas de dopamina e
acetilcolina no corpo estriado, juntamente com numerosas observações
comportamentais e clínicas de uma relação recíproca entre as ações das drogas
dopaminérgicas e colinérgicas, levaram a um conceito geralmente aceito de que um
balanço entre a atividade dopaminérgica e colinérgica é importante para a função
normal desta estrutura (Tarsy, 1977). Um modelo no qual este balanço dopamina-
acetilcolina é o resultado de uma ação inibitória da dopamina na produção de
acetilcolina estriatal tem recebido muito suporte experimental. A estimulação de
receptores dopaminérgicos pela administração sistêmica de agonistas diretos ou
indiretos produziu aparentes diminuições na função colinérgica estriatal (Sethy e
Van Woert, 1974; Guynet et al., 1975; Ladinsky et al., 1975; Mcgreer et al., 1975).
Em contraste, o antagonismo direto ou indireto da função do receptor dopaminérgico
pela administração sistêmica destes compostos produziu aumentos nos índices de
utilização da acetilcolina estriatal (Beani et al., 1966; Stadler et al., 1973; Trabucchi
et al., 1974; Consolo et al., 1975).
Figura 6 – Representação das vias colinérgicas centrais
1.3.7– CIRCUITOS ENCEFÁLICOS E DROGAS DE ABUSO
Os mediadores neurobiológicos das ações psicoestimulantes centrais da
cocaína parecem ser as catecolaminas centrais, principalmente o neurotrasmissor
dopamina. Neurônios dopaminérgicos da área tegumentar ventral (ATV) que
inervam o córtex límbico e frontal são necessários para as ações agudas de reforço
promovidas pela cocaína.
As bases celulares para as ações da cocaína no sistema dopaminérgico
começaram a ser elucidadas recentemente. Por meio da administração de ligantes
marcados, White e Wang demonstraram que a dopamina deprime normalmente a
atividade espontânea do núcleo accumbens inervado por neurônios dopaminérgicos
da área tegumentar ventral, sendo esta ação três a dez vezes mais potente nesta em
relação ao núcleo accumbens. Embora a ação da dopamina no núcleo accumbens se
dê através da interação com receptores das famílias D1 e D2, na ATV ocorre
interação predominante com receptores D2-símile.
A cocaína atua alterando os sistemas de neurotransmissores endógenos.
Centralmente, a cocaína atua na neurotransmissão catecolaminérgica incluindo tanto
as vias noradrenérgicas como dopaminérgicas. A via noradrenérgica parece ser
importante na mediação da ativação dos efeitos inespecíficos estimulantes, incluindo
complicações cardiovasculares e o aparecimento dos sintomas que aparecem após a
interrupção do uso dos estimulantes (Gawin e Ellinwood, 1988; Kosten, 1990). Os
circuitos dopaminérgicos cerebrais parecem ser importantes na euforia e nos efeitos
de reforço induzidos pelos estimulantes, os quais mantêm o abuso dos estimulantes
(Shepherd, 1988).
A via serotonérgica também tem um papel no abuso da cocaína, embora isto
não tenha sido firmemente estabelecido (Kosten, 1990; Shepherd, 1988). A via
dopaminérgica mesolímbica/mesocortical é importante para a auto-administração da
cocaína (Wise, 1987).
Os neurônios dopaminérgicos da ATV são células que se originam das vias
dopaminérgicas mesolímbica/mesocortical e promovem inervação dopaminérgica
para o núcleo accumbens (Oades and Halliday, 1987). As propriedades de
recompensa da cocaína podem ser devidas ao bloqueio da recaptação de dopamina
no núcleo accumbens, o que incrementa e prolonga a liberação sináptica de
dopamina (Ritz et al., 1987; Koob and Bloom, 1988).
O mecanismo central de ação da cocaína e outros estimulantes com alto
potencial de abuso parece ser a estimulação da via de recompensa dopaminérgica no
cérebro (Gawin e Ellinwood, 1988; Goeders e Smith, 1983; Yokel e Wise, 1975).
De acordo com Kosten 1990, as seguintes ações ocorrem na sinápse durante a ação
estimulatória: a liberação de catecolaminas dos terminais pré-sinápticos; o bloqueio
da captação da dopamina, NE e 5-HT (principal mecanismo de inativação dos
neurotransmissores) e alterações na sensibilidade
do receptor com o uso crônico. O uso crônico pode resultar em outros
efeitos que não só os resultantes da disponibilidade aumentada de catecolaminas e 5-
HT. Estes incluem sensibilização (tolerância reversa) e tolerância.
A sensibilização comportamental pode estar localizada no Núcleo
accumbens, embora outros sistemas neurais possam mediar os efeitos motores
agudos da cocaína (Kalivas e Duffy, 1990). Foi demonstrado que a sensibilização
induzida por cocaína pode ser bloqueada pelo haloperidol (Weiss et al., 1989),
enquanto a administração de apomorfina, um agonista do receptor dopaminérgico,
previne o desenvolvimento de uma resposta de sensibilização à anfetamina em
camundongos (Riffee et al., 1987), mas não previne a sensibilização induzida pela
administração subcrônica de cocaína (Riffee et al., 1988); estes resultados sugerem
que a sensibilização para estes dois estimulantes pode envolver diferentes processos.
A tolerância aos efeitos da cocaína pode se desenvolver através da redução
da inibição da recaptação com o uso crônico, diminuindo a liberação dos
neurotransmissores, talvez devido à depleção no terminal pré-sináptico (embora este
mecanismo não tenha sido confirmado) ou alterações na sensibilidade do receptor
nos seus sítios pré- e pós-sinápticos levando a uma auto inibição neuronal (Kosten,
1990).
A hipótese dopaminérgica procura explicar as propriedades de reforço da
cocaína. Ela propõe que a cocaína se liga ao transportador de dopamina e inibe a
recaptação do neurotransmissor. Como resultado, a neurotransmissão dopaminérgica
é potencializada na via mesolimbocortical, levando ao reforço de eventos associados
com a ligação da cocaína e inibição da entrada de dopamina a nível molecular
(Kuhar, 1992). Como outras drogas, tais como nicotina e álcool, também ativam a
via mesolímbica, isto pode servir como via comum final para numerosas substâncias
psicoativas, tanto em seu sítio de ação como em outros locais no SNC (Kuhar et al.,
1991).
Existem evidências substanciais da hipótese dopaminérgica em animais,
mas poucas em humanos. Ritz et al., 1987, reportaram evidências em animais de que
a inibição do transportador de dopamina é o mecanismo primário responsável pelos
efeitos de reforço da cocaína e o sítio receptor, ou sítio de ação onde os eventos
resultantes dos efeitos de reforço são iniciados, embora outros sítios não possam ser
excluídos. Entre as linhas de evidência disponíveis em humanos para esta
explicação, Kuhar et al., 1991, listam as seguintes: 1) estudos de tomografia
emissora de pósitrons (TEP), que mostram similaridades no tempo de curso entre a
ocupação do receptor de cocaína (receptor de dopamina) e os efeitos da cocaína; 2) a
presença de paranóia e psicose em ambos usuários de cocaína de forma prolongada
ou em altas doses e na esquizofrenia, uma desordem que envolve a via
dopaminérgica límbica; 3) a ação de estimulantes indiretos do receptor de dopamina,
tais como, metilfenidato ou bromocriptina em reduzir com sucesso o desejo inicial
pela droga, sugerindo que o agente dopaminérgico pode influenciar o mesmo
processo como a cocaína (Dackes et al., 1987; Khantzian et al., 1984); 4) a
preferência mostrada por bloqueadores da captação de dopamina em estudos de
escolha feitos com várias drogas (Chatt et al., 1987); 5) e a sugestão de que
decanoato de flupentixol, um bloqueador do receptor de dopamina, pode diminuir o
desejo pela droga (Giannini et al., 1986; Gawin et al., 1989).
A administração de drogas bloqueadoras de receptores dopaminérgicos, tais
como clorpromazina ou haloperidol não reduziram a euforia induzida pela cocaína
ou auto-administração, mas reduziram os sintomas psicóticos (Gawin 1986a). O
haloperidol também falhou na tentativa de atenuar o rush (sensação de curta duração
que ocorre imediatamente após a administração da droga e é caracterizada por uma
sensação de poder e extremo prazer comparada a um orgasmo), apenas
modestamente influenciando os efeitos subjetivos da cocaína e atenuando o aumento
da pressão sistólica e diastólica induzido pela cocaína (Shere et al., 1989).
Estes achados sugerem que um bloqueio nos receptores D2 (subtipo de
receptor dopaminérgico do qual o haloperidol é antagonista primário) não afetou
fortemente a euforia causada pela cocaína, embora o pré-tratamento com
bloqueadores do receptor dopaminérgico tenham prevenido a euforia pela
anfetamina. Estes resultados sugerem a possibilidade de que mecanismos
dopaminérgico estejam envolvidos no início do uso da cocaína, mas não em
fenômenos tardios como a dependência e o desejo. Usando um simples estudo de
TEP, Pearlson et al., 1993 encontraram que a cocaína administrada
endovenosamente produziu efeitos subjetivos (auto-limitados, como rush e high)
correspondendo com diminuições regionais no fluxo sanguíneo cerebral para sítios
ricos em terminais dopaminérgicos, sugerindo o envolvimento do sistema
dopaminérgico na produção destes estados subjetivos.
Enquanto os efeitos da cocaína no sistema dopaminérgico neuronal no
cérebro são possivelmente mediados pelo bloqueio de curto período na recaptação
de dopamina, o uso prolongado resulta na depleção de dopamina nestes mesmos
sítios (Volkow et al., 1990). Esta depleção pode resultar na interrupção da
transmissão dopaminérgico, causando disforia e ânsia pela droga. No estudo de
Volkow et al., 1990, porém, foi demonstrado uma recuperação na disponibilidade do
receptor dopaminérgico pós-sináptico a níveis normais em usuários de cocaína
detoxificados depois de um período de 1 mês livre da droga. Um outro estudo
também examinou a possibilidade de que a exposição à cocaína altera o
transportador de dopamina e concluiu que a regulação do transportador de dopamina
é altamente sensível aos regimes de uso e intervalos de retirada da droga (Little et
al., 1993).
Vários aspectos do mecanismo definem as bases das intervenções
farmacológicas para o tratamento do abuso da cocaína. Por exemplo, quando as vias
dopaminérgicas são antagonizadas por neurolépticos, os quais atuam como
bloqueadores dopaminérgico (Phillips et al., 1983), ou quando estas vias são
destruídas quimicamente ou retiradas cirurgicamente (Bozarth e Wise 1986; Roberts
et al., 1977), os efeitos comportamentais da cocaína são eliminados. As qualidades
eufóricas e de reforço da cocaína podem também ocorrer como um resultado do
efeito da droga no sistema 5-HT, embora os mecanismos envolvidos não sejam
ainda conhecidos. A administração da cocaína aumenta a liberação do
neurotransmissor 5-HT nos sítios sinápticos pela inibição da recaptação da 5-HT,
como já descrito anteriormente, da mesma maneira pela qual afeta a dopamina e NE
(Hall et al., 1990), resultando na redução do turnover de 5-HT. Desta forma, agentes
que modulam a 5-HT também influenciam a ação da cocaína (Johnson e Vocci,
1993).
Também é conhecido que agonistas opióides como morfina e metadona
estimulam a transmissão dopaminérgico no sistema mesolímbico, enquanto
agonistas κ reduzem na mesma extensão. Desde que buprenorfina (um agonista
parcial - μ) suprime a auto-administração de cocaína em macacos Rhesus na mesma
extensão que suprime a auto-administração dos opióides, pode existir uma possível
ligação entre o sistema opióide e os sistemas responsáveis pela produção dos efeitos
de reforço da cocaína em primatas (Johnson e Vocci, 1993).
1.4 ETANOL
1.4.1 –CONSIDERAÇÕES GERAIS
A palavra álcool origina-se do árabe al-kuhul, que significa líquido. As
bebidas alcoólicas representam as drogas mais antigas das quais se tem
conhecimento. Obtidas pela fermentação de diversos vegetais, por meio de
procedimentos no início primitivos e depois cada vez mais sofisticados, as bebidas
alcoólicas já estavam presentes nas grandes culturas do Oriente Médio e são
utilizadas em quase todos os grupos culturais, geralmente relacionadas a eventos
festivos. Os mais antigos documentos da civilização egípcia descrevem o uso do
vinho. A medicina egípcia usava essências alcoólicas para uma série de moléstias,
como meio embriagador contra dores e como abortivo. O vinho era bebido entre os
egípcios em honra à deusa Isis. O consumo de cerveja pelos jovens era comum;
muitos contos, lendas e canções de amor relatam os seus poderes afrodisíacos. O seu
uso social e festivo era bem tolerado, embora, já no Egito, moralistas populares se
levantassem contra o seu abuso "por desviar os jovens dos estudos". A embriaguez,
no entanto, era tolerada apenas quando decorrente de celebrações religiosas, onde
era considerada normal ou mesmo estimulada (Lieber et al., 1995). Na Babilônia
500 a.C., a cerveja era ofertada aos deuses. Nas culturas da Mesopotâmia, as bebidas
alcoólicas existiram no final do segundo milênio a.C.; aos poucos, a cerveja à base
de cereais foi substituída por fermentados à base de tâmaras. A fermentação da uva
também é regularmente mencionada. O consumo de álcool nas civilizações gregas e
romanas é bem conhecido, onde era utilizado tanto pelo seu valor alimentício,
quanto para festividades sociais.
O consumo de bebidas alcoólicas é amplamente difundido no Brasil, onde se
consome mais álcool per capita do que leite. Na década de 20, nos Estados Unidos,
houve uma proposta de coibição legal do uso de bebidas alcoólicas chamada Lei
Seca, a qual durou pouco tempo. As bebidas alcoólicas são elaboradas a partir da
fermentação de produtos naturais: vinho (fermentação da uva), cerveja (fermentação
de grãos de cereais) e outros (fermentação do mel, cana de açúcar, beterraba,
mandioca, milho, pimenta, arroz etc.). Bebidas alcoólicas destiladas (como cachaça,
rum, uísque ou gim) são obtidas através da destilação de bebidas fermentadas
(Robbins, 1999).
O etanol é o agente mais utilizado em todo o mundo. Existem, nos Estados
Unidos, 15 a 20 milhões de alcoólatras, e cerca de 100.000 mortes por ano são
atribuídas ao abuso de álcool, com um custo econômico de 100 a 130 bilhões de
dólares (Lieber et al., 1995). O etanol é ingerido por via oral, em bebidas alcoólicas
como a cerveja, vinho e aguardentes. O álcool etílico é uma droga de abuso
conhecida por alterar vários sistemas de neurotransmissores do SNC. Segundo
Nevo & Hamon (1995), o consumo agudo e crônico do etanol interfere
diferentemente com processos de transmissão no SNC, afetando muitos, se não
todos os sistemas de neurotransmissores conhecidos. Entretanto, o mecanismo de
ação pelo qual o etanol altera esses sistemas ainda não foi totalmente esclarecido
(Chandler et al., 1998). O etanol tem propriedades de reforço, causando tanto leve
euforia como uma redução da percepção da ansiedade. A retirada do etanol é
caracterizada por uma síndrome que varia de uma ressaca severa para ansiedade
profunda, tremores, hiperatividade simpática, psicose e morte (Lewis et al., 1994).
