Post on 16-Oct-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA
Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas
CLARISSA SOUZA GOMES DA FONTOURA
ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B
Niterói 2013
CLARISSA SOUZA GOMES DA FONTOURA
ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.
.
Orientador: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Ariadne Machado Gonçalves Letra
Niterói
2013
O F684
Fontoura, Clarissa Souza Gomes da Associação entre as fissuras labiopalatais e os genes ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B / Clarissa Souza Gomes da Fontoura. – Niterói : [s.n.], 2013. 104 f. Orientador:José Mauro Granjeiro. Co-Orientador:Ariadne Machado Gonçalves
Letra.
Dissertação(Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Medicina, 2013.
1. Anormalidades craniofaciais. 2. Fissura palatina. 3. Fenda labial. 4. Polimorfismo genético. I. Titulo. CDD 575.1
CLARISSA SOUZA GOMES DA FONTOURA
ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9β
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.
Aprovado em 04 de julho de 2013.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Beni Olej
Prof. Dr. Marcelo de Castro Costa
Prof.ª Dr.ª Silvia Paula de Oliveira
Niterói 2013
DEDICATÓRIA
Aos pacientes com fissura labiopalatina e suas famílias, razão do
nosso estudo, que gentilmente colaboraram, confiaram e se prontificaram em participar desta pesquisa. Pacientes que na
inocência de suas vidas nos ensinam o valor do nosso trabalho e depositam em nós suas esperanças em busca de uma melhor
qualidade de vida. Que este estudo, em sua pequena contribuição e buscando reduzir o universo de desconhecimento sobre o assunto,
possa ajudar-nos a oferecer-lhes uma melhor qualidade em suas jornadas diárias.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Aos meus orientadores ...
Ao Prof. Dr. José Mauro Granjeiro que me recebeu generosamente e
me incentivou ao longo do curso com seu admirável empenho e dedicação à
pesquisa; um exemplo para todos nós, jovens pesquisadores, mostrando que
com determinação e competência é possível contribuir sobremaneira para o
avanço científico.
À Dra. Ariadne Machado Gonçalves Letra, não somente pela sua
imprescindível colaboração e preciosa orientação durante toda a execução
deste trabalho, mas por compartilhar seus conhecimentos, sabedoria,
competência e pela oportunidade bastante enriquecedora que me proporcionou
profissionalmente nestes anos de convívio e, principalmente, por ser essa
amiga especial.
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Luiz Francisco, minha fonte de inspiração, que durante
toda a minha vida construiu e sedimentou exemplos de honestidade, empenho
e perseverança. Obrigada pelo seu amor incondicional e eterno incentivo.
À minha mãe Regina por sua imensa capacidade de zelar e de amar,
por me guiar a realização dos meus sonhos me ajudando a superar todos os
obstáculos, o meu eterno obrigada.
Às minhas irmãs Flávia, Bárbara e Fernanda, que sempre entenderam
os motivos da minha distância e falta de tempo dispensado a elas.
Ao meu marido, Rodrigo Rocha Maia por seu amor e compreensão,
estimulando-me constantemente a seguir em frente e, principalmente, por estar
sempre ao meu lado compartilhando meus sonhos. Muito obrigada por sua
inestimável ajuda, apoio incondicional e estímulo constante.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, na pessoa da
atual Coordenadora Professora Solange Artimos de Oliveira, pela
oportunidade, aos professores pelos ensinamentos, às secretárias Orlandina
da Silva e Souza Alvarenga, pelo profissionalismo e cordialidade.
Aos amigos da UFF, pelo apoio, amizade ao longo desses meses de
convivência.
Ao Hospital Nossa Senhora do Loreto por ter permitido acesso aos
pacientes e suas famílias para a realização deste trabalho.
Aos colegas do setor de Cirurgia Plástica do Hospital Nossa Senhora do Loreto, por terem me recebido de forma tão amigável, pela
paciência e ajuda durante os procedimentos com os pacientes. Em especial, ao
Dr. Luiz Sério Zanini, pelo apoio fundamental durante muitos meses de
trabalho intenso.
A todos aqueles que, por um lapso de memória, foram esquecidos,
mas que direta ou indiretamente contribuiriam nesta jornada, fica aqui
registrado o meu muitíssimo obrigado.
A ciência não é, e nunca será, um livro terminado. Todo progresso
importante levanta novas questões. Dificuldades novas e mais profundas
são reveladas posteriormente a cada desenvolvimento.
Albert Einstein
RESUMO
A fissura labial com ou sem fissura palatina (FL/P) é uma anomalia
craniofacial muito comum em humanos e pode ocorrer como característica de
um quadro sindrômico ou isolada quando os indivíduos afetados não
apresentam qualquer anomalia estrutural associada. A etiologia da FL/P é
complexa, com a contribuição de componentes genéticos e ambientais.
Diversos genes/loci candidatos a FL/P foram sugeridos nos últimos anos,
contudo, discrepâncias entres os resultados são comumente encontradas.
Recentemente, os genes WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, e ARGHAP29 foram
citados como possíveis genes candidatos à etiologia das FL/P devido à
importante função que exercem durante o desenvolvimento craniofacial. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a associação entre polimorfismos nestes
genes com o fenótipo de FL/P em uma população brasileira. Para tanto,
setenta famílias, constituídas por um indivíduo afetado e seus pais não
afetados, foram examinadas clinicamente e amostras de saliva foram coletadas
para estudos moleculares. Um total de 20 polimorfismos distribuídos nos genes
WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, e ARGHAP29 foram estudados com relação à
associação com FL/P utilizando-se o método de TaqMan. O teste de
desequilíbrio de transmissão (TDT) foi utilizado para detectar a associação de
alelos em cada marcador nos indivíduos com FL/P, através do programa
Family-Based Association Test (FBAT). O nível de significância foi determinado
em P ≤ 0,05. Houve associação positiva entre FL/P para os genes ARGHAP29
(rs1048854), TP63 (rs4575879) e WNT9B (rs1530364) com FL/P. Não foi
detectada associação entre alelos e genótipos de WNT3 e PBX1 com FL/P.
Estes resultados sugerem que ARGHAP29, TP63 e WNT9B podem estar
envolvidos na etiologia da FL/P na população estudada.
Palavras-chave: anomalias craniofaciais; etiologia; fissura labial/palatina;
polimorfismos genéticos; SNPs.
ABSTRACT
Cleft lip with or without cleft palate (CL/P) is a common craniofacial
anomaly in humans, and may occur as part of a syndrome or isolated, when the
affected individuals do not present any associated structural anomalies. The
etiology of CL/P is complex, with both genetic and environmental factors
involved. Several genes/loci have been suggested in the past years although
discrepancies among results are often found. Previous studies have
demonstrated that WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, and ARGHAP29 may be
involved in the etiology of the CL/P due to the important function of these genes
during craniofacial development. The aim of this study was to evaluate the
association between polymorphisms in these genes and CL/P in a Brazilian
population. Seventy families, composed by an affected individual and their
unaffected parents, were examined clinically and saliva samples were collected
for molecular analyses. A total of 20 polymorphisms distributed in WNT3,
WNT9B, PBX1, TP63, and ARGHAP29 were investigated using the TaqMan
method. The Family-Based Association Test (FBAT) and the transmission
disequilibrium test (TDT) were used to verify the association between each
marker allele and CL/P. The level of significance was established at P ≤ 0.05.
Positive associations were detected between CL/P and three markers in
ARGHAP29 (rs1048854), TP63 (rs4575879) and WNT9B (rs1530364) genes.
No association was detected between CL/P and markers in WNT3 and PBX1.
These results suggest that ARGHAP29, WNT9B and TP63 may be involved in
the etiology of CL/P in the studied population.
Keywords: craniofacial anomalies; etiology; cleft lip/palate; genetic
polymorphisms; SNPs.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagramas representando a origem embrionária das
estruturas faciais. O terço médio da face é caracterizado pela fusão do
processo frontonasal na parte superior (amarelo) e os processos
maxilares (PMX) bilateralmente na porção mediana da face em
desenvolvimento (verde). A mandíbula é criada pela fusão dos
processos maxilares (azul) em torno de 3,5 semanas de gestação. IMS,
segmento intermaxilar; LNP, proeminência nasal lateral; MNP,
proeminência nasal medial; NP, fossa nasal ............................................
Figura 2: Diagrama das etapas da fusão em um par de proeminências
faciais onde “A” representa a camada epitelial. As proeminências faciais
são ocupadas por células mesenquimais (B) e o crescimento é
impulsionado por sua proliferação (C). O contato inicial ocorre com a
aproximação dos dois epitélios adjacentes (D) e esta adesão é
consolidada através da intercalação de células epiteliais (E). O epitélio
medial é então removido através de uma combinação de apoptose,
migração, e/ou transformação epitélio-mesenquimal (F) resultando na
fusão completa das proeminências da face (G) .......................................
Figura 3: Diagrama mostrando vias de sinalização molecular durante o
desenvolvimento do palato em camundongos. (A) Seção transversal do
palato embrionário. (B) Seções da parede palatina normal (cinza): as
paredes palatinas emanam das proeminências maxilares (E11.5),
crescem e estendem-se verticalmente (E12.5); a língua (T; rosa) desce,
permitindo que as paredes palatinas se elevem (E13,5), se encontrem
(E14.5), fusionando-se na linha media (E15.5). (C) Expressão celular
específica de moléculas de sinalização durante o crescimento e (D)
fusão do palato moléculas expressas no epitélio (amarelo) ou
mesênquima (cinza). As moléculas que mostraram ser essenciais para
o desenvolvimento do palato em camundongos estão circuladas,
sublinhadas quando essenciais em humanos, e em retângulos quando
22
23
essenciais para ambos. As setas que indicam interações gene-gene
(reto) ou ambiente-gene (onduladas) são estabelecidas (preto) ou
hipotéticas (cinza). Ahr, receptor de hidrocarboneto aromático; ALK5,
receptor de ativina como quinase 5; BMP4, proteína óssea
morfogenética 4; BZD's, as benzodiazepinas; MSX1, msh como 1
homeo-box, PTC, patched homólogo 1, Pvrl1 receptor relacionados
poliovírus 1; SATB2, SATB membro da família 2; TBX22, T-box 22;
TgfB3, fator transformador de crescimento β3 (Murray & Schutte, 2004)
Figura 4: Apresentação clínica das Fissuras Labiais. (A) fissura labial
unilateral sem acometimento do alvéolo dentário. (B) fissura labial
bilateral sem comprometimento do alvéolo dentário (Dixon et al., 2011).
Figura 5: Apresentações clínicas das FL/P. (A) fissura labiopalatina
unilateral incompleta; (B) fissura labiopalatina unilateral completa (C) fissura labiopalatina bilateral incompleta; (D) fissura labiopalatina
bilateral completa (Dixon et al., 2011) ......................................................
Figura 6: Apresentação clínica da FP. Fissura palatina completa com
comprometimento dos palatos duro e mole (Dixon et al., 2011) ..............
Figura 7: Esquema da estrutura do gene PBX1. Caixas verdes
representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.
As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados
(da esquerda para a direita): rs6426870, rs10442643, rs1618566,
rs10800043, rs7543038 ............................................................................
Figura 8: Esquema da estrutura do gene ARHGAP29. Caixas verdes
representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.
As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados
(da esquerda para a direita): rs1576593, rs1048854, rs1541098,
rs3789688, rs3814019 ..............................................................................
Figura 9: Esquema da estrutura do gene TP63. Caixas verdes
representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.
As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados
(da esquerda para a direita): rs9332461, rs4575879, rs4607088,
rs4686529, rs1515490 ..............................................................................
25
26
27
28
41
41
42
Figura 10: Esquema da estrutura do gene WNT9B. Caixas verdes
representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.
As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados
(da esquerda para a direita): rs12602434, rs1530364 .............................
Figura 11: Esquema da estrutura do gene WNT3. Caixas verdes
representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.
As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados
(da esquerda para a direita): rs199525, rs111769, rs3851781 ................
Figura 12: Distribuição dos tipos de fissuras na população estudada .....
Figura 13: Distribuição étnica da população estudada ............................
43
43
45
46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Polimorfismos estudados no gene PBX1 ………………………
Tabela 2: Polimorfismos estudados no gene ARHGAP29 ………………
Tabela 3: Polimorfismos estudados no gene TP63 ……………………… Tabela 4: Polimorfismos estudados no gene WNT9B …………………. Tabela 5: Polimorfismos estudados no gene WNT3 …………………… Tabela 6: Resultados do cálculo de poder estatístico do tamanho da
amostra ……………………….................................................................... Tabela 7: Faixa etária da população estudada ........................................
Tabela 8: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos
estudados no gene PBX1………………………..........................................
Tabela 9: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos
estudados no gene TP63 ……………………….........................................
Tabela 10: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos
estudados no gene WNT3 ………………………........................................
Tabela 11: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos
estudados no gene WNT9B ……………………….....................................
Tabela 12: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos
estudados no gene ARHGAP29 ………………………...............................
40
41
42
42
43
44
46
47
48
48
49
50
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABCA4 Do inglês- ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4
Ahr Do inglês , aryl hydrocarbon receptor
Alk5 Do inglês , receptor tyrosine kinase 5
ARHGAP29 Do inglês , Rho GTPase activating protein 29
Bmp4 Do inglês, bone morphogenetic protein 4
BZD's Benzodiazepinas
DNA Do inglês, Deoxyribonucleic acid
EEC Do inglês, ectrodactyly - ectodermal dysplasia and cleft lip/palate
FBAT Do inglês, Family-Based Association Test
FGF Do inglês, Fibroblast Growth Factor
FL Fissuras labial isolada
FL/P Fissura de lábio e/ou palato
FP Fissuras de palato isolada
GWAS Do inglês, Genome Wide Association Studies
IRF6 Do inglês, Interferon Regulatory Factor 6
LNP Proeminência nasal lateral
MAFB Do inglês, V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene
homolog B
MNP Proeminência nasal medial
MSI Segmento intermaxilar
MSX1 Do inglês, Muscle segment homeobox 1
ng Nanograma
NP
OMIM
Fossa nasal
Do inglês, Online Mendelian Inheritance in Man
PBX Do inglês, pre-B-cell leukemia homeobox
PCR Do inglês, Polimerase chain reaction
PMX Processos maxilares
PTCH1 Do inglês, Patched 1
Pvrl1 Do inglês, poliovirus receptor-related 1
SATB2 Do inglês SATB membro da família 2
SNPs Do inglês, single nucleotide polymorphism
SOX5 Do ingles, SRY (sex determining region Y)-box 5
SPP Síndrome pterígio poplíteo
TBX22 T-box 22
TDT Teste de desequilíbrio de transmissão
TGFA Do ingles, transforming growth factor, alpha
TGFB Do ingles, transforming growth factor, beta
TgfB3 Do ingles, transforming growth factor, beta 3
TP63 Do inglês, tumor protein p63
VAX Do inglês, homeobox anterior ventral1
VWS Síndrome de Van der Woude
WNT Do inglês, wingless-type MMTV integration site family
WNT3 Do inglês ,wingless-type MMTV integration site family, member 3
WNT9B Do ingles, wingless-type MMTV integration site family, member
9B
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................
2. REVISÃO DA LITERATURA ..............................................................
2.1. PRIMÓRDIOS DO DESENVOLVIMENTO CRANIOFACIAL ...........
2.2. REGULAÇÃO MOLECULAR DO DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO .......................................................................................
2.3. FISSURA LABIAL COM OU SEM FISSURA PALATINA .................
2.4. GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS GENÉTICOS ...........
2.5. ESTUDOS GENÉTICOS DAS FISSURAS LABIOPALATINAS ......
2.5.1. Estudos de associação …………………………………………….
2.5.2. TP63 .............................................................................................
2.5.3. Via de sinalização WNT ..............................................................
2.5.4. PBX1 .............................................................................................
2.5.5. ARHGAP29 ...................................................................................
3. HIPÓTESE ..........................................................................................
4. OBJETIVOS ........................................................................................
4.1. OBJETIVO GERAL ..........................................................................
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................
5. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................
5.1. POPULAÇÃO ESTUDADA ..............................................................
5.2. EXAME CLÍNICO E ANAMNESE ...................................................
5.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO .............................................
5.4. EXTRAÇÃO DO DNA ......................................................................
5.5. QUANTIFICAÇÃO DO DNA .............................................................
5.6. SELEÇÃO DE GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS DE
UM ÚNICO NUCLEOTÍDEO (SNPs - single nucleotide polimorphisms)
5.7. PBX1.................................................................................................
5.8. ARHGAP29 …………………………………………………………….
5.9. TP63 .................................................................................................
17
20
20
23
26
28
29
29
31
33
34
35
36
37
37
37
38
38
38
39
39
39
40
40
41
42
5.10. WNT9B ...........................................................................................
5.11. WNT3 .............................................................................................
5.12. GENOTIPAGEM ............................................................................
5.13. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................
6. RESULTADOS ...................................................................................
6.1. CARATERIZAÇÃO DA AMOSTRA ..................................................
6.2. ESTUDOS GENÉTICOS DE ASSOCIAÇÃO COM FL/P .................
6.2.1. PBX1..............................................................................................
6.2.2. TP63 ..............................................................................................
6.2.3. WNT3 ............................................................................................
6.2.4. WNT9B .........................................................................................
6.2.5. ARHGAP 29 ..................................................................................
7. DISCUSSÃO .......................................................................................
7.1. DESENHO DO ESTUDO .................................................................
7.2. SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS
ESTUDADOS ..........................................................................................
7.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS ........................................................
7.4. MÉTODO DE GENOTIPAGEM .......................................................
7.5. RESULTADOS DE ASSOCIAÇÃO COM A FL/P .............................
7.5.1. PBX1 .............................................................................................
7.5.2. TP63 ..............................................................................................
7.5.3. WNT Genes ..................................................................................
7.5.4. ARHGAP29 ...................................................................................
7.6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO .............................................................
7.7. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................
8. CONCLUSÕES ...................................................................................
REFERÊNCIAS ......................................................................................
APÊNDICE 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ......................................................................................
APÊNDICE 2: QUESTIONÁRIO ...........................................................
ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ......
ANEXO 2: INSTRUÇÕES DO FABRICANTE – ORAGENE DNA
42
43
43
44
45
45
47
47
47
48
49
49
51
51
53
55
56
56
56
58
60
62
65
66
67
68
77
78
79
PURIFICATION KIT (DNA GENOTEK) ...............................................
80
17
1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento humano é um evento complexo que exige a
integração de vários mecanismos para permitir a formação correta de todas as
estruturas. As fissuras orofaciais ocupam um lugar de destaque entre as
anomalias de desenvolvimento humano, estando entre os defeitos craniofaciais
congênitos mais comuns e apresentando um forte componente genético
(Fraser & Calnan, 1961). Embriologicamente, as fissuras orofaciais podem ser
distinguidas em fissuras labiais (FL), fissuras de palato (FP), e fissuras lábio-
palatinas (FL/P). As fissuras lábio-palatinas, podem incluir as fissuras labiais
associadas ou não à fissura do palato, uma vez que o desenvolvimento e o
mecanismo fisiopatológico de ambas são distintos (Fogh-Andersen, 1942).
Aproximadamente 30% dos casos de FL/P estão associados a síndromes ou
aberrações cromossômicas e cerca de 400 síndromes apresentam FL/P como
parte do fenótipo. Os 70% restantes são considerados casos isolados, onde a
FL/P ocorre em indivíduos que não apresentam qualquer outra anomalia
estrutural (Murray & Schutte, 2004). Estudos familiares sugerem que a FL e
FLP são malformações genéticas distintas da FP (Natsume, 1987). A incidência
relatada para FL e FLP varia de 1:500 a 1:1000 nascimentos dependendo da
população (Dixon et al., 2011). Para FP a incidência relatada é menor, em
torno de 1:1500 nascimentos (Mossey and Little, 2002). A incidência da FL/P
isolada varia de acordo com os diferentes grupos étnicos, ocorrendo em geral
em um caso a cada 1.000 nascimentos em caucasianos. Os índios norte-
americanos são os mais afetados com 1,99 casos para cada 1.000
nascimentos; já nos asiáticos a prevalência é de 1,05 casos para cada 1.000
nascimentos e a menor prevalência é de afro-americanos com um índice de
0,62 em 1000 nascimentos (Croen et al., 1998). Existem variações também
com relação ao tipo de fissura nos diferentes gêneros, onde pacientes do sexo
masculino apresentam maior prevalência de FL/P enquanto pacientes do sexo
feminino apresentam maior prevalência de FP. Outros fatores como localização
geográfica (cidades com altitude elevada), e baixo status socioeconômico
18
também têm sido sugeridos como fatores que podem aumentar a
susceptibilidade à FL/P.
A etiologia da FL/P isolada é complexa com o envolvimento de diversos
genes e fatores ambientais os quais podem interagir e modular o risco de
ocorrência da condição (Vieira, 2008). Desde o primeiro relato da associação
do gene do fator de crescimento transformador alfa (TGFA) com FL/P (Ardinger
et al., 1989), a identificação de genes candidatos para FL/P e vias de
sinalização importantes para o desenvolvimento craniofacial tem sido objeto de
inúmeras pesquisas (Jugessur & Murray, 2005; Lidral & Moreno, 2005).
Diversos estudos utilizando famílias de indivíduos afetados por FL/P, ou
indivíduos não relacionados afetados por FL/P (casos e controles) seguiram e
sugeriram diversos genes e loci como possíveis candidatos a FL/P isolada em
diferentes populações (Dixon et al., 2011).
Os genes da via wingless-type MMTV integration site family (WNT)
foram associados à FL/P em humanos (Chiquet et al., 2008; Menezes et al.,
2010). Dentre estes, os genes WNT3 e WNT9B foram inicialmente escolhidos
baseado em estudos demonstrando a sua importância na formação do palato
de camundongos (Juriloff & Harris, 2006). Desde então, diversos estudos
demonstraram a associação de diferentes genes da via WNT com a FL/P em
diferentes populações (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Yao et al.,
2011; Mostowska et al., 2012). Os genes da via WNT são considerados
importantes coadjuvantes na etiologia da FL/P uma vez que estes genes
participam de uma complexa cascata de sinalização, que controla diversos
processos durante o desenvolvimento craniofacial (Chiquet et al., 2008;
Menezes et al., 2010).
Assim como os genes da via WNT, o gene PBX1 foi, inicialmente,
escolhido baseado em estudos com modelos animais, uma vez que
camundongos nulos para PBX1 e PBX3 simultaneamente, apresentavam FL/P
(Ferreti et al., 2011). Até o presente momento, não existem estudos
demonstrando associação destes genes em humanos.
O gene TP63 surgiu como candidato ao desenvolvimento de FL/P após
mutações neste gene terem sido identificadas como causadoras da síndrome
19
EEC (ectrodactyly - ectodermal dysplasia and cleft lip/palate), caracterizada por
ectrodactilia, displasia ectodérmica e fenda palatina (Online Mendelian
Inheritance in Man, OMIM # 604292) (Ianakiev et al., 2000). Além disso,
estudos com modelos animais mostraram que este gene desempenha um
papel importante no desenvolvimento do palato (Yang et al., 1999; Thomason
et al., 2008). Outros dois estudos de Genome Wide Association Studies
(GWAS) sugeriram uma região no cromossomo 3q em que o TP63 está
localizado como candidata à etiologia da FL/P. O primeiro estudo foi realizado
com uma amostra de famílias chinesas e replicado em seis diferentes
populações (chinesa, filipina, colombiana, indiana, turca e norte americana), e o
cromossomo 3q (3q27-28) foi novamente citado como candidato de risco para
a ocorrência de FL/P (Marazita et al., 2002; Marazita et al., 2009).
O gene ARGHAP29 foi sido sugerido como possível candidato à FL/P
devido à sua importante função durante o desenvolvimento craniofacial (Leslie
et al., 2012). Diversas evidências biológicas (Kaartinen et al., 1995; Juriloff &
Harris, 2006; Moustakas & Heldin, 2008; Kardassis et al., 2009; Schlessinger et
al., 2009) sugerem que os genes envolvidos na via de sinalização do
ARGHAP29 e suas variações podem estar implicados nas anomalias de
desenvolvimento craniofaciais.
A identificação de genes candidatos ao desenvolvimento da FL/P em
uma determinada população proporcionará um melhor entendimento sobre esta
anomalia e apontará novas direções quanto a possíveis métodos de prevenção
e tratamento futuros. Além da tentativa de detectar novos genes/loci
potencialmente envolvidos na etiologia da FL/P, a replicação de estudos
anteriores é uma prática comum na genética humana, para verificar se as
associações sugeridas se repetem em outras populações. Dessa forma, o
presente estudo teve como objetivo verificar a existência da associação entre
polimorfismos nos genes ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B, em
famílias de indivíduos com FL/P de uma população brasileira. Até a presente
data, não existem relatos de estudos de associação entre os genes
ARGHAP29, PBX1 e FL/P na população brasileira, conferindo ineditismo ao
presente estudo. .
20
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. PRIMÓRDIOS DO DESENVOLVIMENTO CRANIOFACIAL
O desenvolvimento normal da face humana compreende uma cascata
de eventos complexos e rigidamente controlados durante o desenvolvimento
embrionário, regulados através de genes cujos fatores de transcrição podem
ser traduzidos em proteínas estruturais, regulatórias ou enzimáticas (Kirschner
& LaRossa, 2000).
Na quarta semana de vida embrionária, as estruturas ectodérmicas que
contribuem para a formação craniofacial participam da formação da face,
cavidades nasais e oral (Kirschner & LaRossa, 2000). As células originárias da
crista neural cranial migram sob a forma de células mesenquimais para os
processos embrionários craniofaciais durante o fechamento do tubo neural. Os
segmentos da crista neural, por sua vez, migram para os arcos branquiais em
desenvolvimento para se tornarem precursores de cartilagem, osso, músculo e
tecido conjuntivo do complexo craniofacial (Sender et al., 2003; Jiang et al.,
2006).
O espessamento do ectoderma de superfície em ambos os lados da
proeminência frontal, é a primeira indicação da cavidade nasal, que são
chamadas de placas nasais (Burston & Orth, 1959). Estas placas começam a
invaginar-se por dois métodos: o crescimento anterior dos processos nasais e
pela sua migração resultando nas fossas nasais. Uma fina membrana oronasal
localiza-se entre as fossas e a cavidade oral. Esta membrana se rompe e forma
as coanas primitivas. A diferenciação, crescimento, e eventual fusão destas
proeminências darão origem à região nasal (Sender et al., 2003; Jiang et al.,
2006). No final do segundo mês, a maxila se desenvolve enquanto uma
divisória entre o nariz primitivo e a cavidade oral começa a se formar (Figura 1).
A porção anterior do palato é derivada da área da maxila formada pelos
processos nasais mediais (segmento intermaxilar) que e é chamado palato
21
primário. O desenvolvimento dos outros dois terços posteriores do palato
(palato secundário) inicia-se com a formação de duas projeções verticais na
cavidade oral de ambos os lados da língua, que são provenientes do
crescimento medial dos processos maxilares. Durante a sétima semana, as
paredes palatinas elevam-se e assumem uma orientação horizontal, que irá
posteriormente fundir-se (Arosarena, 2007). O septo nasal cresce inferiormente
e une-se com as duas paredes palatinas para formar duas cavidades distintas:
a cavidade oral e as coanas definitivas (Yoon et al., 2000). O desenvolvimento
do palato se completa em torno da décima segunda semana de gestação e
resulta na formação do palato duro, palato mole e a úvula.
A palatogênese exige remodelação da matriz extracelular e fusão
subsequente das paredes palatinas (Figura 2). Em condições fisiológicas
normais, a remodelação é um processo estritamente controlado e necessário
para o desenvolvimento embrionário (Woessner, 1994). Vários fatores de
crescimento, fatores de transcrição, receptores, sinais de polarização,
peptídeos vasoativos, proteínas de adesão celular, componentes da matriz
extracelular e metaloproteinases estão envolvidas no desenvolvimento das
paredes palatais (Arosarena, 2007).
22
Figura 1: Diagramas representando a origem embrionária das estruturas faciais. O terço médio da face é caracterizado pela fusão do processo frontonasal na parte superior (amarelo) e os processos maxilares (PMX) bilateralmente na porção mediana da face em desenvolvimento (verde). A mandíbula é criada pela fusão dos processos maxilares (azul) em torno de 3,5 semanas de gestação. segmento intermaxilar (ISIM); proeminência nasal lateral (LNP); proeminência nasal medial (MNP); fossa nasal (NP). Fonte: Jugessur et al. (2009).
PMX
PNM
PNL SIM
Olho
Fossa nasal
4.5 Semanas 14 Semanas
23
Figura 2: Diagrama das etapas da fusão em um par de proeminências faciais onde “A” representa a camada epitelial. As proeminências faciais são ocupadas por células mesenquimais (B) e o crescimento é impulsionado por sua proliferação (C). O contato inicial ocorre com a aproximação dos dois epitélios adjacentes (D) e esta adesão é consolidada através da intercalação de células epiteliais (E). O epitélio medial é então removido através de uma combinação de apoptose, migração, e/ou transformação epitélio-mesenquimal (F) resultando na fusão completa das proeminências da face (G). Fonte: adaptado de Jugessur et al. (2009).
2.2. REGULAÇÃO MOLECULAR DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
O desenvolvimento craniofacial é considerado um evento complexo
composto por diversos de tecidos de diferentes origens, os quais têm que se
comunicar entre si para que possam se desenvolver corretamente. Os eventos
mais críticos durante a formação do nariz, lábios e palato apresentam períodos
de desenvolvimento que ocorrem de forma ordenada. Durante este processo,
determinadas alterações celulares, tanto físicas quanto biomecânicas, devem
ocorrer com objetivo de fornecer um correto desenvolvimento desta região.
A sinalização celular faz parte de um complexo sistema de comunicação
que governa e coordena as atividades e funções celulares. Este processo
envolve uma série de eventos celulares e moleculares rigidamente controlados.
Tais processos envolvem, por exemplo: reparação tecidual, moléculas de
adesão celular (caderina-e) e da matriz extracelular (Tudela et al., 2002). Erros
A B C D E F G
24
existentes no processamento de informação celular são responsáveis por
doenças e anomalias de desenvolvimento. A partir do melhor entendimento
sobre os processos de sinalização celular, muitas doenças poderão ser
tratadas de maneira mais eficaz e anomalias de desenvolvimento melhor
entendidas (Figura 3). Estas interações celulares ocorrem devido a sinalização
de alguns genes que agrupam-se em quatro famílias (Wolpert et al. 2002).:
• Fibroblast Growth Factor (FGF): estão associados à angiogênese,
desenvolvimento da mesoderme e condução axonal, entre outros;
• Hedgehog Family: aponta-se como o mais conhecido desta família o
Sonic Hedgehog, que é o responsável pela modelação do tubo
neural em vertebrados e indução da formação de diversos tipos de
neurónios;
• WNT Family: são importantes no estabelecimento da polaridade nos
membros dos vertebrados;
• TGF-B super Family: englobam as famílias TGFB, ativina, BMP e
VG1, entre outras proteínas. As proteínas BMP são capazes de
controlar o ciclo celular de outras células, bem como a sua migração
e diferenciação (Wolpert et al. 2002).
