Post on 07-Jan-2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FERNANDA MARQUES DE AZEVEDO
NATAL/RN
2013
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE COMPOSTO TIPO
HEPARINA (cCTH) EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata EM
MODELO EXPERIMENTAL DE PERITONITE
Fernanda Marques de Azevedo
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE COMPOSTO TIPO
HEPARINA (cCTH) EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata EM
MODELO EXPERIMENTAL DE PERITONITE
Dissertação de mestrado apresentada ao
programa de Pós-graduação do Departamento
de Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Suely Ferreira Chavante
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Giulianna Paiva Viana
de Andrade Souza
NATAL/RN
2013
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Tânia e Augusto, por sempre se fazerem presentes e me ajudarem
em todos os momentos que precisei.
Às minhas irmãs, Flaviana e Fabrisia, por fazer meus dias mais agradáveis sempre
que possível.
À minha co-orientadora, Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza, por acreditar no
meu potencial e me ajudar a continuar nos momentos de dificuldades.
“Cada pessoa que passa em nossa vida passa
sozinha, é porque cada pessoa é única e
nenhuma substitui a outra. Cada pessoa que
passa em nossa vida passa sozinha, e não nos
deixa só, porque deixa um pouco de si e leva
um pouco de nós...”.
Charles Chaplin.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me ajudar a superar todos os obstáculos;
A meus pais, Tânia e Augusto e minhas irmãs, Flaviana e Fabrisia,
simplesmente por existirem e estarem presentes na minha vida, por acordar de
madrugada e me buscar na UFRN várias vezes, por me ajudar a comprar
caranguejo, manter o foco em meus objetivos e sempre acreditar em mim. Obrigada
pelo carinho e compreensão;
À minha co-orientadora, Giulianna Andrade Souza, por me aceitar como
aluna, por partilhar comigo a construção desse trabalho e me ajudar a concluí-lo,
sempre pronta a me socorrer em todos os momentos de dúvidas. Com certeza você
foi imprescindível na minha vida acadêmica;
À minha orientadora, Suely Chavante, por me receber no laboratório como IC
e me aceitar como mestranda, me ajudando a descobrir a pesquisa;
À Professora Fernanda Wanderley, por me auxiliar na iniciação à docência e
sempre ser tão simpática com todos no laboratório;
À Ana Katarina Menezes, por ser sempre prestativa em tudo que eu precisei
no laboratório, principalmente a me ensinar os procedimentos de cultura, e pela sua
amizade;
À Raquel Brito, minha companheira de aventuras desde a graduação.
Obrigada pela companhia alegre, por estar sempre disposta a me ajudar dentro e
fora do laboratório, seja quebrando caranguejo ou escutando meus problemas. Sua
amizade é muito preciosa para mim;
À Dayse Santos, por me ajudar em tudo que precisei no laboratório, sempre
disposta a tirar minhas dúvidas, mesmo quando eu insistia e tirava sua paciência.
Obrigada pela sua amizade, por partilhar as coisas “nerds” comigo e me incentivar a
deixar de ser sedentária. Você sempre será minha mestre Jedi;
À Luciana Coelho, minha companheira de bancada, que dividiu comigo todas
as dificuldades e todas as alegrias na elaboração desse trabalho, todas as noites
mal dormidas e dias no laboratório, seja organizando e testando um protocolo novo
ou contando lâminas de células que pareciam não ter fim. Sem você eu não teria
conseguido terminar, disso eu tenho certeza;
À Eliene, por me ajudar nos momentos de necessidade e por sempre
transmitir esse bom humor e alegria contagiantes;
Aos meus companheiros do Laboratório de Glicoconjugados Bioativos I, os
“GAGuinhos”: Ingrid, Lívia, Lais, Rômulo, Jefferson, Manuela, Marlyane, Ramayana,
Iglesias, Adriana, Vanessa, Airton que de uma forma ou de outra estavam sempre
prontos a me ajudar em tudo que eu precisasse. A presença de vocês com certeza
fez meus dias mais divertidos no laboratório! Obrigada por tudo, de coração;
A meus amigos da graduação: Bruno Mattos, Érika Galvão e Hebert Costa,
que tinham paciência de me ajudar e discutir sobre meu trabalho mesmo se
encontrando rapidamente nos corredores. Obrigada pela amizade de vocês;
Às meninas do Laboratório de Imunofarmacologia do DMP: Alessandra
Marinho, Jéssica Jales, Hylarina Diniz. Vocês foram imprescindíveis na etapa final
desse trabalho, não tenho palavras para agradecer toda a ajuda que vocês me
deram, sou muito grata a todas! Obrigada pela amizade de vocês dentro e fora da
UFRN;
À minha turma de mestrado, que partilharam dos momentos de agonia e
mesmo assim conseguiam deixar as coisas mais divertidas;
Aos professores que fizeram parte da minha pré-qualificação, Elizeu Antunes
e Daniella Martins, obrigada pelas contribuições nesse trabalho;
Às professoras da minha qualificação: Janeusa Souto, Celina Dore e Luciana
Guimarães. Obrigada pelas observações, isso me ajudou a juntar forças e seguir
adiante;
À Margarita Mavromatis, por ser tão solícita e conseguir resolver os
problemas de forma muito eficiente;
Aos funcionários do DBq: Rogério, Ricardo, Jonas, Ângela, Creuza, Marcos,
por estarem sempre dispostos a ajudar nos momentos de necessidade, obrigada
pela cordialidade e prestatividade;
A todos os professores do DBq, pelas aulas, pela colaboração em permitir a
utilização de equipamentos e reagentes, por transmitir seus conhecimentos sem
esforço sempre que necessário. Obrigada a todos;
Aos doutorandos, mestrandos e ICs do DBq que me ajudaram em diversos
momentos de dúvidas, partilharam dos finais de semana de trabalho e que, apesar
de todas as dificuldades em se fazer pesquisa, sempre estavam dispostos a ajudar e
transmitir bom humor. Obrigada;
À CAPES pela bolsa concedida;
E a todos que de alguma forma me ajudaram a concluir esse trabalho, meu
muito obrigada!
"Ambição sem conhecimento é como um
barco em terra firme".
Provérbio chinês.
RESUMO
A heparina, um polissacarídeo sulfatado, foi o primeiro composto utilizado
como anticoagulante e agente antitrombótico. Devido às suas características
estruturais, possui ainda um grande potencial anti-inflamatório, entretanto tal uso na
inflamação é limitado em razão de seus efeitos acentuados na coagulação. A
ocorrência de compostos semelhantes à heparina que apresentam atividade
anticoagulante diminuída em invertebrados aquáticos, como o caranguejo Goniopsis
cruentata, despertou o interesse para o estudo de tais compostos como fármacos
anti-inflamatórios. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial
modulador do composto semelhante à heparina extraído do Goniopsis cruentata em
eventos inflamatórios, coagulação, além de avaliar alguns aspectos de sua estrutura.
O composto tipo heparina apresentou alto grau de N-sulfatação em sua estrutura,
sendo capaz de reduzir a migração leucocitária para a cavidade peritoneal em doses
mais baixas em relação à heparina e ao diclofenaco de sódio (anti-inflamatório
comercial). Além disso, foi capaz ainda de inibir a produção de óxido nítrico e fator
de necrose tumoral alfa por macrófagos ativados, inibiu a ativação da enzima
neutrofílica elastase em concentrações baixas e apresentou um menor efeito
anticoagulante em doses altas em comparação com a heparina de mucosa suína.
Devido a essas observações, o composto extraído do caranguejo Goniopsis
cruentata pode ser utilizado como um modelo estrutural para futuros agentes anti-
inflamatórios.
Palavras-chave: Inflamação. cCTH. Heparina. Invertebrados aquáticos. Goniopsis
cruentata. Leucócitos.
ABSTRACT
Heparin, a sulfated polysaccharide, was the first compound used as an
anticoagulant and antithrombotic agent. Due to their structural characteristics, also
has great potential anti-inflammatory, though such use is limited in inflammation
because of their marked effects on coagulation. The occurrence of heparin-like
compounds that exhibit anticoagulant activity decreased in aquatic invertebrates,
such as crab Goniopsis cruentata, sparked interest for the study of such compounds
as anti-inflammatory drugs. Therefore, the objective of this study was to evaluate the
potential modulator of heparin-like compound extracted from Goniopsis cruentata in
inflammatory events, coagulation, and to evaluate some aspects of its structure. The
heparin-type compound had a high degree of N-sulphation in its structure, being able
to reduce leukocyte migration into the peritoneal cavity at lower doses compared to
heparin and diclofenac sodium (anti-inflammatory commercial). Furthermore, it was
also able to inhibit the production of nitric oxide and tumor necrosis factor alpha by
activated macrophages, inhibited the activation of the enzyme neutrophil elastase in
low concentrations and showed a lower anticoagulant effect in high doses as
compared to porcine mucosal heparin. Because of these observations, the
compound extracted from crab Goniopsis cruentata can be used as a structural
model for future anti-inflammatory agents.
Keywords: Inflammation. cCTH. Heparin. Aquatic invertebrates. Goniopsis cruentata.
Leukocytes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados18
Figura 2. Estrutura e localização do heparam sulfato e heparina no organismo ...... 19
Figura 3. Cascata de Coagulação ............................................................................ 21
Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação ........................................... 22
Figura 5. Recrutamento de Leucócitos ..................................................................... 24
Figura 6. Goniopsis cruentata ................................................................................... 30
Figura 7. Esquema extração dos GAGs do caranguejo Goniopsis cruentata ........... 34
Figura 8. Esquema do fracionamento com acetona ................................................. 34
Figura 9. Comportamento eletroforético no sistema de tampão PDA das frações
obtidas da cromatografia de troca iônica (Lewatit) .................................................... 41
Figura 10. Comportamento eletroforético no sistema PDA das frações após
fracionamento com volumes crescentes de acetona ................................................. 42
Figura 11. Comportamento eletroforético no sistema descontínuo Ba-PDA das
frações após fracionamento com volumes crescentes de acetona ........................... 43
Figura 12. Porcentagem do infiltrado leucocitário para a cavidade peritoneal em 3 e
6 horas ...................................................................................................................... 47
Figura 13. Biodisponibilidade sistêmica dos compostos dos animais submetidos à
peritonite com indução da inflamação de três e seis horas ....................................... 49
Figura 14. Efeito do cCTH e heparina na produção de NO por macrófagos ativados
in vitro ........................................................................................................................ 50
Figura 15. Efeito do cCTH e heparina na produção de IL-1β por macrófagos
ativados in vitro ......................................................................................................... 51
Figura 16. Efeito do cCTH e heparina na produção de TNF-α por macrófagos
ativados in vitro ......................................................................................................... 52
Figura 17. Efeito do cCTH e heparina na inibição da elastase neutrofílica in vitro ... 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Massa molecular média do Composto Tipo Heparina do Goniopsis
cruentata, heparina e heparam sulfato de mamíferos. .............................................. 44
Tabela 2. Composição relativa dos dissacarídeos presentes no cCTH extraído do
Goniopsis cruentata em comparação com outros compostos. .................................. 45
Tabela 3. Porcentagem de inibição do infiltrado leucocitário da contagem total e de
polimorfonucleares para cavidade peritoneal nos diferentes tempos. ....................... 47
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Δ Presença de insaturação entre C-4 e C-5 do resíduo de
ácido urônico
ΔUA, 2S-GlcNS Dissacarídeo Insaturado Dissulfatado
ΔUA, 2S-GlcNS,6S Dissacarídeo Insaturado Trissulfatado
ΔUA-GlcNAc Dissacarídeo Insaturado N-acetilado
ΔUA-GlcNAc,6S Dissacarídeo Insaturado N-acetilado-6-sulfatado
ΔUA-GlcNS Dissacarídeo Insaturado N-sulfatado
ΔUA-GlcNS,6S Dissacarídeo Insaturado N,6-dissulfatado
AINEs Anti-inflamatórios não esteroidais
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AT Antitrombina
Ba/PDA Tampão acetato de bário e tampão 1,3 diaminopropano
acetato
cCTH Composto Tipo Heparina do caranguejo Goniopsis
cruentata
CETAVLON Brometo de Cetiltrimetilamônio
CN Controle Negativo
CP Controle Positivo
CXCL8/IL-8 Fator Quimiotático de Neutrófilos/Interleucina 8
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
ELISA Ensaio de Ligação Imunoenzimática
E-selectina Selectina Endotelial
F 0,6v Fração 0,6 volume de acetona
F 0,7v Fração 0,7 volume de acetona
F 0,8v Fração 0,8 volume de acetona
F 1,0v Fração 1,0 volume de acetona
F 2,0v Fração2,0 volume de acetona
F-0,5v Fração 0,5 volume de acetona
F-1,0M Fração 1,0 Molar
F-3,0M Fração 3,0 Molar
GAGs Glicosaminoglicanos
G-CSF Fator Estimulador de Colônia Granulocítica
GlcA Ácido Glucurônico
GlcN Glucosamina
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia Macrofágica-Granulocítica
HCII Cofator II de Heparina
Hep Heparina
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Performance
HS Heparam Sulfato
i.p. Intra-peritoneal
IdoA Ácido Idurônico
IFN-γ Interferon gama
II a XIII Fatores Inativos da Cascata de Coagulação
IIa a XIIIa Fatores Ativos da Cascata de Coagulação
IL- 1β Interleucina 1 beta
IL-12 Interleucina 12
IL-6 Interleucina 6
LP Liquido Peritoneal
LPS Lipopolissacarídeo
L-selectina Selectina de Linfócito
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
NO Óxido Nítrico
NOS-3 Óxido Nítrico Sintase 3
PBS Tampão Fosfato Salino
PDA 1,3-diaminopropano acetato
PMN Leucócitos Polimorfonucleares
P-selectina Selectina de Plaquetas
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
RPM Rotações por minuto
RPMI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SFB Soro Fetal Bovino
TFPI Inibidor da Via do Fator Tecidual
TNF Fator de Necrose Tumoral
TNFα Fator de Necrose Tumoral alfa
TTPa Tempo de Tromboplastina Parcial ativada
UV Ultravioleta
x g RCF – Força centrífuga relativa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18
1.1 GLICOSAMINOGLICANOS ............................................................................. 18
1.2 AÇÃO DE HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA COAGULAÇÃO .............. 20
1.3 AÇÃO DA HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA INFLAMAÇÃO ................ 23
1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO FONTE
DE BIOMOLÉCULAS ATIVAS ............................................................................... 27
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 29
2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................... 29
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 29
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 30
3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS .............................................................................. 30
3.1.1 Caranguejo ................................................................................................ 30
3.1.2 Animais ...................................................................................................... 30
3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES ........................................................... 31
3.3 ENZIMAS ......................................................................................................... 31
3.4 REAGENTES ................................................................................................... 31
3.5 EQUIPAMENTOS ............................................................................................ 32
3.6 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA DO
CARANGUEJO ...................................................................................................... 33
3.7 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE ..................................................... 35
3.7.1 Sistema 1,3 diaminopropano acetato (PDA) .............................................. 35
3.7.2 Sistema descontínuo de Ba/PDA ............................................................... 35
3.8 DEGRADAÇÃO COM ENZIMAS DE Flavobacterium heparinum .................... 36
3.9 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR.................................................. 36
3.10 PERITONITE AGUDA INDUZIDA POR TIOGLICOLATO .............................. 36
3.11 OBTENÇÃO, CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DAS CÉLULAS DO
LÍQUIDO PERITONEAL ......................................................................................... 37
3.12 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA .................................. 38
3.13 COLETA DE MACRÓFAGOS ........................................................................ 38
3.14 CULTURA DE MACRÓFAGOS ..................................................................... 39
3.15 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO ................................................................... 39
3.16 DOSAGEM DE CITOCINAS (IL-1β e TNF-α) ................................................. 39
3.17 TESTE DE INIBIÇÃO DA ELASTASE ........................................................... 39
3.18 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 40
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 41
4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGS DO CARANGUEJO Goniopsis
cruentata ................................................................................................................ 41
4.2 MASSA MOLECULAR E ANÁLISES QUÍMICAS ............................................. 43
4.3 DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA ......................................................................... 44
4.4 EFEITO DO CCTH EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Gonipsis cruentata
SOBRE A INIBIÇÃO DO INFLUXO DE CÉLULAS EM MODELO DE PERITONITE
AGUDA .................................................................................................................. 45
4.5 AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DOS COMPOSTOS NO
MODELO DE PERITONITE AGUDA. .................................................................... 49
4.6 EFEITO DO cCTH NA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E CITOCINAS POR
MACRÓFAGOS ATIVADOS .................................................................................. 50
4.6.1 Dosagem de Óxido Nítrico ......................................................................... 50
4.6.2 Dosagem de IL-1β e TNF-α ....................................................................... 51
4.7 EFEITO DO cCTH DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata SOBRE A
INIBIÇÃO DA ELASTASE NEUTROFÍLICA in vitro ............................................... 52
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 61
7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 62
Introdução 18
1 INTRODUÇÃO
1.1 GLICOSAMINOGLICANOS
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são heteropolissacarídeos constituídos por
unidades dissacarídicas repetitivas formadas por uma hexosamina (glucosamina ou
galactosamina) e por um açúcar não-nitrogenado (galactose ou ácido urônico –
glucurônico ou idurônico), unidos por ligações glicosídicas. Existem seis principais
tipos de GAGs encontrados em tecidos animais: ácido hialurônico, condroitim 4, 6-
sulfato, dermatam sulfato, queratam sulfato, heparam sulfato e heparina, cujas
unidades estruturais estão esquematizadas na Figura 1. Estes compostos são
diferenciados pelos tipos de açúcares constituintes, proporções das unidades
dissacarídicas, presença e grau de sulfatação, tipo de ligação glicosídica e tamanho
molecular das cadeias de dissacarídeos (DIETRICH, 1984).
Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados.
Adaptada de VOLPI & MACCARI, 2006.
Introdução 19
Heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) são expressos na forma de
proteoglicanos: glicoconjugados compostos de um core protéico ligados
covalentemente a polímeros de carboidratos (LI & VLODAVSKY, 2009). Tanto o HS
quanto a Hep consistem de unidades alternadas de glucosamina (GlcN) com ácido
glucurônico (GlcA) e/ou ácido idurônico (IdoA). HS contém uma proporção maior de
GlcA, enquanto que a Hep contém mais IdoA. Ambas as moléculas são sulfatadas,
entretanto a Hep apresenta uma maior quantidade de sulfatação, o que proporciona
um elevado grau de eletronegatividade (LEVER & PAGE, 2002). Células do tecido
conjuntivo de mastócitos degranuladores produzem proteoglicanos de Hep (LI &
VLODAVSKY, 2009) que são liberados juntamente com histamina e capazes de se
dissociar como cadeias de GAGs livres (LEVER & PAGE, 2002). Proteoglicanos de
HS são ubiquamente encontrados na superfície de diversas células, como as do
endotélio vascular e leucócitos circulantes, matriz extracelular e membranas basais
(LI & VLODAVSKY, 2009) (Figura 2).
Figura 2. Estrutura e localização do heparam sulfato e heparina no organismo. a. Heparam
sulfato. b. Heparina. Ver texto para maiores explicações. Adaptado de LEVER & PAGE, 2002.
Introdução 20
A Hep é encontrada em algumas espécies de vertebrados e invertebrados
(NADER et. al., 1999a; 2004) na forma do proteoglicano serglicin (LI &
VLODAVSKY, 2009), enquanto que o HS é ubíquo na superfície celular de diversas
espécies tanto de vertebrados quanto invertebrados (CASSARO et al., 1977;
DIETRICH et al., 1977; 1980; NADER et al., 1984) e expresso na forma de
diferentes tipos de proteoglicanos, como sindecans e glipicans, além de
proteoglicanos da matriz extracelular, como perlecan, agrina e colágeno tipo XVIII (LI
& VLODAVSKY, 2009; PARISH, 2006). Apesar dessas diferentes formas e locais de
expressão, o padrão característico das unidades sulfatadas e não sulfatadas nessas
moléculas possibilita o reconhecimento por uma variedade de proteínas ligantes que
se associam, eletrostaticamente, com esses carboidratos. Devido a tal fato, vários
estudos demonstram a atuação desses compostos em diversos processos
biológicos, como coagulação e inflamação.
1.2 AÇÃO DE HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA COAGULAÇÃO
O fluxo sanguíneo normal do organismo depende da existência de um
equilíbrio preciso entre vários processos fisiológicos, como a coagulação e fibrinólise
(e seus inibidores naturais), a inflamação, a integridade da monocamada de células
endoteliais, entre outros (BOUÇAS et al., 2006), e esse equilíbrio é denominado
hemostasia. O sistema de coagulação é o principal agente na hemostasia contra
estímulos prejudiciais e invasores no organismo (CHOI et al., 2006). A coagulação
tem como objetivo converter fibrinogênio em fibrina para formar uma malha dentro
do agregado de plaquetas, estabilizando o coágulo no local da lesão (Figura 3).
Embora o objetivo final da coagulação seja a polimerização de fibrina, a
característica mais crucial da via de coagulação é a geração de trombina (ou fator
IIa) (RAU et al., 2007). Esse processo ocorre por meio da amplificação de uma série
de reações enzimáticas em que o produto de cada reação converte uma proteína
plasmática inativa em um produto de protease ativa. Assim, os fatores circulam em
uma forma inativa, quer como zimogênios (por exemplo, XII, XIII, II, etc.) ou pró-
fatores (V e VIII), que são ativados por uma proteólise limitada (BOUÇAS et al.,
2006). A cascata de reações consiste de duas vias principais. A primeira é a via
extrínseca, iniciada pela reação da tromboplastina tissular (fator III ou tecidual),
Introdução 21
seguida pelos fatores VII e X. A outra, a via intrínseca, iniciada pelo fator XII é
seguida da ativação dos fatores XI, IX e VIII. Os fatores extrínsecos VII ativado (VIIa)
e intrínseco IX ativado (IXa) ativam o fator X na presença de fosfolipídeos, cálcio e
fator V (proacelerin). O fator Xa catalisa a reação de protrombina (fator II) em
trombina (fator IIa), resultando na clivagem da fibrina (KURATA & HORII, 2004).
Os inibidores naturais da cascata de coagulação desempenham um papel
fundamental no controle da hemostasia, exercido através da inibição específica de
serino proteinases que são formadas na cascata, bem como pela degradação de
fatores. Serpinas como antitrombina (AT), co-fator II de heparina (HCII) e inibidor da
via do fator tecidual (TFPI) pertencem a essa classe de compostos (Figura 4)
(BOUÇAS et al., 2006). A trombina (ou fator II) pode ser inibida por duas serpinas, a
antitrombina (AT) e o co-fator II da heparina (HCII). Ambas as serpinas aceleram a
inibição da trombina pelo menos mil vezes mais mediante a interação com certos
glicosaminoglicanos (HE et al., 2008). A aceleração da inibição da proteinase é
Figura 3. Cascata de Coagulação. II a XIII, diferentes zimogênios e pró-fatores; IIa a XIIIa, diferentes fatores ativados; III, fator tecidual; HK, calicreína; HMWK, quininogênio de alto peso molecular; PL, fosfolipídeos (fosfatidil serino e fosfatidil etanolamina). Adaptado de Bouças e colaboradores (2006).
Introdução 22
conferida através de um modelo de efeito onde a proteinase (trombina) e a serpina
(AT ou HCII) ligam-se a mesma cadeia de heparina. Uma hipótese é que esta co-
ocupação irá limitar a liberdade de difusão aumentando a probabilidade de encontro
entre essas duas moléculas (RAU et al., 2007). Sabe-se também que ocorre uma
mudança conformacional na AT que acelera a inibição do fator Xa (outra serino
proteinase) graças à ligação da heparina ou HS com essa serpina (WANG &
DALLAS, 2006; LIU et al., 2007), diminuindo a amplificação da coagulação (van
DOORMAAL et al., 2008). Numa menor proporção também atua nos fatores XIIa,
XIa e IXa (ALSAYEGH et al., 2009).
A interação da AT com HS sobre o endotélio e subendotélio concentra a
atividade da AT à parede do vaso mantendo a normalidade do fluxo sanguíneo, não
apresentando caráter trombogênico (RAU et al., 2007), sugerindo um papel
fisiológico relevante nos níveis de atividade anticoagulante dentro do vaso
sanguíneo (LIU et al. 2007). A inibição da cascata de coagulação é utilizada na
terapia de anticoagulação em várias especialidades médicas, com indicações
incluindo a prevenção e tratamento de eventos tromboembólicos, tanto venosos
Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação. II a XII, diferentes zimogênios e pro-fatores; IIa a XIIa, diferentes fatores ativados; TF, fator tecidual ou fator III; AT, antitrombina, HC II, co-fator II de heparina; TFPI, inibidor da via do fator tecidual; tPA, ativador plasminogênio tecidual; PC, proteína C; PS, proteína S. Adaptado de Bouças e colaboradores (2006).
Introdução 23
quanto arteriais. As heparinas de administração parenteral, incluindo heparina não
fracionada e seus derivados, como a heparina de baixo peso molecular, tem sido os
anticoagulantes mais utilizados por mais de 60 anos (LAUX et al., 2009;
SUNDARAM et al., 2003).
O sistema de coagulação pode ser considerado como uma parte essencial da
imunidade inata, pois a ativação da cascata de coagulação também promove a
ativação da resposta inflamatória, devido ao fato de ambos possuírem serino-
proteases como fatores de ativação, assim como o fator XIIa que é capaz de ativar a
proteína C1q que promove a ativação da via clássica do Sistema Complemento
(AMARA et al., 2008).
1.3 AÇÃO DA HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA INFLAMAÇÃO
A imunidade natural é a primeira linha de defesa do organismo, ocorrendo o
recrutamento de leucócitos que impede, controla ou elimina a invasão por patógenos
e/ou danos teciduais no hospedeiro (WANG et al., 2002). A reação da imunidade
natural, ou inflamação, é uma resposta do organismo a estímulos nocivos. Esta ação
protetora é obtida principalmente pelo recrutamento de leucócitos, seguida por uma
cascata de reações bioquímicas que se propagam e iniciam a resposta inflamatória
(LI & VLODAVSKY, 2009). Uma característica essencial de qualquer resposta
inflamatória é o recrutamento rápido de leucócitos do sangue para o local da
inflamação (MULLER, 2003; YADAV et al., 2003). Esse processo requer a migração
de leucócitos através o endotélio vascular, sendo um mecanismo conhecido como
extravasamento ou diapedese (PARISH, 2006).
O recrutamento de leucócitos para locais de inflamação é um processo
complexo que envolve diversas moléculas. Com o estímulo inflamatório, mastócitos
residentes liberam histamina e macrófagos residentes, citocinas pró-inflamatórias,
como o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 1 (IL-1), e quimiocinas que
ativam as etapas da migração leucocitária (NATHAN, 2002). A aderência e o
rolamento de leucócitos no endotélio ativado pelo estímulo inflamatório envolvem
selectinas de linfócitos, plaquetas e células endoteliais (L-, P-, e E-selectinas,
respectivamente) e seus ligantes. A L-selectina é expressa constitutivamente por
leucócitos e se liga ao endotélio inflamado através das cadeias de heparam sulfato
Introdução 24
(HS). P- e E-selectina são expressos nas células endoteliais após ativação por
citocinas pró-inflamatórias (LOWE, 2003).
Os neutrófilos são parcialmente ativados pelo TNF levando a liberação de
pequenas quantidades de elastase, clivando o revestimento e expondo integrinas
(moléculas transitórias de adesão presentes nos leucócitos) que permitem uma
ligação mais forte a matriz extracelular (NATHAN, 1993). Após a aderência, os
leucócitos ativados atravessam a superfície vascular (NOURSHARGH & MARELLI-
BERG, 2005; MULLER, 2003), utilizando a ação de enzimas que degradam a
membrana basal, como metaloproteinases, heparanase e elastase (SHERWOOD &
TOLIVER-KINSKY, 2004; YADAV et al., 2003; DELCAUX et al., 1996) e na presença
de quimioatraentes, moléculas solúveis como produtos bacterianos
(lipopolissacarídeos - LPS, por exemplo) e citocinas (quimiocinas, como a CXCL8/IL-
8) (SHERWOOD & TOLIVER-KINSKY, 2004), migram até o local da inflamação
(Figura 5).
Figura 5. Recrutamento de Leucócitos. Em locais de infecção, a produção de citocinas (tais como TNF e IL-1), por macrófagos residentes, ativa as células endoteliais e leva à expressão de selectinas, ligantes de integrinas e quimiocinas. As selectinas medeiam os eventos iniciais de interação com o endotélio; as integrinas medeiam a forte a adesão dos leucócitos por meio de interações com moléculas ligantes de integrinas tais como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1); as quimiocinas aumentam a afinidade das integrinas dos leucócitos e estimulam a migração das células para os locais de infecção. Todos os leucócitos ativados utilizam essencialmente os mesmos mecanismos de migração. (Adaptado de PARISH, 2006).
Introdução 25
O HS, por ser intensamente expresso na superfície celular, possui efeitos
variados no organismo. Ele afeta a conformação de proteínas (SKINNER et al.,
1997), aumenta interações proteína-proteína, atua como co-receptor para fatores de
crescimento e captura ligantes de proteínas na superfície celular e na matriz
extracelular (WHITELOCK & IOZZO, 2005). Acredita-se ainda que o HS esteja
envolvido em diversas etapas do processo de migração leucocitária, característica
essencial da resposta inflamatória, pois ele interage com uma ampla gama de
proteínas funcionais, como fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas,
proteases, lipases e moléculas de adesão celular (PARISH, 2006). Uma das
hipóteses para atuação do HS na inflamação, é que sua ligação às citocinas (como o
IFN- -las da degradação proteolítica, prevenindo sua rápida
remoção da circulação e resultando no aumento de sua biodisponibilidade
(LORTAT-JACOB et al., 1996). Outra forma de atuação poderia ser a habilidade de
estabilizar e concentrar citocinas e quimiocinas nos locais de inflamação, onde elas
podem direcionar e promover a migração e ativação leucocitária, assim aumentando
a ligação aos receptores expressos na inflamação (YOUNG, 2008). Foi observado
que o HS é o ligante expresso das células endoteliais para a L-selectina
(NORGARD-SUMNICHT et al., 1993), interagindo diretamente com L- e P-selectina
in vitro e interferindo com proteínas que medeiam o rolamento de leucócitos (VARKI,
1998; GIUFFRE et al., 1997).
