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Módulo 3

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

Identificação de isolados de Enterobacteriaceae

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3.1. Caracterização das Enterobacteriaceae

As Enterobacteriaceae são uma família de bacilos Gram-negativos de muito

ampla distribuição na natureza. Podem encontrar-se na água, solo, plantas e, como o

nome indica, no tracto gastro-intestinal dos animais de sangue quente (incluindo o

Homem). A família Enterobacteriaceae contém mais de 100 espécies de bactérias. As

Enterobacteriaceae que fazem parte da microflora normal do tracto gastro-intestinal

designam-se por coliformes. Os membros da família Enterobacteriaceae são bacilos

Gram-negativos, não esporulados, relativamente pequenos. Quando móveis, possuem

falgelos peritriquiais. Algumas têm cápsulas. A resistência aos antibióticos é comum

entre os membros desta família. Fermentam um grande número de glúcidos. Os

padrões de açúcares fermentados são utilizados para diferenciá-las e classificá-las.

Algumas enterobacteriáceas são patogénicas. O factor de virulência comum a todas as

enterobacteriáceas patogénicas são as endotoxinas (lipopolissacárido, LPS). Algumas

estirpes patogénicas também produzem exotoxinas: Algumas destas exotoxinas

designam-se por enterotoxinas porque afectam especificamente o tracto gastro-

intestinal, causando diarreia e perda de fluidos. Várias espécies de enterobacteriáceas

podem causar pneumonias e infecções do tracto urinário. Também são conhecidas por

serem uma das principais causas de infecção de feridas e de infecções nosocomiais

(infecções adquiridas em ambientes hospitalares). Podem também causar bacteremia e

meningite, se as condições lhes forem propícias. Contudo, sucumbem sob a acção de

concentrações relativamente baixas dos desinfectantes comuns (cloro, p. ex.). A sua

susceptibilidade aos antibióticos é variável, existindo presentemente numerosas

estirpes resistentes. A congelação não as destrói, nem na natureza, quando presentes

na água ou em alimentos congelados que tenham sido previamente contaminados com

estes microrganismos. Por se encontrarem no tracto gastro-intestinal em número

muito elevado, a transmissão destes microrganismos faz-se normalmente pela via

fecal-oral. A causa mais frequente para que as enterobacteriáceas atinjam os alimentos

resulta de uma lavagem inadequada das mãos após contacto com material fecal ou

pela ingestão ou utilização na confecção de alimentos de água contaminada.

Entre os géneros mais significativos da família Enterobacteriaceae, contam-se

os seguintes:

Cedecea (Cedecia) – tem 3 espécies associadas a infecções humanas e que geralmente

causam bacteremia.

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Citrobacter – é um género próximo da Salmonella, que é o agente etiológico de

infecções do tracto urinário.

Edwardsiella – associado a meningites, septicemia e infecções de feridas.

Enterobacter – género próximo da Klebsiella, que também causa infecções

semelhantes. A espécie mais frequente é a E. cloacae, que apresenta muitas vezes

resistências aos antibióticos.

Escherichia – este género contém uma só espécie, a E. coli. Durante muitos anos,

pensou-se que não existiam estirpes patogénicas de E. coli. Este microrganismo é um

dos elementos predominantes da microflora intestinal e é utilizado como indicador de

contaminação fecal das águas e alimentos. Como a maior parte da investigação em

biologia molecular e tecnologia do DNA recombinante foi feita utilizando E. coli,

sabe-se muito mais sobre este organismo do que sobre qualquer outro. A E. coli

possui a capacidade de reproduzir-se a uma taxa astronómica. Se as condições fossem

as ideais, uma só célula de E. coli poderia originar em três dias uma população com

uma massa superior à do planeta Terra. Esta bactéria pode duplicar de número a cada

15 minutos, embora em geral o faça apenas a cada duas horas. A maior parte das

estirpes de E. coli são inofensivas, mas existem várias estirpes que produzem toxinas

que causam diarreias com diversos graus de gravidade. Uma destas estirpes, a E. coli

O157:H7 (E. coli da Colite Hemorrágica) causa anemia hemolítica aguda e disfunção

renal. Pior ainda – é resistente a muitos antibióticos: tetraciclina, sulfonamida,

estreptomicina e cloranfenicol.

A E. coli O157:H7 é uma mutante que foi descoberta em 1982 e da qual se

conhecem pelo menos 62 subtipos até ao presente. A toxina que esta bactéria produz e

liberta ainda não foi suficientemente estudada, mas como a bactéria faz parte da

microflora natural do gado, pensa-se que o seu comportamento patogénico poderá ter

resultado do abuso dos antibióticos na produção animal. É particularmente perigosa

para as crianças, mas nos casos extremos até mesmo os adultos podem desenvolver

uma disfunção chamada púrpura trombótica trombocitopénica, em que o sangue perde

a capacidade de coagular e começa a escorrer pela boca. Estes casos são fatais.

