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Controle de Dopagem no Esporte:Desafios Analíticos
1º Congresso Sul de Toxicologia Clínico-LaboratorialToxSul 2008
Prof. Henrique Marcelo Gualberto PereiraDepartamento de Química Analítica
LAB DOP - LADETEC / IQ – UFRJhenriquemarcelo@iq.ufrj.br
www.iq.ufrj.br/ladetec2008
Resumo da apresentação
- Controle de dopagem & WADA
- Controle de dopagem no Brasil
- Desafios analíticos- Detecção em ng/mL
- Hormônios peptídicos- Designer steroids
- Perfil endógeno & IRMS- Logística e acreditações
Controle de dopagem no esporte
19671967
19681968 Olimpíadas do México – Começam os exames de controle de dopagem.19881988
19991999
“Uso de substâncias, ou método, potencialmente perigosos à saúde do atleta e/ou capazes de aprimorar seu desempenho.”
Lista de substâncias proibidas
The World Anti-doping CodeThe 2008 Prohibited List
International Standard
S1. ANABOLIC AGENTSS2. HORMONES AND RELATED SUBSTANCESS3. BETA-2 AGONISTSS4 AGENTS WITH ANTI-ESTROGENIC ACTIVITYS5. DIURETICS AND OTHER MASKING AGENTSS6 STIMULANTSS7 NARCOTICSS8 CANNABINOIDSS9 GLUCOCORTICOSTEROIDSP.2 BETA-BLOCKERS
Desafios analíticos
- Hormônios peptídicos
- Designer steroids
- Perfil endógeno & IRMS- Logística e
acreditações
- Detecção em ng/mL
- Doping genético
- Novas substâncias
- Número de substâncias
- Novos métodos
Detecção de baixa concentração (ng/mL).
- Esteróides anabolizantes.
Limite Mínimo de Desempenho1 – 10 ng/mL
3’- hidroxi-estanozolol
N
N
OH
HO
H
Glicocorticosteróide endógeno
Resultado por CG-EM (Q)
Detecção de baixa concentração (ng/mL).
0,2 ng/mL
N
N
CH3
CH3OH
CH3
H
H
HO
Condições de detecção
Íon pai m/z 545
Íons filhos m/z 455 (100%), 387(5%)
Corrente 50 uAmps
Energia de excitação 240,1 m/z
Tipo de onda Ressonante
Amplitude (volts) 1,0
Resultado - POS-QC - LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).
Detecção por CG-EM (ITD)
Detecção de baixa concentração (ng/mL).
HO
OH
H
Epimetendiol
Urina fortificada em 2 ng/mLCG-EM x CG-EMAR
Resultados de Schänzer et. al.
Detecção de baixa concentração (ng/mL).
Espectrometria de massasde alta resolução
Conclusão: Necessidade de té cnicas mais sofisticadas e caras
para TRIAGEM.
- CG-EM (ITD)- CG-EMAR- CLAE-EM2
Aumento de custo com
estrutura e mão de obra
qualificada.
Detecção de baixa concentração (ng/mL).
Hormônios peptídicos
Focalização isoelétrica, double blotting e revelação por Químioluminescencia.Presença de rEPO e NESP. Resultado – LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).
rEPO e NESP
Hormônios peptídicos
Hoje: Ausência de métodos baseados em espectrometria de massas.
EPO - Método longo e caro. Porém, inequívocos.
hCG, LH, hGH – Imunoensáio. Inequívocos?
Hormônios peptídicos
Conclusão: Ausência de mé todos por espectrometria de massas
preconizam grande investimento em pesquisa.
Imunoensáios (qualificação inequívoca?).
Métodos longos e caros (porém, inequí vocos).
Aumento de custo com
estrutura e não de obra
qualificada.
Designer steroids
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)
Monitoramento Seletivo de Íons = Target compounds
Madol (2005)
Norboletona (2002)
THG (2004)
Don H. CatlinDepartament of Molecular & Medical PharmacologyUCLA - EUA
O
OH
OH
O
OH
Designer steroids
O
OH
Testosterona
Conclusão: Estratégia Target Compounds não atende mais a
todas as necessidades do controle
de dopagem.
