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ANDRÉ FILIPE VIEIRA PEREIRA DA SILVA
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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, para obtenção do título de Mestre em Patologia, área de concentração Morfologia Aplicada.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Diógenes Luís da Mota, Professor Adjunto da Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Lúcio Soares da Silva, Professor Adjunto do Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
RECIFE 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
AUTOR: ANDRÉ FILIPE VIEIRA PEREIRA DA SILVA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: MORFOLOGIA APLICADA
NOME DA DISSERTAÇÃO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS DE HEPATÓCITOS DE CAMUNDONGOS (Mus muscullus) TRATADOS COM EXTRATO AQUOSO DE Dioclea grandiflora (FABACEAE) ORIENTADOR: PROF DR. DIÓGENES LUÍS DA MOTA
CO-ORIENTADOR: PROF DR. LUIZ LÚCIO SOARES DA SILVA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA E APROVADA PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE MESTRE EM PATOLOGIA.
DATA: 12/09/2006
BANCA EXAMINADORA:
PROF. DR. EDVALDO RODRIGUES DE ALMEIDA______________________
PROFA. DRA. PALOMA LYS DE MEDEIROS__________________________
PROF. DR. JENNECY SALES CAVALCANTI___________________________
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Não posso deixar de dedicar essa realização a meus pais
(Abelardo e Tania); a minha esposa (Valéria Brito) e,
principalmente, dedico à Cecília Brito Silva, minha
primeira filha e maior realização até então.
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AGRADECIMENTOS
Ao professor Diógenes Luís da Mota, pela amizade, confiança, paciência e compreensiva orientação deste trabalho e também pelas claras e ilustrativas aulas de histologia.
Ao professor Luiz Lúcio Soares da Silva, pelo fornecimento do material e idéias valiosas que contribuíram de maneira singular para confecção deste trabalho.
Ao professor Carlos Eduardo de Queiroz Lima, pelo apoio logístico, cedendo as instalações do Laboratório de Citologia Clínica e Histologia Quantitativa do Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da UFPE.
Ao professor Alexandre Motta Bittencourt, por tornar fácil o estudo da neuroanatomia além da preocupação e interesse em ajudar nos momentos que precisei de motivação.
Ao professor Almir Wanderley pela brilhante condução da disciplina de toxicologia experimental que cursei no programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da UFPE.
À professora Maria Cristina de Farias Agrício, que me ensinou a desenvolver as competências em sala de aula com muito deleite.
Ao professor José Valfrido de Santana, coordenador do Núcleo de Saúde da Faculdade Maurício de Nassau, pelo exemplo de caráter e incentivo no decorrer de minha carreira docente.
Existem alguns cientistas brasileiros que tive a felicidade de conhecer pessoalmente, são neles que me espelho e almejo algum dia chegar perto em termos de realização, cito: Antonio Souto (UFPE); Belmira da Costa (UFPE); Cláudio Gabriel (UFPE); Eduardo Conde Garcia (UFS); Luis Menna-Barreto (USP); e, Luis Carlos Carvalho (UFPB).
Ao amigo e colega no mestrado, professor Raimundo Rosendo, seu bom humor, criatividade, persistência e raciocínio rápido o tornam um gigante.
Aos professores Roberto Melo, pela sua serenidade e sensibilidade e Sílvia Arruda pela sua astúcia e dedicação, que juntos levam à frente a coordenação desta pós-graduação.
À secretária do mestrado Sônia Carvalho, na hora que mais precisamos mostrou-se disposta a tudo, obrigado.
À PROPESQ, pela eficiência e inteligência nas suas ações.
Aos técnicos de laboratório Silvana Rosas, Alex Benício e Sidcley Araújo pelo auxílio prestado para a confecção das lâminas.
A todos os funcionários que pertencem a este mestrado e aos demais professores e colegas que o integram, as minhas cordiais saudações.
