Caroline De Paula Lopes

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

CDTec

GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA MICROBIANA I

CONTROLE DO CRESCIMENTO

MICROBIANO – MÉTODOS FÍSICOS

E QUÍMICOS

O controle dos microrganismos iniciou-se há cerca de 100 anos:

◦ Estudo de Pasteur;

◦ Joseph Lister:

Industrial

Laboratorial

Hospitalar....

A escolha do método depende do objetivo, do tipo de material e do nível de controle que se deseja obter.

Controle de microrganismos

= Redução da carga microbiana

Microbiologia – MORTE – Perda da capacidade reprodutiva

Parede Celular

Membrana Citoplasmática

Enzimas e Proteínas

DNA e RNA

Você sabe o que é....

Desinfecção?

Esterilização?

Sanitização?Assepsia?

Limpeza?

Bacteriostase?

Germicida?

ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a

destruição total de todas as formas de

vida de um material ou ambiente,

através de métodos físicos ou químicos.

DESINFECÇÃO: eliminação parcial dos microrganismos, mata as formas vegetativas, mas não necessariamente as esporuladas de microorganismos patogênicos presentes num material inanimado.

Métodos: substâncias químicas (desinfetantes), radiação UV, água fervente ou vapor.

◦ SANITIZAÇÃO: Utiliza um agente, normalmentequímico, em utensílios e equipamentos, quereduz a população microbiana até níveiscompatíveis com às exigências da saúde pública

◦ ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar oretorno da contaminação a um objeto, superfícieou local.

◦ ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos,como pele e mucosas.

◦ LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos

de desinfecção ou esterilização.

◦ BACTERIOSTASE: inibição do crescimento, pelainibição da síntese protéica, entretanto a bactérianão está morta.

◦ BACTERICIDA: MORTE CELULAR

◦ BACTERIOLÍTICO: morte celular por lise

Inibição da síntese de parede celular

Tamanho da população; Intensidade ou concentração do

agente microbiocida; Tempo de exposição ao agente; Temperatura; Natureza do material contendo

os microrganismos; Características dos

microrganismos; Condições ambientais (pH,

concentração de carboidratos,presença de matéria orgânica).

PARA OBTER MAIOR EFICIÊNCIA DO CONTROLE MICROBIANO, DEVE-SE LEVAR EM

CONSIDERAÇÃO ALGUNS PRINCÍPIOS BÁSICOS, OS MESMOS DEVEM SER APLICÁVEIS

A TODOS OS MÉTODOS.

1- Avaliar susceptibilidade das espécies paraesse agente

2- O contato do agente com o microrganismodeve ser facilitado

3- O tempo de exposição adequado, entre oagente escolhido e o microrganismo parapermitir a ação necessária.

Tempo de redução decimal =VALOR D

1 Físicos:- Calor (úmido, seco, pasteurização)- Filtração;- Baixas temperaturas;- Alta pressão;- Dessecação- Pressão osmótica- Radiação

2 Químicos:

Desinfetantes e/ou anti-sépticos:

- halogênios (cloro, iodo)

- álcoois (etanol 70%, isopropanol)

- fenóis e bifenóis (o-fenilfenol, tricosan)

- biguanidas (clorexidina)

- agentes tensoativos (sabões e detergentes)

- Quaternários de amônio

- Metais (Ag, Hg, Cu)

- Conservantes de alimentos

- Antibióticos (nisina)

- Esterilizantes gasosos (oxirano)

- Aldeídos (glutaraldeído)

CONTROLE FÍSICO

Calor (úmido, seco, pasteurização)

- Mecanismos de ação: desnaturação das proteínas (enzimas)

- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos e grandes partes de vírus em 10 minutos( vírus hepatite e endosporos resistem por mais tempo)

- Autoclave: maior temperatura devido a pressão (esterilização efetiva)

Métodos físicos de controle Microbiano

Métodos físicos de controle Microbiano

Pasteurização:

- Objetivo: eliminar microrganismos patogênicos, prolongar a qualidade, utilizado em alimentos perecíveis (leite, iogurte, sorvete, cerveja)

- Tempo de pasteurização difere: viscosidade, teor de gorduras ....

Métodos físicos de controle Microbiano

Pasteurização:

Métodos físicos de controle Microbiano

Saída dos tubos Entrada da câmara

Saída da câmara

Entrada dos tubos

septos

Lenta (62-65ºC – 30 minutos)

Rápida (72-75ºC/15 a 20

segundos)

UHT (135-145ºC/2 a 5 segundos)

Métodos físicos de controle Microbiano

Aplicado principalmente a instrumentos e materiais sólidos (por exemplo vidraria)

Requer uma temperatura e um tempo maior (170-180°C/algumas horas)

Obtido em fornos de esterilização (Forno de Pasteur)

Métodos físicos de controle Microbiano

Testes utilizados para monitorar e validarprocessos, garantindo a segurança do métodos,podem ser;

Químicos – fitas termossensíveis

Biológicos-consiste numa populaçãopadronizada de microrganismos viáveis(usualmente esporulados) conhecidos comoresistentes ao modo de esterilização a sermonitorizado.