Certas outras estirpes de E. coli designam-se por E. coli enterotoxigénica

(ETEC) e produzem enterotoxinas que funcionam de forma semelhante à do bacilo da

cólera. Estas estirpes são a causa mais comum de diarreias infecciosas a nível

mundial. As infecções por estas estirpes de E. coli são muito comuns entre os

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viajantes, que podem adquiri-las a pelo consumo de carne mal passada, leite não

pasteurizado ou mesmo nadando em águas contaminadas.

Ewingella – género associado a septicemia, infecções de feridas e infecções do tracto

urinário.

Hafnia – associada a bacteremia e casos de diarreia.

Klebsiella – causa pneumonia primária em idosos que já sofrem de outras doenças

como bronquite crónica, diabetes ou alcoolismo. É também uma causa frequente de

septicemia, infecções do tracto urinário e de feridas.

Kluyvera – associada à infecção das feridas de ocorrência frequente em pessoas que

sofrem de diabetes.

Proteus, Providencia e Morganella – são grupos bacterianos muito próximos uns dos

outros. As bactérias destes géneros encontram-se geralmente em águas, solos, esgotos

e no tracto gastro-intestinal do Homem e dos animais. São uma causa frequente de

infecções do tracto urinário e infecções de feridas. Dez por cento das infecções

nosocomiais são atribuíveis a estas bactérias.

Salmonella – é uma espécie muito importante dentro do género Salmonella. Encontra-

se associada a gastroenterites, febres entéricas (febre tifóide, p. ex.) e osteomielites.

Shigella – tem quatro serovariedades responsáveis por infecções humanas associadas

a doenças intestinais com elevada taxa de mortalidade.

Serratia – a espécie mais frequente é a S. marcescens, que produz colónias de

pigmentação vermelha quando cresce à temperatura ambiente. Durante muito tempo,

pensou-se que não era patogénica, mas sabe-se hoje em dia que pode causar

pneumonia, cistite e outras infecções. É uma bactéria em que as resistências a

antibióticos são frequentes, pelo que o tratamento das infecções poderá ser difícil.

Tatumella – associada a bacteremia e a infecções do tracto urinário.

Yersinia – é conhecida por ser o género de microrganismos a que pertence a bactéria

que causa a peste bubónica.

3.2. Características morfológicas empregues na identificação de

Enterobacteriaceae

3.2.1. Gram

As Enterobacteriaceae são, por definição, bacilos Gram-negativos.

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3.2.2. Mobilidade

A mobilidade bacteriana pode se detectada por observação microscópica

directa, colocando uma gota de meio de cultura numa lâmina para microscopia ,

cobrindo-a com uma lamela e observando-a ao microscópio. A microscopia de

contraste de fase dá bons resultados para este fim. Esta técnica é mais usada para

espécies que não crescem bem em meios sólidos. No caso da Pseudomonas

aeruginosa, o emprego de meios semi-sólidos não vai produzir bons resultados

porque, embora esta bactéria seja móvel, não consegue crescer longe da zona da

picada, onde há contacto com a atmosfera e a concentração de oxigénio é elevada.

Neste caso, é aconselhável recorrer a técnicas microscópicas. Não é o caso das

Enterobacteriaceae, pelo que para detectar a mobilidade deste grupo bacteriano se

recorre normalmente ao crescimento em meios semi-sólidos.

Os meios empregues para detectar a mobilidade contêm concentrações de agar

que não excedem os 0,4%, porque concentrações mais elevadas produzem géis

demasiado firmes para que os microrganismos se possam deslocar livremente

neles. Muitas vezes, empregam-se meios como o SIM (Sulfuretos-Indol-

Mobilidade) para detectar a mobilidade. Como estes meios já de si apresentam um

carácter ligeiramente turvo, pode tornar-se difícil a visualização do crescimento.

Para facilitar a visualização, podem incorporar-se sais de tetrazólio no meio. Os

sais de tetrazólio são incolores, mas transformam-se em formazan, que é

vermelho, em resultado das condições redutoras que advêm do crescimento

microbiano. Assim, a zona onde ocorre o crescimento microbiano encontra-se

marcada a vemelho. Contudo, a presença destes sais pode inibir algumas bactérias

fastidiosas.

Dentre as Enterobacteriaceae, as espécies dos géneros Shigella e Klebsiella

são caracteristicamente móveis. A detecção da mobilidade nas enterobacteriáceas

faz-se a 35ºC, com excepção da Yersinia enterocolitica, em que a produção de

proteína flagelar é mais rápida para temperaturas mais baixas. Neste caso, faz-se a

detecção da mobilidade a 22ºC.

3.3. Meios selectivos e diferenciais para Enterobacteriaceae

Os meios geralmente empregues para o isolamento das Enterobacteriaceae são

meios diferenciais e/ou selectivos em que o carácter diferencial advém da presença de

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lactose e de um sistema indicador de pH, tal como o vermelho neutro ou o azul de

bromotimol. A natureza selectiva deriva da incorporação de inibidores do crescimento

doutros microrganismos, como os sais biliares, o cristal violeta ou o verde brilhante.

A presença de crescimento e o tipo de colónia podem já fornecer ao analista uma ideia

sobre o tipo de microrganismo presente.