1.4.2 - FARMACOCINÉTICA
O etanol é consumido por via oral, onde sofre rápida absorção no estômago
(20%), no intestino delgado (75%) e no cólon (5%). O etanol na forma de vapor
pode ser absorvido pelos pulmões, podendo também ser absorvido em menor escala
pela via subcutânea (Ritchie 1987). Após ser absorvido, o etanol sofre distribuição
uniforme para todos os tecidos e líquidos do corpo. Na maioria dos indivíduos o
pico de concentração plasmática máxima ocorre entre 30 e 90 minutos após a
ingestão (Oliveira & Pereira, 1994).
O etanol sofre rápida distribuição para todos os compartimentos aquosos do
organismo, sendo sua concentração diretamente proporcional ao conteúdo de água
do organismo. As membranas são sempre permeáveis a sua passagem e a sua
concentração sanguínea é similar a do restante do organismo. O etanol penetra no
SNC, devido ao amplo suprimento sangüíneo para essa região. A placenta também é
permeável, tendo o etanol livre acesso à circulação fetal (Oliveira & Pereira, 1994;
Rang et al., 2001).
Mais de 90% do etanol absorvido sofre metabolização hepática (Figura 7),
sendo uma pequena parcela eliminada de forma inalterada pelos pulmões e pelos
rins. A metabolização hepática do etanol difere da maioria das substâncias, exibindo
uma cinética de saturação com concentrações relativamente baixas de etanol, de
maneira que a fração de etanol removida do sangue sofre uma diminuição gradativa
à medida que aumenta a concentração plasmática de etanol. Outro fator de grande
importância é a absorção, pois quando esta é rápida, ocorre elevação da
concentração sanguínea, enquanto que quando a absorção é muito lenta, uma maior
fração do etanol é removida pelo metabolismo de primeira passagem. Portanto, a
ingestão de etanol com estômago vazio produz efeito farmacológico mais intenso
(Lieber, 1994). O metabolismo do etanol é predominantemente hepático, sendo a
principal via realizada por processos de oxidações sucessivas. A oxidação inicial do
etanol promove a formação do acetaldeído pela enzima álcool desidrogenase.
Figura 7 – Metabolismo do Etanol
O acetaldeído é então convertido em acetil coenzima A, que sofre oxidação
através do ciclo ácido cítrico ou é utilizado em reações anabólicas que participam da
síntese de colesterol, ácidos graxos e outros constituintes teciduais (Ritchie 1987). O
acetaldeído é um composto tóxico, podendo contribuir para a hepatoxicidade do
etanol. Ocorre ainda um pequeno grau de esterificação do etanol com vários ácidos
graxos nos tecidos, podendo estes contribuírem para a toxicidade a longo prazo
(Lieber, 2000). A álcool desidrogenase oxida o etanol e concomitantemente reduz a
adenina dinucleotídeo (NAD) a NADH. O metabolismo do etanol resulta, portanto
em queda do NAD, ocorrendo assim conseqüências metabólicas como aumento da
produção de lactato e redução da velocidade do ciclo de Krebs.
Outras vias relacionadas com o metabolismo do etanol são a do sistema de
metabolização microssomal do etanol e o sistema de catalase binária associada aos
peroxissomas, ambas tendo importância secundária. A tolerância de alcoólatras a
várias drogas psicoativas tem sido atribuída geralmente a uma adaptação do SNC,
mas adaptações metabólicas têm sido agora muito consideradas em virtude do
clearance de muitas drogas no sangue estar aumentado nos alcoólatas (Lieber, 2000;
Leo et al., 1992).
1.4.3 ETANOL E NEUROTRANSMISSORES
Pesquisas anteriores não são conclusivas quanto às alterações causadas pelo
etanol nos sistemas de neurotransmissores. Assim, enquanto alguns estudos (Di
Chiara & Imperato, 1985; O'Brien et al., 1995) mostram que a administração de
etanol induz liberação de dopamina e serotonina no núcleo caudado e núcleo
acumbente de ratos, outros (Rossetti et al., 1992) observaram que a retirada aguda de
álcool reduz a concentração extracelular de dopamina no núcleo accumbens. Esses
achados fortalecem a hipótese de que a dopamina é um neurotransmissor
fundamental na mediação do efeito de reforço e recompensa de substância de abuso
no cérebro (Koob et al., 1987).
Também, estudos clínicos indicam que inibidores de recaptação de 5-HT
exibem alguma eficácia em reduzir o alcoolismo (Naranjo & Sellers, 1989). O sítio
de ação dos inibidores de recaptação não é conhecido, porém é possível que eles
atuem na via de reforço central no sentido de modificar a ação do etanol (Brodie et
al., 1995).
As interações entre o etanol e os sistemas de transmissores
monoaminérgicos são complexas. Mecanismos dopaminérgicos e noradrenérgicos,
associados com o sistema dos opióides endógenos no cérebro, parecem estar
implicados com o efeito de reforço do etanol via retroalimentação positiva (Nevo &
Hamon, 1995), enquanto o sistema serotonérgico medeia o reforço negativo (Selim
& Bradberry, 1996). Outro fator relevante para o etanol alterar os
neurotransmissores do SNC são as interações do tipo auto-modulatórias que ocorrem
entre esses sistemas. Assim, os níveis de dopamina podem ser modulados por
peptídios opióides endógenos, glutamato e 5-HT no SNC (Sershen et al., 2000;
Nevo & Hamon, 1995).
Muitos estudos são realizados também em relação a ação do etanol como
solvente lipídico em alterar a função geral das membranas neuronais através de
alterações nos lipídios. Tais ações gerais nas membranas parecem ser incompatíveis
com as ações neuropsicofarmacológicas do etanol, isto é, seus efeitos na
coordenação motora, cognição, bem como nos efeitos euforigênicos e ansiolíticos,
porém efeitos celulares seletivos do etanol têm sido reportados. Neurônios
dopaminérgicos da ATV e substância negra são ativados em resposta a
administração sistêmica de etanol. A ativação ocorre somente com doses
relativamente baixas de etanol e o efeito pode ser deprimido pela anestesia. Como os
neurônios da substância negra pars reticulata são deprimidos pelo etanol, o que pode
ser um efeito GABA-mediado, a ativação de neurônios dopaminérgicos pelo etanol
pode resultar em sua desinibição. No hipocampo e córtex cerebral, o etanol facilita o
efeito depressor as somatostatina e aumenta os efeitos excitatórios das respostas
colinérgicas muscarínicas.
1.5 COCAÍNA E ETANOL
O uso de cocaína nos Estados Unidos tem demonstrado proporções
epidêmicas, com estimativas de que 15% da população já utilizou cocaína pelo
menos uma vez na vida e 3 milhões de pessoas são usuárias crônicas (Abelson and
Miller 1998). Mais recentemente foi estabelecido que 62 – 90% dos usuários de
cocaína são também usuários concomitantes de etanol (Weis et al., 1988; Grant and
Hardford 1990; Rounsaville et al., 1991) sendo, portanto o uso simultâneo comum.
Pesquisas mostram que, nos Estados Unidos, houve um aumento de 2,4 a 6% na
ingestão de drogas de abuso em associação, entre as quais, cocaína e o álcool.
O álcool em combinação com a cocaína é a associação mais freqüente de
substâncias de abuso utilizada por viciados que se apresentam comumente para
receber atendimento em emergências dos hospitais de grandes cidades. Os usuários
de cocaína relatam que o uso de etanol durante a ação da cocaína prolonga as
propriedades euforigênicas da cocaína em adição a uma diminuição dos efeitos
físicos e psicológicos indesejáveis como a paranóia primária e agitação.
O uso da combinação de drogas promove em alguns indivíduos diminuição
da disforia associada com a cocaína. O uso desta associação pode resultar não
somente no aumento da euforia, mas também numa maior toxicidade. Embora estes
efeitos possam ocorrer devido as propriedade inerentes do etanol, evidências
recentes sugerem que a interação metabólica entre cocaína e etanol promove a
formação de um metabólito ativo (Cami et al., 1991; Hearn et al., 1991; Jatlow et al.,
1991).
O cocaetileno é um metabólito ativo da cocaína que é formado no fígado na
presença de etanol (Figura 8). A formação do cocaetileno ocorre através da
transesterificação da benzoilecgonina. Estudos sugerem uma maior letalidade do
cocaetileno em comparação com a cocaína em animais e uma relação entre o
cocaetileno e agitação violenta em humanos. De fato, muitos dos efeitos aumentados
observados quando etanol é utilizado em associação com cocaína podem resultar da
formação do cocaetileno.
Figura 8 – Representação estrutural do cocaetileno
O cocaetileno parece produzir efeitos euforigênicos mais intensos que os da
cocaína isolada e tem demonstrado efeitos convulsivantes eqüipotentes aos da
cocaína em estudos animais. Os efeitos tóxicos do cocaetileno podem decorrer da
sua ação de bloqueio da recaptação de dopaminérgico na fenda sináptica,
favorecendo assim a ação da cocaína. Esta ação pode também ser a base da alta
incidência de abuso da combinação cocaína-etanol. Este metabólito tem sido
detectado na urina de indivíduos com histórico de uso da associação entre cocaína e
etanol (Rafla and Epstein 1979; Smith 1984).
Dados recentes têm demonstrado a presença de altos níveis de cocaetileno
em amostras sangüíneas de vítimas fatais de overdose e de pacientes emergências
que tinham ingerido recentemente cocaína e etanol (Hearn et al., 1991; Jatlow et al.,
1991). Achados neuroquímicos e comportamentais sugerem que cocaetileno
apresenta efeitos psicotrópicos em comum com a cocaína. Tem sido demonstrado
que o cocaetileno, similarmente a cocaína, se liga ao transportador da dopamina,
bloqueando a recaptação de dopamina no núcleo accumbens após administração
sistêmica.
O cocaetileno promove ainda incremento da atividade locomotora em ratos,
demonstrando ser equipotente em relação à cocaína para promover estes efeitos, o
que é característico de drogas psicoestimulantes com potencial de abuso (Jatlow et
al., 1991). Diferentemente da cocaína, o cocaetileno tem poucos efeitos no
transportador de serotonina (Hearn et al., 1991; Bradberry et al., 1993).
A habilidade da cocaína em intensificar os efeitos euforigênicos do etanol e
o abuso comum de etanol por viciados em cocaína sugere uma interação entre as
duas drogas. A via dopaminérgica mesolímbica está relacionada com alguns dos
efeitos de reforço de drogas de abuso como o etanol e a cocaína.
Os corpos celulares dos neurônios dopaminérgicos são encontrados na área
tegumentar ventral (ATV) e enviam projeções para duas regiões terminais
separadas, o córtex pré-frontal e o núcleo accumbens. Cocaína e etanol promovem
um aumento da concentração de dopaminérgico no Núcleo accumbens , atuando em
pontos e por mecanismos diferentes na via mesolímbica.
A cocaína inibe a recaptação de dopaminérgico e serotonina no núcleo
accumbens enquanto que o etanol aumenta a intensidade da liberação de
dopaminérgico na ATV. Em adição, o etanol também ativa diferentes sistemas
neurotransmissores incluindo o sistema opióide endógeno. O cocaetileno, por sua
vez, apresenta ações semelhantes às da cocaína, promovendo bloqueio da recaptação
de dopamina.
A cocaína reverte alguns dos efeitos do etanol na performance psicomotora
bem como incrementa alguns dos efeitos subjetivos prazerosos associados com o
uso das drogas isoladamente. O uso da cocaína em combinação com o etanol pode
resultar não só no aumento e prolongamento da euforia, como também em uma
maior toxicidade.
Algumas respostas que resultam da interação entre o álcool ingerido
oralmente e a cocaína cheirada incluem efeitos cardiovasculares (elevação do débito
cardíaco e da pressão arterial) que não são observados com o seu uso isolado. A
cocaína em combinação com etanol atenua a percepção subjetiva da sedação e o
prejuízo da atividade locomotora resultantes do uso isolado do etanol. Estes efeitos
subjetivos podem levar a um incremento do uso destas drogas em combinação. O
uso da cocaína em associação com o etanol pode ainda incrementar
significativamente o risco de reações adversas pela produção de cocaetileno pelo
fígado, através do processo de transesterificação (conversão de um éster em outro)
(Jatlow et al., 1991).
2 – OBJETIVOS
Como o mecanismo através do qual a cocaína produz sensibilização
comportamental e reforço ainda não está bem determinado, e como também pouco
se sabe sobre a maneira pela qual a associação cocaína-etanol promove aumento
tanto do bem estar como da toxicidade, o objetivo deste trabalho foi estudar os
efeitos da administração repetida de cocaína em associação com o etanol sobre os
seguintes parâmetros:
- Atividade locomotora que foi conduzida nos dias de administração, para a
determinação de diferenças entre o tratamento agudo (1 ° dia) e sub-crônicos (7 °
dia) com o intuito de se determinar se ocorreu uma sensibilização comportamental;
- Determinação dos níveis de dopamina (DA), 5- hidroxitriptamina (5-HT) e
seus metabólitos: ácido 3, 4 dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico
(HVA) e ácido 5- hidroxiindol- 3 acético (5-HIAA) em corpo estriado de ratos após
um período de retirada de 24 h usando a técnica de cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) com detecção eletroquímica;
- Densidade de receptores dopaminérgicos D1-símile, D2-símile e
muscarínicos (M1+M2), dando ênfase aos valores de Bmax (densidade máxima de
receptores) e Kd (constante de dissociação), em corpo estriado e hipocampo de
ratos, sendo a determinação feita 24 h após a última injeção da droga;
- Efeito da droga sobre os níveis de enzimas séricas (TGO e TGP) em
amostras sanguíneas coletadas entre o tratamento agudo (1° dia) e sub-crônicos (7°
dia) com o intuito de se avaliar alterações bioquímicas promovidas pela associação
destas drogas.
- Análise histopatológica de amostras de tecidos cerebrais, hepáticos e
cardíacos, visando observar possíveis lesões microscópicas promovidas pelo uso
destas drogas.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar fêmeas, adultos-jovens, 2 - 4 meses, com peso
variando entre 180 – 200 g, provenientes do Biotério Central da Universidade
Federal do Ceará.
Durante todos os experimentos, os animais foram mantidos em gaiolas
com no máximo 6 animais, em condições ambientais semelhantes, com ciclos de
alternância claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão tipo purina e água ad
libitum. Os experimentos foram realizados de acordo com o guia de cuidados e usos
de animais de laboratório do Departamento de saúde e serviços humanos dos
Estados Unidos da América (EUA).