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"É porque há fracasso, que há um freio para os estímulos. Sem este fracasso, os estímulos seriam
valores puros, seriam embriaguez; e por este enorme êxito subjetivo que é uma embriaguez, os estímulos constituiriam o mais irretificável dos
erros objetivos. Assim, em nossa opinião, o homem que tivesse a impressão de nunca enganar-se,
enganar-se-ia sempre." (G. Bachelard, A formação do espírito científico)
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RESUMO
HISTOLOGIA QUANTITATIVA DO FÍGADO DE CAMUNDONGOS (Mus muscullus) TRATADOS COM EXTRATO AQUOSO DE Dioclea grandiflora (FABACEAE) Na medicina popular, a planta Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. (Leguminosae), vem sendo freqüentemente utilizada para tratamento de distúrbios da glândula prostática e urolitíase. De acordo com análises histológicas evidenciou-se que o extrato aquoso do caule provoca lesões hepáticas e renais. Sendo o fígado a maior e mais importante glândula metabólica pela qual as substâncias ingeridas são processadas, faz-se necessário uma análise histológica quantitativa que avaliem a toxicidade da planta em questão. Portanto, o presente estudo teve por objetivo quantificar os efeitos histopatológicos do extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora no tecido hepático. Foram utilizados fígados de 20 camundongos albinos suíços (Mus muscullus) mantidos em sala com temperatura média de 23°C, em ciclo claro-escuro das 6:00 às 18:00h e 18:00 às 6:00h, respectivamente, com comida e água ad libitum. Dos 20 animais utilizados, 10 foram tratados com extrato aquoso do caule da Dioclea grandiflora, constituindo o grupo tratado (GT) enquanto os outros 10 foram utilizados como grupo controle (GC). Foi realizada a análise histológica no microscópio OLYMPUS (modelo BX50) e escolhidos, aleatoriamente, 10 campos de cada fígado corado com hematoxilina-eosina para registro fotomicrográfico através da microcâmera SAMSUNG-COLOR DIGITAL (SHC-410 NAD-HL) acoplada ao microscópio e conectado ao computador PENTIUM II de 200MHz ao qual está instalada a placa de captura de imagens. Após a realização da documentação fotográfica foi iniciado a avaliação morfométrica através do software IMAGE-LAB. A partir dos valores obtidos foram geradas planilhas no Microsoft Excel® para posterior análise estatística. Os seguintes valores foram obtidos para os GC e GT: Área = 34,095±2,919 / 48,687±7,339µm2; Perímetro = 22,608±0,957 / 27,255±2,098µm; Diâmetro = 6,255±0,283 / 7,611±0,589µm; Volume = 130,815±17,958 / 244,068±61,441µm3. As alterações morfológicas observadas e os valores quantitativos obtidos por técnicas morfométricas sugerem que a Dioclea grandiflora promove danos no tecido hepático, especialmente no núcleo, indicando um quadro de hepatoxicidade. Palavras-chave: fígado, avaliação morfométrica, toxicidade, Dioclea grandiflora
7
ABSTRACT
QUANTITATIVE HISTOLOGY OF THE LIVER OF MICE (Mus muscullus) TREATIES WITH AQUEOUS EXTRACT OF Dioclea grandiflora (FABACEAE)
In the popular medicine, the plant Dioclea grandiflora Mart. Former. Benth. (Leguminosae), it has frequently been used for treatment of disturbances of the prostate gland and stones in the kidneys. In agreement with histological analyses it was evidenced that the aqueous extract of the stem provokes hepatic and renal lesions. Being the liver the largest and more important metabolic gland for the which the ingested substances are processed, it is done necessary a quantitative histological analysis that you evaluate the toxicity of the plant in subject. Therefore, the present study had for objective to quantify the histopathologyc effects of the aqueous extract of the peel of the stem of Dioclea grandiflora in the hepatic fabric. Livers of 20 Swiss albino mice were used (Mus muscullus) maintained at room with medium temperature of 23°C, in clear-dark cycle from the 6:00 to the 18:00hrs and 18:00 at 6:00hrs o'clock, respectively, with food and water ad libitum. Of the 20 used animals, 10 were treated with aqueous extract of the stem of the Dioclea grandiflora, constituting the treated group (GT) while the other ones 10 were used as group controls (GC). The histological analysis was accomplished in the microscope OLYMPUS (model BX50) and chosen, aleatoriamente, 10 fields of each red-faced liver with hematoxilina-eosina for registration fotomicrográfico through the micro camera DIGITAL SAMSUNG-COLOR (SHC-410 NAD-HL) coupled to the microscope and connected to the computer PENTIUM II of 200MHz to which the plate of capture of images is installed. After the accomplishment of the photographic documentation it was initiate the evaluation morphometric through the software IMAGE-LAB. Starting from the obtained values spreadsheets were generated in Microsoft Excel® for subsequent statistical analysis. The following values were obtained for GC and GT: Area = 34,095±2,919 / 48,687±7,339µm2; Perimeter = 22,608±0,957 / 27,255±2,098µm; Diameter = 6,255±0,283 / 7,611±0,589µm; Volume = 130,815±17,958 / 244,068±61,441µm3. The observed morphologic alterations and the quantitative values obtained by techniques morphometrics suggest that the Dioclea grandiflora promotes damages in the hepatic fabric, especially in the nucleus, indicating a hepatoxicity picture. Key-word: liver, evaluation morphometric, toxicity, Dioclea grandiflora
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ________________________________________ 9
LISTA DE TABELAS____________________________________________ 10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS _____________________________ 11