3.3.1. Agar de McConkey

O agar de mMcConkey é um meio diferencial para o isolamento de

Enterobacteriaceae e bacilos Gram-negativos com elas relacionados. Os sais biliares e

o cristal violeta que o meio contém inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas

e de alguns Gram-negativos fastidiosos. A lactose é o único glúcido adicionado ao

meio. As bactérias que fermentam a lactose produzem, neste meio, colónias que têm

diversas tonalidades de vermelho, devido à viragem do indicador vermelho neutro

(que apresenta cor vermelha quando pH<6,8) que é causada pela produção de uma

mistura de ácidos orgânicos. As colónias das bactérias que não fermentam a lactose

apresentam-se transparentes ou incolores.

As bactérias que fermentam fortemente a lactose, como as espécies dos

géneros Escherichia, Klebsiella e Enterobacter, produzem colónias vermelhas

rodeadas por um halo de bílis precipitada. As bactérias que apresentam uma

fermentação retardada ou fraca da lactose (Citrobacter, Providencia, Serratia, e

Hafnia) podem apresentar-se incolores após 24h de incubação e ligeiramente rosadas

se a incubação for prolongada até às 48h. As espécies de Proteus, Edwardsiella,

Salmonella e Shigella originam, salvo raras excepções, colónias incolores ou

transparentes.

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Fig. W. Enterobacteriaceae em meio de Mc Conkey Agar: fermentadoras da lactose à esquerda, não

fermentadoras da lactose à direita.

3.3.2. Violet Red Bile Agar

Este agar é utilizado para a pesquisa de coliformes em alimentos, leite, água e

outros materiais semelhantes. É um meio selectivo que detecta o crescimento dos

coliformes através da propriedade que estes possuem de fermentar a lactose. As

colónias de coliformes acidificam o meio, como resultado da fermentação da lactose,

pelo que as suas colónias apresentam cor vermelha, que é a cor ácida o indicador de

pH que o meio contém (vermelho neutro. Para além disso, estas colónias têm à volta

um halo de bílis precipitada. O cristal violeta e os sais biliares do meio inibem o

crescimento de microrganismos Gram-positivos.

Fig. Z. Enterobacteriaceae em Violet Red Bile

Glucose Agar

3.3.3. Hektoen Enteric Agar

O Hektoen Agar foi formulado para permitir uma boa taxa de recuperação de

Salmonella e Shigella a partir de amostras com contaminações pesadas por outros

tipos de microrganismos (p. ex., material fecal). A elevada concentração de sais

biliares inibe o crescimento de todas as bactérias Gram-positivas e retarda o

crescimento de muitas das estirpes de coliformes. O meio contém sucrose e lactose, a

partir das quais pode verificar-se produção de ácidos. Quando isto sucede, o azul de

timol vira para a sua cor ácida – amarelo. O meio possui ainda tiossulfato de sódio,

que funciona como fonte de enxofre para a produção de H2S. A formação de H2S é

detectada pelo indicador citrato férrico de amónio, que é bastante sensível. O citrato

férrico de amónio reage com o H2S produzindo um precipitado de cor negra.

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Neste meio, as bactérias que fermentam rapidamente a lactose (como a E. coli)

são ligeiramente inibidas, produzindo colónias de cores que variam entre o laranja

vivo e o rosa salmão. As colónias de Salmonella são azuis-esverdeadas, tipicamente

com o centro de cor negra devido à produção de H2S. A Shigella apresenta colónias

de um verde mais intenso do que o da Salmonella, com uma cor que se vai esbatendo

em direcção à periferia da colónia. As estirpes de Proteus também sofrem alguma

inibição. Se conseguirem produzir colónias, estas são pequenas, transparentes, e mais

luzidias ou aquosas do que as da Salmonella e da Shigella.

Fig. Y. E. coli e Shigella em Hektoen Agar.

3.3.4. Brilliant Green Agar

O Agar de Verde Brilhante (Brilliant Green Agar) é um meio selectivo que se

utiliza para o isolamento de espécies do género Salmonella. O corante verde brihante

inibe as bactérias Gram-positivas e a maioria das outras Gram-negativas. O outro

corante presente no meio, o vermelho de fenol, serve de indicador de pH para detectar

a produção de ácidos resultante da fermentação da glucose ou da sucrose.

Fig. X. E. coli e Salmonella em Brilliant Green Agar.

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3.3.5. Kligler Iron Agar

O Kligler Iron Agar (ou o Triple Sugar Iron Agar) é especialmente importante

para a identificação dos bacilos Gram-negativos recuperados a partir de meios de

cultura de isolamento primário. Os padrões de reacção nestes meios fazem parte de

muitos dos esquemas de identificação das Enterobacteriaceae e também constituem

um valioso instrumento de confirmação para o controlo de qualidade dos

procedimentos e meios de cultura empregues para o isolamento primário.

