UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Programa de Pós-graduação em Patologia
Wanúzia Keyla Miranda
ESTUDO QUANTITATIVO DAS CÉLULAS DE LANGERHANS
NO CARCINOMA ESCAMOCELULAR IN SITU DO COLO
UTERINO – ANÁLISE MORFOMÉTRICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA
Recife 2006
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II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Programa de Pós-graduação em Patologia
Wanúzia Keyla Miranda
ESTUDO QUANTITATIVO DAS CÉLULAS DE LANGERHANS
NO CARCINOMA ESCAMOCELULAR IN SITU DO COLO
UTERINO – ANÁLISE MORFOMÉTRICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA
Orientadora
Profª. Drª. Maria do Carmo Abreu e Lima
Recife 2006
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia do Departamento de Patologia – CCS/UFPE como requisito para obtenção do grau de Mestre em Patologia Área de concentração: Patologia Geral
III
Wanúzia Keyla Miranda
ESTUDO QUANTITATIVO DAS CÉLULAS DE LANGERHANS
NO CARCINOMA ESCAMOCELULAR IN SITU DO COLO
UTERINO – ANÁLISE MORFOMÉTRICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA
Orientadora
Profª. Drª. Maria do Carmo Abreu e Lima
Apresentada em: 12/04/2006
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Nicodemos Telles de Pontes Filho
Presidente
Profª. Drª. Sílvia Regina Arruda de Moraes
Membro
Prof. Dr. Artur Lício Rocha Bezerra
Membro
IV
Epígrafe
Não se contente em trilhar
um caminho estabelecido.
Ao contrário, vá para onde
não há caminho algum,
e deixe seu rastro.
Muriel Strode
V
Dedicatória
A Deus, dedico este trabalho científico, como
reconhecimento de Sua Soberania sobre mim e
como forma de agradecê-Lo por tudo e todos
que pôs propositalmente em meu caminho,
trançando com fios tênues a rede que deu
sustentação a esta pesquisa.
VI
Agradecimentos
Pensei!
Pensei muito a quem devo gratidão por este trabalho!
Decidi que não devo agradecer, mas convidar a todos
como autores, já que é autor todo aquele de contribui de
forma decisiva para a consecução da obra.
Dessa forma, gostaria que se reconhecessem como
autores:
Minha mãe, Maria Ivete Miranda, pelas aflições e pelas orações a cada
viagem para o Recife;
Meus filhos, Roberto Miranda Moreira Segundo e Renata Miranda Moreira,
pelas inúmeras contas de subtração de convívio, que tiveram que
aprender durante todo o tempo que durou a preparação desta
pesquisa.
Dr. Raimundo Sales Filho, que de imediato estimulou-me a prosseguir, ao ver
traçado o tema que abordei neste trabalho.
Roberto Miranda, o amigo que me apoiou, por tantas vezes em que precisei,
nas idas e vindas a Recife, sempre perto nos momentos exaustivos.
Drª Maria do Carmo Abreu e Lima, a grande mestra, que dedicou sua mão
direita para guiar-me num caminho, inicialmente muito escuro... Sou-lhe
grata, ainda, pela documentação fotográfica deste trabalho.
Dr. Adonis de Carvalho, autor de tantas obras e ajudador de tantas vidas, por
dar-me o que de mais precioso alguém pode receber de outrem – o
saber prazeroso e compartilhado.
Drª. Terezinha Tenório, pela presteza em me ouvir e me ajudar nos passos que
levaram ao meu objetivo.
Dr. Luciano Montenegro, que aceitou o desafio de compartilhar o saber da
imuno-histoquímica no estudo das células de Langerhans.
Drª. Alana Brandão, por ter viabilizado toda a parte prática deste trabalho e,
mais que isso, mostrou-me que o serviço público pode exercer seu
VII
papel último que é servir à coletividade, quando é chefiado por pessoa
com a visão de futuro e de bem-estar.
Drª. Laís Guimarães Vieira, pela luz da amizade que, sem limites de tempo,
transpôs o técnico e ensinou-me a mesclar fortaleza com doçura e
respeito.
Dr. Élson Soares, estatístico, que, nas horas mais inconvenientes, não exitou em
me receber e auxiliar na compreensão dos testes estatísticos.
Dr. Camilo Flamarion, meu cunhado, pela disposição em me ajudar quando
precisei de suas orientações.
Dr. Tarso S. Pereira, que, de modo extremamente prestativo, nos cedeu a
grade morfométrica de Weibel para a execução deste trabalho.
Drª. Vera Andrade de Melo, minha amiga e sócia, por manejar o volume de
trabalho de modo a me proporcionar mais tempo para a execução
dessa pesquisa.
Dr. Alisson Kenedy de Souza, pela atenção dedicada a cada chamado para
melhor entendimento das análises estatísticas.
VIII
RESUMO
Objetivo: Verificar a densidade de células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ do colo do útero em relação ao epitélio escamoso normal. Pacientes e Métodos: Por estudo prospectivo, observacional, tipo caso controle, foram selecionadas 36 espécimes de colo uterino, obtidos por biópsias ou por histerectomia, de mulheres com vida sexual ativa, não gestantes, na faixa etária de 20 a 40 anos, provenientes do Centro de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, no período de janeiro a dezembro de 2003, separadas em dois grupos equivalentes quanto à idade: grupo caso, correspondente a 18 lesões diagnosticadas como carcinoma escamocelular in situ, e grupo controle, formado por 18, com epitélio escamoso histologicamente normal. As preparações histológicas foram submetidas ao exame imuno-histoquímico com anticorpo anti-proteína S-100 (DAKO) e quantificação das células de Langerhans utlizando grade de Weibel, em 10 campos de 400X. Foi calculada a densidade de CL/mm2 considerando a área ocupada pelo epitélio escamoso, para cada campo examinado. Utilizou-se o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 13.0 e os testes t de Student e χ2, ao nível de significância de 0,05. Resultados: Houve diferença significante da densidade média de CL entre o grupo caso e o grupo controle (12,79 ± 5,48 células/mm2 e 2,44 ± 0,79 células/mm2 respectivamente; p < 0,001). Observou-se distribuição topográfica difusa no grupo caso e predominando nas camadas basal e para-basal, no grupo controle. Conclusão: Houve aumento significante da densidade de CL no carcinoma escamocelular in situ do colo uterino, com distribuição difusa por entre as células escamosas neoplásicas, consistente com a ativação da resposta imune celular.
Palavras-chave: Neoplasias do colo uterino. Imunologia, Células de Langerhans / análise morfométrica
IX
ABSTRACT
Objective: To compare the density of Langerhans cells in situ squamous cell carcinoma of uterus cervix with cervix histologically normal. Patients and Methods: According to a prospective, observational case-control study, 36 uterus cervix samples, obtained by biopsy or hysterectomy, of sexually active women, no pregnant, aging from 20 to 40 years old, attempted at Cancer Diagnostic Centre from Paraiba, Brazil, from January to December 2003, were analyzed. Samples were separated into two groups, equivalent by age: case group corresponding to 18 lesions diagnosed as in situ squamous cell carcinoma, and control group including 18 samples from histologically normal cervix. Samples were submitted to immuno histochemistry exam with the immuno marker S-100 (DAKO) and morphometric analysis on Weibel grade, in 10 high power fields. Langerhans cells density was calculated considering the area occupied by squamous epithelium, for each field examined. Data were organized with Statistical Package for Social Sciences (SPSS), version 13.0. Statistical tests were t Student and Chi squared, both at significance level of 0,05. Results: There was significant difference on mean density of Langerhans cells between case and control group (12.79 ± 5.48 cells/mm2 e 2.44 ± 0.79 cells/mm2, respectively; p < 0,001). Langerhans cells topographic distribution was diffuse on case group and predominantly basal and para-basal on control group. Conclusion: There was a significant increase of Langerhans cells in in situ squamous cell carcinoma, diffusely spread between the squamous neoplasic cells, consistent with cellular immune response activation.