1 INTRODUÇÃO _____________________________________________ 12
1.1 Considerações gerais ___________________________________ 12
1.2 Justificativa ___________________________________________ 13
2 OBJETIVOS _______________________________________________ 15
2.1 Geral _________________________________________________ 15
2.2 Específicos____________________________________________ 15
3 REVISÃO DA LITERATURA __________________________________ 16
4 MATERIAL E MÉTODOS_____________________________________ 22
4.1 Material utilizado _______________________________________ 22
4.2 Descrição do tratamento dos grupos ______________________ 23
4.3 Preparo do material________________ Erro! Indicador não definido.
4.4 Análise morfométrica ___________________________________ 24
4.5 Análise matemática_____________________________________ 26
4.6 Análise estatística ______________________________________ 27
5 RESULTADOS_____________________________________________ 28
6 DISCUSSÃO ______________________________________________ 32
7 CONCLUSÃO______________________________________________ 36
REFERÊNCIAS ________________________________________________ 37
ANEXO ______________________________________________________ 49
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Núcleo de hepatócito sendo selecionado para posterior cálculo da
área. Programa de análise morfométrica IMAGE-LAB 2000. _____________ 25
Figura 2 – Núcleo de hepatócito tendo sua área calculada para posterior
plotagem dos dados em planilha do programa Microsoft Excel®. Programa de
análise morfométrica IMAGE-LAB 2000._____________________________ 26
Figura 3 – Valor da área (µm2) do núcleo de hepatócitos de camundongos
albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em
relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 29
Figura 4 – Valor do perímetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos
albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em
relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 29
Figura 5 – Valor do diâmetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos
albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em
relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 30
Figura 6 – Valor do volume (µm3) do núcleo de hepatócitos de camundongos
albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em
relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 30
Figura 7 – A - Grupo controle - Observam-se hepatócitos apresentando
morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto normal quando
comparados com os observados nos cortes do Grupo tratado - B, C e D - cujos
núcleos exibem morfologia alterada, diâmetros variados e citoplasma de
aspecto vacuolizado. Coloração: H-E. x800.__________________________ 31
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores (média±DP) obtidos a partir de medidas de área, perímetro,
diâmetro e volume, realizadas no núcleo de hepatócitos de camundongos
tratados com Dioclea grandiflora comparados com grupo controle.................. 28
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
DL50 Dose Letal capaz de matar 50% da população estudada
GC Grupo controle
GT Grupo tratado
HE Hematoxilina e Eosina
SNC Sistema Nervoso Central
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
A flora brasileira é conhecida mundialmente por sua vasta biodiversidade
que atrai pesquisadores de todo mundo. A caatinga, único bioma restrito ao
território brasileiro, típico da região nordeste (Barros, 2003), é um dos setores
menos estudados do Brasil e, por isso, sua diversidade biológica tem sido
subestimada (Silva e Dinnouti, 1999).
Segundo Leal, et al. (2003), 41,1% da caatinga ainda não foi amostrada
e 80% da área está subamostrada, mesmo assim, atualmente são conhecidas
932 espécies de plantas, sendo 380 endêmicas.
Plantas que sejam capazes de ocasionar danos que alterem a
homeostase em organismos de animais são classificadas como tóxicas
(Oliveira e Akisue, 2000).
Várias alterações são causadas por estímulos externos como agentes
tóxicos rompendo os mecanismos homeostáticos (Fausto et al., 1995;
Michalopoulos e DeFrances, 1997).
Embora, plantas tóxicas sejam onipresentes (Kingsbury, 1964), a
medicina herbária é usada por até 80% da população nos países em
desenvolvimento, como é o caso do Brasil (Almeida, 1993), onde a utilização
de plantas no tratamento de doenças apresenta, fundamentalmente, influências
da cultura indígena e africana (Martins et al., 2000). Apesar do difundido uso,
13
foram empreendidos poucos estudos científicos para averiguar a segurança e
eficácia de remédios tradicionais (Alexeeff et al., 2002).
A planta Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. (Leguminosae),
popularmente conhecida como “mucunã”, “mucunã-de-caroço” e “olho-de-boi”,
é encontrada na caatinga e cerrado do nordeste brasileiro (Bacarat, 1995;
Lima, 1989). Na medicina popular ela vem sendo freqüentemente utilizada para
tratamento de distúrbios da glândula prostática e pedras nos rins (Batista,
1993; Batista, et al., 1993).
1.2 Justificativa
Os humanos são expostos a um grande número de substâncias
químicas. A possibilidade de toxicidade a diversos órgãos, devido a interação
biológica de agentes tóxicos freqüentemente presentes em plantas do uso
popular, é o que motiva essa pesquisa. Faz-se, portanto, necessários estudos
que avaliem a toxicidade das chamadas “plantas medicinais de uso popular”.
Afinal, inúmeras substâncias químicas estão presentes nas plantas de uso
popular, como é o caso da Dioclea grandiflora.
