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Capítulo 3. Materiais e Métodos
Sumário
Neste capítulo descrevem-se os materiais e métodos utilizados durante a dissertação. Inclui-se no
capítulo a caracterização da área de estudo, a construção da base de dados para registar a informação sobre
a micoflora das uvas, e o processo de análise de dados.
1. Área de estudo.............................................................................................................................. 122
2. Plano de amostragem ................................................................................................................... 144
3. Enumeração de fungos filamentosos............................................................................................ 145
4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de Aspergillus........................................... 159
5. Construção duma base de dados para documentação da micoflora das uvas ............................... 161
6. Determinação da OTA em uvas ................................................................................................... 170
7. Avaliação da influência da composição química do estado de maturação e variedade de uva na
produção de OTA .................................................................................................................................. 175
8. Análise dos dados......................................................................................................................... 180
121
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1. Área de estudo
Das 32 regiões demarcadas Portuguesas, seleccionaram-se 4 para recolher uvas e
conduzir o estudo durante 3 anos (2001-2003): 2 no norte do país, Vinhos Verdes e
Douro, e 2 no sul: Alentejo e Ribatejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4). O critério de selecção
baseou-se na diversidade de climas e distribuição geográfica. Em 2003, foram
adicionalmente estudadas amostras da região Demarcada do Dão e da Ilha da Madeira, e
mais um local na região do Douro.
Nesta secção apresenta-se uma caracterização sucinta das regiões estudadas e do tipo
de vinhos nela produzidos. Para informações adicionais podem ser consultados os
seguintes sítios da WWW1: IVV, para informações gerais e legislação sobre todas as
regiões; Comissão Vitivinícola Regional dos Vinhos Verdes (CVRVV) para informações
sobre a região dos Vinhos Verdes; Instituto do Vinho do Porto (IVP), para informações
sobre o vinho do Douro e Porto; Comissão Vitivinícola Regional do Alentejo (CVRA),
para informações sobre vinhos do Alentejo.
1.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes
A região dos Vinhos Verdes localiza-se no noroeste de Portugal (V. Capítulo 2,
figura 2.4), na zona tradicionalmente conhecida como Entre-Douro-e-Minho. Tem como
limites a norte o rio Minho (fronteira com a Galiza), a nascente e a sul zonas
montanhosas que constituem a separação natural entre o Entre-Douro-e-Minho Atlântico
e as zonas do país mais interiores de características mais mediterrânicas, e por último o
Oceano Atlântico que constitui o seu limite a poente.
Orograficamente, a região apresenta-se como “um vasto anfiteatro que, da orla
marítima, se eleva gradualmente para o interior” (Amorim Girão, citado no sítio da
1 URLs: IVV: http://www.ivv.min-agricultura.pt/; CVRVV: http://www.cvrvv.pt/; IVP:
http://www.ivp.pt/pt/index.asp; CVRA: http://www.vinhosdoalentejo.pt/
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CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
CVRVV2), expondo toda a zona à influência do oceano Atlântico, fenómeno reforçado
pela orientação dos vales dos principais rios, que correndo de nascente para poente
facilitam a penetração dos ventos marítimos. Como tal, a região apresenta temperaturas e
amplitudes térmicas moderadas, pluviosidade elevada e insolação baixa.
Durante a vindima, é frequente a ocorrência de chuva, que cria condições
frequentes para o aparecimento de podridão, em particular de Botrytis cinerea, que pode
conduzir à antecipação das vindimas.
É a maior região demarcada nacional, representando 15% da área vitícola
nacional. Os Vinhos Verdes regra geral têm baixo teor alcoólico e são derivados de
mostos medianamente ricos em açúcar, mas ricos em ácido, de pH baixo, com suficientes
teor de azoto. Nestes vinhos as fermentações são totais. O tempo de fermentação
alcoólica de um mosto pode ser prolongado até três a quatro semanas. Os vinhos tintos
são encorajados a fazer a fermentação maloláctica, que consiste na transformação do
ácido málico em ácido láctico.
A Região Demarcada Vinhos Verdes está dividida em 9 sub-regiões: Amarante,
Ave, Baião, Basto, Cávado, Lima, Monção, Paiva e Sousa representadas no mapa
geográfico da Figura 3.1.
Quanto à classificação das Zonas Vitícolas Europeias, a região está inserida na
zona CIa (Regulamento (CE) nº 1493/1999, de 17 de Maio de 1999).
2 URL: http://www.vinhoverde.pt/pt/vinhoverde/regiao1.htm
123
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes (retirado do sítio da CVRVV. URL:
http://www.vinhoverde.pt/pt/vinhoverde/mapaRDVV.htm)
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CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.2. Região Demarcada do Douro
O Douro é das regiões mais antigas do país. Localiza-se no nordeste de Portugal
(V. Capítulo 2, figura 2.4), na bacia hidrográfica do Douro, rodeada de montanhas que
lhe dão características climáticas particulares. A região estende-se por área total de cerca
de 250 000 ha, estando dividida em três sub-regiões naturalmente distintas, por factores
climáticos e sócio – económicos: Baixo Corgo, Cima Corgo e Douro superior (Figura
3.2).
Figura 3.2. Localização das 3 sub-regiões do Douro (retirado do sítio do IVP. URL:
http://www.ivp.pt/pt/Regiao/, acedido a 12/02/05)
O clima da região do Douro é muito distinto da região dos Vinhos Verdes. A
individualidade do Douro deve-se à sua localização, sendo grande a influência que
exercem as serras do Marão e de Montemuro, servindo como barreira à penetração dos
ventos húmidos de oeste. Situada em vales profundos, protegidos por montanhas, a região
caracteriza-se por ter invernos muito frios e verões muito quentes e secos.
O Douro pertence à Zona Vitícola Europeia CIIIb (Regulamento (CE) nº
1493/1999, de 17 de Maio de 1999). Nesta região produz-se vinho do Douro e o vinho do
Porto, que é produzido por paragem da fermentação com adição de aguardente vínica a
77%. O vinho do Porto é um vinho licoroso, e a doçura do vinho advém de açúcares
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CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
naturais nas uvas não fermentados, sem qualquer concentração prévia. O tempo de
fermentação e maceração é muito curto comparado com os outros vinhos (dois a 3 dias)3.
1.3. Região Alentejo
O Alentejo localiza-se no sul de Portugal (V. capítulo 2, Figura 2.4). É a maior
província do país, é limitado a Norte pelo Rio Tejo, a Noroeste pela Estremadura, a Oeste
pelo Oceano Atlântico, a Este pela fronteira com Espanha e a Sul pelo Algarve. A
hidrografia é constituída fundamentalmente pelas bacias do Guadiana e do Sado. Esta
província tem em média 19,9 habitantes por Km2, a mais baixa densidade populacional
de Portugal e uma das mais baixas da Europa. A cultura da vinha tem um papel social
muito importante, o que se evidencia pelo facto dos concelhos com maior área de vinha
serem também aqueles em que a densidade populacional é superior à média da região. A
área de vinha no Alentejo ronda os 13.500 ha, o que corresponde apenas a cerca de 5% da
área dedicada à cultura em todo o país. Encontra-se nos solos mais pobres da região,
sendo uma cultura basicamente estreme, com excepção de algumas vinhas velhas e
encontra-se instalada em terrenos com declives suaves (excepto a zona de Portalegre,
onde predomina a vinha em encosta), cuja exposição dominante é a Sul. Esta província
encontra-se subdividida em quatro unidades, designadas por Alto Alentejo, Alentejo
Central, Baixo Alentejo e Alentejo Litoral. Existe no Alentejo uma Denominação de
Origem Controlada - DOC Alentejo, com oito sub-regiões vitivinícolas: Borba, Évora,
Granja/Amareleja, Moura, Portalegre, Redondo, Reguengos e Vidigueira (Figura 3.3).
Em termos vitícolas, o Alentejo Central é a unidade mais importante uma vez que aqui se
inserem as zonas vitícolas de Borba, Évora, Redondo, Reguengos e parte de
Granja/Amareleja.
3 Para descrição detalhada do processo de vinificação do vinho do Porto, consultar o sítio do IVP. URL:
http://www.ivp.pt/pt/Enologia/enologia1.shtm
126
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.3. Delimitação geográfica das subregiões vitícolas do Alentejo. (retirado do sítio de
clubvintage.com. URL: http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?id=35, acedido a 12/02/05)
As zonas vitivinícolas do Alentejo situam-se na faixa Ibero-Mediterrânea, com
características climáticas mediterrânicas aliadas a uma acentuada continentalidade. O
clima da região é caracterizado por Primaveras e Verões excessivamente quentes e secos.
Os valores relativos à insolação são muito elevados, particularmente no trimestre que
antecede as vindimas, contribuindo para a perfeita maturação das uvas e qualidade dos
vinhos. São de facto condições marcadamente favoráveis à síntese e acumulação dos
açúcares e à concentração de matérias corantes na película dos bagos. A insolação anual é
de aproximadamente 3000 horas. Desde há alguns anos que a grande maioria das vinhas
alentejanas está sujeita a uma prática de protecção integrada, o que reduz
significativamente a utilização de pesticidas, seleccionando os menos tóxicos e
racionalizando ainda a sua aplicação. Em virtude das condições climatéricas existentes na
vindima, a podridão é rara e as principais doenças causadas por fungos são doenças do
lenho, como a esca, escoriose e eutipiose.
Na região produzem-se essencialmente vinhos brancos e tintos. As condições
alentejanas são favoráveis para a sobrematuração dos cachos e, como tal, coloca-se muito
ênfase na determinação correcta da data da vindima.
127
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.4. Região Ribatejo
A região do Ribatejo situa-se acima do rio Tejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4), a
norte de Lisboa. O clima do Ribatejo é sul-mediterrânico temperado, menos quente que o
Alentejo, influenciado pelo rio que a percorre. No Ribatejo, há três regiões de
características diferenciadas: são designadas por lezíria (“campo” ou “borda-d'água”),
bairro e charneca. A lezíria corresponde à planície, inundável pelo rio Tejo. O bairro, na
margem direita do Tejo, adjacente à planície aluvial, surge com um relevo pouco
acentuado, de formações areníticas, calcárias e argilosas que apresentam tonalidades
variadas. A charneca, estende-se da margem esquerda do Tejo até ao Alentejo. É uma
área de solos pobres, condicionando-a a um amplo revestimento florestal de sobreiros,
eucaliptos e pinheiros. O grau alcoométrico volúmico do vinho produzido nesta região
toma valores mais elevados devido ao aquecimento dos bagos pela reflexão do sol nas
areias brancas em que a vinha é implantada. Estão definidas 6 sub-Regiões no Ribatejo:
Almeirim, Cartaxo, Chamusca, Coruche, Santarém e Tomar (Figura 3.4). Todas as sub-
regiões compreendem vinhas na lezíria e/ou bairro, mas apenas as sub-regiões Almeirim,
Chamusca e Coruche têm vinhas na charneca.
Figura 3.4. Localização geográfica das sub-regiões do Ribatejo (retirado de clubvintage.com. URL:
http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?tipo=2, acedido a 12/02/05)
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CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.5. Região Dão
A área geográfica correspondente à Denominação de Origem Dão (V. Capítulo 2,
figura 2.4) fica enquadrada pelas Serras da Estrela, Buçaco, Caramulo, Nave, Lousã e
Açor. As serras dominam a paisagem e formam um verdadeiro anel à volta da Região
Demarcada do Dão. A região do Dão possui um clima bastante chuvoso no Inverno. No
Verão o tempo é quente e seco. Existem também vários microclimas, dependentes da
altitude e da inclinação das zonas. Existem 7 sub-regiões: Alva, Besteiros, Castendo,
Serra da Estrela, Silgueiros, Terras de Azurara e Terras de Senhorim. A região tem
vocação para a produção de espumantes naturais.