Key-words: Uterus cervix neoplasia. Immunology, Langerhans cells/ morphometric analysis
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans segundo grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003 .................................................................................................................................... 58
Tabela 2 - Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso e controle, segundo faixas etárias – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003..................................................................... 65
Lista de Gráficos
Gráfico 1 – Distribuição das faixas etária por grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003................................................................................. 57
Gráfico 2 – Dispersão da densidade de células de Langerhans segundo idade de 18 casos (NIC 3) -– Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003....... 59
Gráfico 3 – Dispersão da densidade de células de Langerhans segundo idade de 18 controles (epitélio escamoso normal) -– Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003...................................................................................................... 59
Lista de Figuras
Figura 1 – Diagrama de seleção das amostras........................................................................... 38 Figura 2 – Desenho a mão livre da área do epitélio escamoso em 10 campos ópticos de 400X,
para contagem de células de Langerhans .......................................................................... 52
XI
Lista de Fotos
Foto 1 – Epitélio escamoso do colo uterino, histologicamente normal, marcado com anticorpo anti-proteína S-100 (100X).................................................................................................. 26
Foto 2 – Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 100X) ..................................................... 39 Foto 3 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 400X) ...................................................... 40 Foto 4 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 25 X)
............................................................................................................................................ 40 Foto 5 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE,
100X) .................................................................................................................................. 41 Foto 6 – Corte de linfonodo histologicamente normal, empregado como controle de qualidade de
imuno-marcação por anticorpo anti-proteína S-100 (à esquerda – 100X, à direita – 400X) 46 Foto 7 - Corte de linfonodo histologicamente normal, empregado como controle de qualidade de
imuno-marcação por anticorpo anti-proteína S-100 (400x) ................................................. 46 Foto 8 – Grade de Weibel, com 10 mm de lado.......................................................................... 49 Foto 9 - Lâmina com escala micrométrica (seta), medindo 1 mm, dividida em 100 partes (0,01
mm)..................................................................................................................................... 49 Foto 10 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (400x)............................................................................................................................... 60 Foto 11 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (1000x) ............................................................................................................................. 60 Foto 12 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (1000x) ............................................................................................................................. 61 Foto 13 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (1000x) ............................................................................................................................. 61 Foto 14 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (1000x) ............................................................................................................................. 62 Foto 15 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (1000x) ............................................................................................................................. 62 Foto 16 – – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in
situ/NIC 3 (1000x) ............................................................................................................... 63 Foto 17 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio escamoso normal (1000X) 63 Foto 18 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio ecamoso normal (100X) .... 66 Foto 19 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3 (100x)............................................................................................................................... 66 Foto 20 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC
3, extensivo às criptas glandulares (100x) .......................................................................... 66
XII
Lista de Siglas e Abreviaturas
AIDS – Síndrome de imunodeficiência adquirida (Acquired immune
defficiency syndrome)
APC – Célula apresentadora de antígeno (Antigen Presenting Cell)
CDC – Centro de Controle de Doenças (Center for Disease Control &
Prevention)
CL – células de Langerhans
HPV – Papiloma Virus Humano
IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (International
Agency for Research on Câncer)
IgG – Imunoglobulina G
IL – Interleucina
LT – Linfócitos T
MHC – Moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (Major
histocompatibility Complex)
NIC 3 – neoplasia intraepitelial cervical grau 3 / carcinoma
escamocelular in situ
NK – linfótico NK (Natural Killer)
OCE – Orifício cervical externa
TNF – Fator de necrose tumoral (tumoral necrosis factor)
XIII
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................................................VIII ABSTRACT ............................................................................................................................ IX Lista de Tabelas .................................................................................................................X Lista de Gráficos ...............................................................................................................X Lista de Figuras...................................................................................................................X Lista de Fotos .....................................................................................................................XI Lista de Siglas e Abreviaturas....................................................................................XII
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 15 2 OBJETIVOS........................................................................................................................ 17 2.1 Geral ............................................................................................................................... 17 2.2 Específicos ..................................................................................................................... 17
3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................... 18 3.1 Células de Langerhans ................................................................................................... 18 3.2 Células de Langerhans e Papilomavírus humano........................................................... 24 3.3 Células de Langerhans e câncer de colo uterino............................................................ 31
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................... 35 4.1 Tipo de estudo ................................................................................................................ 35 4.2 Local e População de estudo.......................................................................................... 35 4.3 Material e seleção das amostras .................................................................................... 36 4.4 Tamanho amostral .......................................................................................................... 41 4.5 Variáveis e conceitos...................................................................................................... 43 4.5.1 Variável independente............................................................................................. 43 4.5.2 Variáveis dependentes............................................................................................. 43
4.6 Métodos.......................................................................................................................... 44 4.6.1 Recortes dos blocos de parafina .............................................................................. 44 4.6.2 Exame imuno-histoquímico ...................................................................................... 45 4.6.3 Análise morfométrica................................................................................................ 48 4.6.3.1 Seleção dos campos para análise quantitativa:............................................... 50 4.6.3.2 Determinação da área ocupada pelo epitélio escamoso (mm2) em ambos os
grupos.............................................................................................................. 51 4.6.3.3 Determinação da densidade de células de Langerhans por mm2.................... 53 4.6.3.4 Fórmulas utilizadas para cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso e
para a densidade das células de Langerhans por mm2 ................................... 55 4.7 Processamento e análise dos dados .............................................................................. 56 4.8 Aspectos éticos............................................................................................................... 56
5 RESULTADOS.................................................................................................................... 57 5.1 Densidade de células de Langerhans............................................................................. 58 5.2 Densidade de células de Langerhans dos grupos segundo faixas etárias ..................... 64 5.3 Distribuição das células de Langerhans no epitélio escamoso segundo grupos ............ 65
6 DISCUSSÃO....................................................................................................................... 67 7 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 74
XIV
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................... 75 9 APÊNDICES ....................................................................................................................... 81 9.1 Apêndice 1 - Protocolo experimental .............................................................................. 81 9.2 Apêndice 2 – Aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba........................................................... 83
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
15
1 INTRODUÇÃO
O Papiloma vírus humano tem sido confirmado pela
International Agency for Research on Cancer (IARC) como agente
responsável pelas lesões intraepiteliais e câncer do colo uterino,
estando presente em 99,7% dos cânceres cervicais (PEREYRA;
PARELLADA, 2003). A resposta imune celular do hospedeiro é um fator
importante no controle dessas infecções (WIELAND; PFISTER, 1999).
O carcinoma cervical é um dos grandes problemas de
saúde pública com relatos de 500.000 novos casos anualmente. É
doença neoplásica mais comum entre mulheres nos países pouco
desenvolvidos (NICOL; FERNANDES; BONECINI-ALMEIDA, 2005). No Brasil,
para 2006, são estimados 19,270 casos novos, dos quais 4.414 ocorrendo
na Região Nordeste e 160 casos no estado da Paraíba (BRASIL, 2005). A
mortalidade por câncer de colo de útero, em 2003, igualou-se a 4.202
casos no Brasil, sendo 1.087 na Região Nordeste e 47, no estado da
Paraíba (BRASIL, 2005).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
16
O Center for Disease Control & Prevention (CDC) passou a
considerar, a partir de 1993, o câncer de colo uterino como uma
manifestação maior da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, por
ser uma forma de expressão do déficit da imunidade celular, com
redução dos linfócitos T CD4 (JACYNTHO, 2001).
Dentre as células do sistema imune, as células de
Langerhans são apresentadoras de antígeno profissionais (APC),
iniciadoras do reconhecimento imune. Capturam e transportam
antígenos aos linfonodos, onde os apresentam aos linfócitos para que
sejam reconhecidos (MALE, 1988).
O número, a distribuição e a morfologia das células de
Langerhans estão alterados nas infecções por HPV e nas lesões pré-
neoplásicas da cérvice uterina (HUBERT et al., 2005).
O conhecimento do comportamento imunológico celular
do colo do útero frente às lesões intraepiteliais induzidas pelo HPV não
acompanhou os avanços de diagnóstico dessas lesões.
Entender que o preenchimento desta lacuna pode
propiciar novas estratégias para prevenção e tratamento dessas lesões
e para o seguimento das portadoras, possibilitando modificar um
quadro de incidência e de mortalidade por câncer de colo do útero,
serviu de estímulo para a escolha do tema.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
17
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Verificar a densidade de células de Langerhans no
carcinoma escamocelular in situ do colo do útero em relação ao
epitélio escamoso normal.
2.2 Específicos
� Caracterizar as portadoras de carcinoma escamocelular in situ e
de epitélio escamoso normal da cérvix uterina quanto à idade.
� Comparar a densidade de células de Langerhans no carcinoma
escamocelular in situ da cérvix uterina em relação ao epitélio
escamoso normal.
� Comparar a distribuição topográfica de células de Langerhans no
carcinoma escamocelular in situ da cérvix uterina em relação ao
epitélio escamoso normal..
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
18
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Células de Langerhans
As células de Langerhans foram assim denominadas em
homenagem a Paul Langerhans que as descreveu em 1868 pensando
tratar-se de uma célula nervosa receptora (DARVISHIAN et al., 2002)
Hoje as células de Langerhans são consideradas células apresentadoras
de antígenos, derivadas de precursores monócitos-macrófagos da
medula óssea. Representam 4% a 5% das células da epiderme (PEREIRA,
1999).
A célula CD34, derivada da medula óssea, é a precursora
de dois tipos celulares dendríticos imaturos: as células de Langerhans, de
distribuição epitelial, e as células dendríticas intersticiais. A geração
destes dois tipos celulares é conseqüente à participação de citocinas
(CORONATO et al., 1998).
As células de Langerhans no epitélio diferem das células
dendríticas presentes no estroma pela expressão de altos níveis de
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
19
receptores para a proteína E-caderina, a qual viabiliza sua adesão e
distribuição por entre os queratinócitos (DINIZ-FREITAS et al., 2005).
As células imaturas podem ser identificadas pelos seus
dendritos (em média de 12), que aumentam a superfície
imunologicamente reativa, e marcadores de superfície envolvidos na
apresentação de antígenos, que as tornam capazes de capturá-los e
apresentá-los aos linfócitos T (UCHIMURA, 2002). Essas células compõem
a imunidade inata e adaptativa (KATOU et al., 2000). São denominadas
células apresentadoras de antígeno profissionais (Antigen presenting
cell - APC), dada sua habilidade de não só apresentar antígenos aos
linfócitos T, mas promover sinais co-estimuladores para a ativação
desses linfócitos, sem os quais estes não se tornam efetores da
imunidade, tanto celular como humoral (ABBAS; LICHTMAN; POBER,
2003).
Os precursores das células de Langerhans migram da derme
para a epiderme em resposta à proteína MIP-3α, secretada por
macrófagos, bem como ao fator de necrose tumoral (TGF α), liberado
por queratinócitos (NICOL; FERNANDES; BONECINI-ALMEIDA, 2005;
PARDO-GOVES et al., 2005).
As características morfológicas e ultra-estruturais das células
de Langerhans puderam ser visualizadas, respectivamente, ao
microscópico óptico e à microscopia eletrônica, após coloração com
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
20
iodeto de zinco – tetróxido de ósmio, usada originalmente para corar
fibras nervosas (DARVISHIAN et al., 2002). Podem também ser
identificadas por métodos imuno-histoquímicos, dirigidos para
receptores e antígenos de superfície da membrana citoplasmática
(FADARE et al., 2005), dentre os quais está o S-100, que integra um grupo
de proteínas de superfície, vinculadas ao cálcio e relacionadas à
progressão, diferenciação e citotoxicidade do ciclo celular. Apenas um
terço das células de Langerhans é S-100 positivo.
A proteína S-100 reage bem como imunomarcador de
superfície, na identificação das células de Langerhans nos tecidos,
ainda que estes estejam congelados ou fixados em parafina, não
sofrendo alterações diante da presença de infiltrado inflamatório
(FADARE et al., 2005).
As células de Langerhans medem de 15 µm a 20 µm, no
maior diâmetro; apresentam núcleo vesicular, lobulado ou indentado
longitudinalmente, ribossomos livres, retículo endoplasmático rugoso,
mitocôndrias, complexo de Golgi, lisossomos e grânulos de Birbeck
(DARVISHIAN et al., 2002). Não têm desmossomos que as interliguem a
outras células (DINIZ-FREITAS et al., 2005).
Os grânulos de Birbeck são morfologicamente semelhantes
a raquetes e provavelmente se originam de invaginações da
membrana celular. São característicos das células de Langerhans
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
21
(NYLANDER et al., 1992). Apesar da função desses grânulos não estar
ainda bem identificada, acredita-se que constituem um compartimento
de reciclagem, provavelmente envolvido no processamento de
antígenos, que antecede sua apresentação aos linfócitos (MIZUMOTO;
TAKASHIMA, 2004).
Conforme sua localização no epitélio, os processos
dendríticos citoplasmáticos das células de Langerhans, variam em
número e disposição. (EDWARDS; MORRIS, 1995). Na camada basal,
apresentam um a dois dendritos, que podem se estender aos vasos do
estroma subepitelial, denotando transferência de informações
antigênicas para as células endoteliais. Na camada suprabasal, seu
citoplasma é escasso e os dendritos citoplasmáticos são numerosos,
distribuídos de forma difusa e arboriforme (KATOU et al., 2000).