3.2 Material utilizado nos experimentos
- Agitador de tubos Modelo 251, FANEM, SP, Brasil
- Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça
- Banho Maria Modelo 102/1, FANEM, SP, BRASIL
- Bomba para HPLC LC-10AD Shimadzu Corp., Japan
- Caixa de atividades Cat. 7400 Ugo basile, Italy
- Degaseificador DGU-2A Shimadzu Corp., Japan
- Detector eletroquímico L-ECD-6A Shimadzu Corp., Japan
Equipamento de Millipore para filtração
à vácuo
Millipore Apparatus, Bedford, MA, USA
- Centrífuga refrigerada Modelo Marathon 26 KMR, Fisher
Scientific
- Contador de cintilação líquida Modelo ls 6500, Beckman, Fullerton,
CA, USA
- Cubetas de plástico para leitura em
espectrofotômetro
Sarstedt, Alemanha Oriental
- Espectrofotômetro Modelo Beckman DU 640B, Fullerton,
CA, USA
- Estufa para secagem Modelo 315 SE FANEM, SP, Brasil
- Filtros de fibra de vidro G/F Whatman, Maidstone, England
- Freezer Modelo ULT 2586-3D14, Revco
Scientific, Inc., USA
- Frascos de vidro para contagem de
cintilação
Vials Beckman. Fullerton, Ca, USA
- Guilhotina Harvard, USA
- Homogeneizadores manuais Bellico, USA
- Integrador C-R6A Chormatopac Shimadzu Corp., Japan
- Medidor de Ph Modelo B374, Micronal, SP, Brasil
- Micropipetas H.E., Pedersen, Dinamarca
- Sonificador Modelo PT 10-35. Brinkmann
Instruments Inc. NY, USA
- Unidade eletrônica (activity cage) Cat. 7401 Ugo basile, Italy
3.3 PREPARO DAS DROGAS
3.3.1 COCAÍNA
Cocaína (cloridrato de cocaína, fornecido pela Polícia Federal do Ceará,
Fortaleza, Brasil) foi dissolvida em água bidestilada, obtendo-se a concentração de
10 e 20 mg/mL para ser administrada na dose de 10 e 20 mg/kg.
3. 3.2 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE PUREZA DA COCAÍNA
Para determinação do grau de pureza, foram realizadas análises físico-
químicas no Laboratório de Perícia da Polícia Federal. Entre os testes realizados,
foram determinados o ponto de fusão e o comportamento da substância em
cromatografia, sempre comparando os resultados com os valores de um padrão da
Polícia Federal.
Com relação ao ponto de fusão, um parâmetro que nos permite estimar o grau
de pureza da cocaína na amostra, o valor encontrado para a amostra utilizada nos
experimentos assinalados nesta dissertação foi de 140oC em relação ao padrão que
registrou um valor de 180oC. Essa proximidade de valores significa que a amostra
apresenta um alto grau de pureza em relação às drogas comumente utilizadas por
viciados (cocaína de rua).
Outro parâmetro avaliado foi o comportamento da amostra em cromatografia.
Como observado na figura 9, a amostra se comportou da mesma maneira que o
padrão, comprovando novamente se tratar de cocaína.
Padrão
Amostra
Figura 9 – Cromatografia da cocaína em comparação com padrão da Polícia Federal
3.3.3 ETANOL
O álcool etílico a 95%, P.A. (Lab. VETEC, Brasil) foi utilizado para o
preparo de solução a 20% (em água bidestilada). Esta foi administrada em volume
que variou conforme a concentração final desejada, obtendo-se as seguintes
concentrações finais:
Droga Concentração final
Volume administrado
(animal de 200g)
Etanol 2 g/kg 0,2 g/mL 2 mL
Etanol 4 g/kg 0,2 g/mL 4 mL
3.4 TRATAMENTO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os animais foram divididos em grupos e tratados durante 7 dias com cocaína
por via intraperitoneal (i.p.), etanol (por via oral, v.o.) e a combinação destes. Para o
tratamento com etanol foi utilizada uma cânula intragástrica de polietileno. Trinta
minutos após a última administração, os animais foram submetidos ao teste
comportamental. Vinte e quatro horas após a última administração, os animais foram
então sacrificados, seus cérebros removidos e a área cerebrail de interesse (corpo
estriado) dissecada sobre gelo. Os animais controle foram tratados com solução
salina 0,9%. Antes de sacrificar os animais, amostras de sangue (aproximadamente 2
mL) foram coletadas do plexo orbital em tubos siliconizados com gel separador para
realização dos testes bioquímicos. O Quadro 1 resume as drogas utilizadas com
suas respectivas doses e vias de administração
Droga Dose Via de administração Abreviatura
Etanol 2 g/kg
4 g/kg
Oral Et-2
Et-4
Cocaína 10 mg/kg
20 mg/kg
Intraperitoneal Coc -10
Coc -20
3. 5 – ESTUDOS COMPORTAMENTAIS
3.5.1 TESTE DA ATIVIDADE LOCOMOTORA
Para realização do teste, foi utilizada a metodologia empregada por Shimada
et al., (1997). Ratas foram acomodadas em caixas de atividade individuais, com 35
cm de comprimento, 23 cm de profundidade e 20 cm de altura (modelo 7400 Ugo
Basile, Itália).
Durante todos os experimentos, os animais foram mantidos em gaiolas com
no máximo 6 animais, em condições ambientais semelhantes, em um ambiente livre
de sons e com ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas. A atividade locomotora
espontânea (ALE) foi determinada por 30 minutos nos períodos de pré e pós-
administração, por uma unidade eletrônica (modelo 7401, Ugo basile). A ALE foi
expressa como número de contagens/30 minutos, onde essa contagem representa o
número de movimentos do animal.
3.6 DISSECAÇÃO DAS ÁREAS CEREBRAIS
Os animais foram decapitados com uma guilhotina (Harvard, USA), os
encéfalos retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa
de Petri com gelo.
Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi
retirada das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a
qual, progredindo delicada e tangencialmente aos ventrículos laterais, divulsionou o
córtex em toda a sua extensão fronto-occiptal. O córtex já divulsionado foi rebatido
para os lados, expondo parte do corpo estriado.
O corpo estriado (caudado, putamen e núcleo accumbens) foi isolado das
estruturas circunjacentes por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação,
sendo a sua retirada orientada pelo diâmetro da porção tuberosa visível desses
núcleos, após o rebatimento lateral do córtex (Zilles & Wree, 1985).
Terminada a dissecação, o corpo estriado foi colocado em papel alumínio
previamente identificado e pesado, sendo então armazenado a –70oC para uso
posterior. Quando necessária a estocagem por um certo período de tempo (no
máximo 1 meses a –70oC), os tecidos foram considerados como tendo a mesma
viabilidade para experimentação que os ensaiados imediatamente ou 24 horas após a
dissecação (Burke & Greenbaun, 1987; Fielder et al., 1987).
3.7 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DOS RECEPTORES
MUSCARÍNICOS
A densidade dos receptores muscarínicos foi determinada através de
ensaios de ligação executados em homogenatos cerebrais. Para a determinação de
receptores muscarínicos (M1 + M2)-símile foi utilizado o ligante não-específico
[3H]-N-metilescopolamina ([3H]-NMS, 85 Ci/mmol – New England), de acordo
com o método previamente descrito (Dombrowski et al., 1983).
- MÉTODO
O antagonista muscarínico marcado [3H]-NMS liga-se a sítios específicos
dentre os quatro primeiros segmentos transmembrana dos receptores
muscarínicos (Wheatley et al., 1988) que existem nos tecidos homogeneizados.
Desse modo, o ligante tritiado marca os receptores presentes no tecido estudado.
A atropina é um outro antagonista clássico utilizado nos brancos dos
experimentos para determinar a radioatividade de background ou ligações não-
específicas.
A atropina acrescentada em concentração muito maior do que a [3H]-NMS
interage, seletivamente, com os mesmos sítios de ligação do receptor, deslocando
e deixando livre toda a droga marcada, que é logo depois filtrada. A
radioatividade contida no filtro é, então, determinada por cintilação líquida.
- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Terminada a dissecação do estriado em gelo, como mencionado
anteriormente, foram preparados homogenatos a 10% em tampão fosfato de
sódio, 150mM, pH 7,4.
Rapidamente, os homogenatos contendo 50-100 μg de proteína foram
incubados em tampão fosfato de sódio contendo entre 0,1282 a 6,41 nM de [3H]-
NMS, na presença ou na ausência de sulfato de atropina 12,5 μM em um volume
final de 0,2 mL.
Após incubação a 37oC por 30 minutos, a reação foi terminada por
filtração a vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os filtros foram lavados três
vezes com 4 mL de solução salina 0,9% gelada, secos a 60oC por no mínimo 2
horas e colocados em frascos de vidro (vials) com 3 mL de um coquetel para
cintilação líquida contendo tolueno.
A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida
Beckman LS-6500 com uma eficiência de 61%. A ligação específica foi calculada
como a ligação total menos a ligação não-específica feita na presença de atropina
12,5 μM, sendo os resultados expressos como fentomoles por miligrama de
proteína. A concentração de proteínas foi determinada segundo o método de
Lowry et al., 1951, utilizando-se albumina sérica bovina (BSA) como padrão.
- SOLUÇÕES REAGENTES
- Solução estoque de [3H]-N-metilescopolamina ([3H]-NMS)
Cloridrato de [3H]-NMS (85 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA,
USA), dissolvido em tampão fosfato de sódio 150 mM, pH 7,4 para obter
uma concentração de 23,52 nM.
- Solução estoque de Atropina
Sulfato de atropina (Sigma, St. Louis, MO, USA) foi dissolvido em água
bidestilada, para obter uma concentração de 0,5 mM.
- Tampão fosfato de sódio
NaH2PO4 (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil) foi dissolvido em água bidestilada,
para obter uma solução 150 mM e o pH foi ajustado para 7,4 com sulução de
HCl 1N (Merck, Rio de Janeiro, Brasil).
- Coquetel de Cintilação
0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO,
USA) e 4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, USA) foram
dissolvidos em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, USA).
3.8 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DOS RECEPTORES
DOPAMINÉRGICOS D2-SÍMILE
A determinação da densidade dos receptores dopaminérgicos foi feita
através de ensaio de ligação executados em homogenatos cerebrais:
- Receptores D2-símile
Foi utilizado o ligante específico [3H]-espiroperidol (114,0 Ci/mmol -
New England Nuclear, EUA), segundo uma adaptação do método previamente
descrito (Kessler et al., 1991 e Meltzer et al., 1989).
- Método
O ligante [3H]-espiroperidol é um antagonista dopaminérgico que possui
alta afinidade pelos receptores D2-símile, possuindo também afinidade pelos
receptores serotonérgicos do tipo 5-HT2 (Kessler et al., 1991; Terai et al., 1989).
Para bloquear os receptores serotonérgicos foi utilizado um antagonista
específico, a mianserina.
O butaclamol, um antagonista dopaminérgico, foi adicionado, na forma
não marcada, nos brancos dos ensaios para receptor D2 para determinar a
radioatividade a radioatividade de background ou ligações não-específicas, em
uma concentração elevada para interagir com os mesmos sítios de ligação do
receptor, impedindo assim, a ligação do [3H]-espiroperidol. O butaclamol
acrescentado em concentração muito maior do que a [3H]-espiroperidol interage,
seletivamente, com os mesmos sítios de ligação do receptor, deslocando e
deixando livre toda a droga marcada, que é logo depois filtrada. A radioatividade
contida no filtro é, então, determinada por cintilação líquida.
- Procedimento Experimental
Logo após a dissecação do estriado em gelo, como mencionado
anteriormente, foram feitos homogenatos a 10% em tampão tris-HCl 50mM, pH
7,4. Os homogenatdos contendo 50-100 μg de proteína foram incubados em
tampão tris-HCl modificado (50 mM, pH 7,4) contendo 10 μM de mianserina
(incubada por 30 minutos à temperatura ambiente) para bloquear os receptores
serotonérgicos e 0,0952 a 7,616 nM de [3H]-espiroperidol para experimentos de
saturação. No ensaio, o ligante foi incubado na presença e na ausência de
butaclamol 10 μM, sendo o volume final do ensaio de 0,2 mL.
Após incubação a 37oC durante 60 minutos, a reação foi terminada por
filtração à vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os discos de papel de filtro
foram lavados três vezes com 4 mL de solução salina 0,9% gelada, secos a 60oC
por no mínimo 2 horas e colocados em frascos de vidro (vials) com 3 mL de um
coquetel para cintilação líquida contendo tolueno.
A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida
Beckman LS-6500 com uma eficiência de 61%. A ligação específica foi calculada
como a ligação total menos a ligação não-específica feita na presença de
butaclamol 10 μM, sendo os resultados expressos como fentomoles por
miligrama de proteína. A concentração de proteínas foi determinada segundo o
método de Lowry et al., 1951, utilizando-se albumina sérica bovina (BSA) como
padrão.
- Soluções reagentes
- [3H]-espiroperidol (114 Ci/mmol, Amersham Life Science, EUA)
5 μL de [3H]-espiroperidol foram diluídos em tampão tris-HCl, pH 7,4, de
forma a obter uma concentração final de 43,28 nM.
- Tampão Tris-HCl
Seis gramas de Tris-HCl (Trizma base, Sigma, Brasil) foram diluídos em
1000 mL de água bidestilada, obtendo-se uma concentração de 50 mM. O pH foi
ajustado com solução HCl 0,1 N (MERCK, Rio de Janeiro, Brasil) para pH 7,4.
- Tris HCl modificado
NaCl 120 mM; KCl 1mM; CaCl2 2 mM; MgCl2 1 mM, NaEDTA 1 mM e
ascorbato sódico 1 mM foram dissolvidos em tampão tris-HCl 50 mM pH 7,4
- Mianserina
Comprimidos de mianserina (Tolvon 30 mg, Organon, SP, Brasil) foram
macerados e diluídos em tampão tris-HCl, obtendo-se uma concentração final de 10
μM.
- Butaclamol (Cloridrato de butaclamol)
Butaclamol (RBI, MA, EUA) foi dissolvido em ácido ascórbico a 0,1%, de
forma a se obter uma concentração final de 10 μM.
- Coquetel de cintilação
0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO,
EUA) e 4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foram
dissolvidos em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, EUA).
3.9 - DOSAGEM DE PROTEÍNA
3.9.1 MÉTODO
A quantidade de proteína em homogenatos cerebrais foi determinada a 25 °C,
utilizando albumina sérica bovina como padrão, de acordo com o método
previamente descrito (Lowry et al., 1951), que emprega duas reações de formação
de cor para analisar a concentração protéica fotometricamente. Inicialmente, é feita
uma reação biureto de baixa eficiência, na qual os íons de cobre alcalino produzem
uma cor azulada na presença de ligações peptídicas. Essa cor biureto é característica
de todas as proteínas, e fornece uma cor básica de fundo para a próxima etapa de
ensaio. Depois, o método emprega uma mistura complexa de sais inorgânicos, o
reagente Folin-Ciocalteau, que produz uma cor verde azulada intensa na presença de
tirosina ou triptofano livres ou ligados a proteínas. Como as quantidades desses dois
aminoácidos são geralmente constantes nas proteínas solúveis, com poucas
exceções, a cor das reações (verde-azulada) é indicativa da presença de proteína e a
intensidade da cor proporcional à concentração. Esta coloração foi medida em
comprimento de onda de 750 nm, através de um espectrofotômetro Beckam DU
640B.