O agar de açúcares duplos foi descrito pela primeira vez em 1911, por Russell,

que o empregou para detectar a produção de ácido e de gás a partir da glucose e da

lactose num único meio de cultura. Kligler modificou a fórmula em 1917,

adicionando-lhe o sulfato ferroso e o tiossulfato de sódio, para permitir detectar a

produção de H2S. As fórmulas do Kliger Iron Agar (KIA) e do Triple Sugar Iron Agar

(TSI) são idênticas, só que o TSI contém 10g de sucrose por litro de meio, para além

da glucose e da lactose. A fórmula do KIA é a seguinte:

Extracto de carne 3g

Extracto de levedura 3g

Peptona 15g

Proteose peptona 5g

Lactose 10g

Glucose 1g

Sulfato ferroso 0,2g

Cloreto de sódio 5g

Tiossulfato de sódio 0,3g

Agar 12g

Vermelho de fenol 0,024g

Água destilada 1 l

pH final = 7,4

Há algumas considerações importantes a ter em conta no estudo da fórmula do

KIA. A incorporação de quatro derivados proteicos (extracto de carne, extracto de

levedura, peptona e proteose peptona) torna o meio muito rico do ponto de vista

nutritivo e a ausência de inibidores faz com que este meio permita o crescimento de

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praticamente todas as bactérias – são excepções as muito fastidiosas e os anaeróbios

obrigatórios. Por este motivo, só se pode utilizar o KIA (ou o TSI) para testar as

características de culturas puras, que já foram submetidas a isolamento primário e a

purificação. A lactose encontra-se presente numa concentração que é 10 vezes

superior à da glucose. O sulfato ferroso é um indicador um pouco menos sensível do

que outros que também são empregues em bacteriologia para a detecção da produção

de H2S pelas bactérias. Por isso, podem verificar-se discrepância entre os resultados

obtidos no KIA e os obtidos, por exemplo, no meio de SIM. O vermelho de fenol é

um indicador de pH que apresenta cor vermelha para valores de pH inferiores a 6,8.

Como o pH do meio não inoculado se encontra tamponizado para 7,4, são necessárias

quantidades relativamente pequenas de ácido para virar a cor do indicador.

Os princípios bioquímicos subjacentes às reacções observadas no KIA ou no

TSI estão ilustrados na fig. 1. É de notar que este agar se coloca em rampas. Esta

configuração resulta na existência de duas câmaras de reacção dentro do mesmo tubo.

A porção da rampa, exposta em toda a sua superfície ao oxigénio, é aeróbia. A porção

inferior, que se designa por fundo, encontra-se protegida do ar, sendo por isso

relativamente anaeróbia. Ao preparar o meio, é importante manter comprimentos

equivalentes da rampa e do fundo, para que este efeito de câmara dupla se verifique

efectivamente. Cada uma das zonas deverá apresentar um comprimento de

aproximadamente 3 cm.

Os tubos de KIA ou de TSI inoculam-se com o fio de inoculação. Toca-se o

crescimento duma cultura pura ou uma colónia bem isolada obtida num meio de

isolamento primário com o fio e faz-se uma picada na zona do fundo do tubo, que

chegar quase ao fundo (3 – 5 mm acima do fundo). Ao remover o fio, procede-se à

inoculação da rampa por estrias superficiais. A incubação é feita a 35ºC, por 18 – 24h.

As reacções que podem verificar-se no KIA são:

Rampa alcalina/fundo alcalino

Não ocorreu fermentação dos glúcidos. Característica de bactérias não fermentativas,

tais como a Pseudomonas aeruginosa.

Rampa alcalina/fundo ácido

A glucose foi fermentada. A lactose não foi fermentada. Característica de espécies

que não fermentam a lactose, como a Shigella.

Rampa alcalina/fundo ácido com enegrecimento

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A glucose foi fermentada. A lactose não foi fermentada. Ocorreu produção de H2S.

Característica de bactérias que não fermentam a lactose e produzem H2S, como as

espécies dos géneros Salmonella, Arizona, Citrobacter e alguns Proteus.

Rampa ácida/fundo ácido

A glucose e a lactose foram fermentadas. Característica de coliformes fermentadores

da lactose, como a E. coli e o grupo Klebsiella – Enterobacter.

A porção do tubo correspondente à rampa, que se encontra exposta ao

oxigénio atmosférico, têm propensão para se tornar alcalina, devido à descarboxilação

aeróbia dos péptidos e aminoácidos que provêm da peptona que o meio contém.

Formam-se assim aminas a partir dos aminoácidos na rampa, reacções estas que são

aceleradas pelo crescimento microbiano. Por este motivo, a rampa tem tendência para

permanecer alcalina (de cor vermelha). Na zona profunda do tubo, onde há pouco

oxigénio, a degradação oxidativa dos aminoácidos é mínima. Na verdade, pode

mesmo verificar-se a produção de pequenas quantidades de ácido, detectáveis pelo

aparecimento duma cor amarelada.

Assim, como mostra a fig. 1, se não houver fermentação dos glúcidos, a

produção de aminas na rampa, juntamente com a tamponização para um pH

ligeiramente alcalino, vão produzir uma cor vermelha, que se espalha por todo o meio.

As bactérias que dão este tipo de reacção designam-se por não fermentativas. A

produção duma reacção negativa no KIA ou no TSI é uma das mais importantes

indicações iniciais de que o microrganismo em causa não é uma Enterobacteriaceae.