Em condições normais, o número de células de Langerhans
é mantido homeostaticamente no epitélio com uma vida média de
nove dias (HUBERT et al., 2005).
Embora descobertas em 1868, as funções das células de
Langerhans estiveram desconhecidas até 1970, quando foram
descobertos certos receptores de superfície, que definem o modo
distinto com que elas reagem aos vários antígenos (DARVISHIAN et al.,
2002).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
22
Estão presentes em vários sítios do corpo: pele, timo,
linfonodos, endotélio e mucosas (oral, do tubo digestivo, do trato
respiratório, vaginal, retal e cervical), nos quais apresentam diferentes
formas e funções (NYLANDER et al., 1992).
Em órgãos não linfóides, periféricos, são imaturas, hábeis a
capturar e processar antígenos, o que as torna ativadas, resultando em
uma dramática mudança na superfície celular e nas características
funcionais e fenotípicas. Assim, um pequeno número de células ativadas
é suficiente para iniciar uma potente resposta imune (ABBAS; LICHTMAN;
POBER, 2003).
As células de Langerhans influenciam tanto o tipo quanto a
quantidade da resposta imune (CHAPEL, MISBOH; SNOWSOWN, 2003).
Iniciam tanto a imunidade inata como a adaptativa contra agentes
antigênicos, atuando como sentinelas do sistema imunológico (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2003).
A captura dos antígenos pelas células de Langerhans se faz
por fagocitose ou pinocitose (antígenos solúveis), pois apresentam
receptores que as capacitam a se ligar aos micróbios (UCHIMURA et al.,
2004).
A ativação das células de Langerhans, por meio de
componentes da superfície bacteriana, de citocinas inflamatórias (tais
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
23
como: TNFα, interleucina Iβ - IL-Iβ) e de eventos mediados por receptores
(BAKRI et al., 2001), faz com que super-expressem moléculas de
histocompatibilidade das classes I e II e moléculas co-estimulatórias
(como CD80 e CD86) e aumentem a secreção de citocinas, com o
objetivo de facilitar a apresentação e a sensibilização de linfócitos T
CD4 nativos e CD8 (CHAPEL; MISBOH; SNOWDOWN, 2003). Ativadas,
adquirem dendritos mais pronunciados e iniciam a expressão de outros
marcadores de superfície como o CD83, o qual as identifica como
maduras. Procedem também à super-expressão de receptores para E-
caderina, assim como das moléculas de CD1A e de langerin, uma
proteína envolvida no tráfego de partículas capturadas dos grânulos de
Birbeck para os receptores MHC classe II (RODRIGUES-SASTRE et al.,
2004).
Perdem então sua adesividade ao epitélio e migram para
fora dos tecidos periféricos (FAUSCH et al., 2002). Durante a migração,
as células maduras tornam-se capazes de apresentar os antígenos aos
linfócitos T e estimulá-los (PARDO-GOVES et al., 2005). As células de
Langerhans migram de uma região para outra em curto espaço de
tempo, facilitando a passagem da informação antigênica aos linfócitos
da pele e aos linfonodos (MIZUMOTO; TAKASHIMA, 2004).
Para uma ativação dos linfócitos T, a união destes com as
células de Langerhans deve ser estável e duradoura, alcançando o
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
24
limiar de sinalização necessário aos linfócitos. Esta estabilidade é dada
por moléculas de adesão situadas nas células T, cujos ligantes estão
expressos nas células de Langerhans, sendo o mais importante a
molécula denominada ICAM-I, da família das integrinas (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2003).
Também no epitélio escamoso do colo uterino, as células
de Langerhans estão distribuídas normalmente por entre as camadas
basais e suprabasais, respondendo por sua vigilância imunológica
(MALE, 1988).
3.2 Células de Langerhans e Papilomavírus humano
Pouco se sabe sobre os fatores que controlam o número,
distribuição e atividade funcional das células de Langerhans na
infecção pelo papilomavírus humano, todavia a densidade, a
distribuição e a morfologia dessas células alteram-se nas infecções por
HPV e nas lesões pré-neoplásicas (HERTEL et al., 2003)
Para que se compreendam os processos fisiológicos que
ocorrem no epitélio do colo uterino na infecção por papilomavirus
humano, é necessário o conhecimento de alguns de seus aspectos
histológicos.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
25
O colo uterino é revestido por epitélio escamoso, assim
denominado pelo modo com que estão dispostas as células que o
constituem. Histologicamente, divide-se em três zonas: zona basal,
germinativa, responsável pela renovação contínua do epitélio; zona
intermediária, também denominada estrato espinhoso, o qual constitui
a maior parte da sua espessura e zona superficial, formada pela
população de células mais maduras do epitélio com função de
proteger as camadas epiteliais abaixo e a vasculatura subepidérmica
contra traumas e infecções (FERENCZY WINCLE, 1987) (Foto 1).
A camada basal é formada por:
• células basais, com diâmetro médio de 10 µm, indiferenciadas,
têm núcleo arredondado, central, vesicular orientado
perpendicularmente em relação à lâmina basal e pequena
rima de citoplasma. Estas células ancoram o epitélio à
membrana basal por meio hemidesmossomos (DEMAY, 1996).
• células parabasais: assim denominadas devido a sua
topografia no epitélio, logo acima das células basais.
Apresentam–se mais largas (15 µm – 30 µm); o núcleo é
redondo, finamente granular. Ultraestruturalmente, possuem
pontes intercelulares e microvilos longos, fixados pelos
desmossomos (DEMAY, 1996).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
26
As células de Langerhans estão presentes na zona basal do
colo uterino (CONNOR et al., 1999) (Foto 1).
Foto 1 – Epitélio escamoso do colo uterino, histol ogicamente normal, marcado com anticorpo anti-proteína S-100 (100X) Observar a distribuição das células de Langerhans nas zonas histológicas predominando nas camadas basal e para-basal
A principal função das células que compõem a zona basal
está na regeneração do epitélio. Assim, possuem, em grande número,
receptores de superfície para o fator de crescimento epidérmico, os
quais são observados em quantidade decrescente à medida que o
epitélio escamoso se diferencia em direção a camada intermediária e
superficial (DEMAY, 1996). Estas células possuem receptores hormonais
no núcleo e são as únicas que normalmente se dividem e também
Zona superficial
Zona intermediária
camada para-basal
camada basal
Célula de Langerhans
Zona basal
Zona superficial
Zona intermediária
camada para-basal
camada basal
Célula de Langerhans
Zona basal
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
27
participam da produção da membrana basal (GROSS; BARRASSO,
1999).
O epitélio escamoso estratificado não queratinizado bem
como o epitélio colunar mucossecretor da cérvice contrapõem-se aos
agentes biológicos patogênicos, constituindo-se assim na primeira linha
de defesa da imunidade inata (imunidade inespecífica que não requer
contato prévio com o patógeno) (ABAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Integram esta barreira epitelial, células especializadas em concentrar o
antígeno, promovendo a interação deste com o sistema imune:
neutrófilos, linfócitos intraepiteliais, monócitos, macrófagos e células de
Langerhans (WRIGHT; KURMAN; FERENCZY, 2001).
A infecção por HPV leva a um efeito imunossupressivo
resultando em neoplasias, como conseqüência de alterações no
desempenho das células apresentadoras de antígeno, que expressam
proteína S-100, dentre as quais estão as células de Langerhans
(CONNOR et al., 1999), envolvidas nos primeiros degraus da resposta
imune primária em um grande número de neoplasias malignas epiteliais
(COX, 2003; EDWARDS; MORRIS, 1995).
Em todas as células apresentadoras de antígeno, algumas
proteínas envolvidas na apresentação do antígeno são moduladas por
infecção viral produtiva (KIRNBAUER et al., 1992).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
28
O vírus do papiloma humano adentra o epitélio escamoso,
através de micro-erosões, alcançando a camada basal, e Infectando a
célula escamosa, através da identificação com antígenos de superfície
(tropismo viral). Uma vez na célula, o genoma viral poderá ou não
integrar-se ao genoma do hospedeiro.(GROSS;BARRASSO, 1999)
A integração do genoma viral ao do hospedeiro se faz de
modo aleatório, o que permite que ocorra próxima a genes importantes
do hospedeiro, favorecendo a rápida transformação maligna celular.
Alterado o código genético, há modificações não só no fenótipo, mas
também nos antígenos de superfície (chamados antígenos tumorais), na
produção protéica celular, na produção de TNF α, GM-CSF, IL-I e
redução da E-caderina (MATTHEWS et al., 2003).
Como resposta inicial à infecção viral, as células de
Langerhans são mobilizadas e migram para os linfonodos locais,
reduzindo sua densidade no epitélio. Em aproximadamente cinco dias
após a infecção viral, a densidade destas células no local da infecção
volta ao normal. No entanto, se persistir a infecção, ocorre redução das
células de Langerhans mediada pelo vírus.
O mesmo fenômeno é observado na infecção pelo HIV,
contudo este vírus é capaz de infectar as células de Langerhans
exercendo influência direta no número e função destas na epiderme, o
que não é observado em relação ao HPV (VISCIDI; SHAH, 1992).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
29
Infectando a célula escamosa, o vírus lança mão de
mecanismos para evadir-se da imunidade celular, dentre os quais, a
latência viral. Mesmo após o genoma viral estar presente na célula
escamosa, o vírus não exerce sobre ela qualquer efeito citopático
(alteração da produção protéica podendo provocar lise e morte
celular). Desta forma, a expressão pelo MHC-I dos antígenos virais na
superfície das células infectadas estará parcial ou totalmente
comprometida, do que decorre a persistência viral. A imunidade celular
não é capaz de erradicar o vírus de modo que a infecção permanece
em baixos níveis, levando a uma adaptação da vigilância imunológica
celular à presença dos peptídeos virais na superfície das células
infectadas.
Outro mecanismo de escape viral às defesas imunológicas
são as possíveis variações antigênicas no vírus capazes de camuflá-lo
das células imunes. Esse fato pode explicar a persistência viral no
hospedeiro sem a ocorrência de lesões epiteliais, como também a
recorrência das lesões virais por longo período (RIETHDORF et al., 1996).
Aventou-se ainda a hipótese que o HPV pudesse interagir
com as células de Langerhans intraepiteliais, as quais não iniciariam
uma resposta imune contra o vírus (KIRNBAUER et al., 1992). Este fato foi
comprovado experimentalmente introduzindo-se partículas semelhantes
às virais (VLP – virus like particles), utilizadas nas vacinas para o HPV-16 e
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
30
baseadas nas proteínas L1 e L2. Observou-se que as células dendríticas
existentes no estroma assim como as células de Langerhans
internalizaram tais partículas, no entanto estas não foram ativadas,
mostrando-se inábeis para iniciar uma resposta específica contra o HPV,
mediada por células T.