A Hep pode competir com o HS ou aumentar as interações realizadas por ele,
interferindo com a função desse glicosaminoglicano (LINDAHL, 2007; LINDAHL & LI,
2009). Propõe-se que a heparina, por ser fortemente negativa, possa se ligar as
células endoteliais (HIEBERT & JAQUES, 1976) e diminuir as propriedades de
adesão ao endotélio quando liberados pelos mastócitos durante uma resposta
inflamatória (DAY et. al., 2004; GIUFFRE et al., 1997). Foi demonstrado que a Hep
possui atividade anti-inflamatória in vivo bloqueando a ação da L- e P-selectina
(NELSON et al., 1993; WANG et al., 2002; XIE et al., 2000), um efeito que é
independente da sua atividade anticoagulante (XIE et al., 2000). Além disso, a Hep
inibe interações leucócitos-endotélio tanto in vitro (BAZZONI et al., 1992; LEVER et
al., 2000; SILVESTRO et al., 1994) quanto in vivo (LEY et al., 1991; SALAS et al.,
2000; XIE et al., 1997), além de inibirem o acúmulo de leucócitos em tecidos
específicos, como o pulmão, pele e cavidade peritoneal (SASAKI et al, 1993; SEEDS
et al., 1993; TEIXEIRA & HELLEWELL, 1993; NELSON et al, 1993). A heparina atua
Introdução 26
ainda na ligação e inativação de diversas proteínas inflamatórias, incluindo
componentes do Complemento (MATZNER et al., 1984; STRUNK & COLTEN,
1976), quimiocinas (MILLER & KRANGEL, 1992), citocinas, tais como IFN-
(LORTAT-JACOB et al., 1995), IL-12 (HASAM et al., 1999) e TNF-α (SALAS et al.,
2000).
Um processo importante para a inflamação é a fagocitose dos patógenos
através da ativação dos monócitos em macrófagos. Quando a ativação é obtida
através do IFN- γ, é conhecida como via clássica da ativação de macrófagos e
promove a expressão de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como, por
exemplo, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 (LACY-HULBERT & MOORE, 2006). O processo
de fagocitose culmina com o evento denominado explosão respiratória, ao qual
induz a formação de espécies reativas de oxigênio (do inglês, Reactive Oxigen
Species – ROS) e nitrogênio (principalmente óxido nítrico – NO, um vasodilatador
endógeno) a fim de se eliminar o patógeno fagocitado. Devido ao fato de induzir
reações tóxicas no hospedeiro e ser altamente produzido durante a inflamação, NO
tem sido considerado um agente pró-inflamatório. NO pode ainda atuar através de
efeitos inibitórios ou apoptóticos nas células (COLEMAN, 2001) atuando como
agente anti-inflamatório. Por exemplo, o papel do NO como indutor da inflamação na
pele pode ser pró-inflamatório em baixas concentrações através da indução da
vasodilatação e recrutamento de neutrófilos, enquanto que em altas concentrações
ele regula negativamente moléculas de adesão, suprime a ativação e induz
apoptose de células inflamatórias, ou seja, inibindo a inflamação (ROSS & RESKE-
KUNZ, 2001).
A heparina também atua na fagocitose de microorganismos, através da
produção de ROS e NO, mas existem estudos controversos acerca de seus efeitos
na produção de NO (BELTRÁN et al., 1999). Utilizando células endoteliais da aorta
de bovinos, a heparina diminuiu a produção de NO através da diminuição da
expressão do mRNA da NOS-3 (UPCHURCH et al., 1997), além de diminuir a
produção de NO estimulada por N-formilmetionina em leucócitos polimorfonucleares
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos) (BELTRÁN et al., 1999). Entretanto, a produção
de NO mensurada através dos níveis plasmáticos de nitrito/nitrato foi aumentada
pela administração de heparina em pacientes submetidos à circulação extracorpórea
(LI et. al., 1996). Estudo in vivo mostrou efeito vasodilatador da heparina em
indivíduos saudáveis (HAWARI et al., 1998) e também foi demonstrado que a
Introdução 27
heparina pode causar liberação de NO das células endoteliais (YOKOKAWA et al.,
1993).
1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO FONTE DE
BIOMOLÉCULAS ATIVAS
Apesar de ser um processo fisiológico imprescindível para a defesa do
organismo, a inflamação, quando em excesso, pode trazer prejuízos para o
indivíduo. Por esse motivo, a busca por substâncias que possam atuar na
modulação desse processo é tão intensa. Nesse sentido, há estudos que indicam a
participação de glicosaminoglicanos, como Hep e HS, no processo inflamatório
(WANG et al., 2002; XIE et al., 2000; PARISH, 2006). Apesar dos diversos efeitos na
resposta inflamatória, o uso da heparina na prática clínica é dificultado devido aos
diversos efeitos colaterais promovidos por essas moléculas (BREDDIN, 1999), como
trombocitopenia (FABRIS et al., 2000) e desequilíbrio hemostático (BOUÇAS et al.,
2006) resultantes de sua potente atividade anticoagulante. Diante disso, muitos
estudos procuram análogos da heparina com efeitos na hemostasia reduzidos, com
a finalidade de serem utilizados em atividades nas quais tais efeitos sejam
indesejáveis, como em processos inflamatórios exacerbados. Sabendo que a
ocorrência de Hep e HS não é restrita aos mamíferos (SANTOS et al., 2007), muitos
estudos buscam fontes alternativas desses compostos em organismos aquáticos,
pois eles são uma fonte rica de produtos naturais com alto potencial farmacológico
(HERENCIA et al., 1998).
A variedade de organismos aquáticos representa uma grande fonte de
compostos bioativos, principalmente devido à diversidade estrutural de compostos
presentes nesses animais com potencial terapêutico (BERTEAU & MULLOY, 2003).
No subfilo Crustacea, compostos isolados dos camarões Litopenaeus vannamei,
Penaeus brasiliensis e Litopenaeus schimitti apresentaram baixa influência na
hemostasia (BRITO et al., 2008; DIETRICH et al., 1999; SANTOS, 2006). Além
disso, o composto extraído do Litopenaeus vannamei apresentou efeito anti-
inflamatório sendo capaz de reduzir infiltrado leucocitário em modelo de peritonite
aguda em ratos (BRITO et al., 2008). Em caranguejos, como Ucides cordatus, foram
encontrados compostos com baixa atuação na inibição da coagulação (MEDEIROS
et al., 2000). Também foi demonstrada a presença de compostos com semelhança
Introdução 28
estrutural à heparina e HS no caranguejo Goniopsis cruentata por Andrade e
colaboradores (2013). Esses compostos mostraram ainda serem agentes
anticoagulantes in vitro menos potentes que a heparina não fracionada de
mamíferos e heparinas de baixo peso molecular, além de apresentarem menor risco
hemorrágico quando comparado à heparina (ANDRADE et al, 2013).
Diante disso, a proposta do presente trabalho é avaliar o potencial modulador
do composto extraído do caranguejo Goniopsis cruentata (cCTH) em eventos
inflamatórios, como a migração leucocitária, atuação na coagulação e atuação em
enzimas relacionadas com inflamação.
Objetivos 29
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Avaliar o potencial de composto tipo heparina extraído do caranguejo
Goniopsis cruentata como modulador de eventos da inflamação.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar a estrutura do composto extraído e comparar com obtido no
estudo descrito por Andrade e colaboradores (2013)
Analisar a capacidade do composto em interferir na infiltração leucocitária na
cavidade peritoneal dos animais em diferentes tempos após a indução da
inflamação em modelo de peritonite aguda;
Avaliar o efeito sobre as populações de leucócitos no líquido peritoneal dos
animais em diferentes tempos após indução da inflamação;
Analisar a biodisponibilidade sistêmica do composto nos animais submetidos
ao modelo de peritonite;
Avaliar a atuação do composto na produção de óxido nítrico e citocinas pró-
inflamatórias;
Analisar o efeito do composto tipo heparina sobre a ação na enzima elastase.
Materiais e Métodos 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.1.1 Caranguejo
Os espécimes do caranguejo Goniopsis cruentata (Latreille, 1803) (Figura 6),
popularmente denominado de maria-mulata ou aratu, foram coletados no mangue do
Rio Potengi, no município de São Gonçalo do Amarante/RN e adquiridos em feiras
livres (Natal/RN). Os animais foram mantidos congelados (-20º C) até o
processamento.
3.1.2 Animais
Para avaliação da migração leucocitária, foram utilizados camundongos da
linhagem Swiss (entre 8-10 semanas de idade e massa de 25-40g), provenientes do
Departamento de Bioquímica na Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN). Todos os animais foram submetidos à dieta e água ad libitum. O manejo
experimental realizado nesse trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA) da mesma Universidade (Protocolo Nº: 044/2010).
Superfilo: Arthropoda
Filo: Crustacea
Subordem: Pleocyemata
Infraordem: Brachyura
Família: Grapsidae
Gênero: Goniopsis
Espécie: Goniopsis cruentata
Figura 6. Goniopsis cruentata. Espécie de crustáceo utilizada.
Materiais e Métodos 31
3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES
Heparina sódica de mucosa suína foi obtida do Laboratório Derivati Organici
(Trino Vercellese, Itália);
Heparam sulfato purificado de pâncreas bovino gentilmente doado ao nosso
laboratório pela Prof.a Dr.a Helena Bonciani Nader;
Condroitim 4-sulfato, extraído de cartilagem de baleia e condroitim 6-sulfato,
extraído de cartilagem de tubarão, assim como dermatam sulfato extraído de
mucosa intestinal bovina, foram obtidos da Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio,
Japão).
3.3 ENZIMAS
Heparina liases I, II e III de Flavobacterium heparinum adquiridas da Sigma-
Aldrich (Sigma Aldrich, USA).
3.4 REAGENTES
1,3-diaminopropano acetato (PDA), acetato de bário, brometo de
cetiltrimetilamônio (CETAVLON), e tolueno fornecida pela Aldrich Chemical
Co. Inc. (Milwaukee,WI, EUA);
Acetona, metanol e benzina fornecida pela Cromato Produtos Químicos Ltda.
(Diadema – SP);
Agarose (standard-Low-Mr) adquirida fornecida pela BioRad Laboratories
(Richmond, CA, EUA);
Azul de toluidina e vermelho de cresol, fornecida pela Sigma Chemical
Company (St.Louis, MO, EUA);
Cloreto de Sódio, fornecida pela Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, RJ,
Brasil);
Corante Panóptico (LB, Laborclin®);
Materiais e Métodos 32
Diclofenaco de sódio (Voltaren®, Novartis);
Enzima Superase fornecida pela Prozyn Indústria e Comércio Ltda.;
Kits comerciais para determinação de tempo de tromboplastina parcial ativada
(TTPa) Labtest (São Paulo, SP, Brasil);
Meios de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute), Estreptomicina,
Penicilina, Soro fetal bovino (Campinas, SP, Brasil);
Reagente Coomassie Blue Brilliant G (Sigma Aldrich, USA);
Reagente de Griess (Sigma Aldrich, USA).
Resina de troca-iônica LEWATIT da Bayer S/A (São Paulo);
Solução salina 0,9% (estéril);
Os demais reagentes e materiais utilizados foram da melhor qualidade disponível.
3.5 EQUIPAMENTOS
Além dos equipamentos usuais de laboratório, utilizou-se:
Balança eletrônica, B-tec 2200, Tecnal
Bancada de Fluxo Laminar, Pa300, Pachane;
Banho Maria, Tecnal;
Câmara de Neubauer, Loptik Labor;
Câmara para eletroforese horizontal em gel de agarose, modelo desenvolvido
por Jaques e colaboradores (1968), (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP,
Brasil);
Centrífuga 5804, Eppendorf;
Centrífuga refrigerada 5804 R, Eppendorf;
Centrífuga refrigerada CR 21, Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);
Cito Centrífuga Presvac CT-12 (Presvac do Brasil, Ltda)
Coagulômetro QuickTimer, Drake Eletrônica Comércio Ltda. (São José do Rio
Preto, SP);
Contador manual de volumes HTC-4D, Digitimer;
Espectrofotômetro de Microplacas Epoch, Biotek;
Materiais e Métodos 33
Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa,
Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
GPC-HPLC em coluna 5mm 11S-2000, tamanho 300 x 7,8mm (BioSep
SEC™);
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model
3110;
Medidor de pH FTP 125, IMPRINT do Brasil Ltda. (Campinas, SP);
Microscópio invertido Eclipse TE300, Nikon;
Microscópio óptico CX 25, Olympus;
Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.).
SAX-HPLC em coluna 5µm SAX-80ÅLC, tamanho 150 x 4.6 mm
(PhenoSphere™);
3.6 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA DO
CARANGUEJO
A obtenção do composto tipo heparina do caranguejo foi realizada com a
trituração do animal, seguida da proteólise e complexação com resina de troca-
iônica (Lewatit). Os compostos obtidos por eluição com NaCl foram precipitados com
metanol e em seguida centrifugados e secos (Figura 7). As frações 3MI e 3MII foram
reunidas, dialisadas, liofilizadas e submetidas ao fracionamento com volumes
crescentes de acetona, gerando frações denominadas F 0,5v; F 0,6v; F 0,7v; F 0,8v;
F 0,9v; F 1,0v e F 2,0v (Figura 8). Uma etapa de branqueamento foi realizada para
eliminar os pigmentos presentes nas frações. Em seguida, o material foi
centrifugado, o sobrenadante dialisado e liofilizado, para então serem submetidos às
análises subsequentes.
Materiais e Métodos 34
Figura 8. Esquema do fracionamento com acetona.
Figura 7. Esquema extração dos GAGs do caranguejo Goniopsis cruentata.
Materiais e Métodos 35
3.7 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
A identificação parcial e a quantificação dos GAGs extraídos dos tecidos do
crustáceo foram realizadas através do método de eletroforese em gel de agarose,
desenvolvido por Jaques e colaboradores (1968) e modificado por Dietrich & Dietrich
(1976), utilizando diferentes sistemas de tampões.
3.7.1 Sistema 1,3 diaminopropano acetato (PDA)
O material foi aplicado em gel de agarose (0,6%) no tampão PDA, 0,05M, pH
9.0 (DIETRICH, McDUFFIE, SAMPAIO, 1977) no qual a diamina interage com os
GAGs em diferentes graus, resultando na ordem decrescente de mobilidade
eletroforética: condroitim 4- e 6-sulfatos (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam
sulfato (HS) juntamente com a heparina (Hep), ou seja, os compostos que mais
interagem com a diamina apresentam menor mobilidade eletroforética. O vermelho
de cresol foi utilizado como indicador de migração.
3.7.2 Sistema descontínuo de Ba/PDA
O sistema descontínuo de Ba/PDA (BIANCHINI et al., 1980) permite o
fracionamento da heparina em 3 componentes: migração lenta (S), intermediária (I)
e rápida (F); assim melhor caracterizando-a e diferenciando-a dos outros GAGs.
Após a corrida eletroforética os GAGs foram precipitados no gel pela imersão
em uma solução de Brometo de Cetiltrimetilamônio (CETAVLON) 0,1% por 2 horas.