Se o KIA for inoculado com um microrganismo que fermenta a glucose, mas

não a lactose, só irá produzir-se uma quantidade muito pequena de ácido, dada a baixa

concentração de glucose (0,1%) que o meio contém. Inicialmente, durante as

primeiras horas de incubação, até mesmo quantidades tão pequenas de ácido podem

bastar para virar a cor do meio, tanto na rampa como no fundo, para amarelo.

Contudo, após mais algumas horas de incubação a rampa reverterá à cor alcalina,

devido à degradação dos aminoácidos por acção das bactérias, em presença do

oxigénio. Ao fim das 18 – 24 h de incubação, já toda a rampa apresentará cor alcalina

(vermelha). No fundo do tubo, contudo, a formação de aminas não é suficiente para

contrabalançar a produção de ácido e o fundo permanece ácido (amarelo). Assim, uma

reacção rampa alcalina/fundo ácido no KIA (ou no TSI) é um indicador inicial

importante de que o microrganismo em questão não fermenta a lactose.

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As bactérias que utilizam a lactose produzem quantidades relativamente

abundantes de ácido no KIA; porque a lactose está presente numa concentração muito

mais elevada do que a glucose (10:1). Esta quantidade de ácido já é suficiente para

contrabalançar a produção de aminas que se verifica na rampa. Por isso, todo o tubo

vai virar para amarelo. Uma reacção rampa ácida/fundo ácido indica que o

microrganismo fermenta a lactose.

Como o H2S é um gás incolor, tem que se adicionar ao meio um indicador que

permita a sua detecção. O tiossulfato de sódio é o composto mais frequentemente

empregue para fornecer às bactérias os átomos de enxofre de que necessitam para

produzirem H2S. Os sais de ferro (sulfato ferroso e citrato férrico de amónio) são os

indicadores mais comuns para a detecção do H2S. O sulfureto de hidrogénio produz

com estes sais um precipitado negro de sulfureto ferroso. Como a produção de H2S só

se verifica em ambiente ácido, o enegrecimento correspondente no KIA ou TSI

aparece frequentemente apenas no fundo do tubo, especialmente quando se trata de

bactérias que não fermentam a lactose. Assim, se o fundo se apresentar enegrecido,

deverá ser lido como ácido, mesmo que a cor amarela não seja visível por se encontrar

obscurecida pelo precipitado de sulfureto ferroso. O KIA e o TSI são menos sensíveis

do que o SIM (Meio para Sulfuretos-Indol-Mobilidade) para a detecção da produção

de H2S. Alguns microrganismos produzem o H2S em quantidades muito pequenas,

que poderão não ser evidenciadas no KIA, mas que poderão resultar num

enegrecimento distinto do SIM.

3.4. Testes para a identificação de Enterobacteriaceae

3.4.1. Teste da citocromo oxidase

Os citocromos são ferro-proteínas hémicas que constituem o último elo da cadeia

respiratória na respiração anaeróbia. Transferem electrões (hidrogénio) para o

oxigénio, com produção de água. Encontram-se em microrganismos aeróbios,

microaerófilos e anaeróbios facultativos. É um teste muito útil para a diferenciação

inicial de Enterobacteriaceae (sempre negativas) e de outros Gram-negativos como

Pseudomonas, Neisseria ou Campylobacter (positivas).

Para fazer o teste da citocromo oxidase utilizam-se certos corantes, como o di-

hidrocloreto de p-tetrafenileno diamina, que vão receber os electrões da cadeia

respiratória, substituindo assim o oxigénio. No estado reduzido, o corante é incolor.

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Contudo, em presença da citocromo oxidase e de oxigénio atmosférico, oxida-se,

originando um composto de cor azul, o azul de indofenol.

Controlo positivo: Pseudomonas aeruginosa

Controlo negativo: Escherichia coli

Fig. 4.1. Teste da oxidase com as Baticdent Oxidase Test Strips. A primeira fita da esquerda mostra um

resultado negativo, a terceira um resultado positivo.

3.4.2. Teste da redução de nitratos

A capacidade de um microrganismo reduzir nitratos a nitritos é uma característica

importante para a identificação e diferenciação de espécies em muitos grupos de

microrganismos. Todas as Enterobacteriaceae, excepto certos biótipos de

Enterobacter e Erwinia, apresentam redução dos nitratos. O teste também é útil na

identificação de membros dos géneros Haemophilus, Neisseria e Branhamella.

Os organismos que reagem positivamente a este teste têm a capacidade de retirar

oxigénio aos nitratos, produzindo nitritos, de acordo com a equação:

NO3- (nitrato) + 2e

- + 2H NO2 (nitrito) + H2O

Detecta-se a presença de nitritos no meio por adição de -naftil amina e ácido

sulfanílico que, em presença de nitrito vão dar origem a um corante diazónioco

vermelho, a p-sulfobenzeno-azo--naftil amina.

