Aula DNA Forense

Arthur Estivalet Svidzinski

Odontologia. 1. Perícia odonto-legal, peritos, documentos médicos, laudos periciais, modelos e interpretação, ética odontológica. 2. Perícia odontológica nos foros civil, penal, trabalhista e administrativo. 3. Documentação odontológica. 4. Marcas de mordidas: metodologias de coleta e estudo comparativo. 5. Crimes de lesões corporais: art. 129 do CPB e as perícias odontológicas das lesões do aparelho estomatogmático. 6. Os arcos dentários na identificação. 7. Estimativa do sexo, idade e estatura por meio do estudo dos dentes. 8. Biotipologia. 9. Técnicas de identificação utilizando o DNA. 10. Técnicas de biologia molecular: técnica de PCR, PCR em tempo real, eletroforese, sequenciamento de DNA. 11. Traumatologia forense: energias de ordem mecânica, energias de ordem física, energias de ordem química, energias de ordem físico-química. 12. Estimativa de sexo, estatura, idade, fenótipo, cor da pele, por meio do estudo do crânio. 13. Noções de tanatologia. 14. Sexologia forense: estupro e atentado violento ao pudor.

9. Técnicas de identificação utilizando o DNA. 10. Técnicas de biologia molecular: técnica de PCR, PCR em tempo real, eletroforese, sequenciamento de DNA.

1.3. Biologia Molecular: transcrição, tradução, replicação, mutação, recombinação e reparo do DNA, expressão gênica. 1.4. Técnicas de Biologia Molecular: técnica de PCR, PCR em tempo real, eletroforese, sequenciamento de DNA; técnicas de identificação usando o DNA. 1.5. Genética e genética de populações: teorema de Hardy-Weinberg, estrutura de populações, análise filogenética, padrões de herança genética, seleção natural, mutação, deriva, fluxo gênico.

Mendel - 1864

Watson e Crick - 1953

Bases Nitrogenadas

Genética – Conceitos básicos

Gene – Sequência de DNA que codifica uma proteína

Somente aproximadamente 1,5% do genoma humano é codificador

Genética – Conceitos básicosE os outros 98,5%?

O DNA não codificante é composto principalmente de sequências altamente repetitivas e aos poucos as suas funções vão sendo descobertas

Por exmplo, as sequencias Alu e L1 representam 28% do genoma humano

Organismo Tamanho em pb

Virus Fago ƛ 5,2 mil

Escherichia coli 4,7 milhões

Homo sapiens 3,2 bilhões

Amoeba proteus 670 bilhões

Tamanho do genoma de diferentes organismos

Organismo Número de cromossomos

Drosófila 8

Minhoca 32

Homem 46

Borboleta 380

Número de cromossomos de diferentes organismos

No início do projeto genoma acreditava-se que o genoma humano codificava algo em torno

de 100 a 120 mil genes.

Hoje sabe-se que esse número não passa de 20 a 30 mil genes

Cromossomos homólogos: Cromossomos que formam

um “par” em espécies diplóides.

Um homólogo é de origem materna e outro paterna

Alelo – Uma das “versões” de um mesmo gene

Exemplo: Sistema ABO

Alelos: IA, IB e i

Genótipo: Conjunto de informações genéticas de um indivíduo

Fenótipo: Conjunto de manifestações físicas relacionadas a essas informações

Homozigose: Quando o indivíduo apresenta os alelos iguais: AA, ii, XX

Heterozigose: Quando o indivíduo apresenta dois alelos diferentes: Aa, IAi, XY

Genótipo Fenótipo

IAIA Sangue tipo “A”

IAi Sangue tipo “A”

IAIB Sangue tipo “AB”

ii Sangue tipo “O”

Exemplo

Cruzamentos: Avaliação dos possíveis genótipos dos descendentes a partir do

genótipo dos seus genitores.

A respeito da natureza química e da funcionalidade do DNA, julgue os itens subseqüentes:

- O conteúdo informacional do DNA reside na seqüência em que suas unidades monoméricas estão ordenadas.

- Espécimes de DNA isolados de diferentes tecidos da mesma pessoa possuem a mesma composição de bases.

- Durante a desnaturação do DNA são quebradas as ligações covalentes presentes em sua estrutura.

