Cromatografia

Profa. Dra. Sonia Apª. de Andrade sonia_andradebr@yahoo.com

Objetivos:

Bases teóricas da cromatografia e suas aplicações;

Apresentar os constituintes básicos de um sistema cromatográfico e cuidados especiais no sistema operante; Discutir as principais técnicas de preparo de amostras para análises cromatográficas;

Discutir os principais reagentes, solventes e modos de injeção utilizados nos diferentes sistemas cromatográficos;

Acoplamento dessa técnica à espectrometria de massas e sua importância na elucidação estrutural de compostos;

Demonstrar os principais parâmetros de validação analítica utilizados em análises cromatográficas.

Conteúdo Programático:

Bases teóricas da cromatografiaIntrodução à análise cromatográfica; Diferentes sistemas cromatográficos e suas aplicaçõescromatografia líquida de alta eficiência;cromatografia gasosa;acoplamento entre técnicas cromatográficas e a espectrometria

de massas;Técnicas de preparo de amostras biológicas, ambientais e

alimentos para análises cromatográficas; Validação de métodos cromatográficos.

Metodologia:• Aulas expositivas.• Estudo de artigos científicos que utilizam as técnicas

estudadas.• Interpretação de cromatogramas.• Resolução de problemas.• Visita a um laboratório de Pesquisa nessa área.

Cronograma:

• 22/10 - Princípios e Aplicações de cromatografia• 29/10 – cromatografia líquida de alta eficiência/artigos• 05/11 - Aula Prática - Instrumental• 12/11 – cromatografia gasosa/artigos

• 19/11 – Aula Prática – Cromatografia Líquida• 26/11 – acoplamento entre técnicas cromatográficas e a

espectrometria de massas• 03/12 - Avaliação Teórica/prática• 10/12 - Resultados Avaliação e Discussão

Histórico:• 1906 o botânico russo Mikhail Tswett

descreveu suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. (coluna de vidro c/CaCO3)

• Substâncias separadas = Bandas coloridas (chroma “cor” e graphein “escrita”)

Aplicações:

• Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes;

• Purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis;

• Separação dos componentes de uma mistura;

• A cromatografia é um método físico-químico de separação

que se fundamenta na migração diferencial dos

componentes de uma mistura devido a diferentes interações

entre duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou um

fluido supercrítico) e fase estacionária (fixa, colocada em

uma coluna ou numa superfície sólida).

Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel através de uma fase estacionária

• Classificação dos Métodos Cromatográficos

• Cromatografia planar;• Cromatografia em coluna;

• Classificação dos MétodosCromatográficos:

• Modo de separação:• Adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou

misturas desses mecanismos.

• Classificação dos MétodosCromatográficos:

• Fase móvel empregada:

• Cromatografia líquida Clássica (CLC): fase móvel - força da gravidade;

• Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE): fases estacionárias de partículas menores - bomba de alta pressão;

• Classificação dos MétodosCromatográficos:

• Cromatografia gasosa simples (CG)• Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) –

colunas capilares

• Classificação dos MétodosCromatográficos:

• Cromatografia supercrítica (CSC) - vapor pressurizado (acima da sua temperatura crítica).

• Classificação dos MétodosCromatográficos:

• Fase estacionária utilizada: fase estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas.

Cromatografia em Papel

• Compostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e ions metálicos• Princípio: partição (solubilidade)• Quantidade de amostra necessária 10-3 a 10-6 g

• F.M. - Sistema de solventes• F.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)

• Métodos de detecção: físico-químicos

• Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) - problema : reprodutibilidade

Cromatografia em camada delgada (CCD)

Adsorção líquido–sólido. • Separação - migração diferencial sobre uma camada delgada

de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos).

• Adsorventes: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida.

• Método simples, rápido, visual e econômico.

• Aplicações:

• acompanhamento de reações orgânicas,• purificação de substâncias• identificação de frações coletadas em cromatografia

líquida clássica.

• fator de retenção (Rf): Razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.

• • Valores ideais para Rf

estão entre 0,4 e 0,6

• Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas).

• Revelação: UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

• Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa.

• Cromatografia em Coluna:

• A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de muitos compostos orgânicos.

• Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas.

• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

• O principal mecanismo de separação da cromatografia líquida baseia-se na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida.

• Aplicação em CLAE:

• Várias áreas da ciência;• no acompanhamento de sínteses;• no isolamento de produtos naturais e sintéticos;• produção e controle de qualidade de medicamentos,

dentre tantas outras aplicações

• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

• A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência

• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.

Forças intermoleculares

• A atração entre moléculas é uma força intermolecular.

• Forças intermoleculares são muito mais fracas do que as forças intramoleculares (por exemplo, 16 kJ mol-1 versus 431 kJ mol-1 para o HCl);

• Quando uma substância funde ou entra em ebulição, forças intermoleculares são quebradas (não as ligações covalentes).

Forças Intermoleculares

• Forças de dispersão• Forças Polares• Forças Iônicas

Forças de dispersão de London

• A mais fraca de todas as forças intermoleculares.• O núcleo de uma molécula (ou átomo) atrai os

elétrons da molécula adjacente (ou átomo).• Por um instante, as nuvens eletrônicas ficam

distorcidas.• Nesse instante, forma-se um dipolo (denominado

dipolo instantâneo).

Forças de dispersão de London

Um dipolo instantâneo pode induzir outro dipolo instantâneo em uma molécula (ou átomo) adjacente.• As forças entre dipolos instantâneos são chamadas forças de dispersão de London

Em biotecnologia, interações dispersivas hidrofóbicas

Interações Dispersivas

Tipicamente ocorre entre hidrocarbonetos

Interações Dispersivas

• Biotecnologia: ID=Hidrofóbicas

Forças Polares

Forças dipolo-dipolo

• As forças dipolo-dipolo existem entre moléculas polares neutras.

• Mais fracas do que as forças íon-dipolo.

Forças dipolo-dipolo

Há uma mistura de forças dipolo-dipolo atrativas e repulsivas quando as moléculas se viram; Se duas moléculas têm aproximadamente a mesma massa e o mesmo tamanho, as forças dipolo-dipolo aumentam com o aumento da polaridade.

• A energia de interação (UP) entre dois dipolos moleculares;

• onde =polaridade da molécula• µ= momento dipolo da molécula• r= distância entre as moléculas

Ligação de hidrogênioCaso especial de forças dipolo-dipolo.A partir de experimentos: os pontos de ebulição de compostos com ligações

H-F, H-O e H-N são altos.

Forças intermoleculares são fortes. A ligação de H necessita do H ligado a um elemento eletronegativo (mais

importante para compostos de F, O e N).

Os elétrons na H-X (X = elemento eletronegativo) encontram-se muito mais próximos do X do que do H.

O H tem apenas um elétron, dessa forma, na ligação H-X, o H d+ apresenta um próton quase descoberto.

Conseqüentemente, as ligações de H são fortes.

Ligação de hidrogênio

Interações Polares: Interações Dipolo-Dipolo

Interações Dipolo – Dipolo induzido

Interações Polares: Interações Dipole-Dipolo Induzido

• compostos hidrocarbonetos aromáticos podem ser separados com base nas interações dispersiva;

• GC: fase estacionária - hidrocarboneto

• Ou por combinação interações polar-induzido e interações dispersivas

• LC: fase estacionária – IPI - sílica gel • Fase móvel – ID- : n-heptano

Forças Iônicas

Interações Iônicas e Dispersivas

Forças Moleculares e Cromatografia

Separação Baseada em Interações Dispersivas

Cromatograma de Hidrocarbonetos da Gasolina utilizando uma fase estacionária Dispersiva

Separação Baseada em Interações Polares

Separação de Hidrocarbonetos Aromáticos e Aromáticos

Separação Baseada em Interações Iônicas

A Separação de cátions por cromatografia de troca iônica

• Controle dos Parâmetros de Cromatografia:• Fase Estacionária (Vs)

• fase estacionária:

• O “recheio” da coluna X tempo de retenção

• Fase estacionária específica X aumento na resolução e redução no tempo de análise.

• Redução do “recheio” X prevenção de desnaturação de proteínas, por exemplo.