25
0000 Figura 3: Diagrama mostrando vias de sinalização molecular durante o desenvolvimento do palate em camundongos. (A) Seção transversal do palato embrionário. (B) Seções da parede palatina normal (cinza): as paredes palatinas emanam das proeminências maxilares (E11.5), crescem e estendem verticalmente (E12,5); a língua (T; rosa) desce, permitindo que as paredes palatinas se elevem (E13.5), se encontrem (E14.5), fusionando-se na linha media (E15.5). (C) Expressão celular específica de moléculas de sinalização durante o crescimento e (D) fusão do palate: moléculas expressas no epitélio (amarelo) ou mesênquima (cinza). As moléculas que mostraram ser essenciais para o desenvolvimento do palato em camundongos estão circuladas, sublinhadas quando essenciais em humanos, e em retângulos quando essenciais para ambos. As setas que indicam interações gene-gene (reto) ou ambiente-gene (onduladas) são estabelecidas (preto) ou hipotéticas (cinza). Ahr, receptor de hidrocarboneto aromático; Alk5, receptor de ativina como quinase 5; Bmp4, proteína óssea morfogenéticas 4; BZD's, as benzodiazepinas; Msx1, msh como 1 homeo-box, PTC, patched homólogo 1, Pvrl1 (receptor relacionados poliovírus 1); SATB2, SATB membro da família 2; TBX22, T-box 22; TgfB3, fator transformador de crescimento B3 (Murray e Schutte, 2004).
26
2.3. FISSURA LABIAL COM OU SEM FISSURA PALATINA
As fissuras labiopalatinas podem acometer somente o lábio, sendo
chamadas fissuras labiais (FL), podendo ou não envolver o alvéolo dentário ou
ocorrendo somente no palato sendo chamadas fissuras palatinas (FP). Mas na
maioria dos casos as fissuras acometem ambas as estruturas labial e palatina
concomitantemente e são chamadas de fissuras labiopalatinas. Quando estas
estão restritas somente ao palato mole, são caracterizadas como fissuras
incompletas. Além disso, as FL/P podem ser classificadas como unilaterais ou
bilaterais (Murray, 2002).
As FL/P possuem diferentes origens embriológicas, onde se destacam
(Moore, 2005):
1) Fissuras de Lábio Isolado (FL): As fissuras do lábio resultam de um
desenvolvimento imperfeito do palato embrionário primário. A Figura 4 ilustra as apresentações clínicas dos tipos de FL;
Figura 4: Apresentação clínica das Fissuras Labiais. (A) fissura labial unilateral sem acometimento do alvéolo dentário. (B) fissura labial bilateral sem comprometimento do alvéolo dentário (Dixon et al., 2011).
2) Fissuras de Lábio e Palato (FL/P) - Quando as fissuras labiais se
estabelecem, frequentemente, a deformação do desenvolvimento facial
impede o contato das cristas palatinas, quando elas giram para a
posição horizontal, de tal forma que as fissuras do palato primário são
B A
27
frequentemente acompanhadas pelas fissuras do palato secundário
(duro e mole). A Figura 5 ilustra as apresentações clínicas das FL/P;
Figura 5: Apresentações clínicas das FL/P. (A) fissura labiopalatina unilateral incompleta; (B) fissura labiopalatina unilateral complete; (C) fissura labiopalatina bilateral incompleta; (D) fissura labiopalatina bilateral completa (Dixon et al., 2011).
3) Fissuras de Palato Isolado (FP): Resultam do distúrbio de qualquer
um dos estágios da palatogênese: crescimento inadequado dos
processos palatinos, elevação atrasada ou falha na elevação dos
processos palatinos, falhas durante a fusão ou ruptura pós-fusão. A
Figura 6 ilustra a apresentação clínica da FP.
A B
C D
28
Figura 6: Apresentação clínica da FP. Fissura palatina completa com comprometimento dos palatos duro e mole (Dixon et al., 2011). 2.4. GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS GENÉTICOS
Genes que potencialmente representam um papel na etiologia de uma
alteração em particular são denominados candidatos àquela alteração. A
maioria dos genes candidatos à FL/P foram, originalmente, sugeridos através
de observações durante o processo de embriogênese em modelos animais
(Young et al., 2000). Outras indicações também surgiram de estudos com
aberrações cromossômicas e estudos de ligação com famílias de indivíduos
afetados, apontando determinadas regiões cromossômicas como contendo
possíveis genes candidatos (Murray, 2002).
Polimorfismos de um único nucleotídeo, também conhecidos como
SNPs (single nucleotide polymorphisms), são formas variantes da sequência de
DNA que podem estar presentes nos indivíduos de uma população dentro de
um espectro considerado biologicamente normal (Kornman et al., 1997). A
hipótese de que a forma variante possa estar associada à função alterada de
um gene em particular e consequentemente possa exercer algum papel na
etiologia da FL/P pode ser analisada através da análise das frequências desses
polimorfismos em indivíduos afetados (Prescott et al., 2000).
A
29
2.5. ESTUDOS GENÉTICOS DAS FISSURAS LABIOPALATINAS
Estudos de genes candidatos têm sido o foco das pesquisas de FL/P
desde que Ardinger e colaboradores (Ardinger et al., 1989) sugeriram o papel
para o gene TGFA (fator de crescimento de transformação alfa) e variantes no
risco de FL/P não-sindrômica. A identificação de genes candidatos em
humanos tem utilizado dados de expressão genica e estudos durante o
desenvolvimento craniofacial em animais, principalmente camundongos (Jiang
et al., 2006). Outros genes candidatos também surgiram a partir de estudos
com aberrações cromossômicas e estudos de ligação com famílias de
indivíduos afetados, apontando determinadas regiões cromossômicas como
susceptíveis a conter possíveis genes candidatos (Murray, 2002).
O uso de genes candidatos sugeridos a partir de estudos de FL/P
sindrômica tem se mostrado uma ferramenta auxiliar também para estudos de
FL/P não sindrômica. Por exemplo, o gene IRF6, sugerido como candidato a
FL/P não sindrômica após a sua identificação como fator causal a síndromes
de Van der Woude (VWS; OMIM 119300; Kondo et al., 2002) e da síndrome
pterígio poplíteo (SPP) (OMIM 119500; Kondo et al., 2002), foi primeiramente
associado a FL/P não sindrômica em Zucchero et al. (2004). As associações
com IRF6 foram posteriormente replicadas em diversas populações (Blanton et
al., 2005; Ghassibe et al., 2005; Scapoli et al., 2005; Vieira et al., 2007; Letra et
al., 2012).
2.5.1. Estudos de associação
Nos estudos de associação são comparadas as frequências alélicas de
polimorfismos de um único nucleotídeo, ou SNPs, entre indivíduos afetados e
não afetados, desde que sejam não relacionados. O polimorfismo em estudo
pode ter ação biológica direta no fenótipo da doença, ou o SNP pode estar em
desequilíbrio de ligação com os genes candidatos que determinam
susceptibilidade a essa doença (Aschard et al., 2007).
30
O termo “associação” descreve a coocorrência entre alelos e fenótipos.
Em contraste aos estudos de ligação, que são apropriados para detectar
grandes efeitos de variantes raras, os estudos de associação são adequados
para detectarem efeitos genéticos pequenos ou moderados ligados às
variantes comuns no genoma (Letra et al., 2010).
Os avanços tecnológicos na área da genética e da genômica permitiram
análises simultâneas de centenas de milhares de marcadores por um custo
razoavelmente baixo, promovendo a expansão dos estudos de associação
genômica em larga escala (Genome Wide Associations Studies - GWAS).
Nesse tipo de estudo, buscam-se novos loci contendo genes de
susceptibilidade a diversas doenças complexas, por meio de varreduras do
genoma, utilizando-se plataformas que analisam milhares de SNPs
simultaneamente (Johnson & O’Donnell, 2009).
Como já é evidente para muitas doenças complexas, os estudos de
GWAS recentes têm proporcionado grandes avanços para o melhor
entendimento dos genes e vias de sinalização que desempenham papel
importante na etiologia da FL/P. O primeiro GWAS para FL/P utilizou uma
população de origem caucasiana, confirmando a associação do gene IRF6
(1q32.3-q41), e revelou uma nova região candidata à etiologia da FL/P,
localizada do cromossomo 8q24 (Birnbaum et al., 2009). Mangold et al. (2010)
replicaram esses resultados em seu GWAS em uma população européia,
identificando ainda loci adicionais nos cromossomos 10q25 (VAX1) e 17q22
(NOG). A região 8q24 foi confirmada por um terceiro GWAS em caucasianos
nos EUA (Grant et al., 2009), e em um estudo com trios de famílias nucleares
(pai, mãe e indivíduos afetado) em uma população composta por caucasianos
e asiáticos (Beaty et al., 2010). Curiosamente, o nível de evidência estatística
de marcadores dentro do cromossomo 8q24 era mais significativo entre os trios
de ascendência europeia, enquanto que a evidência de ligação e associação
para marcadores em IRF6 era mais significativa em trios de ascendência
asiática. Além disso, dois novos loci candidatos, contendo os genes MAFB e
ABCA4 foram identificados, mostrando associações significativas nos
indivíduos asiáticos em comparação com europeus (Beaty et al., 2010). A
31
associação de FL/P com o gene ABCA4 (Fontoura et al., 2012) e com a
região 8q24 (Bagordakis et al., 2013) foi posteriormente confirmada em
populações brasileiras enfatizando o possível papel destes genes na etiologia
da FL/P.
Estas observações enfatizam a natureza multifatorial da FL/P e
encorajam a realização de estudos genéticos em diversas populações para
determinar o papel de cada gene candidato em cada população. Abaixo segue
um breve resumo de cada gene candidato proposto neste estudo.
2.5.2. TP63 O gene TP63 está localizado na região cromossômica 3q27, contém 15
éxons e exerce um papel no desenvolvimento epidérmico, sendo detectado em
vários tecidos humanos incluindo a região craniofacial (Van Bokhoven &
Brunner, 2002). Alguns estudos realizados em animais relacionaram a
expressão da proteína p63 com o desenvolvimento de FL/P (Thomason et al.,
2008). Uma pesquisa recente em camundongos demonstrou que IRF6 é um
alvo direto de TP63, que por sua vez está associado com várias síndromes de
malformações que incluem FL/P. Uma das hipóteses é que TP63 está
relacionado com a transcrição do IRF6 e uma mutação neste gene poderia
aumentar a susceptibilidade às fissuras (Ferreti et al., 2011).
Em outro estudo, camundongos com mutação no gene IRF6 exibiram
uma epiderme hiper-proliferativa sem diferenciação terminal levando a
múltiplas aderências epiteliais e resultando em FL/P. Esses resultados
demonstraram que IRF6 tem um papel determinante na proliferação e na
diferenciação de queratinócitos (Ingraham et al., 2006).
Diversos genes têm sido considerados candidatos na etiologia da FL/P
devido à sua possível interação com genes considerados chave na formação
craniofacial. Assim como o IRF6, o BMP4 tem um papel chave na formação do
palato (Zhang et al., 2002). Por este motivo, várias outras alternativas têm sido
descritas nas vias que regulam BMP4 nos últimos anos incluindo o papel do
32
TP63 na formação do palato. Segundo Thomason et al. (2008), no início do
desenvolvimento do palato, o fator de transcrição TP63 regula a expressão de
BMP4 no palato anterior. A perda do gene TP63 pode levar à alteração da
expressão de uma variedade de genes (incluindo BMP4) nos processos
maxilares a partir do momento em que as conchas palatais são formadas. Isto
resulta na expressão alterada dos genes, consequente em defeitos na
formação do longo eixo das conchas palatinas e no desenvolvimento de fenda
palatina (Thomason et al., 2008).
As principais síndromes humanas envolvendo a desregulação na
expressão da proteína p63 incluem EEC, ectrodactilia e Hay-Wells (Rinne et
al., 2007). Celli et al. (1999) realizaram um estudo que mapeou SNPs no gene
TP63 em várias famílias com a síndrome EEC (ectrodactyly, ectodermal
dysplasia and cleft lip/palate, OMIM 604292). A síndrome EEC é caracterizada
por ectrodactilia, displasia ectodérmica e FL/P. De fato, este gene foi
previamente implicado na síndrome dos membros-glândulas mamárias (LMS,
OMIM 603543), caracterizada por diversas anomalias incluindo fissura palatina
e úvula bífida. Ianakiev et al. (2000) evidenciaram mutações no gene TP63 em
famílias com os fenótipos de ectrodactilia e da síndrome EEC. Wessagowit et
a. (2000) relataram sobre os aspectos clínicos e moleculares de uma paciente
com a síndrome EEC. O estudo concluiu que a desordem era consequente de
uma mutação do gene TP63. Por sua vez, a síndrome Hay-Wells é
caracterizada por diversas anomalias incluindo fenda labial e/ou palatal,
displasia ectodérmica congênita. Acredita-se que esta é causada por mutações
missense do gene TP63 e que a sobreposição dos fenótipos, nesta e nas
síndromes supracitadas, ocorrem devido a interações entre os genes na via de
sinalização do TP63 e as proteínas que interagem com o domínio SAM deste
gene (Mcgrath, 2001).
33
2.5.3. Via de sinalização WNT As proteínas Wnt formam uma família de moléculas de sinalização
altamente conservadas que regulam a interação célula-célula durante a
embriogênese. As descobertas sobre os mecanismos de ação dos genes da
família Wnt surgiram a partir de estudos de vários sistemas incluindo estudos
genéticos em Drosophila e Caenorhabditis elegans, estudos bioquímicos em
cultura de células e expressão de genes em embriões de Xenopus. Mutações
nos genes na família Wnt ou nos genes envolvidos nesta via de sinalização
parecem levar a defeitos específicos de desenvolvimento; além disso, várias
doenças humanas, incluindo o câncer, parecem estar relacionadas com uma
sinalização anormal destes genes. Acredita-se que as proteínas expressadas
pelos genes da família Wnt ligam-se a receptores da família frizzled e LRP na
superfície da célula. Através de vários componentes citoplasmáticos o sinal é
traduzido à beta-catenina, esta, então, entra no núcleo para formar um
complexo com TCF e assim ativar a transcrição dos genes alvo de Wnt. A sinalização desta via pode ter pelo menos três alternativas distintas.
Duas alternativas de sinalização são a da polaridade planar da célula e a outra
dependente de cálcio. Uma terceira via, chamada canônica, sinaliza através da
β-catenina. A ativação do receptor Frizzled pela sinalização Wnt tem como
efeito a instabilidade de um complexo proteico (Gskβ), cuja atividade, quando
estável, reduz a quantidade de β-catenina no citoplasma (Kikuchi, 2000). Deste
modo, em células onde a via Wnt está ativa, há acumulação citoplasmática de
β-catenina, pela instabilidade do Gskβ, possibilitando que esta seja translocada
para o núcleo. Uma vez no núcleo, fatores de transcrição são ativados
promovendo a expressão de genes efetores (Kikuchi, 2000).
Dezenove genes da família WNT foram identificados até o presente
momento. Juriloff & Harris (2006) observaram a presença de mutações no gene
WNT9B em uma linhagem de camundongos A/WySn, característica pela
presença de FL/P, e sugeriram que o gene homólogo em humanos (WNT9B)
poderia ser um gene candidato a FL/P isolada. De fato, variações em genes da
família WNT incluindo WNT3, WNT3B, WNT8, WNT9B, e WNT11 foram
34
associadas à FL/P isolada (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010). Yao et
al. (2011) relataram a associação de duas SNPs (rs752107 e rs3121310),
localizados no gene WNT3, e FL/P em um estudo caso controle realizado com
população chinesa. Chiquet et al. (2008) observaram a associação de WNT9B
com FL/P em uma amostra constituída por americanos com descendência
europeia e hispânicos, sendo a associação mais significativa observada nas
famílias com descendência europeia. Menezes et al. (2010) observaram
associação significativa entre WNT3 (rs142167) e FL/P em seu estudo caso-
controle em uma população brasileira. Estes achados sugerem que os genes
da família WNT desempenham um papel chave no desenvolvimento do lábio e
palato (Juriloff & Harris, 2006; Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Yao
et al., 2011).
