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BIOQUÍMICA I
AULAS PRÁTICAS
2º ano, 1º semestre
2013-2014
Objectivo
Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo
qualitativo e quantitativo de macromoléculas
- péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos -
Objectivo
Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo
qualitativo e quantitativo de macromoléculas
- péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos -
Metodologia de ensino:
• Realização de exercícios;
• Pesquisa e apresentação de temas relacionados com o
programa da disciplina
Temas de trabalho A. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução
(HPLC); Derivatização de aminoácidos;
2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
4. Separação de proteínas por métodos cromatográficos:
cromatografias de exclusão molecular, troca-iónica, afinidade e hidrófoba; electroforese
mono/bidimensional; focagem isoeléctrica;
5. Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas:
Métodos de Lowry, Bradford, Ácido bicinconínico (BCA) e absorção no UV;
6. Ferramentas bioinformáticas para estudo de proteínas:
PDB (Protein Data Bank), Brenda, Expasy, Molecular Viewers (Chimera; Pymol)
Temas de trabalho B. ENZIMAS
1. Utilização de ferramentas informáticas para estudo e caracterização de enzimas:
Determinação da actividade enzimática, parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas e
de enzimas alostéricas e de constantes de inibição.
C. GLÚCIDOS
1. Métodos de análise e caracterização de glúcidos:
Métodos cromatográficos; reacções de identificação (reacções de Benedict, Barfoed,
Selivanoff, Bial, Ácido múcico e Osazonas); marcha geral de identificação de açúcares.
D. LÍPIDOS
1. Métodos de análise e caracterização de lípidos:
Fraccionamento lipídico e análise qualitativa das fracções obtidas.
E. METABOLISMO INTERMEDIÁRIO
1. Metabolismo energético:
Estudo da fosforilação oxidativa; balanço energético do metabolismo glicídico e lipídico;
2. Doenças Hereditárias do Metabolismo
Calendário das aulas práticas Data
30/09 – 04/10
Prática 1
Apresentação da componente prática de Bioquímica I
Apresentação do programa da componente prática e respectiva avaliação; regras de funcionamento; organização da turma em grupos
Tema A: Aminoácidos e Proteínas
A.1 - Identificação e separação de aminoácidos; Sequenciação peptídica; Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos; Determinação do pI de aminoácidos e péptidos.
07/10 – 11/10
Prática 2
Tema A: Aminoácidos e Proteínas
A.2 - Exercícios: determinação da sequência e do pI de péptidos
A.3 - Purificação, detecção e caracterização de proteínas: Introdução.
14/10 – 18/10
Prática 3
Tema A: Aminoácidos e Proteínas
A.4 – Apresentações: Tema “Métodos cromatográficos e electroforéticos para separação e análise de proteínas”: (1) cromatografia de exclusão molecular e troca-iónica; (2) cromatografia de afinidade e hidrófoba; (3) electroforese monodimensional desnaturante; (4) electroforese bidimensional e focagem isoeléctrica.
21/10 – 25/10
Prática 4
Tema A: Aminoácidos e Proteínas
A.5 – Apresentações: Tema “Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas”: (1) Método de Lowry; (2) Método do Ácido bicinconínico BCA; (3) Método de Bradford e (4) Absorvência no ultravioleta;
A.6 - Exercícios: Utilização de curvas de calibração para determinação do teor proteico por métodos espectrofotométricos.
Calendário das aulas práticas Data
28/10 - 01/11
Prática 5
Tema A: Aminoácidos e Proteínas
A.7 – Exercícios: utilização de ferramentas Bioinformáticas para estudo de proteínas.
04/11 – 08/11
Prática 6
Tema B: Enzimas
B.1 – Exercícios: determinação de actividades enzimáticas e de parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas.
11/11 – 15/11
Prática 7
Tema B: Enzimas
B.2 - Exercícios: determinação de parâmetros cinéticos de enzimas alostéricas;
B.3 - Exercícios: determinação de constantes de inibição.
18/11 – 22/11
Prática 8
Tema C: Glúcidos
C.1 - Estrutura e função dos glúcidos: propriedades químicas e estruturais;
C.2- Apresentações: Tema “Métodos de Análise e Caracterização de Glúcidos”: (1) Provas de Benedict e Barfoed; (2) Provas do ácido múcico e de Selivanoff; (3) Prova de Bial e Prova das Ozasonas; (4) Técnicas cromatográficas.
Tema D : Lípidos
D.1 - Estrutura e função dos Lípidos: propriedades químicas e estruturais;
Calendário das aulas práticas Data
25/11 – 29/11
Prática 9
Tema D : Lípidos
D.2 – Apresentações: Tema “Métodos de extracção, separação, identificação e quantificação de lípidos”: (1) Métodos de extracção de lípidos totais e de extracção diferencial; (2) Separação e identificação de fosfolípidos por técnicas cromatográficas; (3) Métodos de doseamento de fosfolípidos; (4) Métodos de doseamento de colesterol.
