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Boletim de Pesquisa 99
e Desenvolvimento ISSN 1676 - 1340 Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil Luiz Inaacutecio Lula da Silva Presidente Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria Conselho de Administraccedilatildeo Luis Carlos Guedes Pinto Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Ernesto Paterniani Helio Tollini Marcelo Barbosa Saintive Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Silvio Crestana Diretor Presidente Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Saacute Diretores Executivos Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias Chefe-Geral Mauriacutecio Antocircnio Lopes Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Maria Isabel de Oliveira Penteado Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios Maria do Rosaacuterio de Moraes Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO M Cristina Mattar da Silva Patriacutecia S F Brunetta Edson L Z Figueira Mariana T Q Magalhatildees Gustavo R Oliveira Hudson B Ramos Rafael P del Sarto Cleiton M Cruz Raquel S Oliveira Keline L Cavalcanti Kilvia Craveiro Aulus E A D Barbosa Norma S Paes Thales L Rocha Fabiola R Teixeira Marise V Coutinho Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF 2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash Brasiacutelia DF CEP 70770-900 ndash Caixa Postal 02372 PABX (61) 3348-4739 Fax (61) 3340-3666 TUTUTUhttpwwwcenargenembrapabrUUUTTT
emailsaccenargenembrapabr Comitecirc de Publicaccedilotildees Presidente Maria Isabel de Oliveira Penteado Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo Membros Arthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi Maria de Faacutetima Batista Mauriacutecio Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo 1ordf impressatildeo (2005) E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do
algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005 22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos
Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99) 1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira
Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
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SUMAacuteRIO RESUMO6 ABSTRACT8 INTRODUCcedilAtildeO 9 OBJETIVO10 MATERIAL E MEacuteTODOS11 1 DNA Shuffling 11 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para
inibidores de α-amilases11 2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12 3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display) 13 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry 13 32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs 13 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13 5 Bioensaios14 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 14 1- Biblioteca de variantes de genes cry14 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes 18 CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19 REFEREcircNCIAS 20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
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RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
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ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
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INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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M1-AGA
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M4-AGA
M5-AGA
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M7-AGA
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M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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2
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8
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PESO (g X 10
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
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cry3Aa1
683 X 105
6
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Repuacuteblica Federativa do Brasil Luiz Inaacutecio Lula da Silva Presidente Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria Conselho de Administraccedilatildeo Luis Carlos Guedes Pinto Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Ernesto Paterniani Helio Tollini Marcelo Barbosa Saintive Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Silvio Crestana Diretor Presidente Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Saacute Diretores Executivos Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias Chefe-Geral Mauriacutecio Antocircnio Lopes Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Maria Isabel de Oliveira Penteado Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios Maria do Rosaacuterio de Moraes Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO M Cristina Mattar da Silva Patriacutecia S F Brunetta Edson L Z Figueira Mariana T Q Magalhatildees Gustavo R Oliveira Hudson B Ramos Rafael P del Sarto Cleiton M Cruz Raquel S Oliveira Keline L Cavalcanti Kilvia Craveiro Aulus E A D Barbosa Norma S Paes Thales L Rocha Fabiola R Teixeira Marise V Coutinho Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF 2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash Brasiacutelia DF CEP 70770-900 ndash Caixa Postal 02372 PABX (61) 3348-4739 Fax (61) 3340-3666 TUTUTUhttpwwwcenargenembrapabrUUUTTT
emailsaccenargenembrapabr Comitecirc de Publicaccedilotildees Presidente Maria Isabel de Oliveira Penteado Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo Membros Arthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi Maria de Faacutetima Batista Mauriacutecio Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo 1ordf impressatildeo (2005) E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do
algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005 22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos
Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99) 1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira
Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
5
SUMAacuteRIO RESUMO6 ABSTRACT8 INTRODUCcedilAtildeO 9 OBJETIVO10 MATERIAL E MEacuteTODOS11 1 DNA Shuffling 11 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para
inibidores de α-amilases11 2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12 3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display) 13 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry 13 32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs 13 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13 5 Bioensaios14 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 14 1- Biblioteca de variantes de genes cry14 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes 18 CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19 REFEREcircNCIAS 20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
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M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N FRAGOSO R R SILVA S M B OLIVEIRA G R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes Bacillus thuringiensis com potencial uso no controle das pragas do algodoeiro In WORKSHOP DE INTERACcedilAtildeO MOLECULAR PLANTAS-PRAGA 1 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004b p37-41
MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
PUEYO J J HUNT D C CHRISPEELS M J Activation of bean (Phaseoulus vulgaris) α-amylase inhibitor requires proteolytic processing of the proprotein Plant Physiology Minneapolis v101 p 1341-1348 1993
RADER C STEINBERG P BARBAS III C F Selection from antibody libraries In Phage Display ndash A Laboratory Manual ndash USA Cold Spring Laboratory 2001 p 101-109
SILVA M C M GROSSI-DE-SAacute M F CHRISPEELS M J TOGAWA R C NESHICH G Analysis of structural and physico-chemical parameters involved in the
22
specificity of binding between α-amylases and their inhibitors Protein Engineering Oxford v13 p 167-177 2000
STEMMER W P C DNA shuffling by random fragmentation and reassembly in vitro recombination for molecular evolution Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v91 p10747-10751 1994
TRANSLATE PROGRAM Disponiacutevel em lt httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate gt Acesso em jul 2005
YOUNG N M THIBAULT P WATSON D C CHRISPEELS M J Post-translational processing of two α-amylase inhibitors and an arcelin from the common bean Phaseolus vulgaris FEBS Letters Amsterdam v 446 p203-206 1999
ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
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8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
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Presidente
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Diretoria-Executiva da Embrapa
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Diretor Presidente
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Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
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Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO M Cristina Mattar da Silva Patriacutecia S F Brunetta Edson L Z Figueira Mariana T Q Magalhatildees Gustavo R Oliveira Hudson B Ramos Rafael P del Sarto Cleiton M Cruz Raquel S Oliveira Keline L Cavalcanti Kilvia Craveiro Aulus E A D Barbosa Norma S Paes Thales L Rocha Fabiola R Teixeira Marise V Coutinho Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF 2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash Brasiacutelia DF CEP 70770-900 ndash Caixa Postal 02372 PABX (61) 3348-4739 Fax (61) 3340-3666 TUTUTUhttpwwwcenargenembrapabrUUUTTT
emailsaccenargenembrapabr Comitecirc de Publicaccedilotildees Presidente Maria Isabel de Oliveira Penteado Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo Membros Arthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi Maria de Faacutetima Batista Mauriacutecio Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo 1ordf impressatildeo (2005) E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do
algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005 22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos
Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99) 1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira
Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
5
SUMAacuteRIO RESUMO6 ABSTRACT8 INTRODUCcedilAtildeO 9 OBJETIVO10 MATERIAL E MEacuteTODOS11 1 DNA Shuffling 11 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para
inibidores de α-amilases11 2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12 3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display) 13 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry 13 32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs 13 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13 5 Bioensaios14 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 14 1- Biblioteca de variantes de genes cry14 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes 18 CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19 REFEREcircNCIAS 20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
30
40
50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash Brasiacutelia DF CEP 70770-900 ndash Caixa Postal 02372 PABX (61) 3348-4739 Fax (61) 3340-3666 TUTUTUhttpwwwcenargenembrapabrUUUTTT