A inabilidade das células Langerhans em ativar os linfócitos
T sugere que permanecem imaturas ou inativadas, mesmo após o
contato com o vírus. Essa inabilidade parece explicar a capacidade de
as células de Langerhans reterem por longo tempo partículas virais,
comportando-se, portanto, como um reservatório e sítio de latência
viral, cuja reativação ocorre após a ação de citocinas pró-inflamatórias
ou estimulação alogênica (FAUSCH et al., 2002).
Não há evidência da competência do HPV em infectar ou
replicar nas células de Langerhans (HERTEL et al., 2003). Supõe-se que a
redução da densidade destas células, mediante a infecção viral, pode
ocorrer devido a um efeito indireto, mediado pelo vírus, relacionado à
redução da expressão de E-caderina nos queratinócitos infectados, de
modo a influenciar a permanência das células de Langerhans, entre as
células epiteliais escamosas, pelo fato de possuírem receptores para E-
caderina em sua superfície. Há relatos de que a redução de E-caderina
seria causada pela proteína E6 do HPV-16, que também parece inibir os
sinais para migração e maturação das células de Langerhans.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
31
3.3 Células de Langerhans e câncer de colo uterino
As células de Langerhans envolvem-se na resposta imune
contra tumores quando ingerem os antígenos tumorais expressos nas
células que sofreram transformação maligna, apresentando-os aos
linfócitos T, através das moléculas de MHC classe II. Deste modo os
antígenos tumorais são reconhecidos pelos linfócitos T (CHAPEL; MISBOH;
SNOWDOWN, 2003).
Os linfócitos T ativados são capazes de matar células
tumorais, que expressam antígenos relevantes. Este tem sido um
mecanismo pelo qual os imunologistas tumorais têm aperfeiçoado
estratégias para estimular a imunidade anti-tumor, sendo a
imunoterapia um recurso bastante promissor por não comprometer
células normais de tecido como ocorre com a radioterapia e
quimioterapia aplicadas em câncer avançado (ABBAS; LICHTMAN;
POBER, 2003).
Recentemente, é de grande interesse o estudo de células
dendriticas, dentre estas as células de Langerhans (isolando precursores
do sangue e expandindo-os em cultura com fatores do crescimento)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
32
para serem usadas como vacinas, após exposição a agentes tumorais
(ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Alguns relatos mostram que o desenvolvimento das lesões
intraepiteliais está associado com o aumento nas células de Langerhans
por incremento prévio das proteínas inflamatórias quimioatrativas
derivadas de macrófago. Mesmo assim, o crescimento tumoral ocorre,
denotanto uma falha do sistema imunológico.
O crescimento tumoral supera a reação imune do
hospedeiro, talvez pelos antígenos tumorais serem fracamente
imunogênicos, pois diferem pouco dos antígenos próprios (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2003).
Várias hipóteses têm sido propostas para explicar a
deficiência imune observada nas lesões pré-neoplásicas induzidas pelo
HPV no colo uterino, já que, nas mulheres com lesões intraepiteliais, a
habilidade de formar células de Langerhans, a partir de precursores de
medula óssea, se mantém inalterada (KADISH et al., 2002).
Os queratinócitos podem produzir citocinas
imunorregulatórias, que têm efeito sobre as células de Langerhans, ou
ainda podem sofrer transformação mediante infecção viral, reduzindo
sua produção de citocinas. Uma dessas citocinas é o fator estimulador
de crescimento de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), cuja
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
33
deficiência reduz o estímulo quimioatrativo para a migração contínua e
para maturação e diferenciação das células de Langerhans e das
dendríticas (HERTEL et al., 2003).
Outra hipótese para a redução da densidade epitelial das
células de Langerhans é a possibilidade da super-expressão nas lesões
intraepiteliais da IL-10, uma citocina imunossupressora. O decréscimo
das células de Langerhans, nessas lesões, sugere um distúrbio na
imunidade celular nas infecções pelo papilomavírus humano (KADISH et
al., 2002).
As neoplasias podem indicar também uma possível falha
nas células profissionais apresentadoras de antígenos em mediar ou
potencializar a resposta imune, do que deriva o crescimento tumoral
(CHAPEL; MISBOH; SNOWDOWN, 2003).
A diminuição ou ausência das células de Langerhans no
epitélio resulta em diminuição da responsividade a antígenos cutâneos,
com conseqüente vulnerabilidade daquele a infecções e neoplasias
(SOBHANI et al., 2000).
As células de Langerhans podem também não apresentar
antígenos por falha na ação das integrinas, responsáveis por estabilizar
a ligação dessas células aos linfócitos T por um período longo o
suficiente para que ocorra a ativação linfocitária, ou ainda por
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
34
interferências nas moléculas co-estimuladoras, sem as quais a ativação
das células T não se faz (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Um mecanismo redutor da imunidade celular é a indução
da tolerância, derivada da persistência da infecção produtiva viral em
baixos níveis, mediante apresentação dos antígenos virais por longo
tempo através dos queratinócitos.
Outro mecanismo da falha imunológica refere-se à
intrínseca relação entre a ação imune e os níveis hormonais. O período
do ciclo menstrual é critico em definir a resposta imune aos antígenos
inoculados, provavelmente pela imunossupressão provocada pela
ação da progesterona, cuja estrutura química em muito se assemelha a
dos glicocorticóides, os quais são imunossupressores (BLACK et al., 2000).
A presença de células dendríticas em tumores e áreas
peritumorais, bem como nos linfonodos regionais, tem demonstrado
correlação com melhor prognóstico (ZHANG, 1992).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
35
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipo de estudo
O estudo foi prospectivo, observacional, tipo caso controle.
4.2 Local e População de estudo
Dois foram os locais de estudo. No Setor de Histopatologia
do Centro de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, localizado
na cidade de João Pessoa, foram obtidos blocos de parafina contendo
material de biópsias de colo do útero ou secções histológicas de colo
de útero obtidas de peças cirúrgicas de histerectomia, encaminhadas
para exame histopatológico, como parte da rotina do programa de
prevenção do colo do útero e tratamento de doenças uterinas,
respectivamente.
No Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de
Pernambuco, localizado na Cidade do Recife – Pernambuco, os blocos
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
36
de parafina contendo fragmentos teciduais do colo do útero foram
submetidos a recortes. Esses cortes histológicos foram, então,
processados como de rotina, em hematoxilina-eosina e também
submetidos a exame imuno-histoquímico com posterior análise
morfométrica.
4.3 Material e seleção das amostras
A partir do banco de dados correspondente a biópsias
cervicais realizadas no período de Janeiro a Dezembro de 2003, foram
selecionados, baseados no relatório histopatológico original, 68 casos
diagnosticados como carcinoma escamocelular intra-epitelial
(carcinoma escamocelular in situ/NIC 3) em mulheres com vida sexual
ativa, conforme dados presentes no prontuário do serviço.
Numa segunda etapa, considerando-se a alta relevância
da idade e do estado gestacional na resposta imune, decidimos
trabalhar apenas com a faixa etária de 20 a 40 anos e mulheres não
gestantes. Assim, foram excluídos nesta etapa 37 amostras, passando, o
material a constituir de 31 casos de neoplasia escamocelular in situ/NIC
3 (grupo caso).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
37
Para formar o grupo controle (epitélio escamoso normal),
retiraram-se do banco de dados 31 amostras obtidas por biópsia
cervical ou histerectomia, representadas por fragmentos de colo uterino
com epitélio escamoso dentro dos limites normais e obedecendo aos
mesmos critérios de inclusão aplicados ao grupo caso (NIC 3), isto é,
oriundas de mulheres com vida sexual ativa, não gestantes, na faixa
etária entre 20 e 40 anos. Tomou-se o cuidado de manter a
equivalência entre as idades deste grupo e as contempladas no grupo
caso.
Numa terceira etapa, foram feitos recortes dos blocos de
parafina correspondentes ao material de ambos os grupos e as lâminas
obtidas foram revistas pela autora e professora orientadora. Incluíram-
se, no estudo, as amostras cujas preparações histológicas estavam em
boas condições para confirmação do diagnóstico e realização do
exame imuno-histoquímico: cortes inteiros, não fragmentados, ausência
de autólise, hemorragia e exsudato inflamatório significativo.
Esta ultima etapa resultou na exclusão de 26 amostras,
sendo 13 em cada grupo, permanecendo 18, representativas do grupo
caso (NIC 3), e 18, do grupo controle (epitélio escamoso normal).
O diagrama da seleção das amostras pode ser visto na
Figura 1.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
38
Figura 1 – Diagrama de seleção das amostras
Banco de dados de relatórios histopatológicos do Centro de Diagnóstico de Câncer do estado da Paraíba – Janeiro-Dezembro 2003
Idade de 20 a 40 anosNão gestantes
Vida sexual ativa
68 casos (NIC 3)
31 casos (NIC 3)
carcinoma escamocelular in situ / NIC 3
Equivalência de idade
Amostras adequadas (NIC 3 e de epitélio escamoso normal) para diagnóstico histopatológico e exame imuno-histoquímico
18 casos(NIC 3)
18 controles(epitélio escamoso normal)
Incluídos13 casos(NIC 3)
13 controles(epitélio escamoso normal)
Excluídas26 amostras
1ª etapa - Critérios de inclusão
AMOSTRA ANALISADA
2ª etapa - Critérios de inclusão
Excluídas37 amostras31 controles
(epitélio escamoso normal)
Vida sexual ativa
Epitélio escamoso normal
Critérios de inclusão
Não gestantes
Idade de 20 a 40 anos
3ª etapa Critério de inclusão
Banco de dados de relatórios histopatológicos do Centro de Diagnóstico de Câncer do estado da Paraíba – Janeiro-Dezembro 2003
Idade de 20 a 40 anosNão gestantes
Vida sexual ativa
68 casos (NIC 3)
31 casos (NIC 3)
carcinoma escamocelular in situ / NIC 3
Equivalência de idade
Amostras adequadas (NIC 3 e de epitélio escamoso normal) para diagnóstico histopatológico e exame imuno-histoquímico
18 casos(NIC 3)
18 controles(epitélio escamoso normal)
Incluídos13 casos(NIC 3)
13 controles(epitélio escamoso normal)
Excluídas26 amostras
1ª etapa - Critérios de inclusão
AMOSTRA ANALISADA
2ª etapa - Critérios de inclusão
Excluídas37 amostras31 controles
(epitélio escamoso normal)
Vida sexual ativa
Epitélio escamoso normal
Critérios de inclusão
Não gestantes
Idade de 20 a 40 anos
3ª etapa Critério de inclusão
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
39
A revisão das preparações histológicas para confirmação
do diagnóstico de NIC 3 foi realizada segundo os critérios da OMS:
[...] maturação (incluindo queratinização superficial) pode
estar presente, mas confinada ao terço superior do epitélio. As
anormalidades nucleares são marcantes em toda espessura do
epitélio. As mitoses anormais são freqüentes (WELLS et al., 2003,
p. 270).