Métodos físicos de controle Microbiano

Recipiente de plástico flexível

Ampola quebrável (de vidro)

com meio de cultura estéril

Papel de filtro com esporos

Controle do

processo de

esterilização em

autoclave

•Cor inalterada

•pH inalterado

•Esporos mortos

•Não há germinação

•Cor alterada

•pH alterado

•Esporos vivos

•Há germinação

Funcionamento da

autoclave normal

Funcionamento da

autoclave comprometido

Métodos físicos de controle Microbiano

Mecanismo de ação: remoção mecânica

Soluções sensíveis ao calor, ar;

Filtros de membrana: ésteres de celulose, polímeros plásticos◦ 0,22μm e 0,45μm para bactérias.

Bactéria retida num filtro tipo Isopore

Métodos físicos de controle Microbiano

Métodos físicos de controle Microbiano

Capelas de fluxo laminar

Filtros de ar de alta

eficiencia (90%)

Membranas de acetato

de celulose

Métodos físicos de controle Microbiano

Mecanismo de ação: interrupção do metabolismo bacteriano.

◦ Liofilização: água sublimada do interior da célula. Os MO permanecem viáveis, porem latentes com a ausência de água.

Métodos físicos de controle Microbiano

Refrigeração comum: bacteriostático 0-7ºC; (exceção bactérias psicrotróficas)

Congelamento -20ºC; ◦ Lento: bactérias em estado latente

◦ Rápido: mais letal, ciclos de congelamento e descongelamento são utilizados

Nitrogênio líquido -179ºC.

Métodos físicos de controle Microbiano

Comprimento de onda

Intensidade

Distância da fonte

Duração

Métodos físicos de controle Microbiano

Ionizantes: Raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia.

◦ Mecanismo de ação: os raios ionizam a água, formando radicais hidroxila altamente reativos.

Métodos físicos de controle Microbiano

Não-ionizantes: radiação não muito penetrante: UV (260nm)

Mecanismo de ação: alteram o DNA pela formação de dímeros.

C A T C A

Métodos físicos de controle Microbiano

Fortes e curtos pulsos elétricos;

Ação sobre bactérias: ruptura da membrana celular, formação de poros na membrana.

Métodos físicos de controle Microbiano

Aumento da concentração de sais ouaçúcares;

Mecanismo de ação: provoca a saída de águacondensando o citoplasma e retraindo amembrana.

Ex???????

Métodos físicos de controle Microbiano

CONTROLE QUÍMICO

Capacidade de penetração na matéria orgânica sem perder sua ação germicida e ausência de ação corrosiva.

Desinfetantes:

Não ser irritante, não interferir no processo de

cicatrização e não ser absorvido pela pele

Anti-sépticos:

Métodos químicos de controle Microbiano

1- Possuir alta eficiência germicida,

2- Ser de efeito rápido, ter amplo espectroantimicrobiano e ação prolongada.

3- Apresentar estabilidade química, devendoser solúvel em água e nos líquidos orgânicos;

4- Ser inodoro ou ter odor agradável;

5- Incolor;

6- Não produzir manchas.

Métodos químicos de controle Microbiano

Alvo/Efeito de alguns agentes químicos

•Parede celular

•Membrana plasmática

•Ligação cruzada entre macromoléculas

•Intercalação de DNA

•Interação com grupos tióis (sulfidrilas)

•Oxidação

SH

Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas e dissolução de lipídios de membranas.

Bactericida;

Não age sobre endósporos e vírus não envelopados.

Álcool etílico: 70%

Álcool isopropílico: puro é superior ao etílico.

Métodos químicos de controle Microbiano

Mecanismo de ação: liberação de O nascente; oxida os sistemas enzimáticos

Exemplos:

Peróxidos: H2O2 3% age sobre organismos anaeróbios;

Ácido peracético: efetivo contra bactérias, fungos, endosporos e vírus.

Ozônio: empregado na desinfecção de água.

Mecanismo de ação: alquilação dos grupos funcionais das proteínas (aminas, carboxilas, hidroxilas), inativando-as.

Aldeído fórmico : solução em água de 3 a 8 %

Aldeído glutárico: soluções alcalinas a 2%

Formalina: solução aquosa de formol, associada a um sabão ou detergente 40%

OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.

Mecanismo de ação antimicrobiana do glutaraldeído

Alvo Ação

Esporos bacterianos •Inibe germinação (concentrações);

É esporocida (concentrações)

Micobactérias •Provavelmente a parede celular

Outras bactérias que

não formam esporos

•Associação forte com camadas mais

externas da parede celular; Ligação

ente aminoácidos de proteínas;

Inibição de transporte na célula

Fungo •Parede celular

Vírus •Ligação proteína-DNA e

mudanças no capsídio

Mecanismo de ação: desnaturam proteínas e rompem membranas plasmáticas lipídicas.