• fase estacionária:

• Moléculas de forma especial – moléculas com formas complementares

• • Cromatografia de moléculas Quirais: Fase

estacionária consiste em um específico enantiomero.

• fase estacionária:

• “diferentes tamanhas de poros”

• Cromatografia por exclusão de tamanho – separação por massa molecular

Separação de Moléculas Quirais

Separação dos Enantiomeros do Acido Halocarboxilico

Separação de uma Mistura por Cromatografia de Exclusão

Separação de uma Mistura por Cromatografia de Exclusão

Considerações Gerais

Fase Móvel: Importância e Preparação

Cerca de 50% de todos os problemas de análise....

Reagentes inadequados...

Solventes devem ser grau de pureza HPLC...

São inadequados:

Água mono destilada: contaminação orgânicos voláteis;

Água deionizada comum: ↑ orgânicos ;

Água de Osmose reversa: íons e orgânicos de baixo peso molecular

Água deve ser grau HPLC

- livre de bactérias – água esterilizada na saída por membrana de 0,22 µm.

- Resistividade 18 megohm. (teor de íons)

- Análise normais: teor de orgânicos 20 ppb.

Fase Móvel: Aditivos

• Grau P.A: grande variação de qualidade entre diferentes marcas;

• Baixas quantidades de orgânicos contaminam a coluna;

• Sais, ácidos, tampões, e reagentes (PIC)

• Fase Móvel: Preparo

Preparar diariamenteMedir os componentes separadamente e depois misturar, antes

da filtração;

• Cuidados! Temperatura do frascoErro de 1% no teor de orgânico pode causar uma mudança de 5-

15% no tempo de retenção dos picos

Preparo da Fase Móvel;

• Fase Móvel

• Ajuste de pH- acertar o pH do tampão aquoso antes de misturar com a parte orgânica

• Partículas em suspensão – riscar selos e pistões da bomba

• Filtração da fase móvel: para evitar entupimento dos filtros (2µm) da coluna deve-se filtrar a fase por membrana de 0,45 µm ou 0,22 µm

Compatibilidade Química – Membranas

Ésteres de celuloseTeflon (TFE)Polipropileno hidrófiloPDVFNylon

• Desgaseificação

Reprodutibilidade do fluxo (bolhas...)Estabilidade da linha de base (entrada de bolhas

no detector...)

O2 absorve 215 nm

Métodos de Gasgaseificação

Ultra-som; muito lento, pouco eficiente

Vácuo: lento (mínimo 20 minutos – pode alterar a composição da fase móvel

Vácuo + ultra-som + agitação simultaneamente: total de 2-5 min. Suficiente para a maioria das separações isocráticas.

Replicar de 12 em 12 horas.

Eficiente!

Reservatório da Fase Móvel

Vidro Pirex para análise de orgânicos; Plásticos para análise de íons

O reservatório de fase móvel deve ficar pelo menos 15 cm acima do ponto de entrada da fase na bomba

Avaliação do Cromatograma

Equação de ResoluçãoAvaliação do grau de separação através do cromatograma.

V= volume de eluição = volume da fase móvel bombeado através do sistema desde o ponto de injeção até a saída do ápice do pico (independe do fluxo)

Tempo de retenção do pico (tR) = tempo corrido entre o ponto de injeção até a saída do ápice do pico (dependente do fluxo)

Volume de Coluna Vo

Vo= volume de eluição (tempo de retenção) de um pico não retido pela coluna. É o volume mínimo que a bomba precisa bombear para qualquer amostra chegar até o detector.

O volume de coluna (Vo) é, também, o volume de fase móvel contido no sistema entre o injetor e o detector, inclusive dentro dos poros.

A coluna é responsável por 90-95% deste volume

Vo (em µL) pode ser estimado para colunas de recheios esféricos de 3-10 µm (com erro de 10-20%) usando o seguinte fórmula:

Vo (0,5). (volume interno da coluna vazia)

Vo (µL)( x r2 x C)/2r=raio interno em mm

C=comprimento em mm.