Nas Fotos 2, 3, 4 e 5, observam-se as preparações
histológicas com diagnóstico de NIC 3.
Foto 2 – Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 100X)
Notar o contraste entre a área de epitélio escamoso com NIC 3 (à esquerda), caracterizada por atipismo nuclear em toda a espessura do epitélio e o epitélio escamoso normal (à direita)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
40
Foto 3 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 400X)
Notar a alta relação núcleo-citoplasma em toda a espessura do epitélio, bem como o aumento do número de mitoses (setas)
Foto 4 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 25 X)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
41
Foto 5 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 100X)
À direita, observa-se a preservação do epitélio glandular endocervical, ainda não completamente substituído pela NIC 3.
4.4 Tamanho amostral
Para cálculo do tamanho amostral, admitiram-se:
� Proporção entre casos e controles (escolha da pesquisadora) = 1,00
(um caso para um controle);
� Menor Odds-Ratio que a pesquisadora aceitou no estudo = 22,91
(valor igual à estimativa do INCA de câncer do colo do útero, para
2005, em João Pessoa) (BRASIL, 2005);
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
42
� Percentual de controles em risco de câncer do colo do útero = 3,62
(incidência de câncer do colo do útero, em 2005, em João Pessoa)
(BRASIL, 2005);
� nível de significância = 0,05;
� poder de prova = 80%,
O tamanho amostral foi estimado em 40 fragmentos de colo
de útero, sendo 20 casos (obtidos por biópsia de mulheres com
diagnóstico de carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, confirmado por
exame histopatológico de acordo com os critérios da Organização
Mundial de Saúde) e 20 controles (obtidos por biópsia de mulheres,
histologicamente livres de neoplasias intraepiteliais cervicais).
Aplicados os critérios de inclusão e de exclusão, o tamanho
amostral analisado igualou-se a 36 espécimes, sendo 18 casos (grupo
caso) e 18 controles (grupo controle), equivalentes quanto à idade,
correspondendo a um poder de prova de 91,5%, ao nível de
significância de 0,05.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
43
4.5 Variáveis e conceitos
4.5.1 Variável independente
A variável independente foi o diagnóstico histopatológico,
firmado pela observação microscópica dos corte corados pela
hematoxilina-eosina. Foi categorizado em: carcinoma escamocelular in
situ/NIC 3 e epitélio escamoso normal.
4.5.2 Variáveis dependentes
� Idade – conceituada como o número de anos de vida
constante no prontuário da mulher. Foi categorizada em
intervalos de classe: 20 – 25; 26 – 30; 31 – 35 e 36 – 40.
� Densidade de células de Langerhans – considerada
como o número de células de Langerhans existentes em
1 mm2 de epitélio escamoso de colo do útero. Foi
expressa pelos parâmetros estatísticos de valor mínimo,
máximo, média e desvio padrão.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
44
� Distribuição topográfica das células de Langerhans – foi
considerada como a localização dessas células na
espessura do epitélio escamoso do colo do útero. Foi
categorizada como: em zona superficial; em zona
intermediária e em zona basal.
4.6 Métodos
Na presente dissertação, foram empregados: recortes dos
blocos de parafina para confecção de preparações histológicas de
rotina (HE), exame imuno-histoquímico e análise morfométrica.
4.6.1 Recortes dos blocos de parafina
Em cada bloco de parafina correspondente ao grupo caso
(NIC 3) e grupo controle (epitélio escamoso normal), foram efetuados
dois recortes histológicos em micrótomo manual, de 3 µm a 4 µm de
espessura.
Uma das duas secções teciduais de cada paciente foi
corada pela técnica da hematoxilina-eosina (HE), montada em
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
45
Bálsamo do Canadá contra lamínula e observada à microscopia óptica
de campo claro, para diagnóstico histológico, realizado pela
pesquisadora e pela professora orientadora.
A outra secção foi utilizada para o exame imuno-
histoquímico e análise quantitativa.
4.6.2 Exame imuno-histoquímico
Para a imunomarcação, foi utilizado o anticorpo
antiproteína S100 da DAKO®, adquirido com o apoio financeiro da
Secretaria de Saúde do estado da Paraíba – Núcleo de Prevenção do
Câncer.
Realizou-se controle de qualidade do imunomarcador
empregando secções histológicas de linfonodos histologicamente
normais, selecionados a partir dos arquivos do Departamento de
Patologia do Hospital de Câncer de Pernambuco (Fotos 6 e 7).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
46
Foto 6 – Corte de linfonodo histologicamente norma l, empregado como controle de qualidade de imuno-marcação por anticorpo anti-prot eína S-100 (à esquerda – 100X, à direita – 400X) Observar imuno-marcação das células de Langerhans, caracterizadas pela coloração marrom, em contraste com a negatividade do tecido linfático. Notar a concentração de células de Langerhans na zona para-cortical, em torno do folículo linfático (setas).
Foto 7 - Corte de linfonodo histologicamente norma l, empregado como controle de qualidade de imuno-marcação por anticorpo anti-prot eína S-100 (400x) Observar imuno-marcação das células de Langerhans, caracterizadas pela coloração marrom, em contraste com a negatividade do tecido linfático. Notar o aspecto estrelado das células de Langerhans, dado pelas projeções dendríticas (seta).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
47
A segunda secção de cada paciente da amostra
analisada foi submetida a desparafinação e clareamento em banho de
xilol e etanol, de acordo com o procedimento padrão em
histotecnologia (FREITAS NETO et al., 2003). As lâminas foram imersas em
banho de solução de citrato de sódio a 5% e colocadas em forno de
microondas por duas sessões de 10 minutos cada uma, para
recuperação antigênica das amostras. Foi utilizada uma solução de
metanol a 2% em peróxido de hidrogênio, para bloqueio da peroxidase
endógena.
O anticorpo anti-proteína S-100 foi diluído a 1:1000 em
tampão salina fosfato, em câmara úmida a 4° C, por 12 horas.
Para a visualização da imuno-marcação, foi empregado o
kit de revelação Liquid DAB - LSAB2-Plus, da marca DAKO®, e a 3’ 3 –
diaminobenzidina.4 HCl como cromógeno.
As preparações histológicas correspondentes a imuno-
marcação foram montadas com Bálsamo do Canadá, contra lamínula.
Foram revistas em conjunto pela autora e pela professora orientadora. A
célula de Langerhans foi identificada pela imuno-marcação para
proteína S100 expressa pela cor castanha do citoplasma e do núcleo e
pelo seu citoplasma peculiar com projeções dendríticas (Foto 7).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
48
4.6.3 Análise morfométrica
A utilização da morfometria seguiu a metodologia de
pesquisa do Programa de Pós-graduação em Patologia pela
Universidade Federal de Pernambuco, iniciada há cerca de 20 anos
pelo Professor Adonis Carvalho.
A fundamentação teórica e prática para a utilização da
estereologia foi obtida nos textos de Weibel (1979), Baak e Oort (1983) e
Elias e Hyde (1983).
As contagens foram feitas pela autora, utilizando um
retículo quadriculado (grade de Weibel) adaptado à ocular do
microscópio. Dito retículo mede dez milímetros de cada lado e contém
400 intersecções que delimitam 400 quadrículos (Foto 8).
Visando evitar quantificações super-estimadas, optou-se por
considerar na contagem as células de Langerhans representadas pelo
corpo celular e respectivo núcleo, desprezando aquelas caracterizadas
apenas pelos prolongamentos citoplasmáticos (dendritos). Foi utilizado,
para a contagem das células de Langerhans, um microscópio óptico
binocular (Olympus CX). A calibração da magnificação de 400X do
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
49
microscópio foi feita pela utilização de uma lâmina contendo escala de
1 mm dividida em 100 partes iguais (escala micrométrica) (Foto 9).
Foto 8 – Grade de Weibel, com 10 mm de lado
Foto 9 - Lâmina com escala micrométrica (seta), me dindo 1 mm, dividida em 100 partes (0,01 mm)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
50
A medida da grade de Weibel, no aumento de 400X, foi
aferida pela superposição da sua imagem à lâmina contendo a escala
micrométrica. Nesse aumento, a grade Weibel mede 0,25mm de cada
lado, com área total de 0,062mm2. Cada quadrículo delimitado pelas
intersecções corresponde a uma área de 0,000015mm2.
Os corpos celulares com imunomarcação para o anticorpo
anti-proteina S100, foram quantificados em dez campos de 400X para
cada amostra do grupo caso (NIC 3) e do grupo controle (epitélio
escamoso normal). Para padronização da avaliação, foram excluidos
da contagem os corpos celulares vistos na intersecção com o limite
superior e o lateral esquerdo da grade.
4.6.3.1 Seleção dos campos para análise quantitativa:
Inicialmente, tanto no grupo caso (NIC 3) como do grupo
controle (epitélio escamoso normal), os campos mais representativos
foram identificados, em menor aumento (100X), nas preparações
coradas pelo HE e marcados com caneta indelével. Através da
superposição das lâminas coradas em HE com as equivalentes,
submetidas a imuno-histoquímica (S100), a marcação da área
estudada foi localizada e repassada à preparação histológica
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular
in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
51
correspondente. Para a contagem, selecionaram-se as áreas de maior
celularidade das células de Langerhans, vizualizadas no pequeno
aumento (50X), nas preparações submetidas a imuno-histoquímica. Foi
elaborado um formulário para a pesquisa das células de Langerhans
(Apêndice 1) sob orientação da Professora orientadora.
4.6.3.2 Determinação da área ocupada pelo epitélio escamoso (mm2)
em ambos os grupos
Como o tamanho e o formato dos cortes histológicos
correspondentes ao epitélio escamoso examinado (e
conseqüentemente a sua área) variava em cada preparação
histológica e em cada campo examinado, o formulário incluiu, ainda,
um diagrama da grade de Weibel, sobre o qual a autora desenhou, à
mão livre, a área representada pelo epitélio escamoso para cada caso,
em cada um dos dez campos examinados, em ambos os grupos (Figura
2).