2.5.4. PBX1 O gene PBX1 está localizado na região 1q23 e é constituído por 338 ou
439 aminoácidos associado às proteínas HOX, cuja função é ligar-se às
sequências específicas do DNA (5’ATCAATCAA3’) para regulação do processo
de transcrição. Por muitos anos os genes da família PBX tem demonstrado seu
envolvimento no desenvolvimento de órgãos e do esqueleto. Uma dentre
muitas das suas funções, os genes da família PBX regulam uma cadeia de
moléculas de sinalização no desenvolvimento craniofacial, incluindo WNT,
fatores de crescimento de fibroblastos (FGF), proteína p63 e do fator regulador
de interferon 6 (IRF6). Porém, apenas recentemente, mutações nos genes da
família PBX foram sugeridas como fatores de risco ao desenvolvimento das
FL/P. Ferretti et al. (2011) analisaram o papel dos genes PBX1, PBX2, e PBX3
no desenvolvimento facial e demonstraram que as mutações que afetam os
genes PBX1 e PBX3 concomitantemente resultaram no desenvolvimento de
FL/P em todos os embriões de rato com essas mutações. Além disso, os
embriões de camundongos com mutações nos genes PBX também tinham
reduzido ou anulado a atividade do WNT, que desempenha um papel de
35
destaque no desenvolvimento do ectoderma em embriões. Os autores
concluíram que distúrbios nesta rede podem levar a uma diminuição da morte
celular programada, interferindo assim, com a fusão apropriada de tecidos
faciais e resultando no desenvolvimento de FL/P (Ferreti et al., 2011). Apesar
de todas as evidências, até a presente data não existem relatos de estudos em
humanos associando genes da família PBX e a ocorrência de FL/P.
2.5.5. ARHGAP29 ARHGAP29 está localizado no cromossomo 1p22, um locus que foi
identificado por GWAS de FL/P a 47 kb de ABCA4. Este gene codifica Rho,
uma proteína de ativação de GTPase (GAP) 29 que modula a regulação cíclica
de pequenas proteínas de ligação de GTP tais como RhoA (Saras et al., 1997).
Acredita-se, ainda, que proteína RhoA está envolvida em várias funções
celulares relacionadas com a forma, movimento, interações célula-célula, e
proliferação; todos esses pontos são críticos para o desenvolvimento
craniofacial (Mossey et al., 2009). De fato, Rho é um fator envolvido em ambas
as vias de sinalização TGFB (Kardassis et al., 2009) e WNT (Schlessinger et
al., 2009) as quais têm sido implicadas no desenvolvimento craniofacial
(Kaartinen et al., 1995; Juriloff & Harris, 2006; Moustakas & Heldin, 2008), uma
vez que camundongos knockout para estes genes desenvolveram defeitos
craniofaciais incluindo fendas do lábio, palato ou ambos. Nesta hipótese,
acredita-se que ARHGAP29 poderia ser um mediador da sinalização Rho
implicado no desenvolvimento craniofacial. Em um estudo mais recente foi
demonstrado que a expressão reduzida do gene IRF6 também acarretava na
diminuição da expressão do ARHGAP29 na região craniofacial,
especificamente no epitélio da região palatina. Ainda, a análise por
sequenciamento direto do gene ARHGAP29 revelou oito mutações como
potenciais candidatas na etiologia das FL/P. Este trabalho sugeriu também Rho
como um fator envolvido na via de sinalização entre o gene ARHGAP29 e os
genes da via de sinalização IRF6 (Leslie et al., 2012).
36
3. HIPÓTESE
Polimorfismos nos genes ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B
estão associados à FL/P em uma população brasileira.
37
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a associação entre variações genéticas (polimorfismos) em
genes expressos no desenvolvimento craniofacial e FL/P.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a existência de associação entre polimorfismos nos genes
ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B com a FL/P em uma população
brasileira.
38
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. POPULAÇÃO ESTUDADA
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil, Rio de Janeiro, RJ (Anexo 1).
A amostra foi constituída de 70 famílias, cada uma incluindo um
indivíduo afetado e seus pais não afetados, totalizando 210 indivíduos que se
encontravam em tratamento no setor de cirurgia plástica do Hospital Nossa
Senhora do Loreto, Rio de Janeiro, RJ. Pacientes diagnosticados previamente
como portadores de alguma síndrome não foram incluídos no estudo. Todos os
pacientes e seus responsáveis foram informados sobre os termos do projeto de
pesquisa e foram incluídos neste estudo após aquiescência e assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice 1).
5.2. EXAME CLÍNICO E ANAMNESE
Todos os indivíduos foram analisados clinicamente e através de fichas
clínicas e/ou exames radiográficos para observação dos seguintes parâmetros:
presença de fissura (FL, FL/P ou FP) e lado da fissura (direito, esquerdo,
bilateral, e central). Indivíduos cujo tipo e/ou lado da fissura não puderam ser
determinados através de exame clínico ou através das fichas clínicas foram
considerados como apresentando “tipo/lado de fissura desconhecido”
(Apêndice 2).
Adicionalmente, para cada indivíduo, as seguintes informações
demográficas foram registradas: história positiva de FL/P na família; idade do
paciente; história positiva de diagnóstico de câncer no paciente ou em algum
familiar de primeiro ou segundo grau de parentesco; história de tabagismo e/ou
uso de substâncias alcoólicas (materna) durante a gestação e uso de
39
medicamentos e/ou substâncias teratogênicas durante a gestação (Apêndice
2). Todos os dados foram registrados em uma ficha individual para cada
paciente e então transferidos para uma base de dados.
5.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
Amostras de saliva foram coletadas de todos os indivíduos como fonte
de DNA genômico utilizando-se os recipientes de coleta Oragene® DNA (DNA
Genotek, Ontario, CA). Após a coleta, as amostras foram mantidas à
temperatura ambiente até o momento de seu processamento.
5.4. EXTRAÇÃO DO DNA
As amostras foram incubadas a 50° C durante 2h antes da extração do
DNA. O DNA foi extraído utilizando-se o tampão de extração prepIt (DNA
Genotek, Ontario, CA) seguindo as instruções do fabricante (Anexo 2).
5.5. QUANTIFICAÇÃO DO DNA
A concentração e a pureza do DNA foram determinadas através da
leitura de densidade óptica em um espectrofotômetro NanoDrop® 8000
(ThermoScientific, Wilmington, DE) através de medições de comprimento de
onda de 260nm. A razão entre os valores obtidos nos comprimentos de onda
260nm e 280nm foi usada para estimar a pureza do DNA genômico. Somente
as amostras de DNA com razão 260/280 acima de 1,7 foram incluídas neste
estudo.
40
5.6. SELEÇÃO DE GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS DE UM
ÚNICO NUCLEOTÍDEO (SNPs - single nucleotide polimorphisms)
A seleção dos genes candidatos deste estudo (PBX1, ARHGAP29,
TP63, WNT3 e WNT9B) foi previamente descrita na Revisão de Literatura.
Neste estudo foram selecionados os SNPs que se classificassem, de
preferência, como: 1) potencialmente funcionais por alterarem a sequência de
aminoácidos da proteína final, por ocorrerem próximo à região promotora do
gene e potencialmente influenciarem a expressão gênica, ou, ainda, àqueles
que demonstraram alterar a função ou expressão do gene; 2) SNPs em
desequilíbrio de ligação com outros SNPs em regiões de um gene candidato.
Carlson et al. (2004) descreveram uma abordagem para seleção do mínimo de
SNPs representando ao máximo a estrutura de desequilíbrio de ligação de
determinada região.
Vinte SNPs foram selecionados para serem investigados quanto a
associação com FL/P. Detalhes sobre a localização e função dos SNPs
selecionados em cada gene candidato constam nas tabelas e figuras a seguir.
5.7. PBX1
Tabela 1: Polimorfismos estudados no gene PBX1
Cromossomo SNP Posição Alelos Função 1 rs6426870 162790577 CT upstream 1 rs10442643 162830010 AG intron 1 rs1618566 162873970 AG intron 1 rs10800043 162924681 CT intron 1 rs7543038 162990459 GT intron
41
Figura 7: Esquema da estrutura do gene PBX1. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs6426870, rs10442643, rs1618566, rs10800043, rs7543038.
5.8. ARHGAP29
Tabela 2: Polimorfismos estudados no gene ARHGAP29 Cromossomo SNP Posição Alelos Função
1 rs1576593 94404339 CT Near-3’ UTR 1 rs1048854 94416119 AG Sinônimo 1 rs1541098 94440558 CT Intron 1 rs3789688 94463828 CT Intron 1 rs3814019 94476984 AG Near-5’UTR
Figura 8: Esquema da estrutura do gene ARHGAP29. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs1576593, rs1048854, rs1541098, rs3789688, rs3814019.
42
5.9. TP63
Tabela 3: Polimorfismos estudados no gene TP63 Cromossomo SNP Posição Alelos Função
3 rs9332461 190824484 AG upstream 3 rs4575879 190904013 AG intron 3 rs4607088 190933984 CT intron 3 rs4686529 190980310 AG intron 3 rs1515490 191079549 CT intron
Figura 9: Esquema da estrutura do gene TP63. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs9332461, rs4575879, rs4607088, rs4686529, rs1515490. 5.10. WNT9B
Tabela 4: Polimorfismos estudados no gene WNT9B Cromossomo SNP Posição Alelos Função
17 rs12602434 42283052 CG Near-5’UTR 17 rs1530364 42306776 AG intron
Figura 10: Esquema da estrutura do gene WNT9B. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a
43
direita): rs12602434, rs1530364.
5.11. WNT3
Tabela 5: Polimorfismos estudados no gene WNT3 Cromossomo SNP Posição Alelos Função
17 rs199525 42203002 GT intron 17 rs111769 42227151 CT intron 17 rs385178
1 42246300 CT intron
Figura 11: Esquema da estrutura do gene WNT3. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs199525, rs111769, rs3851781.
5.12. GENOTIPAGEM
Para genotipagem, as amostras de DNA foram diluídas em agua
deionizada estéril em uma concentração de 2ng/µL e armazenadas a -20o C
para serem utilizadas ao longo do estudo.
As amostras de DNA foram genotipadas utilizando-se o método Taqman
(Ranade et al., 2001). Para cada polimorfismo estudado, as reações foram
realizadas em placas de 384 poços, em um volume total de 3 µL/reação,
contendo 1 µL de DNA, 1,5 µL de Taqman PCR MasterMix (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA), 0,0375 µL de cada SNP (Applied
Biosystems, Foster City, CA) e 0,425 µL de água deionizada estéril. As reações
foram realizadas em um sequenciador automático ViiA7TM (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA) utilizando-se as condições de reação estandardizadas
para a técnica de Taqman (95 o C por 10 minutos, 40 ciclos à 95 o C por 15
44
segundos, e 60 o C por 1 minuto).
5.13. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Poder do estudo:
O teste proposto por Purcell et al. (2003) foi utilizado para calcular o
poder estatístico do estudo. Os cálculos indicaram que o tamanho da amostra
coletada neste estudo (70 trios totalizando 210 indivíduos) proporcionou um
poder estatístico de ~98% para detectar associação com um valor de P=0,05
uma vez que os marcadores selecionados estavam em desequilíbrio de ligação
com o fenótipo (D’=0,08) e a frequência dos marcadores foi estimada em
~20%.
Tabela 6: Resultados do cálculo de poder estatistico do tamanho da amostra
Alpha Poder Estatístico Número de casos para 80% de poder
0,1 0,9947 24,49 0,05 0,9876 31,09 0,01 0,9482 46,27 0,001 0,8194 67,64 0,05 0,9876 31,09
Análise de Associação:
O teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) foi utilizado para verificar
a associação de alelos em cada marcador nos indivíduos com FL/P. Para isto
utilizamos o programa Family Based Association Tests (FBAT) - (Horvath et al.,
2001). O nível de significância foi estabelecido em P < 0,05.
45
6. RESULTADOS 6.1. CARATERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Dos indivíduos portadores de FL/P, 43% eram do gênero feminino
enquanto 57% indivíduos eram do gênero masculino. A distribuição dos tipos
de FL/P na população estudada foi de 6% para as fissuras labiais, 20% de
fissuras palatinas, e 74% de fissuras labiopalatinas (Figura 12). Com relação à
distribuição étnica, 36% dos indivíduos afetados eram de descendência afro-
brasileira e os restantes 64% eram caucasianos (Figura 13). Nenhum
paciente/responsável relatou o uso ou exposição a alguma substância
potencialmente teratogênica como pesticidas e herbicidas.
Figura 12: Distribuição dos tipos de fissuras na população estudada
46
Figura 13: Distribuição étnica da população estudada
A idade média dos indivíduos portadores de FL/P foi de 3,1 ± 2,8 anos
(idade mínima dois meses; máxima 13 anos). A idade média materna foi de
23,4 ± 13,2 anos (idade mínima 13 anos; máxima 40 anos) e a idade média
paterna foi de 25 ±17 (idade mínima 18 anos; máxima 56 anos). Estes dados
estão resumidos na Tabela 7.
Tabela 7: Faixa etária da população estudada Indivíduos Idade média ±dade
média padrao Min/Max
Crianças com FL/P 3,1 ±.2,8 65 dias-13 anos Pais 25 ±17 18-56 anos Mães 23,4 ± 13,2 13-40 anos
47
6.2. ESTUDOS GENÉTICOS DE ASSOCIAÇÃO COM FL/P
6.2.1. PBX1 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene PBX1 e
FL/P estão representados na Tabela 8. Não foi detectada associação
significativa entre os SNPs estudados e FL/P (p>0,05).
Tabela 8: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene PBX1
SNP Alelo afreq Base P valor Referência * rs6426870 1 0,202 C 0,0705 C: 34,314% (1540 / 4488) rs6426870 2 0,798 T 0,0705 T: 65,686% (2948 / 4488) rs1044264 1 0,345 A 0,8907 A: 100,000% rs1044264 2 0,655 G 0,8907 C: 0,000% rs1080004 1 0,188 C 0,0863 C: 92,525% (2030 / 2194) rs1080004 2 0,812 T 0,0863 T: 7,475% (164 / 2194) rs7543038 1 0,512 G 0,8787 G: 52,434% (2273 / 4335) rs7543038 2 0,488 T 0,8787 T: 47,566% (2062 / 4335) rs1618566 1 0,301 A 0,8964 A: 24,983% (1115 / 4463) rs1618566 2 0,699 G 0,8964 G: 75,017% (3348 / 4463)
* Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/). 6.2.2. TP63 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene TP63 e
FL/P estão representados na Tabela 9. A análise de transmissão de alelos
entre os indivíduos afetados e os progenitores mostrou diferenças significativas
para as frequências de ambos os alelos no marcador rs4575879 (p=0,02). Não
foi detectada associação significativa entre os SNPs rs9332461, rs4607088,
rs4686529, rs1515490 e FL/P (p > 0,05) (Tabela 9).
48
Tabela 9: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene TP63
SNP Alelo afreq Base P valor Referência * rs9332461 1 0,277 A 0,6682 A: 30,382% (1352 / 4450) rs9332461 2 0,723 G 0,6682 G: 69,618% (3098 / 4450) rs4575879 1 0,559 A 0,0268 A: 52,605% (2080 / 3954) rs4575879 2 0,441 G 0,0268 G: 47,395% (1874 / 3954) rs4607088 1 0,617 C 0,3523 C: 55,063% (2507 / 4553) rs4607088 2 0,383 T 0,3523 T: 44,937% (2046 / 4553) rs4686529 1 0,468 A 0,0754 A: 56,771% (1811 / 3190) rs4686529 2 0,532 G 0,0754 G: 43,229% (1379 / 3190) rs1515490 1 0,312 C 0,6547 C: 25,8% (30,96/120) rs1515490 2 0,688 T 0,6547 C: 74,2% (89,04/120)
*Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).