Controlo positivo: Escherichia coli

Controlo negativo: Acinetobacter calcoaceticus, var anitratus

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Fig. 4.2. Resultados do teste da redução de nitratos. No tubo 1, resultado negativo, no

tubo 2 resultado positivo. O resultado negativo deve ser confirmado pela adição de

zinco em pó (tubos 3 e 4).

3.4.3. Teste do o-nitrofenil galactósido (ONPG)

O orto- nitrofenil galactósido (ONPG) é um composto estruturalmente semelhante

à lactose. A única diferença entre as duas moléculas reside na substituição da glucose

por ortonitrofenil (fig. 1).

Quando hidrolisado por acção do enzima -galactosidase, o ONPG origina dois

resíduos, galactose e orto-nitrofenol. O ONPG é incolor, mas o o-nitrofenol é

amarelo, o que permite visualizar a hidrólise.

As bactérias que fermentam a lactose possuem dois enzimas, lactose permease e

-galactosidase, para o fazer. A permease é necessária para que a molécula de lactose

possa entrar na célula, enquanto que a -galactosidase serve para cindir a ligação

galactosídica, com produção de glucose e galactose. As bactérias que não fermentam

a lactose são desprovidas de ambos os enzimas e, nos testes de fermentação, não são

capazes de produzir ácido a partir da lactose. Algumas espécies bacterianas podem

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aparentar não fermentarem a lactose porque não têm a permease, têm apenas a -

galactosidase. Estas bactérias conseguem clivar o OMPG e, portanto, dão reacções

positivas a este teste. Nos testes de fermentação, é necessário aguardar mais tempo

para que estas bactérias dêem resultados positivos (reacção retardada) pelo que o teste

do ONPG permite obter uma identificação rápida nestes casos.

Controlo positivo: Escherichia coli

Controlo negativo: Proteus spp.

Fig. 4.3. Teste do ONPG. O tubo da esquerda mostra um resultado positivo, o da

direita um resultado negativo.

3.4.4. Testes IMViC

Um dos mais antigos grupos de testes empregues para a identificação de bacilos

entéricos foram as reacções IMViC. Esta sigla significa Indol, Methyl Red, Voges-

Proskauer e Citrato, que são um conjunto de características diferenciais inicialmente

empregues por sanitaristas e epidemiologistas para detectar contaminações cruzadas

de águas e alimentos com esgotos ou material fecal.

a. Teste do indol

O indol é um dos produtos da degradação metabólica do aminoácido triptofano.

As bactérias que possuem o enzima triptofanase podem hidrolisar e desaminar o

triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amónio. A produção de indol é uma

característica importante para a identificação de muitas espécies de microrganismos,

sendo particularmente útil para a distinção da Escherichia coli (positiva) dos membros

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do grupo Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia (que são, na sua maioria,

negativos).

O teste do indol baseia-se na formação de um complexo de cor vermelha pela

reacção do indol com o grupo aldeídico do p-dimetil aminobenzaldeído. Este

composto é o princípio activo dos reagentes de Kovacs e de Ehrlich que se utilizam

para pesquisar a presença de indol nos meios de cultura. O meio a empregar para este

teste deverá ser rico em triptofano. Na prática, usam-se muitas vezes meios que

permitem fazer um conjunto de testes duma vez só, como o meio de SIM (Meio para

Sulfuretos, Indol e Mobilidade). A presença de indol é visualizada pelo

desenvolvimento duma cor fúcsia viva na interface entre o reagente e o caldo alguns

segundos após a adição do reagente.

Controlo positivo: Escherichia coli

Controlo negativo: Klebsiella pneumoniae

Fig. 4.4. Teste do Indol. A – resultado positivo; B – resultado negativo

b. Teste do Vermelho de Metilo (Methyl Red)

O vermelho de metilo é um indicador de pH com um intervalo de viragem situado

entre os 6,0 (amarelo) e os 4,4 (vermelho). O pH a que o vermelho de metilo detecta

os ácidos é consideravelmente mais baixo do que o pH para o qual os outros

indicadores utilizados em bacteriologia o fazem. Por isso, para produzir alteração da

cor do meio, o microrganismo em estudo tem que produzir quantidades elevadas de

ácidos a partir do glícido que lhes serve de substrato.

Este teste é então um teste qualitativo para a produção de ácidos, requerendo que

o microrganismo produza quantidades apreciáveis de ácidos (láctico, acético, fórmico)

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a partir da glucose, por fermentação ácido-mista, para dar um resultado positivo.

Como, numa fase inicial da incubação, muitas espécies de Enterobacteriaceae poderão

produzir quantidades suficientes de ácidos para virar a cor do indicador, só se

consideram positivos os resultados em que esta viragem se mantenha mesmo após

incubação prolongada (48 – 72 h).

O meio mais empregue para este teste é o caldo de MR-VP, na formulação de

Clark e Lubs.

Controlo positivo: Escherichia coli

Controlo negativo: Enterobacter aerogenes

Fig. 4.5. Teste do vermelho de metilo. Da esquerda para a direita: negativo, não

inoculado, e positivo.

c. Teste de Voges-Proskauer

O nome deste teste deriva do nome de dois microbiologistas do início do século

XX, que foram os primeiros a observar a reacção em que se baseia o Voges-

Proskauer. O teste detecta a presença no meio de um composto intermediário do

metabolismo bacteriano, o acetilmetil carbinol (fig. 2).