À maneira da contagem histológica das células de
Langerhans, foram excluídos da contagem os quadrículos ocupados
parcialmente pelo epitélio escamoso no limite superior da grade e no
limite lateral esquerdo, no desenho à mão livre.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-
histoquímica
52
Figura 2 – Desenho a mão livre da área do epitélio escamoso em 10 campos ópticos de 400X, para contag em de células de Langerhans
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
53
Desse modo, foi calculada a área do epitélio escamoso, em
ambos os grupos e em cada um dos dez campos examinados, obtida
por meio da soma dos quadrículos correspondentes ao desenho do
epitélio escamoso.
O cálculo do número de células de Langerhans/mm2 levou
em consideração a área ocupada pelo epitélio escamoso examinado
em cada um dos dez campos contados para cada caso.
4.6.3.3 Determinação da densidade de células de Langerhans por mm2
A cada contagem, no formulário elaborado para esta
pesquisa (Apêndice 1), registraram-se o número de quadrículos da
grade morfométrica de Weibel ocupados pelo epitélio escamoso no
campo microscópico submetido a exame e o número de células de
Langerhans identificadas.
O início da contagem das células de Langerhans foi
realizado da seguinte forma:
Para o grupo caso (NIC 3):
a) a partir de um dos bordos do epitélio escamoso com NIC 3 ou
b) a partir da transição epitélio normal/NIC 3, iniciando a
contagem na área de NIC 3.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
54
Para o grupo controle:
a) a partir de um dos bordos do epitélio escamoso normal ou
b) a partir da zona de transformação.
As abordagens “b” foram preferenciais, sempre que as
áreas em tela estavam presentes nos cortes histológicos selecionados. O
objetivo foi observar modificações na quantidade de células de
Langerhans em zona de transformação no grupo controle (epitélio
escamoso normal), onde costuma ser mais freqüente o
desenvolvimento das neoplasias intra-epiteliais cervicais. No grupo caso
(NIC 3), a abordagem visou detectar uma possível concentração das
células de Langerhans na área de NIC 3, mais próxima ao epitélio
malpighiano normal.
Para cada paciente, foram calculados média e desvio
padrão do número de células de Langerhans e do número de
quadrículos da grade morfométrica de Weibel ocupados pelo epitélio
escamoso, no campo microscópico submetido a exame.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
55
4.6.3.4 Fórmulas utilizadas para cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso e para a densidade das células de Langerhans por mm2
quadrículo cada de área à entecorrespond constante, fator 400
0,062
examinados campos 10 nos escamoso epitélio
pelo ocupados Weibelde grade da squadrículo de número n
escamoso epitélio pelo ocupada área A
onde400
0,062n A
esc q
esc
esc qesc
→
→→
×=
Fórmula 1 – Cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso
escamoso epitélio pelo ocupada área A
examinados campos 10 nos Langerhans de células de número n
mm por Langerhans de células das densidade D
A
n D
esc
CL
2CL
esc
CLCL
→→→
=
onde
Fórmula 2 – Cálculo da densidade de células de Langerhans
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
56
4.7 Processamento e análise dos dados
Os dados foram organizados por meio do programa
Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 13.0. Da estatística
descritiva empregaram-se média, desvio padrão, variância e
distribuição de freqüências absolutas e relativas.
Foram empregados o teste t de Student para diferenças de
médias de amostras pareadas e o teste de χ2 para teste de associação
de variáveis, ambos ao nível de significância de 0,05.
Os resultados foram apresentados em tabelas e gráficos
obedecidas as normas do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.
4.8 Aspectos éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital Universitário Lauro Wanderley, situado na cidade de João
Pessoa, Paraíba, sob número 600 (Apêndice 2).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
57
5 RESULTADOS
Foram analisados os dados de 36 mulheres, divididas em
dois grupos: caso e controle. No grupo caso (NIC 3), a idade média
igualou-se a 32,17 ± 5,42 anos e variou entre 20 e 40 anos. No grupo
controle (epitélio escamoso normal), a média etária igualou-se a 33,94 ±
4,96 anos, com variação entre 23 e 40 anos. Os grupos caso (NIC 3) e
controle (epitélio escamoso normal) não diferiram significantemente
quanto à distribuição etária (F = 1,054 , p = 0,312) (Gráfico 1)
2 2
4
3
5
4
7
9
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
freqüência
20 - 25 26 - 30 31 - 35 36 - 40faixas etárias
casos (NIC 3) controles (epitélio escamoso normal)
Gráfico 1 – Distribuição das faixas etária por grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
58
5.1 Densidade de células de Langerhans
Na Tabela 1, estão expressos limites mínimo e máximo,
média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans
segundo grupos caso (NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal).
Os intervalos de variação da densidade de células de
Langerhans foram 5,06 – 25,02 células/mm2 e 1,26 – 3,62 células/mm2,
nos grupos caso (NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal),
respectivamente (Tabela 1).
Houve diferença estatisticamente significante da densidade
média de células de Langerhans entre o grupo caso (NIC 3) e o controle
(epitélio escamoso normal) (F = 63,009, p < 0,001). A densidade média
de células de Langerhans igualou-se a 12,79 ± 5,48 células/mm2 e 2,44 ±
0,79 células/mm2 (Tabela 1).
Tabela 1 – Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans segundo grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003
GRUPOS DENSIDADE DE CÉLULAS DE
LANGERHANS caso (NIC 3) controle (epitélio escamoso
normal) Mínimo 5,06 1,26 Máximo 25,02 3,62 Média 12,79 2,44 Desvio-padrão 5,48 0,79
F = 63,009, p < 0,0001
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
59
Nos Gráficos 2 e 3, está representada a dispersão da
densidade de células de Langerhans nos grupos caso (NIC 3) e controle
(epitélio escamoso normal), respectivamente.
idade dos casos
5040302010
dens
idad
e (c
élul
a/m
m2)
30
20
10
0
Gráfico 2 – Dispersão da densidade de células de L angerhans segundo idade de 18 casos (NIC 3) -– Centro Diagnóstico do Câncer do es tado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003
idade dos controles
50403020
dens
idad
e (c
élul
a/m
m2)
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Gráfico 3 – Dispersão da densidade de células de L angerhans segundo idade de 18 controles (epitélio escamoso normal) -– Centro Diag nóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
60
Comparando os grupos caso (NIC 3) (Fotos 10 a 16) e
controle (epitélio escamoso normal) (Foto 17), equivalentes em relação
à idade das pacientes, quanto à densidade de células de Langerhans,
identificou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos
(t=17,458, p < 0,001).
Foto 10 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (400x) Notar o atipismo celular das células escamosas caracterizado por núcleos aumentados, hiper cromáticos com variação de forma e tamanho, em toda a espessura do epitélio. As células de Langerhans encontram-se distribuídas em todos os níveis do epitélio.
Foto 11 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar as células de Langerhans em meio às células escamosas atípicas, bem como coilocitos (setas).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
61
Foto 12 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta).
Foto 13 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
62
Foto 14 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta)
Foto 15 – Imuno-marcação das células de Langerha ns no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar forma estrelada da célula de Langerhans (seta).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
63
Foto 16 – – Imuno-marcação das células de Langerha ns no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar acúmulo focal de células de Langerhans.
Foto 17 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio escamoso normal (1000X) Notar a escassez das células de Langerhans às quais estão localizadas nas camadas basal e para-basal.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
64
5.2 Densidade de células de Langerhans dos grupos segundo faixas etárias
Na Tabela 2, estão expressos os limites de variação, média e
desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso
(NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal) , segundo faixas etárias.
Não houve diferença estatisticamente significante da
densidade de células de Langerhans entre as faixas etárias do grupo
caso (NIC 3) e do grupo controle (epitélio escamoso normal) (F = 0,443 ,
p = 0,726 e F = 1,954, p = 0,167, respectivamente).
Constatou-se que, em todas as faixas etárias, a densidade
celular do grupo caso (NIC 3) foi maior que a do grupo controle (epitélio
escamoso normal). No grupo caso (NIC 3), a densidade celular variou
entre 7,19 células/mm2 e 25,02 células/mm2, enquanto que, no grupo
controle (epitélio escamoso normal), essa variação igualou-se a 1,26
células/mm2 a 3,62 células/mm2 (Tabela 2).
Comparando-se as faixas etárias quanto à variabilidade da
densidade celular de Langerhans identificou-se que, no grupo caso (NIC
3), foi maior nas faixas etárias maiores, enquanto que, no grupo controle
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
65
(epitélio escamoso normal), foi semelhante nas diversas faixas etárias
(Tabela 2).
Tabela 2 - Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso e controle, segundo faixas etárias – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003
GRUPOS
Caso (NIC 3) CONTROLE (epitélio escamoso normal) FAIXAS ETÁRIAS (anos) Mínimo Máximo Média
Desvio-padrão
Mínimo Máximo Média Desvio-padrão
20 – 25 7,19 9,77 8,48 1,82 1,90 3,62 2,76 1,22
26 – 30 9,67 19,67 13,87 4,20 2,19 3,43 2,96 0,67
31 - 35 10,38 17,20 13,47 3,26 1,83 3,51 2,82 0,72
36 - 40 5,06 25,02 12,92 7,82 1,26 3,20 2,03 0,66
5.3 Distribuição das células de Langerhans no epitélio escamoso segundo grupos
No grupo controle (epitélio escamoso normal), as células de
Langerhans foram mais freqüentemente visualizadas nas camadas
profundas do epitélio, correspondentes às camadas basal e para-basal
(Foto 18) e, de modo mais evidente, na área da junção escamocolunar.
No grupo caso (NIC 3), as células de Langerhans se
distribuíram de modo disperso, em toda a espessura do epitélio. Não se
limitavam apenas às camadas profundas do epitélio, mas também
foram encontradas permeando as camadas intermediária e superficial,
tanto na NIC 3 em superfície (Foto 19), como na NIC 3 extensiva às
criptas glandulares (Foto 20).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
66
Foto 18 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio ecamoso normal (100X)
Notar distribuição das células de Langerhans, nas camadas basal e para-basal.
Foto 19 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (100x)
Notar as células de Langerhans, dispersas em toda a espessura do epitélio
Foto 20 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, extensivo às criptas glandulares (100x)
Notar as células de Langerhans, dispersas em toda a espessura do epitélio.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
67
6 DISCUSSÃO
Mulheres portadoras de carcinoma escamocelular in situ
apresentaram uma densidade de células de Langerhans
significantemente maior que mulheres com colo uterino normal,
sugerindo um incremento da imunidade celular no carcinoma
escamocelular in situ.