3.9.2 SOLUÇÕES REAGENTES
- Reagente A: Na2CO3 (Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) a 2 % em NaOH
(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) 0,1 N;
- Reagente B: CuSO4.5H2O a 0,5 % em NaKC4H4O6.4H2O (Grupo Química,
Rio de Janeiro, RJ, Brasil) a 1 %;
- Reagente C: Solução de cobre alcalino (24 mL do reagente A com 1 mL do
reagente B, misturados no momento de usar);
- Reagente de Folin: Ciocalteau - Fenol (Labordin, Piraquara, PR, Brasil), 1:1
em água bidestilada;
- Solução de albumina sérica bovina (Sigma, St Louis, MO, EUA) 1
mg/mLem água bidestilada.
3.10 DETERMINAÇÃO DE MONOAMINAS E SEUS METABÓLITOS COM
HPLC
- MÉTODO
Para a determinação dos níveis de catecolaminas, foi utilizado o equipamento
de HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Na cromatografia líquida
clássica, um adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído
por um líquido ideal (fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na
coluna, e é carregada através da mesma por um líquido eluente. Se um composto da
mistura (soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da fase sólida estacionária,
ele atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto que seja mais
rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se existem
diferenças na adsorção pelo sólido.
Os detectores eletroquímicos medem a condutância do eluente, ou a corrente
associada com a oxidação ou redução dos solutos. Para ser capaz de detectar, no
primeiro caso os solutos devem ser iônicos, e no segundo caso os solutos devem ter
a característica de serem relativamente fáceis de se oxidarem ou reduzirem.
Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou
oxidação de solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos.
Neste estudo, foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade
muito menor de soluto, em torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem
a aplicação de um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo),
oxidação da substância que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo,
seguindo a amplificação e medida da corrente produzida. As catecolaminas são
oxidadas nos grupos de anel hidroxil para produzir um derivado ortoquinona com a
liberação de dois elétrons.
- Procedimento Experimental
Os animais foram decapitados 24 h após a última injeção e, imediatamente,
tiveram seus cérebros dissecados sob gelo. O CE foi utilizado para preparar
homogenatos a 10 %. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico
(HCLO4) por 30 s e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a
15.000 rpm. Uma alíquota de 20 μl do sobrenadante foi, então, injetada no
equipamento de HPLC (Figura 10), para a análise química.
Figura 10 - Aparelho de HPLC com detecção de fluorescência e eletroquímica
Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS (M) com
comprimento de 25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 μm, da
Shimadzu-Japão, foi utilizada. A fase móvel utilizada foi composta por tampão
ácido cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido octanosulfônico sódico, 0,69 M
(SOS), como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4 % v/v e
tetrahidrofurano 1,7 % v/v. Dopamina (DA), DOPAC (Ácido diidroxifenilacético
(DOPAC), Ácido homovanílico (HVA), Serotonina (5-HT), Ácido 5-
hidroxiindolacético (5-HIAA) e Noradrenalina (NE) foram eletronicamente
detectados usando um detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu,
Japão) pela oxidação em um eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85 V relativo
a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.
- SOLUÇÕES REAGENTES
• Fase Móvel
Foram pesados 15,75 g de ácido cítrico (grupo química, RJ, Brasil) e
completado para um volume de 400 mL com água puríssima (Milli-Q). Esta
solução foi ajustada para pH 3,0 com hidróxido de sódio 12,5 M (Reagen, RJ
Brasil). A esta solução foi adicionado o SOS 75 mg (Sigma, MO, EUA) e
completado o volume para 471,5 mL com água Milli-Q. Em seguida, foi
procedida a filtração e degaseificação, e posteriormente adição de 20 mL de
acetonitrila (Carlo Erba Reagenti, MI, Itália) e 10 mL de tetrahidrofurano (Sigma,
MO, EUA) para um volume final de 500 mL.
• Ácido Perclórico 0,1 M
Foram adicionados 1,8 mL de ácido perclórico (Sigma, MO, EUA) em um
balão volumétrico e completado o volume para 300 mL.
• Padrões
Os padrões foram preparados em uma concentração final de 4 ng de NE,
dopaminérgico, 5-HT, DOPAC, HVA e 5-HIAA (Sigma, MO, EUA). A partir da
altura ou área dos picos desses padrões, as amostras foram calculadas no
programa Microsolf Excel em um computar PC e os resultados expressos em ng/g
de tecido.
3.11 ANÁLISE BIOQUÍMICA
- Obtenção das amostras: As amostras de sangue foram coletadas do plexo
orbital de ratos em tubos siliconados com gel separador, e submetidas a
centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos para obtenção do soro.
3.11.1 MÉTODOS BIOQUÍMICOS
GLICOSE (TIESTZ, 1970)
• Metodologia: Enzimático - Glicose Oxidase
• Princípio: A glicose oxidase (GOD) catalisa a oxidação da glicose para ácido
glucônico e peróxido de hidrogênio. Através de uma reação oxidativa de
acoplamento catalisada pela peroxidase (POD), o peróxido de hidrogênio formado
reage com 4-aminoantipirina e fenol, formando um complexo de cor vermelha
(antipirilquinonimina), cuja absorbância é medida em 505 nm e a intensidade da cor
é proporcional à concentração da glicose na amostra.
Glicose + O2 + H2O GOD Ácido Glucônico + H2O2
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol POD Antipirilquinonimina + 4 H2O
• Reagentes:
-Reagente de Cor: Tampão Fosfato, fenol, Glicose Oxidase, Peroxidase, 4-
Aminoantipirina, preservativos, estabilizadores e ativadores.
- Padrão: 100 mg/dL;
- conservação entre 2-8 ºC;
- armazenamento bem vedado para evitar evaporação;
- estável entre 15-25 ºC.
• Amostra: Soro, plasma, líquor.
• Técnica: Foram utilizados 3 tubos e procedeu-se da seguinte maneira:
Tubos Branco Padrão Teste
Amostra - - 0,01 mL
Padrão - 0,01 mL -
Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Os reagentes foram misturados e colocados em banho-maria a 37 °C
durante 15 minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao nível do reagente
nos tubos de ensaio. Foram determinadas as absorbâncias do teste e padrão em 505
nm, acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.
• Cálculo:
Método (1) – Abs do Teste/ Abs do Padrão x 100= mg/dL
Método (2) – Abs do Teste x Fator de Calibração= mg/dL
Glicose (mg/dL)= Absorbância do teste x fator
Fator de Calibração = Conc. do padrão / Abs do padrão
• Linearidade: A reação é linear até 400 mg/dL
TRIGLICÉRIDES (TONKS, 1970)
• Metodologia: Enzimático-Trinder
• Princípio: Os triglicerídes são hidrolisados pela lipase lipoprotéica e o
glicerol liberado é fosforilado pela gicerol quinase, formando glicerol fosfato, que é
oxidado a dihidroxiacetona, e água oxigenada por ação da glicerol-3-fosfato oxidase.
Através da reação oxidativa catalisada pela peroxidase, a água oxigenada reage com
a 4-aminoantipirina e ESPAS, produzindo a antipirilquinonimina, cuja absorbância,
medida em 540 nm, é diretamente proporcional à concentração de triglicerídios.
Triglicerídeos + H2O Lipase Glicerol + Ácidos graxos
Lipoprotéica
Glicerol + ATP Glicerol quinase Glicerol-3-Fosfato + ADP
Mg++
Glicerol-3-Fosfato + O 2 G3P-oxidase Fosfato Dihidroxiacetona + H2O2
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + ESPAS peroxidase Antipirilquinonimina + 4 H2O
*ESPAS= N-etil-N(3-sulfopropil)-m-anisidina/surfatante
• Reagentes:
-Reagente de Cor: Tampão Fosfato, Lipase Lipoproteica, ATP, Glicerol Quinase,
Mg++, Glicerol-3-Fosfato Oxidase, 4-Aminoantipirina, Azida Sódica.
- Padrão: 100 mg/dL;
- conservação entre 2-8 ºC;
- armazenamento bem vedado para evitar evaporação;
- estável entre 15-25 ºC.
• Amostra: Soro.
• Técnica: Foram utilizados 3 tubos e procedeu-se como a seguir:
Tubos Branco Padrão Teste
Amostra - - 0,01 mL
Padrão - 0,01 mL -
Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Misturou-se e colocou-se em banho-maria a 37 °C, 10 minutos. O
nível da água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio.
Foram determinadas as absorbâncias do teste e padrão em 510 nm, acertando o zero
com o branco.
• Cálculo:
Método (1)– Abs do Teste/ Abs do Padrão x 100= mg/dL
Método (2)– Abs do Teste x Fator de Calibração= mg/dL
Triglicerídeos (mg/dL)= Absorbância do teste x fator
Fator de Calibração = Conc. do padrão / Abs do padrão
• Linearidade: A reação é linear até 800 mg/dL
• Metodologia: Enzimático-Trinder
• Princípio: Os ésteres do colesterol são hidrolisados pela colesterol esterase
formando colesterol livre que, após oxidação pela colesterol oxidase, forma
peróxido de hidrogênio. Este, reagindo com o fenol e 4-aminoantipirina, através de
copulação oxidativa catalisada pela peroxidase, produz uma quinonimina de cor
vermelha, cuja absorbância, medida em 500 nm, é diretamente proporcional à
concentração de colesterol da amostra.
Ésteres de Colesterol + H2O col. esterase Colesterol + Ácidos graxos
Colesterol + O2 col. oxidase Colest-4-en-ona + H2O2
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol peroxidase Antipirilquinonimina + 4 H2O
• Reagentes de Cor: Tampão Fosfato, Colesterol Esterase, Colesterol Oxidase,
Peroxidase, 4-aminoantipirina, Fenol, Azida Sódica.
- Padrão: 200 mg/dL .Conservar entre 2-8 oC.
• Amostra: Soro.
• Técnica: Foram utilizados 3 tubos e procedeu-se como a seguir:
Tubos Branco Padrão Teste
Amostra - - 0,01 mL
Padrão - 0,01 mL -
Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Misturou-se e colocou-se em banho-maria a 37 °C, 10 minutos. O
nível da água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio.
Foram determinadas as absorbâncias do teste e padrão em 500 nm, acertando o zero
com o branco.
• Cálculo:
Método (1) – Abs do Teste/ Abs do Padrão x 200= mg/dL
Método (2) – Abs do Teste x Fator de Calibração= mg/dL
Colesterol Total (mg/dL)= Absorbância do teste x fator
Fator de Calibração = Conc. do padrão / Abs do padrão
COLESTEROL HDL (TONKS, 1970)
• Metodologia: Enzimático-Trinder
• Princípio: As lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), as
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e os quilomícrons são quantitativamente
precipitados com a mistura de ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésio. Após
centrifugação, o colesterol ligado as lipoproteínas de alta densidade (HDL) é
determinado no sobrenadante por método colorimétrico enzimático.
• Reagentes:
- Reagente de cor: Tampão Fosfato, Colesterol Esterase, Colesterol Oxidase,
Peroxidase, 4-aminoantipirina, Fenol, Azida Sódica;
- Sobrenadante;
- Padrão: 40 mg/dL;
- estável entre 15-25ºC.
• Amostra: Soro.
• Técnica: Em um tubo de ensaio 12 x 75 foram colocados 0,25 mL de soro e
0,25 mL da solução precipitada. Agitou-se vigorosamente durante 30 segundos.
Centrifugou-se a 3500 rpm durante 15 minutos.
Tubos Branco Padrão Teste
Sobrenadante - - 0,1 mL
Padrão - 0,1 mL -
Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Misturou-se e colocou-se em banho-maria a 37 °C, 10 minutos. O nível da
água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Foram
determinadas as absorbâncias do teste e padrão em 500 nm, acertando o zero com o
branco.
• Cálculo:
Método (1) – Abs do Teste/ Abs do Padrão x 40= mg/dL
Linearidade: A reação é linear até 120 mg/dL
ALANINA AMINOTRANSFERASE (ALT/TGP/GPT ) (TONKS, 1970; TIESTZ, 1970)
• Metodologia: Cinética-UV.
• Princípio: A ALT catalisa a transferência do grupo amina da alanina para o
cetoglutarato, com a formação de glutamato e piruvato. Este é reduzido a lactato por
ação da lactato desidrogenase (LDH), enquanto a coenzima NADH é oxidada a
NAD+. A consequente redução da absorbância em 340 ou 365 nm, monitorizada
espectrofotometricamente, é diretamente proporcional à atividade da enzima na
amostra.
L-alanina + α-cetoglutarato ALT Piruvato + L-glutamato
Piruvato + NADH + H+ LDH L- lactato + NAD+
• Reagentes:
- Reagente de Uso: Alfa-cetoglutarato, L-alanina, Azida sódica, Tampão Tris pH
7.8, NADH e LDH. Conservar entre 2-8 oC.
• Amostra: Soro.
• Técnica: Foi pipetado 1,0 mL do Reagente de Uso, em um tubo de ensaio
(12x75), e adcionou-se 0,1 mL de amostra. Homogeneizou-se e transferiu-se para a
cubeta termostatizada e esperar 1 min. Foi feita a leitura da absorbância inicial (A1),
disparando simultaneamente o cronômetro. Repetiu-se a leitura após 2 minutos (A2).
Calculou-se a média das absorbâncias por minuto (ΔA/ min.) e esta foi utilizada no
cálculo.
• Cálculo:
Método (1) : 340 nm= ΔA/ min. x 1746= U/L
Método (2) : 334 nm= ΔA/ min. x 1780= U/L
Método (3) : 365 nm= ΔA/ min. x 3235= U/L
ALT (U/L)= ΔA (Absorbância do teste)/ min. x fator
Fator de Calibração = VT x 1000 / ε x VA x d
VT = volume total do ensaio
1000= conversão de U/mL em U/L
ε = absortividade milimolar do NADH em nm
VA = volume da amostra
d = espessura da solução
Linearidade: A reação é linear até 500 U/L
ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST/TGO/GOT) (TONKS, 1970; TIESTZ, 1970)
Metodologia: Cinética-UV.
Princípio: A AST catalisa a transferência do grupo amina do ácido aspártico
para o cetoglutarato, com formação de glutamato e oxalacetato. Este é reduzido a
malato por ação da malato desidrogenase (MDH), enquanto a coenzima NADH é
oxidada a NAD+. A consequente redução da absorbância em 340 ou 365 nm,
monitorizada espectrofotometricamente, é diretamente proporcional à atividade da
enzima na amostra.
L-aspartato + α-Cetoglutarato AST Oxalacetato + L-glutamato
Oxalacetato + NADH + H+ MDH L-malato + NAD+
• Reagentes:
- Reagente de Uso: Alfa-cetoglutarato, L-aspartato, Azida sódica, Tampão Tris pH
7.8, NADH, LDH e MDH. Conservar entre 2-8 oC.
• Amostra: Soro, plasma.
• Técnica: Pipetou-se 1,0 mL do Reagente de Uso, em um tubo de ensaio
(12x75), e adiciono-se 0,1 mL de amostra. Homogeneizou-se e transferiu-se para a
cubeta termostatizada e esperar 1 min. Foi feita a leitura da absorbância inicial (A1),
disparando simultaneamente o cronômetro. Repetiu-se a leitura após 2 minutos (A2).
Calculou-se a média das absorbâncias por minuto (ΔA/ min.) e esta utilizá-la no
cálculo.