emailsaccenargenembrapabr Comitecirc de Publicaccedilotildees Presidente Maria Isabel de Oliveira Penteado Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo Membros Arthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi Maria de Faacutetima Batista Mauriacutecio Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo 1ordf impressatildeo (2005) E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do
algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005 22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos
Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99) 1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira
Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
5
SUMAacuteRIO RESUMO6 ABSTRACT8 INTRODUCcedilAtildeO 9 OBJETIVO10 MATERIAL E MEacuteTODOS11 1 DNA Shuffling 11 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para
inibidores de α-amilases11 2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12 3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display) 13 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry 13 32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs 13 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13 5 Bioensaios14 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 14 1- Biblioteca de variantes de genes cry14 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes 18 CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19 REFEREcircNCIAS 20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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M1-AGA
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M4-AGA
M5-AGA
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M7-AGA
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M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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2
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8
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PESO (g X 10
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
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cry3Aa1
683 X 105
6
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4
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c ry8Ha
190 X 107
6
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
5
SUMAacuteRIO RESUMO6 ABSTRACT8 INTRODUCcedilAtildeO 9 OBJETIVO10 MATERIAL E MEacuteTODOS11 1 DNA Shuffling 11 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para
inibidores de α-amilases11 2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12 3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display) 13 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry 13 32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs 13 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13 5 Bioensaios14 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 14 1- Biblioteca de variantes de genes cry14 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes 18 CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19 REFEREcircNCIAS 20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
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M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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PESO (g X 10
-2
)
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
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Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
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Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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EMBED ExcelChart8 s 13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva1
Patriacutecia S F Brunetta2
Edson L Z Figueira3
Mariana T Q Magalhatildees4
Gustavo R Oliveira5
Hudson B Ramos6
Rafael P del Sarto7
Cleiton M Cruz8
Raquel S Oliveira9
Keline L Cavalcanti10
Kilvia Craveiro11
Aulus E A D Barbosa12
Norma S Paes13
Thales L Rocha14
Fabiola R Teixeira15
Marise V Coutinho16
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute17
1 Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2 Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 3 Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 4 Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 5 Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 6 Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 7 Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 8 Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 9 Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 10 Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 11 Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 12 Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 13 Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 14 Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 15 Graduanda em Biologia- FTB 16 Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
617 Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
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30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
7
RESUMO
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho (Spodoptera
frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos
danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas
envolvidas com a defesa de plantas incluindo as δ-endotoxinas e os inibidores de α-
amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos
insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas
por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes
com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas
combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display
Trecircs genes para toxinas Cry (cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo
dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados
para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das
bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes
mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal (Brush
Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para
moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes
foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na
geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade
melhoradas para insetos-praga alvos
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
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M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
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M9-AGA
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M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
PUEYO J J HUNT D C CHRISPEELS M J Activation of bean (Phaseoulus vulgaris) α-amylase inhibitor requires proteolytic processing of the proprotein Plant Physiology Minneapolis v101 p 1341-1348 1993
RADER C STEINBERG P BARBAS III C F Selection from antibody libraries In Phage Display ndash A Laboratory Manual ndash USA Cold Spring Laboratory 2001 p 101-109
SILVA M C M GROSSI-DE-SAacute M F CHRISPEELS M J TOGAWA R C NESHICH G Analysis of structural and physico-chemical parameters involved in the
22
specificity of binding between α-amylases and their inhibitors Protein Engineering Oxford v13 p 167-177 2000
STEMMER W P C DNA shuffling by random fragmentation and reassembly in vitro recombination for molecular evolution Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v91 p10747-10751 1994
TRANSLATE PROGRAM Disponiacutevel em lt httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate gt Acesso em jul 2005
YOUNG N M THIBAULT P WATSON D C CHRISPEELS M J Post-translational processing of two α-amylase inhibitors and an arcelin from the common bean Phaseolus vulgaris FEBS Letters Amsterdam v 446 p203-206 1999
ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
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8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
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Presidente
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Ernesto Paterniani
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Diretoria-Executiva da Embrapa
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Diretor Presidente
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Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Geral
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Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
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30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
8
ABSTRACT
The cotton boll weevil (Anthonomus grandis) and the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control
those insect pests protein related to plant defense including δ-endotoxins and α-
amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution
strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved
toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed
using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were
constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from
Bacillus thuringiensis (Bt) and a further library constructed by homologous recombination
of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted
in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries
were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively
The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large
numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect
pests
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
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5
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cry3Aa1
683 X 105
6
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c ry8Ha
190 X 107
6
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
9
INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para
o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola
20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A
primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de
1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi
plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada
provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta
haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra
19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo
plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de
entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de
trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor
ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de
insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc (Alabama argilacea) a
lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde (Heliothis
virescens) e a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores
e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de
nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na
cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos
meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do
cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas
maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a
quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de
grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa
em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de
preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente
modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos
programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a
aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares
crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
30
40
50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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escala 13
1mm13
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Mortalidade ()13
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Mortalidade ()13
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EMBED ExcelChart8 s 13
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EMBED ExcelChart8 s 13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
10
plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas
GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta
tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da
produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos
riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores
e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do
Bacillus thuringiensis (Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de α-
amilases - αAIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas
aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e
GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais
uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de
moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a
recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes)
que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994
ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir
da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os
fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo
origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR
(Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes
mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito
especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de
importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos
ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees
potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees
de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este
processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e
recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica
de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas
utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
BARBAS III C F BURTON D R SCOTT J K SILVERMAN G J Selection from Antibody libraries In Phage Display ndash A Laboratory Manual ndash USA Cold Spring Laboratory 2001 p 101-1020
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
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Ernesto Paterniani
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Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
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Kepler Euclides Filho
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Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Geral
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Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
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Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
11
insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no
desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS 1 - DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de α-amilases foram
utilizados os genes descritos na tabela 1
Fonte Origem Genes Referecircncias
cry1Ia12 Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1 Magalhatildees MTQ et al 2001
Microorganismo B thuringiensis (Bt)
cry3Aa1 Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal P vulgaris (Feijatildeo comum) α-AI1e α-AI2 Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811
cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180
μgmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta
atividade contra A grandis (LC50 = 230 μgmL) e S frugiperda (LC50 = 5 μgmL) O gene
cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo
apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes α-AI-1 e αAI-2
foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de α-amilases os
quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 μg de DNA foram dissolvidos em 80 μl de tampatildeo de DNAse I (Tris
50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com
a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 UμL) A reaccedilatildeo ocorreu
a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A
fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
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M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
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M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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2
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8
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PESO (g X 10
-2
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Mortalidade ()13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
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30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
12
contendo tamanhos variados foram purificados em coluna (PCR purification Kit - QIagen)
ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes α-AI α-AI-1 e αAI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num
um total de 10 μg A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 μl de tampatildeo
DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo
da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 μL do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo
de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de
dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf
Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC
Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim
de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados
como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo
da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA
polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das
enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity
(Invitrogen) e 08 μM de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24
ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s
a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo
a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos
genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os
genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees
resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no
fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem
franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas
construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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escala 13
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Mortalidade ()13
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Mortalidade ()13
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B13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
13
combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito
por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas
(receptores) existentes nas BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos
insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo
Biber et al (1981) Utilizou-se 100 μg de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma
placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos
sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados
1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas
variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo
de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens
usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo
aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes
com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e
submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O
enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de
saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-
Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para αAIs foram selecionados de
acordo com a afinidade pelas α-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL
SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 μg
da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com
as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994)
A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate
(httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo
de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
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M3-AGA
M4-AGA
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M16-AGA
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M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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40
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70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
14
5 Bioensaios Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos
e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram
incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios
foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As
placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este
periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram
utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas
foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de
incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo
Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de αAIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens
proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a
seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e
especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo
de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de
Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A
grandis e S frugiperda a cepa S811 (Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial
inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e
cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995)
apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de
dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers
especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de
dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema
heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As
proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram
testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda
segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi
utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
18
M1-AGA
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M3-AGA
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M1-AGA
M2-AGA
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M19-AGA
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M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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2
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-2
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
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c ry8Ha
190 X 107
6
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30
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
15
coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi
observada (tabela 2)
Proteiacutenas CL50
A grandis S frugiperdaCry8Ha1 180 μgml NA Cry1Ia12 230 μgml 5 μgml Cry3Aa1 NA NA
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs
estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes
cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12
Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como
descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas
no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de
105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Biblioteca No variantes No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG SF AG SF
cry1Ia12 930 X 105 6 5 5 30 30
cry3Aa1 683 X 105 6 3 4 21 16
cry8Ha 190 X 107 6 3 3 30 30
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de
novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A
grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra
ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a
quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade
foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
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M14-AGA
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M16-AGA
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M18-AGA
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M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
M10-AGA
M11-AGA
M12-AGA
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M14-AGA
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M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N FRAGOSO R R SILVA S M B OLIVEIRA G R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes Bacillus thuringiensis com potencial uso no controle das pragas do algodoeiro In WORKSHOP DE INTERACcedilAtildeO MOLECULAR PLANTAS-PRAGA 1 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004b p37-41
MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
PUEYO J J HUNT D C CHRISPEELS M J Activation of bean (Phaseoulus vulgaris) α-amylase inhibitor requires proteolytic processing of the proprotein Plant Physiology Minneapolis v101 p 1341-1348 1993
RADER C STEINBERG P BARBAS III C F Selection from antibody libraries In Phage Display ndash A Laboratory Manual ndash USA Cold Spring Laboratory 2001 p 101-109
SILVA M C M GROSSI-DE-SAacute M F CHRISPEELS M J TOGAWA R C NESHICH G Analysis of structural and physico-chemical parameters involved in the
22
specificity of binding between α-amylases and their inhibitors Protein Engineering Oxford v13 p 167-177 2000
STEMMER W P C DNA shuffling by random fragmentation and reassembly in vitro recombination for molecular evolution Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v91 p10747-10751 1994
TRANSLATE PROGRAM Disponiacutevel em lt httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate gt Acesso em jul 2005
YOUNG N M THIBAULT P WATSON D C CHRISPEELS M J Post-translational processing of two α-amylase inhibitors and an arcelin from the common bean Phaseolus vulgaris FEBS Letters Amsterdam v 446 p203-206 1999
ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
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2
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8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
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Presidente
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Diretoria-Executiva da Embrapa
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Diretor Presidente
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Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Geral
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Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
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Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
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30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
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Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro
vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado
foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-
M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura
1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando
essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes
apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo
das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios
podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios
utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e
toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram
conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
30
40
50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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escala 13
1mm13
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Mortalidade ()13
13
Mortalidade ()13
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B13
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A13
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EMBED ExcelChart8 s 13
13
EMBED ExcelChart8 s 13
13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
17
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das
larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade
inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos
indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage
display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas
moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde
determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em
quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa
forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de
expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com
maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento
das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas
sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando
comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de
toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal
desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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M17-AGA
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M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
M9-AGA
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M11-AGA
M12-AGA
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M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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21
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
PUEYO J J HUNT D C CHRISPEELS M J Activation of bean (Phaseoulus vulgaris) α-amylase inhibitor requires proteolytic processing of the proprotein Plant Physiology Minneapolis v101 p 1341-1348 1993
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ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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B13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
0
2
4
6
8
10PE
SO (g
X 1
0-2)
A
escala 1mm
B
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de α-
amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes αAI-1 e αAI-2 Estes inibidores isolados de
sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das α-
amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto αAI-1 inibe a α-
amilase pancreaacutetica de porco e as α-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e
Callosobruchus chinensis o αAI-2 inibe especificamente a α-amilase do bruquiacutedeo
Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a α-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com
atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo
pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e
sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes
apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores α-AI1 e
α-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem
identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes
exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do
α-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do α-AI2 Anaacutelises
computacionais utilizando os modelos estruturais dos αAIs variantes (estudo em
andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na
atividade inibitoacuteria
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M1-AGA
M2-AGA
M3-AGA
M4-AGA
M5-AGA
M6-AGA
M7-AGA
M8-AGA
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M9-AGA
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M11-AGA
M12-AGA
M13-AGA
M14-AGA
M15-AGA
M16-AGA
M17-AGA
M18-AGA
M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
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70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
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50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
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M10-AGA
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M16-AGA
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M19-AGA
M20-AGA
M21-AGA
M22-AGA
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos
da seleccedilatildeo contra α-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o
vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300
sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd)
e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo
usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em
plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas
variantes seraacute posteriormente avaliada contra α-amilases de A grandis afim de
identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo
das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande
quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com
atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca
de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos
mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-
praga
19
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
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Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
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Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
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Presidente
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Vice-Presidente
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Ernesto Paterniani
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Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
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Kepler Euclides Filho
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Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
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Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
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Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
30
40
50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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1mm13
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13
Mortalidade ()13
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EMBED ExcelChart8 s 13
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EMBED ExcelChart8 s 13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
20
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios
genes quimeacutericos com distinta afinidade para as α-amilases e receptores do intestino de
larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os
genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo
submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas
seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de
teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de
cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo
extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas
piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia
a pragas
Referecircncias
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MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
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Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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20
30
40
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70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
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Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
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cry3Aa1
683 X 105
6
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c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
21
ISHIMOTO M CHRISPEELS M J Protective mechanisms of the Mexican bean weevil against high levels of a α-amylase inhibitor in the common bean Phaseolus vulgaris Plant Physiology Menneapolis v 111 p 393-401 1996
JAMES C Global Status of Commercialized Transgenic Crops 2004 Ithaca New York ISAAA Briefs 2004
LIU Y WHITTIER R F Thermal asymmetric interlaced PCR Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking Genomics San Diego v 25 p 674-681 1995
MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N FRAGOSO R R SILVA S M B OLIVEIRA G R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes Bacillus thuringiensis com potencial uso no controle das pragas do algodoeiro In WORKSHOP DE INTERACcedilAtildeO MOLECULAR PLANTAS-PRAGA 1 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004b p37-41
MAGALHAtildeES M T Q BATISTA J A N OLIVEIRA G R SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B FIGUEIRA E L Z MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Isolamento de genes cry com potencial uso no controle do bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 9 2004 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2004a p 67
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo bioquiacutemica e clonagem de genes cry de uma estirpe de Bacillus thuringiensis efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 7 2002 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2002 p 34
MAGALHAtildeES M T Q SILVA S M B FRAGOSO R R OLIVEIRA-NETO O B BATISTA J A N MONNERAT R G GROSSI-DE-SAacute M F Caracterizaccedilatildeo e clonagem de genes de estirpes de Bacillus thuringiensis ativas contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) In ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL 6 2001 Brasiacutelia Anais Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2001 p 31
PRACcedilA L B BATISTA A C MARTINS E S SIQUEIRA C B DIAS D G S GOMES A C M FALCAtildeO R MONNERAT R G Prospecccedilatildeo de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidoacuteptera coleoacuteptera e diacuteptera Brasiacutelia Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2003 (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos geneacuteticos e Biotecnologia 1676-1340 41)
PUEYO J J HUNT D C CHRISPEELS M J Activation of bean (Phaseoulus vulgaris) α-amylase inhibitor requires proteolytic processing of the proprotein Plant Physiology Minneapolis v101 p 1341-1348 1993
RADER C STEINBERG P BARBAS III C F Selection from antibody libraries In Phage Display ndash A Laboratory Manual ndash USA Cold Spring Laboratory 2001 p 101-109
SILVA M C M GROSSI-DE-SAacute M F CHRISPEELS M J TOGAWA R C NESHICH G Analysis of structural and physico-chemical parameters involved in the
22
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STEMMER W P C DNA shuffling by random fragmentation and reassembly in vitro recombination for molecular evolution Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v91 p10747-10751 1994
TRANSLATE PROGRAM Disponiacutevel em lt httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate gt Acesso em jul 2005
YOUNG N M THIBAULT P WATSON D C CHRISPEELS M J Post-translational processing of two α-amylase inhibitors and an arcelin from the common bean Phaseolus vulgaris FEBS Letters Amsterdam v 446 p203-206 1999
ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
10
20
30
40
50
60
70
cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
Joseacute Geraldo Eugecircnio de Franccedila
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
10
20
30
40
50
60
70
c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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EMBED ExcelChart8 s 13
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Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
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30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
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16
c ry8Ha
190 X 107
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3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
22
specificity of binding between α-amylases and their inhibitors Protein Engineering Oxford v13 p 167-177 2000
STEMMER W P C DNA shuffling by random fragmentation and reassembly in vitro recombination for molecular evolution Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v91 p10747-10751 1994
TRANSLATE PROGRAM Disponiacutevel em lt httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate gt Acesso em jul 2005
YOUNG N M THIBAULT P WATSON D C CHRISPEELS M J Post-translational processing of two α-amylase inhibitors and an arcelin from the common bean Phaseolus vulgaris FEBS Letters Amsterdam v 446 p203-206 1999
ZHAO H ARNOLD F H Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Washington v 94 p 7997-8000 1997
Resumo
Abstract
Introduccedilatildeo
Objetivo
Material e Meacutetodos
1 DNA Shuffling
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
32 Seleccedilatildeo de variantes para αAIs
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
5 Bioensaios
Resultados e Discussatildeo
1 Biblioteca de variantes de genes cry
2 Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
3 Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α-AI-1 e α-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Conclusatildeo e Perspectivas
Referecircncias
0
2
4
6
8
10
PESO (g X 10
-2
)
0
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cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6c3-M7c3-M8c3-M9
Boletim de Pesquisa99
e DesenvolvimentoISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
Repuacuteblica Federativa do Brasil
Luiz Inaacutecio Lula da Silva
Presidente
Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria
Conselho de Administraccedilatildeo
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Ernesto Paterniani
Helio Tollini
Marcelo Barbosa Saintive
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Silvio Crestana
Diretor Presidente
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Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu Saacute
Diretores Executivos
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Bioteconologia
Joseacute Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Mauriacutecio Antocircnio Lopes
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Maria Isabel de Oliveira Penteado
Chefe-Adjunto de Comunicaccedilatildeo e Negoacutecios
Maria do Rosaacuterio de Moraes
Chefe-Adjunto de Administraccedilatildeo
Recursos Geneacuteticos e
Biotecnologia
ISSN 1676 - 1340
Outubro 2005
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 99
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Brasiacutelia DF
2005
Exemplares desta ediccedilatildeo podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia
Serviccedilo de Atendimento ao Cidadatildeo
Parque Estaccedilatildeo Bioloacutegica Av W5 Norte (Final) ndash
Secretaacuterio-Executivo Maria da Graccedila Simotildees Pires Negratildeo
Membros A rthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi
Maria de Faacutetima Batista
Mauriacutecio Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial Maria da Graccedila S P Negratildeo
Normalizaccedilatildeo Bibliograacutefica Maria Iara Pereira Machado
Editoraccedilatildeo eletrocircnica Maria da Graccedila S P Negratildeo
1ordf ediccedilatildeo
1ordf impressatildeo (2005)
E 92 Evoluccedilatildeo molecular in vitro seleccedilatildeo de moleacuteculas inseticidas para insetos-praga do algodoeiro Maria Cristina Mattar da Silva [et al] ndash Brasiacutelia DF Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia 2005
22p - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 99)
1 Algodatildeo 3 Inseticidas 4 Pragas I Brunetta Patriacutecia S F II Figueira Edson L Z III Magalhatildees Mariana T Q IV Oliveira Gustavo R V Ramos Hudson B VI Del Sarto Rafael P VII Cruz Cleiton M VIII Oliveira Raquel S IX Cavalcanti Keline L X Craveiro Kilvia XI Barbosa Aulus E A D XII Paes Norma S XIII Rocha Thales L XiV Teixeira Fabiacuteola R XV Coutinho Marise V XVI Grossi-de-Saacute Maria de Faacutetima XVII Tiacutetulo XVIII Seacuterie
632951 ndash CDD 21
SUMAacuteRIO
RESUMO6
ABSTRACT8
INTRODUCcedilAtildeO9
OBJETIVO10
MATERIAL E MEacuteTODOS11
1 DNA Shuffling11
11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de (-amilases11
2 Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias12
3 Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas (Phage display)13
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry13
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs13
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas13
5 Bioensaios14
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO14
1- Biblioteca de variantes de genes cry14
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes15
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de (-AI-1 e (-AI-2 e seleccedilatildeo de variantes18
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS19
REFEREcircNCIAS20
EVOLUCcedilAtildeO MOLECULAR IN VITRO SELECcedilAtildeO DE MOLEacuteCULAS INSETICIDAS PARA INSETOS-PRAGA DO ALGODOEIRO
0
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50
60
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c (-)cry3c3-M1c3-M2c3-M3c3-M4c3-M5c3-M6
M Cristina Mattar da Silva
Patriacutecia S F Brunetta
Edson L Z Figueira
Mariana T Q Magalhatildees
Gustavo R Oliveira
Hudson B Ramos
Rafael P del Sarto
Cleiton M Cruz
Raquel S Oliveira
Keline L Cavalcanti
Kilvia Craveiro
Aulus E A D Barbosa
Norma S Paes
Thales L Rocha
Fabiola R Teixeira
Marise V Coutinho
Maria Faacutetima Grossi-de-Saacute
Resumo XE Resumo