A seguir, o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e corado com uma solução de
azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%. O excesso de corante foi
removido com solução descorante (ácido acético 1% e etanol 50%) e o gel seco à
temperatura ambiente. Os GAGs interagem com o azul de toluidina e desenvolvem
atividade metacromática característica, permitindo a visualização de suas
características.
Materiais e Métodos 36
3.8 DEGRADAÇÃO COM ENZIMAS DE Flavobacterium heparinum
Cerca de 100 g do composto foram digeridas por uma mistura de enzimas
específicas preparadas de Flavobacterium heparinum (heparinases I, II, III) (2.5 mIU)
e analisadas por SAX-HPLC (item 3.5). Os Δ-dissacarídeos foram eluídos com um
gradiente linear de NaCl (0 - 1M) num período de 30 minutos com fluxo de 1mL.min-1
e detectados por UV a 232 nm.
3.9 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR
Para a determinação da massa molecular, 300 μg do composto obtido e dos
padrões de calibração (1,7 kDa, 4 kDa, 10 kDa, 16 kDa e 20 kDa) foram submetidos
a análise por GPC-HPLC (item 3.5). Em seguida, a amostra foi recuperada por
eluição isocrática (Eluente 0,3M Na2SO4) a 1mL.min-1 e detectados por UV a 205
nm.
3.10 PERITONITE AGUDA INDUZIDA POR TIOGLICOLATO
O ensaio de peritonite foi realizado com grupos formados por seis
camundongos. Os animais receberam injeção subcutânea de solução salina estéril e
apirogênica pura (grupos controles positivo e negativo) ou contendo diferentes
concentrações de heparina ou do Composto Tipo Heparina extraído do caranguejo
em diferentes concentrações: 0,01 µg/Kg; 0,1 µg/Kg; 1 µg/Kg e 10 µg/Kg. Além
disso, grupos tratados com diclofenaco de sódio (Voltaren®, Novartis) e heparina,
tiveram suas doses estabelecidas segundo o método de extrapolação alométrica
interespecífica (PACHALY & BRITO, 2000). A extrapolação alométrica permite,
através do conhecimento das taxas metabólicas de dois diferentes vertebrados,
extrapolar matematicamente para cada um deles, doses de medicamentos indicadas
para o outro, para o qual já foram feitos estudos laboratoriais de experimentação
farmacocinética e farmacodinâmica (PACHALY & BRITO, 2000). Para os cálculos,
utilizaram-se doses normalmente aplicadas em humanos: diclofenaco (1,07 mg/Kg)
e heparina (3 mg/Kg), empregada na circulação extracorpórea (SOUZA & ELIAS
Materiais e Métodos 37
2006; MELO et al., 2008), resultando em doses médias para os animais de 7 mg/Kg
e 20 mg/Kg, respectivamente. Igualmente, foi preparado um grupo com o Composto
Tipo Heparina utilizando o mesmo critério estabelecido para heparina.
Após trinta minutos, 1 mL de solução salina estéril e apirogênica (grupo
salina) ou tioglicolato de sódio 3% (demais grupos) foram injetados
intraperitonealmente em cada animal. A peritonite foi induzida nos grupos tratados
após dois intervalos de tempos de 3 e 6 horas, sendo para cada intervalo feitos
grupos controles positivos (tioglicolato), negativos (salina) e padrão (diclofenaco de
sódio). O modelo de peritonite aguda realizado nesse trabalho foi adaptado a partir
de metodologia proposta por Xie e colaboradores (2000).
3.11 OBTENÇÃO, CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DAS CÉLULAS DO
LÍQUIDO PERITONEAL
A contagem do número total de células presentes no líquido peritoneal (LP) foi
utilizada como uma indicação do grau de inflamação. Após os tempos descritos
anteriormente, os animais foram sacrificados por injeção em dose letal de tiopental
sódico intraperitoneal. Em seguida, foi feita a lavagem da cavidade peritoneal dos
animais, com 4 mL de solução salina, no intuito de se coletar as células presentes. O
LP foi armazenado em tubos contendo EDTA e transferido para tubos do tipo
Falcon® com capacidade para 15 mL e centrifugado a 405 x g, 4°C por 3 minutos.
Em seguida, o sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em 500 μL de
solução salina, onde 20 μL de cada amostra foram diluídos em 380 μL (1: 20) de
solução de Turk (ácido acético a 3%) e a contagem do número total de leucócitos
presentes no peritônio foi realizada em hemocitômetro (câmara de Neubauer) com
microscopia de luz e objetiva de 40x. Após essa contagem, foram preparadas duas
lâminas de microscopia para a contagem diferencial do LP utilizando o CytoSpin
(137,5 x g; temperatura ambiente por 3 minutos). As lâminas foram coradas com
Panóptico (LB, Laborclin®), de acordo com as recomendações do fabricante e a
leitura foi feita com microscopia de luz e objetiva de 100x utilizando um contador
manual de células sanguíneas para contagem diferencial de polimorfonucleares
(PMN). Um número total de 100 células em duplicata foi lido em diferentes campos
para cada animal. Obteve-se um resultado baseado na média das duas lâminas
Materiais e Métodos 38
lidas, sendo o resultado final para cada população expresso como a média dos
percentuais obtidos individualmente nos animais componentes do grupo.
3.12 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA
Foram retiradas alíquotas de sangue dos animais submetidos a peritonite
para avaliação da atividade anticoagulante através do ensaio do Tempo de
Tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) que analisa a via intrínseca da cascata de
coagulação. O sangue citratado foi centrifugado a temperatura ambiente durante 20
minutos a 1157 x g para separação do plasma. Em seguida, 100 l de plasma
citratado de cada animal foram incubados a 37°C durante três minutos. A seguir, 100
l de cefalina foram adicionados e a mistura incubada a 37ºC por mais três minutos.
Após esse tempo, 100 l de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,025 mol/L pré-aquecido a
mesma temperatura foram adicionados e o tempo de coagulação medido no
coagulômetro QuickTimer. Os testes foram feitos em duplicata e o valor de cada
animal representa a média desses valores, sendo a média dos grupos os
percentuais obtidos individualmente.
3.13 COLETA DE MACRÓFAGOS
Os animais tratados com tioglicolato a 3% foram sacrificados após 3 dias por
injeção em dose letal de tiopental sódico intraperitoneal. Em fluxo laminar, foi feita a
exposição do peritônio seguida da administração de solução salina estéril e
apirogênica. Após 30 segundos de massagem abdominal, o lavado peritoneal foi
recuperado. As células do lavado peritoneal foram centrifugadas a 405 x g a 4°C por
5 minutos, contadas em hemocitômetro e posteriormente utilizadas para a cultura de
macrófagos.
Materiais e Métodos 39
3.14 CULTURA DE MACRÓFAGOS
Foram incubadas 1,0 x 106 células/mL em placas de 24 poços (1000 µL em
cada poço) durante 3 horas a 37°C e 5% CO2. A seguir, as células não aderentes
foram descartadas, o meio trocado e cCTH ou heparina, foram adicionados ao meio
de cultura em concentrações de 0,1; 1; 10; 100 μg/mL. A seguir, as células foram
novamente incubadas durante 48 horas. Após esse período, os sobrenadantes
foram retirados para análises posteriores.
3.15 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO
A produção de óxido nítrico foi mensurada através da concentração de nitrato
(com ou sem nitrito) presente no sobrenadante do meio de cultura utilizando
Reagente de Griess. A absorbância foi medida utilizando um espectrofotômetro
(leitor de microplaca) com um filtro de 540 nm. Os resultados foram expressos em
μM de NO3, baseado em curva padrão de NaNO3 de concentrações conhecidas.
3.16 DOSAGEM DE CITOCINAS (IL-1Β E TNF-Α)
Os níveis de IL-1β e TNF-α foram medidos a partir do meio de cultura obtido
após o estímulo das células aderentes, utilizando kits de ELISA, seguindo protocolo
fornecido pelo fabricante.
3.17 TESTE DE INIBIÇÃO DA ELASTASE
Para determinação da atividade anti-elastática de neutrófilos, foi utilizada uma
placa de 96 poços. Inicialmente, 5µL da elastase leucocitária (0,2 µM) obtida
comercialmente foi pré-incubada com PBS 0,1 M, pH 7,4 e 25 µL de Composto Tipo
Heparina ou heparina em diferentes concentrações (5, 20, 50 e 100 nM) por 10
minutos. A reação foi iniciada após adição de 25 µL do substrato Meo-SucAAPvp (5
mM). O tempo de reação do ensaio foi de 1 hora, a temperatura de 37°C. A reação
Materiais e Métodos 40
foi interrompida com adição de 30 µL de solução de ácido acético 30%. Os produtos
de reação foram lidos a 405 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata. A
quantidade de PBS pipetado em cada poço foi o suficiente para atingir o volume final
de 200 µL.
3.18 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a peritonite e tempo de tromboplastina parcial ativada, os resultados
menos dispersos entre si foram escolhidos para cada grupo. Os resultados foram
expressos como média ± DP e analisados utilizando-se a análise de variância
(ANOVA). A diferença entre grupos foi realizada pelo pós-teste de Tukey-Kramer.
Para as dosagens de óxido nítrico e citocinas, como para o teste de inibição da
elastase, os resultados foram expressos como média ± DP e analisados utilizando o
Teste t bicaudal não pareado confrontando os grupos tratados com o grupo não
tratado. O nível de significância atribuído em todos os testes foi de 5% e os dados
foram analisados utilizando-se o software GraphPad InStat (versão 3.05; GraphPad
Software Inc.).
Resultados 41
4 RESULTADOS
4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGS DO CARANGUEJO Goniopsis
cruentata
Após extração e purificação dos glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no
caranguejo Goniopsis cruentata, as frações obtidas foram analisadas por
eletroforeses em gel de agarose em tampão PDA (Figura 9).
As frações 1M de NaCl (1MI e 1MII) apresentaram compostos de migração
semelhantes ao condroitim sulfato. Já as frações 3M de NaCl (3MI e II)
apresentaram predominantemente compostos semelhantes a heparina/heparam
sulfato e dermatam sulfato. Por esse motivo, e por possuírem constituição
semelhante, essas frações foram reunidas e utilizadas nas etapas posteriores do
processo de purificação.
As frações reunidas foram submetidas ao fracionamento com volumes
crescentes de acetona, como descrito na metodologia. A composição das frações foi
Figura 9. Comportamento eletroforético no sistema de tampão PDA das frações obtidas da
cromatografia de troca iônica (Lewatit). Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo positivo,
respectivamente; (P)- Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (1MI, 1MII, 3MI, 3MII) – Frações após eluição com Cloreto de Sódio (NaCl).
CS
OR
DS
HS
P Hep 1MI 1MII 3MI 3MII
(+)
Resultados 42
novamente analisada por eletroforeses em gel de agarose em dois sistemas de
tampões (Figuras 10 e 11).
No sistema de tampão 1,3-diaminopropano-acetato (PDA) (Figura 10), as
frações 0,6v e 0,7v apresentaram uma banda metacromática de migração
eletroforética intermediária entre dermatam sulfato e heparina/heparam sulfato,
semelhante ao perfil descrito por Andrade e colaboradores (2013).
Entretanto, no sistema descontínuo acetato de bário/ 1,3-diaminopropano-
acetato (Ba-PDA) (Figura 11), apenas a fração 0,6v apresentou uma banda
metacromática semelhante a fração de migração rápida da heparina/heparam
sulfato, descrita em Andrade e colaboradores (2013). A fração 0,7v, apresentou um
perfil de duas bandas metacromáticas, uma semelhante ao heparam sulfato e outra,
sendo a mais predominante, intermediária entre dermatam sulfato e heparam
sulfato. Por isso, apenas a fração 0,6V foi usada para caracterização estrutural e
ensaios posteriores.
Figura 10. Comportamento eletroforético no sistema PDA das frações após fracionamento com
volumes crescentes de acetona. Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo positivo, respectivamente; (P)-
Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (0,5v -2,0v) – Frações obtidas após fracionamento com concentrações crescentes de acetona.
0,6v 2,0v
CS
OR
DS
HS
P Hep 0,5v 0,7v 0,8v 1,0v
(+)
Resultados 43
4.2 MASSA MOLECULAR E ANÁLISES QUÍMICAS
A massa molecular do composto da fração 0,6v de acetona obtido nesse
estudo foi determinada e comparada com a massa do composto tipo heparina
descrito por Andrade e colaboradores (2013). Dessa forma, o Composto Tipo
Heparina apresentou massa molecular média de aproximadamente 17 kDa (Tabela
1). Esse valor é muito semelhante ao encontrado para o composto extraído do
Goniopsis cruentata por Andrade e colaboradores (2013) e semelhante ao valor
descrito para heparinas não fracionadas (12-16kDa) (DIETRICH et al., 1985),
entretanto menor do que os observados para heparam sulfatos (DIETRICH &
NADER, 1974) (Tabela 1).
Figura 11. Comportamento eletroforético no sistema descontínuo Ba-PDA das frações após
fracionamento com volumes crescentes de acetona. Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo
positivo, respectivamente; (P)- Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (0,5v -2,0v) – Frações obtidas após fracionamento com concentrações crescentes de acetona.
F
S
I Hep
0,6v 2,0v
CS
OR
DS
HS
P Hep 0,5v 0,7v 0,8v 1,0v
(+)
Resultados 44
4.3 DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA
A mistura das enzimas heparinases I, II e III de Flavobacterium heparinum
foram empregadas na caracterização estrutural do composto obtido do caranguejo
Goniopsis cruentata. Os dissacarídeos resultantes da degradação estão mostrados
na Tabela 2. O composto do caranguejo apresentou uma proporção de 12% do
dissacarídeo trissulfatado [∆UA(2S)-GlcNS(6S)] , alto teor de dissacarídeos N-
sulfatados e 0,5% do dissacarídeo N-acetilado (∆UA-GlcNac). Essas características
estruturais normalmente encontradas na estrutura de heparinas de mamíferos e
semelhantes aos descritos por Andrade e colaboradores (2013) fizeram com que o
composto em estudo fosse identificado como o mesmo composto tipo heparina
previamente descrito. Devido a essas semelhanças, o Composto Tipo Heparina
obtido no presente estudo compartilhou da denominação cCTH do composto
relatado por Andrade e colaboradores (2013).
Compostos MM média (KDa)
cCTH ~17
Hepa 12,0-16,0
HSb 25,0
MM, massa molecular; cCTH, Composto Tipo Heparina do Goniopsis cruentata; HS, heparam sulfato; Hep, heparina de pulmão bovino.
aDietrich et al., 1985.
bDietrich & Nader, 1974.
TTabela 1. Massa molecular média do Composto Tipo Heparina do Goniopsis
cruentata, heparina e heparam sulfato de mamíferos.