1.6. Região Madeira
A ilha da Madeira possui um clima muito seco, com pouca precipitação, e
temperaturas amenas. No entanto, a humidade do ar é elevada. A área geográfica
correspondente à Denominação de Origem "Madeira" abrange toda a ilha. Nesta região
microclimática, de terrenos saibrosos, de solos vulcânicos e basálticos, a vinha cultiva-se
em socalcos, nas encostas soalheiras, principalmente na zona sul da Ilha da Madeira. É
aqui que se produz o vinho da Madeira, um vinho licoroso de fabrico semelhante ao
vinho do Porto, mas com um processo de envelhecimento muito mais complexo, que
envolve o aquecimento do vinho por “estufagem” até aproximadamente 45 a 50 ºC. O
Vinho da Madeira aquando das descobertas marítimas portuguesas tomou os nomes de
Vinho da Volta, Vinho da Roda da Índia, Vinho da Roda e ainda Vinho da Torna
Viagem. O vinho era exportado para outros continentes de barco. Verificou-se ao
regresso do barco que o vinho que não foi vendido tinha qualidade superior à de quando
foi enviado. Quando passava pelas regiões quentes e com os balanços dos navios, o vinho
sofria um envelhecimento prematuro e vantajoso. Desta forma conseguia-se envelhecer
um vinho em poucos meses, o que em situações normais levaria muitos anos a
envelhecer. O processo de estufagem deriva desta descoberta.
129
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.7. Locais estudados
Em cada região, seleccionaram-se 1 a 3 quintas para estudo. Em 2003, incluíram-se
quintas de 2 regiões adicionais: Madeira e Dão, exclusivamente na vindima. No Douro
superior, foi incluído um local extra, com condições climatéricas diversas. No total,
foram estudados 12 locais (Tabela 3.1).
Tabela 3.1. Locais donde foram recolhidas amostras de uvas em cada região e sub-região
Região Sub-região Locais estudados
Localidade mais próxima Latitude
(GMS)
Longitude
(GMS)
Alentejo Évora Évora 38° 33' 38" N 7° 54' 30" W
Reguengos Reguengos de Monsaraz 38° 25' 27" N 7° 32' 04" W
Dão Silgueiros Viseu 40° 39' 39" N 7° 54' 34" W
Douro Baixo Corgo Régua 41° 09' 30" N 7° 47' 02" W
Cima Corgo Pinhão 41° 11' 35" N 7° 32' 51" W
Douro superior Sra. da Ribeira 41° 09' 30" N 7° 14' 51" W
Madeira Câmara de Lobos 32° 38' N 16° 56' W
Ribatejo Almeirim Almeirim 39° 12' 34" N 8° 37' 46" W
Vinhos Verdes Monção Melgaço 42° 06' 49" N 8° 15' 36" W
Lima Arcos de Valdevez 41° 50' 50" N 8° 25' 14" W
1.8. Caracterização climática e bioclimática dos locais de
estudo
No modelo bioclimático de Rivas-Martinez, os principais parâmetros bioclimáticos
que condicionam a distribuição das espécies são a temperatura e a precipitação. Os dados
climatológicos usados para caracterização climática dos locais foram os das estações
meteorológicas mais próximas (Tabela 3.2), com base nas normais climatológicas de
1951-1980 do Instituto de Meteorologia para todos os locais à excepção da Madeira, em
que as normais a que tivemos acesso foram as de 1931-1960. As normais climatológicas
130
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
correspondem aos dados de 30 anos de estudos climáticos. No sítio do Instituto de
Metereologia, foi possível conseguir cartas com a representação gráfica da distribuição
geográfica da temperatura e precipitação com base nas normais de 1961-1990.
Tabela 3.2. Estações meteorológicas donde se obtiveram os dados climatológicos para caracterização dos
locais onde foram recolhidas uvas
Código Estação Período Localização
Latitude Longitude
A Funchal 1931-1960 32º 38´N 16º 55´W
B Régua 1951-1980 41º 10´N 7º 48´W
C Pinhão/S. Bárbara 1951-1980 41º 10´N 7º 33´W
D Viseu 1951-1980 40º 40´N 7º 54´W
E Monção/Valinha 1967-1980 42º 04´N 8º 23´W
F Braga/Posto agrário 1951-1980 41º 33´N 8º 24´W
G Santarém/Escola Agrícola 1951-1980 39º 15´N 8º 42´W
H Évora 1951-1980 38º 34´N 7º 54´W
I Évora/Mitra 1951-1980 38º 32´N 8º 01´W
J Évora/Currais 1951-1980 38º 31´N 7º 47´W
1.9. Regime de temperaturas
As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão
indicadas na Figura 3.5 e na Tabela 3.3.
Da Figura 3.5 e da Tabela 3.3 observa-se que nos locais estudados as
temperaturas no Verão podem ir até próximo dos 40 ºC. O mês mais quente do ano é
normalmente Julho e mais raramente Agosto. O mês mais frio no Continente é
invariavelmente Janeiro, e na Madeira é Fevereiro. O local mais quente é o Pinhão,
seguido de Évora e Régua. Viseu e Braga são relativamente frescos no Verão, com as
temperaturas a rondar os 20 ºC. Monção no Verão é mais quente que Braga. Viseu é o
local em que as temperaturas são mais frias no Inverno. Em geral, o Inverno é pouco
rigoroso, mas ocasionalmente atingem-se temperaturas negativas. O local com menor
amplitude térmica é o Funchal, na ilha da Madeira. No território continental, os locais
131
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
mais interiores têm maiores amplitudes térmicas que os mais litorais. A amplitude
térmica mais elevada foi registada no Pinhão.
E
B-C F
G
D
H-J
E
B-C F
G
D
H-J
E
B-C F
G
D
H-J
Figura 3.5. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios da temperatura do
ar em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- temperatura mínima
anual; centro- temperatura média anual; direita- temperatura máxima anual. As letras representam a
localização aproximada das estações meteorológicas respectivas utilizadas neste estudo
132
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.3. Dados termoclimáticos principais relativos às estações meteorológicas estudadas.
T=temperatura média anual; MQ=mês mais quente do ano; Tmax=temperatura média de MQ;
Max=temperatura máxima absoluta; MF=mês mais frio do ano; Tmin=temperatura média de MF;
M=temperatura média das máximas de MF; m=temperatura média das mínimas de MF; Min=temperatura
mínima absoluta; AT=amplitude térmica anual; Min<0=valores médios de n.º de dias/ano com
temperaturas negativas; Max>25=valores médios de n.º de dias/ano com temperaturas superiores a 25 ºC
Estação T MQ Tmax Max MF Tmin M m Min AT Min<0 Max> 25
A 18,7 Agosto 22,1 37,4 Fevereiro 15,3 18,5 13,1 4,4 6,7 0 29
B 17,7 Julho 23,0 42 Janeiro 8,1 12,5 3,6 -6,5 14,9 17,9 125,6
C 15,6 Julho 24,4 42,1 Janeiro 7,9 12,5 3,5 -5 16,5 16,1 129,6
D 13 Julho 20,5 38,5 Janeiro 6,6 11,1 2,1 -8,5 13,9 32,8 87,5
E 14,4 Julho 21,4 39 Janeiro 8,6 12,5 4,7 -5 12,8 4,6 82,3
F 14 Julho 20,2 38,9 Janeiro 8,7 12,8 4,5 -4,1 11,5 11,9 81,3
G 16 Agosto 22,8 42,2 Janeiro 9,9 14,4 5,5 -4,5 12,9 5,2 123,0
H 15,6 Agosto 23 40,6 Janeiro 9,3 12,5 6,1 -5 13,7 1,8 105,8
I 15,4 Agosto 23,1 41,6 Janeiro 8,6 13,4 3,8 -7,1 14,5 11,0 118,7
J 15,6 Julho 23,4 42,3 Janeiro 8,8 13,6 4 -5,6 14,6 13,4 135,0
1.10. Regime de precipitações
As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão
indicadas na Figura 3.6 e na Tabela 3.4.
Os únicos locais com precipitações elevadas são Viseu, Braga e Monção. Estes
locais estão incluídos na região do Dão e Vinhos Verdes, que são muito chuvosas. Dos
locais estudados, o mais seco é o Funchal, na Ilha da Madeira. Os meses mais secos no
Verão são Julho e Agosto.
133
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
E
B-C F
G
D
H-J
E
B-C F
G
D
H-J
E
B-C F
G
D
H-J
Figura 3.6. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios anuais da
precipitação em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- quantidade
de precipitação anual (mm); centro- nº de dias com precipitação superior a 1 mm; direita- nº de dias com
precipitação superior a 10 mm. As letras representam a localização aproximada das estações
metereológicas respectivas utilizadas neste estudo
134
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.4. Dados ombroclimáticos principais relativos às estações climatológicas analisadas.
P=precipitação total anual; MCh=mês mais chuvoso do ano; Pmax=precipitação total de MCh; MS=mês
mais seco do ano; Pmin=precipitação total de MS; Max=precipitação diária máxima; P0,1=número de
dias/ano com precipitação (P>0,1mm); P10=número de dias/ano com precipitação abundante (P>10mm).
Estação P Mch Pmax MS Pmin Max P0,1 P10
A 513,7 Novembro 81,0 Julho 1,4 107,0 65 16
B 950 Fevereiro 136,3 Julho 11,4 83,8 110,7 33,2
C 671,7 Fevereiro 91,7 Agosto 10,8 63,7 95,2 23,9
D 1229,3 Fevereiro 176,7 Julho 13,9 112,0 116,0 44,1
E 1235,4 Janeiro 209,8 Agosto 17,9 76,7 137,7 43,9
F 1514,8 Janeiro 217,1 Julho 20,9 114,0 130,4 52,3
G 736,9 Janeiro 109,4 Julho 3,6 104,5 97,6 25,2
H 642,6 Janeiro 94,4 Agosto 3,0 86,4 100,6 21,6
I 664,6 Janeiro 97,7 Julho/Agosto 3,1 93,3 85,1 23,0
J 567,4 Janeiro 80,7 Agosto 2,4 49,0 97,4 18,7
1.11. Insolação
O número de horas de luz (tempo de sol descoberto) é importante para a cultura
da vinha e maturação das uvas. Os valores de insolação estão indicados na Tabela 3.5.
Da Tabela 3.5 observa-se que os locais Santarém e Évora no sul de Portugal são
as que registam níveis de insolação mais elevados.
135
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.5. Dados relativos à insolação das estações climatológicas analisadas. It=insolação total anual;
MImax=mês com maior insolação do ano; I%=percentagem registada de insolação face a insolação máxima
possível calculada com base em tábuas astronómicas; - dados não obtidos
Estação It MImax I%
A 2431,5 Agosto 61
B 2294,6 Julho 74
C 2332,6 Julho 70
D 2532,6 Julho 74
E - - -
F - - -
G 2701,6 Julho 81
H 2869,5 Julho 85
I - - -
J - - -
1.12. Temperatura e precipitação em Setembro
Setembro é regra geral o mês das vindimas, momento em que as uvas estão
maduras, e mais susceptíveis ao ataque de fungos. Por isso, interessa conhecer as
condições climáticas nesta altura do ano. A temperatura e precipitação registadas no mês
de Setembro nas estações climatológicas consideradas estão indicadas na Tabela 3.6.
As temperaturas registadas no mês de Setembro são relativamente elevadas,
rondando os 20 ºC. Os valores de precipitação mais elevados foram observados em
Braga, na região dos Vinhos Verdes. Estas condições favorecem a podridão por fungos,
em particular por B. cinerea. No Funchal e em Évora, registaram-se os níveis de
precipitação mais baixos.
136
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.6. Temperaturas médias (T), média das temperaturas máximas (Max) e mínimas (Min), e
precipitação total (P) do mês de Setembro registadas nas estações climatológicas consideradas
Estação T Max Min P
A 22,0 24,7 19,4 24,0
B 20,6 28,3 12,8 40,9
C 21,4 28,9 13,9 36,2
D 18,0 25,1 10,8 56,8
E 19,2 25,4 13,1 55,4
F 18,4 24,9 11,8 77,7
G 21,2 28,3 14,1 33,4
H 21,1 26,9 15,3 25,0
I 20,9 28,2 13,6 27,7
J 21,2 29,0 13,4 19,3
1.13. Caracterização bioclimática dos locais estudados
A caracterização bioclimática foi feita de acordo com os índices e critérios de
Rivas-Martinez seleccionados por Honrado (2003), indicados no anexo I. Na Tabela 3.7
encontra-se descrita a diagnose climática dos locais das estações meteorológicas.
