UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
EFEITOS DA INIBIÇÃO DA NADPH OXIDASE SOBRE A DEFESA ANTIOXIDANTE
EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Plasmodium berghei
PAULA DO SOCORRO DE OLIVEIRA DA COSTA LAURINDO
Belém-Pará
2014
2
PAULA DO SOCORRO DE OLIVEIRA DA COSTA LAURINDO
EFEITOS DA INIBIÇÃO DA NADPH OXIDASE SOBRE A DEFESA ANTIOXIDANTE
EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Plasmodium berghei.
Tese apresentado ao Curso de Doutorado do
Programa de Pós-Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Pará como requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutor em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário
Belém-Pará
2014
3
PAULA DO SOCORRO DE OLIVEIRA DA COSTA LAURINDO
EFEITOS DA INIBIÇÃO DA NADPH OXIDASE SOBRE A DEFESA ANTIOXIDANTE
EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Plasmodium berghei.
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Pará, como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário
Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo ICB/UFPA
Banca examinadora: Profa. Livre-Docente Dorotéia Rossi Silva Souza
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
Prof. Dr. Flávio de Vasconcelos
Instituto de Ciências da Saúde/UFPA
Profa. Dra. Maria Fani Dolabela
Instituto de Ciências da Saúde/UFPA
Prof. Livre Docente Ricardo Dantas Machado
Instituto Evandro Chagas
Belém, 06 de fevereiro de 2014
4
EPÍGRAFE
“Todo ser que respire louve ao SENHOR. Louvai ao SENHOR”. (Salmos 150:6).
“Porque as suas coisas invisíveis, desde a criação do mundo, tanto o seu eterno poder, como a sua
divindade, se entendem, e claramente se vêem pelas coisas que estão criadas, para que eles
fiquem inescusáveis”. (Romanos 1: 20).
“A Ciência sem Religião é manca, a Religião sem a Ciência é cega” (Albert Einstein).
5
DEDICATÓRIA
À minha avó Yayá (in memoriam) que, além de matricarca da família, foi uma mulher à frente de
seu tempo e plantou a semente do progresso educacional e dos valores de humildade,
simplicidade e amor ao próximo.
À minha mãe Socorro por quem tenho amor, respeito, admiração e é o meu grande exemplo de
determinação, de dedicação, de caráter, de coragem e de vida.
Ao meu esposo Melvin, o meu melhor amigo, companheiro e grande incentivador, alguém por
quem tenho profunda admiração, respeito e amor.
À minha filha Maitê, o meu amor maior do mundo, que veio ao mundo completar minha
felicidade, me dar coragem, me encher de alegria e me fez entender um pouco do amor de Deus
por mim.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por sua infinita misericóridia ao me conceder a vida e me dar
tudo o que preciso (e muito mais) para ter uma vida confortável para que eu pudesse me dedicar
aos estudos e investir em meu conhecimento científico. Agradeço a Ele pela oportunidade, pelo
amor, pela força e coragem. O Senhor é a minha fortaleza, o meu refúgio, meu socorro eterno.
Graças te dou, meu Pai!
Ao meu orientador Sandro Percário que ao longo desses quase 5 anos se mostrou muito mais que
um professor, mas um grande mestre e amigo, sempre com valiosos conselhos e orientaçãoes,
com muita paciência, compreendendo minhas ausências e confiando em mim e no meu
conhecimento muito mais do que eu mesma.
À minha mãe, o meu grande exemplo de vida, a minha grande incentivadora, aquela que
namaioria das vezes abdicou da realização dos seus sonhos em favor dos meus. A minha melhor
amiga e a minha grande inspiração. Mãe te amo e serei grata e fiel a senhora eternamente.
Ao meu padrasto Sérgio, que sempre esteve ao lado de minha mãe, dando forças, nos educando,
trabalhando por nós e contribuindo para que eu chegasse até aqui, com responsabilidade e amor
de um pai.
Ao meu irmão Paulo, que mesmo tão jovem é um grande exemplo de vida, por se dedicar tanto
aos estudos e trabalho e enfrentar o mundo sozinho muito melhor do que eu.
Ao meu pai Paulo e sua família que mesmo de longe sempre me porporcionam momentos alegres
e me incentivam.
Ao meu esposo Melvin, por todo amor e dedicação dados a mim. Obrigada por investir nos meus
sonhos, compreender minhas ausências, e por cuidar tão bem de mim. Minha admiração, meu
respeito e meu amor por você nao têm medidas.
A minha princesa, minha linda, minha filha Maitê, que mesmo tão pequenina não consegue
imaginar a quantidade de ensinamentos, de amor, de alegria e de vida que trouxe à minha vida.
Foi por ela que cheguei até aqui, foi pensando nela que eu adquiri mais força e incentivo para
concluir mais essa etapa. Ela é o meu amor maior do mundo.
Ao meu fiel amigo Dado, que está comigo há quase 12 anos compartilhando dos melhores e
piores momentos de minha vida, sempre me recebendo com alegria, cuidando de mim e passando
muitas noites em claro, só pra me fazer companhia.
A todos os meus familiares, em especial, as primas Audrey e Alynne e tia Maria José, por todo
amor e por sempre confiarem em mim, me incentivarem e orarem por mim.
7
Ao grupo de amigas do G12, que sempre estiveram presentes em minha vida me incentivando e
ouvindo quando mais precisei.
A todos os meus professores que ao longo desses quase 27 anos de estudo muito contribuíram
para que eu chegasse até aqui. Em especial aos professores da pós-graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários pela contribuição científica e preparo profissional.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Estresse Oxidativo (LAPEO), que formam uma
grande equipe e sempre estão prontos a ajudar uns aos outros. Em especial, agradeço a: Ana
Carolina Musa, Danilo Moreira, Marcela Figueira, Amanda Soares, Michelli Ferreira, Rafael
Quadros, Amanda, Luana Sá, Lângela, João, Lúcio, Mayaní, Aline, Vitor e a todos os estagiários
que dedicaram seu tempo na realização dos procedimentos experimentais desse trabalho.
Ao amigo Rogério pela grande ajuda com a análise estatística.
À minha amiga Ana Carolina Musa G. Uberti por ter chegado a minha vida como um anjo
enviado por Deus, por ter compreendido minha ausência e ter desenvolvido esse trabalho durante
a minha licença maternidade e por ter sido meu braço direito em tudo o que diz respeito a esse
doutorado e, além disso, ainda estar sempre disposta a ouvir e ajudar.
Ao Laboratório de Neurociências da UFPA por ter fornecido a cepa de Plasmodium berghei.
Ao Instituto Evandro Chagas (IEC) pelo fornecimento dos animais de experimentação.
Ao Biotério UFPA, especialmente ao Sr. Amarildo pela ajuda com os camundongos, pela
amizade e pelo carinho com que sempre me recebeu.
A todos os animais que precisaram sofrer eutanásia para a execução deste trabalho científico.
À CAPES pelo apoio financeiro, por meio da bolsa e pelo incentivo a pesquisa.
8
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 12
LISTA DE TABELAS E QUADROS 17
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 20
RESUMO 23
ABSTRACT 24
1. INTRODUÇÃO 25
1.1. HISTÓRICO DA MALÁRIA 25
1.2. AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA 26
1.3. EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA 28
1.4. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA MALÁRIA 31
1.5. PATOGENIA DA MALÁRIA 33
1.6. RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO 35
1.6.1. Malária e o Estresse Oxidativo 39
1.7. NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO FOSFATASE
OXIDASE – NADPH OXIDASE
41
1.7.1. Malária e NADPH OXIDASE 45
1.7.2. Inibidores da NOX 46
1.7.2.1. Apocinina 47
1.8 MODELO EXPERIMENTAL DA MALÁRIA EM ROEDORES 51
1.9. OBJETIVOS 53
1.9.1. Objetivo Geral 53
1.9.2. Objetivos Específicos 53
2. MATERIAL E MÉTODOS 54
2.1. ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO 54
2.1.1. Grupos experimentais 54
2.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS ANIMAIS 56
2.3. TRATAMENTO COM APOCININA 56
2.3.1. Preparo da solução de apocinina 57
2.3.2. Determinação do peso corpóreo e consumo de líquidos 57
2.3.2.1. Estimativa de Consumo de líquidos 57
9
2.4. EUTANÁSIA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 57
2.5. DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA 58
2.6. HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PULMÃO E CÉREBRO 59
2.6.1. Preparo das amostras 59
2.6.2. Homogeneização das amostras 60
2.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO
TIOBARBITÚRICO (TBARS)
60
2.7.1. Preparo dos reagentes 61
2.7.1.1. Ácido tiobarbitúrico 61
2.7.1.2. Solução padrão MDA 61
2.7.2. Procedimento técnico 61
2.7.3. Curva padrão do TBARS 62
2.7.4. Cálculo do valor de TBARS das amostras 64
2.8. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL EM EQUIVALÊNCIA AO
TROLOX (TEAC)
64
2.8.1. Preparo dos reagentes 65
2.8.1.1. Tampão salina fosfato (PBS) 65
2.8.1.2. Solução estoque de ABTS.+ 65
2.8.1.3. Solução de trabalho de ABTS.+ 66
2.8.1.4. Solução de Trolox 66
2.8.2. Procedimento técnico 66
2.8.3. Curva Padrão do trolox 66
2.8.4. Cálculo do valor de TEAC das amostras 68
2.9. DOSAGEM DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE PELA REDUÇÃO
DO RADICAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PICRILIDRAZILA)
68
2.9.1. Preparo dos reagentes 68
2.9.1.1. Preparo da Solução de DPPH 68
2.9.1.2. Preparo das Amostras 69
2.9.2. Procedimento técnico 69
2.9.3. Curva padrão do trolox 69
2.9.4. Cálculo do valor de DPPH das amostras 71
10
2.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA 71
3. RESULTADOS 73
3.1 SOBREVIDA 73
3.2 PARASITEMIA 76
3.3 DOSAGENS PULMONARES 79
3.3.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 79
3.3.2 Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox 83
3.3.3 Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical DPPH
(1,1-Difenil-2-Picrilidrazila)
87
3.3.4 Estudos de correlação em amostras pulmonares 91
3.3.4.1 Correlação TBARS e TEAC 91
3.3.4.2 Correlação TBARS e DPPH 94
3.3.4.3 Correlação TBARS e Parasitemia 96
3.3.4.4 Correlação DPPH e Parasitemia 98
3.3.4.5 Correlação TEAC e Parasitemia 99
3.3.4.6 Correlação TEAC e DPPH 100
3.4 DOSAGENS CEREBRAIS 102
3.4.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 102
3.4.2 Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox 107
3.4.3 Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical DPPH
(1,1-Difenil-2-Picrilidrazila)
111
3.4.4 Estudos de correlação em amostras cerebrais 114
3.4.4.1 Correlação TBARS e TEAC 114
3.4.4.2 Correlação TBARS e DPPH 117
3.4.4.3 Correlação TBARS e Parasitemia 119
3.4.4.4 Correlação DPPH e Parasitemia 121
3.4.4.5 Correlação TEAC e Parasitemia 123
3.4.4.6 Correlação TEAC e DPPH 124
4. DISCUSSÃO 127
4.1 ACHADOS PULMONARES 131
4.2 ACHADOS CEREBRAIS 135
11
4.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS 136
5. CONCLUSÕES 138
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 139
ANEXO 155
APENDICES 156
12
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1: Ciclo biológico da Malária (Adaptado de CDC, 2006)
28
Figura 2: Áreas de risco para malária no Brasil, de acordo com distribuição de
casos confirmados no ano de 2011 (Adaptado de WHO, 2012).
30
Figura 3: Reações de Haber-Weiss e Fenton. - (1) Reação de Haber Weiss: O
radical superóxido (O●-
) reage com o peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de
metais de transição, para produzir radicais hidroxila (HO●-), íons hidroxila (HO
-) e
oxigênio (O2). (2) Reação de Fenton: O peróxido de hidrogênio (H2O2) é ionizado
na presença de íons ferrosos, levando à produção de OH● e HO
-. O íon ferroso
(Fe+2
) sofre oxidação, sendo liberado na forma de íon férrico (Fe+3
).
37
Figura 4: A) A sequência de eventos que ocorrem na síndrome de isquemia e
reperfusão (SIR). B) Integração da SIR com a reação de Haber-Weiss. Legenda:
ATP=Trifosfato de adenosina; ADP=Difosfato de adenosina; AMP= Monofosfato
de adenosina; Ca+2
= íon cálcio; O2= Oxigênio; O2●-
= radical superóxido; H2O2 =
peróxido de hidrogênio; OH- = íon hidroxila; OH
● = radical hidroxila; H2O = água
(Adaptado de Percário, 2008).
38
Figura 5: Estrutura da NADPH oxidase fagocítica ativada (Adaptado de Dusting et
al., 2004).
44
Figura 6: Produção do radical superóxido (O2●-
) por ação da enzima NADPH
oxidase.
45
Figura 7: Estrutura Química da Apocinina (adaptado de Kim et al., 2010).
48
Figura 8: Mecanismo proposto para a oxidação da apocinina (adaptado de
Stefanska & Pawliczak, 2008).
49
Figura 9: Mecanismo de inibição da NADPH oxidase por apocinina (adaptado de
Stefanska & Pawliczak, 2008)
50
Figura 10 : Esfregaço Sanguineo de camundongo infectado pelo Plasmodium
berghei corado pelo método de Giemsa, em microscópio óptico com aumento de
100x.
59
Figura 11: Curva Padrão de MDA
64
Figura 12: Curva Padrão do Trolox
67
Figura 13: Curva Padrão da Capacidade Antioxidante pela Redução do Radical
DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazila).
70
13
Figura 14: Percentual de sobrevida de camundongos infectados ou não com
Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado por grupo. A = Grupo
tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; B = Grupo tratado com
Apocinina, não infectado com P. berghei; C = Grupo infectado pelo P. berghei e
não tratado com Apocinina; D = Grupo não infectado com P. Berghei e não tratado
com Apocinina.
73
Figura 15: Progressão da parasitemia de camundongos infectados com Plasmodium
berghei do grupo tratados com apocinina (Vermelho) e do grupo não tratado com
apocinina (Azul).
76
Figura 16: Concentração de Subtâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
por tempo de infecção nos pulmões de camundongos, de acordo com o tratamento
empregado. A = Grupo de animais que recebeu tratamento com Apocinina e foi
infectado pelo Plasmodium berghei. B = Grupo de animais que recebeu o tratamento
com Apocinina e não foi infectados pelo P. berghei. C = Grupo de animais que não
recebeu o tratamento com Apocinina e foi infectado pelo P. berghei. D = Grupo de
animais que não recebeu o tratamento com Apocinina e não foi infectado.
79
Figura 17: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) por tempo de
infecção, nos pulmões de camundongos, de acordo com o tratamento empregado.
Grupo A = Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados
com Plasmodium berghei. Grupo B = Animais que receberam o tratamento com
Apocinina e não foram infectados com P. berghei. Grupo C = Animais que não
receberam o tratamento com Apocinina e foram infectados com P. berghei. Grupo
D – Controle = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e não
foram infectados.
83
Figura 18: Perfil Antioxidante medido pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) por tempo de infecção, nos pulmões de camundongos, de
acordo com o tratamento empregado. Grupo A= Animais que receberam tratamento
com Apocinina e foram infectados com P. berghei. Grupo B = Animais que
receberam o tratamento com Apocinina e não foram infectados com P. berghei.
Grupo C = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e foram
infectados com P. berghei. Grupo D – Controle = Animais que não receberam o
tratamento com Apocinina e não foram infectados.
87
Figura 19: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras
pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com
Plasmodium berghei; Grupo B = Correlação realizada com todos os pontos do grupo
de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. Grupo C =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação realizada com todos
os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P.
92
14
berghei.
Figura 20: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) em amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos
= Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados
com Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com
P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e não infectados com P. berghei.
95
Figura 21: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos. Todos os
Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos
simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo
de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei;. Grupo
C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados
com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
97
Figura 22: Correlações entre Capacidade Antioxidante medida pela redução do
radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) e Parasitemia em amostras pulmonares
de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de
todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium
berghei; Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
98
Figura 23: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e
Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos =
Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados
com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo C = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e
infectados com P. berghei.
99
Figura 24: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e
capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) em amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação
realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com
Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo B = Correlação realizada
com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados
com P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D =
101
15
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e não infectados com P. berghei.
Figura 25: Concentração de Subtâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
por tempo de infecção no cérebro de camundongos, de acordo com o tratamento
empregado. Grupo A = Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram
infectados com Plasmodium berghei. Grupo B = Animais que receberam o
tratamento com Apocinina e não foram infectados com P. berghei. Grupo C =
Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e foram infectados com P.
berghei. Grupo D = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e não
foram infectados.
102
Figura 26: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) por tempo de
infecção, no cérebro de camundongos, de acordo com o tratamento empregado.
Grupo A = Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados
com Plasmodium berghei. Grupo B = Animais que receberam o tratamento com
Apocinina e não foram infectados com P. berghei. Grupo C = Animais que não
receberam o tratamento com Apocinina e foram infectados com P. berghei. Grupo
D – Controle = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e não
foram infectados
107
Figura 27: Perfil Antioxidante medido pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) por tempo de infecção, no cérebro de camundongos, de
acordo com o tratamento empregado. Grupo A = Animais que receberam tratamento
com Apocinina e foram infectados com P. berghei. Grupo B= Animais que
receberam o tratamento com Apocinina e não foram infectados com P. berghei.
Grupo C= Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e foram
infectados com P. berghei. Grupo D – Controle = Animais que não receberam o
tratamento com Apocinina e não foram infectados.
111
Figura 28: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras
cerebrais de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com
Plasmodium berghei; Grupo B = Correlação realizada com todos os pontos do
grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com Plasmodium
berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
não tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. Grupo D =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e não infectados com Plasmodium berghei.
115
Figura 29: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) em amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos =
Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados
118
16
com Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com
P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e não infectados com P. berghei.
Figura 30: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos
= Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados
com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei;. Grupo C = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e
infectados com Plasmodium berghei.
120
Figura 31: Correlações entre Capacidade Antioxidante medida pelo redução do
radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) e Parasitemia em amostras cerebrais de
camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de
todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei;.
Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não
tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
122
Figura 32: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e
Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos =
Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados
com Apocinina e infectados com P. berghei;. Grupo C = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com
P. berghei.
123
Figura 33: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e
capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) em amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos = Correlação
realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com
Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B = Correlação realizada com todos
os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P.
berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e
não infectados com P. berghei.
125
17
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Página
Quadro 1: Distribuição das NADPH oxidases
43
Quadro 2: Distribuição dos subgrupos por tempo de infecção.
55
Quadro 3: Determinação do percentual de parasitemia através de estimativa para a
contagem do número de hemácias totais por campo no microscópio óptico.
58
Quadro 4: Protocolo de Diluições do padrão de malondialdeido (MDA) para curva
padrão
64
Quadro 5: Protocolo de Diluições de Trolox para realização da curva padrão.
67
Quadro 6: Protocolo de Diluições de trolox para curva padrão de DPPH 70
Tabela 1: Sobrevida dos camundongos de acordo com os diferentes grupos de
experimentação
75
Tabela 2: Progressão da parasitemia dos camundongos infectados com o Plasmodium
berghei tratado com Apocinina e não tratado com Apocinina de acordo com os dias
de infecção
77
Tabela 3: Valores de p* para comparação temporal da parasitemia por grupo em
camundongos infectados com Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tatamento
com Apocinina
77
Tabela 4: Valores de p* para comparação entre grupos da parasitemia por tempo de
infecção em camundongos infectados com Plasmodium berghei e submetidos ou não
ao tatamento com Apocinina
78
Tabela 5: Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
nos pulmões de camundongos de acordo com o tratamento recebido
80
Tabela 6: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitútico em amostras de pulmão
81
Tabela 7: Valores de p* para as comparações entre grupos para Substâncias Reativas
ao Ácido Tiobarbitúrico em amostras de pulmão.
82
Tabela 8: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões de
camundongos de acordo com o tratamento recebido
84
18
Tabela 9: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras de pulmão
85
Tabela 10: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de
infecção, para a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox, em amostras de
pulmão
86
Tabela 11: Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-
2-Picrilidrazila (DDPH) nos pulmões de camundongos de acordo com o tratamento
recebido
88
Tabela 12: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a
capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) em amostras de pulmão
89
Tabela 13: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de
infecção, para a capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-
2-Picrilidrazila (DDPH), em amostras de pulmão
90
Tabela 14: Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) no cérebro de camundongos de acordo com o tratamento recebido
103
Tabela 15: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a técnica
de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitútico (TBARS) em amostras de cérebro
105
Tabela 16: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com, para a
técnica de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em amostras de
pulmão
106
Tabela 17: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras
cerebrais de camundongos de acordo com o tratamento recebido
108
Tabela 18: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras de cérebro
109
Tabela 19: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de
infecção, para a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox, em amostras de
cérebro.
110
Tabela 20: Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-
2-Picrilidrazila (DDPH) no cérebro de camundongos de acordo com o tratamento
recebido
112
19
Tabela 21: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a
capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) em amostras de cérebro de camundongos
113
Tabela 22: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de
infecção, para a capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH), em amostras de cérebro de camundongos
113
20
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cNOS Óxido Nítrico Sintetase Constitutiva
ERTO Espécies Reativas de Oxigênio
Fe2+
Cátion Ferroso
Fe3+
Cátion Férrico
G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
H+ Hidrogênio
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HO-
Íon hodroxila
ICAM-1 Molécula de Adesão intercelular 1
IFN-γ Interferon Gama
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
iNOS Óxido Nítrico Sintase induzível
MDA Malondialdeído
MC Malária Cerebral
CPH Complexo Principal de Histocompatibilidade
NADP+
Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida
NK Células Natural Killer
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido Nítrico Sintetase
NOX Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase
O2 Oxigênio
O2.- Radical Superóxido
OH.- Radical Hidroxila
ONOO- Peroxinitríto
R. Radical Alquila
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TEAC Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
21
Ca++
Íon Cálcio
SIR Síndrome de Isquemia e Reperfusão
ADP Disfosfato de Adenosina
AMP Monofosfato de Adenosina
H20 Água
NOX2 Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase Subunidade
gp91phox
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo
HOCL Ácido Hipocloroso
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
LDL Lipopoteína de Baixa Densidade
LDLOX Lipopoteína de Baixa Densidade Oxidada
MPO Mieloperoxidase
VCAM-1 Molécula de Adesão de Células Vasculares 1
DPOC Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
ICB/UFPA Instituto de Ciências Biológicas / Universidade Federal do Pará
USP Universidade de São Paulo
PBS Tampão Fosfato Salina
MDA Malondialdeído
MDA-TBA Malondialdeído-Ácido Tiobarbitúrico
NA2HPO4 Fosfato de Sódio Dibásico
NAH2PO4 Fosfato de Sódio Monobásico
NACL Cloreto de Sódio
TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
KH2PO4 Fosfato de Potássio Monobásico
ABTS 2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-diamôni
K2S2O8 Persulfato de Potássio
ABTS.+
Radical cátion 2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-
diamônio
DPPH 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
22
AAO Atividade Antioxidante
ETOH Álcool Etílico
MC Malária Cerebral
VECAM Molécula de adesão a células Vasculares
23
RESUMO
A malária é uma doença infecciosa febril aguda, cujos agentes etiológicos são protozoários
transmitidos por vetores. Atualmente, reveste-se de importância epidemiológica pela sua elevada
incidência no mundo e potencial gravidade clínica, causando consideráveis perdas sociais e
econômicas na população em risco, principalmente aquela que vive em condições precárias de
habitação e saneamento. As espécies do gênero Plasmodium são altamente suscetíveis a
alterações no equilíbrio redox, as quais podem contribuir para manifestações da doença, tal como
as malárias pulmonar e cerebral. As espécies reativas do oxigênio (ERO) tem envolvimento
importante no desenvolvimento e progressão da malária. Como a NADPH oxidase é um
complexo enzimático especializado em produzir ERO, principalmente o radical superóxido,
parece importante avaliar o papel dessas enzimas no perfil oxidativo dessa doença. Dessa forma,
o objetivo do presente trabalho foi avaliar temporalmente os efeitos da inibição das enzimas
NADPH oxidase sobre o perfil oxidativo e sobre a defesa antioxidante em camundongos
infectados com o Plasmodium berghei. Para tal, 260 camundongos Swiss foram divididos em 20
grupos e submetidos a diferentes tratamentos. O tratamento para inibir o complexo enzimático
NADPH oxidase foi realizado com 1,5mM de apocinina em água de beber. A apocinina é um
composto orgânico natural, metóxi-catecol muito utilizado experimentalmente como um inibidor
da NADPH oxidase. O grupo A correspondeu ao grupo de animais tratados com apocinina e
infectados com P. berghei. O grupo B foi formado por animais que foram tratados com
apocinina, porém não infectados. O grupo C foi composto pelos animais apenas infectados com
P. berghei e o grupo D foi o controle não infectado e não tratado. Observou-se a sobrevida e
foram coletadas as amostras de tecido pulmonar e cerebral de acordo com o tempo de infecção de
cada grupo (1 dia, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias de infecção). Avaliou-se a parasitemia, os
níveis de peroxidação lipídica por meio das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
a e a capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC). O grupo A apresentou menor
sobrevida do que o grupo C sugerindo que o estresse oxidativo possa ter um papel protetor na
malária, uma vez que quando houve diminuição da produção de superóxido, foi observado menor
sobrevida. No entanto, não foram observadas relações entre o tratamento com a apocinina e os
níveis de TBARS, TEAC e DPPH. Os resultados apresentados sugerem que, embora a inibição
da NADPH oxidase, via tratamento com inibidor apocinina, tenha diminuído a sobrevida, o uso
dessa substância não promoveu alterações significativas no perfil oxidativo e antioxidante nas
amostras pulmonares e cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei.
PALAVRAS-CHAVE: NADPH oxidase, Malária, Plasmodium berghei, Apocinina, Estresse
Oxidativo, Antioxidantes, TEAC, DPPH, TBARS.