Tema E : Metabolismo Intermediário
E.1 Exercícios: fosforilação oxidativa
02/12 – 06/12
Prática 10
Tema E : Metabolismo Intermediário
E.2 – Exercícios: balanço energético do metabolismo glucídico e lipídico
09/12 – 13/12
Prática 11
Tema E : Metabolismo Intermediário
E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Deficiência em PDH; (2) Deficiência em MCAD; (3) Doença de Gaucher; (4) Galactosémia clássica.
16/12 – 20/12
Prática 12
Tema E : Metabolismo Intermediário
E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Fenilcetonúria; (2) Homocistinúria clássica; (3) Deficiência em CPSI; (4) Tirosinémia tipo I
Avaliação 1. Frequência de (no mínimo) 2/3 das aulas realizadas (8 aulas).
2. Os conhecimentos adquiridos pelos alunos serão avaliados de forma contínua ao
longo do semestre. Esta avaliação terá em conta a preparação dos exercícios a realizar,
o interesse e participação nas aulas, a preparação dos Temas a apresentar e a
Avaliação final.
3. A ponderação dos vários elementos de avaliação prática será a seguinte:
a) 5% - Assiduidade (onde se inclui ausência de reparos em relação ao material exigido
para as aulas);
b) 10% - Desempenho na resolução dos exercícios apresentados (onde de se inclui o
interesse e participação nas aulas);
c) 45% - Apresentação dos Temas de Trabalho;
d) 40% - Teste.
4. A classificação final da disciplina é a média ponderada da classificação obtida no
exame teórico final (70%) e no ensino prático (30%).
A- Aminoácidos e Proteínas
1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de
alta resolução (HPLC); Derivatização de aminoácidos;
2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Elevada reactividade do Grupo –NH2 e -COOH
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Classificação de acordo com a polaridade do grupo R:
1. Não polares alifáticos
2. Não polares aromáticos
3. Polares não carregados
4. Polares carregados positivamente
5. Polares carregados negativamente
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Ninidrina:
Reage com aminas
Coloração violeta com grupos -NH2
Coloração amarelada com iminoácidos (ex:
Pro)
Elevada sensibilidade
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Ninidrina:
Reage com aminas
Coloração violeta com grupos -NH2
Coloração amarelada com iminoácidos (ex:
Pro)
Elevada sensibilidade
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
U.V.
Cloreto de Dansilo:
Reage com aminas (grupo -NH2)
Emissão de luz amarelo-esverdeada no UV
Elevada sensibilidade
TLC monodimensional
Coloração Ninidrina/UV
Suporte utilizado – em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
TLC bidimensional
Coloração Ninidrina/UV
Suporte utilizado – em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Cromatografia em coluna
A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:
Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;
Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);
Derivatização:
• Pré-coluna
• Pós-coluna
A- Aminoácidos e Proteínas
Propriedades Anfotéricas
Dador de protões
(carga +1)
Aceitador de protões
(carga -1)
(carga 0)
2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
(carga +1) (carga -1) (carga 0)
pK1- -COOH (Gly2.3) pK2 - -NH2 (Gly9.6)
2
21 pKpKpI
pI - ponto isoeléctrico
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
Péptido
(Grupos dadores/aceitadores Protões)
* *
* Apenas R dos aa:
Asp/Glu; His/Arg/Lys; Cys/Tyr
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
1. 1ª forma completamente protonada
2. Calcular a carga desta forma (tem que ser positiva)
3. Retirar o 1º protão (do grupo COOH mais perto do grupo -amina)
4. Aa com carga 0: -COO- e NH3+
His Asp
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
3 pK:
1. pK1 1.8
2. pK2 6
3. pK3 9.3
pI = 7.6 2
32 pKpKpI
(-1)
(0)
(+1)
(+2)
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
NH2-Ala-Lys-COOH
Grupos ionizáveis - 3
Grupo -NH2 da Ala (9,69)
Grupo -COOH da Lys (2,18)
Grupo R da Lys (10.53)
H
+2 +1
NH2
NH2
NH2
0 -1
⇄ ⇄ ⇄ 2.2 8.9 10.5
Lys
A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:
Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;
Grupo pH 1 pH 3-5 pH 7 pH 10 pH 11
Ala -NH2 (pK 9,69) +1 +1 +1 0 0
Lys -COOH (pK 2,18) 0 -1 -1 -1 -1
Lys R (pK 10,53) +1 +1 +1 +1 0
Total +2 +1 +1 0 -1
H
NH2 ⇄ ⇄ 2,3 9,69
H
NH2
NH2
NH2
⇄ ⇄ ⇄ 2,18 8,9 10,53
Ala: Lys:
NH2-Ala-Lys-COOH Grupo -NH2 da Ala (9,69)
Grupo -COOH da Lys (2,18)
Grupo R da Lys (10.53)
2
32 pKpKpI
A- Aminoácidos e Proteínas
Péptido