Da diagnose bioclimática resultante temos que as estações metereológicas
pertencem todos ao mesmo bioclima, Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico, com a
excepção de Braga, que é de macrobioclima temperado na sua variante Submediterrânica.
Existe uma diversidade considerável de climas onde se localizam as estações
metereológicas, quanto às amplitudes térmicas, temperatura e precipitação. Regra geral,
as estações localizadas mais no interior do país têm uma continentalidade mais
acentuada. A maior parte dos locais pertence ao termotipo Mesomediterrânico inferior,
mas o Funchal e Santarém registaram valores de temperatura totais mais elevados,
pertencendo ao termótipo Termomediterrânico. Os locais mais húmidos são Viseu,
Monção e Braga. No Douro, o Pinhão é mais seco que a Régua, e no Sul, Santarém mais
húmido que Évora.
137
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.7. Diagnose bioclimática dos locais das estações meteorológicas
Estação Bioclima Continentalidade Termotipo Ombrótipo
A Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Eu-hiperoceânico Termomediterrânico
inferior
Seco inferior
B Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
inferior
Sub-húmido
inferior
C Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
inferior
Seco superior
D Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
superior
Húmido
inferior
E Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico
inferior
Húmido
inferior
F Submediterrâneo Oceânico Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico
inferior
Húmido
superior
G Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Semi-hiperoceânico Termomediterrânico
superior
Sub-húmido
inferior
H Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
inferior
Seco superior
I Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
inferior
Seco superior
J Mediterrânico
Pluvio-estacional Oceânico
Euoceânico Mesomediterrânico
inferior
Seco superior
1.14. Castas
Para este estudo, foram seleccionadas castas brancas e tintas recomendadas para
as regiões. Ao todo, foram analisadas 13 castas nacionais, 10 tintas e 3 brancas (Tabela
3.8). As únicas castas brancas analisadas foram Alvarinho e Loureiro na região dos
Vinhos Verdes e Boal na Ilha da Madeira. Para fins comparativos, incluiu-se no estudo
Cabernet Sauvignon, uma casta autorizada em muitas regiões portuguesas, neste caso
proveniente do Ribatejo e Dão. A designação das castas foi a recomendada pelo livro da
sinonímia das castas do IVV.
138
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.15. Vinhas amostradas
No total, foram estudadas 17 vinhas. A localização e casta estão indicadas na Tabela
3.8.
Tabela 3.8. Vinhas e castas estudadas entre 2001 e 2003
Código da vinha Região Local Código da Quinta Casta
1 Vinhos Verdes Melgaço V1 Alvarinho
2 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Loureiro
3 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Vinhão
4 Douro Régua Do1 Tinta Barroca
5 Douro Pinhão Do2 Touriga Franca
6 Douro Sra. da Ribeira Do3 Tinta Barroca
7 Ribatejo Almeirim R1 Periquita
8 Ribatejo Almeirim R2 Tinta Miúda
9 Ribatejo Almeirim R2 Cabernet Sauvignon
10 Alentejo Reguengos A1 Aragonês
11 Alentejo Évora A2 Periquita
12 Douro Cedovim Do4 Mistura
13 Dão Viseu Da1 Cabernet Sauvignon
14 Dão Viseu Da2 Touriga Nacional
15 Alentejo Évora A1 Trincadeira
16 Madeira Câmara de Lobos M1 Boal
17 Madeira Câmara de Lobos M1 Tinta Negra Mole
1.16. Caracterização climática dos anos de estudo
A caracterização geral anual será feita de acordo com as indicações fornecidas
pelo Instituto de Metereologia4, nos períodos entre Setembro a Agosto do ano seguinte.
4 URL do sítio: http://www.meteo.pt; URL da página consultada:
http://www.meteo.pt/InformacaoClimatica/Anos/Anos.htm
139
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Fornecem-se adicionalmente as informações específicas para o mês de Setembro de cada
ano.
1.16.1. Setembro de 2000 a Agosto de 2001
A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) foi superior aos valores
das normais 1961-90 em todo o território continental, com excepção da região de Faro
onde foi um pouco inferior ao valor normal. Os meses que mais contribuíram para a
quantidade de precipitação anual foram Dezembro, Janeiro e Março. Registaram-se
valores da temperatura do ar superiores aos valores das normais climatológicas em todo o
território continental, excepto na região de Vila Real, onde a temperatura máxima foi
ligeiramente inferior.
1.16.2. Setembro de 2001 a Agosto de 2002
Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas
médias superiores aos valores médios em todas as regiões estudadas. A quantidade de
precipitação esteve acima dos valores normais na região de Lisboa e nas regiões a sul do
rio Tejo, com excepção das regiões de Alvalade e Portalegre. Nas restantes regiões do
território a quantidade de precipitação foi igual ou inferior aos valores médios.
A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) esteve abaixo dos
valores médios das normais 1961-90. No ano anterior (2000/01) verificou-se a situação
contrária.
Registaram-se valores da temperatura média do ar ligeiramente inferiores aos
valores das normais climatológicas no interior da região norte e superiores no restante
território, com os maiores desvios positivos na região de Portalegre.
140
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
1.16.3. Setembro de 2002 a Setembro de 2003
Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas
máximas e médias muito inferiores aos valores médios em quase todo o território.
Os valores da quantidade de precipitação foram muito superiores aos valores médios.
Excederam-se, nalguns locais, os totais mensais e os máximos diários de precipitação até
agora registados em Setembro. A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto)
esteve acima dos valores médios das normais 1961-90 em todo o território, com excepção
das regiões de Elvas e Beja, onde esteve acima do valor das normais climatológicas.
Registaram-se valores da temperatura média do ar superiores aos valores das normais
climatológicas em todo o território. Registaram-se também, no mês de Agosto, alguns
máximos absolutos da temperatura máxima diária.
O mês de Setembro de 2003 caracterizou-se por temperaturas superiores aos valores
médios em todo o território.
Os valores da quantidade de precipitação foram inferiores aos valores médios em
todas as regiões continentais estudadas.
1.17. Estados de maturação estudados
Durante o período de maturação do bago, entre Junho e Outubro, foram colhidas
amostras em 3 estados de maturação: bago ervilha, pintor e vindima. Os estados de
maturação foram-nos indicados pelos viticultores.
1.18. Total de amostras de uvas analisadas
Na Tabela 3.9 estão indicadas as datas de colheita de todas as amostras usadas
para este estudo.
141
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.9. Data de colheita de amostras de uvas em todos os estados de maturação e vinhas
Vinha Bago ervilha Pintor Vindima
2001 2002 2003 2001 2002 2003 2001 2002 2003
1 27-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 18-09 12-09 12-09
2 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 14-09 - 12-09
3 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 27-09 18-09 24-09
4 13-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 16-09 07-09
5 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 26-09 24-09 27-09
6 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 11-09 07-09
7 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 21-09 13-09 10-09
8 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09
9 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09
10 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 -
11 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 20-08
12 - - - - - - - - 06-10
13 - - - - - - - - 07-10
14 - - - - - - - - 07-10
15 - - - - - - - - 20-08
16 - - - - - - - - 08-09
17 - - - - - - - - 08-09
Salientam-se as seguintes observações quanto à data de recolha das amostras:
• o estado de bago ervilha atingiu-se mais cedo no ano de 2001 comparativamente
aos outros anos. Em 2002 e 2003 não foi possível obter amostras do Alentejo,
situação que se solucionou na recolha de amostras subsequentes;
• O pintor atingiu-se muito tardiamente em 2002 na região dos Vinhos Verdes,
quase com 1 mês de diferença face aos outros anos no mesmo local;
• A vindima da vinha 5 no Douro faz-se aproximadamente 10 dias mais tarde que
as vinhas 4 e 6;
• A casta Vinhão matura mais tardiamente que o Loureiro, e é colhida duas
semanas mais tarde. Em 2002, não foi possível obter amostra de Loureiro devido
a chuvas súbitas que aumentaram o risco de podridão, e as vindimas foram
antecipadas sem aviso;
142
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
• A data da vindima no Alentejo variou consideravelmente, sendo a vindima mais
tardia feita no ano de 2001.
Na Tabela 3.10 está indicado o número de amostras totais em cada ano, região e
estado de maturação.
Tabela 3.10. Número de amostras analisadas em cada ano, região e estado de maturação
Região Amostras recolhidas
Bago ervilha Pintor Vindima
Tota
l
01 02 03
Tota
l 01 02 03
Tota
l 01 02 03
Tota
l
Alentejo 2 0 0 2 2 2 2 6 2 2 2 6 14
Douro 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 4 10 28
Ribatejo 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 3 9 27
V.Verdes 3 3 3 9 3 3 3 9 3 2 3 8 26
Dão 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2
Madeira 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2
Total 11 9 9 29 11 11 11 33 11 10 16 37 99
1.19. Análise de mostos
Em 2001, foram recolhidas amostras de mostos de uva destinados ao fabrico de
vinho em 3 fases distintas: i) antes da adição comercial de sulfuroso; ii) após adição
comercial de sulfuroso; iii) após início de fermentação. As amostras foram cedidas
por adegas nas regiões de: Vinhos Verdes, na sub-região de Monção e de Arcos de
Valdevez; Douro, no Cima Corgo; Ribatejo, em Almeirim. As amostras foram
retiradas de preferência imediatamente antes do transporte. Quando não foi possível,
as amostras foram refrigeradas até transporte e transportadas para o laboratório nas
mesmas condições que as uvas.
143
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.11. Amostras de mosto analisadas em 2001
Sub-região Mosto
Antes SO2 Depois SO2 Depois fermentação
Arcos de Valdevez - 1 tinto
1 branco
1 tinto
1 branco
Almeirim 1 tinto 1 tinto -
Cima Corgo 1 tinto 1 tinto -
Monção 1 branco 1 branco -
2. Plano de amostragem
As amostras são constituídas por 10 cachos de uva colhidos ao longo de dois
transeptos diagonais previamente traçados na vinha, consoante indicado na Figura 3.7.
Figura 3.7. Esquema do plano de recolha de 10 cachos na vinha ao longo de 2 transectos diagonais
A escolha dos locais de amostragem na vinha foi definida à priori. A escolha do
cacho na planta não obedeceu a nenhum critério particular de localização. Foram
colhidos cachos para análise sem podridão aparente, representativos dos estados
144
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
observados na vinha. Quando foram detectados cachos com podridão, estes foram
colhidos e analisados à parte.
2.1. Colheita dos cachos
Sempre que possível os cachos foram colhidos com tesouras de poda usadas nas
vinhas, tocando o mínimo possível nos cachos. O cacho, ainda preso à vinha, era
colocado num envelope de papel A4 de fole com abertura lateral aberto pela primeira vez
no momento da colheita e com a tesoura de poda cortou-se o engaço. O envelope foi
imediatamente fechado após o acto de colheita.
2.2. Transporte para o laboratório
Os envelopes fechados foram colocados numa arca refrigeradora com
termoacumuladores e transportados de carro até ao laboratório. O tempo que decorreu
entre a colheita dos cachos e a chegada ao laboratório foi entre 1 a 6 horas. As amostras
colhidas na ilha da Madeira foram colocadas em caixas rígidas e transportadas de avião,
num intervalo de 3 a 4 horas entre a colheita e a chegada ao laboratório.
3. Enumeração de fungos filamentosos
Para detecção de fungos nas uvas, usaram-se métodos de plaqueamento. Usaram-se
placas de Petri de plástico, triplamente ventiladas para permitir aerificação, de 94 mm de
diâmetro e 16 mm de altura, estéreis, da Greiner (referência 633180). Usaram-se dois
procedimentos: plaqueamento directo das uvas sem desinfecção superficial e com
desinfecção superficial, que se descrevem de seguida:
145
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Plaqueamento directo sem desinfecção superficial. De cada cacho, foram
seleccionados aleatoriamente 5 bagos, cortaram-se ao meio e colocaram-se
assepticamente em placas de Petri com meio de cultura (Figura 3.8). O processo decorreu
à chama, com bisturi e pinça flamejados.