24
ABSTRACT
Malaria is an acute febrile infectious disease whose etiologic agents are protozoa transmitted by
vectors. Currently, is of epidemiological importance because of its high incidence in the world
and the potential clinical severity, causing considerable social and economic losses in the
population at risk, especially those living in poor housing and sanitation. The species of
Plasmodium are highly susceptible to changes in redox balance, which can contribute to the
disease manifestations, such as pulmonary and cerebral malaria. Reactive oxygen species (ROS)
seem to be directly involved in the development and progression of malaria. As the NADPH
oxidase enzyme complex is an important source of ROS production, principally superoxide, so
seems important to assess the role of these enzymes in the oxidative profile of malaria. Thus, the
aim of this study was to evaluate the effect of NADPH oxidase enzymes inhibition of on the
oxidative changes and on the antioxidant defense in mice infected with P. berghei. For this
purpose, 260 Swiss mice were divided into 25 groups and subjected to different treatments. The
treatment to inhibit the NADPH oxidase enzyme complex was accomplished with 1.5 mM
apocynin in drinking water. Apocynin is a naturally occurring methoxy-substituted catechol,
experimentally used as an inhibitor of NADPH oxidase. Group A corresponded to the positive
group, formed by animals treated with apocynin and P. berghei infected. Group B was formed by
animals treated with apocynin but not infected. Group C was compounded only by infected
animal and Group D was the negative group, not treated and not infected. Survival was observed
and samples of lung and brain tissues were colleted according to the time of infection in each
group (1st day 5 days 10 days 15 days 20 days pos infection; p.i.). Parasitemia, the levels of lipid
peroxidation by Tiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and antioxidants capacity
equivalent to trolox were evaluated. Group A showed a lower survival rate than group C
suggesting that oxidative stress may play a protective role in malaria, since when there was a
decrease of superoxide production, lower survival was observed. However, no relationship
between treatment with apocynin and TBARS, TEAC and DPPH levels were observed. The
results suggest that although the inhibition of NADPH oxidase, via treatment with inhibitor
apocynin decreased the survival, the use of this substance did not cause significant changes in
oxidative and antioxidant profile in lung and brain samples of mice infected with P. berghei.
KEYWORDS: NADPH oxidase, Malaria, Plasmodium berghei, Apocynin, Oxidative Stress,
Antioxidants, TEAC, DPPH, TBARS.
25
1. INTRODUÇÃO
A infecção por malária constitui uma das mais importantes doenças tropicais e apresenta-
se bastante difundida no mundo (Garcia et al., 2010). Essa doença caracteriza-se por desencadear
acessos periódicos de febres intensas que debilitam profundamente os acometidos. É uma doença
endêmica, característica das áreas tropicais e subtropicais (Tobón et al., 2006) e de transmissão
vetorial causada por protozoários do gênero Plasmodium transmitidos por fêmeas de mosquitos
do gênero Anopheles infectadas (França et al., 2008).
1.1. HISTÓRICO DA MALÁRIA
A malária representa uma doença humana muito antiga mencionada desde 2700 a.c em
escritos chineses e egípcios e foi descrita como febres periódicas, com esplenomegalia e mortal
(Bruce-Chwatt, 1988; Novelli, 1993; Garcia et al., 2010).
A doença chegou a Roma em 200 a.c e se espalhou pela Europa durante o século XII,
chegando à Inglaterra no século XIV (Celli, 1925 apud França et al., 2008). Supõe-se que os
colonizadores europeus, especificamente os ingleses, tenham trazido o Plasmodium vivax e o
Plasmodium malarie para as Américas. A chegada do Plasmodium falciparum nas Américas
coincide com a importação de escravos africanos, a partir de 1620 (Duffy, 1953 apud França et
al., 2008).
A malária teve um impacto na história mundial maior do que qualquer outra doença
infecciosa, agravando resultado de guerras, movimentos de populações, promovendo o
desenvolvimento e o declínio de várias nações. Alguns países envolvidos com a 1ª Guerra
Mundial descreveram grandes baixas em decorrência da malária (Rocha et al., 2006; Garcia et
al., 2010).
Apesar de mais de um século de esforços para erradicar ou controlar a malária, a doença
continua sendo um perigo crescente para saúde pública de países em desenvolvimento,
especialmente nas regiões tropicais e subtropicais do planeta (Gardner et al., 2002). Entre as
26
dificuldades de combate à doença encontra-se o fato do Plasmodium ter um ciclo de vida
extremamente complexo (Brasil, 2006).
No Brasil, a ocupação desordenada da região amazônica, a construção de usinas
hidrelétricas, o desenvolvimento de projetos agropecuários e instalação de garimpos,
promoveram movimentos de migração interna no país, com alterações ambientais importantes,
provocando um incremento na transmissão da malária no início da década de 1980 (Marques et
al., 1986; França et al., 2008), especialmente na região da Amazônia Legal (Brasil, 2004).
1.2. AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA
A malária é causada por protozoários pertencentes ao gênero Plasmodium, filo
Apicomplexa, classe Sporozoa, ordem Hemosporidiida e família Plasmodidae e gênero
Plasmodium (BRASIL, 2010). As cinco espécies associadas à malária humana são: P. vivax, P.
malariae, P. ovale, P. knowlesi e P. falciparum (Brasil, 2010; Singh & Daneshvar, 2010). Sabe-
se que o P. falciparum foi descoberto por Welch, no ano de 1897; o P. vivax, causador da febre
terçã benigna foi descoberto por Grassi & Feletti, em 1890; já o P. malariae foi descrito por
Laveran em 1881 e por Grassi e Feletti em 1890. O P. ovale foi descoberto por Stephens, no ano
de 1922 e o P. knowlesi foi descrito pela primeira vez em 1927, por Franchiti (Walther &
Wernsdorfer, 1988). Dados sugerem que as espécies P. vivax e P. falciparum são responsáveis
por mais de 95% dos casos, sendo que destes, o P. vivax pode causar 80% dos casos no Brasil,
uma vez que esta espécie tem distribuição mais ampla nos trópicos, zonas subtropicais e zonas
temperadas (WHO, 2010; Garcia et al., 2010).
Os vetores da infecção são as fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles, sendo o
Anopheles darlingi a espécie mais importante no Brasil, cujos criadouros principais são depósitos
de água limpa, quente, sombreada e de baixo fluxo, muito comuns na Amazônia brasileira
(Brasil, 2010).
Os protozoários do gênero Plasmodium têm um ciclo de vida dividido entre o hospedeiro
vertebrado e o inseto vetor (Murgatroyd, 1952; Knell, 1991; França et al., 2008). O ciclo
assexuado do Plasmodium, denominado esquizogônico, inicia-se após o repasto sanguíneo da
27
fêmea do mosquito, com a inoculação de esporozoítos infectantes no tecido subcutâneo do
homem (Murgatroyd, 1952; Brasil, 2006).
Os esporozoítos circulam na corrente sangüínea durante alguns minutos e rapidamente
penetram nos hepatócitos, dando início ao ciclo pré-eritrocítico ou esquizogonia tecidual, que
dura seis dias para o P. falciparum, oito dias para o P. vivax e 12 a 15 dias para o P. malariae.
Nessas células, multiplicam-se e dão origem a milhares de novos parasitos (merozoítos). Durante
esta fase o P. vivax e o P. ovale apresentam desenvolvimento lento de alguns dos seus
esporozoítos, formando os hipnozoítos, formas latentes do parasito responsáveis pelas recidivas
da doença meses ou anos após a infecção inicial (Murgatroyd, 1952; Brasil, 2010).
Ao final do ciclo tecidual, os esquizontes rompem os hepatócitos, liberando milhares de
merozoítos na corrente sangüínea. Os merozoítos penetram nas hemácias, iniciando a segunda
fase do ciclo, chamada esquizogonia sanguínea, fase em que são observados os sintomas da
doença. Durante um período que varia de 48 a 72 horas, o parasito se desenvolve no interior da
hemácia até provocar a sua ruptura, liberando novos merozoítos que irão invadir novas hemácias,
como mostrado na figura 1 (Murgatroyd, 1952; Brasil, 2006).
28
Figura 1: Ciclo biológico da Malária (Adaptado de CDC, 2006)
A ruptura e consequente liberação de parasitos na corrente sangüínea traduzem-se
clinicamente pelo início do paroxismo malárico, que se repetirá com o término do novo ciclo.
Inicialmente, no ciclo sangüíneo, o parasito sofre uma série de transformações morfológicas, mas
sem divisão celular, até chegar à fase de esquizonte, quando se divide e origina novos merozoítos
que serão lançados na corrente sangüínea após a ruptura do eritrócito. Após um período de
replicação assexuada, alguns merozoítos se diferenciam em gametócitos machos e fêmeas, que
amadurecem sem divisão celular e tornam-se infectantes aos mosquitos (Brasil, 2010).
1.3. EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a malária é a doença tropical, infecto-
contagiosa que mais causa problemas sociais e econômicos no mundo (Barata, 1995; WHO,
29
2009). Estima-se que em 2010 ocorreram 219 milhões de casos de malária em todo o mundo com
cerca de 660.000 mortes (WHO, 2012). Atualmente, a malária continua endêmica em 104 países,
com aproximadamente 80% dos casos ocorrendo em 17 países, sendo que a República
Democrática do Congo, Índia e Nigéria respondem por 40% dos casos estimados de malária
(WHO, 2012).
Foi observada uma redução no número de mortes de 985.000 no ano de 2000, para
781.000 no ano de 2009. Essa diminuição foi observada com maiores reduções proporcionais na
região européia, seguida pela América. Entretanto as maiores reduções absolutas foram
observadas na África (WHO, 2010).
No mundo, os dados disponíveis sobre a ocorrência de malária são bastante imprecisos,
decorrente da baixa qualidade dos sistemas de registro de informações em saúde, especialmente
na África, onde se concentram aproximadamente 80% dos casos clínicos da doença e 90% das
infecções (Barata, 1995). As maiores taxas de incidências são observadas na África, na Ásia e
nas Américas, as quais, entre outros fatores, apresentam facilitadores para a manifestação da
doença, tais como a ocorrência de chuvas freqüentes - que ajudam a formar criadouros do vetor -
e a temperatura - geralmente entre 20-30ºC - os quais facilitam o desenvolvimento do parasito e
do mosquito (Kain et al., 2001; Suh et al., 2004). Na África, uma criança morre a cada 45
segundos de malária, a doença é responsável por 20% de todas as mortes na infância (WHO,
2011).
Na América do Sul, a transmissão de malária ocorre nos países que abrangem a Floresta
Amazônica - Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Peru, Suriname e
Venezuela – sendo o Brasil responsável pelo maior número de casos (PAHO, 2002). Apesar do
número de casos estar em declínio, o número absoluto de casos no ano de 2011 ainda foi de
266.348 em todo país (Ribeiro et al., 2008; Brasil, 2013).
A região amazônica é considerada área endêmica para malária (SVS, 2006; Parisi, 2009),
de acordo com o representado no mapa na figura 2, pois apresenta condições socioeconômicas e
ambientais que favorecem a proliferação do mosquito Anopheles (SVS, 2006). Além disso, a
intensa migração de pessoas às áreas endêmicas aumenta a exposição de suscetíveis e o risco de
infecções graves (SVS, 2006). Segundo informações do Ministério da Saúde, esta região
concentra 99,9% dos casos de malária no Brasil, sendo o P. vivax a espécie causadora de quase
90% dos casos (Brasil, 2010).
30
Figura 2: Áreas de risco para malária no Brasil, de acordo com distribuição de casos
confirmados no ano de 2011 (Adaptado de WHO, 2012).
A distribuição da malária no Brasil está freqüentemente associada à atividade exercida
pela população das áreas endêmicas, como é o caso dos indivíduos que desenvolvem atividades
relacionadas ao desmatamento, exploração mineral, extrativismo vegetal e assentamento, bem
como à abertura de grandes rodovias e construção de hidrelétricas. Além disso, a migração de
pessoas para essas áreas endêmicas aumenta o contingente de suscetíveis e o risco de infecções
graves, principalmente quando são precárias as condições de moradia e de trabalho (Brasil, 1995;
Parisi, 2009).
No ano de 2011, no Brasil, 99,7% da transmissão da malária concentrou-se na Região
Amazônica, composta pelos estados do Acre, Amazonas, Amapá, Maranhão, Mato Grosso, Pará,
Rondônia, Roraima e Tocantins, compreendendo 807 municípios (Brasil, 2013). Nos últimos
anos, Manaus e Porto Velho apresentaram extensas áreas de aglomerados urbanos em regiões
periféricas, importantes locais de infecção devido a intenso fluxo de pessoas procedentes de
outros municípios em busca de oportunidades de trabalho ou necessidades comerciais. Esses
municípios concentraram 26,9% e 22,9% dos casos de malária da Região Amazônica nos anos de
2003 e 2004 (Parisi, 2009).
31
O estado do Pará é um dos que apresenta maior número de casos e morbidade da doença
(Mascarenhas et al., 2005) de maneira que, somente no ano de 2011, foram notificados 114.754
casos (Brasil, 2013) e de acordo com a coordenação Estadual de Malária, 70% dos casos
acontecem em áreas rurais (SESPA, 2011). Entretanto, a Secretaria Estadual de Saúde do Pará
(SESPA) divulgou que houve uma redução de 70% dos casos em 2013, em relação ao ano de
2012. Entre os meses de janeiro e abril de 2013, o Estado apresentou 13.420 casos de malária
diagnosticados, contra 53.206 no mesmo período de 2012. Os municípios com a maior queda no
número de registros são Chaves, Curralinho, Anajás, Bagre, Altamira e Anapu (Ministério da
Saúde, 2013).
Em Belém, 51% dos 650 casos autóctones de malária notificados no ano de 2004 foram
procedentes da ilha de Cotijuba (Região Metropolitana da grande Belém; Renault et al., 2007).
Entretanto, a SESPA confirmou 90 casos de malária, no ano de 2013 em Ananindeua, entretanto,
o surto já está controlado (Ministério da Saúde, 2013).
1.4. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA MALÁRIA
O período de incubação da infecção por malária varia de acordo com a espécie de
plasmódio, sendo geralmente de 7 a 30 dias, podendo, contudo, chegar a vários meses em
condições especiais em alguns casos de P. vivax e P. malariae (Svenson et al., 1995; Kain et al.,
2001).
A crise malárica tem relação com a duração do ciclo esquizogônico, com o número de
plasmódios em desenvolvimento e com o período de incubação, de forma que as características
clínicas são principalmente febres intermitentes, calafrios e cefaléia (Brasil, 2006).
A fisiopatologia da doença está relacionada ao ciclo de vida do parasito no organismo
hospedeiro, como ocorre no final do estágio eritrocitário, quando ocorre a liberação de
merozoítos e de pirógenos, tais como o pigmento hemozoína, que é capaz de estimular
macrófagos e citocinas. Por sua vez, estes pirógenos podem provocar um desequilíbrio do
hipotálamo causando elevação da temperatura, caracterizando clinicamente o paroxismo
malárico, que pode durar de acordo com a espécie de plasmódio (Andrade, 2005; CDC, 2010).
O paroxismo febril se justifica pela ruptura das hemácias pelos esquizontes. Este
paroxismo acontece principalmente em conseqüência da liberação de citocinas inflamatórias, tais
32
como IL-6, IL-1, TNF-α e IFN-γ, que produzem, em seu conjunto, a febre e os calafrios
característicos da doença (Anstey et al., 2009).
Anualmente, 5 a 10 milhões de indivíduos infectados desenvolvem complicações durante
a infecção, que podem manifestar-se como acidose metabólica, hipoglicemia, insuficiência renal,
edema pulmonar, hepatoesplenomegalia (White & Ho, 1992; Boulos et al., 1993), além de
anemia profunda devido à destruição maciça dos glóbulos vermelhos que são utilizados pelo
Plasmodium para reproduzir-se (Brasil, 2010). Mal-estar, dores musculares, sudorese, náusea,
vômito, diarréia e tontura podem acompanhar ou preceder os sintomas da tríade (Tobón et al.,
2006). Nos casos complicados, podem ainda ocorrer dor abdominal forte, sonolência e redução
da consciência, podendo levar ao coma nos casos de malária cerebral (Brasil, 2006).
A gravidade da doença depende da espécie de plasmódio presente e do estado
imunológico do hospedeiro (Suh et al., 2004; Brasil, 2006). As infecções causadas por P. vivax,
P. ovale e P. malariae são geralmente mais brandas do que as causadas por P. falciparum, nas
quais o período de incubação é mais curto, a evolução da doença mais rápida e a gravidade da
doença geralmente maior, uma vez que este parasito penetra todos os eritrócitos, sejam células
maduras ou jovens (Suh et al., 2004).
A malária grave, por ser responsável pelo grande número de mortes em regiões tropicais,
tem sido o alvo da maior parte dos estudos sobre a doença, principalmente no que diz respeito ao
P. falciparum, espécie mais patogênica e melhor estudada. Entretanto, diferenças nas
manifestações da doença podem ser observadas, com uma parcela dos indivíduos desenvolvendo
complicações graves, enquanto outros não, sendo as razões para isso pouco esclarecidas (Clark et
al., 2010). Alguns estudos têm demonstrado que fatores do parasito, como a virulência da cepa,
por exemplo, bem como a idade e características genéticas do hospedeiro, podem estar
envolvidos no aumento da susceptibilidade e/ou resistência ao desenvolvimento de complicações
clínicas e hematológicas na infecção malárica (Randall et al., 2010).
A malária cerebral (MC) é uma forma grave de malária e está relacionada à infecção
causada pelo P. falciparum (Moxon et al., 2009; Rao et al., 2010), caracterizada por processos
como a inflamação sistêmica, lesão neuronal e disfunção da hemostase, que ocasionam
complicações cerebrais, tais como danos neuronais, coma e, frequentemente, levam o indivíduo a
morte (Rao et al., 2010).
33
A MC é causada pela aderência das hemácias infectadas aos capilares sanguíneos
cerebrais (Van der Heyde et al., 2006; Wilson et al., 2008). Este fenômeno de citoaderência é
mediado pela interação de proteínas do hospedeiro com proteínas do parasito, que serão
produzidas via estimulação do gene var e expressas na superfície do eritrócito infectado, tais
como a Proteína 1 de Membrana do Eritrócito do P. falciparum (PfEMP1; Chakravorty et al.,
2008). A expressão dessa proteína, por exemplo, permite que as hemácias parasitodas se liguem a
moléculas da célula do hospedeiro, tais como a Molécula de Adesão Intercelular Tipo 1 (ICAM-
1), Molécula de Adesão a Células Vasculares (VECAM), o ácido hilurônico, entre outras, o que
provoca uma interrupção no fluxo sanguíneo, obstruindo vasos e comprometendo a oxigenação
de órgãos adjacentes (Chakravorty et al., 2008; Phiri et al., 2009). O resultado final é a obstrução
de capilares de importantes órgãos como cérebro, pulmão, fígado e rins, cuja anóxia contribui
para a fisiopatologia da malária grave (Clark et al., 2006; Van der Heyde et al., 2006).
Entretanto, os eventos que levam às complicações e à morte por P. falciparum são multifatoriais,
envolvendo ainda alteração da homeostase, inflamação sistêmica e lesão neuronal (Rao et al.,
2010).
A citoaderência nos capilares pulmonares está relacionada com o desenvolvimento da
malária pulmonar, que pode apresentar manifestações clínicas variáveis, desde brandas,
relacionadas às vias aéreas superiores, até complicações mais graves, como hipóxia severa,
edema pulmonar e morte (Boulos et al., 1993; Ferreira et al., 2004; Phiri et al., 2009).
As manifestações clínicas da doença também podem ser relacionadas com a hemólise
intravascular e consumo de glicose pelo parasito. A intensidade dos sintomas está relacionada à
carga parasitária e liberação de citocinas (Suh et al., 2004).
1.5. PATOGENIA DA MALÁRIA
A proteção de um hospedeiro contra uma infecção está ligada a uma complexa interação
entre mecanismos imunes inatos e adquiridos (Smith et al., 2002). Na primeira linha de defesa do
organismo contra a malária, células como macrófagos, células Natural Killer (NK), células
dendríticas e células T são apontadas como as mais importantes (Stevenson & Riley, 2004;
Wykes et al., 2007).
34
A resposta imune adaptativa aos parasitos da malária no estágio sanguíneo depende tanto
da resposta celular, quanto do mecanismo mediado por anticorpos (Gillman et al., 2004). O
Plasmodium utiliza, em especial, a variabilidade genética como estratégia para se evadir do
sistema imune do hospedeiro (Gardner et al., 2002), por isso a reposta imune protetora não é
exclusivamente efetiva e várias são as causas: a estrutura dos antígenos e sua considerável
diversidade dificulta a resposta imune, a localização intracelular do parasito e ausência de
moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) nos eritrócitos concorrem para
que estes proporcionem um meio relativamente favorável ao crescimento do plasmódio,
influenciando a sobrevivência do parasito e a transmissão ao vetor (Smith et al., 2002).
Estudos indicam que as células T CD4+ ativadas liberam fatores químicos, incluindo o
Interferon Gama (IFN-γ), os quais induzem a sequência de mecanismos para matar os parasitos
(Li & Langhorne, 2000; Gillman et al., 2004). As citocinas produzidas por macrófagos possuem
vários efeitos que contribuem para a defesa do organismo. Um desses efeitos é a elevação da
temperatura corporal, que é mediada principalmente pelas citocinas Fator de Necrose Tumoral
Alfa (TNF-α), Interleucina 1 (IL-1) e Interleucina 6 (IL-6), pirógenos que causam febre e
derivam de uma fonte endógena e não de componentes parasitários (Gorczynski & Stanley, 2001;
Seoh et al., 2003). Os efeitos mais importantes do TNF-α, IL-1 e IL-6 são o início da reação da
resposta de fase aguda na infecção. Essa reação envolve uma alteração nas proteínas secretadas
pelo fígado no plasma sanguíneo e resultam da atividade do TNF-α, IL-1 e IL-6 sobre os
hepatócitos (Gorczynski & Stanley, 2001; Seoh et al., 2003).
Sugere-se ainda que uma cascata de reações levando a produção de Óxido Nítrico (NO)
esteja envolvida na fisiopatogenia da malária. No entanto, há alguns relatos contraditórios sobre
o papel do NO e moléculas relacionadas à fisiopatogenia da malária. Alguns pesquisadores
propoem que o NO esteja envolvido no desenvolvimento de malária grave (Gramaglia et al.,
2006), enquanto outros defendem um papel protetor para o NO (Chiwakata et al., 2000).
Paralelamente, fatores genéticos relacionados ao hospedeiro, como a anemia falciforme e
deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), talassemias e antígenos de grupos
sanguíneos podem modificar a gravidade da doença, contribuindo, em alguns casos para proteção
do indivíduo contra a infecção (Roth et al., 1986; Ruwende et al., 1995).
Os parasitos da malária demonstram extensiva diversidade antigênica e ainda sofrem
variação antigênica. A imunidade para malária em uma diversidade de hospedeiros, inclusive
35
humanos, é marcadamente espécie-parasito, linhagem e variante específica, no entanto um grau
de resistência-cruzada é relatado em alguns casos (Mota et al., 1998; Gardner et al., 2002). Sendo
assim, diante da complexidade da patogenia da malária e em virtude do desenvolvimento de
novas ferramentas para seu combate e controle, tem-se discutido nas últimas décadas o
envolvimento das vias de regulação redox, tais como o estresse oxidativo, o aumento das defesas
antioxidantes pelo hospedeiro (Silva, 2011) e a expressão de citocinas diversas, como IFN-γ e
TNF-α (Good & Doolan, 1999; D’Ombrain et al., 2008; Robinson et al., 2009).
1.6. RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO
Radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativos e altamente instáveis, que
contém número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica (Halliwell & Gutteridge,
2007), ou seja, são espécies químicas reativas que possuem elétrons não pareados nos orbitais
mais externos. Os radicais livres podem reagir com qualquer biomolécula, sendo necessário
apenas que estas biomoléculas existam na proximidade do local de formação do radical livre.
Estas espécies químicas podem ser formadas em meio de reações de óxido-redução, isto
é, ou cedem o elétron não-pareado, oxidando-se, ou recebem outro, reduzindo-se, bem como por
fissão homogênea de uma ligação química (Ferreira & Matsubara, 1997).
Entretanto, radical livre não é o termo ideal para designar algumas destas moléculas, uma
vez que, algumas não apresentam elétrons não-pareados em sua última camada, mas são
importantes para o metabolismo oxidativo, constituindo-se as Espécies Reativas do Oxigênio
(ERO). Estas moléculas recebem este nome por serem em sua maioria derivadas do metabolismo
do oxigênio e são consideradas as principais espécies químicas relacionadas a mecanismos
patogênicos em humanos e animais (Halliwell & Gutteridge, 1990).
As principais ERO são: Radical Superóxido (O2●-
), Peróxido de Hidrogênio (H2O2),
Radical Hidroxila (OH●), Radical Alquila (R
●) e Radical Peroxila (ROO
●), Óxido Nítrico (NO) E
Peroxinitrito (ONOO-; Halliwell & Gutteridge, 1986; 2007). As ERO são encontradas nos
sistemas biológicos, tais como as mitocôndrias, peroxissomas, citoplasma e membrana de
células, retículo endoplasmático, fagócitos, lisosomas (Ferreira & Matsubara, 1997) e são
formadas continuamente durante o metabolismo celular, sendo que as principais fontes geradoras
dessas moléculas envolvidas na fisiopatogenia da malária são as reações catalisadas por metais
36
de transição, notadamente as reações de reações de Haber-Weiss e Fenton, responsáveis pela
produção do radical hidroxila (Figura 3); a fosforilação oxidativa; a cadeia de transporte de
elétrons; a explosão respiratória e a síndrome de isquemia e reperfusão - SIR (Figura 4; Percário
et al., 2012).
A fosforilação oxidativa na mitocôndria é o processo metabólico da síntese de Adenosina
Trifosfato (ATP), a partir da energia liberada pelo transporte de elétrons na cadeia respiratória.
Em condições normais a produção de ATP mitocondrial se dá devido ao fluxo intermitente de
elétrons possibilitados pelos derivados reduzidos do ácido tricarboxílico (Nicotinamida Adenina
Dinucleótido - NADH e o Dinucleotídeo de Flavina e Adenina - FADH2). Dessa forma, cerca de
1% do oxigênio consumido para a formação de água (reduzido simultaneamente com quatro
elétrons) é convertido a radical superóxido (redução incompleta do oxigênio com apenas um
elétron), resultado de um fluxo inconstante de elétrons (Fariss, 2005). Um dos principais
mecanismos de combate a microrganismos é fenômeno chamado de explosão respiratória, no
qual os fagócitos, por meio da ativação da enzima Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
Oxidase (NOX) convertem o oxigênio consumido em O2●-
, produzindo grandes quantidades em
frações de segundo (Kontush & Chapman, 2006; Brown, 2009).
37
Figura 3: Reações de Haber-Weiss e Fenton. - (1) Reação de Haber Weiss: O radical superóxido
(O●-
) reage com o peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de metais de transição, para
produzir radicais hidroxila (HO●-), íons hidroxila (HO
-) e oxigênio (O2). (2) Reação de Fenton: O
peróxido de hidrogênio (H2O2) é ionizado na presença de íons ferrosos, levando à produção de
OH● e HO
-. O íon ferroso (Fe
+2) sofre oxidação, sendo liberado na forma de íon férrico (Fe
+3).