Exemplos:

fenol;

cresol

hexaclorofeno;

Fenol: desinfetante fraco, atividade bactericida em [0,2 a 1%]

Cresóis: creolina superfícies;

Triclosano (bifenol): uso em superfícies;

Hexaclorofeno (bifenol): em desuso por causar alterações neurológicas.

anti-sepsia da pele e bucal

IODO

◦ Solução alcoólica a 2%, bactericida, fungicida, virucida,

[ ] esporocida

◦ Mecanismo de ação: presume-se que há a combinação irreversível a proteínas, interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, inibindo suas funções.

CLORO

cloro + água = ácido hipocloroso

◦ Cl2 + H2O H+ + Cl- + HOCl

◦ Mecanismo de ação do 2HOCl: oxida grupos SH e NH2 de enzimas bacterianas, inibindo-as.

CLORO◦ Hipoclorito de sódio;

◦ Dióxido de cloro;

◦ Cloraminas (cloro + amônia);

Mecanismo de ação: alteram a permeabilidade da membrana, inibem enzimas, desnaturação de proteínas;

◦ Ativas contra G+ e pouco menos ativas contra G-

◦ EXEMPLOS:

Cloreto de benzalcônio

Cloreto de cetilpiridínio Cepacol

Agentes de superfície

Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas combinam-se com proteínas, geralmente nos grupos SH (sulfidrilas);

ação bacteriostática;

Mercurocromo e mertiolate

Mecanismo de ação: alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas;

Óxido de etileno: atua pela interação com proteínas, alta capacidade de penetração, é explosivo;

Betapropiolactona: baixa capacidade de penetração, carcinogênico.

OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.

Agente Químico Concentração (%) Aplicações Nível de

Atividade

Compostos Fenólicos 0.5-3.0 Desinfecção de objeto inanimado Intermediário

Álcoois 70-90 Anti-sepsia da pele, desinfecção de

instrumentos cirúrgicos

Intermediário

Iodo 1 Anti-sepsia da pele, pequenos

cortes, desinfecção da água

Intermediário

Compostos Clorados 0.5-5.0 Desinfecção da água, superfícies

não metálicas, equipamentos de

laticínios, materiais domésticos

Baixo

Mercúrio 1 Anti-sepsia da pele, desinfecção de

instrumentos

Baixo

Alta – Mata todas as formas de vida microbiana

Intermediário – Mata o bacilo da Tuberculose, Fungos e vírus, mas não os esporos

Baixo – Não mata o bacilo da tuberculose, nem os esporos e vírus em um tempo

aceitável

Fatores importantes associados

ao uso de agentes químicos

•Potência

•Espectro de ação

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

Fenol Substância a ser testada

2 Banho maria (20°C/5 min)

Determinação do Coeficiente fenólico

1

FenolSubstância a

ser testada

3 Acrescentar 0,5 ml de cultura

padrão

4 Depois de 5, 10 e 15 minutos, semear em

placas estéreis 1 amostra de cada diluição

Salmonella typhi

Staphylococcus aureus

Determinação do Coeficiente fenólico

5 Após 48h, observar as culturas e identificar a

maior diluição onde não se observa

crescimento (turbidez), após 10 min.

Diluição da substância, em que há crescimento

Diluição do fenol em que há crescimento•Coeficiente fenólico =

Determinação do Coeficiente fenólico

1/64

1/8= 8

Exemplo:

Agente Staphylococcus aureus Salmonella typhi

Fenol

Cloramina

Cresols

Etanol

Formalina

Água oxigenada

Lisol

Cloreto de mercúrio

Tintura de iodo

1,0

133,0

2,3

6,3

0,3

-------

5,0

100,0

6,3

1,0

100,0

2,3

6,3

0,7

0,01

3,2

143,0

5,8

Coeficiente fenólico de alguns agentes

químicos

Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa

Determinando o espectro de ação de um

desinfetante

1

3

24

1

3

24

1

3

24

= Disco impregnado com desinfetante

Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa

Incubar

Determinando o espectro de ação de um

desinfetante

Determinando o espectro de ação de um

desinfetante

Ácidos orgânicos: acético, láctico, sórbico...

pH ácido inibe o crescimento microbiano

Nitritos e Nitratos

Formam ác. nitroso e óxido nítrico que são substâncias oxidantes

Gás Sulfeto, metabissulfito e SO2

Redução das pontes dissulfeto em proteínas

Adição de sal e açúcar

VERMELHO, A.L., PEREIRA, A.F., COELHO, R.R.R., SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de Microbiologia,Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006.

FRANCO, B.G.M.F; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, São Paulo, 2005.

TORTORA, G. J.;FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia, Artmed, Porto Alegre, 2005.