Plaqueamento directo com esterilização superficial. De cada cacho, foram
seleccionadas aleatoriamente 5 bagos, colocados num matraz de 250 ml. Adicionou-se
uma solução de lixívia comercial com 4% de cloro diluída 10 vezes até perfazer 250 ml,
mexendo com uma pinça durante alguns segundos. Cobriu-se com um vidro de relógio e
deixou-se estar durante 2 minutos, agitando algumas vezes. No fim deste tempo,
decantou-se a solução e plaquearam-se as uvas imediatamente, conforme recomendado
por Pitt e Hocking (1997).
Meio de cultura. O meio de cultura para isolamento usado foi DRBC, Dichloran Rose
Bengal Chloramphenicol agar (Oxoid CM727). O DRBC é um meio de cultura adequado
à análise de fungos filamentosos em alimentos frescos com elevada actividade de água
como frutos (Pitt & Hocking, ob. cit.). Este meio contém rosa de bengal e diclorano, que
restringem o crescimento dos fungos sem afectar a germinação. A combinação destes
inibidores restringe o crescimento de espécies fúngicas de crescimento galopante, como
Rhizopus e Mucor, que tem um crescimento muito rápido reduzindo o tempo de vida da
placa de isolamento. No entanto, com a presença de uvas no meio de cultura, nem sempre
foi possível controlar o crescimento destes fungos (Figura 3.9). A presença de
cloranfenicol previne o crescimento de bactérias. Este meio é fototóxico (Chilvers et al.,
1999) e foram tomadas precauções no sentido de minimizar a sua exposição à luz.
Condições de incubação. As placas foram incubadas no escuro numa estufa a 25 ºC,
aproximadamente 7 dias, voltadas para cima, não seladas.
Detecção e registo de fungos filamentosos observados. A partir do 2º dia de incubação,
as placas foram monitorizadas diariamente ou de dois em dois dias ao estereomicroscópio
para a presença de fungos filamentosos. Sempre que possível, a identificação até ao
146
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
género era feita ao estereomicroscópio, com base na presença de estruturas de reprodução
especializadas, e o género presente registado na placa, conforme indicado na Figura 3.8.
Figura 3.8. Placa de isolamento com 5 dias de incubação onde se observam fungos do género Penicillium a
crescer em uvas
Figura 3.9. Placa de isolamento ao fim de 5 dias de incubação invadida por Rhizopus sp.
Sempre que se detectou micélio estéril, as placas foram colocadas debaixo de luz
negra para induzir a esporulação, numa dispositivo desenhado para o efeito. A presença
de micélio estéril não foi registada, visto que nenhuma informação pode ser inferida
acerca da presença destes fungos. A informação dos géneros detectados em cada bago é
147
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
possível através duma referência na tampa da placa e base da placa, que se faz coincidir.
Desta forma, no final do tempo de incubação, o número de partículas em que foi
detectada a presença de cada espécie é registado. No caso de placas contaminadas com
fungos de crescimento rápido como Mucorales, quando não foi possível avaliar o número
de bagos colonizados, considerou-se por defeito 1 bago colonizado com a espécie
invasiva.
3.1. Isolamento de fungos das uvas
Exemplares representativos de cada género, géneros não identificados, e todos os
exemplares de Aspergillus e Penicillium foram isolados com agulha, à chama. Nalguns
casos o processo realizou-se ao estereomicroscópio. O inóculo foi transferido com uma
agulha esterilizada à chama duma área jovem da colónia para meios de malte (MEA),
aveia (OA), agar de Czapek (CZ), agar de Czapek com extracto de levedura (CYA) ou
água da torneira (TWA) com papel de filtro, conforme o grupo taxinómico, como
indicado na Tabela 3.12. A pureza da colónia obtida foi verificada por inspecção visual
cuidada ao estereomicroscópio.
Tabela 3.12. Meios de cultura em que foram isolados os fungos dos diferentes grupos taxonómicos
detectados
Grupo taxonómico Meio de cultura
Ascomycetes (Neurospora, Chaetomium) OA, TWA com papel de filtro
Aspergillus CZ, CYA
Coelomycetes OA
Dematiáceos OA
Eurotium CYA20S, M40Y
Fusarium TWA com papel de filtro
Penicillium MEA
Zygomycota MEA
148
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.2. Meios de cultura usados no isolamento de estirpes
A formulação dos meios de cultura MEA, CZ, CYA, CYA20S será apresentada na
secção 3.5 do presente capítulo. A formulação dos meios OA e TWA com papel de filtro
encontra-se descrita no livro de Santos et al. (1998). A formulação de M40Y é indicada
no catálogo da colecção de culturas alemã DSMZ na lista de meios de cultura (M40Y:
meio nº 187) que pode ser acedido electronicamente5. Esterilizaram-se os meios de
cultura a 121 ºC, 15 minutos na autoclave.
• OA:meio de agar com aveia
30 g de flocos de aveia
15 g de agar Nº3 (Oxoid L13)
Água destilada
Cozer os flocos de aveia em lume brando durante cerca de 2 horas. Filtrar por um pano de algodão
fino. Medir e completar o volume com água até perfazer um litro. Acrescentar o agar e esterilizar.
• M40Y: meio para fungos osmofílicos
400 g de sacarose (extra pura, Merck)
20 g de extracto de malte (Oxoid, L39)
5 g de extracto de levedura (Difco 212750)
20 g de agar Nº3 (Oxoid L13)
1l de água destilada
• TWA com papel de filtro: meio de agar com água da torneira com papel de
filtro
15 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
papel de filtro
1l de água da torneira
5 URL: http://www.dsmz.de/media/media.htm (acedido em 12/02/05)
149
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Autoclavar a água com o agar. À parte, cortar e esterilizar rectângulos de papel de filtro. Após o
meio vertido nas placas solidificar, adicionar um rectângulo de papel de filtro.
3.3. Conservação das estirpes isoladas
Estirpes representativas dos géneros encontrados, das espécies de Penicillium
identificadas e todas as estirpes de Aspergillus isoladas foram conservadas, para
construção duma colecção de fungos isolados de uvas portuguesas para documentação e
futuros estudos. A conservação de estirpes dos grupos encontrados não apresenta
dificuldades de maior visto que produzem abundantemente esporos. Inicialmente, as
estirpes isoladas foram conservadas em gel de sílica ou em tubo com meio de cultura a 4
ºC, conforme descrito por Santos (2004). Mas rapidamente se verificou que para o
número de estirpes isoladas, estes métodos eram muito dispendiosos em termos de
espaço. Como tal, adoptou-se por conservar as estirpes a – 80 º C.
3.3.1. Conservação a –80 ºC
Material: Glicerol (p.a., aproximadamente 87%, Merck)
Frascos universais de vidro de 30 ml
Pipetas Pasteur de vidro estéreis
Criovials de 2 ml (Nalgene)
Canetas de frio
Missangas
Cryo Freezing Container (Nalgene)
2- propanol (p.a., Merck) Criovials com missangas. As missangas foram adquiridas em casas comerciais. Lavaram-se
abundantemente com água corrente e deixaram-se numa solução de ácido clorídrico a 2% durante a noite.
No dia seguinte, foram novamente lavadas com água corrente, mergulhadas em água destilada, e de seguida
foram secas numa estufa. Depois de completamente secas, foram autoclavadas em frascos de vidro
150
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
transparente a 121 ºC, 15 minutos. Os crivials foram enchidos até ¼ da sua capacidade com as missangas
numa câmara de fluxo laminar, e fechados.
Frascos com glicerol. Autoclavaram-se alíquotas de 10 ml duma solução de glicerol 10% em
frascos de vidro de 30 ml.
Procedimento: Duma cultura pura em placa, de aspecto saudável e bem esporulada, faz-se uma suspensão de
esporos em glicerol a 10% previamente esterilizado a 121 ºC, 15 minutos, da seguinte forma: com uma
pipeta Pasteur estéril, coloca-se aproximadamente 1 ml da solução de glicerol numa área da colónia. A
solução fica em forma de gota, devido à hidrofobicidade dos esporos, e com a pipeta Pasteur, soltam-se
os esporos dessa área raspando a ponta da pipeta na colónia, e aspira-se de seguida a suspensão.
Coloca-se a suspensão em criovials de 2 ml contendo missangas previamente lavadas e esterilizadas
até ¼ do frasco, a cobrir as missangas. Colocam-se os frascos no Cryo Freezing Container, um
recipiente com 2-propanol que permite o arrefecimento dos criovials a uma taxa controlada de 1 grau
por minuto na arca a -80 ºC. Para obter a estirpe no estado activo, retira-se os criovials da arca,
mantêm-se no recipiente gelado até manuseamento, aquece-se a porção superior das missangas com o
calor das mãos e, com ajuda duma agulha esterilizada, retira-se uma missanga para uma placa com
meio de cultura voltando a congelar o frasco. Desta forma, um criovial permite vários
rejuvescenimentos (Figura 3.10). A técnica mostrou-se eficaz, visto que todas as estirpes
rejuvenescidas estavam viáveis. Por cada estirpe, foram guardados dois criovials, para fazerem parte
do banco de células de trabalho (BT) e banco de células de colecção (BC). No caso de culturas que não
esporulam abundantemente, cortou-se o meio de cultura com fungo crescido e colocam-se porções no
criovial com a solução. Neste caso, um criovial serve para um rejuvescenimento, e foram guardados 6
criovials, 3 em cada banco.
Figura 3.10. Cultura de Aspergillus rejuvenescida a partir da missanga (centro da colónia) dum criovial a
-80 ºC
151
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.3.2. Conservação em gel de sílica (Santos, 2004)
Material: Frascos universais de 30 ml
Silica gel
Leite desnatado em pó (Oxoid, L31)
Pipetas Pasteur de vidro
Procedimento: Prepara-se uma solução de leite desnatado a 5% e autoclava-se a 121 ºC durante 5
minutos. Enchem-se os frascos com silica gel até ¼ e esterilizam-se por calor seco a 180 ºC,
durante 3 horas. No dia antes da conservação, colocam-se os frascos no congelador a -20 ºC. As
culturas e leite desnatado colocam-se no frigorífico a 4 ºC.
A partir dum tubo com uma cultura esporulada, prepara-se uma suspensão de esporos e
adiciona-se a um frasco arrefecido com sílica seco e esterilizado. Deixa-se secar na estufa com
tampa ligeiramente desarrolhada a 25 ºC, durante 10 a 15 dias. Quando bem seco, fecha-se e
guarda-se num ambiente seco com indicador de humidade.
3.3.3. Conservação a 4 ºC (Santos, 2004)
Material:
Tubos de 12 ml (Greiner, 164161)
Meio de cultura
Procedimento Crescem-se culturas em tubo e após esporuladas, colocaram-se a 4 ºC.
3.4. Segurança e higiene no laboratório de micologia
As recomendações sobre regras de higiene e cuidados a ter no laboratório de
micologia de Santos et al. (1998) foram seguidas. Especial atenção foi tomada aos ácaros,
152
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
pequenos aracnídeos que podem estar presentes em materiais vegetais. Após
plaqueamento das uvas, todas as placas são inspeccionadas ao estereomicroscópio, e o
restante material vegetal processado ou descartado, e as bancadas do laboratório
cuidadosamente limpas com álcool a 70% e pulverizadas com lixívia comercial diluída
10 vezes. Se ao fim de 2 dias for detectada a presença de ácaros em alguma placa, esta e
as placas vizinhas ficam de quarentena, numa tina com água, para prevenir a
contaminação de outras placas, até ao fim do tempo de incubação.
No final do tempo de incubação, as placas de isolamento e culturas foram
autoclavadas a 121 ºC, 20 minutos.
3.5. Identificação e caracterização dos fungos
A identificação dos fungos baseou-se na microscopia óptica das estruturas
reprodutoras especializadas, sexuais e assexuais, e na morfologia da colónia. No entanto,
para a caracterização de estirpes de Aspergillus secção Nigri, usou-se SEM. Na
caracterização de algumas estirpes de Penicillium, usou-se o perfil de metabolitos
secundários em TLC.