Paralelamente, radicais superóxido adicionais podem ser produzidos pela síndrome de
isquemia e reperfusão, que também produz o peróxido de hidrogênio. Por sua vez, estes dois
radicais produzidos poderão reagir entre si, produzindo a reação de Haber-Weiss, originando
radicais OH●, ainda mais reativos e capazes de propagar e difundir o dano oxidativo (Percário,
2008).
Outro radical livre importante é o NO, produzido a partir do aminoácido L-arginina por
ação das enzimas óxido nítrico sintetase (NOS). Foram descritas três isoformas de enzimas NOS
que são agrupadas em duas categorias, a NOS constitutiva (c-NOS), dependente de íons cálcio
(Ca+2
) e de calmodulina, que está envolvida na sinalização celular, presente nos neurônios não-
colinérgicos não-adrenérgicos e células endoteliais, e a NOS induzível (i-NOS), produzida por
macrófagos, células hepáticas e endoteliais e ativadas por citocinas, especialmente TNF-α e INF-
γ (Moncada et al., 1991; Marletta, 1993). Todas as isoformas de NOS requerem a Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH) e o O2 como co-substratos na reação de síntese de NO
(Wang & Marsden, 1995).
REAÇÃO DE HABER-WEISS
H2O2 + O2●- OH
● + OH
- + O2
REAÇÃO DE FENTON
H2O2 + Fe2+
OH● + OH
- + Fe
3+
Metais de transição
1
>
2
38
Figura 4: A) A sequência de eventos que ocorrem na síndrome de isquemia e reperfusão (SIR).
B) Integração da SIR com a reação de Haber-Weiss. Legenda: ATP=Trifosfato de adenosina;
ADP=Difosfato de adenosina; AMP= Monofosfato de adenosina; Ca+2
= íon cálcio; O2=
Oxigênio; O2●-
= radical superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; OH- = íon hidroxila; OH
● =
radical hidroxila; H2O = água (Adaptado de Percário, 2008).
Em condições normais, o NO desempenha papel chave na manutenção da integridade da
parede vascular por inibição da inflamação, proliferação celular e trombose, reduzindo o tônus
vascular, a ativação de plaquetas e leucócitos, a proliferação de células musculares lisas, a
deposição de matriz extracelular e a morte de células endoteliais (Marletta, 1993; Fitzgerald et
al., 2007). Quando produzido juntamente com o radical O2●-
reage de forma extremamente rápida
resultando na formação de ONOO-. O peroxinitrito é um vasodilatador menos potente que o NO,
instável e que pode por meio de uma protonação a um íon hidrogênio (H+), originar o radical
OH●-
, aumentando efetivamente a ação tóxica do NO e do O2●-
e dando continuidade a cascata de
reações oxidativas (Beckman & Koppenol, 1996).
As ERO fazem parte do mecanismo intermediário das moléstias que envolvem isquemia,
inflamação, trauma, efeitos da radiação ionizante e hiperóxia (Halliwell, 1990). Mesmo nas
moléstias onde as ERO não são a causa primária de lesão, elas são importantes porque toda
destruição celular libera ferro, o qual catalisa a geração do OH●-
, sendo capaz de iniciar a
A)
ATP
I
s ADP
q
u AMP
e
m ADENOSINA Xantina Desidrogenase
i
a INOSINA Ca++
Calpaina
HIPOXANTINA Xantina Oxidase
O2
- + H2O2 + Urato + Xantina
O2
R e p e r f u s ã o
2
Transição de Metais222
OOHOHOHO
B)
39
peroxidação lipídica e geralmente resultando na destruição das membranas celulares das células
vizinhas e na propagação do dano celular (Ferreira & Matsubara, 1997).
Entretanto, quando ocorre uma produção aumentada de radicais livres em detrimento da
capacidade fisiológica de defesa antioxidante, ocorre o desequilíbrio da sinalização e controle
redox, caracterizando o estresse oxidativo (Jones, 2006). A partir de então, ocorre o dano celular,
resultando no aparecimento de sinais e sintomas clínicos de moléstias (Percário, 2008).
Adicionalmente, as interações parasito-hospedeiro são bastante complexas e promovem
constante mudança no delicado equilíbrio redox, uma vez que, tanto o parasito como o
hospedeiro são capazes de produzir oxidantes e antioxidantes (Uhlemann et al., 2004).
1.6.1. Malária e o Estresse Oxidativo
A resposta à infecção causada pela malária manifesta-se primariamente pelo mecanismo
de defesa natural do organismo hospedeiro com envolvimento de fagócitos (macrófagos ativados
e neutrófilos). Estes, por sua vez, geram grande quantidade de ERO (radicais superóxido e
peróxido de hidrogênio, dentre outras) e enzimas hidrolíticas, ocasionando um desequilíbrio entre
a formação de espécies oxidantes e a atividade dos antioxidantes (Ferreira & Matsubara, 1997).
Este desequilíbrio é o que desencadeia o estresse oxidativo, sendo este um importante mecanismo
do hospedeiro humano em resposta a infecções microbianas em geral.
Nesse sentido, estudos têm sido desenvolvidos no intuito de relacionar o envolvimento
dos radicais livres, através do estresse oxidativo, na resposta imunológica e na patogenia da
malária (Good & Doolan, 1999; Pino et al., 2003; Becker et al., 2004; Gillman et al., 2004;
Moreira, 2010; Silva, 2011).
A exemplo disso é sabido que o parasito é exposto a estresse oxidativo ao entrar nos
glóbulos vermelhos (Hunt & Stocker, 1990). No eritrócito, o ferro do heme está quase que
inteiramente no estado ferroso. Quando ocorre a degradação da hemoglobina no vacúolo
digestivo, o ferro é oxidado para o estado férrico, sendo que os elétrons liberados por oxidação
combinam com o oxigênio molecular para formar as ERO: O2●-
, OH●-
e H2O2. Esta parece ser
uma importante fonte de estresse oxidativo desencadeado pelo parasito (Atamna & Ginsburg,
40
1993; Francis et al., 1997). As ERO que são geradas durante a degradação da hemoglobina têm
sido propostas como as grandes causadoras de danos à célula hospedeira (Vennerstrom & Easton,
1988). De mesmo modo, sabe-se que o Plasmodium é altamente suscetível às ERO durante parte
do seu ciclo eritrocítico, em conseqüência, o estresse oxidativo pode levar à morte do parasito
(Clark et al., 1989).
A exemplo disso, um estudo desenvolvido por Erel et al. (1997) mostrou um aumento nos
indicadores do estresse oxidativo, acompanhado de uma diminuição das defesas antioxidantes em
pacientes infectados com o P. vivax, mostrando a participação do balanço redox na patogenia da
doença, sugerindo que o aumento do estresse oxidativo possa estar ligado ao mecanismo de
defesa do hospedeiro. Da mesma maneira, Hermsen et al. (1997) demonstram que as ERTO
possuem papel importante no desenvolvimento de malária cerebral em camundongos infectados
por P. berghei.
No entanto, ainda não há um grande conhecimento acerca dos mecanismos precisos do
envovimento do estresse oxidativo na doença, existindo diversos relatos contraditórios sobre o
papel dos radicais livres, notadamente acerca do NO, em estudos clínicos e experimentais da
malária. Nesse sentido, alguns pesquisadores propoem que o NO está envolvido na patogenia da
malária (Chiwakata et al., 2000; Gramaglia et al., 2006), como por exemplo o estudo realizado
em 2006 por Nahrevania & Dascombe que relatou o aumento da síntese de óxido nítrico em
camundongos infectados com P. berghei.
Em contrapartida, Chiwakata et al. (2000) encontraram níveis mais elevados de NO em
amostras de pacientes de malária não grave, em comparação a pacientes com malária grave,
sugerindo um papel benéfico do NO na patogenia da malária causada por P. falciparum.
De maneira análoga, o peróxido de hidrogênio ainda não tem papel totalmente esclarecido
na malária. Em meados da década de 80, Dockrell & Playfair (1984) realizaram um estudo para
verificar a possível associação entre a eliminação de P. yoelii ao aumento da produção de ERO,
incluindo, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila e concluíram que o H2O2
foi a ERO mais eficaz na eliminação do P. yoelii em camundongos. Outro estudo com
camundongos infectados com P. berghei K173 susceptíveis a malária grave, demonstrou que
estes animais produzem quantidades significantemente menores de O2●-
e H2O2 do que os
41
camundongos da mesma espécie infectados com P. yoelli 17XNL, os quais apresentam infecção
limitada, sugerindo que a produção de ERO influencie na evolução clínica da malária letal e não
letal (Brinkmann et al., 1984).
Estudos em pacientes infectados com P. vivax ou P. falciparum mostraram que ocorre um
aumento na produção de ERO e que esse aumento contribui para a diminuição da parasitemia
desses pacientes, provavelmente devido ao aumento da produção de H2O2 encontrada (Pabón et
al., 2003; Turrens, 2004).
A respeito do radical superóxido, sua participação é observada em inúmeras doenças. A
produção aumentada de O2●-
relaciona-se com aterosclerose, esclerose múltipla e hipertensão
(Glabinski et al. 1993; Cangemi et al., 2007; Lavi et al., 2007; Custodis et al., 2008),
contribuindo para o início de eventos pró-inflamatórios. A disfunção endotelial também se
relaciona com o aumento da produção de superóxido (Cangemi et al., 2007; Chan et al., 2007).
Alguns autores também discutem o papel do superóxido no clearence de alguns parasitos como
Toxoplasma gondii (Murray & Cohn 1979), Leishmainia donovani e Leishmania tropica
(Haidaris & Bonvetere, 1982) e Trypanossoma cruzi (Maugeri & Cazzulo, 2004; Souza, 2008).
Dessa forma, os intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio, em especial o óxido
nítrico, têm sido sugeridos como possíveis agentes que atuam na eliminação do Plasmodium e na
fisiopatogenia da doença em geral (Good & Doolan, 1999; Greve et al., 1999; Gillman et al.,
2004). Nesse sentido, entre as diversas fontes de radicais livres que podem participar dos
mecanismos fisiopatológicos que cursam com a doença, destaca-se que a produção dessas
espécies pelas NOX, tem recebido especial atenção, nos últimos anos no sentido de elucidar a
participação/relação entre o referido complexo, o desbalanço redox e a patogênese de inúmeras
doenças (Lassègue & Clempus, 2003; Brown & Griendling, 2009).
1.7. NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO FOSFATASE OXIDASE – NADPH
OXIDASE
Os fagócitos são células cuja principal função é identificar, ingerir e destruir
microrganismos. São originários da medula óssea e representados pelos neutrófilos, monócitos e
macrófagos e células dendríticas (Abbas et al., 2008).
42
A ativação de fagócitos e neutrófilos mononucleares resulta na secreção do conteúdo de
seus grânulos: peptídeos microbicidas (defensinas, proteína antimicrobiana catiônica) e enzimas
líticas (mieloperoxidase, elastase, catepsina G). Este fenômeno é acompanhado pela geração de
ERO – fenômeno este, denominado de “explosão respiratória” – que podem ser liberados para o
interior dos fagolisosomos formados após a fagocitose, onde contribuem para a morte dos
microrganismos ingeridos, ou, em algumas circunstâncias, para o meio extracelular, causando
danos aos tecidos (Faurschou & Borregaurd, 2003).
As NOX constituem um grupo de enzimas intrínsecas da membrana, presentes em células
de origem mesodérmica, incluindo os fagócitos, que catalisam a transferência de elétrons através
da membrana celular (Babior, 1999). As proteínas do sistema NADPH oxidase atuam como
doadoras de elétron catalisando a redução do oxigênio, que será transformado em superóxido
(Abdalla, 2001; Bedard & Krause, 2007; Paravicini & Touyz, 2008).
As ERO, a nível vascular, são produzidas por uma grande variedade de enzimas,
nomeadamente xantina oxidases, lipoxigenases, cicloxigenases, NO sintetases e peroxidases
(Miller et al., 2007; Williams & Griedling, 2007). No entanto, é notável que as NADPH oxidases
estão particularmente adaptadas para intervirem nas vias de sinalização redox Bedard & Krause,
2007). A NADPH oxidase clássica foi primeiramente descrita e caracterizada em células
fagocitárias e considerava-se que era exclusivamente utilizada no mecanismo de defesa contra
microrganismos invasores (San Jose et al., 2008).
Os estudos sobre os componentes do sistema de NADPH oxidase, seus genes e estruturas
tem avançado nos últimos 20 anos (Paravicini &Touyz, 2008) e, devido a este fato, a NADPH
oxidase fagocítica é um dos modelos mais bem estabelecidos e foi o primeiro exemplo de um
sistema que gera ERO não como um subproduto, mas sim como a principal função do sistema
enzimático (Geiszt, 2006; Bedard & Krause, 2007).
A forma clássica desta enzima, presente no fagócito, possui subunidades localizadas no
citoplasma celular - p47phox, p67phox, p40phox e Rac2 - e subunidades localizadas na
membrana celular - gp91phox, p22phox, que formam o flavocitocromo b558 (Figura 5; Geiszt,
2006; Bedard & Krause, 2007).
A identificação de subunidades homólogas à gp91phox (Nox2), resultou na formação da
família NOX, constituída, atualmente por sete membros (Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5,
43
Duox1 e Duox2; Quadro 1). A subunidade catalítica da proteína é conhecida como Nox2 ou
gp91phox e juntamente com a Nox4 são as principais componentes do complexo, uma vez que
são altamente expressas nas células vasculares e aumentadas durante o processo de
remodelamento vascular (Brown & Griendling, 2009). A gp91phox é uma proteína altamente
glicosilada que possui propriedades estruturais conservadas, contêm um sítio de ligação para
NADPH e um sítio de ligação para Flavina Adenina Dinucleotídeo (FAD), localizados na porção
carboxi-terminal; seis domínos transmembrana e quatro histidinas como sítios de ligação para
moléculas de heme (Geiszt, 2006). Essa proteína contém 570 aminoácidos e mutações nos genes
que codificam a gp91phox causam a Doença Granulomatosa Crônica, que é caracterizada pela
incapacidade de produção de superóxido e peróxido de hidrogênio pelos seus portadores, o que
os torna suscetíveis a infecções (Volpp et al., 1988; Bedard & Krause, 2007).
Quadro 1: Distribuição das NADPH oxidases
NADPH Oxidase Tipo Celular/ Tecido em que se expressa
NOX1 Cólon, útero, placenta, músculo liso, próstata e osteoclastos
NOX2 Células fagocíticas, endotélio, cardiomiócito, tecido muscular e
pulmão
NOX3 Ouvido interno, rim, pulmão, tecido fetal, fígado e baço
NOX4 Rim, tecido muscular liso, endotélio, fibroblastos, queratinócitos e
cardiomiócitos
NOX5 Tecido Linfoide, Testículo, próstata, ovários e pâncreas
DUOX1 Tireoide, epitélio respiratório, epitélio lingual, cerebelo e testículos
DUOX2 Tireoide, glândulas retais e salivarias, epitélio gastrointestinal,
epitélio respiratório, útero e vesícula biliar.
Sabe-se que este complexo enzimático quando gera ERO de forma lenta e
contínua (Lasségue & Clempus, 2003). Os estudos sobre especificidade tecidual e expressão dos
genes que codificam o flavocitocromo reveleram que o gene CYBB (que codifica a gp91phox) se
expressa predominantemente nos fagócitos e o gene p22-phox se expressa constitutivamente em
várias linhagens celulares (Royer-Pokora et al., 1986; Brown & Griendling, 2009). Sendo assim,
a NOX, pode também estar presente nas mais variadas células do organismo (endoteliais,
pulmonares, cerebrais, etc) desempenhando, além da atividade mencionada, a modulação dos
fatores de transcrição, interferindo diretamente na expressão gênica (Brown & Griendling, 2009).
Entretanto, a NADPH oxidase expressa nos fagócitos difere daquela encontrada em células
44
vasculares, tanto pela estrutura bioquímica quanto pelas funções que realiza (Dusting et al., 2004;
Rabêlo et al., 2010).
Num fagócito inativo, os diferentes elementos do complexo NADPH oxidase
encontram-se dispersos em diferentes partes da célula. Quando ocorre um estímulo, os
componentes citoplasmáticos deslocam-se para o fagossoma ou para a membrana plasmática e
agrupam-se com as proteínas integrais da membrana para formar um complexo enzimático ativo
(San Jose et al., 2008).
Figura 5: Estrutura da NADPH oxidase fagocítica ativada (Adaptado de Dusting et al., 2004).
Para que ocorra a ativação da NADPH oxidase são requeridas as interações de suas
subunidades protéicas na membrana do fagossoma dos macrófagos ativados e é um processo de
várias etapas. Esse processo inicia-se pela fosforilação de um resíduo de serina da p47phox,
desencadeando a formação de um complexo das subunidades citoplasmáticas, o qual é
translocado para a membrana, aonde se associa ao flavocitocromo b558, constituindo assim a
enzima em sua forma ativa (Babior et al., 2002; Sumimoto et al., 2005). Por sua vez, esse
complexo enzimático forma um sistema de transporte de elétrons transmembra que resulta na
45
oxidação da NADPH na superfície citoplasmática e na geração de superóxido na superfície
externa da membrana, segundo a seguinte reação representada na figura 6 (Abdalla, 2001; Babior
et al., 2002).
2 O2 + NADPH 2 O2●-
+ NADP+ + H
+
Figura 6: Produção do radical superóxido (O2●-
) por ação da enzima NADPH oxidase.
A NADPH oxidase retira elétrons do NADPH e os transporta via FAD e heme ao
oxigênio molecular (Abdalla, 2001). O doador terminal de elétrons para o oxigênio é o
flavocitocromo b e o superóxido produzido é, na sequência, convertido em H2O2, Ácido
Hipocloroso (HOCl) e outros produtos microbicidas (Abdalla, 2001; Babior et al., 2002).
As NOX são ativadas e reguladas por diversos fatores como hormônios, citocinas, dentre
os quais se destacam a trombina, o Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF), TNF-α,
a lactosiceramida, Interleucina-1 e a Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) Oxidada (LDLox)
(Rueckschloss et al., 2001; Geiszt, 2006).
1.7.1. Malária e NADPH Oxidase
Diante da participação do complexo enzimático NADPH oxidase na produção de ERTO,
alguns estudos começam a ser desenvolvidos no sentido de tentar elucidar a participação dessas
enzimas na patogênese da malária, entretanto, ainda são poucos os que tentam avaliar o real
papel da NADPH oxidase na patogenia da malária.
A exemplo disso, um estudo de Gillman et al. (2004) realizado em camundongos
knockout para NADPH oxidase (p47phox -/-
) infectados com P. chabaudi, demonstrou que esses
animais não tem a parasitemia exacerbada na ausência da enzima, sugerindo que a supressão da
parasitemia é independente das ERO durante o estágio sanguíneo da doença.
Do mesmo modo, um estudo do estresse oxidativo induzido pelo plasmódio foi realizado
em camundongos knockout para o gene da enzima NADPH oxidase. Entretanto, a despeito do
aumento dos níveis em marcadores do estresse oxidativo, os animais não apresentaram diferenças
na progressão da parasitemia para nenhuma das espécies de Plasmodium testadas (P. yoelii, P.
46
chabaudi K562, P. berguei ANKA, P. berguei K173 e P. Vinckei vinckei). Estes dados sugerem
que a produção de radicais livres esteja aumentada em decorrência da infecção e que não seja
oriunda da explosão respiratória de fagócitos, mas possivelmente esteja associada à produção
pelo próprio parasito, bem como pela produção de óxido nítrico (Potter et al., 2005).
Em contrapartida, um estudo desenvolvido em crianças do Gabão, com malária branda e
malária grave, encontrou a presença de um polimorfismo dinucleotídeo no gene promotor da
gp91phox
da NOX, que conferia proteção contra a malária severa, devido à diminuição dos níveis
da enzima ativa e consequente diminuição da liberação de O2●-
(Uhlemann et al., 2004).
Frente ao exposto, tem se tornado evidente que a produção de ERO, especialmente
superóxido e peroxinitrito, não é um processo acidental, porém um processo enzimático
controlado que pode ativar circuitos fisiopatológicos em inúmeras situações de doença (Finkel,
2003). Isto sugere que a NADPH oxidase como fonte enzimática de ERTO seja um elemento
chave na cascata de sinalização redox (Griendling et al., 2000) e possivelmente integrante
importante da resposta imunológica a malária (Uhlemann et al., 2004).
1.7.2. Inibidores da NOX
Considerando a importância do complexo NADPH oxidase no perfil imunológico e
equilíbrio redox e o efeito deletério da produção descontrolada de ERO, muitas substâncias têm
sido estudadas como inibidores da enzima no intuito de elucidar o seu real papel no perfil
oxidativo, entre as quais se situam o gp91ds-tat, o PR39, o difenileno iodônico, o fluoreto de
aminoetil, a neopterina e a apocinina (Williams & Griendling, 2007).
47
1.7.2.1. Apocinina
Historicamente, a apocinina foi primeiramente descrita por Oswald Schimiedeberg, um
farmacologista alemão também conhecido como “Pai da Farmacologia Moderna”, em 1883
(‘tHart et al., 1991), e foi isolada a partir da raiz da maconha canadense Apocynum cannabinum e
era utilizada no tratamento de hidropsia e problemas cardíacos (Kim et al., 2010). Em 1971, a
apocinina foi identificada durante um estudo de constituintes imunomoduladores da planta
Picrorhiza kurroa (Scrophulariaceae), nativa da Índia, Nepal, Tibet e Paquistão e é largamente
conhecida na medicina indiana (Ayurveda; Stefanska & Pawliczak, 2008).
Desde o início dos anos 90, a apocinina tem sido o inibidor seletivo da NOX de escolha
em modelos experimentais, uma vez que tem se mostrado com baixa toxicidade in vivo e pode
ser usada por longos períodos e altas doses (Figura 7; Aldieri et al., 2008).
A apocinina é um metóxi-catecol (4-hidroxi-3-metoxiacetofenona), também conhecido
como acetovanilona e estruturalmente relacionado à vanilina. É composto orgânico natural,
derivado de acetofenona, que possui peso molecular de 166,17g/mol e forma agulhas após
cristalização em água. Possui um fraco odor de baunilha e um ponto de fusão de 115 ºC (Wang et
al., 2008; Stefanska & Pawliczak, 2008). Este composto tem sido isolado de uma variedade de
fontes vegetais, possui propriedades farmacológicas e tem sido largamente utilizado como um
inibidor eficiente do complexo NADPH-oxidase em muitos modelos experimentais envolvendo
células fagocíticas e não fagocíticas, apresentando um potencial antiinflamatório (Barbieri et al.,
2004; Zhang et al., 2005; Vejrazka et al., 2005; Riganti et al., 2006; Aldieri et al., 2008;
Heumuller et al., 2008; Schlüter et al, 2008).
Essa substância tem recebido especial atenção dos pesquisadores, especialmente quando
se trata de estudos que apontam a apocinina como molécula de escolha para avaliar o
envolvimento do sistema NADPH oxidase em modelos experimentais in vivo e/ou in vitro
(Petrônio et al., 2013). A exemplo disso, Rupin e colaboradores (2004) desenvolveram um
estudo utilizando células endoteliais de cordão umbilical submetidas a SIR, que levou a
processos de ativação celular e consequente produção de ERO e moléculas de adesão conhecidas
48
como selectinas. A cultura dessas células em tratamento com apocinina inibiu a geração de ERO
e diminuiu a expressão das selectinas.
Figura 7: Estrutura Química da Apocinina (adaptado de Kim et al., 2010).
Em um estudo envolvendo suínos submetidos a um modelo experimental de lesão
pulmonar e pré-tratados com altas doses de apocinina (400mg/kg) via intravenosa foi sugerido
que as ERO derivadas do sistema NOX contribuam para o dano pulmonar. Entretanto, o
tratamento com a apocinina diminuiu a ativação basal dos neutrófilos periféricos e diminuiu a
geração de ERO nesses animais (Dodd-o et al., 2004). Paralelamente, outro estudo desenvolvido
em células mononucleares obtidas de pacientes portadores de artrite reumatóide demostrou
também que a apocinina inibiu a liberação de citocinas pró-inflamatórias (LaFeber et al., 1999).
Em animais de experimentação, ‘tHart e colaboradores (1991) mostraram que ratos
tratados via oral com baixas doses de apocinina (0,3µg/ml em água de beber) apresentaram
redução severa da artrite induzida por colágeno (‘tHart et al., 1991). Liu e colaboradores (2012)
reportaram que a administração de apocinina em camundongos deficientes para o receptor de
LDL gerou a diminuição da expressão de P-selentina, VCAM-1e reduzido acúmulo de
monócitos.
Em um modelo experimental da doença de Huntington induzido pela injeção intraestriatal
de ácido quinolínico em ratos, o aumento da atividade da NADPH oxidase parece estar envolvido
nos danos causados pela patologia. Foi observado que a injeção intraperitoneal de apocinina
49
levou à diminuição da atividade enzimática, diminuição da peroxidação lipídica e diminuição do
dano histológico (Maldonado et al., 2009).
Na hipertensão, a apocinina também impediu o aumento da geração de ERO e diminuiu a
rigidez arterial em ratos (Chen et al., 2012). Do mesmo modo, a apocinina melhorou a disfunção
erétil relacionada ao diabetes por reduzir a produção de ERO em de ratos diabéticos (Li et al.,
2012).
Assim, apesar de sua simplicidade estrutural como um derivado de acetofenona e embora
hajam controvérsias em relação à sua potência e seletividade como um inibidor de NOX
(Vejrazka et al., 2005; Riganti et al., 2006; Aldieri et al., 2008; Heumüller et al., 2008; Schlüter
et al, 2008), os efeitos farmacológicos que têm sido obtidos usando este fitoquímico são bastante
relevantes (Petrônio et al., 2013).
Entretanto, o modo de ação desta molécula não é totalmente conhecido, mas parece estar
relacionado ao impedimento da agregação dos componentes da enzima NOX (Barbieri et al.,
2004). Foi reportado que o mecanismo de ação da apocinina envolve sua metabolização por meio
da ação catalítica da enzima mieloperoxidase (MPO) e a consequente geração de um produto
dimérico (Figura 8; Ximenes et al., 2007).
Figura 8: Mecanismo proposto para a oxidação da apocinina (adaptado de Stefanska &
Pawliczak, 2008).
