4. ENSAIOS MICROBIOLÓGICOSPARA PRODUTOS NÃO ESTÉREIS

CONTAMINAÇÃO MICROBIANA

Alterações nas propriedades:- físicas e químicas e,- riscos de infecções

ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS

Produtos cosméticos e farmacêuticos tópicos e orais

Contato com áreas com microbiota normal

Admite a presença de carga microbiana

limitada

Carga microbiana presente no produto

Qualitativo ou quantitativo

Não pode comprometer: - Qualidade final do produto e, - Segurança do paciente

Objetivos da análise:

1. Determinar o número de microrganismos viáveis;

2. Comprovar a ausência de microrganismos patogênicos

• Portaria no.6 de 31.01.1995 (MS)

Norma Técnica para Registro de Fitoterápicos

Pesquisa de contaminantes microbiológicos

Farmacopéia Brasileira ou recomendações da Organização Mundial da Saúde.

1. PADRÕES MICROBIANOS

• RDC Nº. 49, DE 23 DE NOVEMBRO DE 2010Aprova a Farmacopeia Brasileira, 5ª edição, v.1, 2010.

4.1. Limites microbianos para produtos não estéreis

produtos sintéticos e biológicos

Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g / mL

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL

Pesquisa de patógenosem 1 g/mL

Preparação aquosa para uso oral

102 101 Ausência de Escherichia coli

Preparação não aquosa para usooral

103 102 Idem

Preparação para uso retal

103 102 -

Preparação uso tópico (oromucosa,nasal, gengival, cutâneo, auricular)

102 101 Ausência de Staph. Aureus, Pseudomonas aeruginosa

Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL

Pesquisa de patógenosem 1 g/mL

Inalatórios 102 101 Ausência de Staph. aureus,Pseudomonas aeruginosa e bactéria Gramnegativa bile tolerantea

Preparação vaginal

102 101 Ausência de Staph. aureus ,Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans

• Produtos de origem vegetal, mineral e/ou animal

Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL

Pesquisa de patógenosem 1 g/mL

Preparação para uso oral contendomatéria-prima de origem natural

104 102 Ausência de Esch. coli e Staph.aureus/ 1 g, ou mL. Ausência de Salmonellaem 10 g/mL. Limite máx. de 102 bactérias Gram negativa bile tolerante b

Extrato seco 104 103 Ausência de Salmonella spp e Esch.coli em 10g

Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL

Pesquisa de patógenosem 1 g/mL

Drogas vegetais que serãosubmetidas a processos extrativosa quente

107 104 Limite máximo de 102 Esch.coli em 1 g.Limite máx. de 104 bactérias Gram negativabile tolerante b em 1 g/ mL. Ausência deSalmonella em 10 g

Tintura, Extrato fluido 104 103 -

Cosméticos & Cosmecêuticos

A) COSMÉTICOS=>intuito de limpar, perfumar – boas condições, proteger ou mudar a sua aparência.

B) COSMECÊUTICOS=>ação cosmética e terapêutica

MATÉRIAS PRIMAS UTILIZADASEM COSMETOLOGIA

• ÁGUA

• EXTRATOS BIOLÓGICOS

• CORANTES

• CONSERVANTES

• ÁLCOOIS

• COMPOSTOS LIPÍDICOS

• COMPOSTOS GLICÍDICOS

• COMPOSTOS DE ORIGEM MINERAL

• VITAMINAS

• MATÉRIAS AROMÁTICAS

Produtos cosméticos aquosos

• Shampoos• Condicionadores• Finalizadores• Sabonetes líquidos• Delineadores e• Rímel• Batom líquido

PRODUTOS COSMÉTICOS

Resolução no. 481, de 23.09.1999, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

Produtos cosméticos são subdivididos em 2 grupos: Tipo I e Tipo II

Tipo I: - produtos para uso infantil,- para área dos olhos - aqueles que entram em contato com

a mucosa. Tipo II:

- demais produtos susceptíveis à contaminação.