3.5.1. Observação da morfologia das culturas
As culturas foram observadas ao estereomicroscópio (Leica MZ125, com sistema
de iluminação Leica CLS 150X). Para registar as cores da colónia, usou-se o código de
cores do livro de cor Methuen (Kornerup & Wanscher, 1978).
3.5.2. Condições de cultivo para identificação até ao género
Os fungos foram identificados até ao género tipicamente ao fim de 7 dias, ou até
que surjam estruturas reprodutoras. As placas foram incubadas na estufa a 25 ºC no
153
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
escuro, voltadas para cima, não seladas. Em alguns casos, para induzir a esporulação, as
placas foram colocadas debaixo de luz negra, em ciclos de 12 horas.
3.5.3. Condições de cultivo para a identificação de Aspergillus e
Penicillium até à espécie
A identificação de Aspergillus até à espécie foi conduzida em CZ, ao fim de pelo
menos 10 dias. Os teleomorfos de Aspergillus foram identificados em CY20S, ao fim de
15 dias. A identificação de Penicillium foi conduzida em CZ e MEA, ao fim de 7 a 9
dias. A formulação de MEA, CYA e CYA20S pode ser encontrada no manual de
identificação de Aspergillus de Klich e Pitt (1988). Autoclavou-se os meios de cultura a
121 ºC, 15 minutos.
• MEA: meio de agar com extracto de malte
20 g de extracto de malte (Oxoid L39)
1 g de peptona (Oxoid )
22 g de glucose monohidratada (para fins bioquímicos, Merck)
20 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
1 l de água destilada
• CYA: agar de Czapek com extracto de levedura
30 g de sacarose (extra pura, Merck)
5 g de extracto de levedura (Difco 212750)
1 g de K2HPO4
10 ml de concentrado de Czapek
15 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
1 l de água destilada
Concentrado de Czapek (com metais vestigiais)
30 g de NaNO3 (p.a., Merck)
154
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
5 g de KCl (p.a., Merck)
5 g de MgSO4.7H2O (grau para biologia molecular, Calbiochem)
0,1 g de FeSO4.7H2O (p.a., Merck)
0,1 g de ZnSO4.7H2O (extra puro, Merck)
0,05 g de CuSO4.5H2O
100 ml de água destilada
• CYA20S: agar de Czapek com extracto de levedura e sacarose a 20%
1 g de K2HPO4
10 ml de concentrado de Czapek
5 g de extracto de levedura (Difco 212750)
200 g de sacarose (extra pura, Merck)
14 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
1 l de água destilada
3.5.4. Preparação das estruturas para observação ao microscópio óptico
Após observar as culturas ao estereomicroscópio e verificar a sua pureza, as
estruturas reprodutoras foram localizadas e com uma agulha esterilizada à chama, retirou-
se material duma área em esporulação activa. O líquido de montagem mais
frequentemente usado nas preparações microscópicas foi o azul de algodão, mas
ocasionalmente foram usados a lactofucsina e o azul de lactofenol. Ao fazer preparações
microscópicas de culturas muito esporuladas (v.g., Aspergillus e Penicillium), lavou-se
previamente o material a observar com álcool a 96%, para remoção dos esporos. Quando
foi necessário observar ao microscópio as estruturas reprodutoras imobilizadas, usou-se a
técnica da fita-cola, que consiste em pressionar a superfície adesiva de fita-cola contra a
colónia, colocá-la numa lâmina voltada para cima, aplicar uma gota de solução corante e
cobrir com uma lamela.
O microscópio usado foi um Leica DMR, que permite observação tanto de campo
claro como de contraste diferencial de interferência (também conhecido como
microscópio de Nomarski).
155
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.6. Manuais de identificação
Os manuais de referência para cada grupo de fungos estão indicados na Tabela
3.13. Os fungos foram identificados com base em manuais especializados em micologia
alimentar e do solo, visto que o solo é o reservatório de quase todos os fungos.
Tabela 3.13 Manuais de identificação usados para identificação dos Ascomycota e Zygomycota detectados
Manuais de identificação Grupo de fungos
Pitt & Hocking, 1997 Geral para fungos em alimentos
Domsch et al. (1993) Fungos do solo
Barron (1968) Fungos do solo
Ellis (1971) Dematiáceos
Raper & Fennell, 1965; Pitt &
Hocking, 1988
Aspergillus e teleomorfos
Pitt (1979; 1988) Penicillium e teleomorfos
von Arx (1980) Géneros que esporulam em cultura pura
3.7. Preparação de Aspergillus para observação ao SEM
Foram usados dois procedimentos para preparação de amostras para observação
ao SEM. Inicialmente, fixaram-se as amostras com tetróxido de ósmio, lavaram-se e
desidrataram-se através duma série progressiva de soluções de álcool a 25%, 50%, 75%,
95% e 100%. Secaram-se as amostras num excicador, montaram-se nos suportes,
cobriram-se com ouro, e foram observadas de imediato ao SEM. Exemplos de imagens
obtidas por este processo são as fotografias de SEM do capítulo 2 (V. capítulo 2, Figura
2.7, p. 107). Mais tarde, confirmou-se que, tal como mencionado por Kozakiewicz
(1989), que estes passos são desnecessários visto que os esporos são estruturas
naturalmente desidratadas. Como tal, esfregaram-se os suportes com fita de carbono em
áreas esporuladas de culturas de CZ com um mês de idade, cobriram-se de ouro e
observaram-se imediatamente. As imagens de SEM apresentadas no capítulo 3
156
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
(Resultados) foram todas obtidas pelo último processo mencionado. O SEM usado foi um
Leica Cambridge S360.
3.8. Confirmação da identificação de Aspergillus secção Nigri
Estirpes representativas de Aspergillus negros foram enviadas para confirmação
pela perita Dra. Zofia Kozakiewicz (representante do Reino Unido da ICPAS) e para
análise molecular (grupo do Dr. Javier Cabañes). Os resultados foram consistentes no que
diz respeito à distinção das espécies unisseriadas, agregado A. niger e A. carbonarius.
3.9. Diferenciação de Penicillium
Visto que a identificação de Penicillium não foi feita com recurso a técnicas
moleculares, o nome da espécie (v.g., P. miczinskii, P. simplicissimum) diz respeito ao
sentido lato.
A distinção entre P. glabrum e P. spinulosum não foi feita, visto que tal como
descrito, se verificou que as duas espécies formam uma interface (Pitt, 1988). Algumas
estirpes foram facilmente identificadas como P. glabrum ou P. spinulosum, mas outras
não puderam ser atribuídas a uma das espécies com segurança. Como tal, optou-se por se
apresentar os dados respeitantes ao grupo P. glabrum/P. spinulosum, tendo em
consideração que a distinção entre estas duas espécies não se considera relevante até ao
momento da escrita desta dissertação no que diz respeito à produção de micotoxinas, e
que as duas espécies são muito próximas e partilham requisitos ecofisiológicos
semelhantes (Pitt et al., 1990).
157
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.10. Perfis de metabolitos secundários de estirpes de
Penicillium
As culturas foram crescidas em YES durante 7 dias, e analisadas de acordo descrito
por Paterson e Bridge (1994) e Abrunhosa (2001): foram retiradas 3 cilindros de agar
com um fura-rolhas de 4 mm de diâmetro, e aplicados numa placa de TLC (sílica gel 60
em folhas de alumínio, Merck, Lisboa, Portugal). A fase móvel foi tolueno/acetato de
etilo/ácido fórmico (5:4:1, v/v/v). Os solventes usados são de grau para HPLC e foram
adquiridos da Merck. A formulação do meio YES é descrita de seguida:
• YES: meio de agar com extracto de levedura com sacarose
20 g de extracto de levedura (Difco 212750)
150 g de sacarose (extra pura, Merck)
20 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
1 l de água destilada
Esterilizar a 121 ºC, 15 minutos.
O extracto de levedura foi adquirido preferencialmente da Difco com base nos
trabalhos de Filtenborg e colaboradores (1990), que verificaram que esta marca de
extracto de levedura era mais adequada à análise de metabolitos secundários.
3.11. Fotografias dos espécimens identificados
As fotografias dos espécimens foram tiradas com um máquina digital de 3,3
Megapíxeis (JVC GC-X3). Quando necessário, foi feito tratamento de imagem no Corel
Photo Paint para correção de luminosidade e cor.
158
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de
Aspergillus
Para avaliar o potencial ocratoxigénico das estirpes de espécies de Aspergillus
descritas como produtoras de OTA, usou-se o meio CYA. Para verificar se a capacidade
produtora se mantinha em uva, fez-se um rastreio a um número representativo de estirpes
produtoras e não produtoras de OTA em CYA em meio com extracto de uva (GJ50).
4.1. Estirpes analisadas
A lista de estirpes analisadas, com código, espécie, data de isolamento e amostra de
uvas donde foi isolada (origem) encontra-se no anexo II. O número de estirpes analisadas
de cada espécie entre 2001 e 2003 por plaqueamento directo está indicado na tabela 4.2
do capítulo 4 (p. 202).
4.2. Reagentes químicos e materiais
Os solventes usados foram de grau HPLC e foram fornecidos pela Merck (Lisboa,
Portugal). Os filtros de seringa usados têm 0,45 µm de poro (Acrodisc). Os frascos para
conter as amostras são de cor de âmbar de 4 ml com tampas de teflon (Supelco). Antes da
injecção no cromatógrafo, as amostras foram transferidas para frascos brancos de 2 ml
(Chromacol). Na formulação dos meios de cultura, foram usados os mesmos reagentes
indicados na secção anterior.
4.3. Rastreio de produção de OTA pelas estirpes
As estirpes de Aspergillus foram isoladas em CYA, e a produção de OTA foi
testada no mesmo meio, preferencialmente na placa de isolamento, após verificação
159
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
cuidada da pureza da cultura ao estereomicroscópio. A capacidade das estirpes
produzirem OTA num meio à base de extracto de uva (GJ50) também foi testada. A
formulação do meio GJ50 descreve-se de seguida:
• GJ50: meio de agar com extracto de uva a 50%
500 ml de extracto de uva
20 g de agar N º 3 (Oxoid L13)
500 ml água destilada
Preparação do extracto de uva:
1-2 kg de uvas
Homogeneizar as uvas na misturadora cerca de 1 minuto. Centrifugar o homogeneizado a
8500 r.p.m. durante 5 minutos. Decantar o sobrenadante. Colocar o sobrenadante a 4 ºC durante a
noite para estabilizar. Filtrar por filtros de microfibra de vidro de 1,5 µm de poro e de 110 mm de
diâmetro (Whatman). Medir 500 ml. Autoclavar a 90 ºC, 30 minutos.
Autoclavar a água e o agar a 121 ºC, 15 minutos. Adicionar os 500 ml de extracto de uva e
autoclavar novamente a mistura a 102 ºC, 5 minutos.
O método usado para rastreio da capacidade de produção de OTA pelas estirpes foi
o de Bragulat et al. (2001), e consiste no seguinte: as estirpes foram inoculadas em CYA
e incubadas a 25 ºC, no escuro, durante 7 dias. Ao fim do tempo de incubação, retiraram-
se com um fura-rolhas 3 cilindros de agar de 3 áreas da colónia distintas: próximo do
centro, meio da colónia e próximo da periferia. Os cilindros de agar foram colocados em
frascos com 500 µl de metanol. Ao fim de 1 hora, o metanol foi filtrado e evaporado a ca
de 50 ºC com corrente de azoto. O resíduo foi ressuspendido em fase móvel e injectado
no HPLC. A OTA nas amostras foi determinada e confirmada conforme descrito nas
secções 7.7 e 7.8, respectivamente. O limite de detecção deste método foi de 0,1 µg OTA
por kg de cilindros de agar (peso fresco).
160
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
4.4. Ensaio interlaboratorial
Foram fornecidas a 6 laboratórios (incluindo o nosso) 4 estirpes, sem informações
sobre a espécie, para que o teor de OTA nas culturas fosse determinado. O resultado da
identificação coincidiu com a identidade das estirpes determinada pela Dra. Z.
Kozakiewicz, e o resultado quanto à determinação de OTA obtido no nosso laboratório
(P4) foi concordante com o de 3 dos laboratórios (Tabela 3.14).