6.2.3. WNT3 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene WNT3 e
FL/P estão representados na Tabela 10. Não foi detectada associação
significativa entre os SNPs estudados e FL/P (p >0,05) (Tabela 10).
Tabela 10: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene WNT3
SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs199525 1 0,199 G 0,1495 G: 10,994% (241 / 2192); rs199525 2 0,801 T 0,1495 T: 89,006% (1951 / 2192) rs111769 1 0,648 C 0,3096 C: 67,521% (1765 / 2614) rs111769 2 0,352 T 0,3096 T: 32,479% (849 / 2614)
rs3851781 1 0,574 C 0,5078 C: 50,662% (2181 / 4305) rs3851781 2 0,426 T 0,5078 T: 49,338% (2124 / 4305)
*Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).
49
6.2.4. WNT9B Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene WNT9B e
FL/P estão representados na Tabela 11. A análise de transmissão de alelos
entre os indivíduos afetados e os progenitores, mostrou diferenças
significativas para as frequências de ambos os alelos no marcador rs1530364
(p=0,001). Não foi detectada associação significativa entre o SNP rs12602434 e
FL/P (p>0,05) (Tabela 11).
Tabela 11: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene WNT9B
SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs12602434 1 0,156 C 0,7236 C: 28,008% (1285 / 4588) rs12602434 2 0,844 G 0,7236 G: 71,992% (3303 / 4588) rs1530364 1 0,315 A 0,001 A: 29,359% (1411 / 4806) rs1530364 2 0,685 G 0,001 G: 70,641% (3395 / 4806)
*Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).
6.2.5. ARHGAP 29 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene
ARHGAP29 e FL/P estão representados na Tabela 12. A análise de
transmissão de alelos entre os indivíduos afetados e os progenitores mostrou
diferenças significativas para as frequências de ambos os alelos no marcador
rs1048854 (p=0,03). Nenhuma associação foi detectada para os demais SNPs
testados (Tabela 11).
50
Tabela 12: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene ARHGAP29
SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs1576593 1 0,387 C 0,3017 C: 49,982% (1406 / 2813)
rs1576593 2 0,613 T 0,3017 T: 49,982% (1406 / 2813)
rs1048854 1 0,185 A 0,0395 A: 82,575% (8651/10477) rs1048854 2 0,815 G 0,0395 G: 17,425% (1825/ 10477) rs1541098 1 0,133 C 0,8526 C: 19,034% (863 / 4534)
rs1541098 2 0,867 T 0,8526 T: 80,966% (3671 / 4534)
rs3789688 1 0,688 C 0,2733 A: 55,905% (2400 / 4293) rs3789688 2 0,312 T 0,2733 G: 44,095% (1893 / 4293) rs3814019 1 0,250 A 0,1657 A: 70,935% (2958 / 4170)
rs3814019 2 0,750 G 0,1657 G: 29,065% (1212 / 4170)
*Frequência de referência dos alelos em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).
51
7. DISCUSSÃO 7.1. DESENHO DO ESTUDO
Os estudos de associação são ferramentas para identificação de
variantes genéticas que predispõem às alterações de desenvolvimento
caracterizadas como complexas. O objetivo deste estudo foi verificar a provável
associação entre um determinado genótipo ou alelo de um gene candidato à
etiologia das FL/P permitindo, assim, a identificação de genes que podem estar
envolvidos com o fenótipo em questão (Letra et al., 2007). Dois tipos de
desenho de estudo são frequentemente utilizados nos estudos de associação e
são classificados como estudos caso-controle e núcleo familiar.
Pode-se definir os estudos caso-controle como uma forma de pesquisa
na qual são comparados dois grupos, onde o primeiro grupo de indivíduos
apresenta uma determinada condição (caso) e o segundo grupo não apresenta
tal condição (controle). Este tipo de estudo é muito utilizado por permitir um
recrutamento de um grande número de indivíduos afetados, sem a
necessidade de incluir seus familiares (Risch, 2000). Por outro lado, os estudos
caso-controle apresentam a desvantagem de se basearem na diferença entre a
frequência dos alelos entre os grupos, que pode ser influenciada pela
heterogeneidade populacional (Letra et al., 2007). De fato, a população
brasileira tem um histórico de grande miscigenação no qual certamente é uma
das preocupações para grupos de pesquisa nacionais que realizam estudos
genéticos. Esta miscigenação conta com aproximadamente 20 gerações de
casamentos entre três grupos ascendentes (nativos, negros e europeus)
tornando a população brasileira uma das mais heterogêneas do mundo (Pena
et al., 2011).
A forma de obtenção dos dados amostrais é uma outra preocupação
neste tipo de delineamento, pois dependendo desta, pode existir um efeito de
confundimento gerado pelo desbalanceamento na constituição genômica dos
indivíduos caso e controle, conduzindo a falsas conclusões resultantes de
52
testes de hipóteses de interesse. Existem na literatura várias propostas para
contornar este tipo de efeito. Batista et al. (2008) e Giolo et al. (2011)
comparam modelos logísticos com e sem covariáveis genéticas e concluíram
que para estudos caso-controle são necessários ajustes visando controlar o
efeito de estratificação populacional. Uma alternativa mais adequada consiste
no uso de delineamentos experimentais mais robustos, tais como a utilização
de amostras de trios.
O desenho deste estudo foi baseado no uso de famílias nucleares (pai,
mãe, e criança afetada) para a investigação de variações genéticas em cinco
genes candidatos associadas à FL/P. A ideia geral deste tipo de delineamento
é coletar uma amostra aleatória de indivíduos afetados juntamente com seus
pais (não afetados), ou seja; a base da análise e o estudo da segregação de
alelos nos trios, com o intuito de selecionar casos e controles de uma mesma
população genética (o núcleo familiar) e avaliar se o gene em estudo está
associado com a etiologia da doença em questão. Para este tipo de estudo de
associação de marcadores moleculares com uma determinada doença, o
genótipo do filho afetado é considerado como um ponto amostral do grupo
“caso” e os dois alelos (um materno e um paterno) que não foram transmitidos
para o filho afetado são considerados um ponto amostral do grupo “controle”.
Desta maneira, têm-se as amostras de casos e de controles de uma mesma
população genética (Purcell et al., 2005). A principal vantagem do estudo de
núcleos familiares é o controle de possíveis efeitos da estratificação
populacional.
No presente estudo foi utilizada uma amostra de conveniência. Este tipo
de amostragem não probabilística é destituído de qualquer rigor estatístico. O
pesquisador seleciona os elementos a que tem acesso, admitindo que estes
possam representar o universo amostral representativo da população em geral.
No entanto, a amostragem por conveniência é adequada e frequentemente
utilizada para geração de ideias em pesquisas exploratórias (Marotti, 2008), tal
qual a utilizada neste estudo, onde a amostra foi composta por 70 famílias/trios
incluindo indivíduos portadores de FL/P isolada, pai e mãe não afetados. Com
relação à distribuição étnica, 36% dos indivíduos afetados eram de
53
descendência afro-brasileira e os 64% restantes eram caucasianos. A
proporção observada para os tipos de FL/P em homens (57%) e mulheres
(43%) corresponde aos dados relatados na literatura. De acordo com Aquino et
al. (2011) foi, também, observada a predominância de FL/P em indivíduos do
gênero masculino na população brasileira.
7.2. SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS
ESTUDADOS
Antes dos avanços alcançados em biotecnologia, os estudos de
associação genética consideravam plataformas ou mapas de marcadores
moleculares compostos de algumas dezenas de nucleotídeos chamados
microssatélites (Pritchard & Feldman, 1996). Com o avanço das técnicas de
sequenciamento, foram identificadas regiões do genoma onde longas
sequências diferem entre os indivíduos em apenas um nucleotídeo. O nome
dado a este tipo de marcador do genoma é SNP, ou polimorfismo de um único
nucleotídeo. Em particular, este tipo de mapa ou plataforma genômica foi
introduzida e disponibilizada pelo International HapMap Project (2003), que é
um consórcio entre grandes centros de pesquisa com a finalidade de descrever
os padrões comuns de variação genética humana. Atualmente, os estudos que
visam a busca por marcadores moleculares associados a uma doença estão
evoluindo sobremaneira. Alguns métodos têm sido propostos em estudos de
associação para a detecção de loci individuais ao longo do genoma e com o
objetivo de pesquisar o mapa de marcadores para encontrar regiões
candidatas, onde pode-se citar as análises de associação entre os loci e a
doença como uma das mais utilizadas. Esta classe de procedimentos foca
diretamente na doença estudada e visa encontrar regiões de marcadores
associados a ela (Aschard et al., 2007).
Muitos genes candidatos a FL/P têm sido sugeridos através de
resultados de estudos biológicos em modelos animais demonstrando a sua
importância durante o desenvolvimento embrionário, resultados de estudos de
54
ligação e de desequilíbrio de ligação, resultados de estudos de associação com
marcadores em todo o genoma (GWAS), aberrações cromossômicas e formas
sindrômicas de FL/P (Murray, 2002). A abordagem deste estudo, com relação à
seleção dos genes estudados, seguiu os modelos acima. Liu et al. (2012)
estudaram características fenotípicas faciais com o objetivo de identificar genes
envolvidos no desenvolvimento craniofacial. Os resultados dos estudos de
GWAS identificaram cinco loci genéticos independentes associados aos
diferentes fenótipos faciais, sugerindo o envolvimento de TP63 como potencial
candidato na determinação das feições faciais humanas. Outros dois estudos
GWAS (Genome Wide Association Studies) sugeriram uma região no
cromossomo 3q em que o TP63 está localizado como candidata à etiologia da
FL/P. O primeiro estudo foi realizado com uma amostra de famílias chinesas e
replicado em seis diferentes populações (chinesa, filipina, colombiana, indiana,
turca e norte americana), e o cromossomo 3q (3q27-28) foi novamente citado
como candidato de risco para a ocorrência de FL/P (Marazita et al., 2002;
Marazita et al., 2009)
Os genes TP63 e PBX1 foram escolhidos baseados em resultados de
estudos biológicos em modelos animais demonstrando a sua importância
durante o desenvolvimento craniofacial e na formação do palato (Thomason et
al., 2008; Ferreti et al., 2011). Entretanto, até a presente data, existem poucos
relatos de estudos de associação com estes genes na ocorrência de FL/P em
humanos. Além da tentativa de detectar novos genes/loci potencialmente
envolvidos na etiologia da FL/P, a replicação de estudos anteriores é uma
prática comum nos estudos genéticos, visando verificar se associações
sugeridas em uma determinada população se repetem em outras populações.
Nesse contexto, associações entre FL/P e os genes, WNT3, WNT9B, and
ARHGAP29, já foram relatadas em outros estudos (Chiquet et al., 2008;
Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Leslie et al., 2012) e foram
escolhidos no intuito de verificarmos a existência de associação na nossa
população. WNT3 e WNT9B foram localizados na região clf1 e identificados
como contribuidores para o fenótipo de FL/P em camundongos (Juriloff et al.,
2005). Nos seres humanos, as variações em genes WNT foram descritas em
55
casos de FL/P sindrômica (WNT3 e síndrome de Tetra-Amelia) – (Niemann et
al., 2004) e não sindrômica (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010). Com
relação ao gene ARHGAP29, que foi inicialmente sugerido como candidato à
FL/P em estudos de associação cobrindo todo o genoma (GWAS) - (Beaty et
al., 2010), um recente estudo mostrou que mutações neste gene podem
contribuir para FL/P (Leslie et al., 2012).
7.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os resultados do presente estudo foram analisados estatisticamente
através do teste de desequilíbrio de transmissão utilizando-se o programa
FBAT e o valor indicando significância foi estabelecido em p < 0,05.
Este teste foi descrito inicialmente para a utilização de dados
proveniente de trios (pai, mãe e indivíduo afetado), conforme a amostra deste
estudo, com o objetivo de averiguar a associação entre loci de marcadores
moleculares e genes que influenciam a suscetibilidade à doença baseados na
transmissão alélica entre familiares afetados e não afetados (Spielman et al.,
1993). Entre as vantagens deste teste, destaca-se a habilidade de evitar
variáveis de confundimento (por exemplo: efeitos de estratificação
populacional) que podem induzir a evidências falso-positivas (Ewens &
Spielman, 2003).
Para o TDT, as amostras são consideradas geneticamente homogêneas
por possuírem o mesmo “background” genético, onde os pais são utilizados
como amostra controle e os filhos como casos afetados. Uma desvantagem
deste método é que estudos com análises de associação baseadas em família,
especialmente as que utilizam o TDT, são mais restritivos devido ao fato
desses testes utilizarem apenas uma parcela da amostra considerada
informativa. Assim, é possível que os resultados negativos obtidos no presente
estudo se devam a um erro estatístico do tipo II ocorrido em função do método
de análise utilizado (Ewens & Spielman, 2003).
56
7.4. MÉTODO DE GENOTIPAGEM
A genotipagem do presente estudo foi realizada através do método de
TaqMan, proposto por Ranade et al. (2001), e consiste na utilização de sondas
fluorescentes alelo-específicas, que combinam as etapas de amplificação e
detecção dos alelos em uma única etapa e elimina a necessidade de
procedimentos adicionais para a determinação do genótipo. A fluorescência é
medida durante a reação de PCR e os genótipos inferidos a partir desses
valores. Desta forma, o método TaqMan elimina viés por erro de interpretação,
pois os genótipos são gerados automaticamente sem interferência da análise
humana. Esta é uma técnica dispendiosa devido à necessidade de se usar um
equipamento especial com filtros para detecção de fluorescências em
diferentes comprimentos de onda e do alto custo das sondas fluorescentes
(Letra et al., 2007). Entretanto, a simplicidade da técnica, a alta especificidade
e a confiabilidade dos resultados, fizeram com que o método TaqMan se
tornasse uma importante ferramenta para o estudo de associação em doenças
complexas, como a FL/P (Vieira, 2008).
7.5. RESULTADOS DE ASSOCIAÇÃO COM A FL/P
7.5.1. PBX1 A morfogênese da região craniofacial requer uma coordenação precisa
de programas celulares, incluindo a proliferação, migração, diferenciação e
apoptose (Cox, 2004). Camundongos e humanos apresentam morfologia
craniofacial semelhante durante o desenvolvimento embrionário (Tamarine e
Boyde, 1977; Gritli-Linde, 2008), por essa razão o camundongo oferece um
modelo adequado para estudar esses processos. Tomando como base este
ponto, diversos genes candidatos a anomalias genéticas têm sido relatados a
partir de modelos animais. Um estudo recente demonstrou a importância do
57
papel do gene PBX1 durante a palatogênese em camundongos (Ferreti et al.,
2011). Ferreti et al. (2011) demonstraram em seu estudo que camundongos
nulos para ambos os genes PBX1 e PBX3 desenvolveram FL/P sugerindo que
estes genes podem estar associados ao desenvolvimento de FL/P. Neste
mesmo estudo, a mutação de PBX com ausências de ambas as cópias do
gene e, consequentemente, com ausência de expressão do mesmo, destacou
a importância do papel do PBX1 na morfogênese da face média e seu
envolvimento na expressão dos genes PBX2 e PBX3, membros da mesma
família, uma vez que esta ocorre de forma concomitante a expressão do PBX1.