Considerando que, a maioria dos estudos com plantas medicinais de uso
popular avaliam a interação farmacológica, e não a toxicológica, (Dobrev et al.,
2001; Haddad et al., 2000), e baseando-se no ponto de vista da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), publicada na resolução de n°90, de
16 de março de 2004 (Anexo I), onde os dados histológicos, especialmente de
órgãos como o fígado, são de suma importância nas avaliações toxicológicas
14
de plantas usadas na medicina popular, como o caso da Dioclea grandiflora, o
presente estudo tem o papel de quantificar as possíveis alterações
morfoquantitativas nos hepatócitos de camundongos tratados a partir do extrato
aquoso desta planta no intuito de contribuir decisivamente nos resultados de
hepatotoxicidade (Mehendale, 1994, 1995; Mangipudy et al., 1995a; Soni e
Mehendale, 1998a; Soni et al., 1999; Anand et al., 2003a), para a investigação
da Dioclea grandiflora, usada corriqueiramente em pessoas acometidas de
desordens prostáticas e acúmulo de pedras nos rins.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Quantificar os efeitos histopatológicos do extrato aquoso da casca do
caule de Dioclea grandiflora nos núcleos de hepatócitos de camundongos (Mus
muscullus).
2.2 Específicos
• Investigar as possíveis alterações morfológicas no tecido hepático
de camundongos tratados com extrato aquoso da casca do
caule de Dioclea grandiflora;
• Quantificar a área, diâmetro, perímetro e o volume do núcleo dos
hepatócitos por meio de estudo morfométrico.
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
Importantes grupos do mundo inteiro se mobilizam na identificação de
novos compostos produzidos por plantas, promovendo modificações químicas
em suas estruturas através de processos biossintéticos e sintéticos. Procuram-
se novos compostos que possam ser utilizados clinicamente, em altas
dosagens, que apresentam baixa toxidade, absorvidos por via oral, por
períodos prolongados e, ainda, com amplo espectro de aplicação (Bras-Filho,
1994).
O uso de plantas no tratamento das enfermidades ainda é bastante
comum, principalmente no meio rural, em populações de baixo poder aquisitivo,
onde a tradição cultural e os problemas sócio-econômicos dificultam o acesso à
medicina convencional (Agra, 1996).
No sertão brasileiro uma patologia freqüentemente tratada com
fitoterápicos é a urolitíase (cálculos renais). A maioria dos cálculos contém
cálcio, constituído, em grande parte, de oxalato de cálcio (Cotran et al., 2000).
Uso da Dioclea grandiflora para tratamento da urolitíase é relatado por Almeida
et al. (1993).
De acordo com a classificação de Cronquist (1968), o gênero Dioclea faz
parte da família Fabaceae, a qual está incluída na ordem Fabales, tem sua
divisão (Reino) nas Magnoliophyta, pertence a classe das Magnoliopsida
(Dicotiledônea) e subclasse Rosidae.
17
A família Fabaceae (Leguminosae) apresenta-se na forma de arbusto,
ou de árvores, distribuídas em uma extensa variedade de habitat, que vai das
regiões temperadas até os trópicos, inclusive nas regiões subtropicais. Inclui,
também, nesta família as plantas aquáticas, xerófitas e trepadeiras. A ordem
Fabales apresenta em torno de 700 gêneros e mais de 17.000 espécies, com
distribuição cosmopolita (Heywood, 1996).
A espécie D. grandiflora é um cipó vigoroso, trepador, que pode atingir
até a copa das árvores ou subir em conjunto com arbustos. Apresenta folhas
alternas com estípulas delgadas, precocemente caducas, com folíolos terminal
suborbicular a suborvado e com suas florescências augusta-paniculada.
Apresenta flores vistosas de cálice arroxeado e com pétalas em estandarte
amplo, de cor amarela; os frutos (legume) são de grande tamanho, sendo suas
sementes duras e ricas em substâncias nutritivas
Os primeiros estudos com Dioclea grandiflora foram realizados por
Chaves et al. (1948) no campo da nutrição. Só após 36 anos é que Richardson
et al. (1984) publicaram algo com a Dioclea grandiflora acerca das
propriedades químicas da lectina.
Esse assunto despertou interesse de Ainouz et al. (1987) e
Bhattacharyya et al. (1988 e 1990) sendo que este último passou a merecer
destaque nos estudos da Dioclea grandiflora a partir dos artigos subseqüentes.
Em 1993, Batista et al. (que pertence ao grupo de Bhattacharyya)
demonstraram que extrato alcoólico de Dioclea grandiflora produzia uma
significativa ação no Sistema Nervoso Central (SNC) de ratos. Através de
18
técnicas de cromatografia (Bhattacharyya et al., 1995) e análise espectral
(Bhattacharyya et al., 1997), foi possível isolar a ‘dioclein’ e evidenciar a sua
estrutura como 5,2’,5’-trihydroxy-6,7-dimethoxy-flavone. No mesmo ano foi
publicado o efeito analgésico da Dioclea grandiflora constatando sua ação no
SNC envolvendo um mecanismo semelhante aos opióides (Batista et al., 1995).
Em estudo acerca da atividade biológica da lectina encontrada nas
sementes de Dioclea grandiflora, Lima et al. (1993) observaram uma reação
inflamatória cutânea. Análises histológicas revelaram um quadro de ulceração
hemorrágica com reação exudativa acompanhada por um influxo de leucócitos
polimorfonucleados e células gigantes (macrófagos). Isto demonstra que a
lectina de Dioclea grandiflora atua, provavelmente, como um agente
inflamatório. Em estudos de Andrade et al. (1999) foi possível descrever a ação
da lectina de Dioclea grandiflora na produção de óxido nítrico pela via
linfocítica.