Tabela 3.14. Resultado do ensaio interlaboratorial quanto à detecção da OTA produzida por 4 estirpes (P4:
resultados obtidos no nosso laboratório)
Nº Espécie Teor de
OTA
P1 P2 P4 P7 P8 P10
1 Agregado A. niger Muito baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+
2 A. carbonarius Elevado OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+
3 A. aculeatus Baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+
4 Agregado A. niger Negativo OTA- OTA- OTA- OTA+ OTA- OTA+
O laboratório P10 usou um método de HPLC diferente dos restantes laboratórios e
não efectuou a confirmação por derivatização com BF3 conforme descrito na secção 7.8,
o que pode justificar a ocorrência de falsos positivos.
5. Construção duma base de dados para documentação da
micoflora das uvas
À medida que as amostras de uvas foram analisadas quanto à sua micoflora e as
estirpes isoladas e avaliadas quanto à produção de OTA, tornou-se necessário um sistema
de informação que permitisse registar os dados resultantes da análise micológica das
uvas, bem como facilitar o acesso à informação nele depositada. No entanto, criar um
sistema de registo de informação apresenta uma dificuldade inata: seleccionar a
informação a registar. Dados não registados implicam perda de conhecimento, mas
161
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
registar tudo é impraticável. Nesta secção, explana-se o processo de conceptualização da
base de dados, os modelos e ferramentas usados, e a aplicação desenvolvida. A base de
dados é um repositório de informação sobre a micoflora das uvas, que permite
posteriormente a realização de análises estatísticas ou exploração informática aos dados
nela registados, descritos no capítulo seguinte.
5.1. Software
A base de dados foi elaborada recorrendo ao Microsoft Access XP, e os
formulários de interacção foram elaborados com recurso a uma aplicação desenvolvida
no Microsoft Visual Basic versão 6.
5.2. Modelo da base de dados
A base de dados foi desenvolvida com base no modelo entidade-relação (E-R)
(Teorey, 1999). Neste modelo, a informação encontra-se estruturada em entidades, que
correspondem a um dado tema ou assunto (v.g., proveniência das uvas). As entidades
associam-se através do estabelecimento de relações. Cada entidade tem várias
características, designadas de atributos (v.g., nome da quinta, casta de uvas). A
informação respeitante a uma entidade é registada numa tabela. Os atributos são os
campos da tabela. Os campos duma tabela podem ter vários valores, ou seja: o atributo
“casta de uvas” pode ser ter o valor Loureiro, Vinhão, Tinta Barroca, etc. Os atributos
numa tabela são de dois tipos: identificadores e descritivos. Os campos identificadores ou
chaves (campos id) permitem a identificação única duma instância da entidade. O
atributo identificador da tabela chama-se chave primária. Através das chaves, as tabelas
podem ser relacionadas, bem como os registos respeitantes a uma dada instância. Os
atributos descritivos especificam características que não são únicas duma dada instância
(v.g., nome da quinta, casta de uvas). As relações entre as tabelas podem ser de um para
um, um para muitos ou muitos para muitos. Para mais informações sobre a
162
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
conceptualização, implementação e gestão de bases de dados, dever-se-á consultar
(Connolly et al., 1998).
Figura 3.11. Exemplo de duas entidades relacionadas num modelo E-R. A entidade região de origem das
uvas (designada por “Regioes”) é uma tabela com 3 atributos: 1 identificativo (id_regiao) e dois
descritivos: o nome da região (cujo valor pode ser Alentejo, Dão, Douro, Madeira, Ribatejo ou Vinhos
Verdes) e observações (v.g., sul de Portugal). A entidade “Locais” liga-se à entidade “Regioes” com uma
relação de 1 para muitos, pois uma região pode ter vários locais. A entidade “Locais” possui dois atributos
chave: um atributo identificativo (id_local) e um atributo identificativo da tabela regiões, que permite fazer
a ligação entre os dados das duas tabelas. Possui dois atributos descritivos: o nome do local (v.g., EVAG) e
observações (v.g. em Arcos de Valdevez)
5.3. Estrutura da base de dados
A base de dados foi feita para responder a questões como:
• Quais os fungos encontrados numa dada região no bago ervilha no ano de
2002?
• Qual o local, região ou ano em que foram encontrados mais espécies de
Aspergillus?
• Qual a origem das estirpes isoladas?
• Quantas estirpes foram isoladas da quinta A?
• Quantos produtores de OTA foram encontrados?
Com base nas perguntas a que se queria dar resposta, seleccionaram-se os temas e
atributos a registar. Os principais temas considerados são: i) origem das uvas; ii) a placa
163
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
de isolamento; iii) as espécies detectadas e iv) as estirpes isoladas. A estrutura da base de
dados é apresentada de seguida centrada em cada um destes temas.
As relações entre as tabelas podem ser observadas na Figura 3.12. Todas as tabelas
têm campos de observações, que permitem registar informações relevantes não indexadas
noutros campos.
5.3.1. Origem das uvas
Para a amostra ser identificada, necessita de informação sobre a sua origem,
estado de maturação e data de colheita. O estado de maturação e a data da colheita estão
ligados à placa de isolamento (secção seguinte). A tabela que contém informações sobre a
origem das uvas, designada por proveniência das uvas (Figura 3.12), está relacionada
com as tabelas que contêm informação sobre o local (quinta) e casta das uvas. Como um
local pode ter várias castas, e a mesma casta ser estudada em vários locais, a relação entre
as duas tabelas é de muitos para muitos, e faz-se com recurso a uma tabela de ligação
(castas por quintas). A tabela local relaciona-se com a tabela regiões (Figura 3.11). Além
dos atributos identificativos, a tabela proveniência das uvas têm mais dois atributos:
UvaRaquis, um campo binário que especificava se a amostra provinha de bagos de uva
ou de ráquis (os resultados apresentados dizem respeito a dados de bagos de uva), e
amostra, que indica qual o ponto de amostragem onde foi colhido o cacho.
5.3.2. Placa de isolamento
A placa de isolamento cruza informações sobre a origem das uvas, estado de
maturação das uvas e data de colheita, e os fungos detectados nas amostras. A cada placa
de isolamento foi dado um código. O código reflecte a data de isolamento, região, local e
ponto de amostragem, consoante indicado na Figura 3.13.
164
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
165
Quando existe mais que uma casta por local, a casta faz parte do código (v.g.,
para uma amostra da região dos Vinhos Verdes, da EVAG, casta Loureiro, ponto de
amostragem 6, o código é: 25/6VVEVAL6).
As informações que se obtêm da placa de isolamento estão estruturadas na tabela
“Amostragens”. Esta tabela possui campos identificativos que lhe permitem relacionar-se
com a proveniência das uvas e com o meio de cultura (campo “meios”) e procedimento
usado para detecção de fungos filamentosos (campo “metodos”). Possui um campo
identificativo próprio (id_amostragens) e o código atribuído manualmente. No campo
data, é introduzida a data da amostragem (dia/mês/ano). Relaciona-se com a tabela
maturação, onde estão indicados os estados de maturação analisados.
5.3.3. Espécies
A informação que se considerou relevante quanto às espécies foi o nome,
micotoxinas produzidas, propriedades e habitats. As espécies detectadas em cada placa de
isolamento estão ligadas à tabela “amostragens” pela tabela de ligação
“EspeciesPorAmostragem”, onde o nº de bagos colonizados por cada espécie fica
registado.
5.3.4. Estirpes isoladas
As estirpes isoladas estão ligadas à placa de isolamento e, portanto, partilham de
todas as informações sobre a origem e processo de isolamento. Estão relacionadas com a
espécie, e tem campos de informação adicional sobre: i) data de isolamento; ii) produção
de OTA; iii) confirmação da identificação; iv) código. O código é constituído pelos dois
últimos dígitos do ano de isolamento, por um U, que indica que a estirpe derivou de uvas,
seguido de iniciais do género e de um número de ordem sequencial (Figura 3.14)
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
166
Figura 3.12. Modelo conceptual da base de dados. As entidades estão representadas em tabelas (caixas azuis). O nome da tabela está indicado a branco com
fundo azul no topo da caixa. Os atributos estão listados nos espaços brancos. O atributo identificativo (chave primária) está a negrito. As relações entre as tabelas
estão representadas por uma linha negra. O 1 e ∞ indicam que a relação é de um para muitos
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
6/6 DC2Data de colheita
Ponto de amostragem
Local
Região
6/6 D 2CData de colheita
Ponto de amostragem
Local
Região
6/6 D 2CData de colheita
Ponto de amostragem
Local
Região
Figura 3.13. Código de uma amostra de uvas de bago ervilha (colhida em 6 de Junho) proveniente do
Douro, local Do2 (C é a sigla da Quinta), que corresponde ao ponto de amostragem 2
01UAs363Ano 2001
Uvas
rgillus
Número de estirpe
Aspe
01U 363AsAno 2001
Uvas
rgillus
Número de estirpe
Aspe
Figura 3.14. Código duma estirpe de Aspergillus isolada de uvas em 2001. O código de estirpe é
constituído pelo ano de isolamento, inicial do material de onde foi isolado, siglas do género de fungo, e
código sequencial para a estirpe
Formulários
Para introduzir informação na base de dados, foi criada uma aplicação em Visual
Basic disponibilizando vários formulários. Um formulário serve para criar registos numa
tabela. A sequência de preenchimento dos formulários acompanha o processo de análise
das uvas: após ter sido criado o registo dos métodos, meios e origem das uvas, preenche-
se o formulário respeitante à amostragem (Figura 3.15). Em seguida, cria-se o registo
para as espécies, e adicionam-se à lista de espécies detectadas, juntamente com o número
de bagos colonizados. Depois destes registos estarem criados, preenche-se os registos
respeitantes ao isolamento de estirpes, quando existem.
167
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.15. Formulários usados para inserir registos sobre a placa de isolamento (formulário amostragens,
lado esquerdo), que através do botão isolamentos, dá acesso ao formulário isolamentos, que tem
informação sobre as estirpes
5.4. Questionários
Os questionários foram construídos seleccionando as tabelas e campos de que se
deseja obter informação. Um exemplo da construção dum questionário para saber o
número de bagos colonizados com as espécies de Aspergillus negros Aspergillus niger e
Aspergillus carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados está
indicado na Figura 3.16. O resultado do questionário está indicado na Figura 3.17.
A informação obtida dos questionários pode ser exportada directamente para outras
aplicações, como Word, Excel ou SPSS.
168
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.16. Exemplo da construção dum questionário para saber qual o número de bagos colonizados com
os Aspergillus negros A. niger e A. carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados.
Após selecção das tabelas que contêm a informação desejada, seleccionam-se os campos a pesquisar, e a
informação desejada, especificando os critérios
169
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.17. Resultado do questionário construído conforme representado na Figura 3.16, com o número
de bagos colonizados com Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius em 2003 nas regiões nos estados de
maturação estudados
6. Determinação da OTA em uvas
Nesta secção descreve-se o procedimento de validação dum método de extracção de
OTA das uvas. O método de determinação de OTA no mosto foi idêntico ao método de
referência para análise de vinhos.
6.1. Reagentes químicos e materiais
Os solventes usados foram de grau HPLC e foram fornecidos pela Merck (Lisboa,
Portugal). A OTA foi fornecida pela Sigma. Para limpeza da amostra, usaram-se colunas
de imunoafinidade OchraPrep da Vicam (Boston, USA).
170
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
6.2. Colheita e preparação das amostras
As uvas foram colhidas de acordo com o plano de amostragem definido para a
análise micológica, em que se colheram 10 cachos em diferentes locais da vinha, nas
vinhas definidas. Foram analisados uvas aparentemente saudáveis, sem podridão visível.
Um cacho com podridão visível causada por Botrytis, T. roseum e A. carbonarius
encontrado na vinha 5 em 2002 fora dos pontos de amostragem pré-definidos foi
analisado em separado.
Para propósito de análise de OTA, separaram-se os bagos dos engaços e fez-se uma
amostra global, através da mistura dos bagos de todos os cachos. No total foram
analisadas 66 amostras. As amostras colhidas em 2002 foram congeladas a –20 ºC até à
data da análise.