Notavelmente, nas áreas médias da face, os níveis de PBX1 eram mais
elevados quando comparados com os genes PBX2 e PBX3. Outro fato
importante observado neste estudo com os genes da família PBX foi a
ausência de apoptose em camundongos mutantes para o gene PBX indicando
que as proteínas de PBX podem atuar como indutores de apoptose durante a
morfogênese facial média. Curiosamente, p63 e IRF6, foram citados como
mediadores de apoptose em alguns contextos (Ingraham et al., 2006; Pietsch,
et al., 2008) e também são expressos durante desenvolvimento da face. De
fato, foi demonstrado que a desregulação do gene PBX depende da rede
molecular do complexo WNT-p63-IRF6, interligando vários genes dentro de
uma cascata de acontecimentos responsável pela formação anormal do lábio e
do palato primário em camundongos (Ferreti et al., 2011).
Neste estudo, não foi detectada associação significativa entre os SNPs
estudados no gene PBX1 e FL/P (p > 0,05). Entretanto, dada a complexidade
da etiologia das FL/P, outras investigações em outras populações podem ser
necessárias para confirmar a associação do gene PBX1 com a FL/P.
58
7.5.2. TP63 Evidências que apoiam a participação do gene TP63 como gene
candidato ao desenvolvimento de FL/P incluem estudos genéticos em humanos
(Marazita et al., 2002; Rinne et al., 2007; Marazita et al., 2009) e estudos em
modelos animais mostrando que este gene desempenha papel importante no
desenvolvimento do palato (Yang et al., 1999; Thomason et al., 2008). Em um
estudo com famílias chinesas, Marazita et al. (2002) analisaram marcadores
que pudessem estar associados ao desequilíbrio de ligação em outras regiões
que supostamente poderiam estar envolvidas em FL/P. Como resultado desta
varredura genômica, os autores sugeriram o cromossomo 3q (onde se localiza
o gene TP63) como sendo a região mais significativa, juntamente com o
cromossomo 4q, Posteriormente, Marazita et al. (2009) replicaram o estudo em
chineses em diversas populações incluindo as populações chinesa, filipina,
colombiana, indiana, turca e norte americana. Como resultado, o cromossomo
3q (3q27-28) foi novamente citado como candidato de risco para a FL/P.
Contrariando os estudos anteriores, os resultados de Paranaíba et al. (2013)
não demonstraram associação entre TP63 e FL/P em um estudo caso controle
realizado em uma população brasileira.
Através do mapeamento do gene em várias famílias com a síndrome da
displasia ectodérmica com FL/P, Celli et al. (1999) localizaram o TP63 na
região cromossômica 3q27-29. O TP63 codifica pelo menos seis isoformas
protéicas a depender da sequência promotora iniciadora ou do rearranjo
alternativo após exclusão de introns, fenômeno chamado de splicing. De fato, o
gene TP63 codifica três domínios: um domínio de transativação amino-terminal,
representado pelos aminoácidos 01 a 59; um domínio de ligação ao DNA com
os aminoácidos 142 a 321; e um domínio de oligomerização carboxi-terminal
nos aminoácidos 353 a 397. Ainda em humanos, mutações no gene TP63
foram associadas a diversas anormalidades de desenvolvimento, tais como:
síndrome EEC com FL/P (OMIM 604292), síndrome de Hay-Wells (OMIM
106260) e síndrome de Rapp-Hodgkin (OMIM 129400, Rinne et al., 2007).
Ianakiev et al. (2000) evidenciaram mutações afetando o gene TP63,
59
especificamente no domínio de ligação do DNA, em famílias com os fenótipos
da síndrome EEC, caracterizada por ectrodactilia, displasia ectodérmica e
fenda palatina (OMIM 604292). Além disso, a perda da expressão de p63
resultou em várias anormalidades de desenvolvimento incluindo FL/P em
camundongos (Thomason et al., 2008).
Recentemente, foi relatado que p63 e IRF6 interagem epistaticamente
na palatogênese (Thomason et al., 2010). Tendo como base a hipótese que a
expressão de IRF6 é reduzida no desenvolvimento da face média de
camundongos mutantes para PBX e WNT9B e, ainda, que p63 regula a
expressão de IRF6 (Noszczyk et al., 2001; Rahimov et al., 2008; Thomason et
al., 2010).
Mills et al. (1999) analisaram o papel do gene TP63 na embriogênese de
camundongos usando células-tronco e evidenciaram que esse tem função
importante na diferenciação do ectoderma. Os camundongos nulos para o gene
TP63 apresentaram sérias anormalidades estruturais e craniofaciais; algumas
delas incompatíveis com a sobrevivência. Finalmente, Wessagowit et al. (2000)
relataram a ocorrência e os aspectos clínicos e moleculares de uma paciente
com a síndrome EEC, que é descrita como uma desordem de desenvolvimento
autossômica dominante com alta variabilidade de expressão e penetração
reduzida, cujo substrato molecular é a mutação do gene TP63. Apesar das
evidências biológicas implicando o gene TP63 como possível candidato na
etiologia da FL/P, existem poucos estudos incluindo o gene como candidatos a
FL/P não sindrômica em humanos.
Em nosso estudo os resultados forneceram evidência adicional para a
associação de TP63 (rs4575879 com um p valor = 0,02) com FL/P na nossa
população. Ainda se desconhece se os polimorfismos localizados em introns e,
consequentemente, em regiões não codificadoras ou em sítios de splicing,
podem causar alguma mudança funcional na expressão final da proteína.
Contudo, diversos estudos relataram a presença de que polimorfismos
associados com desordens complexas, como FL/P, que estão localizados em
áreas intrônicas, incluindo a associação do gene IRF6 (Zucchero et al., 2004;
Ghassibe et al., 2005; Vieira et al., 2007; Jia et al., 2009; Jugessur et al., 2009).
60
Portanto, este tipo de SNP não deve ser desconsiderado como potencialmente
prejudicial na etiologia das FL/P. Devido à heterogeneidade genética entre as
populações, é importante investigar a associação de genes previamente
relatados com FL/P em múltiplas populações.
7.5.3. WNT Genes Os genes da via de sinalização WNT são conservados entre as espécies
e são essenciais para o desenvolvimento de vários processos, incluindo a
morfogênese da face (Fossat et al., 2011). Outros estudos relataram que estes
genes são expressos no terço médio da face de camundongos e de galinhas
(Lan et al., 2006; Brugmann et al., 2007; Song et al., 2009; Reid et al., 2011)
concluindo-se que a sinalização de WNT tem um papel importante na
padronização facial de espécies específicas. Foi ainda relatado que a perda de
função de componentes de WNT está associada com malformações na região
média da face e com o desenvolvimento de fissuras orais (Carroll et al., 2005;
Juriloff & Harris, 2006).
Evidências que apoiam a participação dos genes da família WNT como
loci possíveis para o desenvolvimento das FL/P vêm do estudo realizado com
camundongos WySn/A, que apresentaram FL/P na ausência de expressão de
WNT3 (Juriloff et al., 2004). WNT3 e WNT9B foram localizados na região clf1
em camundongos e identificados como possíveis contribuidores para a FL/P
nos mesmos (Juriloff et al., 2005). Em humanos, variações genéticas em genes
WNT foram descritos em casos de FL/P sindrômica (Niemann et al., 2004) e
não sindrômica (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Mostowska et al.,
2012).
Neste presente estudo, foram investigados SNPs WNT3 e WNT9B como
possíveis candidatos na etiologia das FL/P em famílias brasileiras. Nossos
resultados corroboram os resultados de Chiquet et al. (2008), que relataram a
associação de WNT9B com FL/P em uma amostra constituída por americanos
com descendência europeia e hispânicos, sendo a associação mais forte
61
observada nas famílias com descendência europeia. Entretanto, nesta
pesquisa, observamos associação apenas para o SNP rs1530364 no gene
WNT9B. Menezes et al. (2010) observaram uma associação significativa entre
WNT3 (rs142167) e FL/P no seu estudo caso-controle em uma população
brasileira, embora neste estudo não tenha sido observada associação com
WNT3 e FL/P. Haplótipos em genes WNT3 e WNT9B também foram
associados com o fenótipo de fenda. Em um estudo realizado na população
polonesa por Mostowska et al. (2012), os resultados sugeriram a mutação em
WNT3 (rs3809857) como uma variante de risco para FL/P. Além disso, a
análise de haplótipos revelou que WNT3 está significativamente associado com
FL/P.A associação de FL/P com WNT5A foi encontrada apenas casos de
fissura unilateral esquerda. No presente estudo as amostras não foram
estratificadas em subgrupos de FL/P (unilateral, bilateral, direita ou esquerda)
porque o número de amostras por grupo seria diminuído prejudicando as
análises.
Em um contexto semelhante, considera-se que indivíduos com fissuras
unilaterais, que apresentam agenesias do incisivo lateral sobre o lado não
fissurado, podem apresentar uma fenda bilateral. Já a ausência do incisivo
lateral representaria uma microforma da fissura, ou seja, um insucesso da
fenda bilateral em se desenvolver (Letra et al., 2007). Em estudos com
diferentes abordagens, as vias de sinalizações moleculares da via WNT têm
sido implicadas na regulação do desenvolvimento dentário, onde WNT3 mostra
a expressão específica na formação do esmalte dentário. A importância do
WNT3 durante odontogênese é ainda realçada pela perda progressiva de
ameloblastos dos dentes incisivos pós-natal em ratos transgênicos (Millar et al.,
2003).
Nesta pesquisa, foi observada a associação do SNP rs rs1530364 (p
valor = 0,03). Este polimorfismo está localizado em uma região intrônica na
posição 42306776. De fato, os SNPs mais investigados estão em regiões
intrônicas ou regiões intergênicas e não parecem alterar sítios de fatores de
transcrição de ligação ou ter qualquer outro efeito potencialmente prejudicial.
No estudo realizado por Menezes et al. (2010), a análise in silico revelou que
62
nenhum dos SNPs testados anularam a expressão da proteína, embora exista
a possibilidade de alguns alelos terem um efeito prejudicial no
desenvolvimento. Por exemplo, o SNP rs566926 em WNT5A, associado com
FL/P unilateral esquerda, está localizado num sítio de ligação para o fator de
transcrição intrônico intensificador da função para a qual o alelo “A” cria dois
novos sítios de ligação com SOX5, ambos estes fatores de transcrição
envolvidos na regulação do desenvolvimento embrionário.
Uma série de observações sugerem os genes WNT9B e o WNT3 como
candidatos para FL/P (Menezes et al., 2010; Mostowska et al., 2012). De fato, a
transdução das vias de sinalização WNT depende da fosforilação da proteína
intracitoplasmática Dsh que, uma vez fosforilada, neutraliza o complexo de
degradação da proteína beta-catenina. A presença de moléculas WNT impede
a fosforilação e posterior ubiquitinação da beta-catenina, o que leva ao
acúmulo desta proteína no citoplasma translocando-a para o núcleo das
células, onde interage com fatores de transcrição (Gordon & Nusse, 2006).
Assim, quando em excesso, os sinais de WNT impedem que a beta-catenina
siga sua via natural de degradação por ubiquitinação, o que resulta no acúmulo
desta proteína no núcleo das células e consequentemente, altera a transcrição
de diversos genes, inclusive os que regulam a proliferação, a sobrevivência e a
adesão celular (Seto & Bellen, 2004).
7.5.4. ARHGAP29
Os primeiros estudos de GWAS para FL/P encontraram fortes
evidências para a associação de um marcador (rs987525) na região
cromossômica 8q24 em FL/P (Birnbaum et al., 2009; Mangold et al., 2010).
Esta associação foi validada de forma independente em diversas populações
incluindo uma população brasileira. Recentemente, um outro estudo GWAS
identificou associações em marcadores perto do gene ABCA4 gene, localizado
no cromossomo 1p22.1 em múltiplas populações de FL/P (Beaty et al., 2010).
Em um estudo subsequente, o gene ABCA4 foi associado como um candidato
63
de risco para o desenvolvimento de FL/P em uma população brasileira
(Fontoura et al., 2012). Tradicionalmente, o desequilíbrio de ligação (LD) tem
sido utilizado para ajudar na identificação de variantes etiológicos após GWAS
com base no conceito de que uma variante etiológica pode mostrar uma
associação estatística com um marcador não causal, se os dois estiveram em
LD em uma determinada população (Murray et al., 1987). Por este motivo,
atualmente, o gene ARHGAP29 tem sido considerado como um gene
candidato a etiologia das FL/P.
ARHGAP29 está localizado na região cromossômica 1p22.1 à 47 kb
centroméricas do gene ABCA4 e codifica a proteína ativadora Rho GTPase
(GAP) 29, que por sua vez medeia a regulamentação cíclica de pequenas
proteínas de ligação de GTP como RhoA (Saras et al., 1997). Segundo
Schlessinger et al. (2009), Rho sofre efeito da sinalização da via WNT e que a
sinalização da proteína Rho está envolvida no desenvolvimento craniofacial.
Esta rede de sinalização é mediada, em parte, pela rede de genes IRF6 e de
ARHGAP29. Na verdade, Rho é uma proteína ativadora de GTPase envolvida
na regulação de pequenas proteínas de ligação de GTP e necessária para a
terminação da transcrição de determinados genes (Heasman et al., 2008). O
suporte para este mecanismo foi sustentado por um estudo realizado com
objetivo de analisar o perfil de expressão da cultura de células-tronco da polpa
dentária obtidas de indivíduos com FL/P. Esta caracterização mostrou uma
diminuição da expressão do gene ARHGAP29 em quase três vezes quando
comparado às culturas de pacientes controle não afetados (Bueno et al., 2011).
Neste caso, a perda da proteína GAP manteve Rho em uma forma ativa (GTP-
dependente) aumentando, consequentemente, a sua atividade. Assim sendo,
este efeito poderia afetar negativamente a migração celular durante o
desenvolvimento, representando um mecanismo possível pelo qual
ARHGAP29 pode estar envolvido na etiologia das FL/P. Em tecidos humanos,
ARHGAP29 parece estar presente nos ossos, músculos, coração, placenta,
fígado e pâncreas, com baixa expressão no cérebro, pulmões e rins (Saras et
al., 1997). Um estudo realizado em humanos utilizou cultura de fibroblastos em
meios folato-deficientes e folato-suficiente, apresentando como resultado uma
64
expressão alterada de ARHGAP29 e outros genes (WNT5A) em diversos
mecanismos como a sinalização celular, citoesqueleto e matriz extracelular
(Katula et al., 2007). A deficiência de folato tem sido sugerida como um fator de
risco para FL/P, mas sem evidências suficientes (Dixon et al., 2011).
Recentemente, Kitase e Shuler (2012) mostraram em um estudo
realizado através do tratamento de culturas de células do palato com nocodazol
(medicamento responsável por desestabilizar microtúbulos) que as células
tratadas com este medicamento apresentaram um aumento na atividade de
RhoA. De fato, este resultado mostrou que a regulação da dinâmica dos
microtúbulos e microfilamentos de actina é necessária para a remodelação da
borda medial do epitélio durante palatogênese por isso, como resultado, podem
ter ocasionado a formação de um epitélio medial hipertrofiado e,
consequentemente, uma falha da fusão palatal. Esta hipótese pode representar
um dos mecanismos pelo qual ARHGAP29 poderia estar envolvido na FL/P.
Até o presente momento, o único estudo genético mencionando um possível
envolvimento dos genes de ARHGAP29 na etiologia da FL/P em humanos foi
conduzido a partir de regiões candidatas sugeridas por estudos de associação
por todo o genoma (GWAS), onde revelou oito variantes no gene ARHGAP29
que estão potencialmente associadas a FL/P (Leslie et al., 2012). Este estudo
corrobora os achados de Leslie et al. (2012) que, por sua vez, encontraram
evidências de associação do ARHGAP29 com FL/P. No entanto, os resultados
do presente estudo revelaram a associação do ARHGAP29 com FL/P em
apenas um dos cinco polimorfismos testados (rs1048854 com um p valor =
0,01). Localizado em uma região não codificadora na posição 94416119, este
polimorfismo acarreta em uma mutação sinônima que são caracterizadas por
mudanças na sequência dos nucleotídeos do material genético contudo o
códon codifica para o mesmo aminoácido da sequência original. Embora SNPs
sinônimas não alterem a sequência de proteína, estes SNPs podem estar em
desequilíbrio de ligação com algum outro SNP realmente funcional, o qual
poderia interferir na estrutura da proteína final.