Majetich et al. (1999) em investigações sistemáticas isolaram da casca
Dioclea grandiflora, três novos flavanóides: agrandol (5, 7-dihidroxi-6-metoxi-8-
prenilflavanona), paraibanol (3,5,7,2’-pentahidroxi-6-metoxi-8-prinilflavanona) e
diosalol (3,5.7.2’.5’-pentahidroxi-6-metoxi-8-prinilflavanona). Também, foram
identificados β-amerina e 5,7,2’,5’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilfavanona.
Alguns flavonóides também apresentam atividade hepatotóxica (Formica
e Regelson, 1995; Hertog, 1996; Rice-Evans et al., 1996; Antônio e Brito, 1998;
Middleton et al., 2000; Havsteen, 2002; Bhatia e Jain, 2004). De fato é
importante investigar a atividade hepatotóxica da Dioclea grandiflora.
19
Vários trabalhos também foram realizados com vistas a isolamento e
caracterização de vários tipos de lectinas da semente de D. grandiflora, como
os de Richardson et al. (1984); Toone et al. (1995); Kiessling et al. (1996);
Toone et al. (1996); Sacchetini et al. (1998); Brewer et al. (1998); Brewer et al.
(2000) e Brewer et al. (2002).
A casca do caule de Symplocos cochinchinensis foi analisada por Khan
et al. (2001), na qual observaram a atividade antimicrobiana dos extratos os
quais apresentaram uma ampla variação de atividade contra bactérias e
protozoários. As frações, quando testadas, melhoraram os níveis de atividade
em todos os casos.
Os estudos com Dioclea avançaram muito a partir de 2002. Neste ano,
Almeida et al. estudaram o efeito da diocleína sobre a circulação coronariana
em ratos. Através do método de Langendorff aplicado nos experimentos os
autores demonstraram nos resultados que a diocleína induziu um efeito vaso-
dilatador direto sobre as artérias coronarianas, independente da participação
do óxido nítrico e ciclooxigenase.
No ano seguinte, Almeida et al. (2003) 1 verificaram em ratos e
camundongos depois de tratamento agudo com extrato hidroalcoólico de
sementes de Dioclea grandiflora um efeito analgésico significativo no
movimento da cauda e testes em chapa quente. Os resultados sugerem que o
extrato hidroalcoólico de sementes de Dioclea grandiflora tenha uma ação
analgésica central destituída de tolerância, efeito típico de drogas opióides.
1 O Almeida et al., 2002 e Almeida et al., 2003 são autores diferentes, como pode ser verificado nas referências. O primeiro é da UFMG, enquanto que o segundo é da UFPB.
20
Porém, ainda não existem estudos significativos sobre a toxicidade da
Dioclea grandiflora. Um órgão cuja avaliação histológica seria muito importante
para avaliação da toxicidade é o fígado, segundo maior órgão e maior glândula
do corpo (Goss, 1988), devido a ele ser a interface entre os sistema digestório
e o sangue (Junqueira e Carneiro, 2004).
A maneira clássica para se descrever a unidade funcional do fígado
envolve o conceito do chamado lóbulo hepático. Histologicamente, o lóbulo
hepático apresenta forma hexagonal, com uma veia centro-lobular e com as
tríades portais nas extremidades desse hexágono imaginário. As colunas de
hepatócitos dispõem-se lado a lado, a partir da veia central e entre elas estão
situados os sinusóides hepáticos, que transportam o sangue que chega pelos
ramos da veia porta e da artéria hepática e os chamados espaços de Disse. Há
ainda os canalículos biliares que transportam a bile até os ductos biliares, nos
espaços porta (Gerber e Thung, 1987).
As células que compõe o fígado, hepatócitos, derivam do epitélio do
intestino primitivo (Alberts et al., 2004). São poliédricas, com seis ou mais
superfícies, variam de 12 a 25µm de diâmetro. Contêm um e às vezes dois
núcleos arredondados que apresentam em seu interior uma rede e um ou dois
nucléolos refringentes. Alguns núcleos são poliplóides, contendo múltiplos do
número haplóide de cromossomos. Núcleos poliplóides são caracterizados pelo
seu tamanho maior, que é proporcional a ploidia (Goss, 1988; Junqueira e
Carneiro, 2004).
Aproximadamente 75% de sangue hepático vêm diretamente das
21
vísceras gastrointestinais e baço através da veia de porta. O sangue
proveniente do sistema porta traz drogas absorvidas diretamente pelo intestino
para o fígado em forma concentrada. Os hepatócitos são responsáveis pela
síntese, pela degradação e pelo armazenamento de um imenso número de
substâncias, enzimas droga-metabolizantes tem papel de desintoxicar muitos
compostos mas ativa a toxicidade de outros (Alberts et al., 2004; Jaeschke et
al., 2002).
