CLONAGEM

PROFª DRª PRISCILA L. MELLO

ELABORADO POR: PROFª DRª MARTA F. BASTOS

CLONAGEM

• Originada da palavra grega Kólon, que designa forma de reprodução

assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA;

• Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas;

• Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de

organismos idênticos derivados de um ancestral comum.

TIPOS DE CLONAGEM

Reprodutiva- Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez

com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997.

- A célula de um indivíduo adulto é fundida com um óvulo sem núcleo, de forma que o "embrião" gerado possui o conteúdo genético da pessoa que doou a célula.

Clonagem Reprodutiva

Clonagem Reprodutiva

Tipos de Clonagem

Terapêutica

- Aprimoramento das técnicas hoje existentes para

culturas de tecidos, que são realizadas há décadas.

- É feita a transferência do núcleo de uma célula de

uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se

gera, em laboratório, células potencialmente capazes de

produzir qualquer tecido.

Clonagem Terapêutica

Terapêutica x Reprodutiva

• Clonagem Molecular

- É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante

e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a

seleção do DNA recombinante.

- Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica,

Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação

genética e Nova genética

Tipos de Clonagem

CLONAGEM MOLECULAR

Estudos genômicos

Estudos de expressão de mRNAs

Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)

Vacinas de DNA

Produção de organismo transgênicos

Terapia Gênica

Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína

Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas

CLONAGEM MOLECULAR

OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA.

- Inserção de fragmentos de DNA em vetores;

- Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras

- Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.

CLONAGEM MOLECULAR

Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de

DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma

célula hospedeira adequada.

Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido

e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras,

células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).

VETORES MOLECULARES

VETORES MOLECULARES

São moléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são

passados de geração para geração;

Características

-Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira

independente

- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de

restrição

- Gene marcador (AmpR)

VETORES MOLECULARES

VETORES MOLECULARES- TIPOS

• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do

experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem

podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes.

-Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb

- Fagos - clonagem de até 23.000 pb

Vetores Moleculares

Clonagem Expressão

Permite a multiplicar as moléculas de DNA de interesse.

Vetores de Clonagem (plasmídios)

- Permite expressar uma

proteína

- Indução da expressão

- Proteína pode ser purificada

Vetores Moleculares

Clonagem Expressão

Proteínas recombinantes-Aplicações

CLONAGEM

Clonagem Molecular

• DNA ligase: Ligar fragmentos de DNA recombinantes

Clonagem Molecular

DNA Ligase

CLONAGEM MOLECULAR

FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS)

• Transformação bacteriana

• Transfecção (transformação em células eucariontes)

• Eletroporação (choque)

• Microinjeção

• Infecção viral

CaCl2: íons Ca²+ neutraliza carga –dos fosfolípideos da membrana e do DNA recombinante

Choque térmico: mudança brusca de temperatura atraem a molécula de DNA recombinante para dentro da célula hospedeira

Transformação

Meio de cultura enriquecido eincubação a 37ºC parapromover recuperação dascélulas hospedeira

Seleção das bactériastransformadas por cultivo emmeio de cultura contendoampicilina.

Transformação

Seleção dos clones

BIBLIOTECAS MOLECULARES

BIBLIOTECAS MOLECULARES

• Conjunto de todos os genes de uma

determinada espécie armazenados

na forma de moléculas de DNA

recombinante.

BIBLIOTECAS MOLECULARES

Bibliotecas Genômicas

- Formadas a partir de DNA genômico

- DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou

enzimaticamente em pedaços menores

- Clonados em fagos e plasmídios.

BIBLIOTECAS GENÔMICAS

Bibliotecas Moleculares

Bibliotecas cDNA (DNA complementar)

- Representa o conteúdo de mRNA de uma

célula/tecido- Transcriptoma

- Clonagem apenas das mensagens dos genes.

- É mais seletiva

- Isolamento de genes específicos

Bibliotecas de cDNA

• Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA

- Transcriptase reversa

Extração de RNA total

Bibliotecas de cDNA

RNA total

Purificação domRNA

DNA Genômico x cDNA