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19/05/2014
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIAEFICIÊNCIA
Centro Universitário FranciscanoÁrea de Ciências Tecnológicas
Programa de Pós-Graduação em Nanociências
Profa. Dr. Patrícia Gomes
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
- Método físico-químico de separação;
- High performance liquid chromatography (HPLC).
ANALITO
FASE MÓVEL
(FM)
FASE ESTACIONÁRIA
(FE)
FE
FE
FE
FM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
VANTAGENSVANTAGENS
- FE: utilizada várias vezes;
- Tempo reduzido de análise;
- Elevada resolução;
- Análise qualitativa: identificação (tempo de retenção, espectro
de absorção no UV e espectro de massas);
- Análise quantitativa:
� DPR (< 5%);
- Automação.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
DESVANTAGENSDESVANTAGENS
- Elevado custo: equipamento e manutenção;
- Geração de resíduos;
- Experiência do operador.
FE
FE
FE
BA
BA
A AB
B
A
AA
B
B
B
B
A
A
A
A
A
B
B
BB
FM
FM
MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO
PROCESSOS
MECÂNICOSMECÂNICOSFÍSICOSFÍSICOS
- Adsorção- Partição: fase normal e
fase reversa- Exclusão
QUÍMICOSQUÍMICOS
- Troca iônica
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MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO
ADSORÇÃOADSORÇÃO
- Fase estacionária (FE): sólida
- Fase móvel (FM): líquido
- A separação baseia-se na competição que existe entre as
moléculas da amostra e as da FM em
ocupar os sítios ativos na
superfície de um sólido (FE).
MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO
PARTIÇÃOPARTIÇÃO
- A separação baseia-se nas diferentes solubilidades que
apresentam os componentes da amostra na FM e FE;
- Os componentes de maior afinidade (solubilidade) com
a FE serão seletivamente retirados por
ela, enquanto que os de menor afinidade
serão transportados mais
rapidamente pela FM.
FASE NORMAL: FE POLAR FM APOLARFASE NORMAL: FE POLAR FM APOLAR
FASE REVERSA: FE APOLAR E FM POLARFASE REVERSA: FE APOLAR E FM POLAR
MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO
TROCATROCA IÔNICAIÔNICA
- Separação de compostos iônicos e compostos muito polares;- FE: resinas trocadoras de íons;- Otimização: força iônica, fatores de carga e pH.
EXCLUSÃO POR TAMANHOEXCLUSÃO POR TAMANHO- Não envolve forças químicas de interação;- FE: diâmetros de poros ;- Cromatografia por exclusão de tamanho: size exclusion
chromatography
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
FASE MÓVEL
- Elevado grau de pureza: HPLC- Água: tipo Milli-Q®- Baixa viscosidade.- Elevado ponto de ebulição- Baixa toxicidade- Custo compatível- Cuidados: filtração e desgaseificação
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
BOMBA
- Pressurização da FM para facilitar a passagem pela FE e reduzir o tempo de análise
- Ampla faixa de fluxo- Fácil de trocar de solvente- Gradientes de eluição
Tempo (min)
Solv
ente
B (
%)
Tempo (min)
Solv
ente
B (
%)
ISOCRÁTICOISOCRÁTICO GRADIENTEGRADIENTE
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INJETOR
- Sistema de introdução da amostra;- Alça de amostragem (injection loop): 1 a 500 µl- Tipo: manual e automática (auto sampler)
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INJETOR
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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INJETOR
VmáximoVmáximo ((µlµl)= )= ππππππππ (raio)(raio)22 (comprimento) (0,01)(comprimento) (0,01)
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
PRÉ-COLUNAS
- Localizada entre o injetor e a coluna de separação;- Comprimento: 2-5 cm e Diâmetro=coluna de separação;- Mesma fase estacionária da coluna de separação;
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
COLUNAS
- Cartuchos de aço ou plástico: comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula;
- Separação: adsorção ou partição.
ADSORÇÃO: grupos polares da molécula nos grupos polares da
fase estacionáriaFE: sílica-gel
PARTIÇÃO: entre a porção lipofílica da molécula na fase
estacionáriaFE: octadecilsilano ou C18 ou ODS
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
COLUNAS
- ODS (C18): fase mais utilizada- Octil (C8) e butil silano (C4): alternativa a C18- Cianopropil sílica-gel (CN)
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTORES
- UV/VIS
- Arranjo de fotodiodos (DAD/PDA)
- Fluorescência
- Eletroquímico
- Massa
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR UV/VIS
- Moderadamente seletivo e sensível
- Amplamente utilizado
- Aplicação simples
- Nível de detecção: ng ou µg
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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR PDA/DAD
- PDA: Photodiode array detector
- DAD: Diode array detector
- Comprimento de onda variável
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR PDA/DAD
- Pureza do pico
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\003-0301.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\005-0501.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\007-0701.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\009-0901.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\011-1101.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\013-1301.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\015-1501.D)
2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 min
A
B
DETECTOR PDA/DAD
- Pureza do pico
Figura - Estudo da cinética de degradação ácida das soluções de duloxetina
(DLX) (10 µg/ml) nos tempos: zero, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos, onde (A)
DLX e (B) produto de degradação majoritário, PDA-14.
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR PDA/DAD
- Pureza do pico
min0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750 2
.34
6
4.5
90
14
.22
5
Figura - Cromatograma do produto de degradação ácida (PDA-14) isolado em CCD preparativa.
min0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXISOLAM\DEG000000.D)
14.2
15
nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
mAU
0
100
200
300
400
500
*DAD1, 14.212 (589 mAU, - ) Ref=13.799 & 14.799 of DEG000000.D a
min0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXETINA300409\DLXPDIDENTIFIC2009-04-30\009-0801.D)
12
.22
1
nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
mAU
0
100
200
300
400
*DAD1, 12.224 (504 mAU,Apx) Ref=11.597 & 12.797 of 009-0801.Dc
min0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXETINA300409\DLXPDIDENTIFIC2009-04-30\008-0701.D)
14
.48
1
nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
mAU
0
50
100
150
200
*DAD1, 14.557 (240 mAU, - ) Ref=0.291 & 15.091 of 008-0701.D
b
Figura - Cromatogramas obtidos para PDA-14 (a), 1-naftol (b) e 2-naftol (c).
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR FLUORESCÊNCIA
- Altamente seletivo e sensível
- Compostos que sofrem fluorescência ou pode ser derivatizados
com grupos fluorescentes
- λ de excitação e λ de emissão
- Nível de detecção: pg
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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR- ELETROQUÍMICO
- Altamente seletivo e sensível
- Compostos que sofrem reação de oxidação ou redução
- Nível de detecção: pg
- Uso: catecolaminas, fenóis e diversos fármacos
INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO
DETECTOR- MASSAS
- Altamente seletivo e sensível
- Compostos orgânicos que se ionizam
- Especificidade: leitura da massa (carga) dos íons
- Nível de detecção: pg
O
S
NH . H Cl
CH 3
PM= 297 PM= 297
((TheThe MerckMerck, 2001), 2001)
� TEMPO DE RETENÇÃO (tR): Medida entre o ponto de injeção e omáximo do pico;
� TEMPO MORTO (tM):Tempo de eluição de um soluto não retido;
� tR’ : tempo que o soluto permanece na fase estacionária.
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSPARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSPARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
• SIMETRIA DO PICO ((TailingTailing factorfactor))
tP: largura do pico medida da cauda a partir do máximo do pico
fP: largura do pico medida da frente a partir do máximo do pico
P
Ps
f
tA =