• Cálculo:
Método (1) : 340 nm= ΔA/ min. x 1746= U/L
Método (2) : 334 nm= ΔA/ min. x 1780= U/L
Método (3) : 365 nm= ΔA/ min. x 3235= U/L
AST (U/L)= ΔA (Absorbância do teste)/ min. x fator
Fator de Calibração = VT x 1000 / ε x VA x d
VT = volume total do ensaio
1000= conversão de U/mL em U/L
ε = absortividade milimolar do NADH em nm
VA = volume da amostra
d = espessura da solução
• Linearidade: A reação é linear até 500 U/L
4.0 – ESTUDO HISTOPATOLÓGICO
4.1 – Procedimento experimental
Cérebros de ratos tratados e controles foram submetidos à análise
histopatológica. Após 24 h da última injeção, os animais foram decapitados, os
cérebros removidos e fixados em formalina a 10% por 72 horas. Cortes sagitais,
feitos em intervalos de 1 mm, foram obtidos a partir de um corte inicial ao nível do
quiasma óptico. Para dissecção de coração e fígado, foi feita uma incisão no externo
para abertura da caixa toráxica. Após a abertura, foi realizada a retirada de tais
órgãos, seguindo-se a fixação em formalina a 10% durante 72 horas.
Para estudo micorscópico, secções de 10 μm foram feitas, coradas em
Hematoxilina-Eosina e Nissl ou Violeta de Cresil, e analisadas com auxílio de um
microscópio óptico. As áreas cerebrais foram observadas e classificadas de acordo
com o Atlas de Paxinos & Watson (1986).
Para análise das lesões nas estruturas, foram observados os seguintes
parâmetros: aspectos mormais semelhantes aos controles ou a presença de células
tumefietas, núcleos picnóticos, morte celular e vacuolização.
5.0 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos dados foi acompanhada por um computador PC,
utilizando o programa InsTat. Para comparação de dados não paramétricos foram
utilizados os testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney como testes post hoc. Já nos
dados paramétricos, o teste “t” de Student foi utilizado para comparação de médias
de dois grupos e Análise de Variância (Student-Newman-Keuls como teste post hoc)
para comparações múltiplas. As diferenças foram consideradas estatisticamente
significativas em p< 0,05.
6 - RESULTADOS
6.1 – Teste de atividade locomotora espontânea
Os resultados do teste de atividade locomotora espontânea (ALE) foram
expressos como número de contagens/30 minutos. Como apresentado na Tabela 1
ocorreu um aumento na ALE no 7° dia de tratamento com cocaína nas doses de
10mg/kg e 20mg/kg, correspondendo a um aumento de 51,4 e 88,8%
respectivamente, em relação à atividade registrada no grupo controle (Coc 10 = 611
± 66 e Coc 20 = 762 ± 68 em relação ao controle = 403,5 ± 20). Não ocorreram
alterações significativas em ambas as doses com relação às ações da cocaína no
decorrer do tratamento com Coc 10mg (1° dia pós = 810 ± 49; 7° dia pós = 611 ±
44) e Coc 20mg (1° dia pós = 725 ± 71; 7° dia pós = 762 ± 68).
Os animais tratados com etanol apresentaram uma diminuição significante da
ALE no 7° dia de tratamento apenas com Etanol 2g em relação à atividade
registrada no grupo controle, como visto na tabela 2. (Etanol 2g = 164,9 ± 15,63 e
Etanol 4g = 402,2 ± 25,06 em relação ao controle = 403,5 ± 20). Com relação às
ações do etanol no decorrer do tratamento, observou-se uma dessensibilização
significante da ALE com Etanol 4g no 7o dia em relação ao 1o dia (1° dia pós =
155,9 ± 11,8; 7° dia pós = 402,2 ± 25,06).
Na tabela 3, observa-se que a interação cocaína + etanol não promoveu
alterações significativas na ALE no 7° dia de tratamento em ambas as doses em
relação à atividade registrada no grupo controle (Interação baixas doses = 328,9 ±
23,35 e Interação altas doses = 324,6 ± 10,3 em relação ao controle = 403,5 ± 20).
Não foram observadas alterações significantes na ação da interação em ambas
as doses no decorrer do tratamento.
Tabela 1 - Efeitos da administração repetida de cocaína sobre a atividade
locomotora de ratos
GRUPO 30 minutos antecedentes a administração da droga
30 minutos posteriores a administração da droga
Dia 1 Dia 7 Dia 1 Dia 7
Controle 1025 + 89 814 + 94 399 ± 16,03 403 ± 20
Coc 10 mg/kg 1176 + 83 867 + 83 810 ± 49a 611 ± 66ª
Coc 20 mg/kg 1075 + 37 888 + 47 725 ± 71a 762 ± 68ª
A atividade locomotora espontânea foi medida por 30 minutos antes (pré) e por 30
minutos após a administração (pós) da cocaína nas doses de 10 e 20 mg/kg., i.p. Os
valores representam média ± EPM (n= 14-18 ratos por grupo). a estatisticamente
significante (p< 0,05. Anova e Student-Newman-Keuls como teste post hoc).
Tabela 2 - Efeitos da administração repetida de etanol sobre a atividade
locomotora de ratos
GRUPO 30 minutos antecedentes a
administração da droga 30 minutos posteriores a administração da droga
Dia 1 Dia 7 Dia 1 Dia 7
Controle 1025 + 89 814 + 94 399 ± 16 403 ± 20
Etanol 2g/kg 1069 + 73 704 + 68 222 ± 24a 164 ± 15a
Etanol 4g/kg 1043 + 84 814 + 11 155 ± 11a 402 ± 25b
A atividade locomotora espontânea foi medida por 30 minutos antes (pré) e por 30
minutos após a administração (pós) de etanol 2 e 4g/kg, v.o. Os valores representam
média ± EPM (n= 14-18 ratos por grupo). a estatisticamente significante (p< 0,05.
Anova e Student-Newman-Keuls como teste post hoc) em relação ao controle do
mesmo dia; b (Estatisticamente significante (p< 0,05. Anova e Student-Newman-
Keuls como teste post hoc) em relação ao grupo tratado no primeiro dia.
Tabela 3 - Efeitos da administração repetida de cocaína + etanol sobre a
atividade locomotora de ratos
GRUPO 30 minutos antecedentes a administração da droga
30 minutos posteriores a administração da droga
Dia 1 Dia 7 Dia 1 Dia 7
Controle 1025 + 89 814 + 94 399 ± 16 403 ± 20
Interação baixas doses
905 + 66 670 + 77 407 ± 68 328 ± 23
Interação altas doses
955 + 76 957 + 11 304 ± 16 324 ± 10
A atividade locomotora espontânea foi medida por 30 minutos antes (pré) e por 30
minutos após a administração (pós) de cocaína + etanol nas seguintes combinações
de doses: Interação baixas doses (Cocaína 10mg/kg + etanol 2g/kg) e Interação altas
doses (Cocaína 20mg/kg + etanol 4g/kg). Os valores representam média ± EPM (n=
14-18 ratos por grupo).
6.2 – Efeitos da administração repetida de cocaína, etanol e a combinação
destes sobre as concentrações de DA, DOPAC e 5-HT em CE de ratos.
Os resultados da análise de monoaminas pela técnica de HPLC com detecção
eletroquímica foram expressos em ng/g de tecido. Os resultados das determinações
dos níveis de monoaminas em corpo estriado de ratos tratados por 7 dias com
cocaína nas doses de 10 e 20 mg/kg, i.p. e sacrificados 24 h após a última
administração mostraram um aumento expressivo (Figura 11) nos níveis de
dopamina (controle = 2038 ± 143,3; coc 10 = 5135 ± 572,6 e coc 20 = 4102 ±
660,2). Os níveis de serotonina não foram alterados de maneira significante quando
comparados ao grupo controle.
A Figura 12 mostra que o etanol promoveu uma elevação dos níveis de
dopamina (controle = 2038 ± 143,3; Etanol 2g = 3189 ± 141,3 e Etanol 4g = 3960 ±
273, p< 0,05), enquanto seus metabólitos não sofreram alterações significantes. Por
sua vez, no que se refere aos níveis de 5-HT, nenhuma alteração significante foi
observada quando comparados ao controle.
Com relação a associação entre cocaína e etanol, foi visto na figura 13 um
aumento significante dos níveis de dopamina em relação ao controle (controle =
2038 ± 143,3; Interação baixas doses = 4314 ± 508,6 e Interações altas doses = 4267
± 461,6). Quanto aos metabólitos, a análise eletroquímica revelou uma diminuição
nos níveis de DOPAC em ambas as doses, de forma dose-dependente (controle =
2380 ± 283,6; Interação baixas doses = 1979 ± 296,3 e Interação altas doses = 1121
± 92,13). Já quanto a 5-HT, um aumento nos níveis foi detectado com a interação
altas doses quando comparado ao controle (510,0 ± 46), bem como a Interação
baixas doses (471,3 ± 171,3) e Interação altas doses (813,7 ± 18,81).
Figura 11 - Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos tratados com cocaína
0
2500
5000
7500
DA DOPAC 5-HT
****
ControleCocaína 10mgCocaína 20mg
ng/g
de
teci
do
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com cocaína 10 e 20 mg/kg, i.p. e Etanol 2 e 4 g/Kg v.o., sendo decapitados 24 h após a última injeção. Os níveis dos neurotransmissores e metabólitos foram determinados em HPLC. Os valores representam a x + EPM com (n) de 6 a 12 animais em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. *p<0,01
Figura 12 - Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos tratados com etanol
0
1000
2000
3000
4000
5000
DA DOPAC 5-HT
**
**ControleEtanol 2gEtanol 4g
ng/g
de
teci
do
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com Etanol 2 e 4 g/Kg v.o., sendo decapitados 24 h após a última injeção. Os níveis dos neurotransmissores e metabólitos foram determinados em HPLC. Os valores representam a x + EPM com (n) de 6 a 12 animais em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. *p<0,01
Figura 13 - Concentrações de DA, DOPAC e 5-HT medidas em CE de ratos
tratados com cocaína + etanol
0
1000
2000
3000
4000
5000
DA DOPAC 5-HT
** **
*
ControleInt baixas dosesInt altas doses
**ng/g
de
teci
do
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com cocaína 10mg + etanol 2g (interação baixas doses) e Cocaína 20 mg + etanol 4g (interação altas doses), sendo decapitados 24 h após a última injeção. Os níveis dos neurotransmissores e metabólitos foram determinados em HPLC. Os valores representam a x + EPM com (n) de 6 a 12 animais em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. ** VS controle p< 0,01 e * VS controle p< 0,05
6.3 – Efeitos da administração repetida de cocaína, etanol e a associação destes
sobre os receptores D2-símile em CE de ratos
Os resultados da determinação do número máximo de receptores (Bmax) e
constante de dissociação (Kd) foram expressos em fmoles/mg de proteína e nM,
respectivamente. Os valores representam média ± EPM com o número de
experimentos feitos em duplicata em parênteses.
Os resultados da densidade de receptores D2-símile em corpo estriado de
ratos tratados com coc 10 e 20 mg/kg durante 7 dias são mostrados na Tabela 4 e
Figura 14. Ocorreu uma diminuição no Bmax de 56,85 e 56,14% respectivamente
com as doses de 10 e 20 mg/kg (controle = 312,4 ± 35; coc 10 = 134,8 ± 7 e coc 20
= 137,4 ± 6,7). Com relação ao Kd não foi observada nenhuma alteração (Controle =
0,55 ± 0,11; Coc 10 = 0,83 ± 0,02 ; Coc 20 = 1,12 ± 0,19 ).
O número de receptores D2 estriatais dos animais tratados com etanol 2 e 4g
v.o. pode ser visualizada na Tabela 4 e Figura 15. Foi vista uma diminuição
significante no Bmax somente com etanol 4g (Controle = 312,4 + 35; Etanol 2g =
239 + 18; Etanol 4g = 164 + 18), sem alterações no Kd (controle = 0,55 ± 0,11;
Etanol 2g = 1,11 + 0,33; Etanol 4g = 1,7 ± 0,39).
Com relação a associação cocaína + etanol, a Tabela 4 e figura 16 mostram
uma diminuição significativa da densidade de receptores D2-símile em corpo
estriado de ratos tratados com a associação em ambas as doses (controle = 312,4 ±
35; Interação baixas doses = 161 ± 24 e Interação altas doses = 74 ± 4), não sendo
observadas alterações nos valores de Kd.
TABELA 4 - Efeitos da administração de cocaína e etanol na densidade (Bmax) e Kd dos receptores dopaminérgicos D2-símile em CE de ratos. Grupos D2-SÍMILE Bmax Kd Controle 312,4 + 35 (7) 0,55 + 0,11 (3) Etanol 2g 239 + 18 (5) 1,11 + 0,33 (3) Etanol 4g 164 + 18 (7)** 1,7 + 0,39 (3) Cocaína 10mg 134,8 + 7 (4)** 0,83 + 0,023(3) Cocaína 20mg 137,4 + 6,7 (5)** 1,12 + 0,19 (3) Interação baixas doses 161 + 24 (3)* 1,73 + 0,82 (3) Interações altas doses 74 + 4 (3)** 1,73 + 0,68 (3)
Animais foram tratados diariamente por 1 semana com cocaína 10 e 20 mg/kg, i.p., etanol 2 e 4 g/kg v.o. e interação cocaína 10mg + etanol 2g (baixas doses) e interação cocaína 20mg + etanol 4g (interação altas doses). O Scatchard dopaminérgico foi realizado com [3H]-spiroperidol e os resultados expressos em fmol/mg de proteína e nM em relação ao Bmax e Kd, respectivamente. Os valores representam as x ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA e o Student-Newman-Keuls como teste post hoc. *p<0,05 comparado com o controle. **p< 0.01 comparado com controles.
Figura 14 - Efeitos da cocaína nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de ratos
contro
leCoc1
0Coc2
00
100
200
300
400
** **
fmol
/mg
de p
rote
ína
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com cocaína 10 e 20g/Kg i.p., sendo decapitados 24 h após a última injeção. O Scatchard dopaminérgico foi realizado com [3H]-spiroperidol e os resultados expressos em fmol/mg de proteína em relação ao Bmax. Os valores representam a x + EPM do no de experimentos em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. **p<0,01
Figura 15 - Efeitos do etanol nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de rat
contro
le
etanol 2
g
etanol 4
g0
100
200
300
400
**
fmol
/mg
de p
rote
ína
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com Etanol 2 e 4 g/Kg v.o., sendo decapitados 24 h após a última injeção. O Scatchard dopaminérgico foi realizado com [3H]-spiroperidol e os resultados expressos em fmol/mg de proteína em relação ao Bmax. Os valores representam a x + EPM do no de experimentos em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. **p<0,01
Figura 16 - Efeitos da associação cocaína + etanol nos receptores dopaminérgicos D2-símile sobre os valores de Bmax em estriado de ratos
contro
le
int baix
dose
int alt d
ose0
100
200
300
400
*
**
fmol
/mg
de p
rote
ína
Os animais foram tratados diariamente por 7 dias com cocaína 10mg + etanol 2g (intertação baixas doses) e cocaína 20mg + etanol 4 g (interação altas doses), sendo decapitados 24 h após a última injeção. O Scatchard dopaminérgico foi realizado com [3H]-spiroperidol e os resultados expressos em fmol/mg de proteína em relação ao Bmax. Os valores representam a x + EPM do no de experimentos em cada grupo experimental. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA e teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc. *p<0,05. **p<0,01.