Resultados 45
Dissacarídeos Porcentagem (%)
cCTH Hepn a Hep HS
∆UA-Nac 0,5 ≤1 3,42 45,77
∆UA-NS 46 45,9 2,75 17,03
∆UA-Nac(6S) 8 8,1 3,71 11,08
∆UA(2S)-Nac 7,5 7,5 2,20 3,89
∆UA-NS(6S) 5 5,1 9,25 7,19
∆UA(2S)-NS 18 18 8,10 8,79
∆UA(2S)-Nac(6S) 3 3 1,51 ND
∆UA(2S)-NS(6S) 12 12 69,06 6,23
4.4 EFEITO DO cCTH EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Gonipsis cruentata SOBRE A
INIBIÇÃO DO INFLUXO DE CÉLULAS EM MODELO DE PERITONITE AGUDA
Contagem Total e Diferencial de Leucócitos no Líquido Peritoneal
Os valores do infiltrado de leucócitos para a cavidade peritoneal nos
diferentes tempos foram obtidos em relação ao grupo tioglicolato, subtraindo os
valores do grupo salina de todos os grupos. Dessa forma, o controle positivo (grupo
tioglicolato) foi considerado como 100% de infiltração e o negativo (grupo salina) 0%
(Figura 12). A diferença entre os grupos controles nos dois tempos testados foi
significativa (p < 0,001), evidenciando intensa infiltração celular na cavidade
peritoneal.
No tempo de 3 horas, o pré-tratamento dos animais com heparina em todas
as doses testadas ocasionou redução significativa no influxo de células para a
cavidade peritoneal, quando comparada ao grupo tioglicolato, não apresentando
diferença estatística significativa com relação ao grupo salina e ao grupo tratado
com diclofenaco – anti-inflamatório usado na prática clínica (Figura 12). De fato, as
doses de heparina e diclofenaco apresentaram uma porcentagem de inibição na
Tabela 2. Composição relativa dos dissacarídeos presentes no cCTH extraído do Goniopsis cruentata em comparação com outros compostos.
ND – não detectado; cCTH – composto extraído do Goniopsis cruentata; Hep - Heparina de mucosa suína; HS - Heparam Sulfato de pâncreas bovino. a composto extraído do Goniopsis cruentata por Andrade e colaboradores (2013).
Resultados 46
contagem total de mais de 90% quando comparadas ao grupo tioglicolato (Tabela 3).
Para os grupos tratados com o cCTH, todas as doses testadas também reduziram
significativamente o influxo de células em relação ao grupo tioglicolato (p < 0,001),
entretanto apenas as doses de 1 e 10µg/Kg apresentaram o mesmo efeito de
redução na migração das células obtidas para a heparina e diclofenaco (Figura 12),
com um percentual de inibição de mais de 50% para ambas as doses (Tabela 3).
Ao extrapolarmos para camundongos a dosagem de heparina utilizada na
circulação extracorpórea em humanos, foi observado, no grupo tratado com
heparina, hemólise em todos os animais não sendo possível a contagem do número
total e diferencial de leucócitos do líquido peritoneal (dados não mostrados). Já o
grupo tratado com o cCTH, na mesma dose, apresentou efeito na redução do influxo
de células para a cavidade peritoneal, sem diferença estatística significativa com
relação ao grupo tratado com diclofenaco e ao controle negativo (Figura 12),
apresentando uma porcentagem de inibição de 50,49%.
Em 6 horas, o grupo diclofenaco manteve o mesmo efeito na redução do
influxo de células para a cavidade peritoneal apresentado em 3 horas quando
comparado ao grupo tioglicolato (p < 0,001), não apresentando diferença em relação
ao grupo salina (Figura 12), entretanto, o percentual de inibição diminuiu para
55,61% (Tabela 3). Para o pré-tratamento com heparina, a redução do infiltrado
leucocitário para a cavidade peritoneal só foi mantida nas doses de 0,1 e 1µg/Kg,
não apresentando diferença estatística significativa entre o grupo salina e o
diclofenaco, contudo, a porcentagem de inibição diminuiu para 89,84 e 68,28%,
respectivamente (Tabela 3). Para o pré-tratamento com o cCTH, a redução na
inibição do infiltrado foi observada nas doses de 0,01 e 10µg/Kg também não
apresentando diferenças entre os grupos salina e diclofenaco. A dose de 0,01µg/Kg
aumentou a porcentagem de inibição de 31,47 para 58,5%, enquanto que a de
10µg/Kg se manteve aproximadamente igual ao tempo de 3 horas, com 54,14%
(Tabela 3). A dose de 0,1µg/Kg do cCTH diferiu estatisticamente tanto do grupo
tioglicolato quanto do grupo salina. As demais doses não apresentaram diferença
estatística significativa em relação ao grupo tioglicolato (Figura 12).
Resultados 47
INIBIÇÃO DO INFILTRADO LEUCOCITÁRIO PARA CAVIDADE PERITONEAL (%) *
HEPARINA cCTH DICLOFENACO
Doses
3h 6h 3h 6h 3h 6h
CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN
µg/Kg
0,01 92,51 35,02 28,08 41,25 31,47 12,68 58,5 16,14 .. .. .. .. 0,1 99,5 57,84 89,84 46,22 23,88 3,01 40,53 12,82 .. .. .. .. 1 99,64 61,65 68,28 84,13 50,99 37,56 36,94 4,53 .. .. .. .. 10 90,5 28,37 14,99 40,77 55,72 43,58 54,14 54,28 .. .. .. ..
mg/Kg 1,07 .. .. .. .. .. .. .. .. 98,92 55,94 55,61 90,52
3 .. .. .. .. 50,49 36,93 .. .. .. .. .. ..
*diminuição da migração de leucócitos totais e de polimorfonucleares em relação ao grupo tioglicolato (+). Doses de 1,07 mg/Kg e 3 mg/Kg (humanos) extrapoladas para 7 mg/Kg e 20 mg/Kg (animais), respectivamente. CT: contagem total de leucócitos; PMN: polimorfonucleares.
Tabela 3. Porcentagem de inibição do infiltrado leucocitário da contagem total e de polimorfonucleares para cavidade peritoneal nos diferentes tempos.
Figura 12. Porcentagem do infiltrado leucocitário para a cavidade peritoneal em 3 e 6 horas. Cada coluna representa a porcentagem média de inibição em relação ao grupo tioglicolato ± DP em grupos de seis animais. Os valores médios das porcentagens indicados com letras diferentes são estatisticamente diferentes de acordo com ANOVA (p < 0,0001). Doses de 1,07 mg/Kg e 3 mg/Kg (humanos) extrapoladas para 7 mg/Kg e 20 mg/Kg (animais), respectivamente.
Resultados 48
Os principais leucócitos observados na contagem diferencial foram neutrófilos
e eosinófilos. Não foram obtidos valores significativos de basófilos, dessa forma, não
foram contabilizados nos polimorfonucleares. Os valores para inibição do influxo de
polimorfonucleares (PMN) para a cavidade peritoneal também foram obtidos em
relação ao grupo tioglicolato, subtraindo o grupo salina (Tabela 3). Entre os grupos
tratados, houve um aumento da porcentagem de inibição de 3 para 6 horas na
maioria das doses, em 3 horas houve uma diminuição média de aproximadamente
37% e em 6 horas, 43% (Tabela 3). A doses de 1µg/Kg de heparina e 10µg/Kg de
cCTH foram as únicas capazes de manter a redução da migração de leucócitos para
a cavidade peritoneal e aumentar a porcentagem de inibição de PMN nos dois
tempos estudados (Figura 12 e Tabela 3).
Resultados 49
4.5 AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DOS COMPOSTOS NO
MODELO DE PERITONITE AGUDA.
No intuito de monitorar os compostos na circulação sistêmica dos animais
durante o modelo de peritonite aguda, foi realizado o ensaio do Tempo de
tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) do plasma citratado dos animais. No tempo de
três horas, somente as doses extrapoladas de heparina e do cCTH (ambas, 3mg/Kg)
apresentaram diferença estatística extremamente significativa (p < 0,001) em
relação a todos os grupos (Figura 13a).
No tempo de seis horas, apenas a dose de 10µg/Kg de heparina e do cCTH
apresentaram diferença estatística significativa (p < 0,05) em relação ao controle
negativo (salina). As demais doses não apresentaram diferença estatística entre si
(Figura 13b).
Figura 13. Biodisponibilidade sistêmica dos compostos dos animais submetidos à peritonite com indução da inflamação de três (a) e seis horas (b). Cada coluna representa os valores expressos como a média do tempo em segundos ± DP em grupos de seis animais (n=6). Os valores médios de tempos que não compartilham letras iguais são estatisticamente diferentes de acordo com ANOVA (p < 0,0001). Doses de 1,07 e 3mg/Kg (humanos) extrapolada para 7 e 20mg/Kg (animais).
b a
Resultados 50
4.6 EFEITO DO cCTH NA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E CITOCINAS POR
MACRÓFAGOS ATIVADOS
Uma vez que após estímulo inflamatório ocorre a ativação de macrófagos e a
liberação de espécies reativas de nitrogênio, como óxido nítrico (NO) e citocinas, tais
como IL-1β e TNF-α, a ocorrência de um efeito anti-inflamatório suscita a ideia de
verificar a ação dos compostos na produção desses compostos. No intuito de se
avaliar um possível mecanismo, o efeito do cCTH e Hep foram observados após
incubação por 48 horas.
4.6.1 Dosagem de Óxido Nítrico
A adição cCTH e Hep aos macrófagos ativados inibiu a produção basal de
NO. Nas concentrações de 10 e 100µg/mL de Hep e 0,1 e 100µg/mL do cCTH, as
concentrações reduziram totalmente a produção de NO, não sendo possível a
detecção pelo método de dosagem utilizado. Exceto a concentração de 0,1µg/mL de
Hep, as demais concentrações tanto de Hep quanto do cCTH, apresentaram
diferença em relação ao grupo não tratado (Figura 14).
Figura 14. Efeito do cCTH e heparina na produção de NO por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (Controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs
controle (n=3). ***p<0,001 e *p<0,05.
Resultados 51
4.6.2 Dosagem de IL-1β e TNF-α
O cCTH e Hep não foram capazes de inibir ou ativar a produção de IL-1β em
todas as concentrações testadas, não apresentando diferença em relação ao grupo
não tratado. Somente o grupo de LPS (controle positivo) apresentou diferença em
relação ao grupo não tratado (Figura 15).
Entretanto, os compostos apresentaram efeito na produção de TNF-α. A Hep
diminuiu a produção de basal de TNF-α somente na concentração de 1µg/mL, já o
cCTH foi capaz de inibir nas concentrações mais baixas de 0,1 e 1µg/mL. As
concentrações mais altas (10 e 100µg/mL) do cCTH promoveram um aumento da
concentração de TNF-α. As demais concentrações não apresentaram diferença em
relação ao grupo não tratado (Figura 16).
Figura 15. Efeito do cCTH e heparina na produção de IL-1β por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs
controle (n=3). ***p<0,001.
Resultados 52
4.7 EFEITO DO cCTH DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata SOBRE A INIBIÇÃO
DA ELASTASE NEUTROFÍLICA in vitro
Como a quimiotaxia de leucócitos, função importante para a inflamação,
ocorre através de diversos tecidos vasculares com a liberação de diversos
componentes, entre eles a enzima de neutrófilos elastase, é interessante verificar a
atuação do composto nessa enzima utilizando ensaio in vitro descrito na
metodologia. A heparina foi capaz de inibir a ação da elastase em todas as
concentrações testadas, exceto na concentração de 20nM, não apresentando
diferença em relação ao grupo controle. Já o cCTH foi capaz de inibir a elastase nas
concentrações de 5nM e 20nM (p<0,01 e p< 0,05, respectivamente), apresentando
uma porcentagem de inibição maior que a apresentada pela heparina nas mesmas
Figura 16. Efeito do cCTH e heparina na produção de TNF-α por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs
controle (n=3). ***p<0,001 e *p<0,05.
Resultados 53
concentrações. As concentrações mais altas do cCTH promoveram a atuação da
elastase, entretanto somente a concentração de 100nM apresentou diferença
estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05) (Figura 17).
Figura 17. Efeito do cCTH e heparina na inibição da elastase neutrofílica in vitro. Controle Positivo (+) Os valores são expressos como a porcentagem média ± desvio padrão vs controle (n=3). **p<0,01 e *p<0,05.
Discussão 54
5 DISCUSSÃO
A variedade de organismos invertebrados aquáticos representa uma grande
fonte para obtenção ou desenvolvimento de moléculas com amplo potencial
terapêutico, devido principalmente à diversidade estrutural de compostos presentes
nesses animais, como, por exemplo, GAGs sulfatados (MEDEIROS et al., 2000).
GAGs de invertebrados aquáticos apresentaram efeitos na coagulação e hemostasia
diminuídos em relação à heparina comercial, como foram observados nos
crustáceos Penaeus brasiliensis, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus schimitti,
Ucides cordatus (BRITO et al., 2008; SANTOS, 2006; DIETRICH et al., 1999;
MEDEIROS et al., 2000), incluindo também o caranguejo Goniopsis cruentata
(ANDRADE et al., 2013). Por esse motivo, no presente trabalho foi avaliado o efeito
anti-inflamatório in vivo do composto tipo heparina isolado do caranguejo Goniopsis
cruentata (cCTH). Para isso, o cCTH foi obtido utilizando a mesma metodologia
descrita em Andrade e colaboradores, 2013. Também foi necessário analisar alguns
aspectos estruturais, como também a atuação em ensaios in vitro relacionados a
eventos inflamatórios. O cCTH obtido nesse estudo mostrou o mesmo padrão de
migração eletroforética no sistema de tampão PDA descrito em Andrade e
colaboradores (2013). Por apresentar uma banda única e intermediária ao dermatam
e heparina/heparam sulfato de mamíferos, Andrade e colaboradores (2013)
mostraram que o cCTH possui um grau de sulfatação diferente daqueles descritos
para heparam sulfato e heparina isolados e caracterizados de tecidos de
vertebrados e invertebrados (DIETRICH, NADER E STRAUS, 1983; DIETRICH et
al., 1989; NADER & DIETRICH, 1989; FERREIRA et al., 1993; TERSARIOL et al.,
1994). Entretanto, no sistema de tampão Ba/PDA, no qual a heparina de mamíferos
é fracionada em seus componentes de migração rápida, intermediária e lenta,
observa-se a predominância de uma banda metacromática com perfil de migração
semelhante ao componente de migração rápida da heparina, indicando que o cCTH
é composto principalmente por dissacarídeos dissulfatados (ANDRADE et al., 2013;
VOLPI, 1993). Esse comportamento eletroforético semelhante ao componente de
migração rápida da heparina foi observado também nas heparinas de baixo peso
molecular isoladas do camarão Penaeus brasilienses (DIETRICH et al., 1999),
Litopenaeus vannamei (BRITO et al., 2008), Penaeus schimit (SANTOS, 2006), na
Discussão 55
lagosta Panulirus laevicauda (SILVA, 2003) e no microcrustáceo Artemia franciscana
(CHAVANTE et al., 2000).