Quaisquer picos ou grupos de picos que saem no Vo:

Não interagiram com a colunaNão podem ser reconhecidos pelo tempo de retençãoNão podem ser quantificados

Vo é normalmente ( mas nem sempre!) a 1 perturbação da linha de base...

System Suitability e Vo

O System Suitability do computador pode calcular os parâmetros de avaliação do cromatograma; k, , N, assimetria, cauda, etc....

Para isso o analista deve informar o tempo do Vo..

Retenção (K´)

Retenção é afetada/controlada por:

-Polaridade da fase móvel; isto é pela % dos componentes da fase

- Polaridade da fase estacionária

- Temperatura da coluna

Seletividade

Seletividade :

capacidade do sistema químico (coluna e fase móvel) de diferenciar entre os componentes de interesse

Seletividade é afetada/controlada por:

Características químicas da fase móvel

Características químicas da fase estacionária

pH da fase móvel, quando se trata de compostos ionizados

Eficiência (N)

Eficiência NDiluição da banda de um componente sofrida ao passar

pelo sistema (~~alargamento do pico)

Fatores que influenciam NDiferença no comprimento de percurso

• Fatores que influenciam NEfeito de transferência de massa

Fatores usados para maximizar N

Usar uma coluna bem empacotadaUsar recheios esféricosUsar recheios de partículas pequenas (5µm)Usar um sistema sem problemas de volumes mortos

(injetor, detector, tubulações, conexões, etc)

N (número de pratos teóricos)

Medida da qualidade do empacotamento da coluna e serve para detectar defeitos e degradação do leito do recheio.

A eficiência é afetada/ controlada por fatores físicos

TemperaturaForma e tamanho da partícula de recheioComprimento da colunaFluxoVolume e massa de amostra injetada

Parâmetros de Separação

Principais Fatores de Controle

Retenção k´Polaridade da fase móvelPolaridade da fase estacionáriaÁrea superficial do suporte (m2/g)Tamanho do poro em A (1A= 10-10m)

Principais Fatores de Controle dos Parâmetros de Separação

- Seletividade

Características químicas da fase móvelCaracterísticas químicas da fase estacionáriapH da fase móvel, quando se trata de compostos

ionizados

Seletividade alterada pela Fase Móvel

Seletividade controlada pelo pH da solução

Seletividade Alterada pela Coluna

Seletividade controlada pela coluna

Os principais fatores de Controle dos Parâmetros de Separação

Eficiência N

Tamanho médio das partículas do recheio (µm)Temperatura da colunaComprimento da colunaViscosidade da fase móvel

Efeito do tamanho médio da partícula – Eficiência (N)

Comprimento e Diâmetro da Coluna

O número de pratos teóricos é geralmente proporcional ao comprimento da coluna.

Uma coluna de diâmetro menor aumenta a altura do pico, mas não necessariamente a resolução

Os Principais Fatores de Controle dos Parâmetros de Separação

Eficiência N

Fluxo da fase móvelCarga (massa) de amostra injetadaVolume de injeçãoPolaridade do diluente da amostraEfeitos extra-coluna (tubos, etc..)

Efeito do fluxo sobre N

Comparação de fluxos diferentes em coluna C18 com amostra de Parabenos

Mudanças de Fluxo/Pressão

Aumentar fluxo gradativamente (passos de 0, 1 ou 0,2 mL/min; deixar a pressão estabilizar.

Sobrecarga de Massa de Amostra

• ↓N e ↓K´ (cauda/ombro)

Volume Máximo de Injeção

Para manter toda a eficiência da coluna o volume de injeção deve ser, no máximo, 1% do volume interno da coluna vazia.

Exemplo de cálculo do volume máximoPara uma coluna de 4,6 mmx 250 mm o volume

máximo de injeção sem perda de eficiência (N) é: (3,14)(2,3 mm)2(250mm)(0,01)=41 mm3=41 µL

Efeito do volume de injeção sobre N

A polaridade do diluente da amostra

Dissolver amostra ou na fase móvel ou em algo mais fraco

Amostra injetada em um solvente mais forte que a fase móvel N↓ + K´↓.