6.4 – Efeitos da administração repetida de cocaína, etanol e a associação
destes sobre os receptores M1+M2 símile em CE
Os resultados da determinação do número máximo de receptores (Bmax) e
constante de dissociação (Kd) foram expressos em fmoles/mg de proteína e nM,
respectivamente. Os números mostrados nos resultados dos dados representam
média ± EPM e em parênteses está representado o número de experimentos feitos
em duplicata.
A Tabela 5 mostra os resultados da densidade de receptores M1+M2 símile
em corpo estriado de ratos tratados com coc 10 e 20 mg/kg, etanol 2 e 4 g/kg e a
associação destes durante 7 dias. Não foram observadas alterações significativas nos
valores de Bmax (controle = 427,33 ± 56; coc 10 = 410,1 ± 10; coc 20 = 399,1 ± 43;
Et 2g = 450 ± 50; Et 4g = 400 ± 60; Int baixas doses = 397 ± 20 e Int altas doses =
402 ± 3) nem na constante de dissociação Kd nos grupos tratados em relação ao
controle
TABELA 5 - Efeitos da administração de cocaína e etanol na densidade dos receptores muscarínicos em CE de ratos. Grupos (M1 + M2)-símile
Bmax Kd
Controle 427,33 + 56 (3) 1,29 + 0,15 (3)
Etanol 2g 450 + 50 (3) 1,34 + 0,4 (3) Etanol 4g 400 + 60 (3) 1,1 + 0,95 (3) Cocaína 10mg 410,1 + 10 (3) 1,23 + 0,02 (3) Cocaína 20mg 399,1 + 43 (3) 1,10 + 0,34 (3) Interação baixas doses 397 + 20 (3) 1,04 + 0,40 (3) Interações altas doses 402 + 3 (3) 0,98 + 0,52 (3)
Animais foram tratados diariamente por 1 semana com cocaína 10 e 20 mg/kg, i.p., etanol 2 e 4 g/kg v.o. e interação cocaína 10mg + etanol 2g (baixas doses) e interação cocaína 20mg + etanol 4g (interação altas doses), sendo as medidas realizadas 24 h após a última administração. O Scatchard muscarínico foi realizado com [3H]-NMS e os resultados expressos em fmol/mg de proteína e nM em relação ao Bmax e Kd, respectivamente. Os dados foram expressos como média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA e o teste Student-Newman-Keuls como teste post hoc quando p<0,05.
6.5 – Efeitos da administração repetida de cocaína, etanol e a associação destes
sobre os níveis de enzimas séricas
Os resultados da determinação dos níveis de enzimas séricas foram expressos
em mg/dL ou U/L, respectivamente. Os números mostrados nos resultados
representam média ± EPM e em parênteses está representado o número de
experimentos feitos.
A Tabela 6 mostra os resultados dos níveis séricos de TGO, TGP colesterol
total em ratos tratados com coc 10 e 20 mg/kg, etanol 2 e 4 g/kg e a associação
destes durante 7 dias. Os animais tratados com cocaína apresentaram em ambas as
doses elevações dos níveis de TGO (controle = 106 ± 10; coc 10 = 131 ± 11; coc 20
= 144 ± 9) enquanto que os animais tratados com a associação altas doses
apresentaram diminuição significativa (controle = 114 ± 7; Int altas doses = 101
± 8).
Em relação aos níveis de TGP, a cocaína promoveu, em ambas as doses,
diminuição significativa dos níveis séricos desta enzima (controle = 54 ± 7; coc 10 =
33 ± 3; coc 20 = 34 ± 2), o mesmo ocorrendo com os animais que receberam a
associação altas doses (controle = 51 ± 7; int alt dose = 32 ± 3). Com relação ao
colesterol total, ocorreu uma diminuição significativa dos níveis com os animais
tratados com cocaína (controle = 66,8 ± 3; coc 10 = 53 ± 4; coc 20 = 43 ± 3), etanol
4g (controle = 69 ± 2; Et 4g = 43 ± 3) e a associação destes (controle = 69 ± 4; int
baix dose = 52 ± 4; int alt dose = 52 ± 3).
A Tabela 7 mostra os resultados dos níveis séricos de TRI e HDL em ratos
tratados com coc 10 e 20 mg/kg, etanol 2 e 4 g/kg e a associação destes durante 7
dias. Os animais tratados com Coc 10 (controle = 56 ± 3; coc 10 = 42 ± 4)
apresentaram redução dos níveis de TRI, sendo que Coc 20 promoveu efeito
contrario (controle = 36 ± 6; coc 20 = 51 ± 4). Os animais tratados com Et 4g
apresentaram um aumento significativo dos níveis de TRI (controle = 46 ± 3; Et 4g
= 60 ± 3), enquanto que os animias tratados com a associação apresentaram
diminuição dos níveis (controle =74 ± 7; int bai dose = 53 ± 4; int alt dose = 49 ± 4).
Em relação ao HDL, todos os grupos apresentaram diminuição significativa dos
níveis séricos desta lipoproteína (controle = 29 ± 1; coc 10 = 22 ± 2; coc 20 = 21 ±
2; Et 2g = 24 ± 1; Et 4g = 20 ± 2; Int bai dose = 23 ± 2; Int alt dose = 23 ± 2).
Tabela 6 – Efeitos da administração de cocaína, etanol e a associação destes nos
níveis de TGO, TGP e Colesterol total
Grupo TGO TGP Col .T
Cocaína pré 106 + 10(9) 54 + 7(10) 66,8 + 3(9) 10mg/kg pos 131 + 11(10)* 33 + 3(10)* 53 + 4(10)* Cocaína pré 123 + 9(11) 51 + 7(9) 69+ 3(10) 20mg/kg pos 144 + 9(10)** 34 + 2(11)* 43 + 3(10)*** Etanol pré 139 + 7(10) 43 + 6(9) 60 + 1(10) 2g/kg pos 133 + 6(9) 47 + 6(9) 51 + 5(9)
Etanol pré 142 + 6(10) 48 + 6(10) 69 + 2(9) 4g/kg pos 127 + 7(9) 45 + 6(8) 43 + 3(9)*** Interação pré 111 + 6(10) 40 + 3(7) 69 + 4(9) Baixa dose pos 110 + 6(9) 40 + 3(11) 52 + 4(10)* Interação pré 114 + 7(10) 51 + 7(10) 70 + 4(11) Alta dose pos 101 + 8(9)* 32 + 3(9)* 52 + 3(9)* Os animais foram tratados diariamente durante 7 dias com cocaína (10 e 20mg/kg, i.p.), etanol (2 e 4 g/kg, v.o.) e as associações cocaína 10mg + etanol 2g (interação baixas doses) e cocaína 20mg + etanol 4g (interação altas doses) ou água destilada. O sangue dos animais foi coletado 24 h após a última administração das drogas, pelo plexo orbital, para análise bioquímica. Os dados em mg/dL ou U/L são representados como média + EPM do número de experimentos mostrado em parênteses. Para a análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Student-Newman-Keuls como post hoc. *p<0,05;**p<0,01;***p<0,001
Tabela 7 – Efeitos da administração de cocaína, etanol e a associação destes nos
níveis de Triglicerídeos e HDL
Grupos Tri HDL
Cocaína pré 56 + 3(8) 29 + 1(10) 10mg/kg pos 42 + 4(8)** 22 + 2(10)* Cocaína pré 36 + 6(7) 29 + 1(11) 20mg/kg pos 51 + 4(10)* 21 + 2(10)* Etanol pré 60 + 10(9) 31 + 1(10) 2g/kg pos 54 + 5(8) 24 + 1(10)*
Etanol pré 46 + 3(9) 29 + 1(10) 4g/kg pos 60 + 3(8)** 20 + 2(9)* Interação pré 74 + 7(11) 28 + 1(11) Baixa dose pos 53 + 4(10)* 23 + 2(10)* Interação pré 74 + 5(7) 29 + 1(10) Alta dose pos 49 + 4(8)** 23 + 2(9)*
Os animais foram tratados diariamente durante 7 dias com cocaína (10 e 20mg/kg, i.p.), etanol (2 e 4 g/kg, v.o.) e as associações cocaína 10mg + etanol 2g (interação baixas doses) e cocaína 20mg + etanol 4g (interação altas doses) ou água destilada. O sangue dos animais foi coletado 24 h após a última administração das drogas, pelo plexo orbital, para análise bioquímica. Os dados em mg/dL ou U/L são representados como média + EPM do número de experimentos mostrado em parênteses. Para a análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Student-Newman-Keuls como post hoc. *p<0,05;**p<0,01;***p<0,001
6.5 – Análise histopatológica de animais tratados com cocaína, etanol e a
associação destes
Os animais tratados com cocaína (10 e 20mg/kg), etanol (2 e 4 g/kg) e as
associações cocaína 10mg + etanol 2g (interação baixas doses) e cocaína 20mg +
etanol 4g (interação altas doses) não apresentaram alterações nos estudos
histopatológicos, feitos nas estruturas cerebrais.
Com relação ao músculo cardíaco, a cocaína em ambas as doses promoveu
congestão e edema intersticial, mas sem necrose. Os animais tratados com etanol nas
doses estudadas apresentaram alterações histopatológicas semelhantes ao grupo
tratado com cocaína, porém estas alterações se mostraram mais intensas. Os animais
tratados com a interação (em ambas as doses) também apresentaram no músculo
cardíaco edema acompanhado de congestão, mas sem necrose evidente (figura 17).
O estudo histopatológico do fígado dos animais tratados com cocaína
mostrou que, no grupo Coc 10mg ocorreu dilatação de sinusóides (congestão)
acompanhada de uma ocorrência difusa de aglomerados linfóides em espaços
portais. Já com o grupo Coc 20, foi observada uma intensificação da lesão, com
edema, aglomerado de células inflamatórias (linfócitos) no interstício (necrose),
células com citoplasma mais claro próximo a veia centrolobular e presença de
microinfiltrados no interstício. No grupo tratado com etanol 2g/kg, foi observada
microvesiculação com áreas de degeneração mais hidrófila, congestão e dilatação
dos seios.
Os animais tratados com etanol 4g/kg apresentaram no tecido hepático
intensificação da lesão com agregados linfóides, congestão e dilatação sinusóide e
presença de área de degeneração hidrófita (perda de coloração do citoplasma) em
estágio inicial. Quanto ao grupo tratado com as interações, ocorreu uma
potencialização da promoção de lesões em relação aos tratamentos com as drogas
individuais. Os animais tratados com a interação em baixas doses apresentaram
congesta, hipertrofia e hiperplasia das células de Kupfer, microagregados de células
mononucleares em torno da veia centrolobular no interstício e congestão. Por sua
vez, o grupo tratado com a interação em altas doses apresentou no tecido hepático
Congestão nítida, degeneração mais acentuada dos hepatócitos que nos demais
grupos estudados, alguns hepatócitos com núcleo hipercromático e áreas de
degeneração hidrófita em torno da região centrolobilar (figura 18).
a b
c d
e f
g
Figura 17 – a) Músculo cardíaco normal de ratos tratados com salina. b e c) Músculo cardíaco de ratos tratados com cocaína 10 e 20mg respectivamente. d e e) Músculo cardíaco de ratos tratados com etanol 2 e 4g/kg respectivamente. f e g) Músculo cardíaco de animais tratados com interação baixas doses e altas doses respectivamente (aumento de 200 x).
a b
d c
e f
g Figura 18 – a) Fígado normal de ratos tratados com salina. b e c) Fígado de ratos tratados com cocaína 10 e 20mg respectivamente. d e e) Fígado de ratos tratados com etanol 2 e 4g/kg respectivamente. f e g) Fígado de animais tratados com interação baixas doses e altas doses respectivamente (aumento de 200 x).
7 – DISCUSSÃO
Este trabalho teve como objetivo estudar as alterações neurobiológicas (níveis
de monoaminas – DA, DOPAC e 5-HT, receptores muscarínicos e dopaminérgicos
D2), bioquímicas e histopatológicas desencadeadas pelo uso sub-crônico da cocaína,
etanol e a associação destes em CE de ratos 24 h após a retirada das drogas em
animais sensibilizados comportamentalmente.
Neurônios dopaminérgicos mesolímbicos que se originam na ATV e se
projetam no Núcleo accumbens e outras áreas do mesencéfalo são substratos bem
conhecidos para a recompensa e o reforço e são também importantes alvos para a
ação da cocaína, cocaetileno e outros psicoestimulantes. Muitos estudos descrevem
os efeitos da administração de drogas nesta via (Wise & Bozarth, 1987; Koob &
Bloom, 1988; Kuhar et al., 1991) sendo que os mais recentes, feitos em animais,
observaram os efeitos que ocorrem com a retirada após administração repetida de
cocaína nos parâmetros bioquímicos associados com neurônios mesolímbicos. Os
resultados mostraram mudanças importantes e prolongadas nos neurônios durante o
período de retirada. Alterações nos neurotransmissores, receptores ou enzimas
freqüentemente refletem algumas modificações gerais ou perturbações e isto pode
criar um neurônio anormal. Estas mudanças podem ser similares àquelas que
ocorrem em humanos durante a retirada após um uso crônico e, dessa forma, auxiliar
no entendimento das bases ou alguns aspectos do desejo e recaída ao uso de drogas
(Kuhar et al., 1996).
Nos nossos experimentos, o período de retirada foi de 24 h, período este que
deve ser entendido como o tempo decorrido após o último dia de tratamento com
cocaína, etanol e a associação destes, tendo o tratamento a duração de 7 dias, o que
não implica necessariamente em uma síndrome de abstinência fisiológica ou
comportamental.
A administração continuada de psicoestimulantes em roedores resulta em um
aumento progressivo na resposta locomotora estimulante a uma subseqüente dose
adicional do psicoestimulante (Robinson e Becker 1986; Kalivas e Stewart 1991).
Este fenômeno é referido como sensibilização comportamental e é utilizado como
modelo animal para o aumento progressivo da disforia, ansiedade e paranóia que
freqüentemente estão associados com o abuso crônico de psicoestimulantes (Segal e
Weinstock 1983; Post e Weiss 1988). Esta sensibilização à cocaína pode ser
produzida por uma única exposição à droga e é de longa duração (Post & Rose,
1976).
Os nossos resultados demonstraram que a cocaína apresentou uma atividade
estimunte do sistema nervoso central, visto que houve um aumento na atividade
locomotora produzida pela cocaína no 7° dia em relação ao aumento produzido no
1° dia. O aumento no 7° dia foi significante em relação ao 1° dia de tratamento, não
havendo diferenças entre os resultados do controle, sendo este um dos critérios para
se determinar uma sensibilização comportamental. A literatura relata que esta
sensibilização comportamental acarreta várias modificações principalmente no SNC.
Neste trabalho em particular, o que se tentou avaliar, utilizando ratos tratados
durante 7 dias e submetidos a um período de 24 h de retirada da droga, foi se tais
modificações citadas na literatura persistem após este período de retirada.