O bicudo-do-algodoeiro ( Anthonomus grandis) e a lagarta do cartucho ( Spodoptera frugiperda) satildeo insetos que causam perdas significativas para a agricultura devido aos danos causados agrave cultura do algodatildeo Estrateacutegias biotecnoloacutegicas utilizam proteiacutenas envolvidas com a defesa de plantas incluindo as (-endotoxinas e os inibidores de α-amilases (αAIs) como ferramentas no desenvolvimento de plantas resistentes aos insetos-praga Neste contexto a estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas por meio da teacutecnica de DNA shuffling tem sido aplicada para gerar moleacuteculas variantes com melhor toxicidade e especificidade para insetos-praga Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram construiacutedas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e Phage display Trecircs genes para toxinas Cry ( cry1Ia12 cry3Aa1 e cry8Ha) assim como a recombinaccedilatildeo dos genes αAI-1 and αAI-2 isolados de sementes de Phaseolus vulgaris foram utilizados para a reaccedilatildeo de DNA shuffling gerando bibliotecas individualizadas Cada uma das bibliotecas de variantes de αAIs e de toxinas Cry geraram cerca de 105-107 genes mutantes que foram selecionados in vitro contra as α-amilases e BBMV intestinal ( Brush Border membrane Vesicles) dos insetos A grandis e S frugiperda Os genes para moleacuteculas variantes foram expressos na superfiacutecie de fagos e as proteiacutenas recombinantes foram avaliadas em bioensaios Os dados obtidos confirmam a eficiecircncia da estrateacutegia na geraccedilatildeo de um grande nuacutemero de moleacuteculas variantes com atividade e especificidade melhoradas para insetos-praga alvos
Abstract XE Abstract
The cotton boll weevil ( Anthonomus grandis) and the fall armyworm ( Spodoptera frugiperda) are insects that cause severe losses to cotton agriculture In order to control those insect pests protein related to plant defense including (-endotoxins and α-amylases inhibitors (αAIs) has been used Additionally in vitro molecular evolution strategy has been applied to create variant genes whose protein products have improved toxicity and specificity against those insects Four combinatorial libraries were constructed using DNA shuffling and Phage Display techniques Three combinatorial libraries were constructed using the individual genes cry1Ia12 cry3Aa1 and cry8Ha isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt) and a further library constructed by homologous recombination of αAI-1 and αAI-I2 genes isolated from Phaseolus vulgaris seeds All the libraries resulted in a range of 105-107 recombined genes The αamylase inhibitors and cry gene libraries were selected in vitro against A grandis α-amylases and or BBMV receptors respectively The results confirm in vitro molecular evolution as an efficient strategy to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests
INTRODUCcedilAtildeO XE INTRODUCcedilAtildeO
A cotonicultura eacute uma das atividades de grande importacircncia soacutecio-econocircmica para o Brasil na atualidade ocupando 11518 mil hectares de aacuterea cultivada no ano agriacutecola 20042005 dentre os quais 631 mil na regiatildeo Centro-Oeste (COMPANHIA 2005) A primeira ocorrecircncia do bicudo do algodoeiro em territoacuterio nacional foi registrada no ano de 1983 quando uma aacuterea recorde de algodatildeo herbaacuteceo (2200000 de hectares) foi plantada Posteriormente observou-se uma diminuiccedilatildeo progressiva na aacuterea cultivada provocada principalmente pelas dificuldades no controle desta praga que apresenta haacutebito de crescimento endofiacutetico e altos iacutendices de danos econocircmicos Na safra 19961997 o Brasil registrou seu pior desempenho em termos de aacuterea cultivada tendo plantado nesse periacuteodo apenas 600 mil hectares (COMPANHIA 2005) A partir de entatildeo houve uma recuperaccedilatildeo gradativa da cotonicultura motivada pela conjunccedilatildeo de trecircs fatores a migraccedilatildeo da cultura para a regiatildeo Centro-Oeste a reorganizaccedilatildeo do setor ocorrida no final dos anos 90 e a melhoria da qualidade da fibra produzida
No entanto o cultivo sucessivo do algodatildeo em grandes aacutereas favorece o ataque de insetos-praga que incluem o bicudo do algodoeiro o curuquerecirc ( Alabama argilacea) a lagarta do cartucho do milho ( Spodoptera frugiperda) a lagarta da maccedilatilde ( Heliothis virescens) e a lagarta rosada ( Pectinophora gossypiella) que encontram nas folhas flores e bototildees florais substacircncias accedilucaradas excretadas por glacircndulas denominadas de nectaacuterios tornando dessa forma a cultura muito atrativa para os insetos-praga
O bicudo do algodoeiro eacute considerado uma das pragas de maior relevacircncia na cotonicultura mundial devido aos danos causados e agraves dificuldades de controle pelos meacutetodos convencionais Destacam-se tambeacutem os problemas relacionados agrave lagarta do cartucho do milho que se alimenta das folhas em seu estaacutegio larval penetrando nas maccedilatildes e nos bototildees florais o que dificulta o seu controle e compromete a qualidade e a quantidade de fibra produzida O controle quiacutemico desses insetos requer a aplicaccedilatildeo de grande quantidade de inseticida aleacutem de apresentar uma eficiecircncia relativamente baixa em decorrecircncia da dificuldade de acesso aos insetos que apresentam haacutebito endofiacutetico
Tendo em vista os prejuiacutezos causados pelos insetos-praga e a necessidade de preservaccedilatildeo da sauacutede humana e do meio ambiente o uso de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de melhoramento geneacutetico vegetal A prova disso eacute que no ano de 2004 a aacuterea total cultivada com as culturas GM atingiu a marca dos 81 milhotildees de hectares crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 17 milhotildees de hectares plantados em 1996 (JAMES 2004) Do total da aacuterea mundial cultivada com as culturas GM 34 foram cultivados em paiacuteses em desenvolvimento A crescente adoccedilatildeo desta tecnologia eacute reflexo dos benefiacutecios diretos que incluem a melhoria substancial da produtividade proteccedilatildeo do meio ambiente fortalecimento da economia reduccedilatildeo dos riscos tanto para a sauacutede dos pequenos e grandes agricultores como para consumidores e para a sociedade em geral
Genes para proteiacutenas com potencial bioinseticida incluindo as toxinas Cry do Bacillus thuringiensis ( Bt) e os inibidores de enzimas hidroliacuteticas (inibidores de (-amilases - (AIs e proteinases) satildeo moleacuteculas alvos em estrateacutegias biotecnoloacutegicas aplicadas na obtenccedilatildeo de plantas GM com resistecircncia a insetos-praga (CARLINI e GROSSI-DE-SAacute 2002) Para alcanccedilar melhorias de potenciais benefiacutecios comerciais uma das alternativas eacute a utilizaccedilatildeo da estrateacutegia envolvendo a evoluccedilatildeo in vitro de moleacuteculas aplicando-se a teacutecnica de DNA Shuffling Esta teacutecnica promove a recombinaccedilatildeo in vitro do DNA e foi desenvolvida para gerar genes variantes (mutantes) que codifiquem proteiacutenas com funccedilatildeo nova ou melhorada (STEMMER ET AL 1994 ZHAO e ARNOLD 1997) Trata-se de um processo que envolve diferentes etapas a partir da digestatildeo enzimaacutetica dos genes e produccedilatildeo de pequenos fragmentos de DNA Os fragmentos satildeo hibridizados randomicamente gerando fragmentos maiores que datildeo origem a genes recombinados (mutantes) por meio da amplificaccedilatildeo por PCR (Polymerase Chain Reaction) A aplicaccedilatildeo da teacutecnica resulta em um conjunto de genes mutantes que podem ser traduzidos em novas proteiacutenas de acordo com um propoacutesito especiacutefico como por exemplo para o controle de insetos-praga de culturas de importacircncia agronocircmica Genes para moleacuteculas variantes podem ser submetidos a novos ciclos de shuffling e seleccedilatildeo a fim de gerar um maior nuacutemero de mutaccedilotildees potencializando assim a atividade da proteiacutena Embora a reuniatildeo de muacuteltiplas mutaccedilotildees de interesse em um uacutenico gene possa demandar vaacuterios ciclos de DNA shuffling este processo eacute significativamente mais raacutepido do que o processo de mutaccedilotildees e recombinaccedilotildees associados agrave seleccedilatildeo natural para a fixaccedilatildeo de uma nova caracteriacutestica de interesse que ocorre na natureza
OBJETIVO XE OBJETIVO
Construir bibliotecas de genes para variantes de proteiacutenas entomotoacutexicas utilizando as teacutecnicas de DNA shuffling e selecionar biomoleacuteculas com atividade sobre os insetos-praga do algodoeiro A grandis e S frugiperda visando sua aplicaccedilatildeo no desenvolvimento de plantas GM resistentes a estes insetos-praga
MATERIAL E MEacuteTODOS XE MATERIAL E MEacuteTODOS
1 - DNA Shuffling XE 1 DNA Shuffling
Na construccedilatildeo das bibliotecas de genes cry e de inibidores de (-amilases foram utilizados os genes descritos na tabela 1
Tabela 1 Genes utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas para obtenccedilatildeo de moleacuteculas variantes
O gene cry8Ha foi isolado de uma estirpe de B thuringiensis denominada S811 cuja toxina codificada apresenta atividade para o bicudo do algodoeiro (LC50 = 180 (gmL) O gene cry1Ia12 foi isolado da mesma estirpe cuja toxina Cry apresenta atividade contra A grandis (LC50 = 230 (gmL) e S frugiperda (LC50 = 5 (gmL) O gene cry3Aa foi doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e a toxina expressa natildeo apresenta atividade significativa para nenhum dos dois insetos Os genes (-AI-1 e (AI-2 foram isolados de sementes de P vulgaris codificam para inibidores de (-amilases os quais apresentam diferentes especificidades para insetos-praga de gratildeos armazenados
11 - Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de α-amilases XE 11 Etapas para a construccedilatildeo das bibliotecas utilizando os genes cry e genes para inibidores de -amilases
Etapa 1 (Digestatildeo enzimaacutetica)
Genes Cry 10 (g de DNA foram dissolvidos em 80 (l de tampatildeo de DNAse I (Tris 50 mM pH 75 contendo 1 mM de MnCl2 e 01 mgmL de albumina de soro bovino) com a adiccedilatildeo de 004 unidades da enzima DNase I (Invitrogen 1245 U(L) A reaccedilatildeo ocorreu a 15oC sendo interrompida apoacutes 15 minutos com a adiccedilatildeo de 250 mM de EDTA A fragmentaccedilatildeo total do gene foi confirmada em gel de agarose 25 Os fragmentos contendo tamanhos variados foram purificados em coluna ( PCR purification Kit - QIagen) ou extraiacutedos diretamente do gel de agarose
Genes (-AI(-AI-1 e (AI-2 foram misturados na proporccedilatildeo de 11 resultando num um total de 10 (g A mistura liofilizada dos DNAs foi dissolvida em 80 (l de tampatildeo DNase I e digerida com 003 unidades de DNase I a 15oC por 15 minutos A interrupccedilatildeo da reaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos fragmentos ocorreram como descrito para os genes cry
Etapa 2 (Recombinaccedilatildeo de fragmentos)
Foram adicionados 10 (L do produto da digestatildeo (etapa 1) a 25 l de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo da polimerase Taq Platinum Pfx 1X (Invitrogen) 04 mM de dNTPs e 01 U de Taq Platinum Pfx A reaccedilatildeo foi realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler gradient) programado para 42 ciclos com uma etapa inicial de 2 min a 95oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 1 min a 95 oC 1 min 42 oC 1 min + 5 sciclo a 72 oC e 7 mim de extensatildeo final a 72 oC
Etapa 3 (Amplificaccedilatildeo dos variantes)