Os bagos foram homogeneizados numa misturadora (Moulinex) de 1,5 litros de
capacidade durante ca de 10 minutos, com 1 minuto de intervalo cada 3 minutos, para
minimizar o aquecimento. O peso médio das amostras globais no bago verde, pintor e
vindima foi de 0,360, 1,815 e 3,070 kg, respectivamente. Do homogeneisado, retiraram-
se 3 alíquotas de 50 gramas. Uma foi analisada imediatamente e 2 foram congeladas a –
20 ºC, para eventuais réplicas ou estudos confirmatórios.
6.3. Validação de método de extracção de OTA em uvas
Para extracção de OTA das uvas, usou-se a solução de diluição usada no método
de referência de análise de vinhos como solução de extracção. Visto que as uvas têm uma
matriz sólida, foi necessário avaliar se a solução bicarbonada era capaz de extrair
eficazmente a OTA da massa sólida das uvas. Para avaliar o desempenho do método,
fizeram-se amostras com adição de padrão e comparou-se o procedimento de extracção
com outro previamente validado para uvas passas. O método de uvas passas foi
seleccionado visto que se considerou que a matriz é semelhante.
171
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
6.4. Experiências de adição de padrão
Nas experiências de adição de padrão, fizeram-se 6 réplicas em dias diferentes
para estimar a taxa de recuperação e desvios padrões relativos em condições de
repetibilidade, RSDr, e de reprodutibilidade (precisão intermédia), RSDR. Estas
experiências foram feitas para duas concentrações de OTA, 0,05 µg/kg e 1 µg/kg. A OTA
foi adicionada em 1 ml de metanol a 0,5 kg de uvas homogeneizadas previamente
analisadas e com resultado negativo quanto à presença de OTA no copo da misturadora.
Permitiu-se que a amostra equilibrasse durante 1 hora, e em seguida, misturou-se por ca
de 1 minuto. Retiraram-se 6 alíquotas de 50 g cada. Três foram analisadas imediatamente,
e as outras 3 foram congeladas a –20 ºC para análise noutro dia.
6.5. Comparação dos métodos com uvas naturalmente
contaminadas
Para obter amostras naturalmente contaminadas com OTA, uvas de mesa da casta
Dominga, a que foram inflingidos alguns danos com uma agulha, foram pulverizadas
com uma suspensão de esporos da estirpe de A. carbonarius MUM03.59 na concentração
de 103 esporos/ml. As uvas foram incubadas em caixas de plástico a 25 ºC, durante 3 e 6
dias, para se obterem níveis diferentes de contaminação (Figura 3.18).
172
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.18. Aspecto das uvas de mesa (casta Dominga) ao fim de 6 dias de incubação após pulverização
com uma suspensão de esporos de A. carbonarius MUM03.59
As uvas naturalmente contaminadas foram analisadas pelos 2 métodos conforme
descrito nas secções anteriores. Para obter várias concentrações, fizeram-se diluições do
material contaminado com homogeneizado de uvas não contaminadas, em diferentes
proporções, para obter 0,5 kg de amostra, e misturou-se ca 1 minuto.
6.6. Extracção com solução bicarbonada e PEG
Colocam-se 50 g de homogeneizado numa proveta de 250 ml e adiciona-se
solução A (5% NaHCO3, 1% PEG 8000) até perfazer 150 ml. Agita-se, e transfere-se a
mistura para tubos de centrífuga de 250 ml e coloca-se em agitação com agitador
magnético durante ca de 30 minutos. Após este período, centrifuga-se a 8500 r.p.m.
durante 20 minutos a 4 ºC. Filtra-se o sobrenadante por um filtro de vidro de 1,5 µm de
110 mm de diâmetro (Whatman 934-AHTM) e recolhe-se o filtrado num cilindro
graduado. Deste filtrado, passam-se 20 ml por uma coluna de imunoafinidade.
173
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
6.7. Extracção com metanol acidificado
Este procedimento foi descrito para uvas passas (MacDonald et al., 1999) e foi
por nós adaptado para uvas frescas. A adaptação consistiu em: i) omitir o passo de
hidratação, desnecessário em uvas frescas; ii) usar-se a misturadora Moulinex para
homogeneização; iii) diluir-se a mistura com solução A ao invés de PBS.
A 50 g de uvas homogeneizadas adicionam-se 50 ml de metanol e 5 ml de ácido
ortofosfórico 0,1 M na misturadora, e mistura-se durante 2 minutos. Filtra-se a mistura
por um filtro de microfibra de vidro de 1,5 µm de poro e recolhe-se o filtrado num
cilindro graduado. Desse filtrado, diluem-se 12,5 ml a 100 ml com solução A, e passa-se
o extracto diluído na coluna de imunoafinidade.
6.8. Limpeza da amostra por imunoafinidade
O método de referência de limpeza de amostras de vinho que foi usado na análise
do sobrenadante consiste em passar a amostra diluída com solução A pela coluna de IAC
de acordo com as recomendações do fabricante: ajustar o fluxo a uma taxa de 1 a 2 gotas
por segundo, lavar a coluna em seguida com solução B (2,5% NaCl; 0,5% NaHCO3),
seguida de 5 ml de água desionizada.
A OTA foi eluída com 2 ml de metanol, evaporada com uma corrente de azoto e
ressuspendida em 1 ml de fase móvel e a amostra injectada no cromatógrafo.
6.9. Quantificação
Para se determinar a OTA presente por kg de uva, usou-se a seguinte equação:
[ ] [ ]PAVA
VFVOTAOTA amostrauva ×
××= 1 (equação 1)
174
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Em que:
[ ]uvaOTA representa a concentração de OTA nas uvas expressa em µg OTA por kg uva;
[ ]amostraOTA representa a concentração de OTA na alíquota da amostra injectada na
coluna determinada de acordo com a curva de calibração, em µg/ml;
V1 é o volume de de fase móvel usado para dissolver o resíduo seco em ml (=1 ml)
VF representa o volume filtrado (ml)
VA representa o volume de filtrado aplicado na IAC (ml)
PA peso da amostra teste (kg)
A OTA na amostra foi detectada e quantificada de acordo com o procedimento
descrito na secção 7.7. Os resultados apresentados derivam da equação 1 e não estão
corrigidos quanto às taxas de recuperação.
7. Avaliação da influência da composição química do estado de
maturação e variedade de uva na produção de OTA
7.1. Estirpe e inóculo
Foi usada para este estudo a estirpe de A. carbonarius MUM03.59, isolada de
mosto de uvas. O inóculo obteve-se a partir duma cultura em MEA incubada durante 5
dias a 25 ºC num tubo inclinado.
7.2. Amostras de uvas
As amostras foram colhidas em 2002, homogeneizadas e autoclavadas a 90 ºC
durante 30 minutos. Foram usadas para este estudo 5 castas nacionais e Cabernet
Sauvignon (Tabela 3.15), para propósitos comparativos.
175
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.15. Origem e tipo de castas (branca/tinta) usadas para estudar a influência da casta na produção
de OTA por A. carbonarius
Casta Região de origem Branca/Tinta
Alvarinho Vinhos Verdes Branca
Cabernet Sauvignon Ribatejo Tinta
Loureiro Vinhos Verdes Branca
Tinta Barroca Douro Tinta
Touriga Franca Douro Tinta
Vinhão Vinhos Verdes Tinta
7.3. Determinação da composição de açúcares e ácidos
orgânicos das uvas
A principal variação na composição química das uvas no processo de maturação
diz respeito aos açúcares redutores e à acidez total. O teor destes parâmetros nas amostras
foi determinado por métodos de titulação de acordo com o descrito na regulamentação da
UE Nº 2676/90, 17 de Setembro de 1990, no laboratório de análises da CVRVV.
7.4. Avaliação da produção de OTA nas uvas
Incubação. Colocaram-se 5 g de uvas homogeneizadas em frascos universais de
vidro de 30 ml e inocularam-se os frascos com uma suspensão de esporos de 100 µl. A
suspensão de esporos foi preparada da seguinte forma: adicionou-se água esteril com
0,1% peptona aos tubos com a cultura de A. carbonarius, agitou-se para soltar os esporos
e decantou-se a suspensão para outro tubo estéril. A suspensão de esporos foi lavada e
centrifugada 3 vezes para remover a OTA em solução e ajustada a uma concentração de
106 esporos /ml. Incubaram-se os frascos inclinados, para aumentar a superfície exposta
ao ar, ligeiramente dessarolhados, para permitir trocas gasosas, durante 7 dias. As
experiências foram realizadas em triplicado.
176
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Extracção de OTA. No fim do tempo de incubação, a extracção de OTA foi feita com
clorofórmio (Abrunhosa et al., 2002), com as seguintes modificações: a extracção foi
feita uma única vez em vez de duas e quantificou-se a OTA presente em 1 ml de
clorofórmio, em vez de retirar todo o clorofórmio. As modificações foram feitas por duas
razões: i) estimava-se que as concentrações de OTA fossem elevadas, não justificando
uma segunda extracção; ii) durante a mistura de clorofórmio com o meio de cultura,
forma-se frequentemente uma emulsão, que é desfeita com agitação magnética, mas não
completamente. Ao retirar volume de clorofórmio definido, esperava-se eliminar esta
fonte de variação. As taxas de recuperação foram calculadas com base na adição de OTA
a uvas homogeneizadas dos 3 estados de maturação em que não foi detectada OTA, nas
concentrações de 10, 100 e 1000 ng/g. As taxas de recuperação foram calculadas com
base nos resultados de 6 réplicas, 2 por cada estado de maturação. As taxas de
recuperação do método usado para analisar a produção de OTA nas uvas com OTA
adicionada nas concentrações de 10, 100 e 1000 µg/kg foram 56,9%, 74,8% e 79,8%,
respectivamente. O desvio padrão relativo a 10, 100 e 1000 µg/kg foi de 24,3%, 4,9% e
8,1%, respectivamente. Os resultados das amostras são apresentados sem correcção de
cálculos quanto à taxa de recuperação.
7.5. Detecção, quantificação, e confirmação da OTA
Os reagentes usados são de grau analítico e foram adquiridos à Merck. A OTA foi
adquirida na forma cristalizada à Sigma.
7.6. Preparação do padrão de OTA
Foi preparada uma solução stock de 20 µg/l em tolueno- acido acético (99:1) e
mantida a –20 ºC. A concentração de OTA desta solução foi determinada por
espectrofotometria UV a 331 nm segundo a equação 2 e verificada com regularidade,
cada vez que foi preparada uma nova solução de trabalho. A solução de trabalho foi
177
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
preparada na concentração de 2 µg/l, e a concentração de OTA desta solução foi de novo
verificada por espectrofotometria UV. Da solução de trabalho, foram preparados os
padrões para HPLC.
[ ]δε ×××
=1000max MA
OTA (equação 2)
Em que:
[OTA] representa a concentração de OTA na solução expressa em µg/ml;
Amax é a absorção determinada no máximo da curva de absorção (= 331 nm)
M é a massa molecular relativa da OTA (M=403,8 g/mol)
ε é o coeficiente de extinção molar da OTA nesta mistura de solventes (=5440 m2/mol)
δ é o passo óptico em cm
7.7. Detecção e quantificação por HPLC- FL
A OTA foi detectada e quantificada nas amostras por um HPLC de fase reversa
com um detector de fluorescência. O equipamento de fluorescência usado foi um sistema
Jasco FP-920, ajustado a um comprimento de onda de 330 nm para excitação e 460 nm
para emissão. As separações cromatográficas foram realizadas numa coluna Waters
Spherisorb ODS2 (4,6 mm x 250 mm; 5 µm), equipada com uma pré-coluna com a
mesma fase estacionária e operada a 30 ºC. A fase móvel foi bombeada a uma taxa de 1
ml/minuto e consistiu num programa isocrático de acetonitrilo: água: acido acético
(99:99:2, v/v/v). No caso de amostras derivatizadas com BF3 em metanol, para detecção
do metil-ester da OTA, o fluxo usado foi de 2 ml/minuto. O volume de injecção foi de
100 µl. O software de aquisição usado foi o Varian Star 5.3. As amostras foram
consideradas positivas para OTA quando foi detectado um pico com tempo de retenção
similar ao do padrão de OTA (11 minutos, aproximadamente). A OTA nas amostras foi
quantificada por substituição da ordenada na equação da recta de calibração pela altura
do pico de OTA na amostra, de acordo com a equação 3:
178
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
y = bx + a (equação 3)
Em que:
y é a altura do pico
b é o declive da recta
x é a concentração de OTA na amostra
a é a ordenada na origem
7.8. Identificação e confirmação da OTA
Em amostras representativas, a identidade da OTA foi confirmada através da adição
de padrão ou da formação do metil-ester da OTA com derivatização por adição de BF3
em metanol (solução a 14%, Sigma), de acordo com o descrito por Hunt et al. (1980): a
amostra foi evaporada completamente, e o resíduo seco ressuspendido em 50 µl de BF3
em metanol, e deixou-se reagir a 65 ºC, durante 15 minutos.