Weibel et al. (1969) descreveram os dados morfométricos normais em
fígado de ratos. Segundo os autores, estudos pela microscopia de luz
demonstraram que 96% do volume hepático dos ratos é constituído pelo
parênquima lobular, isto é, pelos hepatócitos, sinusóides, espaços de Disse e
capilares biliares, enquanto os 4% restantes constituem o parênquima não
lobular, ou seja, espaços portais, veias centro-lobulares e ramos da veia
hepática.
22
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material utilizado
Para o presente estudo foram utilizados fígados (montados em blocos de
parafina) de 20 camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos com
idade entre 45 e 60 dias com peso médio de 26±6g, provenientes do biotério do
Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE). Esses blocos de parafina foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz
Lúcio Soares da Silva do Departamento de Histologia e Embriologia da UFPE.
Para a realização deste estudo, é necessária a compreensão detalhada
das etapas que antecederam a confecção dos blocos em parafina tais como
manutenção dos animais e tratamento farmacológico realizado. Essas
informações serão detalhadas a seguir de acordo com procedimento realizado
por Silva (2003).
4.2 Obtenção do extrato
Na obtenção do extrato aquoso da casca do caule, foram utilizados 100g
do material seco, previamente triturados, em máquina forrageira. O material
triturado, foi colocado em um becker e adicionada água destilada até cobrir, por
completo, o material, perfazendo um total de 800mL. Foi submetido à agitação
mecânica por 1 hora e em seguida deixado em repouso para maceração
durante 24 horas na geladeira. Logo após, o extrato foi filtrado, em filtro de
23
papel, e submetido à liofilização. O processo foi repetido por mais 24 horas,
nas mesmas condições, com o objetivo de se obter quantidade adicional de
extrato. Após processo de liofilização, os resíduos foram reunidos,
cuidadosamente guardado em dessecador. O extrato foi pesado, calculado e
seu rendimento, lacrado com para-filme e depositado no freezer até o momento
dos testes de atividade biológica.
4.3 Tratamento dos grupos
Os animais foram mantidos em sala com temperatura média de 23°C,
em ciclo claro-escuro das 6:00 às 18:00h e 18:00 às 6:00h, respectivamente.
Todos com idade entre 45 e 60 dias, foram submetidos a dieta padrão (LABINA
– Purina do Brasil S/A) e água ad libitum do biotério do Departamento de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, registrado no COBEA
sob o nº 18.
Dos 20 animais utilizados, 10 foram tratados com extrato aquoso da
casca do caule da Dioclea grandiflora, constituindo o grupo tratado (GT)
enquanto os outros 10 foram utilizados como grupo controle (GC), no período
de sete dias consecutivos. A via utilizada na aplicação dos extratos foi
intraperitonial na dose de 62mg/kg de peso.
24
4.4 Estudo histopatológico
Foi realizada a microtomia, com aproximadamente 80 cortes a
espessura de 3µm. Aleatoriamente foram retirados cortes que apresentavam
boa aparência macroscópica para confecção de lâminas previamente
banhadas com albumina de Mayer. Em seguida, foram mantidas em estufa
(FANEM), durante 1h a 58°C para retirada da parafina e desumedecimento do
material.
Os cortes, depois de desparafinizados e hidratados, foram corados com
hematoxilina-eosina (HE) e em seguida desidratados e clarificados com xilol e
montados em Entelan conforme Tolosa et al. (2003).
4.5 Análise morfométrica
Inicialmente foi realizada a análise histológica no microscópio OLYMPUS
(modelo BX50) no Laboratório de Citologia Clínica e Histologia Quantitativa do
Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da
UFPE das lâminas do grupo tratado (GT) em comparação com o grupo controle
(GC). Em seguida, foram escolhidos, aleatoriamente, 10 campos de cada
fígado corado com HE para registro fotomicrográfico através da microcâmera
SAMSUNG-COLOR DIGITAL (SHC-410 NAD-HL) acoplada ao microscópio e
conectado ao computador PENTIUM II de 200MHz ao qual está instalada a
placa de captura de imagens.
Após a realização da documentação fotográfica foi iniciado a avaliação
morfométrica através do software IMAGE-LAB. Selecionou-se a área do núcleo
25
(Figura 1) realizou-se o cálculo (Figura 2) e depois os dados foram plotados em
arquivo com extensão no formato xls (Microsoft Excel – Office XP). Em cada
campo fotografado os núcleos escolhidos foram medidos três vezes e sua
média foi considerada. Foi feita a média e o desvio padrão do fígado analisado
de cada animal e, dessas médias e desvios, foi obtida a média aritmética geral
e a média dos desvios padrão dos animais do GC e do GT para posterior
análise estatística.
Figura 1 – Núcleo de hepatócito sendo selecionado para posterior cálculo da área. Programa
de análise morfométrica IMAGE-LAB 2000.
26
Figura 2 – Núcleo de hepatócito tendo sua área calculada para posterior plotagem dos dados
em planilha do programa Microsoft Excel®. Programa de análise morfométrica IMAGE-LAB
2000.