O padrão de sulfatação é considerado um parâmetro importante para a
caracterização estrutural dos glicosaminoglicanos. Por esse motivo, enzimas
específicas que atuam em dissacarídeos com teor de sulfatação característicos são
utilizadas para caracterizar tais polímeros. Heparinases são enzimas comumente
utilizadas para avaliar a composição dissacarídica de compostos tipo
heparina/heparam sulfato. Cada enzima atua em regiões específicas e geram
dissacarídeos com padrão de sulfatação definidos. A heparinase I identifica resíduos
contendo ácido α-L-idurônico obrigatoriamente sulfatado na posição C-2 e
glucosamina N-sulfatada, liberando dissacarídeo trissulfatado (UA-2S, GlcNS,6S) e
o tetrassacarídeo pentassulfatado (SILVA & DIETRICH, 1975; NADER et al. 1999b;
DESAI, WANG & LINHARDT, 1993b; DIETRICH, SILVA & MICHELACCI, 1973). A
heparinase III é específica para ligações glicosídicas do tipo α(14) entre o resíduo
de D-glucosamina (N-acetilada ou N-sulfatada) — que não apresenta sulfatação em
C-6 — e ácido D-glucurônico (SILVA & DIETRICH, 1974; DESAI, WANG,
LINHARDT, 1993a; NADER et al., 1999b). A heparinase II atua nas ligações do tipo
α(14) entre D-glucosamina (N-acetilada ou N-sulfatada) preferencialmente
sulfatada na posição C-6, e ácido α-L-idurônico ou α-D-glucurônico, mas não age
nas sequências contendo α-D-glucurônico ligado a glucosamina N-acetilada ou α-L-
idurônico 2-sulfatado ligado a glucosamina N,6-dissulfatada. Entretanto, sabe-se
que o uso das enzimas individualmente gera muitos oligossacarídeos. Por isso, uma
mistura das três enzimas foi usada para determinar a composição dissacarídica total
do composto em estudo. Embora apresente alto grau de N-sulfatação e
insignificante teor de dissacarídeos N-acetilados, a composição dissacarídica do
cCTH difere da estrutura da heparina, onde aproximadamente 80% dos
dissacarídeos são ∆UA,2S-GlcNS,6S, tão bem como para heparam sulfatos que
apresentam 50-60% de dissacarídeos ∆UA-GlcNAc/∆UA-GlcNS (DIETRICH et al.,
1998; DESAI, WANG, LINHARDT, 1993a). Entretanto, o cCTH apresentou
proporção 24 vezes maior de dissacarídeos trissulfatados em relação a
dissacarídeos N-acetilados (Tabela 02). Essa relação entre dissacarídeos evidencia
que o cCTH compartilha mais características com a heparina do que com o
heparam sulfato.
Discussão 56
A presença concomitante e em proporções diferenciadas de dissacarídeos
normalmente encontrados no heparam sulfato e na heparina também foi observada
em outras espécies de caranguejos, como o Ucides cordatus e Chaceon fenneri
(MEDEIROS et al., 2000). Essas mesmas características estruturais foram
encontradas por Andrade e colaboradores (2013) em compostos também extraídos
do caranguejo Goniopsis cruentata. Tal fato é um indicativo de que o cCTH possa
se tratar do mesmo composto obtido por Andrade e colaboradores (2013), visto que
os dois trabalhos utilizam o mesmo caranguejo como objeto de estudo. Além disso,
o peso molecular dos compostos obtidos em ambos os trabalhos foi uma média de
17KDa, assim, podemos concluir que se tratam da mesma molécula extraída do
Goniopsis cruentata.
As características estruturais presentes no cCTH podem estar relacionadas a
seus efeitos menos pronunciados quando comparados à heparina de mamíferos,
como observado por Andrade e colaboradores (2013). A baixa atividade
anticoagulante in vitro, o potente efeito antitrombótico e menor efeito
antihemostático in vivo possibilitaram sua utilização como modelo de pesquisa para
possíveis efeitos sobre a resposta inflamatória. Um parâmetro utilizado para
investigar as propriedades anti-inflamatórias do cCTH foi a avaliação de sua
capacidade de interferir na migração leucocitária em um modelo experimental de
peritonite aguda induzida por tioglicolato de sódio em dois tempos de 3 e 6 horas.
Em estudo prévio realizado em nosso laboratório, utilizando esse modelo em ratos,
foi demonstrado que um composto extraído do camarão Litopenaeus vannamei
reduziu a infiltração leucocitária à cavidade peritoneal após 3 horas de indução da
inflamação (BRITO et al., 2008). Utilizando o mesmo modelo em camundongos, em
3 horas, foi demonstrado que a administração do cCTH, 30 minutos antes da
indução da inflamação, foi capaz de reduzir o influxo de leucócitos para a cavidade
peritoneal nas doses a partir de 1µg/Kg. Já a heparina de mamíferos foi capaz de
reduzir a migração em todas as doses testadas, exceto a dose de 3mg/Kg de
heparina (extrapolada para 20mg/Kg nos animais) que causou sangramento na
cavidade peritoneal de todos os animais testados não sendo possível a contagem
total nem diferencial dos leucócitos peritoneais, como citado anteriormente. A
mesma dose utilizada do cCTH, além de não ocasionar sangramento, reduziu
significativamente o influxo de células para a cavidade peritoneal, sendo semelhante
ao grupo salina (não tratado) e ao grupo tratado com diclofenaco.
Discussão 57
O tempo de 6 horas utilizado foi baseado em trabalhos que demonstram a
ocorrência de aumento no número de neutrófilos na cavidade peritoneal de
camundongos em modelos de peritonite em 6 horas (ZHANG et al. 1992; ALCAMO
et al., 2001). No experimento de 6 horas, o cCTH e a heparina assumem padrões
não monotônicos em seus resultados. A esse padrão não monotônico, dar-se o
nome de “efeito hormesis” ou “hormese”, um tipo específico de dose-resposta cuja
ocorrência tem sido documentada através de uma vasta gama de modelos
biológicos (COOK & CALABRESE, 2006). Refere-se a uma dose-resposta bifásica
(MATTSON, 2008) caracterizada por uma estimulação modesta em doses baixas e
uma inibição em doses altas (CALABRESE & BALDWIN, 2003) que pode resultar na
forma de “U invertido” ou “U”. Os resultados em 6 horas da contagem total de
leucócitos da cavidade peritoneal mostram que a heparina reduziu a migração
leucocitária nas doses de 0,1 e 1µg/Kg, mantendo o resultado obtido para 3 horas,
enquanto que a menor (0,01µg/Kg) e a maior (10µg/Kg) dose não apresentaram tal
efeito, apresentando um padrão de “U” invertido. Já o cCTH apresentou efeito na
redução da migração leucocitária nas doses de 0,01 e 10µg/Kg, não tendo resultado
significativo nas demais doses (0,1 e 1µg/Kg), formando um padrão de “U”. Essa
estimulação em doses baixas é observada algumas vezes após uma resposta inicial
inibitória, parecendo representar uma modesta compensação na ruptura da
homeostase (CALABRESE & BALDWIN, 2003). Tal fenômeno pode representar o
fato da dose de 0,01µg/Kg do cCTH não ter apresentado inibição da migração
leucocitária em 3 horas, mas sim em 6 horas.
As doses do cCTH que apresentaram efeito na redução da migração
leucocitária apresentaram o mesmo comportamento observado para o diclofenaco
de sódio, anti-inflamatório da classe dos AINEs (anti-inflamatórios não esteroidais)
utilizados comercialmente (FILHO et al., 2006) e presente na lista de fármacos de
referência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Entretanto esse
efeito do cCTH foi alcançado com doses de 700 até 700.000 vezes menores do que
a dose terapêutica utilizada para o diclofenaco. Apesar dos AINEs serem largamente
utilizados na prática clínica, eles possuem efeitos colaterais importantes como
toxicidade renal e hepática (VANE & BOTTING, 1998; SALLUSTIO & HOLBROOK,
2001; BRICKS & SILVA, 2005), justificando a busca por compostos que apresentem
capacidade anti-inflamatória, mas não tais efeitos nocivos, como o cCTH.
Discussão 58
Em 3 e 6 horas, a contagem diferencial de leucócitos no líquido peritoneal
apresentou, para os grupos tratados com tioglicolato, uma porcentagem mais
elevada de polimorfonucleares em relação ao grupo salina, sendo os neutrófilos as
células em maior número encontradas nos dois tempos estudados (dados não
mostrados). Em relação ao grupo tioglicolato, a maioria dos grupos tratados que
apresentaram inibição do influxo de células para a cavidade peritoneal na contagem
total, também reduziram a porcentagem de polimorfonucleares na contagem
diferencial. Em praticamente todos os grupos tratados, a porcentagem de
polimorfonucleares diminuiu entre os tempos de 3 e 6 horas. Essa diferenciação e
proliferação dos leucócitos podem ser reguladas por diversos fatores, entre eles
citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF) e a interleucina 1 (IL-1). Estímulos
inflamatórios liberam TNF e IL-1 (citocinas pró-inflamatórias), os quais estimulam
células do estroma na medula óssea à produção de fatores de crescimento, como os
fatores estimuladores de colônias granulocíticas (G-CSF) e macrofágica-
granulocítica (GM-CSF) (DANIS et al., 1991), consequentemente, promovendo a
formação de polimorfonucleares e macrófagos. Assim, a presença dessas citocinas
poderia explicar o fato dos grupos tratados com tioglicolato apresentarem diferenças
na contagem diferencial em relação ao grupo salina. Nos grupos tratados, a
diminuição na quantidade de polimorfonucleares em relação ao grupo tioglicolato,
principalmente observada no tempo de 3 horas para as doses de 1µg/Kg de
heparina e 3mg/Kg do cCTH, poderia ocorrer devido à inibição dessas citocinas.
Como observado, o cCTH e a Hep foram capazes de interferir somente na produção
de TNF-α. De fato, foi observado que TNF possui afinidade pela heparina (LANTZ et
al., 1991) e, além disso, dissacarídeos sulfatados de heparina foram capazes de
inibir a produção de TNF-α em macrófagos de camundongos (CAHALON et al.,
1997), dessa forma, é possível que o cCTH possa atuar na proliferação de
polimorfonucleares através da inibição dessas citocinas pró-inflamatórias. Os efeitos
fisiológicos da IL-1 são essencialmente idênticos aos do TNF-α, entretanto a IL-1
isolada não é capaz de provocar lesão tecidual ou a morte celular por apoptose, e,
além disso, pode potencializar os efeitos do TNF-α (SHERWOOD & TOLIVER-
KINSKY, 2004). Dessa forma, o fato do cCTH não interferir na produção dessa
citocina pode estar associado a diminuição da resposta inflamatória observada.
Além disso, o efeito anti-migratório nesse estudo pode também ocorrer
através de interferência nos mecanismos de recrutamento leucocitário, como, por
Discussão 59
exemplo, a inibição da enzima elastase liberada por neutrófilos ativados. A elastase
é uma proteinase presente nos grânulos de neutrófilos com atividade microbicida e
com capacidade de degradar diversos componentes da matriz extracelular, tais
como a elastina ou o colágeno tipo IV (FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003). Já
foi demonstrado que heparina e heparina de baixo peso molecular inibem a
degranulação neutrofílica por mecanismos dependentes de sulfatação (BROWN et
al., 2003; 2012), dessa forma a presença de dissacarídeos N-sulfatados e
dissulfatados do cCTH poderiam interagir e inibir a elastase, dificultando o processo
de quimiotaxia neutrofílica durante o estímulo inflamatório. Tal fato foi observado nas
concentrações mais baixas testadas para o cCTH, assim, o composto extraído do
Goniopsis cruentata poderia atuar na redução da migração leucocitária através
desse mecanismo de inibição.
Nesse estudo foi demonstrado que o cCTH possui efeito na inibição de NO,
assim como a heparina. Foi observado por Dandona e colaboradores (1999), que a
heparina possui efeito inibitório na geração de ROS pelos leucócitos. Algumas das
ROS se ligam ao NO (MONCADA & HIGGS, 1993), para formar peroxinitrato, que é
toxico e não um vasodilatador como o NO (SZABO et al., 1996), dessa forma, uma
redução na formação de ROS pela heparina permitiria uma grande
biodisponibilidade de NO para vasodilatação. O aumento da biodisponibilidade de
NO pode possuir um efeito adicional na inibição da adesão leucocitária ao endotélio,
inibindo também a inflamação (DE CATERINA et al., 1995).
No intuito de monitorar os compostos na circulação sistêmica dos animais
durante o modelo de peritonite aguda, foi realizado o ensaio do Tempo de
tromboplastina Parcial ativada (TTPa) do plasma citratado. No tempo de 3 horas, o
cCTH na dose de 3mg/kg aumentou o tempo de coagulação em aproximadamente
60% em relação aos grupos controles. A mesma dose de heparina ultrapassou o
tempo máximo de detecção avaliado pelo coagulômetro (>240 segundos),
aumentando o tempo de coagulação em relação aos controles em aproximadamente
600%, não permitindo a coagulação das amostras e promovendo o sangramento
excessivo que impossibilitou a contagem de leucócitos da cavidade peritoneal desse
grupo citado anteriormente. Alguns aspectos estruturais observados para o cCTH,
como a ocorrência de um peculiar ácido glucurônico 2-sulfatado e predominância de
dissacarídeos dissulfatados, podem estar relacionados com a sua reduzida atividade
anticoagulante em relação à heparina no teste de TTPa.
Discussão 60
Quanto mais se conhece a biodiversidade aquática, maior a probabilidade da
descoberta de novas substâncias com potenciais farmacológicos e diante disso, o
conhecimento dos mecanismos de atuação desses compostos se faz necessário,
por isso, esse trabalho fornece uma base para os conhecimentos a respeito dessas
moléculas e seus possíveis alvos envolvidos em sua ação anti-inflamatória. O cCTH,
por apresentar efeitos na coagulação diminuídos, pode servir como um modelo para
estudar os requerimentos estruturais necessários para interferir na resposta
inflamatória.
Conclusão 61
6 CONCLUSÃO
O cCTH obtido do caranguejo Goniopsis cruentata apresentou alto teor de N-
sulfatação e dissacarídeos dissulfatados, estruturas observadas em outros
compostos extraídos de invertebrados aquáticos, sendo similar ao composto
extraído por Andrade e colaboradores (2013);
O cCTH apresentou efeito na redução do influxo de células para a cavidade
peritoneal nos tempos de 3 e 6 horas de forma semelhante a heparina, mas
não apresentou efeito anticoagulante significativo em doses elevadas;
Em relação a um provável mecanismo anti-inflamatório, o cCTH foi capaz de
interferir na produção de TNF-α e NO, mas não de IL-1β por macrófagos
ativados e ainda inibiu a atuação da enzima elastase, liberada por neutrófilos,
em concentrações mais baixas do que a heparina de mucosa suína em
ensaio in vitro;
Por apresentar efeitos na coagulação e hemostasia reduzidos, o cCTH pode
atuar como modelo de estudo para possíveis compostos anti-inflamatórios.
Referências 62
7 REFERÊNCIAS
ALCAMO, E.; MIZGERD, J.P.; HORWITZ, B.H.; BRONSON, R.; BEG, A.A.; SCOTT,
M.; DOERSCHUK, C.M.; HYNES, R.O.; BALTIMORE, D. Targeted Mutation of TNF
Receptor I Rescues the RelA-Deficient Mouse and Reveals a Critical Role for NF- kB
in Leukocyte Recruitment. J Immunol. 167: 1592-1600, 2001.
ALSAYEGH, F.; AL-RASHEED, M.; AL-MUHAINI, A.; AL-HUMOUD, E.; AL-OSTAZ,
M.; MOUSA, S.A. Heparin Anticoagulation Responsiveness in a Coronary Care Unit:
A Prospective Observational Study. Cardiovasc Ther. 27: 77–82; 2009.
AMARA, U.; RITTIRSCH, D.; FLIERL, M.; BRUCKNER, U.; KLOS, A.; GEBHARD,
F.; LAMBRIS, J.D.; HUBER-LANG, M.; LAMBRIS, J.D. Interaction Between the
Coagulation and Complement System. Adv Exp Med Biol. 632: 71–79, 2008.