Os fragmentos de tamanhos variados (recombinados na etapa 2) foram utilizados como molde na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Foram adicionados 15 microL do produto da reaccedilatildeo da etapa 2 para 100 microL de uma reaccedilatildeo de PCR contendo tampatildeo de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) 1x 02 mM de cada dNTP 25 U de cada uma das enzimas Taq DNA polimerase (Invitrogen) e Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity (Invitrogen) e 08 (M de cada oligonucleotiacutedeo especiacuteficos A reaccedilatildeo foi realizada em 24 ciclos com etapa inicial de 2 min a 95 oC Cada ciclo foi constituiacutedo de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC 45 s a 72 oC 14 ciclos adicionais de 30 s a 95 oC 30 s a 42oC e 45 s a 20 sciclo a 72 oC e 7 min a 72 oC As reaccedilotildees de recombinaccedilatildeo dos fragmentos e amplificaccedilatildeo dos genes de α-AI1 e α-AI2 variantes seguiram as mesmas condiccedilotildees empregadas para os genes cry com exceccedilatildeo da etapa de anelamento que ocorreu a 55oC As reaccedilotildees resultaram em genes variantes contendo o mesmo tamanho dos genes originais
2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias XE 2 - Construccedilotildees das bibliotecas combinatoacuterias
Os produtos da etapa 3 foram digeridos com enzima SfiI e inseridos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS (RADER et al 2001) contendo extremidades tambeacutem franqueadas em SfiI As ceacutelulas de E coli XL1-Blue foram transformadas com estas construccedilotildees e infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (1011 pfumL) Quatro bibliotecas combinatoacuterias foram expressas na superfiacutecie de fagos segundo o procedimento descrito por Barbas et al (2001)
3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display) XE 3 - Seleccedilatildeo das formas ligantes a proteiacutenas especiacuteficas ( Phage display)
31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry XE 31 Seleccedilatildeo dos variantes de genes cry
A seleccedilatildeo foi realizada com base na afinidade destas toxinas por proteiacutenas (receptores) existentes nas BBMV ( Brush Border Membrane Vesicles) do intestino dos insetos As BBMVs foram extraiacutedas do intestino de A grandis e S frugiperda segundo Biber et al (1981) Utilizou-se 100 (g de BBMV para absorccedilatildeo em dois poccedilos de uma placa de microtitulaccedilatildeo a qual foi incubada durante 16 horas a 4oC e 1h a 37oC Os poccedilos sensibilizados com estas proteiacutenas foram bloqueados com o uso de BSA 3 e incubados 1h a 37oC A soluccedilatildeo de bloqueio foi descartada e o cultivo de fagos contendo formas variantes de toxina Cry na superfiacutecie foi imediatamente adicionado Apoacutes uma incubaccedilatildeo de 2 horas a 37oC os poccedilos foram submetidos a um crescente nuacutemero de lavagens usando PBS-Tween 01 para a eliminaccedilatildeo das formas inespeciacuteficas permanecendo aderidas ao alvo apenas as formas que apresentaram alta afinidade As formas variantes com afinidade pelas BBMV foram liberadas em condiccedilotildees de pH aacutecido re-amplificadas e submetidas a novos ciclos de seleccedilatildeo ateacute a ocorrecircncia do enriquecimento da biblioteca O enriquecimento de fagos especiacuteficos foi identificado pelo aumento crescente do tiacutetulo de saiacuteda apoacutes cada ciclo de seleccedilatildeo Este enriquecimento foi confirmado com o teste Fago-Elisa usando anticorpo anti-M13 (BARBAS III et al 2001)
32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs XE 32 Seleccedilatildeo de variantes para (AIs
Os genes da biblioteca combinatoacuteria de variantes para (AIs foram selecionados de acordo com a afinidade pelas (-amilases extraiacutedas do intestino das larvas do bicudo (DEL SARTO et al 2004) Dois poccedilos de uma placa de ELISA foram sensibilizados com 50 (g da enzima cujo procedimento de seleccedilatildeo ocorreu como descrito no item 31
4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas XE 4 Anaacutelise das sequecircncias nucleotiacutedicas
As sequecircncias dos novos genes para as diferentes variantes foram alinhadas com as sequecircncias dos genes originais utilizando programa ClustalW (HIGGINS et al 1994) A traduccedilatildeo das sequecircncias nucleotiacutedicas foi realizada pelo programa Translate ( httpbimasdcrtnihgovmolbiotranslate ) Os alinhamentos possibilitaram a identificaccedilatildeo de mutaccedilotildees reais e mutaccediloes silenciosas
5 Bioensaios XE 5 Bioensaios
Os genes selecionados das bibliotecas para toxinas Cry foram expressos em fagos e avaliados em bioensaios As proteiacutenas recombinantes obtidas da expressatildeo foram incorporadas na dieta artificial de A grandis segundo Praccedila et al (2003) Os bioensaios foram realizados em placas de 6 poccedilos contendo 5mL de dieta artificial esterilizada As placas foram incubadas por sete dias a 28degC com umidade entre 55-60 Apoacutes este periacuteodo de incubaccedilatildeo contou-se o nuacutemero de larvas vivas e mortas
Para testar a atividade das proteiacutenas expressas contra S frugiperda foram utilizadas 480 larvas segundo o protocolo descrito por Praccedila et al (2003) As larvas foram incubadas a 28degC com umidade relativa variando entre 60-80 Apoacutes dois dias de incubaccedilatildeo as larvas receberam uma nova dieta contendo a mesma formulaccedilatildeo Posteriormente as larvas foram avaliadas a fim de se determinar a taxa de mortalidade
No caso dos inibidores de (AIs que necessitam de glicosilaccedilotildees e clivagens proteoliacuteticas para serem ativos (PUEYO et al 1993 YOUNG et al 1999) apoacutes a seleccedilatildeo cada gene mutante foi expresso em plantas de Arabidopsis A atividade e especificidade para os insetos-praga do algodatildeo seratildeo testadas utilizando a determinaccedilatildeo de atividade inibitoacuteria in vitro e in vivo partindo do extrato proteacuteico de plantas de Arabidopsis thaliana (experimento em andamento)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO XE RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
1- Biblioteca de variantes de genes cry XE 1- Biblioteca de variantes de genes cry
Objetivando a identificaccedilatildeo de biomoleacuteculas com atividade contra os insetos A grandis e S frugiperda a cepa S811 ( Bt -Embrapa) que apresenta elevado potencial inseticida foi utilizada para a clonagem dos dois genes denominados cry8Ha1 e cry1Ia12 O gene cry8Ha1 foi isolado pela teacutecnica de Tail-PCR (LIU e WHITTIER 1995) apresentando 60 de similaridade com as outras toxinas Cry8 presentes no banco de dados enquanto que o gene cry1Ia12 foi isolado por meio de PCR com o uso de primers especiacuteficos apresentando 99 de similaridade com as outras toxinas Cry1Ia do banco de dados (MAGALHAtildeES et al 2004ab) Ambos os genes foram expressos em sistema heteroacutelogo Escherichia coli utilizando o vetor de expressatildeo pET101-DTOPO As proteiacutenas recombinantes foram purificadas em coluna de Ni-NTA e suas atividades foram testadas em bioensaios seletivos contra as larvas dos insetos A grandis e S frugiperda segundo protocolo descrito por Praccedila et al (2003) (tabela 2)
O gene para a toxina Cry3Aa1 obtido no Bacillus Genetic Stock Center-EUA foi utilizado devido a sua conhecida atividade entomotoacutexica contra insetos da ordem coleoacuteptera A toxina foi avaliada contra A grandis e nenhuma atividade significativa foi observada (tabela 2)
Tabela 2 Atividade inseticida dos genes de Bt utilizados na construccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias
2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes XE 2 - Construccedilotildees de bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e seleccedilatildeo de variantes
Finalizada a etapa de seleccedilatildeo dos genes a serem empregados estabeleceu-se trecircs estrateacutegias a serem desenvolvidas na obtenccedilatildeo das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry sendo todas geradas pela recombinaccedilatildeo dos genes cry3Aa1 ou cry8Ha1 ou cry1Ia12 Os fragmentos gecircnicos (30-50pb) de cada uma das bibliotecas foram recombinados como descrito na etapa 2 (Materiais e Meacutetodos) gerando novas variantes que foram inseridas no fagomiacutedeo pCOMB3XSS As variantes obtidas em cada biblioteca foram da ordem de 105 a 107 mutantes como descrito na tabela 3
Tabela 3 Tamanho das bibliotecas combinatoacuterias de genes cry e dados da seleccedilatildeo in vitro usando proteiacutenas do intestino de A grandis (AG) e S frugiperda (SF)
As bibliotecas geradas foram utilizadas para selecionar genes para variantes de novas toxinas Cry variantes com atividade entomotoacutexica melhorada sobre os insetos A grandis e S frugiperda As toxinas selecionadas foram avaliadas em bioensaios contra ambos os insetos cujos resultados se encontram nas figuras 1 e 2Tendo como base a quantidade de proteiacutenas expressas pelos fagos a toxina que apresentou maior atividade foi selecionada da biblioteca para o gene cry8Ha1 que apresentou mortalidade de aproximadamente 70 (c8-M3) contra S frugiperda indicando aumento de trecircs ndash quatro vezes na atividade em comparaccedilatildeo com a toxina original (Figura 1B) O mesmo resultado foi observado para as toxinas selecionadas da biblioteca de Cry3Aa11 cujas toxinas (c3-M3 e c3-M5) apresentaram de 60 a 70 de mortalidade contra as mesmas larvas (Figura 1A) Nos bioensaios contra as larvas de A grandis os resultados alcanccedilados utilizando essa mesma biblioteca tambeacutem foram satisfatoacuterios vaacuterias toxinas variantes apresentaram mortalidade superior a 50 (Figura 2) Devido ao baixo niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas na superfiacutecie dos fagos as taxas de mortalidade obtidas nos bioensaios podem ser consideradas resultantes de dose subletal das proteiacutenas Os bioensaios utilizando toxinas selecionadas da biblioteca cry8Ha com atividade para A grandis e toxinas selecionadas da biblioteca cry1Ia12 com atividade para ambos os insetos foram conduzidos da mesma forma e seratildeo publicados apoacutes a validaccedilatildeo estatiacutestica dos resultados
Figura 1 Bioensaios seletivos realizados com larvas de S frugiperda mostrando o niacutevel de mortalidade na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1 (A) e cry8Ha1 (B)
Figura 2 Bioensaios seletivos realizados com larvas de A grandis mostrando a mortalidade das larvas na presenccedila de toxinas selecionadas das bibliotecas de cry3Aa1
Uma vez constatado que o gene Cry3Aa11 original natildeo apresenta atividade inseticida significativa sobre as larvas de A grandis e S frugiperda os resultados obtidos indicam que a teacutecnica de DNA shuffing associada agrave metodologia de seleccedilatildeo Phage display foi bem sucedida na geraccedilatildeo de variantes e possibilitou o isolamento de novas moleacuteculas com melhor atividade entomotoacutexica Em relaccedilatildeo agrave toxina Cry8 natildeo se pocircde determinar com precisatildeo as doses letais (CL50) jaacute que os fagos expressam as toxinas em quantidades muito baixas o que impossibilita uma anaacutelise quantitativa dos dados Dessa forma o proacuteximo passo seraacute expressar os genes selecionados em um sistema de expressatildeo mais eficiente que possibilite maior niacutevel de expressatildeo para determinar com maior precisatildeo a taxa de mortalidade dos insetos