4.6 Análise matemática
O volume nuclear foi obtido a partir das médias dos diâmetros dos
núcleos analisados por campo fotografado. Calculou-se o raio médio através da
formula geométrica dividida por dois (Equação 1) e depois aplicando-se a
fórmula para cálculo do volume da esfera (Equação 2).
Equação 1
221 dd
r+
= 1
Equação 2 334 rV ⋅⋅= π Fórmula 2
27
4.7 Análise estatística
A partir dos valores obtidos foram geradas planilhas no Microsoft Excel®
e os valores amostrados em tabelas. A análise comparativa dos valores foram
da análise de variância (ANOVA), duas vias, e o teste de Tukey para
comparação das médias. Ainda na análise estatística utilizou-se o teste “t” de
Student para dados pareados, sendo consideradas significativos os valores
quando p<0,05.
Foi realizada uma análise de variância (ANOVA) entre os valores obtidos
dos campos dentro de cada grupo para analisar o grau de diferença. Aplicou-se
o teste t de Student independente com variância igual de duas amostras
(homoscedástica) entre as médias dos campos. O resultado da análise
demonstrou um p<0,001 para os valores de área, perímetro, diâmetro e
volume.
Os dados foram processados, através do programa Microsoft® Excel
2002 no sistema operacional Windows XP Professional, procedendo-se o
tratamento matemático dos dados e construção de gráficos que facilitem a
visualização.
28
5 RESULTADOS
A partir dos valores obtidos obteve-se a média e o desvio padrão
(Tabela 1). A análise estatística entre os grupos apresentou uma diferença
significativa para um p<0,001.
Tabela 1 – Valores (média±DP) obtidos a partir de medidas de área, perímetro, diâmetro e volume, realizadas no núcleo de hepatócitos de camundongos tratados com Dioclea grandiflora comparados com grupo controle.
Área (µm2)
Perímetro (µm)
Diâmetro (µm)
Volume (µm3)
GC 34,095±2,919 22,608±0,957 6,255±0,283 130,815±17,958
GT 48,687*±7,339 27,255*±2,098 7,611*±0,589 244,068*±61,441
* p<0,001 para área, perímetro, diâmetro e volume no GT em relação ao GC.
Os valores da área (Figura 3), perímetro (Figura 4), diâmetro (Figura 5) e
volume (Figura 6) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços
(Mus muscullus) machos do GC foram superiores aos do GT, apresentando
uma diferença significativa (p<0,001).
Na análise histológica, do grupo tratado com salina (GC) observou-se
hepatócitos com morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto
normal, enquanto os cortes histológicos de camundongos tratados com Dioclea
grandiflora foram observados núcleos com morfologia alterada, diâmetros
variados e citoplasma de aspecto vacuolizado (Figura 7).
29
48,687
34,095
0
10
20
30
40
50
60
µm²
GCGT
Figura 3 – Valor da área (µm2) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.
27,255
22,608
0
5
10
15
20
25
30
35
µm
GCGT
Figura 4 – Valor do perímetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.
*
*
30
7,611
6,255
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
µm
GT GC
Figura 5 – Valor do diâmetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.
244,068
130,810
0
50
100
150
200
250
300
350
µm³
GT GC
Figura 6 – Valor do volume (µm3) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina.
* p<0,001 no GT em relação ao GC.
*
*
31
Figura 7 – A - Grupo controle - Observam-se hepatócitos apresentando morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto normal quando comparados com os observados nos cortes do Grupo tratado - B, C e D - cujos núcleos exibem morfologia alterada, diâmetros variados e citoplasma de aspecto vacuolizado. Coloração: H-E. x800.
32
6 DISCUSSÃO
Constatou-se, a partir da avaliação quantitativa obtida por técnica
morfométrica, que camundongos Mus muscullus submetidos a tratamento
agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora, durante 7
dias, apresentam alterações significativas nos núcleos de hepatócitos. A
principal alteração observada foi o aumento do núcleo referente a área,
diâmetro, perímetro e volume.
Em estudo morfoquantitativo dos rins de camundongos Mus muscullus
submetidos a tratamento semelhante, Almeida (2004) verificou redução no
corpúsculo renal, glomérulo e espaço sub-capsular.
Em estudo pioneiro, Chaves et al. (1948), utilizando sementes de
Dioclea grandiflora, preparadas à maneira popular, observou, através de
investigação histopatológica em pombos e em ratos, efeitos degenerativos nos
rins e no fígado. Mas não foi realizada uma análise quantitativa.
Souza, et al. (1997) estudaram, em suínos, outra Fabacea, a Crotalaria
spectabilis. Observaram lesões no tecido hepático, apesar de não terem
realizado uma precisa análise quantitativa, destacaram aumento do tecido
hepático. Corroborando com os resultados encontrados no presente estudo.