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
MPO – Mieloperoxidase
Apocinina
Dímero de
Apocinina
50
De modo geral, sugere-se que este metabólito iniba a agregação e translocação para a
membrana dos componentes citosólicos do complexo NADPH oxidase (Johnson et al., 2002). De
forma mais detalhada, a apocinina inibe a translocação para a membrana de dois componentes
citosólicos da Nox2, a porção p47phox
, p40phox
e p67phox
em leucócitos, monócitos e células
endoteliais (Figura 9; Aldieri et al., 2008; Stefanska & Pawliczak, 2008). No entanto, essa ação
inibitória ocorre apenas depois de um determinado tempo e parece ser dependente de MPO, uma
vez que, em células desprovidas ou deficientes de MPO, a apocinina não inibe o sistema NOX
(Stolk et al., 1994; Stefanska & Pawliczak, 2008) e estudos que utilizam zimosan para liberação
da MPO, reportam melhorar a eficácia da apocinina (Van den Worm et al., 2001).
Figura 9: Mecanismo de inibição da NADPH oxidase por apocinina (adaptado de Stefanska &
Pawliczak, 2008).
Atualmente não existem registros de trabalhos realizados que tratem do envolvimento da
NADPH oxidase e tampouco do uso da apocinina na infecção por malária. No entanto, alguns
NADPH Oxidase
Ativada
Dímero de
Apocinina
NADPH Oxidase
Inativada
51
estudos realizados em modelos de outras doenças criam evidências que sugerem um potencial
envolvimento da NADPH oxidase na resposta inflamatória da malária. A exemplo disso, Dhiman
& Garg (2011) estudaram camundongos infectados com Trypanossoma cruzi e que recebiam
tratamento com apocinina (1,5mM) em água de beber, os quais apresentaram 50 a 90% de
diminuição na produção de NOX/ERO endógenos, bem como diminuição de níveis de citocinas e
proliferação de fagócitos no baço. Foi concluído que a NOX/ERO tem papel regulador na
resposta do baço à infecção por T. cruzi e que a inibição da NADPH oxidase melhorou a
miocardite durante a doença de Chagas.
Analogamente, a diapocinina, forma oxidada dimérica da apocinina, teve profundos
efeitos neuroprotetores num modelo animal pré-clínico de doença de Parkinson, por meio da
atenuação do dano oxidativo e das respostas neuroinflamatórias (Gosh et al., 2012).
Em um modelo de estresse induzido, a depressão de animais provocou um aumento na
expressão de componentes citosólicos p47phox
e p67phox
de NADPH oxidase. No entanto, a
inibição farmacológica da NADPH oxidase por apocinina durante o período de estresse ou pós-
estresse bloqueou completamente o comportamento depressivo nesses animais (Seo et al., 2012).
Em um estudo com pacientes portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)
se constatou o aumento do estresse oxidativo, derivado do aumento da carga de oxidantes
inalados (fumaça de cigarro) e da poluição do ar. Em vista da falta de terapia que pode inibir a
progressão da doença, Stefanska e colaboradores (2012) realizaram a inalação de apocinina por
nebulização nesses pacientes, o que reduziu a concentração de peróxido de hidrogênio no ar
exalado e diminuiu a concentração de óxido nítrico. Os resultados sugeriram que apocinina pode
ser considerado como um agente anti-inflamatório e, eventualmente, utilizado em terapia de
DPOC.
1.8. MODELO EXPERIMENTAL DA MALÁRIA EM ROEDORES
São reconhecidas quatro espécies distintas de Plasmodium de roedores:
Plasmodium berghei, Plasmodium yoelii, Plasmodium vinckei e Plasmodium chabaudi. Cada
uma, com exceção do Plasmodium berghei, representadas por duas ou mais subespécies (Carter
& Diggs, 1977). Os plasmódios de roedores são divididos dentro de dois grupos: o grupo berghei
(P. berghei e P. yoelii) e o grupo vinckei (P. vinckei e P. chabaudi). As diferenças entre os dois
grupos são avaliadas em múltiplos aspectos, incluindo a morfologia dos parasitos no estágio
52
sangüíneo, padrão de proteção cruzada, sorologia e polimorfismo enzimático (Carter & Diggs,
1977).
O mais utilizado é o P. berghei cujas mudanças histopatológicas encontradas na maioria
dos órgãos e sequências genômicas são muito similares às causadas pela infecção humana pelo P.
falciparum (Andrade Junior et. al., 1991). O quadro clínico apresentado pelos animais infectados
também é muito semelhante ao encontrado em humanos, apresentando lesões em órgãos como
fígado, baço, cérebro e pulmões, tornando-se um modelo experimental ideal para o estudo da
malária (Penet, 2007).
53
1.9. OBJETIVOS
1.9.1. Objetivo Geral
Avaliar temporalmente os efeitos da inibição das enzimas NADPH oxidase sobre a defesa
antioxidante em camundongos infectados com o Plasmodium berghei.
1.9.2. Objetivos Específicos
(a) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase e suas isoformas em
marcadores laboratoriais da peroxidação lipídica em camundongos infectados por P.
berghei.
(b) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase e suas isoformas sobre a
atividade antioxidante total nesses animais.
(c) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase e suas isoformas sobre a
evolução da parasitemia nesses animais, bem como sua potencial relação com marcadores
do estresse oxidativo e da defesa antioxidante.
54
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Para a execução do experimento, foram utilizados 260 camundongos machos (Mus
musculus), linhagem Swiss, adultos, com 10 semanas de idade, peso variando entre 25 e 40g. Os
camundongos eram provenientes do Biotério do Instituto Evandro Chagas e foram alojados no
Biotério de Experimentação do Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo do ICB/UFPA
em gaiolas específicas para roedores, livre de ruídos, com condições livres de patógenos e livres
de reprodução durante os experimentos. O biotério foi mantido durante todo o experimento com
temperatura em torno de 25ºC e ciclo claro/escuro a cada 12 horas. Antes e durante o período de
estudo os animais foram mantidos com ração e água ad libitum.
Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, com tampa de arame inox, nas
medidas 41x34x16cm, contendo cama em maravalha de Pinus. As gaiolas eram substituídas em
dias alternados, sendo lavadas com água, sabão e desinfetadas com hipoclorito de sódio (Braggio
et al., 2003).
Os procedimentos experimentais com camundongos foram realizados de acordo com o
guia para utilização de animais de laboratório (citação) e o projeto foi submetido à apreciação
pelo Comitê de Ética na Pesquisa com Animais de Experimentação da Universidade Federal do
Pará – UFPA (Anexo 1).
2.1.1. Grupos Experimentais
Os animais foram divididos randomicamente em quatro (4) grandes grupos, descritos
abaixo:
Grupo A (+/+): Animais que receberam a administração de Apocinina e foram infectados
com P. berghei;
Grupo B (+/-): Animais que receberam a administração de Apocinina e não foram
infectados com P. berghei;
55
Grupo C (-/+): Animais que não receberam a administração de Apocinina e foram
infectados com P. berghei;
Grupo D (-/-): Animais que não receberam a administração de Apocinina e não foram
infectados com P. berghei.
Para a execução técnica, os animais foram subdivididos randomicamente de acordo com o
tempo de infecção a que eram submetidos, distribuídos segundo o quadro 2.
Quadro 2: Distribuição dos subgrupos por tempo de infecção.
GRUPO A (+/+) (Apocinina + / Infecção P. berghei +)
GA/1 dia
(N=10)
GA/5 dias
(N=10)
GA/10 dias
(N=15)
GA/15 dias
(N=15)
GA/20 dias
(N=15)
Eutanásia após 24
h de infecção. Eutanásia após 5
dias de infecção. Eutanásia após 10
dias de infecção. Eutanásia após 15
dias de infecção. Eutanásia após 20
dias de infecção.
GRUPO B (+/-) (Apocinina + / Infecção P. berghei -)
GB/1 dia
(N=10)
GB/5 dias
(N=10)
GB/10 dias
(N=15)
GB/15 dias
(N=15)
GB/20 dias
(N=15)
Eutanásia após 24
h de infecção. Eutanásia após 5
dias de infecção. Eutanásia após 10
dias de infecção. Eutanásia após 15
dias de infecção. Eutanásia após 20
dias de infecção.
GRUPO C (-/+) (Apocinina - / Infecção P. berghei +)
GC/1 dia
(N=10)
GC/5 dias
(N=10)
GC/10 dias
(N=15)
GC/15 dias
(N=15)
GC/20 dias
(N=15)
Eutanásia após 24
h de infecção. Eutanásia após 5
dias de infecção. Eutanásia após 10
dias de infecção. Eutanásia após 15
dias de infecção. Eutanásia após 20
dias de infecção.
GRUPO D (-/-) (Apocinina - / Infecção P. berghei-)
GD/1 dia
(N=10)
GD/5 dias
(N=10)
GD/10 dias
(N=15)
GD/15 dias
(N=15)
GD/20 dias
(N=15)
Eutanásia após 24
h de infecção. Eutanásia após 5
dias de infecção. Eutanásia após 10
dias de infecção. Eutanásia após 15
dias de infecção. Eutanásia após 20
dias de infecção.
56
Nos Grupos Controles (B, C e D) os animais foram submetidos aos mesmos
procedimentos experimentais e estiveram expostos às mesmas condições laboratoriais dos
animais do Grupo A.
2.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS ANIMAIS
Os animais dos Grupos A e C foram infectados por inoculação intraperitoneal de 107
hemácias infectadas pela cepa ANKA de Plasmodium berghei, diluídas em 0,2 mL de solução
salina estéril (0,9%). Os animais foram imobilizados sempre pela mesma pessoa, segurando-o
pela pele da nuca com o polegar e o indicador, deixando-o de abdômen voltado pra cima, e
prendendo a cauda (Garvey et al., 1977). A inoculação foi realizada utilizando-se seringas de
1mL e agulhas de 12,7mm e cada animal recebeu 150µl da solução de hemácias parasitadas.
A cepa de P. berghei utilizada encontrava-se conservada em sangue total de
camundongos BALBC na presença de solução de glicerina a 30% e armazenada a -70ºC, foi
originalmente fornecida pelo Laboratório de Neuroquímica do Instituto de Ciências Biológicas
da UFPA – Belém – PA e mantida em sucessivas replicações no Biotério de Experimentação do
Laboratório (Percário 1994; Scardoeli, 1996).
Os animais dos grupos B e D não foram infectados com a cepa de P. berghei, recebendo
apenas a inoculação intraperitoneal de 150 µL de hemácias não parasitadas (contendo 107
células).
2.3. TRATAMENTO COM APOCININA
Para verificarmos o papel da enzima NADPH oxidase na infecção por P. berghei, os
grupos de animais A e B receberam tratamento com o inibidor de NADPH oxidase, apocinina,
em água de beber, enquanto que os animais dos grupos C e D receberam água mineral não tratada
com apocinina. O tempo de tratamento foi dividido de acordo com cada grupo de experimento
(24h, 5, 10, 15 e 20 dias), sendo que os Grupos A e C receberam tratamento prévio de 5 dias com
o inibidor.
57
2.3.1. Preparo e administração da solução de apocinina
A apocinina (1,5 mM; Sigma Aldrich; #55539) foi preparada em água destilada,
misturando-se 0,246g do inibidor em 1000mL de água destilada com auxílio de bastão de vidro e
homogeneizador tipo vórtex, até que se diluísse complemente. Posteriormente, a solução era
acondicionada em geladeira por até 07 dias e diariamente cada gaiola recebia 100 mL da solução,
distribuída em mamadeiras próprias.
2.3.2. Determinação do peso corpóreo e consumo de líquidos
Para avaliarmos se a administração de apocinina induziu alterações biológicas nos
camundongos e se estas alterações influenciaram na expressão de NADPH oxidase, alguns
parâmetros foram avaliados diariamente, como segue:
2.3.2.1. Estimativa de Consumo de líquidos
Baseado na experiência de nosso Grupo de Pesquisas, o consumo de líquidos para a
espécie Mus musculus é, em média, de 10mL de água por dia por animal. Levando-se em
consideração que cada gaiola abrigava no máximo cinco camundongos e considerando as
eventuais perdas, cada gaiola recebeu diariamente um bebedouro com o volume de 200mL da
solução de apocinina ou 200mL de água mineral não tratada com apocinina (USP, 2013). Após
24 horas, o volume de líquido remanescente no bebedouro foi medido em proveta e, por
diferença, obteve-se o volume de líquido consumido pelos animais. Os dados foram expressos
em mL de líquido por dia (mL/dia).
2.4. EUTANÁSIA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Após o período de estudo de cada subgrupo (24h, 5, 10, 15 ou 20 dias) os animais foram
submetidos à eutanásia por exsanguinação. O procedimento de eutanásia iniciava-se com a
inoculação intraperitoneal de heparina (Sulfato de heparina 100 Ul, i.p.) e, após 7 minutos, os
animais eram anestesiados com Cloridrato de Kentamina 10% (Vetnil) e Xilazina (Vetbrands;
58
2:1; 80µl, i.p). Após aproximadamente 3 minutos, o camundongo encontrava-se totalmente
anestesiado e, então, era procedido o deslocamento cervical com posterior exsanguinação.
As amostras de sangue foram obtidas em seringas de 1mL heparinizadas (50 µl de
heparina e 100 µl de PBS), após toractomia, por punção do ventrículo direito do coração de cada
camundongo. Em seguida, ambos os pulmões foram extraídos, bem como o cérebro de cada
animal, os quais foram lavados e armazenados a -20ºC, para que posteriormente fossem
submetidos ao processo de disrupção de tecidos e à análise laboratorial.
2.5. DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA
Esfregaços sanguíneos dos camundongos foram fixados com metanol e corados com
solução recém diluída de Giemsa na proporção de três gotas para cada 1ml de solução salina
tamponada pH 6,8. Após 10 minutos, as lâminas foram lavadas em água corrente, secas ao ar e
examinadas ao microscópio óptico com objetiva de imersão (1000x; Fig. 10).
O percentual de parasitemia de P. berghei nos esfregaços corados foram determinados
pela contagem do número de hemácias totais e infectadas.
Através da estimativa para a contagem do número total de hemácias infectadas por campo
microscópico, e a partir desta, foi calculado o número de campos a serem contados. Esta
estimativa encontra-se descrita na Quadro 3. O resultado foi expresso em percentagem de
hemácias parasitadas.
Quadro 3 - Determinação do percentual de parasitemia através de estimativa para a contagem do
número de hemácias totais por campo no microscópio óptico.
Parasitemia Estimada (%) Hemácias a serem contadas
0% 10.000
Até 5% 5.000
5 a 10% 2.000
10 a 20% 1.000
+ 20% 300
59
Figura 10 - Esfregaço Sanguineo de camundongo infectado pelo Plasmodium berghei corado
pelo método de Giemsa, em microscópio óptico com aumento de 100x.
2.6. HOMOGENIEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PULMÃO E CÉREBRO
Após a retirada do cérebro e do pulmão, os órgãos foram lavados, secos e pesados. Na
seqüência, foram executadas as técnicas de disrupção de tecidos seguindo os seguintes
procedimentos:
2.6.1. Preparo das amostras
Para execução da técnica de disrupção, as amostras de pulmão e cérebro foram trituradas
manualmente, com auxílio do material cirúrgico e posteriormente pesadas. Primeiramente, tubos
falcon foram devidamente identificados e em seguida, os órgãos foram picotados com tesoura de
ponta fina, para produzir fragmentos menores, com a finalidade de facilitar a sua
homogeneização, tomando cuidado de escolher sempre a mesma metade para todos os órgãos.
Para a pesagem, foi utilizada uma balança analítica de precisão (A&D Company Limited
ER-182A), ligada 30 minutos antes da utilização. A balança foi zerada com tubo falcon vazio e,
60
então, procedeu-se a pesagem. Após a pesagem, com o auxílio de uma pipeta Pasteur,
acrescentou-se em cada órgão pesado, solução tampão salina fosfato PBS (pH 7,2), até que o
peso chegasse à proporção de 1:10 (m:m). O PBS foi preparado pela mistura dos seguintes sais
em água destilada: Na2HOP4 (PM: 174,18; Vetec); NaH2PO4 (PM: 137,99; Cinética Química);
NaCl (PM: 58,44; Impex).
2.6.2. Homogeneização das amostras
O processo de homogeneização foi realizado em um disruptor de células
ultrassônico (Unique Modelo: DE500). O tempo de permanência de cada órgão no disruptor
dependeu da observação do fracionamento, sendo de aproximadamente 5 min. Durante o
processo de homogeneização um béquer contendo o tubo falcon com o órgão foi mantido dentro
de gelo picado, para evitar que o calor produzido no processo comprometesse a viabilidade das
amostras.
Após a homogeneização, o material foi centrifugado a 2.500 rpm, por 10 minutos. Após a
centrifugação, foi coletado o sobrenadante, sendo as amostras armazenadas e congeladas a -20ºC
até o momento do uso.
2.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO
(TBARS)
O protocolo para dosagem de TBARS segue os fundamentos iniciais propostos por Konn
& Livesedge (1944), com as condições químicas da reação alterados segundo Percário, et al.
(1994). O método se baseia na reação do malondialdeído e outros compostos com o ácido
tiobarbitúrico (TBA), em pH baixo e temperatura elevada, para formar o complexo MDA-TBA,
de cor rosada e absorção máxima em 535nm.
61
2.7.1. Preparo de Reagentes
2.7.1.1. Ácido tiobarbitúrico
Para a execução da técnica, no dia da realização do teste, 250 µl do ácido Tiobarbitúrico
(10nM; Sigma Aldrich; T5500) foi preparado em solução aquosa de KH2PO4. Devido a difícil
solubilização do TBA, foi necessária a homogeneização em placa agitadora magnética.
2.7.1.2 Solução padrão de MDA.
O malondialdeído (1,1,3,3, tetrahidroxipropano; Sigma Aldrich; T9889) foi preparado a
20µM em água destilada. Após o preparo, a solução foi estocada em geladeira até o momento do
uso.
2.7.2. Procedimento técnico
Após o preparo dos reagentes, as amostras foram descongeladas para iniciar as dosagens.
Todas as amostras e padrões foram ensaiados em duplicata, desprezando-se as leituras nas quais
houvesse diferenças maiores que 10% de absorbância entre os dois tubos, situação em que as
dosagens foram repetidas.
Após a identificação dos tubos, foi adicionado 500µl do reagente TBA em todos os tubos
e 250 µl de amostra, sendo que nos tubos do branco foram adicionados 250 µl de água destilada e
nos tubos do padrão foram adicionados 250 µl de solução padrão de MDA. Em seguida, todas as
amostras foram colocadas em banho-maria a 94ºC, durante 1 hora. Findado o tempo no banho-
maria, as amostras foram refrigeradas em água corrente. Depois do resfriamento, foram
adicionados 2 mL de álcool n-butílico (Dinâmica #1171) e os tubos foram devidamente tampados
e levados ao agitador tipo vórtex, para que houvesse a homogeneização da amostra.
Subsequentemente, as amostras foram centrifugadas (2.500 rpm x 10 minutos) e, ao
término, observou-se que apresentavam duas fases, uma ao fundo transparente e límpida e outra
62
mais superficial de coloração rosada, variando de acordo com a quantidade e MDA na amostra.
Na sequência, foram pipetados 3 mL do sobrenadante e, então, foi realizada a leitura em
espectrofotômetro (Femto; 800XI). A leitura foi realizada em comprimento de onda de 535nm e
o aparelho foi zerado com o branco (água destilada). As absorbâncias dos tubos dos padrões e de
cada amostra foram anotadas e posteriormente utilizadas para elaboração de curva padrão e para
determinação do valor de MDA na amostra, respectivamente.
2.7.3. Curva padrão do TBARS
Antes da execução procedimentos técnicos, foi realizada a curva padrão para verificar a
linearidade da reação e, se necessário, calcular um fator de conversão de valores de absorbância
em concentração.
A curva padrão de TBARS (Figura 11) foi realizada pela diluição sucessiva do padrão
MDA, a partir de uma solução de 400 µM, conforme o protocolo no Quadro 4.
63
Quadro 4: Protocolo de Diluições do padrão de malondialdeido (MDA) para curva padrão
TUBO Padrão de MDA (µl) H2O Destilada (µl) MDA (nmol)
S1 3000 0 100
S2 900 de S1 300 75
S3 1000 de S1 1000 50
S4 1000 de S3 1000 25
S5 1200 de S4 300 20
S6 600 de S5 200 15
S7 100 de S1 900 10
S8 100 de S2 900 7,5
S9 50 de S1 950 5
S10 300 de S9 300 2,5
S11 10 de S1 990 1
S12 300 de S11 300 0,5
S13 0 600 0
Após a realização das diluições, foram utilizados 500µl de cada valor de concentração
para realização das dosagens. Cada ponto da curva foi realizado em triplicata e ao final calculou-
se a média das absorbâncias dos valores encontrados.
Dessa maneira, a curva padrão encontrada está demonstrada na figura 12.
64
Figura 11: Curva Padrão de MDA
Com base nos dados obtidos e no gráfico apresentado acima, seguiu-se o cálculo da
equação da reta, utilizando-se a equação de mínimos quadrados, obtendo a seguinte equação da
reta:
MDA = Abs+ 0,0172
0,0601
2.7.4. Cálculo do valor de TBARS das amostras
O valor final de TBARS de cada amostra foi determinado em nmol/mL e foi calculado
pela fórmula obtida através da curva padrão:
TBARS = Absorbância da amostra corrigida para o fator do dia + 0,172
0,0601
Após esse cálculo, o valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição utilizado na disrrupção.
2.8 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL EM EQUIVALÊNCIA AO TROLOX (TEAC)
Para a determinação da capacidade antioxidante total das amostras de homogeneizado de
pulmão e cérebro dos camundongos foi utilizado o trolox, um potente antioxidante análogo
y = 0,0601x - 0,0172 R² = 0,998
65
sintético da vitamina E. O método utilizado foi o proposto por Miller et al., 1993 e modificado
por Re et al., 1999, no qual foram adaptadas as condições de temperatura, proporções relativas
dos reagentes e tempo de mensuração. A técnica consistiu na reação colorimétrica entre o ABTS
(2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-diamônio) com o persulfato de potássio
(K2S2O8), produzindo diretamente o radical cátion ABTS.+
, que é um cromóforo de cor
verde/azul que possui absorbância máxima nos comprimentos de onda 645, 734 e 815 nm.
Após a adição de antioxidantes ao radical cátion ABTS.+
, este é reduzido novamente a
ABTS, na extensão e escala de tempo dependentes da capacidade antioxidante, sendo que essa
reação é mensurada por meio de espectrofotometria pela observação da alteração de absorbância,
lida a 734nm, dentro de um intervalo de tempo. Assim sendo, a alteração da cor da reação é
determinada como a atividade antioxidante total da amostra, sendo então calculada a sua relação
com a reatividade do trolox como padrão, sob as mesmas condições. Os resultados finais foram
expressos em milimols por litro (mmol/l).
Para a execução da técnica foram realizados os seguintes procedimentos:
2.8.1. Preparo de Reagentes
2.8.1.1. Tampão salina fosfato (PBS)
O PBS foi utilizado como solvente no preparo de reagentes e diluição de amostras. Os
sais utilizados no preparo foram o Na2HPO4 (0,008mol/l; Vetec), o NaH2PO4 (0,0031 mol/l;
Cinética Química) e o NaCl (Cloreto de Sódio; 0,124 mol/l; Impex), os quais foram dissolvidos
em água destilada. Os reagentes foram homogeneizados e o pH ajustado para 7,2 com ácido
acético.
2.8.1.2. Solução estoque de ABTS.+
A solução estoque do sal diamônio ABTS (7mM; Sigma Aldrich; A1888) foi preparada
com uma solução de 2,45mM persulfato de potássio (Sigma Aldrich; P5592), em média 16h
antes da utilização e era mantida ao abrigo da luz em frasco âmbar coberto com papel alumínio, a
temperatura ambiente.
66
2.8.1.3. Solução de trabalho de ABTS.+
Para preparar a solução de trabalho de ABTS foi misturada a solução estoque com PBS,
até que a absorbância a 734nm estivesse entre de 0,7 ±0.02, equilibrada a 30ºC.
2.8.1.4. Solução de trolox
O trolox (ácido 6 hidroxi-2,5,7,8-tetrameticomono-2-carboxílico; Aldrich Chemical;
23881-3; 2,5mM) foi preparado em solução PBS e devido a sua difícil dissolução foi levado a
placa agitadora magnética.
2.8.2. Procedimento Técnico
Para a realização da técnica as amostras de cérebro e pulmão homogeneizados foram
deixadas a temperatura ambiente até o descongelamento. Toda a execução da técnica e a leitura
do espectrofotômetro foi feita em temperatura ambiente (25ºC). Em cada tubo foi adicionado
2.970µl de solução de trabalho de ABTS e 30 µl de amostra. As leituras foram realizadas em
espectrofotômetro, em comprimento de onda de 734nm. Foram realizadas duas leituras por
amostra, sendo a primeira no tempo zero (0´) e a segunda após 5 minutos da primeira (5´).
2.8.3. Curva padrão do trolox
A curva padrão de TEAC (Figura 13) foi realizada pela diluição sucessiva do padrão trolox, a
partir de uma solução de 2,5 m M, conforme o protocolo abaixo.
67
Quadro 5: Protocolo de Diluições de Trolox para realização da curva padrão
Tubo Padrão de Trolox 2,5mM (µl) PBS (µl) Concentração de Trolox (nmol)
A 5000 0 2,5
B 4000 1000 2,0
C 3000 2000 1,5
D 2000 3000 1,0
E 1000 4000 0,5
F 0 5000 0
Após a realização das diluições, a curva foi realizada em triplicata e ao final calculou-se
a média das absorbâncias dos valores encontrados.
Dessa maneira, a curva padrão encontrada está demonstrada na figura 13.
Figura 12: Curva Padrão do Trolox
Com base nos dados obtidos e no gráfico apresentado acima, seguiu-se o cálculo da equação da
reta, utilizando-se a equação de mínimos quadrados, obtendo a seguinte equação da reta:
Trolox = Abs – 0,002
0,2618
68
2.8.4. Cálculo do valor de TEAC das amostras
O valor final de TEAC de cada amostra foi determinado em mM e foi calculado pela
fórmula obtida através da curva padrão.
2.9. DOSAGEM DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE PELA REDUÇÃO DO RADICAL
DPPH (1,1-DIFENIL-2-PICRILIDRAZILA)
O potencial antioxidante foi determinado através da redução do radical 1,1-difenil-2-
picrilidrazila. O DPPH quando em solução, apresenta coloração violeta com forte absorção em
torno de 515-517 nm e apresenta paramagnetismo conferido pelo elétron desemparelhado.