A Polaridade do diluente da Amostra

Sempre quando possível dissolver amostra na fase móvel ou numa fase mais fraca (fase reversa: % menor de orgânico ou orgânico + fraco = + polar)

Errado: Fase móvel 30% metanol; coluna C18Amostra dissolvida em 100% metanolA mostra dissolvida em 30% acetonitrila

Correto;Fase móvel 30% metanolAmostra dissolvida em 0-30% metanol

Filtração da Amostra

Para não entupir o filtro de entrada da coluna e leitos com partículas 4 µm usar filtros descartáveis de 0,45 µm.

Para colunas com partículas menores de 4 µm é interessante usar filtros de 0,22 µm.

• Obs; Compatibilidade das amostras; Os filtros são descartáveis

Pré-Coluna

A pré-coluna se usa em linha e protege a coluna analítica contra partículas e contaminantes dissolvidos.

Filtro de Linha (In Line Filter)

Um filtro de linha contem um filtro de aço inox sintetizado de 2µm parecido com o da entrada da coluna.

É usado em linha entre o injetor e a coluna analítica protegendo somente contra partículas em suspensão.

Análise Quantitativa

• Comparação da altura ou da área do pico do analito com a de um ou mais padrões

Análise baseada na altura de Pico

• Variáveis a serem controladas:

• Temperatura da coluna• Vazão do eluente• Velocidade de injeção da amostra

Análise baseada nas áreas de pico

• A medida das áreas dos picos, normalmente, é o método preferido para quantificação.

• Computadores ou integradores;

• Manual; para picos simétricos – multiplique a altura do pico pela sua largura a meia altura

Calibração e Padronização

• Preparação de uma série de soluções padrão;

• Os cromatogramas para os padrões são, então, obtidos, e as alturas ou as áreas dos picos são lançadas num gráfico em função de concentração

Incertezas;

• Volume de amostra• Velocidade de injeção da amostra

Método da Padronização Interna

• Padrões internos• Vantagens: evita-se incertezas produzidas

pela injeção da amostra• Padrão interno+ padrão + analito• Razão entre as áreas ou alturas = variável

analítica

Método da normalização da área

• Considera-se que ocorre a eluição completa dos componentes da amostra;

• As áreas são computadas e corrigidas considerando as diferentes respostas do detector

• A concentração do analito é obtida multiplicando –se a sua área pelo fator resposta

Cromatografia Gasosa

Histórico

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG?

• Misturas de constituintes voláteis;

• Pontos de ebulição até 300C;

Cromatógrafo a Gás1. Reservatório de gáse controle de vazão/pressão

2. Injetor (vaporizador de amostra

3. Coluna cromatográfica e Forno da coluna

4. Detector

5. Amplificador de sinal

6. Registro de sinal

Instrumentação

CG: Fase Móvel: Não interage com a amostra – apenas a carrega através da coluna (Gás de arraste)

Requisitos

• Inerte

• Puro

• Compatível com o Detector;

Linha de gás

1. Cilindro de gás2. Regulador de Pressão primário3. “Traps” para eliminar impurezas4. Regulador de pressão secundário5. Regulador de vazão6. Medidor de vazão

Dispositivos de Injeção de Amostra

• Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Injetor “on-column” Convencional

1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica

• TEMPERATURA DO INJETOR; Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição

• Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

Colunas: Definições Básicas

EMPACOTADA = 3 a 6 mmL = 0,5 m a 5 m

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Temperatura da Coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO (VR’)

VR = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito)VM = Volume de Fase Móvel (volume de gás de arraste contido na coluna; “volume morto”)VR’ = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o analito está sorvido na FE)

Constante de Distribuição (KC)

Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste

FATOR DE RETENÇÃO, k:razão entre as massas deanalito contidas na FE(Ws) e gás de arraste (WM)

RAZÃO DE FASES:razão entre volumes de FEe gás de arraste na coluna

O fator de retenção k dependeda constante termodinâmicade distribuição KC eda razão de fases da coluna

Razão de fases ()Depende das DIMENSÕES da coluna:

Relações entre VR’, KC e

• VR’ pode ser definido em função de KC e

• VR’ depende diretamente da constante de distribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e das dimensões da coluna.