Em estudo histológico em bovinos, camundongos, ratos e coelhos
tratados com Riedeliella grandiflora (Fabacea), Riet-Correa et al. (2001)
observaram, no fígado desses animais, desorganização da estrutura trabecular
33
e degeneração e necrose de alguns hepatócitos. Nobre et al. (2004) observou
variados graus de fibrose em tecido hepático de eqüinos tratados com
Crotalaria retusa. Observou ainda necrose e vacuolização citoplasmática nos
hepatócitos. Achados semelhantes também foram observados no presente
estudo.
Os hepatócitos dos camundongos Mus muscullus submetidos a
tratamento agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora
apresentaram vacuolizações citoplasmáticas e apesar de não terem sido
quantificados morfometricamente, observa-se que, neste grupo tratado,
ocorreram possíveis aumentos nos sinusóides, o que corrobora com Lemos et
al. (1999) que discute o possível efeito vasodilatador do flavonóide diocleína
ativando óxido nítrico e fatores de relaxamento do endotélio. Em Almeida et al.
(2002) foi observado aumento do fluxo coronariano no coração de ratos
tratados com o flavonóide extraído da Dioclea grandiflora.
Nos estudos de Silva (2003), os extratos aquoso e etanólico da casca do
caule de Dioclea grandiflora, apresentaram efeitos tóxicos importantes sobre
fígado e rins de camundongos. Os mesmos efeitos foram observados nos
hepatócitos dos animais tratados no presente trabalho.
O aumento do núcleo observado no presente estudo pode indicar um
aumento da atividade nuclear e pode estar relacionado a processos
apoptóticos, como observado por Vekemans e Braet (2004) em ratos tratados
com 3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate e com Propidium iodide.
Porém, conclusões mais consistentes exigiriam uma investigação à alta-
34
resolução em nível microscópico, como microscopia de elétron de transmissão,
por exemplo.
A degeneração citoplasmática, possivelmente deve-se (Jaeschke et al.,
2000) a reação de alta energia no citocromo p450 comprometendo a
homeostase do cálcio com a ruptura de fibrilas intracelulares e lise de
hepatócitos deve ser investigada, além de apoptose e estresse oxidativo
gerado por dano a organelas intracelulares, principalmente nos casos de
estudos com extrato etanólico, como realizado por Silva (2004). De acordo com
Bertolami (2005), deve-se realizar o controle das enzimas hepáticas antes de
iniciar o tratamento e depois, periodicamente. Segundo Amacher et al. (1998;
2001) a relação enzimática e alterações histológicas em estudos toxicológicos
deve ser realizada.
Um estudo da DL50, dentro da exigência da ANVISA, deve ser realizado
com a Dioclea grandiflora. Porém, de acordo com Jaeschke et al. (2000) dano
celular e morte não só é determinada pela natureza e dose de uma droga
particular mas também através de fatores como o perfil de expressão genética
do indivíduo, estado de antioxidante, e capacidade regenerativa. Por causa do
muitos mecanismos diretos e indiretos de dano celular droga-induzido no
fígado, a evidencia de hepatotoxicidade permanece uma razão principal para
retirada da droga no seu uso clínico.
Além do interesse da aplicação terapêutica em humanos, alguns estudos
toxicológicos são motivados por interesses na medicina veterinária ou na
fabricação de defensivos agrícolas e inseticidas. Seja qual for o interesse da
35
investigação, os possíveis danos hepáticos desses fitofármacos não podem
deixar de serem analisados, devido a importante interface que o fígado
representa com o meio externo, além das suas propriedades de síntese e, de
acordo com Bohne et al. (2006) biotransformação.
O pioneiro nos estudos morfométricos em fígado são de Weibel et al.
(1969). Os estudos morfométricos do fígado tem sido úteis para uma avaliação
mais precisa, por ser uma análise quantitativa. Parâmetros como volume lobar
têm sido utilizado por Harada et al. (1997) como dado clínico em pacientes
humanos. Engelman et al. (2001) realizou um estudo morfométrico do fígado
de ratos submetidos a doses supra-fisiológicas de tiroxina.
A investigação da histologia hepática, incluindo análise quantitativa por
meio de recursos morfométricos tem sido uma característica importante que
pode ser incorporada aos estudos toxicológicos de elementos
fitofarmacológicos.
No caso da Dioclea grandiflora, deve-se haver melhores investigações
acerca dos compostos já isolados para uma possível aplicação terapêutica dos
mesmos na tentativa de discernir essas ações das alterações hepatotóxicas
aqui observadas. Caso não seja possível, deve-se afastar da cultura popular a
utilização dessa planta no tratamento da urolitíase e dos distúrbios prostáticos.
36
7 CONCLUSÃO
O tratamento agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea
grandiflora provoca:
• degeneração hepática com presença de vacuolizações citoplasmáticas;
• aumento na área, perímetro, diâmetro e volume do núcleo do hepatócito;
Não é recomendado o seu uso na medicina popular até que
investigações mais precisas sejam realizadas com os compostos isolados.
37
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ANEXO
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