Os achados da presente pesquisa diferiram de estudos
prévios, nos quais foi identificada redução das células de Langerhans
em câncer cervical. Mathews et al. (2003) referiram uma produção
reduzida de E-caderina nas neoplasias intraepiteliais cervicais e no
câncer cervical, com conseqüente redução das células de Langerhans
no local da lesão. Hubert et al. (1999) relataram redução das células de
Langerhans em câncer cervical in situ como conseqüência da
diminuição da produção do fator de necrose tumoral alfa e do fator
estimulador de colônia GM-CSF pelos queratinócitos.
No entanto, o presente estudo pareceu corroborar os
achados de outras pesquisas. McArdle e Muller (1986) e Abdou et al.
(1999) referiram haver um aumento significante nas células de
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
68
Langerhans nas neoplasias intraepiteliais cervicais e no carcinoma
escamocelular in situ, sugerindo que este fato decorreria de uma
resposta imune direta contra neoantígenos associados com a
transformação maligna.
Outros pesquisadores relataram aumento dessas células em
carcinomas gástricos (LI, 1992) e de laringe (ZHANG, 1992), o que
consideraram ser um importante fator de defesa, atuando como critério
prognóstico, com menor número de metástases e maior sobrevida
desses pacientes.
A idade das pacientes dos grupos caso e controle variaram
entre 20 e 40 anos e 23 a 40 anos, respectivamente, sem diferença
significante.
As células de Langerhans integram o sistema imunológico
tecidual do colo do útero. A adoção na presente pesquisa da faixa
etária de 20 a 40 anos, para os grupos caso e controle, deveu-se a
pouca variação do status hormonal nessas idades, o qual se constitui no
principal fator de regulação da apresentação de antígenos no trato
genital inferior e, portanto, da imunidade celular (WIRA et al., 2005). Por
esse motivo, é importante ressaltar que os grupos caso e controle não
diferiram significantemente quanto à distribuição etária.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
69
No presente estudo, constatou-se que o grupo controle
(epitélio escamoso normal) diferiu do grupo caso (NIC 3) quanto à
distribuição das células de Langerhans.
Histologicamente, o colo do útero normal caracterizou-se
por baixa densidade de células de Langerhans, situadas
predominantemente na camada profunda (basal e parabasal) do
epitélio (WEISS; SANDERS; WESTBROOK, 1993), assim como na zona de
transformação e na junção escamocolunar, compondo uma barreira
inata de defesa contra patógenos.
A junção escamocolunar tem como característica estar em
parte constituída por células indiferenciadas, chamadas células de
reserva, capazes de diferenciar-se para células colunares ou
escamosas, enquanto que a zona de transformação contém células
metaplásicas, com alto dinamismo genético para multiplicação,
maturação e diferenciação celular. Assim sendo, a localização das
células de Langerhans parece estar relacionada à maior
vulnerabilidade das células dessas camadas a agentes mutagênicos e
patógenos intracelulares (JABLONSKA, 1982).
A distribuição difusa das células de Langerhans constatada
no grupo caso (NIC 3), de portadoras de carcinoma escamocelular in
situ/NIC 3, pareceu uma resposta imunológica aos antígenos tumorais
presentes, os quais estariam também difusamente dispersos em todas as
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
70
camadas celulares, recrutando essas células de defesa (ABBAS;
LITCHMAN; POBER, 2003).
No grupo caso (NIC 3), a densidade de células de
Langerhans foi significantemente maior que a do grupo controle
(epitélio escamoso normal), em todas as faixas etárias. Essa
constatação contrariou relatos prévios de que a densidade de células
de Langerhans está diretamente relacionada à concentração de E-
caderina. Essa proteína é apontada como responsável pela adesão
intercelular e pela manutenção das células de Langerhans
intraepiteliais. Desta forma, a redução dos níveis de E-caderina
acarretaria conseqüente redução das células de Langerhans, o que
não se verificou na presente pesquisa.
Na literatura consultada, não se identificou qualquer
publicação que abordasse com precisão esse aspecto da imunologia
do colo do útero na carcinogênese. Todavia, com base nos estudos de
imunologia dos tumores em outros órgãos (DINIZ-FREITAS et al., 2005),
pode-se aventar hipótese para explicar os resultados obtidos.
As células alteradas pela carcinogênese expressam
antígenos tumorais em sua superfície. Este fato, aliado à alteração da
arquitetura epitelial, pela perda de coesão celular e alteração
comportamental das células que compõem o tumor, se constituiriam
em agentes agressores ao epitélio normal adjacente, que reagiria,
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
71
produzindo os níveis significantes de citocinas, como o fator de necrose
tumoral alfa, interleucina-1 e o MIP-3 alfa, os quais são quimiotáxicos
para as células de Langerhans, macrófagos e linfócitos T.
A comprovação do aumento significante da densidade de
células de Langerhans em carcinoma escamocelular in situ/NIC 3
convida a refletir sobre o porquê do processo cancerígeno evoluir para
estágios mais agressivos, uma vez que a imunidade celular local foi
incentivada.
Há algumas causas plausíveis. As células de Langerhans,
atraídas ao sítio da carcinogênese, estreitamente relacionadas à
infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV), englobariam partículas
virais, expressas como agentes tumorais na superfície celular, capazes
de promover alteração na expressão de moléculas co-estimuladoras
(B7-1 e B7-2), expressas pelas células de Langerhans e responsáveis pela
estimulação de linfócitos T, sem a qual a sensibilização destes não
ocorre. Estas partículas virais, uma vez englobadas pelas células de
Langerhans, poderiam também promover defeito na molécula de
adesão intercelular 1 (ICAM-1), expressa na superfície, o que não
ofereceria tempo suficiente para sinalização e sensibilização dos
linfócitos T após o encontro destes com as células apresentadoras de
antígenos (ABBAS; LITCHMAN; POBER, 2003).
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
72
Seria viável também supor que, na carcinogênese, ao
englobar partículas virais, as células de Langerhans sofreriam alteração
no processamento ou na apresentação de antígenos, através do MHC
II, em conseqüência ao efeito citopático viral nestas células as quais já
não completam a digestão desses antígenos por terem limitados
poderes enzimáticos (CHAPEL; MISBOH; SNOWDWN, 2003), podendo se
constituir em um reservatório, onde os vírus, assim, permaneceriam em
latência ou seriam reativados (HERTEL et al., 2003).
Outra hipótese provável seria a de que o processo de
carcinogênese levaria a produção de interleucina-10, designada como
fator inibidor de citocinas, portanto uma imunossupressora, promovendo
uma tolerância das células de defesa aos antígenos tumorais. Assim
sendo, o aumento da densidade de células de Langerhans não se faria
corresponder ao aumento da proteção imunológica do tecido à
carcinogênese.
A partir da literatura consultada, pode-se identificar que
pouco se sabe sobre a imunologia dos tumores cervicais. Novas
pesquisas devem ser realizadas para que se possa responder
adequadamente ao fato de que, apesar de todos os esforços
envidados, não se tem obtido sucesso em impedir a evolução das
neoplasias intraepiteliais cervicais ao câncer invasivo, reduzindo sua
incidência e sua prevalência.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
73
Dentro dessa abordagem, o desenvolvimento de vacinas
profiláticas com capsídeos virais vazios (viral-like particles) é a linha de
pesquisa e realidade atual mais promissora que, se supõe, resultará em
grande impacto na redução da incidência do câncer de colo uterino
nas próximas décadas. Todavia as vacinas terapêuticas, que
objetivavam a regressão das lesões intra-epiteliais escamosas e indução
de depuração viral, não têm conseguido os mesmos resultados.
Talvez o melhor entendimento da resposta imune celular ao
HPV e às neoplasias intra-epiteliais cervicais possa impulsionar a
pesquisa para novas opções terapêuticas, visando a impedir a
progressão das neoplasias intra-epiteliais para o carcinoma invasor.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
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7 CONCLUSÃO
Por meio de imuno-histoquímica e análise morfométrica,
constatou-se que, no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, ocorre
aumento significante da densidade das células de Langerhans, as quais
se mostram distribuídas difusamente em todas as camadas do epitélio
cervical.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
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8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia básica. Funções e distúrbios do sistema imune. São Paulo: Revinter, 2003. 307 p.
ABDOU, L. A. et al. Immunohistochemical and ultrastructural study of Langerhan’s cells in squamous cell carcinoma of the cervix. Obstet Gynaecol Res, v. 25, n. 1, p. 15-21, 1999.
BAAK, J.P.A.; OORT, J. A manual of morphometry in diagnostic pathology. Berlin: Springer-Verlag. 1983, 205 p.
BAKRI, Y. et al. The maturation of dendritic cells results in post integration inhibition of HIV-1 replication. J Immunol, v. 166, p. 3780-3788, 2001.
BLACK, C. A. et al. Vaginal mucosa serves as an inductive site for tolerance. J Immunol, v. 165, p. 5077-5083, 2000.
BRASIL. Ministério da Saúde. Estatísticas de mortalidade, Brasília, DF, Centro de Documentação do MS, 2000.
BRIMINI, R. Câncer no Brasil, dados histopatológicos. Instituto Nacional do Câncer. Rio de janeiro, 1982.
CARTIER, R.; CARIER, I. Colposcopia prática. 3. ed. São Paulo: Roca. 1994. p. 41-49.
CASTLE, P. E. Beyond Human Papilomavirus: the cervix, exogenous secondary factors, and the development of cervical precancer and cancer. J Lower Genital Tract Dis, v. 8, n. 3, p. 224-230, 2004.
CHAPEL, H.; MISBOH, M. H. S.; SNOWDWN, N. Imunologia para o clínico. São Paulo: Revinter. 2003. p. 11-17, 35-39.
1 Referências Bibliográficas elaboradas segundo a NBR-6023 da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT, 2003)
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
76
COX J. T. Current understandings on the Immune response to HPV infection of the vagina and cervix. In: Sth International Multidisciplinary Congress – Eurogin. 2003
DARVISHIAN, F. et al. Case report: Langerhans’ cell histiocytosis in the parotid gland. Ann Clin Lab Sci, v. 32, n. 2, 2002.
DEMAY, R. M. The art and science of cytopathology. ASCP Press – American Society of Clinical Pathologists. Chicago. 1996. p. 62-72.
DINIZ-FREITAS, M. et al. Reduced E-cadherin expression is an indicator of unfavourable prognosis in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol, 2005.
EDWARDS, J. N.; MORRIS, H. B. Langerhans cells and lymphocyte subset in the female genital tract. Br J Obst Gynecol, v. 92, p. 974-982, 1995.
ELIAS, H.; HYDE, D.M. A guide to practical stereology. Basel: Karger, 1983. 148 p.
FADARE, O. et al. E-cadherin and β-catenin expression in early stage cervical carcinoma: a tissue microarray study of 147 cases. W J Surg Oncol, v. 3, p. 38, 2005.