65
7.6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Este estudo apresentou algumas limitações, dentre elas, o tamanho da
amostra, devido à dificuldade de coleta de material de trios (Indivíduo afetado,
Pai e Mãe), especificamente pela ausência ou desconhecimento do progenitor.
Entretanto, a amostra utilizada (70 trios totalizando 210 indivíduos) resultou em
um poder de estudo estimado em ~98% para detectar associação com um
valor de P=0.05 uma vez que os marcadores selecionados estavam em
desequilíbrio de ligação com o fenótipo (D’=0,08) e a frequência dos
marcadores foi estimada em ~20%. Ainda, se estabelecêssemos um valor de P
mais conservador (ex. P=0.001), nossa amostra resultaria em um poder
estatístico de ~82%.
Um dos grandes problemas em estudos genéticos de doenças
complexas é avaliar a real significância dos resultados obtidos. Os resultados
deste estudo foram avaliados estatisticamente pelo teste de desequilíbrio de
transmissão utilizando-se o programa FBAT e o nível de significância foi
estabelecido em 0,05. Uma desvantagem do TDT consiste na natureza
restritiva da análise, uma vez que utiliza apenas uma parcela da amostra,
considerada informativa. Sendo assim, é possível que algumas associações
positivas tenham sido descartadas em função do método de análise utilizado.
Devido ao pequeno número de SNPs investigados em cada gene, optou-se por
não utilizar correção para testes múltiplos, como por exemplo: o teste de
correção de Bonferroni, por ser um teste extremamente conservador, uma vez
que o objetivo deste estudo era investigar associações entre alguns
marcadores em genes candidatos a FL/P, que pudessem justificar a
necessidade de estudos mais detalhados, como estudos de mapeamento
genético.
66
7.7. PERSPECTIVAS FUTURAS
A identificação de novos genes e loci candidatos à FL/P são de
fundamental importância para o entendimento dessa anomalia. A complexidade
e a diversidade dos aspectos clínicos e mecanismos moleculares envolvidos no
desenvolvimento craniofacial proporcionam inúmeras oportunidades para
investigações futuras da etiologia da FL/P. Os avanços no campo da
engenharia genética poderão proporcionar, num futuro próximo, a identificação
completa dos genes causadores das alterações craniofaciais e
subsequentemente o aconselhamento genético de casais previamente à
concepção (devido à probabilidade de ter genes de alto risco), bem como
propor uma possível terapia gênica em fetos afetados, culminando com a
prevenção da ocorrência da FL/P em humanos.
67
8. CONCLUSÕES
Baseado nos objetivos propostos e nos resultados obtidos no presente
estudo, foi possível concluir que:
• os polimorfismos estudados dos gene ARGHAP29, TP63 e WNT9B
foram associados com FL/P na população estudada;
• o polimorfismo nos genes WNT3 e PBX1 não foram associados com
FL/P na população estudada.
68
REFERÊNCIAS
Aquino SN, Paranaíba LM, Martelli D, Swert MS, Barros L, Bonan PR, et al. Estudo de pacientes com fissuras lábio-palatinas com pais consanguineous. Braz j otorhinolaryngol. 2011;77(1). Ardinger HH, Buetow KH, Bell GI, Bardach J, VanDemard DR, Murray JC. Association of genetic variation of transforming Growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet. 1989; 45:348-53. Arosarena OA. Cleft lip and palate. Otolaryngol Clin North Am. 2007;40: 27-60. Aschard H, Guedj M, Demenais F. A two-step multiple-marker strategy for genome- wide association studies. BMC proceedings I. 2007; S134. Bagordakis E, Paranaiba LM, Brito LA, de Aquino SN, Messetti AC, Martelli-Junior H, et al. Polymorphisms at regions 1p22.1 (rs560426) and 8q24 (rs1530300) are risk markers for nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population. Am J Med Genet A. 2013 Mar 26. [Epub ahead of print] Batista MJ, Giolo SR, Pereira AC, Soler JMP. Evidence for SNP Effect through Supervised Association Analysis. Proceedings of the Genetic Analysis Workshop 16 Problem 1, St. Louis, USA; 2008. Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, Munger RG, Ruczinski I, Hetmanski JB, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat Genet. 2010; 42:525–9. Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, Herms S, Steffens M, Rubini M, et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat Genet. 2009; 41(4):473–7. Blanton SH, Cortez A, Stal S, Mulliken JB, Finnell RH, Hecht JT. Variation in IRF6 contributes to nonsyndromic cleft lip and palate. Am J Med Genet. 2005;137A:259–62. Brugmann SA, Goodnough LH, Gregorieff A, Leucht P, Ten Berge D, Fuerer C, et al. Wnt signaling mediates regional specification in the vertebrate face. Development. 2007; 134:3283-95. Bueno DF, Sunaga DY, Kobayashi GS, Aguena M, Raposo-Amaral CE, Masotti C, et al. Human stem cell cultures from cleft lip/palate patients show enrichment of transcripts involved in extracellular matrix modeling by comparison to controls. Stem Cell Rev. 2011;7(2):446-57.
69
Burston WR, Orth D. The development of cleft lip and palate. Ann R Coll Surg Engl. 1959; 25: 225-33. Carlson CS, Eberle MA, Rieder MJ, Yi Q, Kruglyak L, Nickerson DA. Selecting a maximally informative set of single-nucleotide polymorphisms for association analyses using linkage disequilibrium. Am J Hum Genet. 2004;74:106-20. Carroll TJ, Park JS, Hayashi S, Majumdar A, McMahon AP. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 2005; 9(2):283-92. Celli J, Duijf P, Hamel BC, Bamshad M, Kramer B, Smits AP, et al. Heterozygous germline mutations in the p53 homolog p63 are the cause of EEC syndrome. Cell. 1999;99(2):143-53. Chiquet BT, Blanton SH, Burt A, Ma D, Stal S, Mulliken JB, et al. Variation in WNT genes is associated with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Hum Mol Genet. 2008;17(14):2212-8. Cox TC. Taking it to the max: the genetic and developmental mechanisms coordinating midfacial morphogenesis and dysmorphology. Clin Genet. 2004; 65(3):163–76. Croen LA, Shaw GM, Wasserman CR, Tolarová MM. Racial and ethnic variations in the prevalence of orofacial clefts in California, 1983-1992. Am J Med Genet. 1998;79(1):42-7. Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, Murray JC. Cleft lip and palate: under- standing genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 2011;12(3):167-78. Ewens WJ, Spielman RS. The transmission/disequilibrium test. In Handbook of statistical genetics. 2nd ed. New York: Wiley; 2003. Ferretti E, Li B, Zewdu R, Wells V, Hebert JM, Karner C, et al. A conserved Pbx-Wnt-p63-Irf6 regulatory module controls face morphogenesis by promoting epithelialapoptosis. Dev Cell. 2011;21:627-41. Fogh-Andersen P. Inheritance of harelip and cleft palate. Copenhagen: Munksgaard; 1942. Fontoura C, Silva RM, Granjeiro JM, Letra A. Further evidence of association of the ABCA4 gene with cleft lip/palate. Eur J Oral Sci. 2012;120(6):553-7. Fossat N, Jones V, Khoo PL, Bogani D, Hardy A, Steiner K et al. Stringent requirement of a proper level of canonical WNT signalling activity for head formation in mouse embryo. Development. 2011;138(4):667-76.
70
Fraser GR, Calnan JS. Cleft lip and palate: seasonal incidence, birth weight, birth rank, sex, site, associated malformations and parental age. A statistical survey. Arch Dis Child.1961;36(188):420-3. Ghassibe M, Bayet B, Revencu N, Verellen DC, Gillerot Y, Vikkula M. Interferon regulatory factor-6: a gene predisposing to isolated cleft lip with or without cleft palate in the Belgian population. Eur J Hum Genet. 2005;13(11):1239-42. Giolo SR, Soler JMP, Batista MJ, Almeida MAA, Pereira AC. Evidence of SNP effect on the risk of rheumatoid arthritis: effects of covariate adjustment upon association results. Rev Bras Biom. 2011;29:47-59. Gordon MD, Nusse R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 2006;281:429-33. Grant S, Wang K, Zhang H, Glaberson W, Annaiah K, Kim CE, et al. A genome-wide association study identifies a locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on 8q24. J Pediatr. 2009; 155:909-13. Gritli-Linde A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Curr Top Dev Biol. 2008;84:37–138. Heasman SJ, Ridley AJ. Mammalian Rho GTPases: new insights into their functions from in vivo studies. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:690–701. Horvath S, Xu X, Laird NM. The family based association test method: strategies for studying general genotype-phenotype associations. Eur J Hum Genet. 2001; 9:301-6. Ianakiev P, Kilpaatrick MW, Toudjarska I, Basel D, Beighton P, Tsipouras P. Split-hand/split-foot malformation is caused by mutations in the p63 gene on 3q27. Am J Hum Genet. 2000;67(1):59-66. Ingraham CR, Kinoshita A, Kondo S, Yang B, Sajan S, Trout KJ, et al. Abnormal skin, limb and craniofacial morphogenesis in mice deficient for interferon regulatory factor 6 (Irf6). Nat Genet. 2006; 38(11):1335-40. International HapMap Project. Nature. 2003;426:789-96. Jia ZL,Li Y,Li L,Wu J,Zhu LY,Yang C,et al. Association among IRF6 polymorphism, environmental factors, and nonsyndromic orofacial clefts in western china. DNA Cell Biol. 2009;28:249–7. Jiang R, Bush JO, Lidral AC. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Dev Dyn. 2006; 235:1152–66. Johnson AD, O'Donnell CJ. An open access database of genome-wide association results. BMC Medical Genetics. 2009;10:6.
71
Jugessur A, Murray JC. Orofacial clefting: recent insights into a complex trait. Curr Opin Genet Dev. 2005;15(3):270-8. Jugessur A, Farlie PG, Kilpatrick N. The genetics of isolated orofacial clefts: from genotypes to subphenotypes. Oral Diseases. 2009; 5(7):437-53. Juriloff DM, Harris MJ. Wnt9b is the mutated gene involved in multifactorial nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in A/WySn mice, as confirmed by a genetic complementation test. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2006;76(8):574-9. Juriloff DM, Harris MJ, Dewell SL. A digenic cause of cleft lip in Astrain mice and definition of candidate genes for the two loci. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004;70:509-18. Juriloff DM, Harris MJ, Dewell SL, Brown CJ, Mager DL, Gagnier L, et al. Investigations of the genomic region that contains the clf1 mutation, a causal gene in multifactorial cleft lip and palate in mice. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2005; 73(2):103-13. Kaartinen V, Voncken JW, Shuler C, Warburton D, Bu D, Heisterkamp N, et al. Abnormal lung develop- ment and cleft palate in mice lacking TGF-beta 3 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction. Nat Genet. 1995;11(4):415-21. Kardassis D, Murphy C, Fotsis T, Moustakas A, Stournaras C. Control of transforming growth factor beta signal transduction by small GTPases. FEBS J. 2009;276(11):2947-65. Katula KS, Heinloth AN, Paules RS. Folate deficiency in nor- mal human fibroblasts leads to altered expression of genes primarily linked to cell signaling, the cytoskeleton and extracellular matrix. J Nutr Biochem. 2007;18(8):541-52. Kikuchi A. Regulation of beta-catenin signaling in the Wnt pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000;268(2):243-8. Kirschner RE, LaRossa D. Cleft lip and palate. Otolaryngol. ClinNorth Am. 2000;33(6):1191-213.
Kitase Y, Shuler CF. Multi-layered hypertrophied MEE formation by microtubule disruption via GEF-H1/RhoA/ROCK signaling pathway. Dev Dyn. 2012;241:1169-82. Kondo S, Schutte BC, Richardson RJ, Bjork BC, Knight AS, Watanabe Y, et al. Mutations in IRF6 cause Van der Woude and popliteal pterygium syndromes. Nat. Genet. 2002; 32(2):285-9.
72
Kornman KS, Crane A, Wang HY, di Giovane FS, Pirk FW, Wilson TG, et al. The interleukin-1 genotype as a severity factor in adult periodontal disease. J Clin Periodontol. 1997;24(1):72-7. Lan Y, Ryan RC, Zhang Z, Bullard SA, Bush JO, Maltby KM, et al. Expression of Wnt9b and activation of canonical Wnt signaling during midfacial morphogenesis in mice. Dev Dyn. 2006;235:1448-54. Leslie EJ, Mansilla MA, Biggs LC, Schuette K, Bullard S, Cooper M, et al. Expression and mutation analyses implicate ARHGAP29 as the etiologic gene for the cleft lip with or without cleft palate locus identified by genome-wide association on chromosome 1p22. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2012;94(11):934-42. Letra A, Fakhouri W, Fonseca RF, Menezes R, Kempa I, Prasad JL, et al. Interaction between IRF6 and TGFA genes contribute to the risk of nonsyndromic cleft lip/palate. PLoS One. 2012;7(9):e45441. Letra A, Silva RA, Menezes R, Granjeiro JM. MMP gene polymorphisms as contributors for cleft lip/palate: Association with MMP3 but not MMP1. Arch Oral Biol. 2007;86:986-91. Letra A, Menezes R, Fonseca RF, Govil M, McHenry T, Murphy MJ, et al. Novel cleft susceptibility genes in chromosome 6q. J Dent Res. 2010;89(9):927-32. Letra A, Menezes R, Govil M, Fonseca RF, McHenry T, Granjeiro JM, et al. Follow-up association studies of chromosome region 9q and nonsyndromic cleft lip/palate. Am J Med Genet A. 2010 Jul;152A(7):1701-10. Lidral AC, Moreno LM. Progress toward discerning the genetics of cleft lip. Curr Opin Pediatr. 2005;17:731-9. Liu F, Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, Hysi PG, et al. A Genome-Wide Association study identifies five loci influencing facial morphology in europeans. PLoS Genet. 2012 Sept; 8(9):e1002932. Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, Baluardo C, Ferrian M, Herms S, et al. Genome-wide associa- tion study identifies two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet. 2010;42(1):24-6. Marazita ML, Lidral AC, Murray JC, Field LL, Maher BS, Goldstein M, et al. Genomescan, fine-mapping,and candidate gene analysis of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate reveals phenotype-specific differences in linkage and association results. Hum Hered. 2009;68(3):151-70.
73
Marazita ML, Field LL, Cooper ME, Tobias R, Maher BS, Peanchitlertkajorn S, et al. Genome scan for loci involved in cleft lip with or without cleft palate, in Chinese multiplex families. Am J Hum Genet. 2002;71(2):349-64. Marotti J, Galhardo APM, Furuyama RJ, Pigozzo MN, Campos TN, Laganá, DC. Amostragem em pesquisa clínica: tamanho da amostra. Rev Odontol Universidade Cidade de São Paulo. 2008;20(2):186-94. McGrath JA, Duijf PH, Doetsch V, Irvine AD, de Waal R, Vanmolkot KR, et al. Hay-Wells syndrome is caused by heterozygous missense mutations in the SAM domain of p63. Hum Mol Genet. 2001; 10(3):221-9. Menezes R, Letra A, Kim AH, Küchler EC, Day A, Tan- Nure PN, et al. Studies with Wnt genes and nonsyndromic cleft lip and palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(11): 995-1000. Millar SE, Koyama E, Reddy ST, Andl T, Gaddapara T, Piddington R, et al. Over- and ectopic expression of Wnt3 causes progressive loss of ameloblasts in postnatal mouse incisor teeth. Connect Tissue Res. 2003;44(Suppl 1):124-9. Mills JL, Kirke PN, Molloy AM, Burke H, Conley MR, Lee YJ, et al. Methylenetetrahy- drofolate reductase thermolabile variant and oral clefts. Am J Med Genet.1999;86(1):71-4. Moore LK. Embriologia clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2005. Mossey PA, Little J. Cleft lip and palate. Lancet. 2009;37:1773-85. Mossey PA, Little J. Epidemiology of oral clefts: an international perspective. In: WYSZYNSKI DF, ed. Cleft lip and palate: from origin to treatment. New York, NY: Oxford University Press; 2002; 127–158.