Eficiência de Sistemas Cromatográficos

A migração um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:

Efeitos do alargamento excessivo de picos

Separação deficiente de analitos com retenções próximas.Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

Quantificação da Eficiência

Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste:

Otimização da Eficiência

O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

N= 16. (tR/Wb)2

Otimização da Eficiência

• A altura equivalente a um prato teórico é função da velocidade linear média do gás de arraste u:

• O valor de H pode ser minimizado otimizando-se a a vazão de gás de arraste

• FASES ESTACIONÁRIAS• Características de uma FE ideal

FE Seletiva: separação adequada dos constituintesda amostra

FE pouco Seletiva:má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

Regra geral

a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem

separados (polar, apolar, aromático ...)

• Características de uma FE ideal

• Ampla faixa de temperaturas de uso: maior flexibilidade na otimização da separação;

• Boa estabilidade química e térmica maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra;

• Baixa viscosidade: colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases);

• Elevado grau de pureza: ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas.

FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas: Adsorção

• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

FE Sólidas• Características Gerais:• - Sólidos finamente granulados (diâmetros de

partículas típicos de 105 μm a 420 μm).• - Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g).• Mais usados:• Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-

divinilbenzeno),• Tenax (polióxido de difenileno)• Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões

ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa)

• Principais Aplicações:

• Separação de gases fixos• Compostos leves• Séries homologas

Famílias de FE Líquidas

• POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes.

• Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)

FE Líquidas: Absorção

• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)

Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m)TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)Gás de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FIDAmostra: 2L de solução dos pesticidas “on-column”

• Separação de piridinas

• ANÁLISE QUALITATIVA

• Conceitos Gerais• Identificação individual das espécies contidas na

amostra

• Determinação da identidade da amostra propriamente dita

• Fontes de Informações Qualitativas

• RETENÇÃO - Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação

• DETECÇÃO - Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas

• Tempos de Retenção

Comparação de cromatogramasda amostra e de uma solução padrão do analito suspeito

Tempos de RetençãoIdentificação por t’R é muito pouco confiável:

Bibliografia básica

• 1- COLLINS, C.H., BRAGA, G.L E BONATO,P.S –Introdução à Métodos Cromatográficos – Editora da Universidade Estadual de Campinas. São Paulo (2006) – 5a edição.

• 2- SKOOG, D. A.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental, 5. ed. São Paulo: Editora Bookman, 2002.

Bibliografia Complementar

1. HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa, 6. ed. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 2001

2. Artigos Científicos da área

Bibliografia básica

• 1- COLLINS, C.H., BRAGA, G.L E BONATO,P.S –Introdução à Métodos Cromatográficos – Editora da Universidade Estadual de Campinas. São Paulo (2006) – 5a edição.

• 2- SKOOG, D. A.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental, 5. ed. São Paulo: Editora Bookman, 2002.

Bibliografia Complementar

1. HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa, 6. ed. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 2001

2. Artigos Científicos da área

Cromatografia em PapelCompostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos

Princípio: partição (solubilidade);Quantidade de amostra necessária 10-3 a 10-6 g

F.M. - Sistema de solventesF.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)

Métodos de detecção: físico-químicos

Análise qualitativa: Rf (fator de retenção)

Problema : reprodutibilidade

Cromatografia em camada delgada (CCD)

Adsorção líquido–sólido. Separação - migração diferencial sobre uma camada

delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos).

Adsorventes: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida.

Método simples, rápido, visual e econômico.

Aplicações

acompanhamento de reações orgânicas,

purificação de substâncias

identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica.

fator de retenção (Rf): Razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.

Valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6

Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas).

Revelação: UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa.

Cromatografia em Coluna

A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de muitos compostos orgânicos.

Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

O principal mecanismo de separação da cromatografia líquida baseia-se na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida.

Aplicação em CLAE

Várias áreas da ciência;Acompanhamento de sínteses;Isolamento de produtos naturais e sintéticos;Produção e controle de qualidade de medicamentos,

dentre tantas outras aplicações

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

• A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência

Cromatografia - Classificação

Aplicações

• Separação

• Identificação qualitativa (investigação espectral ou química dos componentes isolados)

• Determinação quantitativa