- Nas moléculas de DNA dos eucariotos, a ocorrência das bases G + C é aproximadamente igual à de T + A.

Reação de PCR

Polimerase Chain Reaction

Método de amplificação de DNA invitro

Ciclo Celular

Reação de PCR

Utilizada em situações em que é preciso trabalhar com quantidades muito pequenas de DNAAmplifica sequências específicas de DNAProcesso realizado em vários ciclos

Reação de PCR

DNA a ser amplificadoPrimers – Forward e ReversedNTPs – NucleotídeosDNA Polimerase

Reação de PCR

Primers: Iniciadores da duplicação de DNA

Reação de PCR

Polimerase:Duplica uma fita simples de DNANecessita de uma sequência iniciadora

Reação de PCR

Taq Polimerase: Enzima polimerase do micro-organismo Thermus aquaticusTemperatura de duplicação de 70 a 72ºCAdiciona uma adenina ao final da duplicação da sequência de DNA

Reação de PCR

1ª Fase: Aquecimento a mais de 90ºC para a separação da dupla fitaSepara tanto a Fita de DNA original quanto os produtos de amplificação

Reação de PCR

2ª Fase: Anelamento dos primersHibridizaçãoTemperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de primersDetermina a especificidade da ligação

Reação de PCR

3ª Fase: Extensão dos primers – Duplicação do DNATemperatura ótima em torno de 72ºC

Reação de PCR

Reação de PCRAo final da reação, a quantidade de DNA amplificado em relação ao DNA inicial é igual a 2n, sendo que n= número de ciclos da PCR

Exemplo: PCR de 29 ciclos:

229= 536.870.912 cópias para cada fita original

Reação de PCR

Reação de PCREfeito Plateau: desvio da quantidade teóricaPerda da atividade da PolimeraseAcúmulo de inibidoresLimitação dos componentesCompetição entre produtosPareamento Produto x Molde, Competição com anelamento do primer

Reação de PCR

Em uma investigação de estupro seguido de morte, na tentativa de identificação do criminoso por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), os investigadores coletaram material junto ao corpo da vítima. A respeito desse assunto, julgue os itens seguintes:

- Sangue, cabelo e sêmen encontrados no local do crime constituem material com potencial para fornecimento de DNA para a realização da técnica de PCR.

- A técnica de PCR possibilita a clonagem de seqüências específicas de DNA, de forma rápida, numerosa e sem a necessidade de uma célula viva.

- Por ser bastante simples, a técnica de PCR dispensa o uso de luvas descartáveis, reagentes e soluções de alta qualidade ou micropipetas de uso exclusivo.

- Independentemente da técnica de PCR, a presença de espermatozóides do criminoso em esfregaço vaginal da vítima de estupro possibilita a identificação inequívoca deste.

- Além da molécula de DNA, o RNA também pode ser usado como molde original para a técnica de PCR.

Genética Forense

Ramo da genética humana voltada para questões legais

Genética Forense

Identificação Humana através do DNAEstabelecimento de vínculo genético

Genética Forense

Quem é a vítima?Quem é o pai dessa criança?A quem pertence a mancha de sangue deixada em um local de crime?

Quem deixou os espermatozóides no corpo da vítima?

Genética Forense

Aplicações de DNA para fins forensesJustiça Cívil: Testes de paternidadeJustiça Criminal: Identificação humana, crimes sexuais, crimes contra a vida, crimes contro o patrimônio, desastres de massa.

Perito Criminal - Polícia Federal 2004

Para a realização do exame de paternidade, a perícia, geralmente, é realizada no campo médico-legal por meio da pesquisa do DNA. Porém, pode ocorrer que, sendo esta impossível por alguma razão, o juiz determine a realização de perícia de caracteres dos arcos dentários, o que somente será possível se existirem caracteres teratológicos ou doenças de transmissão genética dominante no campo bucodentário, como a síndrome de Gorlin, que é hereditária autossômica dominante, com alta penetrância e expressividade variável.

Genética ForenseIdentificação Humana

Necessidade do ser humano desde antiguidadeCaracteres morfológicosTatuagensFotografiasImpressões digitaisMarcadores genéticos

Genética ForenseHistórico

1986 - Alec Jeffreys: Descobriu que o DNA apresentava regiões altamente repetitivas.