3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
Terminal -NH2
Terminal COOH
Ligação peptídica
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
HCl 6M/110ºC
Bases fortes/Temp
Agentes químicos
Endopeptidases
Carboxipeptidases
Geral
Específica
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
Agente Local de clivagem Observações
Cliv
agem
quím
ica
Brometo de cianogénio
Terminal carboxílico dos resíduos de Metionina
Met-X
O-Iodobenzoato
Terminal carboxílico dos resíduos de Triptofano
Trp-X
Hidroxilamina
Ligação Asparagina-Glicina
Asn-Gly
2-Nitro-5-tiobenzoato
Terminal amina dos resíduos de Cisteína
X-Cys
Cliv
agem
enzim
ática
Tripsina
Terminal carboxílico dos resíduos de Lisina e Argina
Lys-X; Arg-X
Proetease submaxilar
Terminal carboxílico do resíduo de Arginina
Arg-X
Clostripan
Terminal carboxílico dos resíduos de Arginina
Arg-X
Protease stafilococica
Terminal carboxílico dos resíduos de Aspartato e
Glutamato (glutamato apenas em certas condições)
Asp-X; Glu-X
Asp-N-protease
Terminal amina dos resíduos de Aspartato e Glutamato
X-Asp; X-Glu
Pepsina
Terminal amina dos resíduos de Fenilalanina, Triptofano
e Tirosina
X-Phe; X-Trp; X-Tyr
Trombina
Terminal carboxílico da Arginina
Arg-X
Endoproteinase Lys C
Terminal carboxílico da Lisina
Lys-X
Quimotripsina
Terminal carboxílico da Tirosina, Triptofano, Fenilalanina
Tyr-X; Trp-X; Phe-X
Carboxipeptidase A
Cliva a ligações peptídicas C-terminal, excepto na
presença de Arginina, Lisina e Prolina
X-Aminoácido (excepto
quando Arg, Lys, Pro
Carboxipeptidase B
Actua sobre a extremidade C-terminal de um péptido ou
proteína mas apenas quando o aminoácido C-terminal é
Arginina ou Lisina
X-Arg; X-Lys
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
Sequenciação peptídica: Processo de identificar a sequência de amino
ácidos numa cadeia polipeptídica (estrutura primária)
Insulina
A- Aminoácidos e Proteínas
Insulina
3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem)
2. Para cadeia polipeptídica:
1. Identificar o aa N-terminal e C-terminal
2. Identificar os aa totais constituintes de cada ppa proteína
3. Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis
3. Identificar o aa N-terminal e C-terminal de cada péptido
4. Sequenciar os fragmentos individualmente
5. Montar o puzzle
Estratégia analítica:
A- Aminoácidos e Proteínas
Insulina
3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem)
Estratégia analítica:
-mercapto etanol
Técnicas
Cromatográficas
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
2. Para cadeia polipeptídica:
• Identificar o aa N-terminal e C-terminal
Estratégia analítica:
Derivatização
(ex: Cl-Dns)
HCl 6M/110ºC
(hidrólise)
Apenas a Gly se encontra marcada,
os restantes aa libertados não se
encontram marcados
Identificação técnicas
cromatográficas
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
2. Para cadeia polipeptídica:
• Identificar o aa N-terminal e C-terminal
Liberta apenas Asn Identificação técnicas
cromatográficas
Hidrólise
Estratégia analítica:
Carboxipeptidase
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
2. Para cadeia polipeptídica:
• Identificar a composição em aa
Liberta todos os aminoácidos
Identificação técnicas
cromatográficas
Hidrólise
HCl 6M/110ºC Derivatização (ex: Cl-Dns)
Todos os aa ficam marcados
Estratégia analítica:
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
2. Para cadeia polipeptídica:
• Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis (endopeptidases
ou agentes químicos)
Hidrólise
Pepsina
(Ligação amina de
aa aromáticos)
Repetir os passos anteriores para cada
um dos péptidos obtidos
Estratégia analítica:
+
+
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
2. Para cadeia polipeptídica:
• Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis
(carboxipeptidases)
Hidrólise
Carboxipeptidase 5 min:
10 min:
15 min:
Identificação técnicas
cromatográficas
Estratégia analítica:
A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:
Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;
PITC: Fenil isotiocianato
Hidrolizar e separar aa
Dansilar/ Hidrolizar e separar aa
E
Proteína constituida por
38 aa. Como tem R (Arg)
e K (Lys) pode-se utilizar
Tripsina . Por ter M (Met)
pode utilizar-se CnBr
Aa N-terminal: E(Glu)
Digerir com tripsina/separar
os péptidos e sequenciar
cada um
T2 é o primeiro péptido
(começa com um E)
T3 é o último (não
termina com R ou K)
Digerir com CnBr/separar
os péptidos e sequenciar
cada um
Ordem: C1, C3, C2
A- Aminoácidos e Proteínas