Mostowska A, Hozyasz KK, Biedziak B, Wojcicka P, Lianeri M, Jagodzinski PP. Genotype and haplotype analysis of WNT genes in non-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Eur J Oral Sci. 2012;120:1–8. Moustakas A, Heldin CH. Dynamic control of TGF-beta signaling and its links to the cytoskeleton. FEBS Lett. 2008;582(14):2051–65. Murray JC, Schutte BC. Cleft palate: Players, pathways, and pursuits. J Clin Invest, 2004:113; 1676-1678. Murray JC, Buetow KH, Donovan M, Hornung S, Motulsky AG, Disteche C, et al. Linkage disequilibrium of plasminogen polymorphisms and assignment of the gene to human chromosome 6q26–6q27. Am J Hum Genet. 1987;40:338–50. Murray JC. Gene/environment causes of cleft lip and/or palate. Clin Genet. 2002;61:248-56.
74
Natsume N, Suzuki T, Kawai T. The prevalence of cleft lip and palate in the Japanese: their birth prevalence in 40,304 infants born during 1982. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1987;63(4):421-3. Niemann S, Zhao C, Pascu F, Stahl U, Aulepp U, Niswander L, et al. Homozygous WNT3 Mutation Causes Tetra-Amelia in a Large Consanguineous Family. Am J Hum Genet. 2004; 74:558-63. Nikopensius T, Jagoma ̈gi T, Krjutskov K, Tammekivi V, Saag M, et al. Genetic variants in COL2A1, COL11A2, and IRF6 contribute risk to nonsyndromic cleft palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88: 748-56. Noszczyk BH, Majewski ST. p63 expression during normal cutaneous wound healing in humans. Plast Reconstr Surg. 2001;8(5):1242-7. Paranaíba LM, de Aquino SN, Bufalino A, Martelli-Júnior H, Graner E, Brito LA, et al. Contribution of polymorphisms in genes associated with craniofacial development to the risk of nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2013 Pietsch EC, Sykes SM, McMahon SB, Murphy ME. The p53 family and programmed cell death. Oncogene. 2008; 27:6507–21. Pena SD, Di Pietro G, Fuchshuber-Moraes M, Genro JP, Hutz MH, Kehdy FS, et al. The genomic ancestry of individuals from different geographical regions of Brazil is more uniform than expected. PLoS One. 2011;6(2):e17063. Prescott NJ, Lees MM, Winter RM, Malcolm S. Identification of susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in a two stage genome scan of affected sib-pairs. Hum Genet. 2000;106(3):345–50. Pritchard JK, Feldman MW. Statistics for microsatellite variation based on coalescence. Theoretical Population Biology. 1996;50:325-44. PURCELL S, CHERNY SS, SHAM PC. Genetic power calculator: design of linkage and association genetic mapping of complex traits. Bioinformatics 2003; 19(1):149–50. Purcell S, Sham PC, Daly MJ. Parental phenotypes in family-based association analysis. Am J Hum Genet. 2005;76(2):249-59. Rahimov F, Marazita ML, Visel A, Cooper ME, Hitchler MJ, Rubini M, et al. Disruption of an AP-2alpha binding site in an IRF6 enhancer is associated with cleft lip. Nat Genet. 2008;40(11):1341-7. Ranade K, Chang MS, Ting CT, Pei D, Hsiao CF, Olivier M, et al. High- throughput genotyping with single nucleotide polymorphisms. Genome Res. 2001; 11(7):1262-8.
75
Reid BS, Yang H, Melvin VS, Taketo MM, Williams T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Dev Biol. 2011; 349(2):261-9. Rinne T, Brunner HG, Van Bokhoven H. p63-Associated Disorders. Cell Cycle. 2007; 6(3):262-8. Risch NJ. Searching for genetic determinants in the new millennium. Nature. 2000;405(6788):847-56. Saras J, Franzén P, Aspenstrom P, Hellman U, Gonez LJ, Heldin CH. A novel GTPase-activating protein for Rho interacts with a PDZ domain of the protein-tyrosine phosphatase PTPL1. J Biol Chem. 1997;272(39):24333-8. Scapoli L, Palmieri A, Martinelli M, Pezzetti F, Carinci P, Tognon M. Strong evidence of linkage disequilibrium between polymorphisms at the IRF6 locus and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, in an Italian population. Am J Hum Genet. 2005;76(1):180-3. Schlessinger K, Hall A, Tolwinski N. Wnt signaling pathways meet Rho GTPases. Genes Dev. 2009;23(3):265–7. Sender CW, Peterson EC, Hendrickx AG, Cukierski MA. Development of the upper lip. Arch Facial Plast Surg. 2003; 5:16-25. Seto ES, Bellen HJ. The ins and outs of Wingless signaling. Trends Cell Biol. 2004;14(1):45-53. Song L, Li Y, Wang K, Wang YZ, Molotkov A, Gao L, et al. Lrp6-mediated canonical Wnt signaling is required for lip formation and fusion. Development. 2009;136(18):3161–71. Spielman RS, McGinnis RE, Ewens WJ. Transmission test for linkage disequilibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am J Hum Genet. 1993;52(3):506-16. Tamarine A, Boyde A. Facial and visceral arch development in the mouse embryo: a study by scanning electron microscopy. J Anat. 1977; 124(Pt 3):563-80. Thomason HA, Dixon M J, Dixon, J. Facial clefting in Tp63 deficient mice results from altered Bmp4, Fgf8 and Shh signaling. Dev Biol. 2008;321(1):273-82. Thomason HA, Zhou H, Kouwenhoven EN, Dotto GP, Restivo G, Nguyen BC, et al. Cooperation between the transcription factors p63 and IRF6 is essential to prevent cleft palate in mice. J Clin Invest. 2010;120(5):1561-9.
76
Tudela C, Formoso MA, Martínez T, Pérez R, Aparicio M, Maestro C, et al. TGF-beta3 is required for the adhesion and inter- calation of medial edge epithelial cells during palate fusion. Int J Dev Biol. 2002;46(3):333-6. Van Bokhoven H, Brunner HG. Splitting p63. Am J Hum Genet. 2002;71(1):1-13. Vieira AR, Cooper ME, Marazita ML, Orioli IM, Castilla EE. Interferon regulatory factor 6 (IRF6) is associated with oral-facial cleft in individuals that originate in South America. Am J Med Genet A. 2007;143(17):2075-8. Vieira AR. Unraveling human cleft lip and palate research. J Dent Res. 2008; 87(2):119-25. Wessagowit V, Mellerio JE, Pembroke AC, McGrath JA. Heterogeneous germline missense mutation in the p63 gene underlying EEC syndrome. Clin Exp Der matol. 2000;25:441–3. Woessner JF. The family of matrix metalloproteinases. In: inhibition of matrix metalloproteinases: therapeutic potential. Ann NY Acad Sci. 1994;732:11–21. Wolpert L, Beddington R, Jessell T, Lawrence P, Meyerowitz E, Smith J. Principles of development, 2nd ed. Oxford university press: 2002. Yang A, Schweitzer R, Sun D, Kaghad M, Walker N, Bronson RT, et al. p63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial development. Nature. 1999; 398(6729):714-8. Yao T, Yang L, Li PQ, Wu H, Xie HB, Shen X, et al. Association of Wnt3A gene variants with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese population. Arch Oral Biol. 2011 Jan; 56(1): 73-8. Yoon H, Chung IS, Seol EY, Park BY, Park HW. Development of the lip and palate in staged human embryos and early fetuses. Yonsei Med J. 2000; 41(4):477-84. Zhang Z, Song Y, Zhao X, Zhang X, Fermin C, Chen Y. Rescue of cleft palate in Msx1-deficient mice by trans- genic Bmp4 reveals a network of BMP and Shh signaling in the regulation of mammalian palatogenesis. Development. 2002;129(17):4135-46. Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, Daack-Hirsch S, Nepomuceno B, Ribeiro L, et al. Interferon regulatory factor 6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate. N Engl J Med. 2004; 351(8):769-80.
77
APÊNDICE 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
“Estudo da Etiopatogenia das Alterações Craniofaciais e Patologias Dento-Bucais” Pesquisador responsável: Dra. Patricia Nivoloni Tannuri / Dra. Clarissa Souza Gomes da Fontoura. Telefones para contato: (21) 2629-9255 (21) 2498-2195 (21) 8568-5505
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Nome: _____________________________________________________________ Idade: _____________ anos. R.G. ______________________________________________________ Responsável legal: _________________________________________________________________ O Sr(a) está sendo convidado(a) a participar dos projetos de pesquisa “Estudo da Etiopatogenia das Alterações Craniofaciais e Patologias Dento-Bucais” de responsabilidade do pesquisador Dra. Patricia Nivoloni Tannuri. O presente estudo que apresenta parceria com o Hospital Municipal Nossa Senhora do Loreto (HMNSL), têm como objetivo estabelecer uma base de dados epidemiológico e moleculares para auxiliar em investigações genéticas da formação da fissura labiopalatina. Caso concorde em participar, os procedimentos a serem realizados constam de uma rápida entrevista, coleta de saliva e/ou de tecido descartado em procedimentos cirúrgicos. Estes procedimentos não apresentam desconfortos, riscos ou custos. Este estudo não proporcionara benefícios diretos entretanto os benefícios indiretos serão relevantes para o melhor entendimento das causas das fissuras labiopalatinas. Adicionalmente, a sociedade deve se beneficiar da identificação dos mecanismos moleculares envolvidos com as alterações congênitas. O registro de sua participação nesta pesquisa será mantido de forma confidencial através do uso de códigos numéricos e arquivos fechados. A amostra será armazenada no Banco de Amostras Biológicas da Unidade de Pesquisa Clínica do HUAP/UFF e poderá ser utilizada para estudos futuros. Os resultados desta pesquisa serão publicados em literatura científica especializada. Este é um projeto de pesquisa e não uma forma de tratamento. A sua participação e/ou de seu filho são voluntárias. Nenhuma punição, discriminação ou perda de benefícios ocorrerá se vocês decidirem não participar. Vocês podem desistir da participação em qualquer momento sem punição ou perda de benefícios aos quais vocês têm direito. Se vocês cancelarem a participação, seus dados serão removidos do banco de dados e suas amostras serão destruídas. Eu________________________________________ declaro ter sido informado e concordo em participar, como voluntário, do projeto de pesquisa acima descrito. Data______/_______/________ ____________________________ ___________________________ ____________________________ Assinatura do paciente Responsável Legal Testemunha Eu discuti os pontos acima com o participante e/ou representante legal. É minha opinião que o participante entendeu os riscos, benefícios e obrigações envolvidas na participação neste projeto. _________________________________ ________________________________ _______/________/_______ Dra.. Clarissa Souza Gomes da Fontoura Pesquisador responsável Data Dra. Patricia Nivoloni Tannuri
78
APÊNDICE 2: QUESTIONÁRIO Pai Mãe Indivíduo Família
Identificação da Criança: Use: (s) sim ou (n) não No do protocolo:____________data da entrevista:_____/_____/_____ Nome da criança: _____________________________________________________ Idade ____________ anosI__I mesesI__I sexo|__| (f - feminino ; m - masculino) Raça da criança:______________do Pai:_______________da Mãe:________________ Nome do responsável:_________________________________________________ Endereço:____________________________________________________________ Estado: _______________________________________ cep: __________________ Telefone:____________________________________________________________ Escolaridade: Mãe _______________________Pai:_____________________________ Mora ou morou próximo de indústrias |__| Mora ou morou em área rural |__| História ocupacional do pai Tipo de trabalho:__________________________Função:_________________________ Riscos: ______________________Tempo de exposição: ______________________ Tempo de trabalho: |__|__| (em anos) Número de dias de trabalho na semana: |__| Número de horas por dia: |__|__| Já sofreu algum acidente do trabalho com produto químico? |__| Quantas vezes? |__|__| História ocupacional da mãe Tipo de trabalho:____________________Função:_______________________________ Riscos: ______________________Tempo de exposição: ______________________ Tempo de trabalho: |__|__| (em anos) Número de dias de trabalho na semana: |__| Número de horas por dia: |__|__| Já sofreu algum acidente do trabalho com produto químico? |__| Quantas vezes? |__|__| História clínica Use: (s) sim ou (n) não Presença de fenda na família |__| Quem (Lado Materno ou Paterno)?_______________ Tem outros familiares com malformações, anomalias dentárias e/ou síndromes genéticas associadas |__| Quem/Qual? _______________________________________ Câncer|__| Quem (Lado Materno ou Paterno)? ______________________________ tipo do câncer?_______________________________________________________ Idade na época da gestação pai ______ anos / mãe______anos Portadora de alguma patologia durante a gestação? D.S.T. (doença venérea) |__| Hipertensão arterial |__| Epilepsia|__| Diabetes|__| Outra |__| Qual? ______________________________________________________ Uso de medicação durante a gravidez (pré-natal): Suplementos Alimentares: Acido fólico I__I Sulfato ferroso I__IOutras_______________ Período gestacional de uso?_____________________________________________ Anticonvulsivantes |__| Antiinflamatórios |__| Para abortamento |__| Outras |__| Quais?______________________________________________________________ Período gestacional?___________________________________________________ Você faz uso de alguma destas substâncias? Pai: Fumo |__| frequência:_______________Álcool |__| frequência:_________________ Drogas |__| qual / frequência:_______________________________________________ Mãe: Fumo |__| frequência:_____________Álcool |__| frequência:__________________ Drogas |__| qual / frequência:_______________________________________________ Período de uso: antes e/ou durante a gravidez?_________________________________ NÃO PREENCHER Tipo de fissura:_________________________ Lado:___________________________ Odontológico:______________________________________________________
NÃO PREENCHER
79
ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
80
ANEXO 2: INSTRUÇÕES DO FABRICANTE - ORAGENE DNA PURIFICATION KIT (DNA GENOTEK)
1. 1000 uL das amostra Oragene / saliva mista foram transferidas para um
tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Para 1000 mL de Oragene / saliva, foi adicionado 40 mL (1/25th
volume) de Oragene purificador (OG-L2P, incluídos) para o tubo de
microcentrífuga e misturado em vortex por alguns segundos.
3. As amostras foram Incubadas em gelo durante 10 minutos.
4. As amostras foram centrifugadas em temperatura ambiente durante
5 minutos a 13.000 rpm (15.000 x g).
5. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido com uma pipeta
para um tubo de microcentrífuga novo e as as impurezas descartadas.
6. Um volume de 95 - 100% de etanol igual ao volume do de
sobrenadante foi adicionado e misturado suavemente 10 vezes por
inversão.
7. As amostras foram deixadas em repouso à temperatura ambiente
durante 10 minutos para permitir que o DNA precipite completamente.
8. As amostras foram centrifugadas a temperatura ambiente durante 2
minutos a 13.000 rpm (15.000 x g).
9. O sobrenadante foi removido cuidadosamente com uma pipeta e
descartado, tomando cuidado para não perturbar o sedimento de DNA.
9a. 250 ul de etanol a 70%. foi adicionado e deixado em repouso à
81
temperatura ambiente durante 1 minuto. 9b. O etanol foi completamente
removido.
10. 100 ul de tampão TE foi adicionado para dissolver o sedimento de
DNA e misturado em vortex durante pelo menos 5 segundos. As
amostras foram deixadas temperatura ambiente durante 1-2 dias