Assim, ao receber um elétron ou um radical hidrogênio, seu elétron passa a ser pareado,
tornando-se uma molécula diamagnética e a absorção característica desaparece. A descoloração
resultante está relacionada estequiometricamente com o número de elétrons aceitos. De acordo
com o método proposto por Blois (1958) adaptado, a atividade antioxidante (AAO) de
substâncias é medida através da interação com o DPPH, resultando na formação irreversível do
produto hidrogenado (hidrazina) que é incolor. A AAO da amostra é expressa em função da
capacidade de provocar um decréscimo na absorção de uma solução de DPPH a uma determinada
concentração.
2.9.1. Preparo de Reagentes
2.9.1.1. Preparo da Solução de DPPH
Para preparar uma solução de 0,5 L de DPPH 0,1mM, utilizou-se 0,0197g de DPPH e
misturou-se com álcool etílico até que todo o soluto foi dissolvido. A solução preparada
apresentava coloração roxa e foi identificada e armazenada em frasco âmbar, recoberto com
papel alumínio para não sofrer interferência de luz e nem evaporação. O armazenamento foi
realizado em geladeira a 4ºC, por até 07 dias.
69
2.9.1.2. Preparo das Amostras
Após o preparo dos reagentes, as amostras foram descongeladas para iniciar as dosagens. As
amostras de pulmão precisaram ser diluídas (1:2) e para tanto, utilizou-se solução salina de
cloreto de sódio (NaCl) 0,9 % (0,9 g de NaCl para 100 mL de água destilada). As amostras de
cérebro não apresentaram necessidade de diluição, portanto, após descongelamento,
encontravam-se prontas para uso.
2.9.2 Procedimento Técnico
Após o preparo das amostras, tubos de ensaio previamente identificados eram acrescidos
de 600 µL de solução DPPH 0,1 mM em EtOH, 50 µL da amostra e 350 µL de água destilada
para completar um volume final de 1 mL. Todas as amostras eram, então, levadas ao banho-
maria a 37ºC por um período de 30 minutos.
As leituras das absorbâncias foram realizadas em espectrofotômetro com comprimento de
onda de 517 nm. Primeiramente, foi lida a absorbância inicial da solução de DPPH para cada
bateria realizada; as mudanças observadas na absorbância são proporcionais à atividade anti-
oxidante da amostra.
2.9.3 Curva Padrão DPPH
A curva padrão do DPPH (Figura 14) foi realizada pela diluição sucessiva do padrão de
trolox (2,5mM) e PBS, conforme os volumes indicados no Quadro 6.
Após a realização da curva em triplicata e de obter-se uma média das absorbâncias
encontradas, os valores foram subtraídos da absorbância inicial do DPPH, logo, foi obtida a
seguinte curva padrão (Figura 14).
70
Quadro 6: Protocolo de Diluições de trolox para curva padrão de DPPH
Tubo Solução de Trabalho
de Trolox (µl)
PBS (µl) Concentração Final
(mM de Trolox)
A 0 1000 0 (BRANCO)
B 50 950 0,125
C 100 900 0,250
D 150 850 0,375
E 200 800 0,500
F 250 750 0,625
G 300 700 0,750
H 350 650 0,875
I 400 600 1,000
DPPH = capacidade antioxidante pela redução do radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazila)
Figura 13: Curva Padrão da Capacidade Antioxidante pela Redução do Radical DPPH (1,1-
difenil-2-picrilidrazila).
y = 0,392x - 0,001 R² = 0,9988
Série1
Linear (Série1)
71
Com base nos dados obtidos e no gráfico apresentado acima, seguiu-se o cálculo da
equação da reta, utilizando-se a equação de mínimos quadrados, obtendo a seguinte equação da
reta:
DPPH = Abs + 0,001
0,392
2.9.4. Cálculo do valor de DPPH das amostras
O valor final de DPPH de cada amostra foi determinado em ng/mL e foi calculado pela
fórmula obtida através da curva padrão:
DPPH = (Absorbância da amostra – Absorbancia do DPPH Inicial) + 0,001
0,392
Após esse cálculo, o valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição utilizado na
disrrupção e no caso das amostras de pulmão, foram multiplicadas pelo valor da diluição
utilizada no preparo da amostra. O valor final de DPPH de cada amostra foi determinado em
mmol/L.
2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas, assim como os gráficos, foram realizadas utilizando os programas
Microsoft Office Excel 2010, SigmaStat versão 3.5 e Biostat 5.0 (Ayres et al., 2007). Para cada
parâmetro foi realizada a análise de possíveis pontos discrepantes (outliers), utilizando o cálculo
do intervalo interquartil.
Para realização do estudo foram testadas as suposições de normalidade e igualdade de
variâncias dos grupos por meio dos testes Kolmogorov-Smirnov e Levene, respectivamente. Com
a satisfação das suposições, aplicou-se o Teste ANOVA dois fatores e o teste de Tukey. Também
foi aplicado o teste de correlação de Pearson para investigar a relação entre as variáveis
estudadas.
72
Para verificação de possível correlação entre parâmetros, foi realizado o teste de
correlação de Pearson, considerando-se os valores pareados de dois parâmetros obtidos para um
mesmo animal, realizando-se os cálculos com os dados obtidos de todos os animais
simultaneamente, independente do grupo a que pertenciam, bem como para cada grupo
individualmente. Para as correlações estatisticamente significantes foram atribuídas intensidades
sendo até 0,30 (r < 0,30) uma fraca correlação, entre 0,31 e 0,70 (0,31 < r < 0,70) moderada
correlação e entre 0,71 e 1,00 (0,71 < r < 1,00) uma forte correlação, o sinal de positivo (+) ou
negativo (-), do valor da correlação indica se a relação entre as variáveis é diretamente
proporcional ou inversamente proporcional, respectivamente.
Todos os testes foram aplicados considerando o nível de significância a 5% (p< 0,05).
Para edição dos gráficos e tabelas foi utilizado o programa Excel do pacote Office da Microsoft
versão 2010.
73
3. RESULTADOS
3.1. SOBREVIDA
O percentual de sobrevida dos animais, infectados ou não com P. berghei, que
receberam ou não o tratamento com apocinina, descritos por grupo é mostrado na Figura 14. Os
valores de percentual utilizados na elaboração do gráfico estão descritos na tabela 1.
Figura 14: Percentual de sobrevida de camundongos infectados ou não com Plasmodium
berghei, de acordo com o tratamento empregado por grupo. A = Grupo tratado com Apocinina e
infectado com P. berghei; B = Grupo tratado com Apocinina, não infectado com P. berghei; C =
Grupo infectado pelo P. berghei e não tratado com Apocinina; D = Grupo não infectado com P.
Berghei e não tratado com Apocinina.
Os dados mostram que a sobrevida dos animais do grupo A (tratados com Apocinina e
infectados com P. berghei) foi menor quando comparada a dos animais infectados que não
receberam o tratamento com a Apocinina (grupo C). Ao longo dos 20 dias de infecção ambos os
grupos apresentaram progressiva diminuição da sobrevida como esperado para os grupos
infectados por P. berghei. Da mesma forma, quando comparados os grupos B (animais tratados
74
com apocinina e não infectados) e D (animais não tratados e não infectados) observou-se que
também houve diminuição do número de indivíduos.
A figura 15 e a tabela 1 mostram que houve diferença percentual entre os grupos A e C
(13%) e a diferença percentual entre os grupos B e D (10%).
75
Tabela 1 – Sobrevida dos camundongos de acordo com os diferentes grupos de experimentação
N= Número de amostras por grupo por dia; d= tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P.
berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei
Dias Sobrevida (%)
N A N B N C N D
0 64 100 50 100 65 100 50 100
1 64 100 50 100 64 100 50 100
2 54 100 40 100 54 100 40 100
3 54 100 40 100 54 100 40 100
4 54 100 40 100 54 100 40 100
5 54 98 40 100 54 100 40 100
6 44 97 30 100 44 100 30 100
7 44 95 30 100 44 100 30 100
8 44 88 30 100 41 93 30 100
9 44 88 30 100 40 91 30 100
10 44 88 30 100 39 89 30 100
11 30 87 20 100 25 86 20 100
12 30 87 20 100 25 86 20 100
13 30 87 20 100 25 86 20 100
14 30 83 20 100 22 76 20 100
15 30 80 20 100 20 69 20 100
16 15 47 10 100 5 33 10 100
17 15 27 10 100 5 33 10 100
18 15 13 9 90 5 33 10 100
19 15 13 9 90 3 20 10 100
20 15 7 9 90 3 20 10 100
76
3.2 PARASITEMIA
A Figura 15 mostra a progressão da parasitemia em camundongos infectados com o P.
berghei de acordo com o tempo de infecção (24 horas, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias). Para a
sua elaboração foram utilizados os valores constantes da tabela 2. As tabelas 3 e 4 apresentam o
valor da significância estatística para para as diferenças encontradas entre os tempos de um
mesmo grupo (tabela 3) e entre os grupos para um mesmo tempo (tabela 4).
Os dados encontrados mostram que houve aumento progressiva e exponencial da
parasitemia (p<0,001) nos grupos A e C, como esperado para animais infectados. Ao
observarmos o grupo A, nota-se um aumento pronunciado da parasitemia em relação ao grupo C,
à partir do 15º dia de infecção, entretanto, essas diferenças não são estatisticamente significantes
(p= 0,209).
Figura 15: Progressão da parasitemia de camundongos infectados com Plasmodium berghei do
grupo tratados com apocinina (A) e do grupo não tratado com apocinina (C).
0
10
20
30
40
50
0 5 10 15 20
Parasitemia
A C
Par
asit
em
ia(%
)
Tempo de Infecção (Dias)
77
Tabela 2- Progressão da parasitemia dos camundongos infectados com o Plasmodium berghei
tratado com Apocinina e não tratado com Apocinina de acordo com os dias de infecção
Grupo
PARASITEMIA (%)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 10 1,41 ±0,49 10 2,72 ±1,53 11 9,72 ±4,29 11 22,84±8,42 1 55,90
C 9 1,72 ±0,65 10 2,13 ±1,22 12 9,11 ±5,72 12 21,43±8,21 3 45,33±18,17
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados pelo Plasmodium berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (recebram água potável) e infectados com P.
berghei.
N = Número de animais por grupo de dias; d= tempo de infecção em dias.
Tabela 3: Valores de p* para comparação temporal da parasitemia por grupo em camundongos
infectados com Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tatamento com Apocinina
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P.
berghei.
* Obtido por teste de Tukey
Grupos
Comparação A C
1 dia vs. 5 dias 0,990 1,000
1 dia vs. 10 dias 0,025 0,074
1 dias vs. 15 dias <0,001 <0,001
1 dia vs. 20 dias <0,001 <0,001
5 dias vs. 10 dias 0,085 0,076
5 dias vs. 15 dias <0,001 <0,001
5 dias vs. 20 dias <0,001 <0,001
10 dias vs. 15 dias <0,001 <0,001
10 dias vs. 20 dias <0,001 <0,001
15 dias vs. 20 dias <0,001 <0,001
78
Tabela 4: Valores de p* para comparação entre grupos da parasitemia por tempo de infecção em
camundongos infectados com Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tatamento com
Apocinina
Tempo de Infecção (Dias)
Comparação (Grupos) 1 5 10 15 20
A vs. C 0,808 0,834 0,816 0,209 0,145
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey
79
3.3 DOSAGENS PULMONARES
3.3.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
Na figura 16 observa-se o comportamento dos diferentes grupos quanto ao nível das
TBARS nos pulmões de camundongos infectados ou não pelo P. berghei. Para a sua elaboração
foram utilizados os valores médios discriminados na tabela 5. As tabelas 6 e 7 apresentam os
valores de p das concentrações de TBARS por grupo e por tempo, respectivamente.
O Grupo D (Controle), no qual os animais não foram tratados com Apocinina e não foram
infectados, mostrou que os valores do TBARS para os animais controles variaram entre 90 e 160
nmol/mL e que houve uma diminuição progressiva dos níveis de TBARS até o 10º dia e aumento
apenas no 15º dia de infecção e retornando aos valores apresentados no 10º dia no final do
período de estudo, entretanto sem diferenças estatiscamente significantes entre os diferentes
tempos de estudo (Tabela 6).
Figura 16: Concentração de Subtâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) por tempo
de infecção nos pulmões de camundongos, de acordo com o tratamento empregado. A = Grupo
de animais que recebeu tratamento com Apocinina e foi infectado pelo Plasmodium berghei. B =
Grupo de animais que recebeu o tratamento com Apocinina e não foi infectados pelo P. berghei.
C = Grupo de animais que não recebeu o tratamento com Apocinina e foi infectado pelo P.
berghei. D = Grupo de animais que não recebeu o tratamento com Apocinina e não foi infectado.
30
60
90
120
150
180
1 5 10 15 20
D A C B
Tempo de infecção (Dias)
TBA
RS
(nm
ol/
ml)
80
No grupo B foram encontradas diferenças estatisticamente siginificantes quando
comparados os valores de TBARS de 1 dia de infecção vs. 10 dias (p= 0,041), 1 dia vs. 20 dias
(p= 0,002) e de 15 dias vs. 20 dias de infecção (p= 0,013), entretanto, essas variações ocorreram
dentro da faixa de normalidade apresentada pelos animais do grupo D (90 a 160 nmol/mL).
O grupo de animais infectados e não tratados com Apocinina (grupo C) apresentou
valores abaixo da faixa de valores apresentados pelos animais do grupo D (45 a 95 nmol/mL),
entretanto, essa diferença não se mostrou estatisticamente significante.
O Grupo A (tratados com Apocinina e Infectados com P. berghei) apresentou uma
diminuição importante dos níveis de TBARS entre o 1º e o 10 º dia de infecção (p= 0,004), 1 dia
vs. 15 dias (p= <0,001), entre o 5º e o 10º dia de infecção (p= 0,005) e 5 dias vs.15 dias (p=
<0,001). Porém, ao compararmos o grupo C ao grupo A observou-se que, de fato, o grupo A
apresenta valores maiores de TBARS no primeiro dia (p = 0,001), entretanto, após esse período
apresenta comportamento semelhante ao grupo C e, apesar desse achado, não foram encontradas
diferenças estatísticas significantes que sutentassem um comportamento diferente entre esses
grupos.
De modo geral, ainda que tenham ocorrido diferenças estatísticas em alguns pontos de
comparação entre dias e entre grupos, estas não apresentam significância, uma vez que
acontecem em tempos isolados e não se repetem ao longo dos dias de infecção.
Tabela 5: Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos
pulmões de camundongos de acordo com o tratamento recebido
N= Número de amostras por grupo por dia; d= tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão. A = Grupo de animais tratados com Apocinina e
infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com
P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com
P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
Grupo
TBARS (nmol/mL)
N 1d N 5d N 10d N 15d N 20d
A 8 128 ± 44 10 122 ± 44 10 61 ± 14 12 54 ± 12 1 61
B 10 83 ± 40 10 156 ± 55 7 153 ± 17 10 94 ± 37 9 151 ± 58
C 9 49 ± 13 10 97 ± 27 12 63 ± 23 6 63 ± 11 3 38 ± 7,0
D 9 156 ± 19 10 125 ± 53 10 96 ± 43 10 130 ± 29 10 105 ± 56
81
Tabela 6: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para Substâncias Reativas
ao Ácido Tiobarbitútico em amostras de pulmão
A = Grupo de camundongos tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com Plasmodium berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com
Plasmodium berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com Plasmodium berghei. *Obtido por teste de Tukey.
Comparação
Grupos
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,999 0,332 0,196 0,892
1 dia vs. 10 dias 0,004 0,041 0,999 0,076
1 dia vs. 15 dias <0,001 0,972 0,999 0,963
1 dia vs. 20 dias 0,500 0,002 0,936 0,248
5 dias vs. 10 dias 0,005 0,866 0,265 0,461
5 dias vs. 15 dias <0,001 0,719 0,467 0,999
5 dias vs. 20 dias 0,571 0,291 0,163 0,793
10 dias vs. 15 dias 0,994 0,180 1,000 0,317
10 dias vs. 20 dias 1,000 0,878 0,871 0,984
15 dias vs. 20 dias 1,000 0,013 0,901 0,647
82
Tabela 7: Valores de p* para as comparações entre grupos para Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico em amostras de pulmão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com Plasmodium berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com
Plasmodium berghei
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com Plasmodium berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
Comparação TEMPO (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,077 0,982 <0,001 0,093 0,132
A vs. C 0,001 0,462 1,000 0,972 0,960
A vs. D 0,883 0,998 0,202 <0,001 0,703
B vs. D 0,005 0,949 0,165 0,174 0,057
C vs. D <0,001 0,364 0,200 0,006 0,048
83
3.3.2 Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
A figura 17 mostra o comportamento da capacidade antioxidante equivalente ao trolox
nos pulmões de camundongos de acordo com tratamento empregado em cada grupo. A figura foi
construída utilizando os valores de média, que estão expressos na tabela 8. Nas tabelas 9 e 10
estão descritos os valores de “p” para o TEAC por grupo e por tempo, respectivamente.
Figura 17: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) por tempo de infecção, nos
pulmões de camundongos, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (Vermelho) =
Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados com Plasmodium berghei.
Grupo B (Amarelo) = Animais que receberam o tratamento com Apocinina e não foram
infectados com P. berghei. Grupo C (Azul) = Animais que não receberam o tratamento com
Apocinina e foram infectados com P. berghei. Grupo D – Controle (Verde) = Animais que não
receberam o tratamento com Apocinina e não foram infectados.
O grupo controle (D), no qual os animais não foram tratados com Apocinina e não foram
infectados, mostrou que os valores de TEAC para os animais controles variaram de 10 a 16 mM e
que houve um aumento dos níveis de TEAC até o 5º dia e posterior diminuição até o 15º dia de
0
5
10
15
20
1 5 10 15 20
Pulmão
A D C B
Tempo de Infecção (Dias)
TEA
C (
mM
)
84
infecção e retornando aos valores apresentados no 10º dia no final do período de estudo,
entretanto sem diferenças estatiscamente significantes entre os diferentes tempos de estudo.
O grupo B (animais não infectados que tomaram Apocinina) apresentou valores mais
baixos de TEAC (8 a 12 mM) em relação aos valores apresentados pelo grupo D (10 a 16 mM).
Nesse grupo, a comparação de 1 dia vs. 5 dias apresentou diferença estatisticamente significante
(p= 0,049), entretanto essa diferença não mostra significância, pois ao compararmos os grupos B
vs. D não são encontradas diferenças estatisticamente significantes.
Tabela 8: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões de
camundongos de acordo com o tratamento recebido
Grupo
TEAC (mM)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 9 13 ± 2 10 15 ± 2 11 14 ± 3 12 17 ± 2 1 14
B 10 8 ± 2 10 12 ± 3 9 10 ± 2 10 10 ± 4 9 8 ± 1
C 10 8 ± 1 10 17 ± 1 12 15 ± 2 6 16 ± 2 3 15 ± 1
D 8 10 ± 2 10 15 ± 4 10 13 ± 3 10 11 ± 2 10 12 ± 2
N= Número de amostras; d= tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média e ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
No grupo C as variações de TEAC (8 a 17 mM) ocorreram dentro da faixa de referência
apresentada pelos animais do grupo D (10 a 16 mM), mostrando que o tratamento com Apocinina
não variou os níveis de TEAC nesse grupo. Este grupo foi o que mais apresentou diferenças
temporais estatisticamente significantes, ocorrendo entre os tempos de 1 dia vs. 5 dias (p<0,001),
1 dia vs. 10 dias (p<0,001), 1 dia vs. 15 dias (p<0,001) e de 1 dia vs. 20 dias de infecção
(p<0,001). No entanto, quando se comparou o grupo A vs. C encontrou-se diferença apenas
estatisticamente significante nas amostras de 1 dia (p= 0,002), de maneira que após esse período
ambos os grupos apresentam comportamento iguais. Assim sendo, apesar dessa diferença
estatística pontual, não foi encontrado comportamento diferente nesses grupos.
85
No grupo A foi encontrada diferença estatisticamente significante quando comparados os
animais de 1 dia de infecção vs. 15 dias (p= 0,01), entretanto, essa diferença não mostrou
significância, uma vez que o comportamento do grupo (9 a 17mM) apresentou variações
ocorrendo dentro da faixa de normalidade apresentada pelos animais do grupo D (10 a 16 mM),
não apresentando alterações estatíticas significantes.
Tabela 9: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a Capacidade
Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras de pulmão
Comparação Grupos
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,613 0,049 <0,001 <0,001
1 dia vs. 10 dias 0,776 0,157 <0,001 <0,001
1 dia vs. 15 dias 0,016 0,806 <0,001 0,276
1 dia vs. 20 dias 0,991 1,000 0,005 0,056
5 dias vs. 10 dias 0,999 0,990 0,752 0,853
5 dias vs. 15 dias 0,444 0,474 0,954 0,011
5 dias vs. 20 dias 1,000 0,065 0,821 0,087
10 dias vs. 15 dias 0,281 0,774 0,998 0,174
10 dias vs. 20 dias 1,000 0,191 0,998 0,555
15 dias vs. 20 dias 0,913 0,837 0,989 0,956
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
86
Tabela 10: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de infecção,
para a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox, em amostras de pulmão
Comparação Tempo (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,001 0,062 0,036 <0,001 0,172
A vs. C 0,002 0,410 0,896 0,858 0,999
A vs. D 0,001 1,000 0,849 <0,001 0,779
B vs. C 0,999 <0,001 0,003 <0,001 0,003
B vs. D 1,000 0,076 0,238 0,844 0,056
C vs. D 0,998 0,363 0,407 0,003 0,302
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
87
3.3.3 Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical (1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila) DPPH
Na figura 18 é demonstrado o comportamento da dosagem capacidade antioxidante pela
redução do radical DPPH, de acordo com tratamento empregado nos camundongos. Os valores
de média e desvio padrão estão descritos na Tabela 11. Nas tabelas 12 e 13 estão descritos os
valores de p para DPPH por grupo e por tempo, respectivamente.
Figura 18: Perfil Antioxidante medido pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) por tempo de infecção, nos pulmões de camundongos, de acordo com o tratamento
empregado. Grupo A = Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados
com P. berghei. Grupo B = Animais que receberam o tratamento com Apocinina e não foram
infectados com P. berghei. Grupo C = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e
foram infectados com P. berghei. Grupo D – Controle= Animais que não receberam o
tratamento com Apocinina e não foram infectados.
O grupo D (Controle) mostrou valores de DPPH variando entre 5 e 7 nmol/mL e
apresentou aumento progressivo dos níveis de DPPH até o 10º dia e apresentou diminuição
0
2
4
6
8
10
12
14
1 5 10 15 20
DPPH
A D C B
Tempo de Infecção (Dias)
DP
PH
(m
mo
l/L)
88
estatisticamente significante quando comparados os animais de 10 dias vs. 15 dias de infecção (p
<0,0001) e 10 dias vs. 20 dias de infecção (p = 0,002).
No grupo B, que abrangia os animais não infectados, porém tratados com apocinina,
apresentou valores muito inferiores de DPPH (0,7 a 5 nmol/mL) em relação aos valores
apresentados pelo grupo D (5 a 7 nmol/mL). Na avaliação temporal, esse grupo apresentou
diferença estatisticamente significante quando comparados os níveis de DPPH nos animais de 10
vs. 20 dias (p= 0,001). Entretanto, essa diferença não mostra significância, pois ao compararmos
os grupos B vs. D, foi apenas encontrada uma diferença estatística siginificante no 5º dia (p=
0,028), o que não comprova um comportamento diferente desse grupo.
Tabela 11: Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) nos pulmões de camundongos de acordo com o tratamento recebido
N= Número de amostras por grupo por dia; d= tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
O grupo C, no qual estavam os animais infectados não tratados com apocinina, apresentou
aumento nos níveis de DPPH (6 a 9 nmol/mL) quando comparados ao valores encontrados pelos
animais do grupo controle (D; 5 a 7 nmol/mL).
Observou-se que no grupo A houve um aumento progressivo da produção de
antioxidantes até o 15º dia, com diferenças temporais estastisticamente significantes entre 1 dia
de infecção vs. 10 dias (p = 0,003), 1 dia vs. 15 dias (p<0,001), 5 dias vs. 15 dias (p<0,001) e 10
GRUPOS
DPPH (mmol/L)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 9 6 ± 2 7 8 ± 0,6 10 10 ± 3 12 12 ± 2 1 7
B 10 4 ± 2 10 3 ± 3 9 5 ± 2 10 4 ± 3 7 0,7 ± 1
C 10 6 ± 1 8 8 ± 0,5 12 9 ± 1 6 7 ± 2 3 9 ± 1
D 10 6 ± 1 9 6 ± 2 10 7 ± 2 10 4 ± 2 8 5 ± 1
89
dias vs. 15 dias (p=0,021). Porém, ao compararmos o grupo A vs. C não foram encontradas
diferenças estatísticas significantes que justifiquem uma alteração nesse grupo de animais.
Tabela 12: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a capacidade
antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em amostras de
pulmão
Comparação Grupos
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,566 0,857 0,175 0,994
1 dia vs. 10 dias 0,003 0,745 0,023 0,222
1 dia vs. 15 dias <0,001 0,972 0,617 0,33
1 dia vs. 20 dias 0,997 0,068 0,167 0,497
5 dias vs. 10 dias 0,211 0,177 0,960 0,445
5 dias vs. 15 dias <0,001 0,996 0,987 0,147
5 dias vs. 20 dias 0,998 0,469 0,949 0,258
10 dias vs. 15 dias 0,021 0,355 0,805 <0,001
10 dias vs. 20 dias 0,743 0,001 0,998 0,002
15 dias vs. 20 dias 0,097 0,261 0,834 0,999
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
90
Tabela 13: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de infecção,
para a capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH), em amostras de pulmão
Comparação Tempo (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,152 <0,001 <0,001 <0,001 0,077
A vs. C 0,987 0,987 0,637 <0,001 0,842
A vs. D 0,869 0,224 0,087 <0,001 0,521
B vs. C 0,265 <0,001 0,002 0,002 <0,001
B vs. D 0,516 0,028 0,108 0,999 0,079
C vs. D 0,971 0,112 0,582 0,003 0,002
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
91
3.3.4 Estudos de Correlação em Amostras Pulmonares
3.3.4.1 Correlação TBARS e TEAC
A figura 19 mostra os gráficos de correlação entre TBARS e TEAC nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com inibidor da NOX, Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento
isoladamente e com todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
92
Figura 19: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras pulmonares de
camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos
simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo B = Correlação realizada
com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P.
berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados
com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
r = - 0,21 p = 0,188 r = - 0,119 p = 0,437
r = 0,485 p = 0,0015 r = - 0,240 p = 0,100
93
Observou-se que o único grupo que apresentou correlação positiva moderada
significante foi o grupo C, que abrangia camundongos não tratados com Apocinina, porém
infectados com P. berghei (r = 0,485 e p = 0,0015) e mostra que nesses animais quando ocorre
um aumento nos níveis de TBARS são aumentados também os níveis de TEAC. Entretanto, a
correlação do grupo A mostra que o tratamento com Apocinina desfaz essa correlação.