Essas repetições variavam de indivíduo para indivíduo

DNA fingerprint

Genética Forense

Genética ForensePolimorfismo

Acúmulo de mutações durante diversas gerações

Gerou sequências hipervariáveis no DNA humano não codificante

Utilizadas para a diferenciação de indivíduos

Impressões digitais e outras pistas coletadas em cenas de crimes estão cedendo espaço para as análises de DNA nas investigações policiais. O DNA extraído de fios de cabelo, de pequenas amostras de sangue ou da saliva permite descobrir a identidade de criminosos.

Ciência Hoje, n.º 169, mar./2001 (com adaptações).

Tendo o texto acima como referência inicial e considerando as técnicas para identificação com base em ácidos nucléicos e os conceitos moleculares e genéticos a elas relacionados, julgue os itens a seguir:

- Apesar de a identificação com a utilização de DNA ser um método bastante específico, algumas características genéticas, como o polimorfismo, são obstáculos a esse método.

- A existência de quantidades restritas de amostra para identificação com base no DNA não inviabiliza o processo, pois técnicas como a de PCR amplificam a quantidade de ácidos nucléicos presentes.

Genética ForenseDNA fingerprint

Perfil de DNA obtido através da técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism)

Utilizava enzimas de restrição para clivar a sequência de DNA, produzindo um padrão de fragmentos diferente em cada indivíduo

Genética Forense

Genética ForenseEm 1983 e 1986 duas mulheres foram estupradas e mortas em Narborough, InglaterraUm homem confessou a autoria dos crimes, mas o seu perfil não batia com o sangue e o sêmen encontradosExames de DNA em massa foram realizados com todos os homens do vilarejo (5.000 pessoas) mas o autor não foi encontrado

Genética ForenseAproximadamente 1 ano depois uma mulher ouviu em um bar um homem comentando que havia doado sangue no lugar do seu amigo Colin Pitchfork. O perfil deste homem era idêntico ao encontrado nos locais de crime.Foi o primeiro caso de condenação baseado em um exame de DNA

Genética Forense

Genética ForenseDesvantagens

Técnica muito demorada e trabalhosaNecessita de grande quantidade de DNADificuldade em se estabelecer vínculos genéticosAnálise de misturas inviável

Genética Forense

Short Tandem Repeat – Marcadores de DNA utilizados na genética forense atualmente

Genética Forense

São pequenas sequências de DNA (2 a 8 bases) que se repetem inúmeras vezes. A quantidade de repetições da sequência varia de um indivíduo para o outro

Genética Forense

Exemplo: Marcador XAlelo 1:

AGCTAATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGGTGCA

Alelo 2: AGCTAATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGGTGCA

Genética Forense

Marcador X

Alelo 1: 7 repetições

Alelo 2: 8 repetições

Marcador X

Genética Forense

Criança

Genética ForenseSTRs

Possuem um grande poder de diferenciação entre indivíduos e apresentam um tempo de análise relativamente rápido

Possibilitam a análise de mais de um marcador ao mesmo tempo - Multiplex

Genética Forense

Reação de PCR Multiplex

É uma reação de PCR em que são amplificados diversos fragmentos do DNA de interesse ao invés de apenas um

Genética ForenseAlelo Mãe Criança Suposto Pai

TH01 7 8 8 8 8 10

TPOX 12 12 10 12 10 12

D5S818 12 12 11 12 9 11

D7S820 13 14 13 13 12 13

D18S51 20 21 20 20 20 21

CSF1PO 6 8 6 7 7 7

FGA 21 25 23 25 22 23

vWA 17 17 17 18 18 18

Amelog. X X X X X Y

Genética ForenseSTRs

Sequências de 4 e 5 repetições são amplificadas facilmente e sofrem menos com degradação de DNA e amplificação diferencial

Fazem parte de uma classe de marcadores geneicos chamados de microssatélites

Genética Forense

Amelogenina: Gene que codifica proteínas presentes no esmalte do dente.

No cromossomo X um íntron desse gene apresenta uma deleção de 6 bp, o que não acontece no cromossomo Y.