O aumento observado na ALE, também foi observado por outros
pesquisadores e usado como critério para determinação da sensibilização
comportamental. Pierce et al., 1995, utilizando cocaína 15 mg/kg, observaram que a
resposta comportamental à droga no 7° dia de tratamento foi aproximadamente o
dobro daquela vista no 1° dia de administração. Shimada et al., 1997, estudaram a
ALE durante 8 dias e notaram um aumento progressivo causado pela administração
repetida da droga. No presente trabalho, observou-se que a associação cocaína +
etanol em ambas as doses não promoveu diminuição significante da ALE nos
animias tratados em relação ao grupo controle. Este fato pode ser explicado pela
associação da cocaína, revertendo a ação depressora do etanol, e pela possível
formação do cocaetileno, que também atuaria estimulando a atividade locomotora e
diminuiria, assim, as ações depressoras do etanol.
A administração de cocaetileno em ratos promove alterações comportamentos
tais como aumento da atividade locomotora, excitação das respostas ativas e
sensibilização contexto-dependente (Katz et al., 1992; Prinssen et al., 1996;
Schechter et al., 1995). Similarmente, o cocaetileno produz em humanos uma
miríade de efeitos subjetivos, incluindo euforia, semelhante àquela produzida pela
cocaína (McCance et al., 1995; Perez-Reyes et al., 1992). Trabalhos demonstram
ainda que ratos Long-Evans LE apresentam menor sensibilidade comportamental
para o cocaetileno em relação a ratos Sprague-Dawley SD (Horowitz et al., 1997).
Este fato é particularmente intrigante pelo fato de não ocorrerem diferenças na
sensibilidade de comportameto com a cocaína (Horowitz et al., 1997). Os fatores
responsáveis pela variação de responsividade para o cocaetileno não são conhecidos,
mas podem envolver: 1- diferenças na biodisponobilidade do cocaetileno ou, 2-
diferenças na transmissão dopaminérgica e serotonérgica em regiões discretas do
cérebro mediando atividades comportamentais.
Muitas hipóteses foram sugeridas para justificar esta sensibilização,
incluindo: aumento da liberação de dopamina (Robinson & Becker, 1986),
dessensibização de autoreceptores dopaminérgicos (Kalivas et al., 1988, Henry et
al., 1989, Ackerman & White, 1990) e alterações dopaminérgicas pós-sinápticas
(Memo et al., 1981). Usando medidas in vivo da transmissão dopaminérgica, foi
mostrado que a resposta estimulatória motora aguda a psicoestimulantes é
acompanhada por um aumento extracelular de dopamina na área tegumentar ventral,
núcleo accumbens, corpo estriado e córtex pré-frontal (Sharp et al., 1987; Di Chiara
e Imperato, 1988; Bradberry et al., 1989; Carboni et al., 1989; Kuczenski e Segal
1989; Moghaddam et al., 1990). Similarmente, a sensibilização da atividade
locomotora produzida pela administração repetida de psicoestimulantes a roedores
está associada com o aumento na concentração de dopamina extracelular observado
na área tegumentar ventral, núcleo accumbens e corpo estriado após o uso de uma
dose extra do psicoestimulante (Robinson et al., 1988; Akimoto et al., 1990;
Kazahaya et al., 1989; Pettit et al., 1990, Kalivas e Duffy 1990; 1993a,b; Patrick et
al., 1991; Parsons e Justice 1993). A alteração pré-sináptica na liberação de
dopamina é acompanhada por um aumento na responsividade do receptor D1 no
Núcleo accumbens (Higashi et al., 1989; Henry e White, 1991). Estas alterações pré
e pós-sinápticas provêm de evidências primárias da hipótese de que o aumento da
transmissão dopaminérgica no Núcleo accumbens e corpo estriado é um importante
substrato na mediação da sensibilização comportamental a psicoestimulantes.
A sensibilização comportamental esta relacionada com alterações na
plasticidade sináptica e, de fato, compartilha algumas propriedades com a
potenciação que ocorre em longo prazo (long-term potenciation), o tipo de
plasticidade sináptica mais bem conhecido. Muitas modificações associadas com a
indução da sensibilização comportamental por estimulantes psicomotores, incluindo
modificações neuroquímicas, eletrofisiológicas, moleculares e morfológicas foram
identificadas. Além da importância para a neurociência básica, a sensibilização
comportamental tem também relevância clínica. Várias evidências sugerem que a
sensibilização exerce um importante papel no abuso humano da cocaína. Em
particular, a sensibilização comportamental pode contribuir para o intenso desejo,
alta taxa de recaída, e psicose paranóica associada com o abuso da cocaína.
A ação primária da cocaína é sua interferência com o transporte de dopamina,
NE e 5-HT (Boja e Mell, 1998; Gawin, 1991; Feldman et al., 1997). A cocaína
parece não produzir liberação, mas sim atuar aumentando os níveis intersinápticos
dos neurotransmissores pelo bloqueio da sua recaptação (Boja e Mell, 1998; Gawin
1991; Feldman et al., 1997). Esta elevação nos níveis de neurotransmissores
intersinápticos, especialmente a dopamina, pode produzir os efeitos de desejo pelo
uso da droga. Boja e Mell, 1998 detalham os efeitos da cocaína no transportador de
dopamina (DAT). O DAT consiste em uma estrutura que apresenta sítios de ligação
para uma molécula de dopamina, cloreto e dois íons sódio. Quando estes compostos
estão ligados, o transportador sofre uma alteração conformacional, liberando
dopamina dentro do neurônio pré-sináptico. Ao se ligar, tanto cocaína como
cocaetileno promovem uma inibição deste transporte. Esta inibição do complexo
DAT pode resultar em um aumento da concentração de dopamina no espaço
extracelular de até 100 vezes (Carlson, 1998).
As propriedades de reforço podem ser mediadas por um aumento de
dopamina no Núcleo accumbens (De Wit & Wise, 1977). Injeções sistêmicas e
intracerebrais de cocaína aumentam a dopamina extracelular no Núcleo accumbens e
no córtex pré-frontal (Bradberry & Roth, 1989; Church et al., 1987; Hernandez &
Hoebel, 1988; Hernandez et al., 1988; Hurd & Ungerstedt, 1989; Moghaddam &
Bunney, 1989). Estes efeitos parecem ser independentes das propriedades
anestésicas locais da droga, pois injeções de lidocaína (um anestésico local) no
acumbens não provocam a liberação de dopamina (Hernandez et al., 1991).
Neste trabalho foi observado que 24 h após a última administração de
cocaína, os níveis de dopamina permaneceram elevados em ambas as doses
administradas de cocaína, não ocorrendo alterações significantes nos seus
metabólitos, DOPAC e HVA. Também não foram observadas alterações
significantes nos níveis de serotonina (5-HT). O aumento da concentração de
dopamina durante o tratamento com cocaína em homogenatos de corpo estriado é
citado na literatura, entretanto, os resultados com relação à retirada da droga, ainda
são controversos. Alguns pesquisadores encontraram uma persistência no aumento
desta monoamina, enquanto outros observaram níveis diminuídos ou inalterados
após 24 h de retirada.
Kalivas et al., (1993) mediram tanto o efluxo de dopamina como a atividade
locomotora simultaneamente nos mesmos animais e encontraram uma correlação
entre mudanças nestas duas medidas, onde aumentaram após um período de
tratamento repetido com cocaína. Em um estudo posterior, sendo examinado mais
cuidadosamente o tempo de curso dos dois efeitos, Kalivas e Duffy, 1993,
demonstraram que, após um regime de tratamento de 5 dias com cocaína 15 mg/kg,
a atividade locomotora foi aumentada e se observou uma persistência nos níveis
aumentados de dopamina 24 h após a administração da última dose do tratamento.
Além disso, níveis similares de aumento de atividade locomotora foram observados
4, 10 e 20 dias após o tratamento com uma dose teste. Porém, níveis elevados de
dopamina no Núcleo accumbens, em resposta à injeção de cocaína, foram
observados apenas 10 e 20 dias no pós-regime, mas não nos primeiros dias de teste.
Um estudo feito por Koob et al., 1987, também observou mudanças no efluxo
e nos níveis basais de dopamina induzidos pela droga, e níveis basais de dopamina
seguindo o tratamento repetido com cocaína. Este estudo mostrou que os níveis
basais da dopamina foram aumentados no 1° dia de tratamento seguindo um regime
de administração de cocaína 10 e 30 mg/kg, por 10 dias, nos ratos. Sete dias após o
término do regime de tratamento repetido com cocaína, os níveis de dopamina
retornaram àqueles observados nos animais tratados com salina.
Em contraposição, Alburges et al., 1996, ao monitorarem a concentração de
monoaminas no SNC de ratos usando a técnica de HPLC-EC, seguindo um esquema
de tratamento de 5, 10, 15, 20 e 25 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia, por 21 dias,
encontraram que 12 horas após a última administração de cocaína, as concentrações
de monoaminas corticais e estriatais e seus metabólitos não foram significantemente
diferentes dos animais tratados com salina.
Com relação aos metabólitos DOPAC e HVA, nossos resultados não
demonstraram alterações significantes nas suas concentrações. Estes achados estão
de acordo com os de Yeh e De Souza, que ao tratarem animais com cocaína (20
mg/kg, 2 vezes ao dia, por 8 dias) ou salina observaram que 1, 8, 15 ou 48 dias após
a última injeção de cocaína, as concentrações de NE, DA, 5-HT e seus metabólitos
no córtex frontal, hipocampo, corpo estriado, hipotálamo, mesencéfalo, tronco
encefálico e medula espinhal não foram significantemente diferentes daquelas
encontradas nos animais tratados com salina em nenhum dos períodos de retirada
examinados.
Pouco é conhecido sobre o exato mecanismo pelo qual a cocaína bloqueia a
recaptação de outras monoaminas. Acredita-se que a molécula de cocaína pode
interagir com o transporte de serotonina no sítio de ligação da imipramina (Gawin,
1991). Foi mostrado que a cocaína tem uma afinidade similar para todos os três
sistemas monoaminérgicos, embora existam algumas evidências de que a cocaína
tenha uma menor afinidade pela 5-HT do que pela dopamina (Feldman et al., 1997),
o que poderia explicar o fato do presente trabalho não ter visualizado alterações
significativas nos níveis de serotonina (5-HT) e de seu metabólito 5-HIAA. Em
oposição, a associação cocaína 20mg + etanol 4g (interação altas doses) promoveu
uma elevação significante dos níveis de serotonina (5-HT), o que provavelmente se
explica pela formação in vivo do cocaetileno, que atuaria potencializando as ações
da cocaína no bloqueio da recaptação deste neurotransmissor.
É sabido que tanto a cocaína como o cocaetileno atuam no mecanismo de
recaptação mediado pela proteína transportadora de 5-HT (Akunne et al., 1992; Ritz
et al., 1990; Rudnick & Wall, 1991). Este transportador de 5-HT foi clonado
(Blakely et al., 1991; Hoffman et al., 1991) e sua atividade é inibida pela cocaína
(Ramamoorthy et al., 1993).
Nossos resultados obtidos em relação aos níveis de monoaminas e
metabólitos indicam que um período de retirada de 24 horas pode não ser suficiente
para o início da síndrome de abstinência, pelo menos em ratos, pois o que foi visto
neste período de retirada é que os neurotransmissores continuam com seus níveis
elevados, o que é uma característica do uso repetido da droga e não da síndrome de
abstinência, onde ocorrem sinais e sintomas indicativos de uma disfunção
(diminuição) serotonérgica e dopaminérgica. Portanto, parece que o que foi
evidenciado neste estudo constitui indicativo de uma permanência no bloqueio da
recaptação das monoaminas após 24 horas de retirada.
A administração simultânea de cocaína e etanol resulta na formação de um
metabólito farmacologicamente ativo da cocaína, o cocaetileno (Rafla et al., 1979).
Estudos mostram que o cocaetileno é sintetizado in vivo pelas ações de enzimas
carboxilesterases presentes no fígado tanto em ratos como em humanos (Boyer et
al., 1992; Dean et al., 1991). O cocaetileno, assim como a cocaína, se liga ao
transportador de dopamina no parênquima cerebral inibindo a recaptação de
dopamina em neurônios pré-sinápticos (Hearn et al., 1991; Jatlow et al., 1991). Estes
resultados corraboram com os resultados obtidos nos nossos experimentos, onde se
observa um aumento significante dos níveis de dopamina nos animais tratados com a
associação cocaína + etanol em ambas as doses. Esta elevação dos níveis de
dopamina pode estar relacionada tanto com as ações da cocaína como com a
formação in vivo do cocaetileno.
Em contraste com a cocaína, o cocaetileno apresenta uma afinidade
relativamente baixa pelo transportador de serotonina (5-HT), sendo, portanto, suas
ações mais específicas no eixo dopaminérgico em relação ao composto original. No
presente trabalho, a associação cocaína 20mg + etanol 4g promoveu um aumento
dos níveis de serotonina (5-HT), o que não ocorreu com as drogas utilizadas
isoladamente.
Neste trabalho foi observado que 24 horas após a retirada de cocaína, a
densidade dos receptores D2-símile apresentou-se diminuída no corpo estriado de
ratos nas duas doses estudadas (10 e 20 mg/kg. Segundo Hamdi & Prasad (1993). A
downregulation pode ser explicada pelo aumento da concentração dopamina no
terminal sináptico, induzido pela cocaína.
O receptor D2 parece ter um papel crucial no desenvolvimento da
dependência. Acredita-se que ele tem uma importante função no desejo e na
administração compulsiva da droga. O efeito da administração crônica da cocaína
nos receptores D2 é o aumento da densidade no tubérculo olfatório, núcleo
accumbens rostral e caudado-putamen (Katz et al., 1999).
O receptor D2 pode ser localizado pré e pós-sinápticamente, sendo que a
densidade dos pós-sinápticos é maior que a dos pré-sinápticos. A dopamina
normalmente interage com os receptores D2, acelerando a velocidade do
transportador de dopamina e aumentando o clearence de dopamina. Baseado no fato
de que receptores D2 abrem canais de potássio, os quais hiperpolarizam a membrana,
aumentos nos níveis de dopamina extracelular podem produzir dois efeitos via
ativação de receptores D2: inibição da liberação de dopamina e aceleração da
captação de dopamina, que podem trabalhar em conjunto e limitar a ativação do
receptor pós-sináptico (Staley et al., 1998).
Os resultados obtidos neste estudo em relação aos receptores D2 estão de
acordo com Pilotti, 1997, que demonstrou resultados semelhantes aos obtidos aqui
ao utilizar técnicas de imagem para ajudar a identificar alterações ocorridas
subsequentes ao uso repetido e retirada da droga, encontrou uma profunda
deficiência no receptor D2 nos neurônios dopaminérgicos mesoestriatais em
humanos. Já Kunko et al., 1998, após tratamento por 7 dias com cocaína nas doses
de 15, 30 e 50 mg/kg e 24 horas de retirada não observaram modificações nos
valores de Bmax nem de Kd para os receptores D1 e D2, no núcleo accumbens e
caudado-putamen.