Os grupos B (r= -0,119; p= 0,437) e D (r= - 0,240; p= 0,100), não apresentaram
correlação significante, mostrando que a apocinina não exerce influencia sobre eles.
94
3.3.4.2 Correlação TBARS e DPPH
A figura 20 mostra os gráficos de correlação entre TBARS e DPPH nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
95
Figura 20: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em
amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não
infectados com P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados
com P. berghei.
r = - 0,338 p <0,0001
r = - 0,436 p = 0,006
r = 0,315 p = 0,0540
r = - 0,046 p = 0,770
r = - 0,119 p = 0,434
96
Quando todos os grupos foram correlacionados foi encontrada uma correlação negativa
moderada (r = - 0,338 p <0,0001). Apesar do grupo A (r = - 0,0436; p = 0,062) e do grupo C ( r =
0,315 p = 0,054) não terem apresentado correlação significante estatisticamente, esses dados
sugerem uma tendência a diferença, uma vez que os dois grupos tiveram comportamentos
opostos quanto aos níveis e DPPH e TBARS.
3.3.4.3 Correlação TBARS e Parasitemia
A figura 21 mostra os gráficos de correlação entre TBARS e Parasitemia nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
Quando todos os grupos foram correlacionados foi encontrada uma correlação negativa
moderada (r = - 0,379 p = 0,0006) significante. De mesmo modo, o grupo A apresentou uma
correlação negativa moderada (r = - 0,494; p = 0,0012) significante mostrando uma relação
inversamente proporcional entre a concentração de TBARS e Parasitemia.
Apesar do grupo C (r = - 0,30 p = 0,061) não ter apresentado correlação significante
estatisticamente, os valores de correlação encontrados mostram que existe uma tendência a
diferença corroborando com os achados anteriores que constataram que o estresse oxidativo pode
atuar como um fator protetor para o hospedeiro na infecção por P. berghei, uma vez que, quanto
mais alta a parasitemia, menores foram os níveis de peroxidação lipídica, encontrados pelo
TBARS.
97
Figura 21: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada
com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium
berghei;. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados
com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
r = - 0,379 p = 0,0006
r = - 0,494 p = 0,0012 r = - 0,303 p = 0,061
98
3.3.4.4 Correlação DPPH e Parasitemia
A figura 22 mostra os gráficos de correlação entre DPPH e Parasitemia nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
Foram encontradas correlações moderadas quando correlacionados todos os grupos (r =
0,371 p = 0,0010) e no grupo A (r = 0,484 p = 0,0021), entretanto, a correlação desapareceu no
grupo C, o que evidencia que entre os grupos comparados o comportamento foi inverso quando
da presença de Apocinina.
Figura 22: Correlações entre Capacidade Antioxidante medida pela redução do radical 1,1-
Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) e Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos. Todos
os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com
Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo C = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
r = 0,371 p = 0,0010
r = 0,484 p = 0,0021 r = 0,244 p = 0,138
99
3.3.4.5 Correlação TEAC e Parasitemia
A figura 23 mostra os gráficos de correlação entre TEAC e Parasitemia nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
Figura 23: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e Parasitemia em
amostras pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei;
Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com
Apocinina e infectados com P. berghei.
r = 0,238 p = 0,032
r = 0,254 p = 0,109 r = 0,223 p = 0,166
100
3.3.4.6 Correlação TEAC e DPPH
A figura 24 mostra os gráficos de correlação entre TEAC e DPPH nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
101
Figura 24: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e capacidade
antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em amostras
pulmonares de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de
todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo
de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo B =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não
infectados com P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados
com P. berghei.
r = 0,720 p<0,0001
r = 0,701 p<0,0001 r = 0,562 p<0,0001
r = 0,670 p<0,0001 r = 0,536 p<0,0001
102
Todos os grupos analisados apresentaram correlação de moderada a forte, mostrando que
os valores de TEAC e DPPH estão correlacionados positivamente, sendo um indicativo de que
está sendo produzido antioxidante.
3.4 DOSAGENS CEREBRAIS
3.4.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
Na figura 25, observa-se o comportamento dos diferentes grupos quanto ao nível das
TBARS no cérebro de camundongos infectados ou não pelo P. berghei. Para a elaboração do
gráfico foram utilizados os valores discriminados na tabela 14.
Figura 25: Concentração de Subtâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) por tempo
de infecção no cérebro de camundongos, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A =
Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados com Plasmodium berghei.
Grupo B = Animais que receberam o tratamento com Apocinina e não foram infectados com P.
berghei. Grupo C = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e foram infectados
com P. berghei. Grupo D = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e não foram
infectados.
Observa-se que o grupo D, o qual abrangia animais que não receberam tratamento com
Apocinina e não foram infectados, apresentou valores de TBARS entre 106 a 231 nmol/mL, de
maneira que os níveis diminuíram com diferença estatística significante especialmente entre o
80
120
160
200
240
280
1 5 10 15 20
TBARS
A D C B
Tempo de Infecção (Dias)
TBA
RS
(nm
ol/
ml)
103
15º e o 20º dia (p<0,001; Tabela 15). Foram encontradas ainda diferenças estatísticas
significantes temporais entre 1 dia vs. 20 dias (p<0,001), 5 dias vs. 20 dias (p<0,001) e 10 dias vs.
20 dias (p<0,001).
Tabela 14: Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) no cérebro
de camundongos de acordo com o tratamento recebido
N= Número de amostras por grupo por dia; d= tempo de infecção do grupo.
Valores apresentados como média ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
No grupo B foram encontradas diferenças estatisticamente siginificantes temporais
quando comparados os valores de TBARS de 1 dia de infecção vs. 20 dias (p< 0,001), 5 dia vs.
10 dias (p= 0,001), de 5 dias vs. 20 dias de infecção (p< 0,001) e 15 dias vs. 20 dias (p= 0,002)
entretanto, essas variações (95 a 226 nmol/mL) ocorreram dentro da faixa de normalidade
apresentada pelos animais do grupo D (106 a 231 nmol/mL).
Quando comparados os grupos B vs. D não foram encontradas diferenças estatisticamente
siginificantes (Tabela 16).
GRUPOS
TBARS (nmol/mL)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 10 210 ± 19 10 191 ±14 10 199 ± 10 12 212 ± 15 1 115
B 9 213 ± 18 10 226 ± 30 10 155 ± 43 10 186 ± 57 8 95 ± 39
C 10 203 ± 13 8 199 ±10 12 211 ±18 11 181 ± 16 3 153 ± 60
D 10 196 ± 28 9 233 ± 8 9 205 ± 45 10 231 ± 90 9 106 ±75
104
O grupo C, o qual abrangia camundongos infectados com P. berghei e não tratados com
Apocinina, não apresentou variações nos níveis (153 a 211 nmol/mL) de TBARS fora faixa de
valores apresentados pelos animais do grupo D (106 a 231 nmol/mL) e não foram encontradas
diferenças estatisticamente significantes.
O mesmo comportamento foi observado no grupo A, de animais tratados com Apocinina
e Infectados com P. berghei, que mostrou valores entre 115 e 212 nmol/mL, encontrando-se
dentro da faixa de normalidade encontrada nos animais controle do grupo D (106 a 231
nmol/mL). De mesmo modo, não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos
diferentes tempos de infecção. Mesmo quando comparados os grupos A vs. C não foram
encontradas diferenças significantes que mostrem alguma alteração entre os animais tratados ou
não tratados com Apocinina.
105
Tabela 15: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a técnica de
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitútico (TBARS) em amostras de cérebro
Comparação
Grupos
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,862 0,784 0,989 0,444
1 dia vs. 10 dias 1,000 0,060 0,991 1,000
1 dia vs. 15 dias 1,000 0,858 0,812 0,346
1 dia vs. 20 dias 0,196 <0,001 0,367 <0,001
5 dias vs. 10 dias 0,921 0,001 0,881 0,380
5 dias vs. 15 dias 0,774 0,204 0,981 1,000
5 dias vs. 20 dias 0,411 <0,001 0,591 <0,001
10 dias vs. 20 dias 0,223 0,223 0,200 <0,001
10 dias vs. 15 dias 0,998 0,455 0,487 0,290
15 dias vs. 20 dias 0,169 0,002 0,793 <0,001
A = Grupo de camundongos tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. *Obtido por teste de Tukey
106
Tabela 16: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com, para a técnica de
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em amostras de pulmão
Comparação
Tempo de Infecção (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,993 0,246 0,025 0,468 1,000
A vs. C 0,986 0,999 0,992 0,349 0,857
A vs. D 0,890 0,207 0,909 0,722 0,996
B vs. C 1,000 0,342 0,009 0,999 0,507
B vs. D 0,969 1,000 0,151 0,079 0,966
C vs. D 0,982 0,296 0,775 0,043 0,314
A = Grupo de camundongos tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. *Obtido por teste de Tukey
107
3.4.2 Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
A figura 26 mostra o comportamento do TEAC no cérebro de camundongos de acordo
com tratamento empregado em cada grupo. O gráfico foi construído utilizando os valores
expressos na tabela 17. Nas tabelas 18 e 19 estão descritos os valores de p para o TEAC por
grupo e por tempo, respectivamente.
Analisando o comportamento do grupo D, o qual abrangia os animais não foram tratados
com Apocinina e não foram infectados, encontrou-se que os valores de TEAC para os animais
controles variaram de 5 a 7 mM. Foi encontrada diferença estatística significante quando
comparados os níveis de TEAC nos animais de 1 dia vs. 20 dias (p= 0,001).
Figura 26: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) por tempo de infecção, no
cérebro de camundongos, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A = Animais que
receberam tratamento com Apocinina e foram infectados com Plasmodium berghei. Grupo B =
Animais que receberam o tratamento com Apocinina e não foram infectados com P. berghei.
Grupo C = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e foram infectados com P.
berghei. Grupo D – Controle = Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e não
foram infectados
0
5
10
15
1 5 10 15 20
TEAC
A D C B Tempo de Infecção (Dias)
TEA
C (
mM
)
108
O grupo B de animais tratados com apocinina, mas não infectados, apresentou variações
nos níveis de TEAC de 4 a 8mM ao longo do período de estudo.
Houve um aumento significante entre 1º e o 5º dia de infecção (p=0,048), seguido de
diminuição estatisticamente significante entre o 5º e o 10º dia (p<0,001), o 5º e o 15º dia
(p=0,040) e entre o 15º e o 20º dia (Tabela 18). A despeito disso, essas diferenças não mostram
significância, pois ao compararmos os grupos B vs. D não são encontradas diferenças
estatisticamente significantes que justifiquem diferenças entre os grupos (Tabela 19).
Tabela 17: Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras cerebrais de
camundongos de acordo com o tratamento recebido
N= Número de amostras por grupo; d= tempo de infeção do grupo.
*Valores apresentados como média ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
Ao analisar o comportamento do grupo C encontrou-se que os valores de TEAC foram
mais altos (7 a 9 mM) do que os valores apresentados pelo grupo D (5 a 7 mM) com um aumento
estatisticamente significante nos níveis de TEAC entre o 1º e o 5º dia de infecção (p=0,045).
Entretanto, essa diferença foi a única encotrada na análise temporal, não havendo diferenças
estatisticamente significantes importantes na análise entre grupos.
O grupo A apresentou comportamento semelhante ao grupo C com os níveis de TEAC
variando entre 8 e 10 mM. Em comparação ao grupo D, chamado grupo controle, esses níveis
foram mais altos do que a faixa de normalidade encontrada pelos animais controles (5 a 7 mM),
ainda assim, essa alteração não mostrou diferenças estatísticas significantes. Mesmo que tenha
havido uma diferença estatisticamente significante na comparação temporal dos valores de 5 vs.
GRUPOS TEAC (mM)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 9 8 ± 0,5 10 10 ± 1 11 8 ± 1 12 8 ± 1 1 9
B 10 6 ± 1 10 8 ± 2 10 5 ± 1 8 5 ± 1 9 4 ± 1
C 9 7 ± 0,5 9 9 ± 1 11 7 ± 1 12 8 ± 2 3 9 ± 0,5
D 9 7 ± 2 10 6 ± 1 10 6 ± 2 10 6 ± 2 9 5 ± 1
109
10 dias (p=0,042), essas diferenças pontuais aparecem em tempos isolados e não se repetem ao
longo dos dias de infecção e com isso não apresentam significância.
Tabela 18: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a Capacidade
Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras de cérebro
Comparação Grupo
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,379 0,048 0,045 0,391
1 dia vs. 10 dias 0,875 0,346 0,998 0,472
1 dia vs. 15 dias 0,997 1,000 0,63 0,511
1 dia vs. 20 dia 0,931 0,029 0,167 0,001
5 dias vs. 10 dias 0,042 <0,001 0,076 1,000
5 dias vs. 15 dias 0,173 0,040 0,546 1,000
5 dias vs. 20 dias 1,000 <0,001 0,998 0,215
10 dias vs. 15 dias 0,968 0,381 0,792 1,000
10 dias vs. 20 dias 0,751 0,797 0,235 0,166
15 dias vs. 20 dias 0,879 0,035 0,658 0,145
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey
110
Tabela 19: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de infecção,
para a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox, em amostras de cérebro.
Comparação Tempo de Infecção (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,403 0,487 0,984 0,992 1,000
A vs. C 0,743 0,816 0,071 0,022 0,992
A vs. D 0,762 0,777 0,091 0,860 0,936
B vs. C 0,948 0,107 0,032 0,014 0,988
B vs. D 0,938 0,966 0,043 0,732 0,706
C vs. D 1,000 0,271 1,000 0,214 0,973
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey
111
3.4.3 Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
Na figura 27 é demonstrado o comportamento da dosagem capacidade antioxidante pela
redução do radical DPPH, no cérebro de camundongos de acordo com tratamento empregado. Os
valores de média e desvio padrão estão descritos na Tabela 20. Nas tabelas 21 e 22 estão
descritos os valores de p para DPPH por grupo e por tempo, respectivamente.
Figura 27: Perfil Antioxidante medido pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila
(DDPH) por tempo de infecção, no cérebro de camundongos, de acordo com o tratamento
empregado. Grupo A = Animais que receberam tratamento com Apocinina e foram infectados
com P. berghei. Grupo B= Animais que receberam o tratamento com Apocinina e não foram
infectados com P. berghei. Grupo C= Animais que não receberam o tratamento com Apocinina e
foram infectados com P. berghei. Grupo D – Controle = Animais que não receberam o
tratamento com Apocinina e não foram infectados.
O grupo D apresentou valores de níveis de DPPH que variaram entre 1 e 3 mmol/L e ao
observarmos as variações temporais foram encontradas diferenças estatisticamente significantes
quando comparados os valores de DPPH nos seguintes tempos: 1 dia vs. 15 dias (p<0,001), 1 vs.
20 dias (p=0,008), 5 dias vs. 15 dias (p<0,001), 5 dias vs. 20 dias (p=0,004) e 10 dias vs. 15 dias
(p<0,001). No entanto, essas diferenças não foram indicativas de um comportamento diferente
estatisticamente.
0
1
2
3
4
5
1 5 10 15 20
DPPH
A D C B Tempo de Infecção (Dias)
DP
PH
(m
mo
l/L)
112
Tabela 20: Dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-
Picrilidrazila (DDPH) no cérebro de camundongos de acordo com o tratamento recebido
N= Número de amostras por grupo; d= tempo de infeção do grupo.
*Valores apresentados como média ± desvio padrão.
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
O grupo B, que abrangia os animais não infectados, porém tratados com apocinina,
apresentou valores de DPPH (0,5 a 3 nmol/mL) que se mantiveram dentro dos valores da faixa
apresentada pelos animais do grupo D (1 a 3 nmol/mL). A avaliação temporal do grupo mostrou
diferenças estatisticamente significantes quando comparados os níveis de DPPH nos animais de 1
dia vs. 5 dias (p=0,044), 1 dia vs. 15 dias (p<0,001), 5 dias vs. 10 dias (p<0,001), 5 dias vs. 15
dias (p<0,001), 5 dias vs. 20 dias (p<0,001), 10 vs. 15 dias (p=0,001) e 15 dias vs. 20 dias
(p<0,001). Muito embora tenham sido encontradas essas diferenças estatiscamente significantes,
estas não representam significância biológica, especialmente ao compararmos o grupo B vs. D,
que mostra que os dois grupos apresentam comportamentos iguais.
O grupo e o grupo A apresentaram comportamento semelhante e não apresentaram
diferenças estatítisticas significantes quanto aos valores de DPPH ao longo dos dias de infecção.
Grupo DPPH (mmol/L)
N 1d N 5d N 10d N 15d N 20d
A 10 1 ± 1 9 1 ± 1 11 1 ± 0,5 11 1 ± 1 1 1
B 10 2 ± 0,5 10 3 ± 0,5 10 2 ± 0,5 10 0,50 ± 0,50 9 2 ± 1
C 8 2 ± 0,5 9 1 ± 1 12 2 ± 0,5 10 1 ± 0,5 3 2 ± 0,2
D 9 2 ± 0,4 10 3 ± 0,5 9 2 ± 0,5 10 1 ± 1 9 2 ± 0,5
113
Tabela 21: Valores de p* para as comparações de tempo de cada grupo para a capacidade
antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em amostras de
cérebro de camundongos
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo
de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não
tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com
Apocinina e não infectados com P. berghei. *Obtido por teste de Tukey.
Tabela 22: Valores de p* para as comparações entre grupos de acordo com os dias de infecção,
para a capacidade antioxidante medida pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH),
em amostras de cérebro de camundongos
Comparação Tempo de infecção (Dias)
1 5 10 15 20
A vs. B 0,403 0,487 0,984 0,992 1,000
A vs. C 0,743 0,816 0,071 0,022 0,992
A vs. D 0,762 0,777 0,091 0,860 0,936
B vs. C 0,948 0,107 0,032 0,014 0,988
B vs. D 0,938 0,966 0,043 0,732 0,706
C vs. D 1,000 0,271 1,000 0,214 0,973
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei
D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
*Obtido por teste de Tukey.
Comparação Grupos
A B C D
1 dia vs. 5 dias 0,986 0,044 0,742 0,999
1 dia vs. 10 dias 0,926 0,581 0,542 0,581
1 dia vs. 15 dias 1,000 <0,001 0,982 <0,001
1 dia vs. 20 dias 0,998 0,653 0,692 0,008
5 dias vs. 10 dias 0,998 <0,001 0,046 0,439
5 dias vs. 15 dias 0,971 <0,001 0,949 <0,001
5 dias vs. 20 dias 1,000 <0,001 0,211 0,004
10 dias vs. 15 dias 0,878 <0,001 0,186 <0,001
10 dias vs. 20 dias 1,000 1,000 0,998 0,315
15 dias vs. 20 dias 0,996 <0,001 0,44 0,252
114
3.4.4 Estudos de Correlação em Amostras Cerebrais
3.4.4.1 Correlação TBARS e TEAC
A figura 28 mostra os gráficos de correlação entre TBARS e TEAC nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com inibidor da NOX, Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento
isoladamente e com todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
115
Figura 28: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em amostras cerebrais de
camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos
simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei; Grupo B = Correlação realizada
com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com
Plasmodium berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais
não tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. Grupo D = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados
com Plasmodium berghei.
r= 0,332 p <0,0001
r= - 0,113 p =0,477 r= 0,499 p =0,0005
r= - 0,236 p =0,132 r= 0,429 p =0,002
116
Quando comparados todos os grupos encontrou-se uma correlação positiva moderada
estatisticamente significante (r= 0,332; p<0,0001).
Nos grupos B (r= 0,449; p=0,0005) e D (r= 0,429; p=0,0002), ambos de animais não
infectados, foi encontrada correlação positiva moderada, ou seja, que nesses animais, quando
ocorre um aumento nos níveis de TBARS, são aumentados também os níveis de TEAC.
Entretanto, a correlação do grupo A (r= 0,113; p=0,477) mostra que o tratamento com Apocinina
desfaz essa correlação.
O grupo C (r= -0,236; p= 0,132) não apresentou correlação significante, mostrando que
a infecção não exerce influencia sobre esses animais.
117
3.4.4.2 Correlação TBARS e DPPH
A figura 29 mostra os gráficos de correlação entre TBARS e DPPH nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
118
Figura 29: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
capacidade antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em
amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não
infectados com P. berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação
realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados
com P. berghei.
r= 0,116 p= 0,129
r= - 0,269 p= 0,009 r= 0, 259 p= 0,782
r= 0,203 p= 0,207 r= 0,154 p= 0,304
119
Após serem avaliadas as correlações, o único grupo que apresentou correlação
estatisticamente significante foi o grupo A (r =-0,269; p=0,009) com uma correlação negativa
moderada. Os dados mostram que na presença da Apocinina os animais infectados estabelecem
relação inversamente proporcional entre aos níveis de TBARS e DPPH.
3.4.4.3 Correlação TBARS e Parasitemia
A figura 30 mostra os gráficos de correlação ente TBARS e Parasitemia nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
120
Figura 30: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e
Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada
com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com
todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium
berghei;. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados
com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei.
Quando todos os grupos foram correlacionados foi encontrada uma correlação negativa
moderada (r=-0,48; p<0,0001) estatisticamente significante. De mesmo modo, o grupo C
apresentou uma correlação negativa moderada (r=-0,64; p<0,0001) significante mostrando uma
relação inversamente proporcional entre a concentração de TBARS e Parasitemia.
Entretanto, o grupo A, de animais infectados e que foram tratados com Apocinina, não
apresentou correlação (r=-0,26; p=0,101) indicando que na presença da apocinina os animais
infectados não tem relação inversamente proporcional entre Parasitemia e TBARS.
r= - 0,48 p < 0,0001
r= - 0,26 p = 0,101 r= - 0,64 p < 0,0001
r= - 0,48 p < 0,0001
121
3.4.4.4 Correlação DPPH e Parasitemia
A figura 31 mostra os gráficos de correlação entre DPPH e Parasitemia nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
Não foram encontradas correlações quanto ao DPPH e a Parasitemia. Todos os Grupos
(r= 0,026 p= 0,818); Grupo A (r= 0,063 p= 0,697) e Grupo C (r= 0,080 p= 0,618).
122
Figura 31: Correlações entre Capacidade Antioxidante medida pelo redução do radical 1,1-
Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) e Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos. Todos
os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente;
Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais tratados com
Apocinina e infectados com P. berghei;. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do
grupo de animais não tratados com Apocinina e infectados com P. berghei.
r= 0,026 p= 0,818
r= 0,063 p= 0,697 r= 0,080 p= 0,618
123
3.4.4.5 Correlação TEAC e Parasitemia
A figura 32 mostra os gráficos de correlação entre TEAC e Parasitemia nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
Não foram encontradas correlações quanto ao TEAC e a Parasitemia. Todos os Grupos
(r= 0,092 p= 0,404); Grupo A (r=0,193 p=0,222) e Grupo C (r=0,294 p=0,560).
Figura 32: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e Parasitemia em
amostras cerebrais de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os
pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei;. Grupo C =
Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e
infectados com P. berghei.
r= 0,092 p=0,404
r= - 0,193 p=0,222 r= 0,294 p=0,560
124
3.4.4.6 Correlação TEAC e DPPH
A figura 33 mostra os gráficos de correlação entre TEAC e DPPH nas amostras cerebrais
de camundongos infectados ou não infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isoladamente e com
todas as amostras de todos os grupos simultaneamente.
125
Figura 33: Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox e capacidade
antioxidante pela redução do radical 1,1-Difenil-2-Picrilidrazila (DDPH) em amostras cerebrais
de camundongos. Todos os Grupos = Correlação realizada com todos os pontos de todos os
grupos simultaneamente; Grupo A = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de
animais tratados com Apocinina e infectados com P. berghei; Grupo B = Correlação realizada
com todos os pontos do grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P.
berghei. Grupo C = Correlação realizada com todos os pontos do grupo de animais não tratados
com Apocinina e infectados com P. berghei. Grupo D = Correlação realizada com todos os
pontos do grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
O grupo B apresentou correlação moderada positiva estatisticamente significante
(r=0,534; p=0,0001), mostrando que os valores de TEAC e DPPH estão correlacionados
r= 0,0374 p= 0,625
r= 0,206 p= 0,197 r= 0,534 p= 0,0001
r= - 0,286 p= 0,073 r= 0,296 p= 0,045
126
positivamente, sendo um indicativo de que está sendo produzido antioxidante na vigência do
tratamento com apocinina e ausência de infecção por P. berghei.
O grupo D apresentou comportamento semelhante (r=0,296; p=0,045) ao grupo B nas
correlações, indicando que mesmo na ausência do tratamento e da infecção existe correlação
entre os níveis de TEAC e DPPH.
127
4. DISCUSSÃO
Em todo o mundo, a malária continua a ser um dos mais relevantes problemas de saúde
pública e em nosso país também persiste como uma das principais questões, em especial na
região Amazônica, que registra cerca de 99% do número de casos (Silva-Nunes et al., 2006;
Ministério da Saúde, 2012).
Durante a infecção da malária ocorre a produção das ERO, tanto pela ativação do sistema
imune em resposta aos estímulos antigênicos, como pela própria degradação da hemoglobina
pelo parasita (Kharazmi et al., 1987). Os antígenos do P. falciparum ativam fagócitos
diretamente, os quais, por sua vez produzem as ERO durante a invasão do plasmódio. Variações
na produção de ERO são importantes em doenças como esclerose múltipla, aterosclerose,
hipertensão arterial, proliferação celular e hipertrofia (Lassègue & Clempus, 2003) ou na
eliminação de protozoários (Murray & Cohn 1979; Farombi, 2003; Uhlemann et al., 2004;
Maugeri et al., 2004; Souza, 2008).
Alguns estudos mostram que o estresse oxidativo pode atuar de forma prejudicial devido
as ERO reagirem e modificarem a estrutura e funções de várias biomoléculas, incluindo
proteínas, lipídeos, açúcares e ácidos nucléicos (Gachot et al, 1995; Castro & Freeman, 2001;
Araújo et al., 2008). Por outro lado, é também reconhecido que as ERO desempenham papéis
fisiológicos importantes, como na sinalização celular, na apoptose, na fagocitose de agentes
patogênicos, entre outros (Taylor et al., 2006; Gillrie et al., 2007; Vasconcelos et al., 2007).