O ácido pirúvico, que é um composto fulcral produzido durante a degradação

fermentativa da glucose, pode ser posteriormente metabolizado segundo diversas vias.

Uma destas vias resulta na produção de acetilmetil carbinol, que é um composto

neutro. Em presença de oxigénio atmosférico e de hidróxido de potássio a 40%, o

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acetilmetil carbinol é convertido em diacetilo. Adiciona-se -naftol para servir de

catalisador e produzir um complexo de cor vermelha. Esta via metabólica é

característica dos membros dos grupos Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia.

Controlo positivo: Enterobacter aerogenes

Controlo negativo: Escherichia coli

Fig. 4.6. Resultados do teste de Voges-Proskauer.

d. Citrato

O citrato de sódio é um sal do ácido cítrico, composto orgânico que é um dos

metabolitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Algumas bactérias podem obter

energia de outra forma que não a fermentação de glúcidos. Podem, por exemplo,

utilizar o citrato como fonte exclusiva de carbono e energia. Esta característica é

muito importante para a identificação de Enterobacteriaceae.

Detecta-se a utilização do citrato pela bactéria testada através da produção de

produtos metabólicos secundários alcalinos. No meio, há citrato de sódio como fonte

exclusiva de carbono e fosfato de amónio como fonte exclusiva de azoto. As bactérias

que utilizam o citrato como fonte de azoto também podem utilizar o sal de amónio

com libertação de NH4+, o que conduz a uma alcalinização do meio. Existe no meio

um indicador de pH, o azul de bromotimol, que assume cor amarela para pH<6,0 e

azul para pH>7,6. O resultado positivo é visualizado pela formação de uma cor azul

intensa após 24 – 48 h de incubação.

Controlo positivo: Enterobacter aerogenes

Controlo negativo: Escherichia coli

39

Fig. 4. 7. Resultados do teste do citrato.

3.4.5. Urease

A ureia é uma diamida com a fórmula:

Todas as amidas são facilmente hidrolisadas, libertando amónio e dióxido de

carbono.

Muitas espécies de microrganismos são capazes de hidrolisar a ureia, por

possuírem a enzima urease:

O amónio formado origina posteriormente carbonato de amónio, o que vai resultar

numa alcalinização do meio, que é detectada pela mudança de cor do indicador

vermelho de fenol.

Os microrganismos que hidrolisam rapidamente a ureia, dão reacções positivas

(cor vermelha) após 1 – 2h de incubação. Os microrganismos menos activos podem

necessitar de 3 ou mais dias de incubação antes de produzirem alcalinização suficiente

para virar a cor do indicador. No primeiro grupo contam-se as espécies dos géneros

Proteus – Morganella, no segundo, as Klebsiella.

Controlo positivo: Proteus

Controlo positivo (fraco): Klebsiella

2 NH3 + CO2 CH4N2O + H2O

urease

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Controlo negativo: Escherichia coli

Fig. 4.8. Resultados do teste da urease. Da esquerda para a direita, negativo, positivo

(24 h), positivo (4 h) e não inoculado.

3.4.6. Pesquisa de descarboxilases

As descarboxilases são um grupo de enzimas que atacam o grupo COOH dos

aminoácidos, formando aminas, de reacção alcalina. Esta reacção, que se designa por

descarboxilação, liberta CO2 como produto secundário. Cada descarboxilase é

específica para um dado aminoácido. Os aminoácidos que normalmente se testam

para identificar Enterobacteriaceae são a lisina, ornitina e arginina. A descarboxilação

da lisina dá origem à cadaverina. As reacções correspondentes da ornitina e da

arginina originam, respectivamente, putrescina e citrulina. No último caso

(degradação da arginina) o enzima interveniente é uma di-hidrolase e não uma

descarboxilase e o mecanismo da reacção é diferente: inicialmente, ocorre a remoção

de um grupo NH2, seguidamente verifica-se a conversão da citrulina e orinitina e é

esta última que sofre descarboxilação, convertendo-se em putrescina.

O meio mais utlizado para a pesquisa de actividade das descarboxilases é o meio

basal de Moeller. O aminoácido que se pretende testar só é adicionado ao meio basal

após a esterilização, sob a forma duma solução aquosa que foi esterilizada por

filtração, imediatamente antes da inoculação com o microrganismo em estudo.

Simultaneamente, prepara-se um tubo de controlo, só com meio basal (sem

aminoácido), que também é inoculado. Como a descarboxilação é favorecida em

condições de anaerobiose, cobre-se a superfície do meio contido em ambos os tubos

com óleo mineral. Durante as fases iniciais da incubação, ambos os tubos vão mudar

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de cor (passam de roxo a amarelo) devido à fermentação das quantidades vestigiais de

glucose presentes no meio. Se ocorrer descarboxilação do aminoácido, formam-se

aminas alcalinas e o meio retoma a sua cor inicial (roxo).