ANDRADE, G.P.V.; LIMA, M.A.; DE SOUZA-JUNIOR, A.A.; FAREED, J.;
HOPPENSTEADT, D.A.; SANTOS, E.A.; CHAVANTE, S.F.; OLIVEIRA, F.W.;
ROCHA, H.A.O.; NADER, H.B. A heparin-like compound isolated from a marine crab
rich in glucuronic acid 2-O-sulfate presents low anticoagulant activity. Carbohydrate
Polymers. doi:10.1016/j.carbpol.2013.01.069
BAZZONI, G.; NUNÄ EZ, A.B.; MASCELLANI, G.; BIANCHINI, P.; DEJANA, E.; DEL
MASCHIO, A. Effect of heparin, dermatan sulfate, and related oligoderivatives on
human polymorphonuclear leukocyte functions. J. Lab. Clin. Med. 121(2): 268-275,
1992.
BELTRÁN, A.E.; CONCEPCIÓN, F.; MANZANARES, D.; GARRIDO, G.; GLARIA,
L.A.; ROJAS, A. Heparin and Low Molecular Weight Heparin Decrease Nitric Oxide
Production by Human Polymorphonuclear Cells. Arch Med Res. 30 (2): 116-119,
1999.
BERTEAU, O. & B. MULLOY. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures,
functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes
active toward this class of polysaccharide. Glycobiology. 13(6): 29-40, 2003.
Referências 63
BIANCHINI, P.; NADER, H. B.; TAKAHASHI, H. K.; OSIMA, B., STRAUS, A. H. &
DIETRICH, C. P. Fractionation and identification of heparin and other acidic
mucopolysaccharide by a new discontinuous eletroforetic method. J. Cromatogr.
196: 455-462, 1980.
BOUÇAS, R.I.; SAMPAIO, L.O.; ANDRADE, G.P.V.; LOPES, C.C.; NASCIMENTO,
F.D.; TERSARIOL, I.L.S.; ROCHA, H.A.O.; NADER, H.B. Heparin and heparin
derivatives and their effect on hemostasis. Insights into Carbohydrate Structure
and Biological Function. 2: 25-50, 2006.
BREDDIN, H.K. Low molecular weight heparins in the prevention of deep-vein
thrombosis in general surgery. Semin Thromb Hemost. 25(3): 83-89, 1999.
BRICKS, L. F.; SILVA, C. A. A. Toxicidade dos antiinflamatórios não-hormonais.
Pediatria. 27: 181-193, 2005.
BRITO, A.S.; ARIMATEIA, D.S.; SOUZA, L.R.; LIMA, M.A.; FERREIRA, P.A.; SILVA,
R.A.; VERISSIMA, C.F.; JUSTO, G.Z.; LEITE, E.L.; ANDRADE, G.P.V.; OLIVEIRA,
F.W.; NADER, H.B. & CHAVANTE, S.F. Anti-inflammatory properties of a heparin-
like glycoaminoglycan with reduced anticoagulante activity isolated from a marine
invertebrate. Bioorg Med Chem. 16: 9588-95951, 2008.
BROWN, R.A.; LEUNG, E.; KANKAANRANTA, H.; MOILANEN, E.; PAGE, C.P.
Effects of heparin and related drugs on neutrophil function. Pulmonary
Pharmacology & Therapeutics. 25: 185-192, 2012.
BROWN, R.A.; LEVER, R.; JONES, N.A.; PAGE, C.P. Effects of heparin and related
molecules upon neutrophil aggregation and elastase release in vitro. British Journal
of Pharmacology. 139: 845–853, 2003.
CAHALON, L.; LIDER, O.; SCHOR, H.; AVRON, A.; GILAT, D.; HERSHKOVIZ, R.;
MARGALIT, R.; ESHEL, A.; SHOSEYEV, O.; COHEN, I.R. Heparin disaccharides
inhibit tumor necrosis factor-a production by macrophages and arrest immune
inflammation in rodents. International Immunology. 9 (10): 1517–1522, 1997.
Referências 64
CALABRESE, E.J.; BALDWIN, L.A. Toxicology rethinks its central belief. Nature.
421: 691-692, 2003.
CASSARO, C.M.; DIETRICH, C.P. Distribution of sulfated mucopolysaccharides in
invertebrates. J Biol Chem. 252(7): 2254-2261, 1977.
CHAVANTE, S.F.; SANTOS, E.A.; OLIVEIRA, F.W.; GUERRINI, M.; TORRI, G.;
CASU, B.; DIETRICH, C.P.; NADER, H.B. A novel heparan sulphate with high
degree of N-sulphation and high heparin cofactor-II activity from the brine shrimp
Artemia franciscana. Int J Biol Macromol. 27(1):49-57, 2000.
CHOI, G.; SCHULTZ, M.J.; LEVI, M.; VAN DER POLL, T. The relationship between
inflammation and the coagulation system. Swiss Med Wkly. 136: 139–144, 2006.
COLEMAN, J.W. Nitric oxide in immunity and inflammation. International
Immunopharmacology. 1 (8): 1397–1406, 2001.
COOK, R. & CALABRESE, E.J. The importance of hormesis to public health.
Environ Health Perspect. 114(11): 1631–1635, 2006.
DANDONA, P.; QUTOB, T.; HAMOUDA, W.; BAKRI, F.; ALJADA, A.; KUMBKARNI,
Y. Heparin Inhibits Oxygen Species Generation by Polymorphonuclear and
Mononuclear Leucocytes, Thromb Res. 96 (6): 437-443, 1999.
DANIS, V.A.; FRANIC, G.M.; RATHJEN, D.A.; BROOKS, P.M. Effects of
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-2, interferon-gamma
(IFN-y), tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) and IL-6 on the production of
immunoreactive IL-1 and TNF-a by human monocytes. Clin. exp. Immunol. 85: 143-
150, 1991.
DAY, J.R.S.; LANDIS, R.C.; TAYLOR, K.M. Heparin is much more than just an
anticoagulant. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 18(1): 93-100,
2004.
Referências 65
DE CATERINA, R.; LIBBY, P.; PENG, H.B.; THANNICKAL, V.J.; RAJAVASHISTH,
T.B.; GIMBRONE, M.A. Jr.; SHIN, W.S.; LIAO, J.K. Nitric oxide decreases cytokine-
induced endothelial activation. Nitric oxide selectively reduces endothelial expression
of adhesion molecules and proinflammatory cytokines. J Clin Invest. 96(1): 60–68,
1995.
DELCAUX, C.; DELACOURT, C.; d’ORTHO, M.P.; BOYER, V.; LAFUNA, C.; HARF,
A. Role of gelatinase B and elastase in human polymorphonuclear neutrophil
migration across basement membrane. Am J Respir Cell Mol Biol. 14:288, 1996.
DESAI, U.R.; WANG, H.M. & LINHARDT, R.J. Specificity studies on the heparin
lyases from Flavobacterium heparinum. Biochemistry. 32: 8140–45, 1993a.
DESAI, U.R.; WANG, H.M. & LINHARDT, R.J. Substrate specificity of the heparin
lyases from Flavobacterium heparinum. Arch Biochem Biophys. 306: 461–468,
1993b.
DIETRICH, C.P. & DIETRICH, S.M. Electrophoretic behaviour of acidic
mucopolysaccharides in diamine buffers. Anal. Biochem. 70: 645-7, 1976.
DIETRICH, C.P. & NADER, H.B. Fractionation and properties of four heparitin
sulfates from beef lung tissues. Isolation and characterization of a homogenous
species of heparitin sulfate. Biochim. Biophys. Acta. 343: 34-44, 1974.
DIETRICH, C.P. A model for cell-cell recognition and control of cell growth mediated
by sulfated glycosaminoglycans. Braz. J. Med. Biol. Res. 17: 5-15, 1984.
DIETRICH, C.P.; McDUFFIE, N.M. & SAMPAIO, L.O. Identification of acidic
mucopolysaccharides by agarose gel electrophoresis. J Chromatogr. 30: 299-304,
1977.
DIETRICH, C.P.; NADER, H.B.; de PAIVA, J.F.; TERSARIOL, I.L.S.; SANTOS, E.A.;
HOLME, K.R.; PERLIN, A.S. Heparin in molluscs: chemical, enzymatic degradation
Referências 66
and 13C and 1H n.m.r. spectroscopical evidence for the maintenance of the structure
through evolution. Int. J. Biol. Macromol. 11: 361-6, 1989.
DIETRICH, C.P.; NADER, H.B.; STRAUS, A.H. Structural differences of heparan
sulfates according to the tissue and species of origin. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 111: 865-71, 1983.
DIETRICH, C.P.; PAIVA, J.F.; CASTRO, R.A.B.; CHAVANTE, S.F.; JESKE, W.;
FAREED, J.; GORIN, P.A. J.; MENDES, A.; NADER, H.B. Structural features and
anticoagulant activities of a novel natural low molecular weight heparin from the
shrimp Penaeus brasiliensis. Biochim. Biophys. Acta. 1428: 273-283, 1999.
DIETRICH, C.P.; PAIVA, J.F.; MORAES, C.T.; TAKAHASHI, H.K.; PORCIONATTO,
M.A.; NADER, H.B. Isolation and characterization of a heparin with high
anticoagulant activity from Anomalocardia brasiliana. Biochim. Biophys. Acta. 843:
1-7, 1985.
DIETRICH, C.P.; SAMPAIO, L.O.; MONTES DE OCA, H.;NADER, H.B. Role of
sulfated mucopolysaccharides in cell recognition and neoplastic transformation. An
Acad Bras Cienc. 52(1):179-186, 1980.
DIETRICH, C.P.; SAMPAIO, L.O.; TOLEDO, O.M.; CASSARO, C.M. Cell recognition
and adhesiveness: a possible biological role for the sulfated mucopolysaccharides.
Biochem Biophys Res Commun. 75 (2): 329-336, 1977.
DIETRICH, C.P.; SILVA, M.E.; MICHELACCI, Y.M. Sequential degradation of
heparin in Flavobacterium heparinum. Purification and properties of five enzymes
involved in heparin degradation. J Biol Chem. 248: 6408-6415, 1973.
DIETRICH, C.P.; TERSARIOL, I.L.; TOMA, L.; MORAES, C.T; PORCIONATTO,
M.A.; OLIVEIRA, F.W.; NADER, H.B. Structure of heparan sulfate: identification of
variable and constant oligosaccharide domains in eight heparan sulfates of different
origins. Cell. Mol. Biol. 44: 417-29, 1998.
Referências 67
FABRIS, F.; AHMAD, S.; CELLA, G.; JESKE, W.P.; WALENGA, J.M.; FAREED, J.
Pathophysiology of heparin-induced thrombocytopenia. Clinical and diagnostic
implications--a review. Arch Pathol Lab Med. 124(11): 1657-1666, 2000.
FAURSCHOU, M. & BORREGAARD, N. Neutrophil granules and secretory vesicles
in inflammation. Microbes and Infection. 5: 1317–1327, 2003.
FERREIRA, T.M.; MEDEIROS, M.G.; DIETRICH, C.P.; NADER, H.B. Structure of
heparan sulfate from the fresh water mollusc Anomantidae sp: sequencing of its
disaccharide units. Int. J. Biochem. 24: 1219-25, 1993.
FILHO, R.; GARCIA, J.; KORUKIAN, M.; SANTOS, F.P.E.; VIOLA, D.C.M.;
PUERTAS, E.B. Ensaio clínico randomizado, duplo-cego, comparativo entre a
associação de cafeína, carisoprodol, diclofenaco sódico e paracetamol e a
ciclobenzaprina, para avaliação da eficácia e segurança no tratamento de pacientes
com lombalgia e lombociatalgia agudas. Acta Ortop Bras. 14: 11-16, 2006.
GIUFFRE, L.; CORDEY, A.; MONAI, N.; TARDY, Y.; SCHAPIRA, M. SPERTINI, O.
Monocyte adhesion to activated aortic endothelium: role of L-selectin and heparan
sulfate proteoglycans. J. Cell. Biol. 136(4): 945-956, 1997.
HASAN, M.; NAJJAM, S.; GORDON, M.Y.; GIBBS, R.V.; RIDER, C.C. IL-12 is a
heparin binding cytokine. Journal of Immunology. 162(2): 1064-1070, 1999.
HAWARI, F.I.; SHYKOFF, B.E.; IZZO, J.L.Jr. Heparin attentuates norepinephrine-
induced venoconstriction. Vasc Med. 3 (2): 95-100, 1998.
HE, L.; GIRI, T.K.; VICENTE, C.P.; TOLLEFSEN, D.M. Vascular dermatan sulfate
regulates the antithrombotic activity of heparin cofactor II. Blood. 111(8): 4118–4125,
2008.
HERENCIA, F.; UBEDA, A.; FERRÁNDIZ, M.L.; TERENCIO, M.C.; ALCARAZ, M.J.;
GARCÍA-CARRASCOSA, M.; CAPACCIONI, R.; PAYÁ, M. Anti-inflammatory activity
Referências 68
in mice of extracts from Mediterranean marine invertebrates. Life Sci. 62 (9): 115-20,
1998.
HIEBERT, L.M.; JAQUES, L.B: The observation of heparin on endothelium after
injection. Thromb Res. 8(2): 195-204, 1976.
JAQUES, L.B.; BALLIEUX, R.E.; DIETRICH ,C.P. & KAVANAGH, L.W. A
microelectrophoresis method for heparin. Can J Physiol Pharmacol. 46:351-60,
1968.
KURATA, M. & HORII, I. Blood Coagulation Tests in Toxicological Studies – Review
of Methods and their significance for Drug safety assessment. J Toxicol Sci. 29 (1):
13-32, 2004.
LACY-HULBERT, A. & MOORE, K.J. Designer macrophages: Oxidative metabolism
fuels inflammation repair. Cell Metab. 4 (1): 7-8, 2006.
LANTZ, M.; THYSELL, H.; NILSSON, E.; OLSSON, I. On the Binding of Tumor
Necrosis Factor (TNF) to Heparin and the Release In Vivo of the TNF-binding Protein
I by Heparin. J. Clin. Invest. 88: 2026-2031, 1991.
LAUX, V.; PERZBORN, E.; HEITMEIER, S.; VON DEGENFELD, G.; DITTRICH-
WENGENROTH, E.; BUCHMÜLLER, A.; GERDES, C.; MISSELWITZ, F. Direct
inhibitors of coagulation proteins – the end of the heparin and low-molecular-weight
heparin era for anticoagulant therapy. Thromb Haemost. 102: 892–899; 2009.
LEVER, R. & PAGE, C. Novel drug development opportunities for heparin. Nature
Reviews Drug Disc. 1: 140-148, 2002.
LEVER, R.; HOULT, J.R.S.; PAGE, C.P: The effects of heparin and related
molecules upon the adhesion of human polymorphonuclear leucocytes to vascular
endothelium in vitro. Br J Pharmacol. 129(3): 533-540, 2000.
Referências 69
LEY, K.; CERRITO, M.; ARFORS, K.E. Sulfated polysaccharides inhibit leukocyte
rolling in rabbit mesentery venules. Am. J. Physiol. 260(5 Pt 2): H1667-73, 1991.