O reconhecimento de marcadores de dano oxidativo e a análise do balanço redox, através
dos efeitos da inibição das enzimas NADPH oxidase podem ser úteis para o reconhecimento dos
processos patológicos da infecção malárica, bem como, na fisiopatologia da doença e na resposta
farmacológica terapêutica.
Desse modo, este estudo objetivou avaliar temporalmente os efeitos da inibição das
enzimas NADPH oxidase sobre sobre o perfil oxidativo e a defesa antioxidante em camundongos
infectados com o P. berghei.
Os resultados apresentados demonstram pela primeira vez a utilização da apocinina na
inibição do complexo enzimático NADPH oxidase na infecção por malária causada por P.
berghei em camundongos.
Para darmos início ao estudo, foi escolhido o modelo experimental que mais se adequava
ao desenho de estudo. Modelos experimentais animais tem sido fundamentais para a
128
compreensão de doenças humanas. Até o momento, os modelos experimentais de malária têm
sido desenvolvidos em macacos, ratos e camundongos e mesmo que não possam “simular”
exatamente a doença completa, representam fielmente certos aspectos da malária humana. O
modelo mais amplamente utilizado para a malária falciparum em humanos é o da infecção por P.
berghei ANKA em camundongos (Hunt & Grau, 2003; Combes et al., 2005; Bassir et al., 2012).
Assim, o modelo experimental escolhido para este estudo foi o camundongos Swis
infectados com a cepa de P. berghei ANKA, uma vez que, como dito anteriormente, esta espécie
infecta prioritariamente roedores e apresenta mudanças histopatológicas encontradas na maioria
dos órgãos, quadro clínico e sequências genômicas muito semelhantes àquelas encontradas pela
infecção humana pelo P. falciparum (Andrade Junior et. al., 1991;
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_berghei/).
Este modelo tem se mostrado eficaz e estudos mostram que o P. berghei ANKA é o
parasita de escolha devido a sua capacidade de citoaderência na microcirculação, que é
característica de malária grave em humanos, especialmente na cerebral (Cardoso, 2001; Gomes
et al., 2011; Jambou et al., 2011; Bassir et al., 2012).
Considerando os efeitos da produção exacerbada de ERO, e que pode ser decorrência da
síntese de radicais superóxido pelas enzimas da família NOX, algumas substâncias têm sido
estudadas como inibidores no intuito de avaliar a atividade dessa enzima (Williams &
Griendling, 2007). Entre essas substâncias, a apocinina tem sido o composto de escolha de
grande parte dos estudos que objetivam avaliar o envolvimento do complexo enzimático
NADPH oxidase em modelos animais in vivo (Bedard & Krause, 2007; Williams & Griendling,
2007; Stenfanska & Pawliczak, 2008). Assim, para avaliar o papel da inibição das enzimas
NADPH oxidase no perfil oxidativo da malária foi utilizado como inibidor a Apocinina.
Apesar de a Apocinina apresentar algumas particularidades quanto a sua especificidade,
sua ação antioxidante e sua dependência ou não de peroxidases (Williams & Griendling, 2007;
Heumuller et al., 2008, Simonyi et al., 2012) o uso desta em água de beber tem sido
amplamente difundido já que pode ser administrada oralmente e sem apresentar toxicidade em
doses já suficientes para inibir esse complexo enzimático (Bedard & Krause, 2007; Williams &
Griendling, 2007; Stenfanska & Pawliczak, 2008).
Muitos estudos têm apresentado resultados satisfatórios na inibição da NOX utilizando
Apocinina em água de beber (‘tHart et al., 1991; Matsuhima et al., 2009; Yokota et al., 2009
129
Yukihiro et al., 2011, Dhiman & Garg, 2011; Castro et al., 2012; Shortt et al., 2014) e por isso
nos valemos dessa via de administração neste estudo.
Nossos animais foram tratados com a concentração de 1,5mM de apocinina em água de
beber, assim como Dhiman & Garg (2011) que trataram camundongos infectados e não
infectados com Trypanossoma cruzii com apocinina em água de beber na mesma concentração
que o presente estudo, conseguindo bloquear o complexo NADPH oxidase de forma eficiente.
De mesmo modo, Hiroyuki e colaboradores (2011) trataram camundongos na dosagem de 10
mmol/L em água de beber e também conseguiram inibir o complexo enzimático em questão.
Em nossos resultados, a inibição da atividade da NADPH oxidases foi observada pelos
valores dos níveis de peroxidação lipídica, de parasitemia, de sobrevida e de capacidade
antioxidante diferenciados encontrados nos grupos tratados com apocinina em relação aos grupos
não tratados, entretanto, apesar de terem sido encontradas diferenças, de forma geral, estas não
foram estatisticamente significantes a ponto de afirmarmos que houveram alterações no
comportamento dos animais tratados com o inibidor.
Assim, apesar das diferenças encontradas entre os grupos, não foi possível afirmar de
forma incontestável que ocorreu o bloqueio da atividade da NOX, o que poderia se verificado
pela aplicação de técnicas de Histopatologia, Imunohistoquímica, Quimioluminescência, ou de
técnicas moleculares como Reação em Cadeia mediada pela Polimerase com Transcrição
Reversa (RT – PCR), a fim de investigar a expressão dos componentes citosólicos e
transmembrana, ou ainda por Western Blott com investigação das proteínas do complexo
NADPH oxidase.
Em sequência, foram utilizados métodos que quantificam a peroxidação lipídica
(TBARS) e a capacidade antioxidante (TEAC e DPPH). Os dados encontrados foram
comparados entre si e aos efeitos sobre a parasitemia e a sobrevida.
Confirmando a primeira hipótese do estudo, sugere-se que o estresse oxidativo confira
um fator de proteção para o hospedeiro, uma vez que, diferença percentual entre os grupos A e C
e diferença percentual entre os grupos B e D (10%) podem ser indicativas de que o consumo de
apocinina pode ter contribuído para a diminuição da sobrevida dos animais nos grupos
estudados.
Ou seja, uma vez que inibida a produção de superóxido pela Apocinina, a diminuição da
biodisponibilidade desse radical livre pode ter gerado maior mortalidade de camundongos nos
130
grupos que fizeram o tratamento com a Apocinina. Assim sendo, sugere-se que nos grupos que
fizeram o tratamento com a Apocinina houve uma diminuição do estresse oxidativo, e
consequente diminuição da sobrevida, em comparação aos que não foram tatados, o que nos leva
a supor que o estresse oxidativo represente um papel protetor na infecção por malária ou por
outros agentes infecciosos, uma vez que, mesmo nos animais não infectados pelo plasmódio, a
sobrevida foi menor nos grupos tratados com o inibidor (grupo B).
Esses achados corroboram o estudo de Erel e cols. (1997) que sugere que o estresse
oxidativo possa estar ligado ao mecanismo de defesa do hospedeiro à infecção. Entretanto, vale
ressaltar que apesar dos dados de sobrevida de camundongos por grupo de estudo serem
oportunos, tais dados não foram analisados estatisticamente, uma vez que esses valores
representam valores percentuais, portanto não passíveis de análise pelos métodos estísticos.
A análise da parasitemia mostra que houve aumento progressivo e exponencial na
parasitemia (p<0,001) nos grupos A e C, como esperado para animais infectados. Entretanto, a
análise do grupo A, o qual abrangia os animais tratados com Apocinina e que estavam infectados
com P. berghei, mostra que houve um aumento pronunciado da parasitemia a partir do 15º dia de
infecção, em relação ao grupo C, de animais não tratados e infectados, porém sem diferenças
estatísticas significantes (p=0,209).
Embora as diferenças não tenham sido estatisticamente significantes entre ambos os
grupos, os valores de p estão caminhando para uma diminuição progressiva, sugerindo que com
o passar do tempo de infecção as médias tendem a se distanciar (Tabela 4). Dessa forma,
possivelmente, a diminuição de estresse oxidativo, decorrente da inibição da NOX, e
consequente diminuição da produção de superóxido, causaria um aumento da parasitemia. Se
esse perfil ocorrer, confirmar-se-ia a primeira hipótese de que o estresse oxidativo tem papel
protetor para o hospedeiro frente a infecção por malária, agindo como primeira linha de defesa
do hospedeiro frente à agressão causada pela infecção pelo parasito. Desta forma, de fato, se o
estresse oxidativo tiver um papel protetor, com a inibição da NOX se diminuiria a
disponibilidade de radicais livres e, consequentemente, o estresse oxidativo, minimizando a
defesa do hospedeiro e, assim, favorecendo a progressão da doença e o aumento da parasitemia.
No entanto, neste estudo ficou demonstrado que a diminuição da produção de superóxido
não exerce influência na progressão da parasitemia. Esses achados corroboram o estudo de
Gillman et al. (2004) que comparou o curso da parasitemia por Plasmodium chabaudi em
131
camundongos knockout (KO) para a porção p47phox(-/-)
da NOX com um grupo controle de
camundongos C57BL/6 e observou que a parasitemia nos grupos experimental e controle,
apresentou um padrão similar e que os animais KO não apresentavam parasitemia exacerbada.
De mesmo modo, Potter et al., (2005) também não encontrou diferenças na progressão da
parasitemia em 5 diferentes cepas de plasmódio, quando comparados animais controle de
linhagem selvagem com animais KO para gp9 phox(-/-)
da NADPH oxidase infectados com P.
berghei ANKA, P. berguei K173, P. yoelii, ou P. chabaudi K562, e/ou P. Vinckei vinckei.
Outros estudos também mostraram que não há diferenças entre a produção de superóxido e o
progresso da parasitemia (Favre et al., 1999; Harada et al., 2001)
De forma contrária, Sanni et al. (1999) que infectou camundongos KO gp9 phox(-/-)
com P.
berghei e comparou com grupo controle reportou que a parasitemia foi significantemente maior
nos camundongos KO, especialmente entre o 5º e o 7º dia após a inoculação.
4.1 ACHADOS PULMONARES
Os antígenos do P. falciparum ativam fagócitos diretamente, os quais, por sua vez
produzem as ERO durante a invasão do plasmódio (Uhlemann et al., 2004; Maugeri et al., 2004;
Souza, 2008). Dentre os radicais livres, o superóxido recebe especial destaque por ter grande
participação na síndrome da angústia respiratória e entre outras ações de sinalização celular e de
ativação de inflamação (Uhlemann et al., 2004)
Neste raciocínio, a fim de avaliar a participação das ERO nas alterações oxidativas da
malária em camundongos tratados e não tratados com Apocinina foram avaliados indicadores de
estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como as Substâncias Reativas ao
Ácido Tiobarbitúrico.
No que diz respeito ao TBARS, os resultados encontrados mostram que ainda que tenham
ocorrido diferenças estatísticas em alguns pontos de comparação entre dias e entre grupos, estas
não apresentam significância, uma vez que acontecem em tempos isolados e não se repetem ao
longo dos dias de infecção. Dessa maneira, os dados encontrados sugerem que o tratamento com
a Apocinina não interferiu significativamente nas concentrações de TBARS entre os grupos
estudados.
132
Dessa forma, nossos achados discordam dos achados de Sohail et al., 2007 que encontrou
que o aumento de estresse oxidativo, com aumento na produção de TBARS, era acompanhado de
aumento da carga parasitária. O mesmo padrão foi encontrado por Stocker et al. (1985) que
sugeriu que o aumento da carga parasitária foi acompanhada por um aumento na produção de
TBARS, indicando reforçada peroxidação lipídica.
Paralelamente, um estudo que avaliou se a Apocinina influenciava na peroxidação
lipídica utilizando a técnica TBARS em homogeneizados de coração de ratos mostrou que o uso
do inibidor da NOX provocou uma diminuição significativa nos níveis de TBARS (Kleniewska
et al., 2013).
No entanto, apesar de não terem sido encontradas diferenças estatísticas significantes, ao
observarmos o comportamento dos grupos A e C em relação ao grupo controle D, nota-se que
houve uma diminuição estatisticamente significante dos níveis de TBARS no grupo A,
especialmente entre o 1º e o 15º (p<0,0001), sugerindo que o uso da Apocinina possa diminuir
níveis de TBARS. Este dado sugere que a produção de O2.- pela NOX seja uma fonte importante
de estresse oxidativo na doença (Figura 17; Tabelas 5-7).
Como dito anteriormente, as ERO têm importante função biológica, como na fagocitose,
fenômeno em que essas espécies são produzidas no intuito de eliminar o agente agressor. Por
outro lado, quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema
antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio (Vasconcelos et al., 2007).
Os níveis intracelulares das ERO são mantidos baixos por um número de antioxidantes
consumíveis, sintetizáveis ou mobilizáveis e moléculas queladoras de metais (Halliwell &
Gutteridge, 2007).
Os antioxidantes mobilizáveis são produzidos de modo endógeno e são representados por
muitas substâncias, com destaque para a glutationa (GSH), um peptídeo hidrossolúvel sintetizado
pelo fígado e principal composto antioxidante intracelular, além das enzimas superóxido
dismutase (SOD), que catalisam a dismutação do ânion radical superóxido (O2.-) a peróxido de
hidrogênio (H2O2) e O2; pela catalase (CAT), que atua na decomposição de H2O2 a O2 e H2O; e
pela glutationa peroxidase (GPx), que atua sobre peróxidos, em geral, com utilização de
glutationa como co-fator (Vasconcelos et al., 2007).
Por outro lado o sistema antioxidante consumível é composto por biomoléculas obtidas
diretamente da dieta tais como tocoferóis, ascorbato e β-caroteno. As substâncias capazes de
133
quelar os metais de transição são a transferrina (transporte do ferro) e a ceruloplasmina
(transporte do cobre e oxidação do ferro para ser captado pela transferrina), por serem proteínas
com sítios de ligação para metais (Vasconcelos et al., 2007). Para a análise da capacidade
antioxidante foram realizadas as técnicas de TEAC e de DPPH.
Em nossos resultados não foram encontradas variações significantes nas dosagens de
TEAC para os grupos B, C ou D, observando-se que, de forma geral, tiveram comportamento
semelhante, sendo que todos se mantiveram dentro da faixa de normalidade de 10 a 16 mM,
independente da presença ou não da infecção (Figura 18). Entretanto, para o grupo A, que
abrangia os animais infectados com P. berghei e tratados com Apocinina, encontrou-se diferença
estatisticamente significante nos níveis de TEAC entre o 1º dia de infecção e o 15º dia (p=0,01),
sugerindo que a inibição da NOX promova uma gradual elevação nos níveis de TEAC.
Da mesma forma que o encontrado em relação ao TBARS, os dados encontrados
mostram que a ingestão de Apocinina não promoveu alterações significativas na capacidade
antioxidante equivalente ao Trolox, nas amostras de pulmão dos grupos estudados. Entretanto, a
despeito da Apocinina não ter causado alterações nos níveis de TEAC, encontra-se uma
tendência a diminuição (p=0,056) dos níveis de TEAC para os animais do grupo B (tratados com
Apocinina e não infectados), sugerindo que a Apocinina possa diminuir os níveis de defesa
antioxidante em animais não infectados (Tabelas 8-10). Este dado sugere também que a
diminuição da síntese de superóxido decorrente da inibição da NOX, promova níveis de estresse
oxidativo menores e, por isso, ocorram menos estímulos para síntese de moléculas mobilizáveis
da defesa antioxidante.
Quando se trata da análise do grupo A (animais infectados e tratados com apocinina)
nossos resultados também mostram um perfil diferente do esperado, uma vez que, pelo tempo de
estudo (20 dias) é muito provável que o organismo dos animais infectados tenha tido tempo de
produzir a síntese endógena de moléculas antioxidantes. Logo, esperava-se um aumento dos
níveis de TEAC nos animais infectados devido ao aumento da síntese de moléculas
antioxidantes mobilizáveis. A dosagem da capacidade antioxidante pela redução do radical
DPPH apresentou resultados iguais aos de TEAC, dados que reforçam o perfil antioxidante
encontrado nessa doença. Ou seja, dependendo do grupo estudado, poderiam ter sido
encontrados perfis antioxiantes diferente, no entanto, como dito anteriormente, o tratamento com
apocinina não diminuiu significativamte os níveis de TEAC nem tampouco os de DPPH e esse
134
fato pode ter acontecido por problemas particulares dessa doença, ou ainda por problemas
técnicos nos métodos de análise.
Outrossim, seria ideal que fossem desenvolvidas técnicas que pudessem comprovar que
as defesas antioxidantes encontradas são, de fato, mobilizáveis/sintitetizáveis como a dosagem e
quantificação de GSH, SOD e CAT, os quais também dariam maior amplitude para conhecermos
o perfil antioxidante em animais tratados e não tratados com apocinina.
Paralelamente, alguns autores referem a Apocinina como uma molécula que apresenta
ação antioxidante (Simons et al., 1990; Heumüller et al., 2008). Entretanto, nossos resultados
não contribuíram para essa afirmação, já que não houveram alterações significativas nos níveis
de antioxidantes nos animais tratados com Apocinina.
No presente estudo houve correlação moderada positiva e estatisticamente significante
entre as dosagens de TBARS e TEAC no grupo C (r=0,485 p=0,0015), de animais não tratados e
infectados, o que é perfeitamente pertinente, já que, como as amostras analisadas foram de
tecidos, o esperado é que encontremos enzimas antioxidantes estimuladas pelo aumento da
produção de ERO, logo, aumento de TBARS, seguido de aumento de TEAC se as moléculas de
defesa antioxidantes forem mobilizáveis.
Entretanto, na presença da apocinina, (grupo A) essa correlação se desfez, já que não
foram encontradas correlações entre os níveis de TBARS e TEAC para o grupo A
individualmente, mas foram para Todos os Grupos em conjunto e para o grupos C
individualmente (Figura 20), confirmando a hipótese de que o estresse oxidativo apresenta papel
protetor para o hospedeiro e que a NOX é fonte importante de radicais livres para o estresse
oxidativo.
Paralelamente, ao correlacionarmos TBARS e DPPH houve correlação negativa
moderada no grupo A (r=-0,436; p=0,0006), que abrangia camundongos infectados e tratados
com apocinina, o que é diferente do esperado já que na presença da infecção e com inibição da
produção de O2.-, esperava-se que houvesse um aumento da defesa antioxidante pela síntese de
moléculas mobilizáveis. Esse perfil pode ser indicativo de que as moléculas envolvidas no
processo possam ser antioxidantes consumíveis e/ou ainda que este método de análise não seja o
mais adequado para este modelo experimental.
135
4.2 ACHADOS CEREBRAIS
Embora a MC seja a mais grave complicação da doença e principal causa de óbitos das
infecções causadas por P. falciparum, a patogenia dessa doença ainda se mantém obscura
(Wyler, 1983; Roman, 1991). Esta síndrome apresenta uma patogênese complexa, sendo definida
como um estado de coma, com exclusão de outras encefalopatias, associado às manifestações
neurológicas resultantes do dano endotelial e seqüestro de eritrócitos parasitados na
microcirculação cerebral. Alterações morfológicas, como ativação da microglia, redistribuição de
astrócitos, modificações na barreira hematoencefálica (BHE) e dano neuronal, já foram
identificadas nos portadores da MC (Turner, 1997; Sanni et al., 1999; Medana et al., 2002).
Já foi relatada participação das ERO na MC (Sanni et al., 2012), porém, pouco se sabe a
respeito da participação do complexo enzimático NOX na fisiopatogenia dessa doença.
Nesse sentido, no curso da infecção, após a ativação da NADPH oxidase nos fagóitos,
grandes quantidades de O2.- são produzidas e que são rapidamente convertidos em H2O2 e outras
ERO. No entanto, a excessiva e inapropriada produção de ERO pode contribuir para o dano
tecidual, tal como o dano às celulas endoteliais que por sua vez, podem comprometer a BHE,
provocando o agravamento da doença.
De fato, lidar com complicações cerebrais não é nada fácil já que o cérebro é um órgão
com estrutura e fisiologia extraordinariamente complexas e funcionamento que revela
inigualáveis sutilezas. Assim sendo, é muito comum que se encontrem manifestações diferentes
de uma mesma doença em amostras cerebrais, uma vez que a anatomia e fisiologia do cérebro
lhes confere características especiais.
A exemplo disso podemos citar estruturas como: 1) o crânio – que protege contra o
traumatismo mas possibilita o aumento da pressão intracraniana; 2) o liquor – que também
protege contra traumatismo, mas é o agente para o desenvolvimento da hidrocefalia e de
disseminação dos microorganismos e células tumorais; 3) a barreira hematoencefálica - que
além de estabilizar o meio interno, no interior do parênquima, confere, juntamente com a
ausência de drenagem linfática, ao cérebro, um local privilegiado do ponto de vista imunológico,
mas que no entanto, o torna suscetível ao acúmulo de edema (Robins et al., 1991).
Nesse sentido, nossos estudos não mostraram alterações significativas nos níveis de
TBARS, TEAC e DPPH nas amostras cerebrais estudadas. Esses resultados sugerem que a
136
produção de superóxido, pelo menos no parênquima cerebral não desenvolve papel importante
no desenvolvimento e na patogênese da malária, ou que a Apocinina não foi capaz de atravessar
a BHE.
Nossos achados corroboram os estudos de Sanni et al. (1991) que investigou o papel das
ERO na patogênese da malária cerebral em camundongos KO gp91phox (-/-) e sugeriu que as
ERO, especialmente o superóxido, não estão envolvidas na patogênese da malária cerebral.
4.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Muito embora, nossos resultados tenham sido consistentes em não mostrar diferenças
significantes nos níveis de TBARS, TEAC e DPPH e confirmados pelos estudos de correlação,
ainda é cedo para que se possa afirmar que o superóxido não tenha participação na patogênese da
malária nas amostras pulmonares. Observou-se que em alguns casos houveram tendencias a
modificações comportamentais, dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de estudos
que aumentem o tempo de infecção afim de que essas tendências observadas possam ou não ser
confirmadas.
Não obstante, os resultados de parasitemia mostram que o estresse oxidativo mostra-se,
de fato, com um papel protetor para o hospedeiro corroborando com outros estudos que também
discutiram a participação de moléculas do estresse oxidativo na proteção contra malária grave
(Yeo et al, 2007; 2008; Brown et al, 2009, Dhangadamajhi et al, 2009).
A respeito dos resultados na malária cerebral o não envolvimento das enzimas na
patogênese da malária corrobora um trabalho semelhante que também inibiu a NADPH oxidase e
sugere que a barreira hematoencefálica possa proteger esses animais da malária cerebral.
Os resultados apresentados sugerem que, embora a inibição da NADPH oxidase, via
tratamento com inibidor Apocinina, tenha diminuído a sobrevida, o uso dessa substância não
promoveu alterações significativas no perfil oxidativo e antioxidante nas amostras pulmonares e
cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei.
Eventualmente, doses maiores desse inibidor, ou ainda grupos de animais com maior
tempo de infecção possam promover esse efeito, entretanto, mais estudos são necessários para se
verificar essa sugestão.
137
Assim sendo, é necessário o desenvolvimento de novos estudos a fim de que se possa
elucidar o papel dessas enzimas nesta patologia e, eventualmente, permitir o desenvolvimento de
novas estratégias terapêuticas mais eficientes.
138
5. CONCLUSÕES
Os resultados apresentados sugerem que, embora a inibição da NADPH oxidase, via
tratamento com o inibidor Apocinina, tenha diminuído a sobrevida, o uso dessa substância não
promoveu alterações significativas no perfil oxidativo e antioxidante nas amostras pulmonares e
cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei.
O uso da Apocinina não promoveu alterações significantes sobre a evolução da
parasitemia durante 20 dias após a infecção pelo P. berghei. Entretanto, sugere-se que em
períodos de tempo maiores, possa ocorrer o aumento da parasitemia em decorrência da inibição
da NOX.
139
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155
ANEXO 1
PARECER MED014/2008
Projeto: ALTERAÇÕES OXIDATIVAS, DO ÓXIDO NÍTRICO E EXPRESSÃO DE CITOCINAS E GM-CSF,
INDUZIDAS PELO PLASMODIUM BERGHEI EM CAMUNDONGOS
Coordenador: Sandro Percário (ICB/UFPa)
Vigência: 06-03-2011 a 06-03-2014
O Projeto de Pesquisa intitulado “ALTERAÇÕES OXIDATIVAS, DO ÓXIDO NÍTRICO E
EXPRESSÃO DE CITOCINAS E GM-CSF, INDUZIDAS PELO PLASMODIUM BERGHEI EM
CAMUNDONGOS” foi avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais de
Experimentação da Universidade Federal do Pará (CEPAE) e os procedimentos experimentais
utilizados seguem as normas locais e internacionais para manipulação e uso de animais de
experimentação. Portanto, o CEPAE, através de seu presidente, no uso das suas atribuições,
resolve APROVAR a utilização de animais de experimentação nas atividades do projeto em
questão, no período de vigência estabelecido. As atividades experimentais fora deste período
devem receber nova autorização deste comitê. Ao CEPAE é facultado o direito de verificar in
loco a correta aplicação do protocolo aprovado.