Outra anaacutelise importante foi com relaccedilatildeo ao tamanho e tempo de desenvolvimento das larvas obtidas nos bioensaios de S frugiperda em que as poucas larvas sobreviventes mostraram reduccedilatildeo de 97 no seu tamanho (Figura 3) quando comparadas com o desenvolvimento das larvas do controle negativo sem a presenccedila de toxinas Estes dados indicam que as variantes podem atingir um niacutevel de toxicidade letal desde que seja ajustada a dosagem de proteiacutena recombinante utilizada no bioensaio (experimento em andamento)
Figura 3 (A) Peso das larvas de S frugiperda sobreviventes ao ensaio usando expressatildeo de genes selecionados da biblioteca de variantes para toxinas Cry8 (B) Efeito das proteiacutenas recombinantes no desenvolvimento de S frugiperda
3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de α -AI-1 e α -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes XE 3- Construccedilatildeo de bibliotecas combinatoacuterias de gene de -AI-1 e -AI-2 e seleccedilatildeo de variantes
Uma biblioteca de fagos que expressa formas recombinadas de inibidores de (-amilase foi construiacuteda utilizando-se os genes (AI-1 e (AI-2 Estes inibidores isolados de sementes de feijatildeo apresentam diferentes especificidades na accedilatildeo inibitoacuteria das (-amilases (GROSSI-DE-SAacute et al 1997 SILVA et al 2000) Enquanto (AI-1 inibe a (-amilase pancreaacutetica de porco e as (-amilases dos bruquiacutedeos Callosobruchus maculatus e Callosobruchus chinensis o (AI-2 inibe especificamente a (-amilase do bruquiacutedeo Zabrotes subfasciatus mas natildeo inibe a (-amilase do bicudo do algodoeiro
Os genes foram recombinados a fim de desenvolver e selecionar moleacuteculas com atividade sobre a enzima de A grandis Os novos genes introduzidos no fagomiacutedeo pCOMB3XSS geraram uma biblioteca combinatoacuteria com 37 x 107 transformantes Vinte e sete clones foram sequumlenciados e as anaacutelises indicaram 22 formas variantes apresentando cada uma delas diferente padratildeo de recombinaccedilatildeo Os inibidores (-AI1 e (-AI2 possuem 56 resiacuteduos de aminoaacutecidos natildeo conservados em posiccedilotildees tambeacutem identificadas nos mutantes indicando alta homologia As sequumlecircncias dos mutantes exibidos na representaccedilatildeo esquemaacutetica (Figura 4) foram na sua maioria idecircnticas as do (-AI1 poreacutem apresentam regiotildees intercaladas com sequumlecircncias do (-AI2 Anaacutelises computacionais utilizando os modelos estruturais dos (AIs variantes (estudo em andamento) propiciaratildeo um melhor entendimento sobre os efeitos das mutaccedilotildees na atividade inibitoacuteria
Figura 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do perfil de recombinaccedilatildeo das sequumlecircncias dos 22 mutantes obtidos da seleccedilatildeo contra (-amilase de A grandis As regiotildees em azul referem-se agraves sequumlecircncias do α-AI-1 o vermelho representa sequumlecircncias do α-AI- 2
As variantes previamente selecionadas foram subclonadas no vetor pCAMBIA 2300 sob o controle do promotor 35S do viacuterus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd) e do enhancer do viacuterus do mosaico da alfafa (AMV) Estas construccedilotildees estatildeo sendo usadas para inserccedilatildeo dos genes mutantes gerados pela tecnologia de DNA shuffling em plantas de Arabdopsis thaliana via Agrobacteirum A atividade inibitoacuteria destas moleacuteculas variantes seraacute posteriormente avaliada contra (-amilases de A grandis afim de identificar os inibidores com maior potencial de utilizaccedilatildeo em plantas de algodatildeo GM
CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS XE CONCLUSAcircO E PERSPECTIVAS
Os resultados apresentados neste trabalho reforccedilam a estrateacutegia de combinaccedilatildeo das tecnologias de DNA shuffling e Phage display para a geraccedilatildeo de uma grande quantidade de variantes e seleccedilatildeo de genes codificadores de proteiacutenas e enzimas com atividade melhorada Essas metodologias podem ser aplicadas como alternativa na busca de soluccedilotildees de problemas especiacuteficos como por exemplo aqueles relacionados aos mecanismos de accedilatildeo das moleacuteculas envolvidas no processo de resistecircncia aos insetos-praga
As bibliotecas combinatoacuterias aqui apresentadas permitiram a seleccedilatildeo de vaacuterios genes quimeacutericos com distinta afinidade para as (-amilases e receptores do intestino de larvas de A grandis e S frugiperda Seguindo a metodologia de evoluccedilatildeo molecular os genes variantes selecionados a partir do primeiro ciclo de DNA shuffling estatildeo sendo submetidos a novos ciclos de recombinaccedilatildeo e seleccedilatildeo
Os efeitos das mutaccedilotildees na estrutura-funccedilatildeo das moleacuteculas variantes selecionadas seratildeo explicados nas anaacutelises de modelos tridimensionais construiacutedos por meio de teacutecnicas de modelagem molecular utilizando as coordenadas atocircmicas de estruturas de cristal ou modeladas das moleacuteculas parentais
As proteiacutenas variantes que mostraram atividade toacutexica ou inibitoacuteria in vivo seratildeo extensivamente caracterizadas e consideradas no desenho de construccedilotildees gecircnicas piramidais para aplicaccedilatildeo no programa de melhoramento do algodatildeo quanto agrave resistecircncia a pragas
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13
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13
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13
13
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13
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13
13
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13
13
13
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13
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13
13
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13
13
13
13
13
13
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13
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13
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13
13
13
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13
13
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13
13
13
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13
13
13
13
13
13
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13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
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13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
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13
13
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13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
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13
13
13
13
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13
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13
13
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13
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13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
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13
13
13
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13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
escala 13
1mm13
13
Mortalidade ()13
13
Mortalidade ()13
13
B13
13
A13
13
EMBED ExcelChart8 s 13
13
EMBED ExcelChart8 s 13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
Bioacuteloga ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra ndash Doutoranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Farmacecircutico ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Enga Agra- Mestranda em Biologia Molecular ndash Universidade Federal do Rio Grande do Sul ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Quiacutemico ndash Graduando ndashUniversidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Mestrando em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash Graduando- Faculdade da Terra de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Mestranda em Ciecircncias Genocircmicas e Biotecnologia ndash Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Doutoranda em Biologia Molecular ndash Universidade de Brasiacutelia ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo Doutorando ndash Universidade Catoacutelica ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacuteloga ndash Msc em Biologia Molecular ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Bioacutelogo ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Graduanda em Biologia- FTB13
Enga Agra ndash Msc em Biologia Molecular - Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
Biomeacutedica ndash PhD ndash Embrapa Recursos Geneacuteticos e Biotecnologia13
13
Biblioteca
No variantes
No ciclos seleccedilatildeo
Enriquecimento de fagos(ciclo)
Clones selecionados
AG
SF
AG
SF
cry1Ia12
930 X 105
6
5
5
30
30
cry3Aa1
683 X 105
6
3
4
21
16
c ry8Ha
190 X 107
6
3
3
30
30
Proteiacutenas
CL50
A grandis
S frugiperda
Cry8Ha1
180 (gml
NA
Cry1Ia12
230 (gml
5 (gml
Cry3Aa1
NA
NA
Fonte
Origem
Genes
Referecircncias
Microorganismo
B thuringiensis (Bt)
cry1Ia12
Magalhatildees MTQ et al 2002 2004
cry8Ha1
Magalhatildees MTQ et al 2001
cry3Aa1
Bacillus Genetic Stock Center-EUA
Vegetal
P vulgaris (Feijatildeo comum)
α-AI1e α-AI2
Ishimoto et al 1996 Grossi-de-Saacute et al 1997
Graacutef4
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14175
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84225
Plan1
Plan1
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Plan2
MORTALIDADE ()
TRATAMENTOS
MORTALIDADE ()
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1666
1666
1666
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0
0
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1666
50
Plan3
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TRATAMENTOS
PESO (g)
PESO POR LAGARTA DE Spodoptera frugiperda
TRATAMENTOS
MORTALIDADE ()
BIOENSAIO DOS CLONES CRY8 SHUFFLED CONTRA Spodoptera frugiperda
MORTALIDADE ()
TRATAMENTOS
MORTALIDADE ()
BIOENSAIO DOS CLONES CRY8 SHUFFLED CONTRA Spodoptera frugiperda
PESO (g X 10-2)
6388
14175
483666
024333
018
84225
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Graacutef1
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333
Plan1
Plan1
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1666
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333
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333
Plan2
Plan3
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Plan1
Plan1
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Plan2
Mortalidade ()
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Plan1
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Plan2
Mortalidade ()
Plan3
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2083
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28
cry3
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S-17
S-18
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S-27
S-28
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TRATAMENTOS
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S-27
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TRATAMENTOS
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CRY8 Selvagem
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1666
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1666
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