Necessidades de estratégias abrangentes na
busca de compostos desconhecidos.
Designer steroids
Caso BalcoEscândalo de doping
Victor ConteFundador do laborat ório Balco
Alternativas: Métodos abrangentes em CL-EM n.
Cromatografia gasosa bidimencional
abrangente.Sistema CG x CG - TOF.
Grande resolução+
Grade velocidade de aquisição
=Superfície cromatográfica
Designer steroids
H O
O
H O
O H
O
O H
O
O D H E A
Andros tened io l
O
O H
H
Tes tos te ro na
An dro s ten ed io na
5a e 5b -D H T
H O
O H
H
H
O
H Oandros te ro na ee tioco lano lon a
5a e 5b -and ro s taned io l
H O C o les te ro l
17
2022 23
2425
A B
C DPerfil endógeno & IRMS
Perfil endógeno & IRMS
Esteróides anabolizantes endógenos
Número de casos
% de cada fármaco
dentro da classe
Testosterona 1124 57,2
Precursores da testosterona
13 0,7
Prasterona (DHEA) 11 0,6
Etiocolanolona 3 0,2
Androsterona 1 0,1
RAA WADA - 2006
Perfil endógeno & IRMS
Perfil endógeno – Complexidade dos perfis endógenos
torna, por vezes, a interpretação
extremamente complexa.Necessidade de técnica complementar de
caráter inequívoco para falso-positivos.
Cromatografia gasosa acoplada a
forno
de combustão acoplado
espectrômetria
massas por razão isotópica.
REPORTING AND EVALUATION GUIDANCE FORTESTOSTERONE, EPITESTOSTERONE, T/E RATIO AND OTHER ENDOGENOUS STEROIDSWADA Technical Document – TD2004EAAS
i) A e/ou Etio (G) > 10.000 ng/mL.
ii) T e/ou Epit (G) > 200 ng/mL.
iii) T/Epit superior a 4.
iv) DHEA (G) > 100 ng/mL.
Recomenda-se IRMShttp://www.wada-ama.org
CGAR/C/EMRI (IRMS) Resultado PAN-2007
Testosterona / precursor de testosterona
T/E = 5.2
RAA resultou na retirada da medalha de bronze e diploma no levantamento de peso de um atleta brasileiro.
Esteróide endógeno δδδδ 13C/12C [per mil]
Androsterona acetato - 25.45
Etiocolanolona acetato -24.90
5αααα-Androstanediol diacetato -31.42
5ββββ-Androstanediol diacetato - 25.51
Pregnanediol diacetato -22.25
14 amostras com T/E > 4 (maior = 8.2), todas negati vas por GC-C- IRMS.
Resultado - LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).
Logística e Acreditações
Logístic
a •Equipe altamente
qualificada.
• Estrutura sólida.
• Apoio institucional
continuo.
• Apoio governamental
Conclusões
No Brasil:
- Controle de dopagem no LAB DOP – LADETEC desde
1989.
- Acreditação junto a WADA desde 2000.
- Predominantemente amostras de futebol (< 80%).
- No Brasil, o futebol é o esporte mais “limpo” (> 1% de
RRA).
Média inferior a internacional = trabalho de preven ção
de 20 anosControle de dopagem (WADA) = Experiência +
Investimentos
Conclusões
No Brasil:
- PAN 2007 – controle dentro dos critérios da
WADA.
- RAA de difícil detecção:
Testosterona / precursores por IRMS
Boldenona por IRMS
NESP
- Duplos cego da WADA durante os Jogos
No
Brasil:
Conclusões / Preocupações
- A ausência da estrutura necessária e
apoio
institucional / governamental colocam
em risco a atividade de controle de
dopagem.
AGRADECIMENTOS
Professores, alunos, técnicos, estagiários, administrativos dos laboratórios, IQ e instituições
colaboradoras
Patrocinadores e clientes preferenciais