Prof. Dr. Antônio Pereira
Presidente do CEPAE/UFPA
156
APÊNDICES
APÊNDICE 1- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos tratados com
Apocinina após 1 dia de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 189,7
AI
1,3
8,6
10,3
0,5
2,9
2 203,6
155,1
0,7
8,0
11,6
2,2
5,7
3 172,3
TQ
1,7
8,1
TQ
2,3
TQ
4 218,8
175,3
1,9
7,2
17,2
1,1
7,4
5 232,3
96,9
1,8
7,8
11,9
1,8
7,1
6 199,4
137,6
1,3
7,3
13,9
1,3
7,4
7 205,3
51,8
2,2
8,5
14,0
1,2
7,7
8 223,9
145,6
1,0
10,8 * 13,4
1,3
7,4
9 234,5
171,9
1,0
7,8
14,9
0,0
8,8
10 218,4
88,2
1,3
8,6
9,5
0,5
2,6
Média 209,8
127,8
1,4
8,3
13,0
1,2
6,3
DP 19,6
44,2
0,5
1,0
2,4
0,7
2,2
Q1 200,4
94,7
1,0
7,8
11,6
0,7
5,7
Q3 222,6
159,3
1,8
8,5
14,0
1,7
7,4
DJ 22,2
64,6
0,7
0,8
2,4
1,0
1,7
2/3DJ 33,3
96,9
1,1
1,1
3,6
1,5
2,6
Q1-3/2DJ 167,2
-2,1
-0,1
6,6
8,0
-0,9
3,1
Q3+3/2DJ 255,9
256,2
2,9
9,7
17,6
3,2
10,0
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
AI= Amostra insuficiente
TQ= tubo quebrou na centrífuga
157
APÊNDICE 2- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 5 dias de infecção com P. Berghei
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 178,82
166,86
2,8
10,36
9,39
1,68
0,81 *
2 199,15
56,67
0,8
10,50
13,30
1,78
6,87
3 190,55
179,67
2
10,01
13,01
0,92
8,04
4 192,90
78,27
5
9,56
14,84
1,65
7,24
5 188,59
122,93
2,6
7,93
15,90
0,00 * 7,97
6 162,00
172,71
2,4
7,72
16,83
1,61
11,14 *
7 210,49
70,22
1,1
11,24
17,93
1,70
11,21 *
8 183,90
143,06
5,2
9,03
13,83
2,05
8,50
9 203,06
113,41
3,8
9,15
17,26
2,01
8,23
10 204,63
121,83
1,5
9,26
15,17
0,19
7,97
Média 191,41
122,56
2,72
9,48
14,75
1,36
7,80
DP 14,24
43,83
1,53
1,11
2,51
0,73
2,86
Q1 185,07
87,05
1,63
9,06
13,44
1,09
7,42
Q3 202,08
160,91
3,55
10,27
16,60
1,76
8,43
DJ 17,01
73,85
1,93
1,21
3,16
0,67
1,01
2/3DJ 25,51
110,78
2,89
1,82
4,74
1,00
1,51
Q1-3/2DJ 159,56
-23,72
-1,26
7,24
8,70
0,09
5,91
Q3+3/2DJ 227,60 271,68 6,44 12,09 21,33 2,77
9,95
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
158
APÊNDICE 3- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 10 dias de infecção com P. Berghei
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 286,06 * 80,73
8
8,32
16,27
0,78
11,67
2 199,09
45,43
4,8
9,13
14,03
2,19
8,96
3 191,31
77,96
7,1
8,00
11,55
1,51
5,59
4 195,20
50,28
9,4
8,24
18,00
1,87
8,17
5 202,21
72,08
4,3
8,02
17,78
1,67
13,26
6 192,48
TQ
18,2
5,68
TQ
1,37
TQ
7 220,51
43,01
13,3
6,65
8,57
0,94
6,45
8 †
†
†
†
†
†
†
9 †
†
†
†
†
†
†
10 †
†
†
†
†
†
†
11 182,35
72,43
13,8
7,14
12,55
1,75
10,42
12 195,98
61,00
12,9
6,34
17,75
0,78
13,53
13 196,37
65,50
7,5
7,74
12,63
1,46
9,90
14 211,16
45,08
7,6
8,68
15,01
1,48
10,22
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 198,67
61,35
9,72
7,63
14,41
1,44
9,82
DP 10,69
14,47
4,29
1,06
3,13
0,45
2,63
Q1 193,16
46,64
7,30
6,89
12,57
1,16
8,37
Q3 201,43
72,34
13,10
8,28
17,38
1,71
11,36
DJ 8,27
25,70
5,80
1,39
4,81
0,55
2,99
2/3DJ 12,41
38,55
8,70
2,08
7,22
0,83
4,49
Q1-3/2DJ 180,75
8,10
-1,40
4,81
5,35
0,32
3,88
Q3+3/2DJ 213,84
110,89
21,80
10,36
24,59
2,54
15,85
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
TQ= tubo quebrou na centrífuga
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
159
APÊNDICE 4- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 15 dias de infecção com P. Berghei
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 184,69
53,04
39,1
7,47
16,57
3,05
13,79
2 198,71
54,08
8,5
7,29
16,30
0,00
11,94
3 218,95
39,20
44,5 * 8,73
16,90
0,00
12,20
4 192,09
39,55
18,7
8,25
17,15
1,10
16,44
5 †
†
†
†
†
†
†
6 214,67
58,24
25,8
6,97
12,59
1,63
13,46
7 213,11
67,93
17,7
8,31
19,22
2,06
13,86
8 222,46
41,28
17,9
9,47
19,03
1,59
11,01
9 196,76
45,43
21,9
7,01
15,14
0,73
10,62
10 †
†
†
†
†
†
†
11 222,46
52,01
21,9
8,02
16,36
1,30
10,88
12 227,91
52,70
24,8
7,76
14,47
0,81
10,55
13 232,58
72,43
20,0
9,23
18,48
1,20
12,27
14 221,68
75,54
35,0
7,95
18,24
0,92
13,92
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 212,17
54,29
22,84
8,04
16,70
1,20
12,58
DP 15,36
12,37
8,42
0,81
1,96
0,84
1,77
Q1 198,22
44,39
18,30
7,43
16,01
0,79
10,98
Q3 222,46
60,66
25,30
8,41
18,30
1,60
13,81
DJ 24,24
16,27
7,00
0,98
2,29
0,81
2,83
2/3DJ 36,36
24,40
10,50
1,48
3,43
1,21
4,24
Q1-3/2DJ 161,86
19,99
7,80
5,95
12,58
-0,42
6,74
Q3+3/2DJ 258,81
85,06
35,80
9,89
21,73
2,81
18,05
160
APÊNDICE 5- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 20 dias de infecção com P. Berghei
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 †
†
†
†
†
†
†
2 †
†
†
†
†
†
†
3 †
†
†
†
†
†
†
4 †
†
†
†
†
†
†
5 †
†
†
†
†
†
†
6 115,19
60,76
55,9
9,53
14,29
1,43
7,11
7 †
†
†
†
†
†
†
8 †
†
†
†
†
†
†
9 †
†
†
†
†
†
†
10 †
†
†
†
†
†
†
11 †
†
†
†
†
†
†
12 †
†
†
†
†
†
†
13 †
†
†
†
†
†
†
14 †
†
†
†
†
†
†
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 115,19
60,76
55,90
9,53
14,29
1,43
7,11
DP
Q1 115,19
60,76
55,90
9,53
14,29
1,43
7,11
Q3 115,19
60,76
55,90
9,53
14,29
1,43
7,11
DJ 0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
2/3DJ 0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Q1-3/2DJ 115,19
60,76
55,90
9,53
14,29
1,43
7,11
Q3+3/2DJ 115,19
60,76
55,90
9,53
14,29
1,43
7,11
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
161
APÊNDICE 6- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 237,4
42,4
7,3
8,7
2,8
3,1
2 226,4
83,8
8,7
7,4
2,0
0,0
3 130,5 * 88,5
5,2
9,5
2,2
2,9
4 229,0
62,5
7,5
10,0
2,7
4,7
5 184,2
55,9
5,1
10,5
2,3
6,0
6 195,6
118,2
6,3
7,5
2,0
5,6
7 208,9
150,4
6,1
5,5
2,2
2,0
8 228,5
39,5
4,8
8,6
2,0
5,9
9 197,2
51,2
7,0
9,8
2,4
7,7
10 210,5
134,6
4,9
6,7
1,4
4,9
Média 213,1
82,7
6,3
8,4
2,2
4,3
DP 18,3
39,7
1,3
1,6
0,4
2,3
Q1 197,2
52,4
5,1
7,4
2,0
3,0
Q3 228,5
110,8
7,2
9,7
2,4
5,8
DJ 31,3
58,4
2,1
2,3
0,4
2,9
2/3DJ 46,9
87,6
3,2
3,5
0,6
4,3
Q1-3/2DJ 150,3
-35,2
2,0
3,9
1,4
-1,4
Q3+3/2DJ 275,4
198,3
10,4
13,2
3,0
10,1
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
162
APÊNDICE 7- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 235,52
154,04
5,6
13,0
2,5
6,4
2 237,47
136,84
9,3
11,7
3,3
4,7
3 200,72
168,69
7,0
17,7
3,2
5,8
4 168,65
50,45
6,5
11,1
2,5
0,0
5 245,68
55,94
11,9
8,2
3,1
3,1
6 184,68
125,86
11,3
7,3
3,3
0,0
7 250,10
49,35
6,3
11,6
2,1
3,7
8 246,99
207,49
7,0
8,3
2,8
1,4
9 248,15
74,61
6,8
12,0
3,1
0,6
10 243,87
135,74
9,9
16,3
3,5
7,8
Média 226,18
115,90
8,2
11,7
2,9
3,3
DP 29,95
55,35
2,2
3,4
0,4
2,8
Q1 209,42
60,61
6,6
9,0
2,6
0,8
Q3 246,66
149,74
9,7
12,8
3,2
5,5
DJ 37,24
89,13
3,2
3,8
0,7
4,8
2/3DJ 55,87
133,70
4,8
5,6
1,0
7,1
Q1-3/2DJ 153,55
-73,09
1,8
3,4
1,6
-6,4
Q3+3/2DJ 302,52
283,44
14,5 18,4 4,2
12,6
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
163
APÊNDICE 8- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 159,38
51,31 * 3,8
13,5
1,8
3,2
2 236,08
181,10
4,9
7,0
2,2
5,7
3 133,68
132,30
4,8
19,5 * 1,4
11,2 *
4 94,75
79,69 * 4,0
10,6
1,4
4,1
5 115,77
AI
6,5
7,7
1,6
2,2
6 150,04
156,87
4,9
9,7
1,7
6,4
7 119,28
140,26
5,0
10,5
1,4
6,1
8 211,55
144,76
5,1
9,8
2,4
3,3
9 158,21
149,95
5,8
10,2
2,0
5,7
10 171,84
166,91
5,8
12,9
2,1
6,6
Média 155,06
153,16
5,0
11,2
1,8
5,4
DP 43,47
16,66
0,8
3,5
0,4
2,5
Q1 122,88
142,51
4,8
9,8
1,5
3,5
Q3 168,73
161,89
5,58
12,31
2,08
6,32
DJ 45,85
19,38
0,77
2,54
0,62
2,82
2/3DJ 68,77
29,07
1,16
3,81
0,93
4,24
Q1-3/2DJ 54,11
113,44
3,65
5,96
0,54
-0,74
Q3+3/2DJ 237,49
190,96
6,73
16,12
3,01
10,55
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
AI= Amostra insuficiente
*= valores excluídos
164
APÊNDICE 9- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 141,86
76,58
6,13
6,0
1,0
1,5
2 202,60
160,33
5,96
3,8
1,0
1,3
3 206,49
117,76
6,55
11,0
0,0
1,6
4 248,93
67,23
4,72
11,8
0,0
5,4
5 184,69
143,37
9,19 * 14,3
1,3
8,1
6 203,38
60,66
6,09
12,1
0,0
3,0
7 183,91
83,15
4,26
11,8
0,0
5,2
8 282,00
71,04
4,12
12,8
0,0
6,8
9 97,87
110,15
9,04 * 3,7
1,0
0,0
10 110,34
46,47
6,53
9,9
0,8
4,1
Média 186,21
93,68
6,26
9,7
0,5
3,7
DP 57,37
37,56
1,75
3,8
0,5
2,7
Q1 152,37
68,19
5,03
7,0
0,0
1,5
Q3 205,71
115,86
6,55
12,01
1,01
5,34
DJ 53,34
47,67
1,52
5,05
1,01
3,85
2/3DJ 80,01
71,51
2,28
7,58
1,52
5,78
Q1-3/2DJ 72,36
-3,32
2,75
-0,62
-1,52
-4,30
Q3+3/2DJ 285,73
187,37
8,82
19,58
2,54
11,12
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
165
APÊNDICE 10- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos tratados
com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 77,41
119,93
5,20
6,91
1,72
0,57
2 162,97
254,33
5,25
6,42
2,36
0,00
3 65,11
119,08
4,73
7,83
0,97
1,46
4 †
†
†
†
†
†
5 274,56 * 104,29
5,01
8,31
1,94
0,00
6 142,26
119,51
5,22
9,28
2,62
0,00
7 72,64
76,73
3,47
10,40
1,20
1,69
8 90,88
198,12
3,39
7,96
2,51
1,46
9 46,43
210,37
2,83
8,26
1,22
4,52 *
10 101,59
160,08
3,31
10,63
1,81
5,86 *
Média 94,91
151,38
4,27
8,44
1,82
1,73
DP 39,60
58,28
1,00
1,43
0,60
2,10
Q1 70,75
119,08
3,39
7,83
1,22
0,00
Q3 111,76
198,12
5,20
9,28
2,36
1,69
DJ 41,00
79,03
1,82
1,45
1,14
1,69
2/3DJ 61,50
118,55
2,73
2,18
1,71
2,54
Q1-3/2DJ 9,25
0,54
0,66
5,65
-0,49
-2,54
Q3+3/2DJ 173,26
316,66
7,93
11,46
4,08
4,23
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
166
APÊNDICE 11- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 185,0
49,0
1,8
7,19
10,32
1,78
5,79
2 206,6
73,1
2,7
6,71
6,56
1,30
5,98
3 191,8
46,1
2,6
7,48
8,05
1,46
6,02
4 190,1
44,6
1,6
7,87
10,78
0,38 * 6,65
5 217,6
46,1
1,2
7,43
8,74
0,10 * 7,11
6 195,2
35,8
1,7
6,66
9,08
1,53
3,88
7 195,6
44,2
5,5 * 6,98
7,39
1,76
5,90
8 218,4
66,9
1,0
8,68 * 9,05
2,35
7,07
9 216,7
145,6 * 0,9
7,13
6,53
1,76
4,78
10 217,6
33,2
2,0
6,97
9,06
1,82
6,95
Média 203,4
48,8
1,7
7,31
8,56
1,42
6,01
DP 13,3
13,2
0,7
0,60
1,44
0,69
1,04
Q1 192,6
44,2
1,2
6,98
7,55
1,34
5,82
Q3 217,3
49,0
2,0
7,47
9,07
1,78
6,87
DJ 24,7
4,8
0,9
0,49
1,52
0,44
1,06
2/3DJ 37,1
7,1
1,3
0,74
2,28
0,65
1,59
Q1-3/2DJ 155,5
37,1
-0,2
6,23
5,27
0,69
4,23
Q3+3/2DJ 254,4
56,1
3,4
8,21
11,35
2,43
8,46
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
167
APÊNDICE 12- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 209,3
133,2
1,3
9,83
17,01
0,00
9,89 *
2 208,4
121,5
1,3
9,03
15,58
1,15
8,37
3 186,6
95,1
1,3
9,95
15,34
1,51
7,90
4 192,5
128,1
1,6
10,16
17,04
0,52
5,99 *
5 190,9
90,7
0,6
8,43
16,80
1,47
7,97
6 215,6
88,5
3,7
8,69
15,99
2,05
9,03
7 196,4
49,7
1,8
7,86
17,13
0,54
7,77
8 151,5 * 85,2
2,7
9,42
18,09
1,55
7,51
9 196,4
65,5
4,5
9,77
17,04
1,00
8,04
10 AE
109,4
2,5
AE
16,21
AE
8,70
Média 199,5
96,7
2,1
9,24
16,62
1,09
8,12
DP 10,3
26,9
1,2
0,79
0,83
0,64
1,03
Q1 192,1
86,0
1,3
8,69
16,05
0,54
7,80
Q3 208,7
118,4
2,7
9,83
17,04
1,51
8,61
DJ 16,5
32,4
1,4
1,13
0,99
0,98
0,81
2/3DJ 24,8
48,6
2,0
1,70
1,48
1,46
1,22
Q1-3/2DJ 167,3
37,5
-0,7
6,99
14,56
-0,93
6,59
Q3+3/2DJ 233,5
167,0
4,7
11,53 18,52 2,98
9,83
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
AE= Amostra extraviada
*= valores excluídos
168
APÊNDICE 13- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemi
a TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 220,51
79,35
21,5
10,89 * 17,88
1,67
11,01
2 232,19
65,16
4,9
8,28
12,51
1,03
9,50
3 211,16
49,24
13
6,58
12,85
2,39
7,51
4 203,77
32,28
2,2
6,70
12,97
1,78
7,97
5 210,39
29,86
5,6
6,97
13,58
1,51
7,97
6 190,14
66,54
14,5
7,14
17,82
0,89
8,96
7 210,78
53,74
9,3
6,98
18,06
2,52
6,98
8 252,44
47,16
9,4
7,04
12,58
2,28
6,58
9 †
†
†
†
†
†
†
10 †
†
†
†
†
†
†
11 190,92
50,28
6,2
6,12
13,97
2,21
10,62
12 222,46
81,08
14,2
6,89
16,85
2,23
9,56
13 194,03
103,92
5,5
8,14
18,07
1,60
8,50
14 199,48
94,23
3,0
8,51
15,62
1,73
9,70
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 211,52
62,74
9,11
7,52
15,23
1,82
8,74
DP 18,33
23,34
5,72
1,29
2,37
0,52
1,40
Q1 198,12
48,72
5,35
6,84
12,94
1,58
7,85
Q3 221,00
79,78
13,30
8,17
17,84
2,24
9,59
DJ 22,87
31,06
7,95
1,33
4,89
0,66
1,74
2/3DJ 34,31
46,59
11,93
1,99
7,34
0,99
2,61
Q1-3/2DJ 163,81
2,13
-6,58
4,85
5,60
0,59
5,24
Q3+3/2D
J 255,31
126,37
25,23
10,17
25,18
3,23
12,20
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
169
APÊNDICE 14- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 220,51 * 79,00
27,7
5,80
13,83
1,45
5,90
2 170,28
53,04
18,6
5,74
14,41
0,82
6,12
3 189,75
52,01
14
8,03
16,52
1,25
7,77
4 183,52
59,62
17,8
6,41
13,28
1,17
5,70
5 †
†
†
†
†
†
†
6 183,13
59,62
9,9
8,14
16,32
1,49
8,70
7 160,55
74,50
21,4
9,27
19,40
1,16
11,21
8 176,12
AE
11,8
7,11
AE
1,62
AE
9 175,34
AE
18,6
7,15
AE
2,47 * AE
10 212,72
AE
22,1
10,42
AE
1,77
AE
11 187,80
AE
24,8
11,27
AE
0,10 * AE
12 193,64
AE
36,0
10,91
AE
1,13
AE
13 153,93
AE
34,4
8,36
AE
0,96
AE
14 †
†
†
†
†
†
†
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 180,62
62,97
21,43
8,22
15,63
1,28
7,57
DP 16,19
11,24
8,21
1,91
2,27
0,57
2,14
Q1 172,81
54,69
16,85
6,94
13,98
1,09
5,95
Q3 188,78
70,78
25,53
9,56
16,47
1,52
8,47
DJ 15,96
16,09
8,68
2,62
2,50
0,44
2,51
2/3DJ 23,95
24,14
13,01
3,93
3,74
0,66
3,77
Q1-3/2DJ 148,87
30,55
3,84
3,01
10,23
0,43
2,18
Q3+3/2DJ 212,72
94,92
38,54
13,49
20,22
2,18
12,24
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
AE= Amostra extraviada
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
170
APÊNDICE 15- Valores de TBARS, TEAC, DPPH, e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemi
a TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 116,35
30,33
54,6
10,0
15,3
2,1
8,8
2 222,51
43,43
24,4
9,0
14,5
2,1
10,4
3 †
†
†
†
†
†
†
4 †
†
†
†
†
†
†
5 †
†
†
†
†
†
†
6 †
†
†
†
†
†
†
7 †
†
†
†
†
†
†
8 †
†
†
†
†
†
†
9 †
†
†
†
†
†
†
10 †
†
†
†
†
†
†
11 121,85
40,48
57,0
9,6
14,3
1,7
8,2
12 †
†
†
†
†
†
†
13 †
†
†
†
†
†
†
14 †
†
†
†
†
†
†
15 †
†
†
†
†
†
†
Média 153,57
38,08
45,33
9,5
14,7
1,9
9,1
DP 59,76
6,87
18,17
0,5
0,5
0,2
1,1
Q1 119,10
35,40
39,50
9,3
14,4
1,9
8,5
Q3 172,18
41,96
55,80
9,83
14,90
2,06
9,59
DJ 53,08
6,55
16,30
0,54
0,47
0,18
1,06
2/3DJ 79,62
9,83
24,45
0,80
0,70
0,28
1,59
Q1-3/2DJ 39,49
25,58
15,05
8,49
13,73
1,60
6,94
Q3+3/2D
J 251,80
51,78
80,25
10,63
15,60
2,34
11,18
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
171
APÊNDICE 16- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 208,9
136,8
8,33
8,14
2,32
6,65
2 236,7
14,9 * 7,01
1,01 * 2,72
7,88
3 196,8
142,7
4,68
1,53 * 1,90
3,18
4 211,3
165,0
5,53
12,42
1,99
7,71
5 208,5
132,8
8,48
10,13
2,47
4,07
6 144,8
149,3
5,84
9,72
3,83 * 5,82
7 164,4
165,4
5,58
10,19
2,05
4,78
8 196,8
184,1
13,40 * 10,88
3,08
5,40
9 222,2
143,4
9,13
7,79
2,53
4,31
10 173,3
181,9
5,48
11,57
2,64
6,10
Média 196,4
155,7
7,35
8,34
2,55
5,59
DP 28,0
19,1
2,61
3,98
0,58
1,55
Q1 179,2
142,7
5,54
7,88
2,12
4,43
Q3 210,7
165,4
8,44
10,71
2,70
6,51
DJ 31,5
22,7
2,90
2,83
0,58
2,08
2/3DJ 47,2
34,0
4,35
4,24
0,87
3,12
Q1-3/2DJ 132,0
108,7
1,19
3,64
1,24
1,30
Q3+3/2DJ 257,9
199,4
12,79
14,95
3,57
9,63
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
†= camundongo falecido
*= valores excluídos
172
APÊNDICE 17- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 242,3
83,4
4,86
18,38
2,97
7,31
2 244,3
192,8
4,71
11,30
2,76
3,51
3 237,6
132,6
4,01
14,09
2,53
6,98
4 220,1
109,8
5,91
19,01
2,62
8,43
5 233,7
194,7
7,04
18,45
2,81
8,76
6 221,7
56,9
5,94
14,21
2,20
5,92
7 231,4
77,3
9,65
17,40
2,32
6,85
8 232,6
191,8
6,01
7,39
2,70
1,16 *
9 232,2
78,0
6,92
16,08
3,08
4,86
10 182,7 * 137,5
6,39
10,18
2,12
6,05
Média 232,9
125,5
6,15
14,65
2,61
5,98
DP 8,2
53,0
1,57
3,96
0,32
2,31
Q1 231,4
79,3
5,12
11,99
2,37
5,13
Q3 237,6
178,2
6,79
18,13
2,80
7,23
DJ 6,2
98,9
1,67
6,14
0,43
2,10
2/3DJ 9,3
148,4
2,50
9,21
0,65
3,15
Q1-3/2DJ 222,1
-69,1
2,62
2,79
1,72
1,98
Q3+3/2DJ 247,0
326,6
9,30
27,34
3,44
10,38
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
173
APÊNDICE 18- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 229,85
53,39
7,50
10,46
2,41
8,86
2 222,46
92,50
9,43
14,06
2,75
7,04
3 231,02
143,72
8,88
12,19
2,87
6,78
4 193,64
157,22
6,40
9,60
2,28
5,51
5 271,90
131,95
5,95
12,12
2,46
6,76
6 176,90
135,07
4,03
11,52
2,21
10,00
7 218,56
81,08
5,41
16,95
2,07
6,98
8 197,54
67,93
4,50
18,70
1,93
8,63
9 90,86 * 32,28
4,79
16,21
1,16 * 5,65
10 111,49
66,20
5,47
12,47
1,41
9,60
Média 205,93
96,13
6,23
13,43
2,15
7,58
DP 44,68
42,99
1,83
2,97
0,54
1,59
Q1 193,64
66,63
4,95
11,67
1,96
6,76
Q3 229,85
134,29
7,22
15,67
2,45
8,80
DJ 36,21
67,66
2,28
4,00
0,49
2,04
2/3DJ 54,31
101,49
3,42
6,00
0,73
3,06
Q1-3/2DJ 139,33
-34,86
1,53
5,68
1,23
3,71
Q3+3/2DJ 284,17
235,78
10,64
21,67
3,18
11,85
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
174
APÊNDICE 19- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 187,32
82,12
5,64
8,46
1,62
1,89
2 157,26
105,30
5,47
14,85
2,36
6,52
3 285,56
166,56
9,42
7,82
2,74
2,51
4 57,55
152,72
5,06
11,22
0,20
4,68
5 325,15
90,08
5,82
8,49
0,19
2,48
6 287,02
138,18
4,25
8,74
0,00
0,87
7 276,03
128,15
10,40
13,94
0,72
7,44
8 135,75
141,30
2,16
10,09
1,34
4,48
9 305,35
134,38
8,30
10,87
1,46
5,47
10 292,16
159,29
6,25
12,90
0,00
1,69
Média 230,91
129,81
6,28
10,74
1,06
3,80
DP 89,92
28,72
2,47
2,48
1,00
2,23
Q1 164,77
111,01
5,17
8,55
0,19
2,04
Q3 290,87
149,86
7,79
12,48
1,58
5,27
DJ 126,10
38,85
2,62
3,93
1,39
3,24
2/3DJ 189,15
58,27
3,93
5,89
2,08
4,86
Q1-3/2DJ -24,38
52,74
1,24
2,66
-1,89
-2,82
Q3+3/2DJ 480,02
208,14
11,72
18,37
3,66
10,13
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
175
APÊNDICE 20- Valores de TBARS, TEAC, DPPH e Parasitemia para camundongos não
tratados com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei
TBARS TEAC DPPH
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 66,56
76,82
2,77
8,29
0,74
0,00 *
2 155,06
93,73
4,00
10,02
1,81
5,34
3 243,04
185,44
4,04
15,43
1,63
6,25
4 151,39
171,91
4,66
14,02
1,96
5,90
5 35,29
82,64
5,41
9,24
1,09
0,00 *
6 10,24
54,00
4,00
10,99
1,31
3,73
7 152,13
64,14
5,23
12,59
2,09
4,02
8 46,43
78,51
5,87
12,58
1,96
4,55
9 AE
194,22
AE
11,06
AE
5,50
10 90,73
53,90
6,11
11,70
2,03
5,37
Média 105,65
105,53
4,68
11,59
1,63
4,07
DP 74,90
55,69
1,08
2,17
0,47
2,28
Q1 46,43
67,31
4,00
10,26
1,31
3,80
Q3 152,13
152,37
5,41
12,59
1,96
5,47
DJ 105,69
85,05
1,41
2,33
0,64
1,67
2/3DJ 158,54
127,58
2,11
3,49
0,97
2,50
Q1-3/2DJ -112,10
-60,27
1,88
6,77
0,35
1,30
Q3+3/2DJ 310,66
279,95
7,52
16,09
2,93
7,97
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= j-ésimo decil
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= valores excluídos
176
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