Controlos:

Aminoácido Controlo positivo Controlo negativo

Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella spp.

Arginina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

Fig. 4.9. Resultados do teste da ornitina descarboxilase.

3.4.7. Pesquisa de fenilalanina desaminase

A fenilalanina é um aminoácido que origina, ao perder o grupo amina, um ceto-

ácido, o ácido fenilpirúvico. Dentre as Enterobacteriaceae, apenas os membros do

género Proteus, Morganella e Providencia possuem o enzima (desaminase)

necessária para esta conversão.

O teste da fenilalanina baseia-se na detecção do ácido fenilpirúvico no meio de

cultura, após crescimento do microrganismo em estudo. O teste é positivo se aparecer

uma cor verde após a adição de uma solução a 10% de cloreto férrico.

Controlo positivo: Proteus spp.

Controlo negativo: Escherichia coli

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Fig. 4.10. Resultados do teste da fenilanina desaminase. O tubo da esquerda é

negativo, o da direita positivo.

3.4.8. Identificação de espécies

Para a identificação de espécies de Enterobacteriaceae é necessário analisar um

número bastante elevado de características fisiológicas (consultar Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology). Como isto pode tornar-se um trabalho moroso e

dispendioso, devido à grande quantidade de meios de cultura que são necessários,

existem alguns kits comerciais que facilitam o trabalho de identificação. O mais

utilizado para Enterobactereaceae e outros bacilos Gram-negativos é o sistema API

20E (BioMérieux). Este sistema consiste numa tira de plástico com 20 cúpulas

miniaturizadas que contêm substratos desidratados e que, depois de inoculada, se

coloca numa câmara de incubação própria, em plástico. Por acção do crescimento

bacteriano, verificam-se alterações de cor dos substratos que podem ser lidas

visualmente ou com sistemas automatizados. O padrão destas alterações de cor é

comparado com os padrões das espécies conhecidas de Gram-negativos para chegar a

uma identificação da espécie. Os substratos contidos no API 20E destinam-se aos

seguintes testes: ONPG, arginina di-hidrolase, lisina descarboxilase, ornitina

descarboxilase, citrato, H2S, urease, triptofano deaminase, indol, Voges-Proskauer,

liquefação da gelatina, e utilização dos açúcares glucose, manitol, inositol, sorbitol,

ramnose, sucrose, melibiose, amigdalina e arabinose.

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3.5. Trabalho prático – Identificação de isolados de Enterobacteriaceae

São fornecidas aos alunos culturas dos seguintes géneros bacterianos:

Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Proteus e

Pseudomonas. Para cada cultura, é necessário proceder à inoculação dos seguintes

meios de cultura:

McConkey Agar: inoculação à superfície, por estrias.

Violet Red Bile Agar: inoculação por incorporação de 1 ml de cultura diluída.

Após a inoculação, deixar que o agar solidifique e adicionar mais 4 ml de agar para

que se forme uma camada que iniba a difusão de oxigénio. Deixar solidificar esta

camada antes de inverter as placas para incubar.

Hektoen Enteric Agar: inoculação à superfície, por estrias.

Brilliant Green Agar: inoculação à superfície, por estrias.

Kligler Iron Agar: inoculação por picada + inoculação à superfície.

Ainda durante esta sessão, realizar-se-ão os seguintes testes:

Preparação de esfregaços para posteriormente corar pelo método de Gram

Oxidase (em Oxidase Strips)

Inoculação dos meios IMViC

Teste das descarboxilases

Notas sobre a inoculação dos meios IMViC:

1. VP: inocular o meio de MR-VP com uma cultura pura do organismo em estudo.

Incubar a 35ºC por 24 h um dos tubos. Retirá-lo da estufa, adicionar o reagente

para a pesquisa de acetilmetil carbinol. Agitar muito bem e deixar o tubo aberto,

para haver melhor contacto com o oxigénio atmosférico. A cor característica do

teste VP+ aparecerá 15 – 60 min após a adição do reagente. Não se deve esperar

mais de 1 h para fazer a leitura porque poderão surgir falsos positivos.

2. MR: inocular o meio de MR-VP com uma cultura pura do microrganismo em

estudo. Incubar a 35ºC por 48 – 72h. Ao fim deste tempo, adicionar 5 gotas de

solução de vermelho de metilo. Se o meio virar para amarelo, considerar positivo.

Cores alaranjadas ou vermelhas constituem resultados negativos.

3. Indol: inocular o meio de SIM por picada central. Incubar a 35ºC por 18 – 24h.

Ao fim deste tempo, examinar a linha de picada para detectar a mobilidade,

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verificar se houve enegrecimento para detectar a produção de H2S e adicionar o

reagente de Kovac para fazer a pesquisa de indol.

4. Citrato: inocular a rampa do meio com uma única estria longitudinal. Incubar a

35ºC por 24 – 48h. Considera-se que o resultado foi positivo quando ocorreu

desenvolvimento duma cor azul profunda e/ou crescimento visível ao longo da

linha de picada durante o tempo de incubação. O teste deu resultado negativo se

não tiver havido crescimento e a cor do meio se apresentar verde.