PADRÃO MICROBIOLÓGICO

• Tipo I: > 102 UFC/g(mL) de microrganismos

totais aeróbicos;

Ausência de: - Pseudomonas aeruginosa, -

Staphylococcus aureus, Coliformes totais e fecais em 1g(mL)

• Tipo II:

> 103 UFC/g(mL) de microrganismos totais aeróbicos;

Ausência de: - Pseudomonas aeruginosa, -

Staphylococcus aureus, - Coliformes totais e fecais em 1g(mL)

PRODUTOS FARMACÊUTICOS DE USO ORAL E TÓPICO

Cápsulas, comprimidos, suspensões, cremes, adesivos, etc.

Não têm como requerimento serem estéreis

Controle de contaminação microbiana

4.2. MÉTODOS DE ANÁLISE

MEDICAMENTOS NÃO ESTÉREIS E COSMÉTICOS

4 etapas

Amostragem, Coleta e transporte, Quantidade a ser analisada, Preparação da amostra

4.2.1. Amostragem:- Obter frações da parte inferior,

mediana e superior da embalagem

4.2.2. Coleta e transporte

- Recipientes, espátulas ou pipetas esterilizados;

- Recipientes de boca larga com capacidade para 100g(mL)

- Transporte em condições adequadas de temperatura

4.2.3. Quantidade a ser analisada

Recomendação das farmacopéias

10 g(mL)

4.2.4. Preparação da amostra

Verificar a atividade antimicrobiana do produto (conservantes na fórmula)

Inativar

Inativantes específicos para agentes antimicrobianos de fórmulas farmacêuticas e

cosméticos

Antimicrobiano InativanteFormaldeído O,1% de histidina no diluente inicial

Clorados 0,5% de tiossulfato de sódio

Sais de amônio quaternário 3,0% de polissorbato + 0,3% de

lecitina

Continuação:

Fenóis e derivados 1,0% de polissorbato 80 no diluente inicial

Tensoativos anfóteros 3,0% de polissorbato 80 + 0,3% de lecitina

Metais pesados, orgânicos ou ionizados (As, Pb)Cd, Hg, Cr, Mn) 0,1% de cisteína

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

1. Produtos hidrossolúveis:

10 g ou 10 mL da amostra

+ 90mL de solução tampão fosfato - pH 7,2

+ Preparar diluições decimais com o mesmo diluente

2. Produtos de natureza não lipídica insolúveis em água

Preparar suspensão de 10 g ou 10 mL da amostra +

Solução tampão fosfato pH 7,0 +

Polissorbato 80 (na concentração de 1 g/L (agente tensoativo, se necessário)

Preparar diluições decimais com o mesmo diluente

3. Produtos de natureza lipídica

3.1. Método de filtração por membrana

3.1.1. Preparo do diluente - 100 mL de miristato de isopropila

(esterilizado por filtração em membrana)

Dissolver 1 g ou 1 mL da amostra +

100mL do diluente+

polissorbato 80 estéril ou outro agente tensoativo não inibitório (optativo)

Aquecer a 40 – 45ºC

3.2. Método de contagem em placa

Frasco contendo 5 g de polissorbato 20 ou 80 estéril ou outro agente tensoativo não inibitório

+ 10 g ou 10 mL da amostra

Aquecer a temperatura entre 40 - 45°C (Manter aquecido)

1. Adicionar diluente previamente aquecido – proporção 1:10;

2. Misturar, cuidadosamente, mantendo a temperatura máxima de 40 - 45 °C durante o tempo necessário para a formação de uma emulsão, em qualquer caso não mais que 30 minutos;

3. Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de polissorbato 20 ou 80.

Cremes e pomadas insolúveis em miristato de isopropila

10 g da amostra +

90 mL caldo caseína-soja contendo 0,1g detetradecilsulfato de sódio (aquecido a 40 - 45 °C)

Agitar até mistura homogênea

Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de

0,1% de tetradecilsulfato de sódio.