A análise de DNA teve sua primeira aplicação no contexto criminal em 1986 e, desde então, tem experimentado um enorme desenvolvimento, caracterizando-se como uma especialidade das ciências forenses. A esse respeito, julgue os itens a seguir.

- De forma geral, as regiões codificantes do genoma humano são altamente polimórficas.

- As repetições curtas em tandem (STR) fazem parte de uma classe de marcadores que reúne características altamente desejáveis na identificação humana.

- Quando comparados aos marcadores genéticos, alguns marcadores protéicos polimórficos têm expressão tecido-específica e, conseqüentemente, aplicação limitada a algumas categorias de material biológico.

- Os marcadores de DNA, quando comparados aos marcadores convencionais, possibilitam a identificação de vestígios em elevado estado de putrefação ou submetidos a altas temperaturas.

Rotina de DNA forense

Processos, reagentes e equipamentos na rotina de um laboratório de DNA forense

Tudo começa fora do laboratório

Coleta das amostras

A coleta das amostras é importantíssima para a qualidade do resultado final

Origens diversas:Local de crimeVítimasSuspeitosRoupas e objetosPartes em um processo

Materiais biológicos mais utilizados coletados em pessoas vivas:

SangueSwab mucosa oralPelos

O modelo do DNA, proposto em 1953, por Watson e Crick, com base na seqüência linear de nucleotídeos, rendeu a seus autores o Prêmio Nobel em 1962. É graças ao DNA que cada pessoa é caracterizada como um indivíduo singular. Com base nos estudos sobre o DNA, julgue os itens que se seguem:

- Somente a partir da década de 80 do século XX, o DNA passou a ser usado legalmente para justificar uma condenação.

- As principais técnicas laboratoriais usadas para comparar e avaliar fragmentos de material de DNA são as análises de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) e a reação em cadeia da polimerase (PCR).

- Freqüentemente, os tecidos moles da cavidade bucal são boas fontes de DNA. Entretanto, a saliva não pode ser usada como fonte para estudo do DNA, por ser destituída de células, ao contrário dos tecidos bucais.

Materiais biológicos mais utilizados coletados em cadáveres:

SangueSwab mucosa bexigaMúsculo e CartilagemOssos e dentes

Rotina de DNA forenseMateriais biológicos coletados de

suportes:RoupasProjétilArmasCigarroVeículo

Coleta e conservação:

Os vestígios encontrados em locais de crime devem ser corretamente coletados, preservados, transportados e armazenados antes de serem examinados em laboratório

Cadeia de custódia:

É um processo usado para manter e documentar a história cronológica de um vestígio, desde a sua coleta em um local de crime até o resultado final dos exames

Rotina de DNA forenseCaso O. J. Simpson

Em uma cidade dos Estados Unidos da América (EUA), a polícia local encontrou uma cena de crime farta em evidências: muito sangue, peças de vestuário, pegadas e uma trilha de sangue que revelava o caminho seguido pelo criminoso. Seguindo essas pistas, os policiais chegaram à casa do ex-marido de Nicole, o astro de cinema e ídolo do futebol norte-americano O. J. Simpson, obtendo ali mais evidências: manchas de sangue em seu carro, nas suas meias e no chão do jardim. Exames de DNA comprovaram que esse sangue era das vítimas. Assim, a promotoria acreditava ter nas mãos um caso fechado, que não poderia ser contestado, mas foi surpreendida pela estratégia dos advogados de O. J. Simpson: o questionamento das provas. As câmeras de televisão flagraram o principal perito da polícia coletando amostras sem luvas, policiais manipulando evidências sem trocar as luvas e muitas pessoas circulando na cena do crime, que não tinha sido bem isolada.

Ciência Hoje, vol. 29, n.º 169 (com adaptações).

Considerando a situação descrita no texto acima, que relata dados referentes a um caso de homicídio ocorrido nos EUA em 1994, julgue os itens a seguir.

- As metodologias de RFLP e PCR, que são fundamentadas no mesmo princípio e requerem a mesma quantidade de amostra, diferindo apenas quanto às enzimas utilizadas, poderiam ter sido aplicadas à situação descrita.

- Na situação descrita, a tipagem sanguínea seria suficiente para a precisa identificação das vítimas a partir de manchas de sangue, não sendo necessário o uso de exames de DNA.