7.9. Calibração
As soluções padrão foram preparadas diariamente em fase móvel a partir da solução
de trabalho como indicado na secção 7.6. Usaram-se 4 concentrações: 0,05; 0,1; 1 e 10
µg/l. As curvas de calibração foram obtidas por regressão linear pelo método dos
mínimos quadrados usando a altura do pico do padrão como resposta à sua concentração.
Os coeficientes de correlação da curva de calibração foram de 0,9999 ou superiores.
O limite de detecção de OTA nas amostras de HPLC foi estabelecido em 0,03 µg/l,
determinado como a soma de a (ordenada na origem, equação 3) com 3 vezes o desvio
padrão dos y-residuais da curva de calibração (Sy/x, equação 4), de acordo com o
recomendado por Miller e Miller (1993).
179
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
( ) 2
12
2
ˆ
⎪⎭
⎪⎬
⎫
⎪⎩
⎪⎨
⎧
−
−=∑
n
yyS i
ii
xy (equação 4)
Em que:
xyS é o desvio padrão dos y-residuais da curva de calibração;
( 2ˆ ii yy − ) são os y residuais, em que yi é a altura do pico de OTA da amostra duma
concentração conhecida xi, e é o valor calculado de y em que x é substituído por xiy i na
recta de calibração;
n é o número de pontos de calibração.
O limite de quantificação considerado foi a concentração mais baixa do padrão usado
na curva de calibração (0,05 µg/l).
7.10. Procedimentos de segurança
A OTA é um composto tóxico e deve ser manipulada com cuidado e com as medidas
de segurança adequadas. Ao longo deste trabalho experimental usaram-se os
procedimentos de descontaminação para desperdícios laboratoriais aconselhados pela
IARC (Castegnaro et al., 1991) usando hipoclorito de sódio. O material e soluções
aquosas com OTA foram descontaminados com excesso de lixívia comercial, com pelo
menos 5% de cloro, durante a noite.
8. Análise dos dados
De seguida apresenta-se a análise de dados efectuada aos dados da composição da
micoflora das uvas e ao estudo de validação do procedimento de extracção.
180
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
8.1. Software
O tratamento estatístico dos dados foi realizado no software Statistic Package for
Social Sciences (SPSS) para Windows versão 11.0 e no Microsoft Excel 2000. As árvores
de decisão foram feitas no Waikato Environment for Knowledge Analysis (WEKA)
desenvolvido no âmbito do projecto de aprendizagem máquina da Universidade de
Waikato, na Nova Zelândia. Esta aplicação está disponível na internet gratuitamente e
pode ser adquirido na URL: http://www.cs.waikato.ac.nz/~ml/index.html. O uso desta
aplicação para a criação de modelos preditivos na ciência alimentar já foi sugerido por
Holmes e Hall (2002).
8.2. Testes estatísticos realizados
Verificou-se se as variáveis seguem ou não uma distribuição normal através do
teste de Kolmogorov-Smirnov. Para se avaliar se as variáveis diferem significativamente
usou-se o teste de análise de variância (ANOVA), quando as variáveis seguem uma
distribuição normal, e o teste não paramétrico Kruskal-Wallis H com aproximação ao
teste Chi-quadrado como teste de significância, quando a distribuição não foi normal.
Quando estatisticamente significativas, as diferenças entre grupos foram
localizadas, no caso das variáveis de distribuição normal, através de testes de
comparações múltiplas de pares. Usaram-se os testes de comparações múltiplas de pares
Tukey’s honestly significant difference, quando a variância era homogénea entre grupos, e
Tamhane’s T2, quando a variância não era homogénea. Como teste de homogeneidade de
variâncias, usou-se o teste Levene. Quando as variáveis não seguem uma distribuição
normal, as diferenças foram exploradas pelo mesmo teste não paramétrico para grupos de
2 amostras.
Para investigar eventuais relações lineares entre as variáveis, fizeram-se
correlações bivariadas com o coeficiente de correlação de Spearman, visto que a
distribuição dos fungos nas amostras geralmente não foi normal. As análises estatísticas
foram consideradas significativas quando P<0,05.
181
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
8.3. Representação gráfica de estatísticas
Na representação gráfica de estatísticas, foram usados diagramas do tipo caixa
(ing., box plot ou box and whisker plot). No diagrama do tipo caixa estão representadas
graficamente a mediana, o primeiro quartil, o terceiro quartil, os valores máximo e
mínimo, e os outliers e extremos quando existem.
373329N =
321
Peni
cilli
um
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0-5
Outlier
Valor máximo
Terceiro quartil
Mediana
Primeiro quartil
Valor mínimo
Extremo
373329N =
321
Peni
cilli
um
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0-5
Outlier
Valor máximo
Terceiro quartil
Mediana
Primeiro quartil
Valor mínimo
Extremo
Figura 3.19. Diagrama do tipo caixa da distribuição do número de bagos colonizados com Penicillium nas
amostras de uvas dos 3 estados de maturação (1, 2 e 3 correspondem a bago ervilha, pintor e vindima,
respectivamente). Estão representadas graficamente a mediana do número de bagos colonizados com
Penicillium nas amostras, o primeiro e terceiro quartil, o valor máximo e mínimo excepto outliers e
extremos. N indica o número de amostras analisadas de cada estado de maturação
182
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
8.4. Árvores de decisão
Foram usadas árvores de decisão para classificar as amostras quanto à sua origem
geográfica com base na micoflora, e para classificar estirpes de Aspergillus negros com
base no tamanho dos esporos e produção de OTA.
As árvores de decisão são uma das abordagens possíveis para a classificação de items.
Com base nos atributos da amostra (no caso das amostras de uvas, os atributos
considerados foram a incidência dos géneros e espécies de fungos; no caso das estirpes de
Aspergillus negros, os atributos foram o tamanho dos esporos e a produção de OTA), o
algoritmo de classificação selecciona os atributos preditivos, i.e., os atributos que lhe dão
mais informação para a classificação do item na classe pré-definida. No caso da
classificação das amostras de acordo com a sua origem geográfica, as classes pré-
definidas foram as 4 regiões de origem estudadas durante 3 anos: Alentejo, Douro,
Ribatejo e Vinhos Verdes. No caso dos Aspergillus negros, as classes são os taxa
agregado A. niger, A. ibericus, A. carbonarius.
As árvores são constituídas por nós e ramos. Os nós não terminais representam testes
aos atributos preditivos, e os nós terminais (designados de folhas) reflectem as decisões
do modelo, i.e, os valores das classes. Em cada nível da árvore, o atributo mais
informativo que ainda não foi usado é seleccionado. O processo repete-se até que todos
os itens sejam classificados. Os ramos são caminhos de decisão, da raiz da árvore até às
suas folhas. O modelo gerado expõe o conhecimento adquirido duma forma intuitiva.
O algoritmo da árvore de decisão usado não têm como pré-requisito a normalidade
dos dados. O algoritmo de árvore de decisão usado na dissertação foi o J4.8, que é uma
implementação em JAVA do C4.5 (Quinlan, 1993). Este algoritmo baseia-se na teoria de
Informação de Shannon para medir o valor informativo dos atributos.
Os dados usados para construir o modelo de classificação designam-se por conjunto
de treino. O conjunto de treino na classificação das amostras em regiões geográficas
consoante a micoflora foi composto por 32 amostras das 4 regiões e locais estudados nos
3 anos na vindima. No caso da classificação de Aspergillus negros, o conjunto de treino
foram 25 estirpes de Aspergillus bisseriados. A árvore produzida pelo algoritmo tem
183
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
várias medidas estatísticas associadas e uma matriz de confusão. Na figura 3.20 está um
exemplo duma árvore de classificação.
Figura 3.20. Árvore de decisão para a classificação das amostras em regiões. Os atributos são indicados
numa oval, e as classes num rectângulo. Nas folhas do modelo, os números entre parêntesis significam o
número de itens do conjunto de treino que o nó classificou naquela folha, bem como o número de itens
incorrectamente classificados, caso existam (10.0/2.0 significa que 10 amostras foram classificadas como
sendo dos Vinhos Verdes usando o critério de <4 bagos colonizados nas amostras com A. niger; 2 amostras
foram incorrectamente classificadas por este critério)
Na matriz de confusão associada à árvore de decisão estão indicados o número de
amostras de cada classe que foram classificadas em cada uma das categorias predefinidas
(Tabela 3.16). Através dos dados indicados na matriz, é possível calcular o sucesso e
insucesso do modelo para cada classe (v.g., o sucesso do modelo para o Douro foi de 7
amostras correctas em 9, ou seja, 78%).
Tabela 3.16. Matriz de confusão da árvore de decisão representada na Figura 3.20. Nas linhas indica-se o
número total de amostras de cada uma das classes classificadas pelo modelo em cada uma das categorias
predefinidas. Por exemplo, no caso do Douro, das 9 amostras totais, 7 foram correctamente classificadas
pelo modelo como sendo do Douro, uma incorrectamente classificada como sendo do Sul e outra como
sendo dos Vinhos Verdes
Douro Sul Verdes
Douro 7 1 1
Sul 0 14 1
Verdes 0 0 8
184
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
Para avaliar a capacidade preditiva do modelo, i.e., verificar se o modelo é capaz de
identificar correctamente amostras de origem desconhecida duma das 4 regiões
estudadas, usou-se um método designado de validação cruzada de 10 subgrupos. O
conjunto de treino é dividido em 10 subconjuntos, assegurando o algoritmo que cada
classe está representada em proporção igual (Kohavi, 1995). Um dos subgrupos é usado
para teste e os restantes para treino. Desta forma avalia-se a taxa de sucesso preditivo do
modelo.
Para refinamento do modelo, fez-se selecção de atributos. O avaliador de atributos
seleccionado do WEKA foi o CfsSubsetEval, e os métodos usados foram o BestFirst e o
RankSearch.
8.5. Avaliação do desempenho dos métodos de extracção
A avaliação do desempenho dos métodos fez-se com base na regressão linear entre a
resposta dos métodos e a concentração de OTA nas amostras, ou na falta deste valor (nas
amostras naturalmente contaminadas), na taxa de diluição. Foram obtidos e analisados o
coeficiente de correlação r, o declive da recta (b) e a ordenada na origem (a), com o
programa Microsoft Excel 2000. O intervalo de confiança para o declive da recta (b ± tsb)
e ordenada na origem (a ± tsa) foram calculados de acordo com o descrito por Miller e
Miller (1993), com base nas equações 5 e 6, respectivamente.
( )2
12
⎭⎬⎫
⎩⎨⎧
−
=
∑i
i
xy
b
xx
SS (equação 5)
185
CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS
( )
21
2
2
⎪⎭
⎪⎬
⎫
⎪⎩
⎪⎨
⎧
−×=
∑∑
ii
ii
xya xxn
xSS (equação 6)
Em que:
xyS é calculado de acordo com a equação 4;
xi é a concentração de OTA dum padrão, e x a média;
n é o número de pontos da calibração.
O valor de t obtido foi para um nível de confiança de 95%.
O RSD é calculado com base na razão do desvio padrão e do valor médio, e é
expresso em percentagem. A taxa de recuperação é a razão entre a concentração de OTA
detectada na amostra, calculada pela equação 1, e a concentração de OTA conhecida e é
expressa em percentagem.
186