Cápsulas vazias:

10 g de cápsulas vazias+

90 mL de solução tampão fosfato pH 7,2 aquecido a 40 - 45 °C

+ Agitar no máximo durante 30 minutos

Completar o volume para 100 mL (diluição 5:10)

Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente

Gelatinas

10 g da amostra +

90 mL água estéril aquecida a 40 - 45 °C +

deixar em repouso durante uma hora (diluição 1:10).

Banho-maria a 45 °C

Agitar

Preparar diluições decimais sucessivas em água estéril

4.3. Contagem do número total demicroorganismos mesofílicos

Determinar o número total

Bactérias mesófilas e fungos

Produtos e matérias-primas não estéreis

Satisfaz às exigências microbiológicas farmacopeicas

4.3.1. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

4.3.1.1. Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (“pour plate”):

a. Agar caseína-soja ou agar nutriente - bactérias;b. Agar Sabouraud dextrose ou agar batata - fungosc. Fazer diluições decimais do produto

d. alíquotas de 1 a 2 mL de cada diluição

Placas de Petri

Meio de Cultura (~20 mL)

Homogeneizar

Incubar a 30º - 35ºC/2-5dias - bactérias 20º - 25ºC/5-7 dias - bolores e leveduras

1. Fazer contagem das colônias;

1. Considerar a diluição;

1. Resultado: UFC/g (mL)

4.3.1.2. Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície

Placas de Petri contendo meio de cultura apropriado

0,1 a 0,5 mL de cada diluição da amostra

Semear com alça de Drigalsky.

4.3.1.3. Membrana filtrante

Filtrar 10mL do produto sob a forma líquidaou suas diluições em membranasapropriadas (0,45μm ou 0,20 μm de poro)

Depositar na mesma posição, sobre placasde Petri contendo meio de cultura apropriado.

4.3.1.4. NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

• Método utilizado apenas quando outros métodos mais precisos não puderem ser utilizados

4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS

- Pseudomonas aeruginosa – nas preparações tópicas, particularmente naquelas envolvendo regiões próximas aos olhos;

- Staphylococcus aureus – nas preparações tópicas em geral;

- Escherichia coli – nas preparações orais;

- Salmonella sp. – nas preparações orais

1. Meios de enriquecimento

1. Enriquecimento não seletivo de E. coli e Salmonella sp.

10g(mL) da amostra + 100 mL de caldo lactosado

Incubar a 36+/-1ºC/24 a 48 horas

Após o enriquecimento

Semear em ágar SS OU ágar EMB e/ou ágar MacConkey

Incubar 36-37ºC/24-48 h

Identificação bioquímica

Agar MacConkey

Colônias vermelho-tijolo a púrpura com halo de precipitação de bile

.

COLÔNIAS LACTOSE POSITIVA E LACTOSE NEGATIVA

Escherichia coli Agar eosina-azul de metileno

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» Quinto nível

Colônias com brilho m

etálico esverdeado e centro

escuro

SALMONELLA SP

- Meios de enriquecimento: a. Caldo selenito-cistina; b. Caldo tetrationato

- Meios de isolamento- seletivo-indicador:

a. Agar verde brilhante (coloração transparente);

b. Agar sulfito de bismuto (colônia preta ou esverdeada).

ÁGAR SULFITO DE BISMUTOCOLÔNIA PRETA OU ESVERDEADA

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» Quinto nível

SALMO

NELL

A

ÁGAR VERDE BRILHANTESALMONELLA

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E.COLISALMONELLA

Staphylococcus aureus

a. Agar Baird-Parker

Meio específico para estafilococos coagulase-positivos (S. aureus)

Colônias pretas, halo transparente

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

b. Agar Vogel-Johnson Colônias pretas, halo amarelo

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» Quinto nível

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

c. Ágar manitol salgado Colônias amarelas, halo amarelo

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Pseudomonas aeruginosaa. Agar cetrimida

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