FAUSCH, S. C. et al. Human Papilomavirus like particles do not activate Langerhans cells: a possible immune escape mechanism used by human papillomaviruses. J Immunol, v. 169, p. 3242-3249, 2002.
GOSS, C. M.; GRAY, H. Anatomia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 29. ed.1997. p. 1081-1086.
GROSS, G. E.; BARRASSO, R. Infecção por Papilomavirus Humano. Atlas Clínico de HPV. São Paulo: Artmed. 1999. cap. 1, p. 1-16, 59-61, 257.
HAUSER, C. The interaction between Langerhans cells and CD4+T cells. J Dermatol, v. 19, n. 11, p. 722-725, 1992.
HERTEL, L. et al. Susceptibility of immature and mature Langerhans cell-type dendritic cells to infection and immunomodulation by human cytomegalovirus. J Virol, p. 7563-7574, 2003.
HUBERT, P. et al. Colonization of in vitro-formed cervical Human Papilomavirus-associated (pre)neoplastic lesions with dendritic cells. Am J Pathol, v. 154, n. 3, p. 775-784, 1999.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
77
HUBERT, P. et al. E-cadherin-dependent adhesion of dendritic and Langerhans cells to keratinocytes is defective in cervical human papilomavirus-associated (pre)neoplastic lesions. J Pathol, v. 206, p. 346-355, 2005.
JABLONSKA, S. Human Papilomavirus and oncogenesis. Z Hautkr, v. 57, n. 8, p. 551-566, 1982.
JACYNTHO, C. HPV. O vírus do câncer pelo sexo? Nossas dúvidas! Rio de Janeiro: Editora Cláudia Jacyntho, 2001.
KADISH, A. S. et al. Regression of cervical intraepithelial neoplasia and loss of Human Papilomavirus (HPV) infection is associated with cell-mediated immune responses to an HPV type E7 peptide. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 11, n. 5, p. 483-488, 2002.
KATOU, F. et al. Immunological activation of dermal Langerhans cells in contact with lymphocytes in a model of human inflamed skin. Am J Pathol, v. 156, n. 2, p. 519, 2000.
KIRNBAUER, R. et al. Papilomavirus L1 major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic. Proc Natl Acad Sci USA, v. 89, p. 12180-12184, 1992.
LI, N. Relationship between Langerhans cells and prognosis of patients with gastric carcinoma. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, v. 14, n. 6, p. 421-422, 1992.
MAITLAND, N.J.; CONWAYS, S.; WILKINSON, N; S, et al Expression Patterns of Human Papillomavírus Type ´6 transcription factor E2 in low and high grade cervical intraepithelial neoplasia. J. Pathol, v. 186, p. 275-280, 1998.
MALE, D. Imunologia – Um Resumo Ilustrado. 3 ed. São Paulo: Manole Ltda., 1988. p. 2-11, 42-43, 46-57.
MATHEWS, K. et al. Depletion of Langerhans cells in Human Papilomavirus type 16-infected skin is associated with E6-mediated down regulation of E-cadherin. J Virol, p. 8378-8385, 2003.
MCARDLE, J. P.; MULLER, H. K. Quantitative assessment of Langerhans cells in human cervical intraepithelial neoplasia and wart virus infection. Am J Obstet Gynecol, v. 154, n. 3, p. 509-515, 1986.
MIZUMOTO, N.; TAKASHIMA, A. CD1a and langerin: acting as more than Langerhans cell markers. J Clin Invest, v. 113, n. 5, p. 658-660, 2004.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
78
MURRAY, J. C. et al. Immunohistochemical analysis of endothelial-monocyte-activating polypeptide-II expression in vivo. Am J Pathol, v. 157. n. 6, p. 2045-2053, 2000.
NYLANDER, K. et al. The ELAM-1 ligand sialossyl-Le(X) is present on Langerhans cells isolated from stratified epithelium. Exp Dermatol, v. 1, n. 5, p. 236-241, 1992.
ONSRUD, M. et al. Lymphoid cell distribution as prognostic factor in carcinoma of the uterine cervix. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 71, n. 2, p. 135-139, 1992.
PARDO-GOVES, T. et al. Expresión de interferón gamma (IFN-γ), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interleucinas 2, 4 y 6 (IL-2, IL-4, IL-6) en células de neoplasias intraepiteliales de cuelo uterino: reporte preliminar. Invest Clín, v. 46, n. 1, 2005.
PARR, E. L.; PARR, M. B. Immunoglobulin G, plasma cells, and lymphocytes in the murine vagina after vaginal or parenteral immunization with attenuated herpes simplex virus type 2. J Virol, v. 72, n. 6, 1998.
PEREIRA, T. S. Estudo quantitativo das células de Langerhans em lesões melanocíticas. 1999. 48f. Tese (Mestrado). Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências da Saúde. Recife – PE.
PEREYRA, E. A. G.; PARELLADA, C. I. Diagnóstico e tratamento da infecção Genital pelo Papilomavirus – Ginecologia. ARTSMED: Médico Científica, 2003. p. 3-14.
RIETHDORF, L. et al. Differential expression of the monocyte chemoattractant protein-1 gene in Human Papillomavirus-16-infected squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the cervix uteri. Am J Pathol, v. 149, n. 5, p. 1469-1476, 1996.
RODRÍGUEZ-SASTRE, M. A. et al. Abnormal distribution of E-cadherin and β-catenin in different histologic types of cancer of the uterine cervix. Gynecol Oncol, v. 97, p. 330-336, 2005.
SHU, J.; MCGRAWHILL, E. G. Comprehensive cancer cytopathology of the cervix uteri. Correlation with histopathology. 1995. cap 8, p. 57-66, 236-256.
SINGER, A.; MONAGHAN, J. M. Colposcopia patologia e tratamento do trato genital inferior. São Paulo: Artes Médicas. 1999. p. 16-44.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
79
SOBHANI, I. et al. Effect of anal epidermoid cancer-related viruses on the dendritic (Langerhan’s) cells of the human anal mucosa. Clin Cancer Res, v. 8, n. 9, p. 2862-2869, 2000.
SPEROFF, L.; GLASS, R. H.; KASE, N. G. Endocrinologia ginecológica. Clínica e infertilidade. 4. ed. São Paulo: Manole. cap 3. 1991. p. 103-131.
TAVASSOLI, F. A.; DEVILEE, P. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs: World Health Organization classification of tumours. Lyon: International Agency for Research on Cancer Press. 2003, 482 p.
UCHIMURA, N. S. Alterações das células de Langerhans e sua relação com lesão histopatológica do colo uterino por Papilomavirus Humano em paciente com captura híbrida positiva. 2002. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. São Paulo.
UCHIMURA, N. S. et al. Behavioral factors and changes in the number of Langerhans’ cells. RBGO, v. 26, n. 4, p. 2898-294, 2004.
VISCIDI, R. P.; SHAH, K. V. Immune response to infections with human papillomaviruses. In: QUINN, T. C.; GALLIN, J. I; FAUCI, A. S. Advances in host defense mechanisms. New York: Raven Press, 1992.
WEIBEL, E. R. Stereological methods: practical methods for biological morphometry. Toronto: Academic Press. 1979. v. 1.
WEISS, G. N.; SANDERS, M.; WESTBROOK, K. C. The distribution and density of Langerhans cells in human prepuce: site of a diminished immune response? Israel J Med Sci, v. 29, n. 1, p. 1993.
WELLS, M. et al. Epithelial tumours. In: TAVASSOLI, F. A.; DEVILEE, P. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs: World Health Organization classification of tumours. Lyon: International Agency for Research on Cancer Press. 2003, p. 270.
WIELAND, U.; PFISTER, H. Papilomavírus em Patologia Humana: epidemiologia, patogênese e papel oncogênico. In: GROSS, G. E.; BARRASSO, R. Infecção por Papilomavírus Humano – Atlas Clínico de HPV. São Paulo: Editora Artes Médicas Sul Ltda, 1999. p.1-18.
WIRA, C. R. et al. Innate and adaptive immunity in female genital tract: cellular responses and interactions. Immunol Rev, v. 206, p. 306-335, 2005.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
80
WRIGHT, T. C.; KURMAN, R. J.; TELINDE, R. W. Pre cancerous legions of the cervix. In: KURMAN, R. J.; TELINDE, R. W. Blaustein’s pathology of the female genital tract. New York, 2001. p. 253-324.
ZHANG, S. R. Langerhans cells in laryngeal carcinoma in relation to prognosis. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, v. 27, n. 5, p. 297-298, 1992.
Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in
situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica
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9 APÊNDICES
9.1 Apêndice 1 - Protocolo experimental
PESQUISA DE CÉLULAS DE LANGERHANS (CL) DADOS DE IDENTIFICAÇÃO: REGISTRO: IDADE: VIDA SEXUAL sim ( ) não ( ) Gestante sim ( ) não ( ) TIPO DE ESPÉCIME: Biópsia ( ) Histerectomia ( ) Exame histológico e conclusões: ( ) Epitélio escamoso normal ( ) Eversão com metaplasia escamosa ( ) Cervicite discreta ( ) NIC 3 em superfície ( ) NIC 3 em superfície e glândula ( ) NIC 3 em glândula ( ) Coilocitose ( ) Mitoses ( ) Mitoses atípicas Foto HE: ( ) Sim ( ) Não Exame imuno-histoquímico – S100: Campo mais representativo inclui: ( ) NIC 3 em superfície ( ) NIC 3 em superfície e glândula ( ) NIC 3 em glândula ( ) Área de transição normal/NIC 3 ( ) Epitélio escamoso normal ( ) Zona de transformação / epitélio escamoso normal
AP Nº _______
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Foto S100: ( ) Sim ( ) Não Morfometria: Grade de Weibel Medida: 10 x 10 mm Limite da grade excluído: superior e lateral esquerdo
Número de campos avaliados: 10 campos serão escolhidos (os campos mais celulares identificados no aumento 50 x, seguindo-se a contagem ao longo do fragmento, no aumento de 400 x). Critério: Serão contadas apenas as células de Langerhans representadas pelo corpo celular. Os prolongamentos citoplasmáticos (dendritos) não serão incluídos na contagem. Início da contagem – campo escolhido ( ) Contagem a partir de um dos bordos ( ) Contagem a partir da transição normal/NIC 3 ( ) Contagem a partir da zona de transformação
Nº de campos
Nº de quadrículos ocupados pelo epitélio
escamoso
Área ocupada pelo epitélio escamoso
Nº de células de Langerhans
Nº células/mm²
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
Média Desvio-padrão
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9.2 Apêndice 2 – Aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba
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