Nossos resultados sugerem que modificações pré-sinápticas na liberação de
dopamina causadas pela administração de cocaína requerem ativação dos receptores
D2 ao invés de um simples bloqueio na captação de dopamina. Tentativas prévias de
bloquear a sensibilização comportamental após injeções repetidas de cocaína com
antagonistas dos receptores dopaminérgicos não-seletivos têm resultado em bloqueio
completo ou parcial (Gale, 1984) dando suporte a esta relação. A ativação de
receptores dopaminérgicos, a maioria dos quais localizados pós-sinápticamente,
pode então, afetar mecanismos pré-sinápticos determinando a liberação de dopamina
em pools susceptíveis a diferentes tipos de estimulação. Além disso, parece que as
vias estriatonigral e nigroestriatal participam integralmente desta via de retro-
alimentação e são necessárias para a ocorrência deste aumento.
Quanto aos efeitos sobre os receptores D2-símile observados após a
administração de etanol durante 7 dias (2 e 4 g/kg, v.o.) e com tempo de retirada de
24 h, uma downregulation foi verificada. No que se refere à constante de
dissociação, uma tendência a aumento foi observada nos valores de Kd nos
receptores D2 após o tratamento com etanol em ambas as doses praticadas. Os
resultados de downregulation encontrados neste trabalho concordam com os de
Hamdi & Prasad (1993) que também observaram uma downregulation.
Não existe consenso quanto ao efeito do etanol nos receptores D2. Enquanto
alguns trabalhos encontraram um aumento (Hruska et al., 1988) outros relataram não
haver diferença (Lucchi et al., 1988) em receptores D2-símile. Um trabalho recente
(Souza-Formigoni et al., 1999) observou aumento na densidade de receptores D2 no
núcleo caudado-putamem ventrolateral somente em camundongos sensibilizados, e
nenhuma diferença em outras regiões, incluindo Núcleo accumbens, bulbo olfatório
e substância negra.
Esses resultados aparentemente contraditórios podem ser devidos a diferentes
protocolos experimentais, tais como: dose de etanol, estado nutricional, idade e raças
dos animais estudados (Lucchi et al., 1988; Hietala et al., 1990; Nevo & Hamon,
1995). Com relação aos receptores dopaminérgicos, períodos prolongados de
tratamento levam a uma resposta específica de downregulation (Lucchi et al., 1988;
Syvalahti et al., 1988) baseado na perda geral da função neuroreceptora. Segundo
Hamdi & Prasad (1993) a downregulation também pode ser explicada: 1 - pelo
aumento da síntese e liberação de dopamina no terminal sináptico, induzido pelo
etanol; 2 - o etanol poderia modificar a estrutura da membrana (Deitrich et al.,
1989), resultando em uma diminuição na incorporação da proteína receptora dentro
do domínio da membrana e levando a uma downregulation; 3 - o etanol poderia
modular a regulação do receptor na transcrição genética diminuindo a função do
receptor.
Segundo Rilke et al., (1995), o efeito da auto-administração crônica de etanol
também parece depender de envolvimento ambiental. Assim, esses autores
mostraram que receptores D2 sofrem diminuição do número após tratamento crônico
em ratos agrupados, mas não em animais isolados socialmente.
O presente trabalho demonstrou que a associação cocaína + etanol promoveu
uma diminuição do número de receptores D2 – símile, sem alterações significativas
nos valores de Kd. Esta downregulation foi mais intensa que a promovida pelos
tratamentos com cocaína e etanol isoladamente, principalmente com a interação
altas doses (Cocaína 20mg + etanol 4g). Esta potencialização de efeito pode ser
explicada pela somação de ações da cocaína e do etanol, já que os grupos tratados
com estes agentes isoladamente apresentaram também uma diminuição.
A cocaína inibe diretamente os receptores colinérgicos muscarínicos e
nicotínicos (Platt, 1995). Sharkey et al., 1988 mostraram que a cocaína era capaz de
exibir afinidade micromolar por receptores muscarínicos e seus resultados sugerem
que a mesma não atua como agonista dos receptores muscarínicos, pois quando na
presença de cocaína o coeficiente de Hill não é diferente de 1. No caso da
administração de drogas agonistas o coeficiente de Hill é < 1 (ex.: carbacol).
Portanto, o referido autor demonstrou pela 1ª vez que a cocaína inibia os receptores
colinérgicos cerebrais, ou seja, se comporta como antagonista.
Vários trabalhos reportam que as propriedades de reforço da cocaína são
mediadas via inibição do transporte de dopamina (Ritz et al., 1987). Porém, deve ser
lembrado que a atropina, aparentemente antagoniza a auto-administração de cocaína,
sugerindo que, mecanismos colinérgicos podem estar envolvidos nas propriedades
de reforço comportamental da cocaína (Wilson e Schuster, 1973). Sharkey et al.,
1988 esclareceram que a possibilidade das propriedades anticolinérgicas da cocaína
podiam interferir com a auto-administração da droga através de um mecanismo
indireto, visto que a concentração de (-) cocaína requerida para inibir os receptores
muscarínicos foi de aproximadamente 20 vezes mais alta do que as concentrações
plasmáticas que produzem euforia em voluntários humanos (Fischman et al., 1976,
1983). Vale salientar que altas concentrações sanguíneas de drogas anticolinérgicas
estão associadas com déficits cognitivos e delírio (Tune et al., 1981).
Nossos experimentos não mostraram alterações significativas na densidade
dos receptores muscarínicos no corpo estriado nem no Kd nos animais tratados com
cocaína, etanol e a associação destes em ambas as doses. De fato, não existe um
consenso acerca das ações promovidas na densidade dos receptores colinérgicos.
Consolo et al., 1992, através da técnica de microdiálise, demonstraram que a
administração de cocaína estimula a produção de acetilcolina estriatal. Assim,
possivelmente este aumento da acetilcolina pode levar a uma diminuição
compensatória do número de receptores.
Heidbreder e Shippenberg, 1996, ao tratar animais por 5 dias com
escopolamina (3,0 mg/kg, s.c.), um antagonista muscarínico em combinação com
cocaína (20 mg/kg, i.p.), observaram que a sensibilização comportamental
desenvolvida quando a cocaína é administrada sozinha era prevenida, sugerindo um
importante papel do sistema colinérgico na mediação da sensibilização
comportamental da cocaína.
Resultados contrários aos nossos com relação ao corpo estriado, foram vistos
por Lipton et al., 1995, que observaram que administrações de cocaína por 5 dias
através de implante subcutâneo e 12 horas de retirada promoviam um aumento de
24 % nos receptores muscarínicos. Nos experimentos feitos após 48 horas de
retirada foi observado que após este período os receptores voltavam a níveis normais
(controle). Após 3 dias de administração contínua de cocaína através de implante
subcutâneo e 21 dias de retirada, houve apreciável redução (26 %) na ligação do
(3H)-QNB no corpo estriado, enquanto que após a administração por 5 e 21 dias de
retirada houve uma redução de 45 % no ligação do (3H)-QNB.
No que se refere às alterações bioquímicas, analisando os resultados do
presente trabalho, pode-se observar que o tratamento durante 7 dias com cocaína, em
ambas as doses, causou alterações significativas nos níveis de TGO, TGP,
colesterol total, triglicérides e HDL.
Já o tratamento durante 7 dias com etanol promoveu alterações significativas
nos níveis de triglicerídeos, HDL e colesterol total. A associação entre cocaína e
etanol também foi efetiva em promover alterações em todos os parâmetros
enzimáticos analisados.
O aumento nos níveis de TGO observado nos animais tratados com cocaína,
em ambas as doses, sugere uma alteração hepática produzida pela cocaína nos
animais tratados.
A cocaína e o etanol são conhecidos por suas capacidades de causar lesões
hepáticas, que podem ser determinadas através da análise de variações nas
concentrações de enzimas hepatocelulares, como TGO e TGP (Smith et al., 1991;
Enomoto et al., 1999). Essas enzimas são marcadores clássicos, pois refletem danos
hepatocelulares, sendo que a TGO se localiza tanto no citosol como na mitocôndria,
sendo sua elevação característica de uma lesão mais grave e mais profunda,
enquanto que a TGP se localiza somente no citosol e sua elevação representa uma
lesão menos profunda.
Alguns trabalhos mostram que o uso crônico do etanol parece ter um efeito
protetor em doenças coronarianas, decorrente de sua ação que aumenta os níveis de
apolipoproteínas APO A1 e colesterol HDL (Kiechl et al., 1998). Neste trabalho, em
contrapartida, tanto cocaína e etanol isoladamente como a combinação destes,
mostrou-se efetiva em reduzir os níveis de triglicerídeos, HDL e colesterol total,
revelando uma ação protetora da função cardiovascular no que diz respeito ao
aparecimento de doenças cardiovasculares relacionadas com o aparecimento de
trombos e placas ateroscleróticas.
Evidências clínicas e experimentais têm mostrado que a cocaína apresenta
efeitos hepatotóxicos em animais de laboratório e em humanos (Perino et al., 1987;
Wanless et al., 1991; Kanel et al., 1990; Silva et al., 1991). O mecanismo proposto
para a ação hepatotóxica da cocaína envolveria espécies reativas de oxigênio, as
quais seriam produzidas durante o metabolismo da cocaína para norcocaína pelo
citocromo p-450 (Boelsterli et al., 1993). Estudos patológicos têm implicado o
estresse oxidativo gerado pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio como o
responsável pela lesão hepática gerada pela cocaína. Nossos experimentos
demonstraram em estudos histopatológicos a presença de alterações inflamatórias no
tecido hepático dos animais tratados com cocaína em ambas as doses. O abuso de
cocaína em humanos está associado tipicamente com o aparecimento de zonas de
necrose hepática (Wanless et al., 1990). Tratamentos crônicos com cocaína em
camundongos promovem morte mitocondrial e necrose centrolobular (Gotlfried et
al., 1986). Estudos in vitro demonstram também a ação hepatotóxica da cocaína.
Hepatócitos de ratos expostos a 1 ou 10 mM de cocaína em cultura por 24 horas
apresentam perda substancial de viabilidade celular como indicado pela liberação de
LDH (Robert set al., 1990).
Os efeitos do etanol no fígado são numerosos e variados. Jover et al., 1991,
demonstraram que o etanol aumenta a hepatotoxicidade induzida pela cocaína em
camundongos e humanos. Isto estaria de acordo com nossos resultados, que
mostraram que o etanol isoladamente promoveu alterações histopatológicas leves,
mas quando associado à cocaína, se mostrou muito mais eficiente em promover
lesões hepáticas, o que é reforçado pelo fato de que a necrose só foi observada no
fígado dos animais tratados com a interação em altas doses de cocaína e etanol. O
mecanismo preciso de como ocorre esta potencialização não está totalmente
esclarecido, mas alguns trabalhos implicam a formação do cocaetileno a partir da
interação entre cocaína e etanol no fígado como o fator responsável (Boelsterli et al.,
1993).
O fato é que mais estudos devem ser feitos para proporcionar um maior
conhecimento de como essas subtâncias atuam, em diferentes níveis, no organismo
humano, contando com a investigação em animais. É sabido que o uso de drogas de
abuso tem crescido muito na última década, sendo que o abuso de combinações de
drogas como a estudada em nossos ensaios tem sido preferida em relação ao uso
isolado. Uma das associações de uso mais prevalente é a combinação cocaína +
etanol (Leite et al., 1999). Em nossos experimentos, realmente, evidenciou-se uma
interação entre o uso de cocaína e etanol, o que sugere a importância clínica do
estudo desta associação para a total elucidação de seus efeitos em sistemas
neurotransmissores e parâmetros bioquímicos e histopatológicos.
8 – CONCLUSÕES
O estudo das alterações comportamentais, neuroquímicas, histopatológicas e
bioquímicas ocorridas em ratos após administração repetida de cocaína, etanol e a
associação destes permitiu as seguintes conclusões:
1. Foi observado um aumento da atividade locomotora nos animais tratados com
Coc em ambas as doses. O Et promoveu, nas doses estudadas, diminuição da
atividade locomotora, sendo que no grupo tratado com a maior dose, ocorreu
uma dessensibilização a este efeito, o que demonstra que a Coc atua como um
estimulante do SNC e o Et, na maior dose, pode promover uma tolerância aos
seus efeitos depressores.
2. A associação cocaína + etanol, nas doses estudadas, não promoveu alteração
na atividade locomotora, o que sugere que na associação ocorre uma
diminuição dos efeitos depressores do etanol pela cocaína e pelo cocaetileno,
o que estimula o uso da combinação.
3. Na determinação dos níveis de DA, 5-HT e seus metabólitos ocorreu aumento
nos níveis de DA em CE de ratos tratados com coc em ambas as doses, não
sendo observadas alterações nos níveis de DOPAC e 5-HT. Nos animais
tratados com Et, ocorreu um aumento nos níveis de DA no CE, sem
alterações nos demais neurotransmissores e seus metabólitos. Com relação às
associações, a int baixas doses promoveu aumento dos níveis de DA, sem
alterações nos demais neurotransmissores e metabólitos. Já na int altas doses,
observou-se um aumento de DA e 5-HT, e diminuição nos níveis de DOPAC,
o que mostra que nos protocolos estudados todos os agentes foram efetivos
em aumentar os níveis de DA, neurotransmissor fortemente relacionado com
o vício.
4. Ocorreu uma diminuição na densidade máxima dos receptores D2 – símile,
sem alterações nos níveis de Kd em todos os grupos tratados em ambas as
doses, sendo esta diminuição mais intensa na interação altas doses,
demonstrando uma ação potencialização da combinação cocaína + etanol em
promover alterações em receptores dopaminérgicos, o que pode estar
relacionado com o poder viciante maior da combinação em relação aos
agentes isolados. Não foram observadas alterações nos receptores
muscarínicos estriatais nem nos valores de Kd nos protocolos experimentais
utilizados.
5. A administração de Coc promoveu em ambas as doses utilizadas elevação
dos níveis de TGO e diminuição dos níveis de colesterol total, triglicerídeos e
HDL. O Et promoveu aumento dos níveis de triglicerídeos e diminuição do
HDL. Com relação às interações, foi observada uma diminuição dos níveis de
TGO, TGP, triglicerídeos e HDL, levando a crer que a associação apresenta
um componente hepatotóxico, o que alteraria o perfil enzimático sérico.
6. As análises histopatológicas evidenciaram o aparecimento de alterações
inflamatórias em tecidos cardíacos e hepáticos de ratos tratados com Coc, Et
e a associção destes em ambas as doses. As alterações observadas nas
associações foram mais intensas, com quadros de necrose tecidual,
demonstrando assim o maior potencial tóxico da combinação cocaína +
etanol, especialmente em relação a lesão hepática. Não foi observada
alteração em tecidos cerebrais.
7. Nossos experimentos evidenciaram importantes efeitos na interação entre o
uso de cocaína e etanol, que foi mais efetiva em promover alterações nos
receptores dopaminérgicos e se mostrou também mais lesiva para alguns
tecidos estudados, suscitando a importância clínica do estudo desta
associação para a total elucidação de seus efeitos comportamentais, nos
sistemas neurotransmissores e em parâmetros bioquímicos e histopatológicos.
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Farmcologia) - Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal
do Ceará.
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