- Na situação considerada, material úmido coletado pelo perito para análise de padrões de DNA deveria ser armazenado em sacos plásticos hermeticamente fechados, pois microrganismos capazes de contaminar a amostra não sobrevivem em tais condições.

Cuidados na coleta de material biológico:Usar luvas e máscarasEvitar conversar sobre as amostrasColetar quantidade suficiente para os exames evitando ao máximo contaminação

Cuidados na preservação do material biológico:Secar os suportes utilizados para a coletaManter as amostras em baixa temperatura (congeladas)

Testes de natureza das amostras

Sangue: Imunológicos, sorológicos, luminolEsperma: PSA, fosfatase alcalinaGlobulina humana

Extração

Tem o objetivo de retirar o material celular do suporte, lisar as células e eliminar todo o conteúdo celular deixando apenas o DNA

Extração

Protocolos diferentes para cada tipo de amostra

Sangue

Amostra padrão para coletas de referências

Extração simplificada

Pouca variação entre diferentes amostras

Rotina de DNA forensePapel FTA

Rotina de DNA forenseSwab de mucosa oral

Alternativa menos invasiva ao sangue

Muito utilizada para coleta em crianças

Coleta necessita ser bem feita para se obter boa quantidade de células

Coleta menos especializada

Rotina de DNA forenseSwab de mucosa oral

Rotina de DNA forensePelos

Praticamente não se usa a coleta de pelos e fios de cabelo para amostras de referência, devido a dificuldade de se trabalhar com esse tipo de amostra

Rotina de DNA forensePelos

Rotina de DNA forenseAmostras Forenses

Diversos protocolos diferentes de extração

Extração orgânica Fenol-Clorofórmio mais usada, por ser barata e extrair grande quantidade

Desvantagem: Mais trabalhosa, muitas etapas, reagentes perigosos e o produto final não é tão limpo

Rotina de DNA forenseAmostras Forenses

1ª Etapa: Amostra incubada com um tampão de lavagem e lise celular

2ª Etapa: Extração com Fenol-clorofórmio

3ª Etapa: Precipitação com álcool

4ª Etapa: Centrifugação e ressuspenção em H2O

Rotina de DNA forenseExtração diferencial

Utilizada em casos de crimes sexuais

Objetivo é realizar uma lise diferencial das células epiteliais femininas e dos espermatozóides

Utiliza dois “detergentes” de membrana diferentes

Rotina de DNA forenseExtração diferencial

Rotina de DNA forenseExtração com Chelex®

Resina que tem afinidade por DNA

Extração mais rápida e com menos etapas do que a orgânica

Produto final em menor quantidade e mais “sujo” do que orgânica.

Rotina de DNA forenseExtração com kit comerciais

Kits de extração prontos, otimizados para um grupo ou amostras específicas

Extração mais rápida e produto mais “limpo”, porém mais cara e menor quantidade.

Rotina de DNA forenseExtração com kit comerciais

Rotina de DNA forenseQuantificação

Importante para avaliar a quantidade de DNA presente em uma amostra

Técnicas modernas também passam informação sobre a presença de inibidores de PCR

Quantificação através de PCR-RT

PCR em tempo realModificação da técnica de PCR que a torna quantitativa

Utilizada para detecção de alelos em DNA genômicos, diagnóstico de doenças, identificação de organismos transgênicos, identificação de patógenos em alimentos

PCR em tempo real

Amostra Protocolo Ct Qtd (ng)

C-9856 Humano 29,58 3,324

Masculino 28,49 3,129

IPC 27,31

PCR em tempo real permite quantificar o DNA presente em uma amostra

Permite também distinguir a fonte de DNA em humana e masculina

Padrão interno permite avaliar a presença ou não de inibidores

Possibilita ajuste da concentração ideal de DNA

Rotina de DNA forenseAmplificação

Amplificação

Primers: Forward e Reverse (sense - anti-sense

Se o produto for submetido à eletroforese capilar, os primers são marcados com um fluoróforo

A amplificação ocorre sempre no sentido 5`- 3`

Amplificação

Parâmetros dos ciclos

1. Temperatura e Tempo de desnaturação

Falta de desnaturação do molde é uma causacomum de falha na PCR

Tipicamente 94ºC por 30 sTempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima

Parâmetros dos ciclos

2. Temperatura e Tempo de anelamento

Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primersTempo de anelamento = 15 a 30 sTempo de extensão: função tamanho do AMPLICON– 1 minuto é suficiente 1,2 kb– Longo, reduz a meia vida da enzima

Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica

Eficiência teórica x Eficiência Real

Principais fatores contribuintesPerda da atividade da PolimeraseAcúmulo de inibidoresLimitação dos componentesCompetição entre produtosPareamento Produto x Molde, Competição com anelamento do primer

Componente Volume

H2O 5,5 цL

Reaction Mix 12,5 цL

Primer Set 10,5 цL

Taq Gold 0,5 цL

Volume total 22,0 цL

DNA (0,5 a 1,25 ng) 5,0 цL

Rotina de DNA forenseEletroforese

EletroforesePara separação de fragmentos de DNA são utilizados dois tipos de gel: Agarose e Poliacrilamida

Agarose utilizado para fragmentos maiores e poliacrilamida pra amplicons menores (como os de STR)

EletroforeseA eletroforese em gel trabalha com DNA tanto na forma fita simples quanto fita dupla

Para conseguir que o DNA fique estável na forma de fita simples são utilizados agentes desnaturantes como por exemplo Uréia e Formamida

Eletroforese Capilar Separação dos amplicons de DNA em um capilar ao invés do gel

Possui diversas vantagens como maior poder de resolução, corrida mais rápida, potencial para automação, utiliza pequenas quantidades de amostra, visualização do resultado imediata

Eletroforese

Resumo

Recebimento Armazenamento Extração

Quantificação

AmplificaçãoEletroforeseGenotipagem

Sequenciamento

Técnicas utilizadas para descobrir a sequencia das bases de um fragmento de DNA não conhecido

Sequenciamento

Sequenciamento de Nova Geração

Novas metodologias que permitiram aumentar muitas vezes a capacidade de sequenciamento, abrindo a possibilidade para novos estudos que eram inviáveis com as tecnologias mais antigas

Marcadores dos Cromossomos X e Y

Cromossomo Y

Linhagem Patrilínea

90% da população brasileira possui Y de origem européia

Estudo da origem populacional

Cromossomo Y

Cromossomo YMuito útil em crimes sexuais

Reconstituições de paternidade com filhos homens ou com parentes homens

Marcadores de linhagem, não indivíduos específicos

Cromossomo Y

O resultado do matching do Y não identifica indivíduo, mas sim uma linhagem!

Resultado forte nos casos de exclusão e fraco nas inclusões.

Cromossomo X

Principal uso: Casos de paternidade deficientes, com apenas um genitor

(principalmente suposto pai ausente)

Complementar em casos de identificação humana e mutação de autossômicos

DNA Mitocondrial

Cromossomo mitocondrial 16,569 bp, centenas de cópias por célula

Útil para amostras com alto grau de degradação e em baixíssima quantidade

DNA Mitocondrial

Cromossomo característico da linhagem materna, passado da mãe para os filhosMembros de uma mesma família possuem o mesmo haplótipo, a não ser que tenham ocorrido mutações

DNA Mitocondrial

Desvantagens

Baixo poder de discriminaçãoEstudo caro e trabalhoso

Sobre a utilização de DNA mitocondrial como fonte de material para análises de DNA é correto afirmar que:

(A) é freqüentemente utilizado em casos de determinação de paternidade, pois está presente em grande quantidade no espermatozóide;

(B) sua utilização não é indicada para materiais resultantes de incêndios ou explosões, pois só há uma cópia de DNA mitocondrial.

(C) é indicado nos casos em que a quantidade de material celular é reduzida, como nos resíduos fecais e material calcinado, pois as células possuem grande número de cópias do DNA mitocondrial em relação ao nuclear;

(D) não permite a realização de estudos evolutivos em materiais muito degradados, como as múmias, pois é menos resistente que o nuclear.

(E) a análise do DNA mitocondrial humano não é recomendada às aplicações forenses, pois possui muitas regiões desconhecidas e é tão grande quanto o DNA nuclear.

DNA Mitocondrial

MUITO OBRIGADO E BOA SORTE!

arthursvidzinski@hotmail.com

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