LI, J.M.; HAJARIZADEH, H.; LA ROSA, C.A.; ROHRER, M.J.; VANDER SALM, T.J.;
CUTLER, B.S. Heparin and protamine stimulate the production of nitric oxide. J
Cardiovasc Surg (Torino). 37(5):445-52, 1996.
LI, J-p. & VLODAVSKY, I. Heparin, heparan sulfate and heparanase in inflammatory
reactions. Thromb Haemost. 102: 823–828, 2009.
LINDAHL, U. Heparan sulfate – protein interactions — a concept for drug design?
Thromb. Haemost. 98 (1): 109-15, 2007.
LINDAHL, U.; LI, J.P. Interaction between heparan sulfate and proteins - design and
functional implications. Int. Rev. Cell Biol. 276: 105-159, 2009.
LIU, J.; PEDERSEN, L.C. Anticoagulant Heparan Sulfate: Structural Specificity and
Biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol. 74 (2): 263–272, 2007.
LORTAT-JACOB, H.; BALTZER, F.; GRIMAUD, J.A. Heparin decreases the blood
clearance of interferon-gamma and increases its activity by limiting the processing of
its carboxyl-terminal sequence. J Biol Chem. 271 (27): 16139-16143, 1996.
LORTAT-JACOB, H.; TURNBULL, J.E.; GRIMAUD, J.A. Molecular organization of
the interferon γ-binding domain in heparan sulfate. Biochemical Journal. 310 (2):
497-505, 1995.
LOWE, J.B. Glycan-dependent leukocyte adhesion and recruitment in inflammation.
Curr. Opin. Cell Biol. 15: 531–538, 2003.
MATTSON, M.P. Hormesis Defined. Ageing Res Rev. 7(1): 1–7, 2008.
Referências 70
MATZNER, Y.; MARX, G.; DREXLER, R.; ELDOR, A. The inhibitory effect of heparin
and related glycosaminoglycans on neutrophil chemotaxis. Thromb. Haemost. 52
(2): 134-137, 1984.
MEDEIROS, G.F.; MENDES, A.; CASTRO, R.A.B.; BAÚ, E.C.; NADER, H.B.;
DIETRICH, C,P. Distribution of sulfated glycosaminoglycans in the animal kingdom:
widespread occurrence of heparin-like compounds in invertebrates. Biochim.
Biophys. Acta. 1475: 287-294, 2000.
MELO, E.I.; PEREIRA, M.S.; CUNHA, R.S.; SÁ, M.P.L.; MOURÃO, P.A.S. Heparin
quality control in the Brazilian market: implications in the cardiovascular surgery. Rev
Bras Cir Cardiovasc. 23(2): 169-174, 2008.
MILLER, M.D. & KRANGEL, M.S. Biology and biochemistry of the chemokines: A
family of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit. Rev. Immunol. 12(1-2): 17-
46, 1992.
MONCADA, S. & HIGGS, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 329:
2002-2012, 1993.
MULLER, W.A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration
and the inflammatory response. Trends Immunol. 24: 327-334, 2003.
NADER, H.B. & DIETRICH, C.P. Natural occurrence and possible biological role of
heparin. In Heparin: chemical and biological properties, Eds. D.A. Lane and U.
Lindahl, Edward Arnold Ltd., London, pp. 81-96, 1989.
NADER, H.B.; CHAVANTE, S.F.; SANTOS, E.A.; OLIVEIRA, F.W.; PAIVA, J.F.;
JERÔNIMO, S.M.B.; MEDEIROS, G.F.; ABREU, L.R.D.; LEITE, E.L.; SOUSA
FILHO, J.F.; CASTRO, R.A.B.; TOMA, L.; TERSARIOL, I.L.S.; PORCIONATTO,
M.A.; DIETRICH, C.P. Heparan sulfates and heparins: similar compounds performing
the same functions in vertebrates and invertebrates? Braz J Med Biol Res.; 32: 529-
538, 1999.
Referências 71
NADER, H.B.; FERREIRA, T.M.; PAIVA, J.F.; MEDEIROS, M.G.; JERONIMO, S.M.;
PAIVA, V.M.; DIETRICH, C.P. Isolation and structural studies of heparan sulfates
and chondroitin sulfates from three species of molluscs. J Biol Chem. 259 (3): 1431-
1435, 1984.
NADER, H.B.; KOBAYASHI, E.Y.; CHAVANTE, S.F.; TERSARIOL, I.L.S.; CASTRO,
R.A.B.; SHINJO, S.K.; NAGGI, A.; TORRI, G.; CASU, B. & DIETRICH, C.P. New
insights on the specificity of heparin and heparan sulfate lyases from Flavobacterium
heparinum revealed by the use of synthetic derivatives of K5 polysaccharide from E.
coli. and 2-O-desulfated heparin. Glycoconj J. 16: 265-270, 1999b.
NADER, H.B.; LOPES, C.C.; ROCHA, H.A.O.; SANTOS, E.A.; DIETRICH, C.P.
Heparins and Heparinoids: Occurrence, Structure and Mechanism of Antithrombotic
and Hemorrhagic Activities. Current Pharmaceutical Design. 10: 951-966, 2004.
NATHAN, C. Points of control in inflammation. Nature. 420: 846-852, 2002.
NATHAN, C., XIE, Q.W., HALBWACHS-MECARELLI, L. & JIN, W.W. Albumin
inhibits neutrophil spreading and hydrogen peroxide release by blocking the
shedding of CD43 (sialophorin, leukosialin). J. Cell Biol. 122: 243-256, 1993.
NELSON, R.M.; CECCONI, O.; ROBERTS, W.G.; ARUFFO, A.; LINHARDT, R.J.;
BEVILACQUA, M.P. Heparin oligosaccharides bind L- and P-selectin and inhibit
acute inffammation. Blood. 82(11): 3253-3258, 1993.
NORGARD-SUMNICHT, K.E.; VARKI, N.M.; VARKI, A. Calcium-dependent heparin-
like ligands for L-selectin in nonlymphoid endothelial cells. Science. 261 (5120): 480-
3, 1993.
NOURSHARGH, S. & MARELLI-BERG, F.M. Transmigration through venular walls: a
key regulator of leukocyte phenotype and function. Trends Immunol. 26: 157–165,
2005.
Referências 72
PACHALY, J.R.; BRITO, H.F.V. Emprego do método de extrapolação alométrica no
cálculo de protocolos posológicos para animais selvagens. A Hora Veterinária.
20:59-65, 2000.
PARISH, C.R. The role of Heparam sulphate in inflammation. Nature Reviews
Immunol. 6: 633-643. 2006.
RAU, J.C.; BEAULIEU, L.M.; HUNTINGTON, J.A.; CHURCH, F.C. Serpins in
thrombosis, hemostasis and fibrinolysis. J Thromb Haemost. 5(1): 102–115, 2007.
ROSS, R. & RESKE-KUNZ, A.B. The role of nitric oxide in contact hypersensitivity.
Int Immunopharmacology. 1 (8): 1469-1478, 2001.
SALAS, A.; SANS, M.; SORIANO, A.; REVERTER, J.C.; ANDERSON, D.C.; PIQUE,
J.M.; PANES, J. Heparin attenuates TNF-alpha induced inflammatory response
through a CD11b dependent mechanism. Gut. 47: 88-96, 2000.
SALLUSTIO, B.C.; HOLBROOK, F.L. In vivo perturbation of rat hepatocyte
canalicular membrane function by diclofenac. Drug Metab Dispos. 29: 1535–1538,
2001.
SANTOS, J.C.; MESQUITA, J.M.F.; BELMIRO, C.L.R.; SILVEIRA, C.B.M.; VISKOV,
C.; MOURIER, P.A.; PAVÃO, M.S.G. Isolation and characterization of a heparin with
low antithrombin activity from the body of Styela plicata (Chordata-Tunicata). Distinct
effects on venous and arterial models of thrombosis. Thrombosis Research. 121:
213–223; 2007.
SANTOS, V.O. Polissacarídeos sulfatados de interesse farmacológico no camarão
marinho Litopenaeus schmitti. Natal-RN, 2006 [Dissertação – mestrado –
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – Dpto. de Bioquímica].
SASAKI, M.; HERD, C.M.; PAGE, C.P. Effect of heparin and a low-molecular weight
heparinoid on PAF-induced airway responses in neonatally immunized rabbits. Br. J.
Pharmacol. 110(1): 107-112, 1993.
Referências 73
SEEDS, E.A.M.; HANSS, J.; PAGE, C.P. The effect of heparin and related
proteoglycans on allergen and PAF-induced eosinophil infiltration. J. Lipid Mediat.
9(2): 85–91, 1993.
SHERWOOD, E.R.; TOLIVER-KINSKY, T. Mechanisms of the inflammatory
response. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 3: 385–405, 2004.
SILVA, L.P. Heparina e dermatam sulfato da lagosta Panulirus laevicauda. Natal-RN,
2003 [Dissertação – mestrado – Universidade Federal do Rio Grande do Norte –
Depto. De Bioquímica].
SILVA, M.E. & DIETRICH, C.P. Isolation and partial characterization of three induced
enzymes from Flavobacterium heparinum involved in the degradation of heparin and
heparitin sulfates. Biochem Biophys Res Commun. 56: 965–972, 1974.
SILVA, M.E. & DIETRICH, C.P. Structure of heparin. Characterization of the products
formed from heparin by the action of a heparinase and heparitinase from
Flavobacterium heparinum. J. Biol. Chem. 250: 6841-6, 1975.
SILVESTRO, L.; VIANO, I.; MACARIO, M.; COLANGELO, D.; MONTRUCCHIO, G.;
PANICO, S.; FANTOZZI, R. Effects of heparin and its desulfated derivatives on
leukocyte-endothelial adhesion. Sem. Thromb. Haemost. 20 (3): 254-258, 1994.
SKINNER, R.; ABRAHAMS, J.P.; WHISSTOCK, J.C.; LESK, A.M.; CARRELL, R.W.;
WARDELL, M.R. The 2.6 A structure of antithrombin indicates a conformational
change at the heparin binding site. J Mol Biol. 266 (3): 601-609. 1997.
SOUZA, M.H.L. & ELIAS, D.O. Fundamentos da Circulação Extracorpórea. Segunda
Edição, Rio de Janeiro, 2006.
STRUNK, R.; COLTEN, H.R. Inhibition of the enzymatic activity of the first
component of complement (C1) by heparin. Clin. Immunol. Immunopathol. 6 (2):
248-255, 1976.
Referências 74
SUNDARAM, M.; QI, Y., SHRIVER, Z.; LIU, D.; ZHAO, G.; VENKATARAMAN, G.;
LANGER, R.; SASISEKHARAN, R. Rational design of low-molecular weight heparins
with improved in vivo activity. PNAS. 100 (2): 651–656, 2003.
SZABO, C. DNA strand breakage and activation of poly-ADP ribosyltransferase: A
cytotoxic pathway triggered by peroxynitrate. Free Radic Biol Med. 21 (6):855-69,
1996.
TEIXEIRA, M.M.; HELLEWELL, P.G. Suppression by intradermal administration of
heparin of eosinophil accumulation but not oedema formation in inflammatory
reactions in guinea-pig skin. Br. J. Pharmacol. 110(4): 1496-500, 1993.
TERSARIOL, I.L.S.; FERREIRA, T.M.P.C.; MEDEIROS, M.G.L.; PORCIONATTO,
M.A., MORAES, C.T., ABREU, L.R.D.; NADER, H.B. & DIETRICH, C.P. Sequencing
of heparan sulfate proteoglycans: Identification of variable and constant
oligosaccharide regions in eight heparan sulfate proteoglycans from different origins.
Braz. J. Med. Biol. Res. 27: 2097-102, 1994.
UPCHURCH, G.R.Jr.; WELCH, G.N.; FREEDMAN, J.E.; FABIAN, A.J.; PIGAZZI, A.;
SCRIBNER, A.M.; ALPERT, C.S.; KEANEY, J.F.Jr.; LOSCALZO, J. High-dose
heparin decreases nitric oxide production by cultured bovine endothelial cells.
Circulation. 95 (8):2115-2121, 1997.
van DOORMAAL, F.F.; BÜLLER, H.R.; MIDDELDORP, S. Development in
anticoagulant therapy. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 66 (2):145-154,
2008.
VANE, J.R.; BOTTING, R.M. Anti-inflammatory drugs and their mechanism of action.
Inflamm res. 47: S78–S87, 1998.
VARKI, A. Differential interactions of heparin and heparan sulfate
glycosaminoglycans with the selectins. Implications for the use of unfractionated and
low molecular weight heparins as therapeutic agents. J. Clin. Invest. 101 (4): 877-
889, 1998.
Referências 75
VOLPI, N. “ Fast moving” and “slow moving” heparins, dermatam sulfate, and
chondroitin sulfate: qualitative and quantitative analysis by agarose-gel-
electrophoresis. Carbohydrate Research. 247: 263-278, 1993.
VOLPI, N.; MACCARI, F. Electrophoretic approaches to the analysis of complex
polysaccharides. J. Chromatogr. B. 834: 1–13, 2006.
WANG, J. & DALLAS, L. Interaction of Heparin with Two Synthetic Peptides That
Neutralize the Anticoagulant Activity of Heparin. Biochemistry. 45 (51): 15740–
15747, 2006.
WANG, L.; BROWN, J.R.; VARKI, A.; ESKO J.D. Heparin’s anti-inflammatory effects
require glucosamine 6-O-sulfation and are mediated by blockade of L- and P-
selectins. J Clin Invest. 110: 127–136, 2002.
WHITELOCK, J.M. & IOZZO, R.V. Heparan sulfate: a complex polymer charged with
biological activity. Chem Rev. 105 (7): 2745-2764, 2005.
XIE, X.; RIVIER, A-S; ZAKRZEWICZ, A; BERNIMOULIN, M; ZENG, X-L; WESSELI,
H.P.; SCHAPIRA, M.; SPERTINI, O. Inhibition of selectin-mediated cell adhesion and
prevention of acute inflammation by nonanticoagulant sulfated saccharides. J Biol
Chem. 275: 34818-34825, 2000.
XIE, X.; THORLACIUS, H.; RAUD, J.; HEDQVIST, P.; LINDBOM, L. Inhibitory effect
of locally administered heparin on leukocyte rolling and chemoattractant-induced firm
adhesion in rat mesenteric venules in vivo. Br. J. Pharmacol. 122 (5): 906-910,
1997.
YADAV, R.; LARBI, K.Y.; YOUNG, R.E. & NOURSHARGH, S. Migration of
leukocytes through the vessel wall and beyond. Thromb. Haemost. 90: 598-606,
2003.
Referências 76
YOKOKAWA, K.; TAHARA, H.; KOHNO, M.; MANDAL, A.K.; YANAGISAWA, M.;
TAKEDA, T. Heparin regulates endothelin production through endothelium-derived
nitric oxide in human endothelial cells. J Clin Invest. 92 (4):2080–2085, 1993.
YOUNG, E. The anti-inflammatory effects of heparin and related compounds,
Thromb Res. 122: 743-52, 2008.
ZHANG, Y.; RAMOS, B.F.; JAKSCHIK, B.A. Neutrophil Recruitment by Tumor
Necrosis Factor from Mast Cells in Immune Complex Peritonitis. Science. 258: 1957-
1959, 1992.